CHO细胞衍生的细胞外囊泡和细胞物质在单抗灌流生产过程中对过滤器污染的影响

2024-07-08

在生物制药的灌流生产过程中，中空纤维过滤器的污染问题一直是业界面临的挑战。尽管过滤器污染的成因复杂且难以捉摸，本研究致力于揭示细胞培养介质中特定成分——特别是中国仓鼠卵巢 (CHO) 细胞释放的细胞外囊泡——在这一现象中扮演的角色。我们的研究发现，灌流过程中产生的直径介于 50 至 200 纳米的 CHO 源性小细胞外囊泡 (sEV) 的数量减少，往往预示着跨膜压 (TMP) 的升高和产品筛分效率的下降，这暗示 sEV 可能在过滤器内部积累，进而导致污染。利用扫描电子显微镜和氦离子显微镜的观察，我们在中空纤维切向流过滤过滤器 (HF-TFF) 的膜孔隙和污染区域发现了类似 sEV 的结构。此外，我们还发现，在灌流培养的第 28 天，TMP 的升高与污染区域的面积百分比存在正相关性。通过能量色散 X 射线光谱分析，我们进一步确认了污染斑块中富含细胞成分，但并未检测到消泡剂的存在。荧光染色的实验结果进一步揭示了这些细胞成分可能包括 DNA、蛋白质，甚至是贴壁的 CHO 细胞。在小规模的 HF-TFF 模型中，我们通过向 CHO 培养基中添加特定浓度的 CHO 特异性 sEVs，模拟了过滤器污染的行为。基于这些实验结果，我们提出了一种可能的 HF-TFF 污染机制：CHO sEVs 导致滤孔收缩，随后细胞物质在滤膜表面形成滤饼，从而引发污染。中国仓鼠卵巢 (CHO) 细胞因其卓越的生产能力和能够执行类似人类的翻译后修饰，如糖基化，而在生物制药行业中被广泛用作宿主细胞。传统上，CHO 细胞培养主要采用批次或补料分批模式，但近期，连续灌流培养因其潜在的单位体积生产率提升、产品质量改善和成本降低而受到重视。在这种灌流培养模式中，细胞截留装置，如切向流过滤 (TFF) 或交替式切向流 (ATF) 中空纤维过滤器，被用来实现新鲜培养基的连续补充和含产物废培养基的移除（见图 1a）。然而，这些系统可能会遇到过滤器污染问题，这不仅影响产品筛分效率，还可能导致生产过程提前终止。先前的研究指出，微滤膜能够截留与其孔径相匹配的颗粒，而直径约 100 nm 的颗粒被认为是导致工业级 0.2 μm 中空纤维过滤器污染的元凶。尽管如此，这些颗粒的具体性质尚未得到明确。最近的研究通过低倍横截面扫描电子显微镜 (SEM) 图像和能量色散 X 射线光谱 (EDS) 分析，揭示了 ATF 过滤器中蛋白质物质在中空纤维内腔表面的沉积，这是造成过滤器污染的原因之一。此外，CHO 细胞释放的细胞外囊泡 (EV)，这些含有蛋白质、RNA 和 DNA 的膜包裹颗粒，大小范围从 50 到 1000 nm 不等。基于这些发现，我们提出一个假设：CHO EV 可能是引起中空纤维过滤器污染的关键因素。图1. 四个灌流生物反应器中表达 mAb 的 CHO 细胞系的过滤器污染情况。（a）典型的 3 L 台式灌流生物反应器设置。四个 3 L 灌流生物反应器使用相同的表达 mAb 的 CHO 细胞系运行。显示了这些生产批次的 (b) VCD、(c) 活性、(d) TMP 和 (e) 产物筛分百分比。(d) 和 (e) 中的虚线表示过滤器污染（TMP ≥ 1.5 psi，产物筛分 ≤90%）。细胞外囊泡（EV）是细胞分泌的小型膜囊泡，它们作为信号传递的多功能复合体，在细胞和生物体内多种基本功能中扮演着关键角色。EV 可以根据其大小和来源分为小细胞外囊泡（sEV）和大细胞外囊泡（lEV）。sEV，尺寸通常在 50 至 200 纳米之间，是由细胞内部的内陷形成的多囊泡结构。而 lEV，包括凋亡过程中产生的 EV，尺寸较大，范围在 200 至 1000 纳米，它们直接由细胞膜起泡形成。在生物制药领域，中国仓鼠卵巢（CHO）细胞产生的 EV 浓度随着培养时间的延长而增加。有研究显示，将从 CHO 细胞培养中分离出的 EV 添加回培养基，能够抑制细胞凋亡并促进细胞生长。我们最近对 CHO 细胞源性的 sEV 和 lEV 中的 mRNA 和 miRNA 含量进行了详细分析。我们发现，与氧化磷酸化相关的 mRNA 在 lEV 中显著富集，而与细胞增殖、活性和生长相关的信号通路，如 TGFβ 和 PI3K/Akt 通路，其对应的 mRNA 在 sEV 和 lEV 中均有表达。特别是，miR-196a-5p 在两种类型的 EV 中均有富集，这表明 CHO 源性的 EV 可能通过细胞间的通讯机制发挥其抗凋亡和促进增殖的作用。在本项研究中，我们对 CHO 细胞在灌流生产过程中产生的 EVs 进行了动态监测。我们发现，在灌流过程的中期，通过纳米粒子跟踪分析（NTA）观察到生物反应器滤液中的 sEV 数量显著减少，这与跨膜压（TMP）的升高和产品筛分效率的下降同步发生。利用扫描电子显微镜（SEM），我们观察到过滤器的多孔结构出现阻塞，这与 TMP 的升高具有定性的相关性。通过氦离子显微镜（HIM）和 SEM 的进一步表征，我们在污染膜的孔隙和斑块中发现了 sEV 状结构。元素映射和荧光染色的分析结果进一步揭示了这些污染斑块可能含有 DNA、蛋白质以及粘附的 CHO 细胞等生物材料。为了深入探究 sEVs 在过滤器污染中的作用，我们采用了中空纤维切向流过滤（HF-TFF）灌流模型进行实验。实验结果表明，向培养基中添加分离的 sEVs 会导致 TMP 升高和产品筛分效率降低，并且这种效应呈现出浓度依赖性。这些发现表明，在 CHO 细胞培养过程中产生的 sEVs 可能与其他生物材料共同作用，导致 HF-TFF 过滤器的污染。详细实验操作和结果，请参考原文。图2. 通过纳米跟踪分析 (NTA) 观察灌流生物反应器细胞外囊泡的动力学。分析了四种灌流生物反应器培养物中的 CHO EVs 动力学（图 1）。分析了 (a) 生物反应器和 (b) 滤液中的培养物。白色虚线表示 200 nm 直径，用于区分 sEV 和 lEV 以便进行量化。图中显示了灌流生产过程中生物反应器中的 (c) sEVs、生物反应器中的 (d) lEVs 和滤液中的 (e) sEVs 的总数。图3. 通过显微镜检查可发现 HF-TFF 过滤器内腔上的过滤器污染结构。（a）HF-TFF 过滤器及其中空纤维腔的示意图。在灌流生产过程中，细胞培养液流过纤维腔，但滤液以垂直于培养液流动的方向穿过腔壁上的小孔。（b）具有不同最终TMP和产物筛分（从左到右）的HF-TFF过滤器（来自图 1中相应的生物反应器）的扫描电子显微镜（SEM ）表征：新过滤器，过滤器A（第28天TMP：13.9 psi，产物筛分：73.1％），过滤器B（第28天TMP：5.83，产物筛分：73.9％），过滤器C（第28天TMP：12.0 psi，产物筛分：68.1％）和过滤器D（第28天TMP：10.4 psi，产物筛分：86.4％）。双箭头表示沿中空纤维腔的流动方向。虚线圆表示sEV在中空纤维腔上的沉积。图4. 使用 SEM 能量色散 X 射线光谱 (EDS) 对 HF-TFF 过滤器进行元素映射。显示了 (a) 完整和 (b) 污染的 HF-TFF 过滤器的元素映射结果。a1 和 b1：映射区域的 SEM 图像；a2 和 b2：F（显示为红色）和 C（显示为蓝色）的元素映射；a3 和 b3：来自 S、P、O、N（显示为黄色）以及 F 和 C（显示为蓝色）的信号的元素映射；b4：来自 Si（显示为黄色）以及 F 和 C（显示为蓝色）的信号的元素映射。c1：完整过滤器内腔的能量色散 X 射线光谱。c2 和 c3：污染的 HF-TFF 过滤器内腔上微米级污染结构的能量色散 X 射线光谱。c2：b3 中的区域 1；C3：b3 中的区域 2。氟信号以白色箭头突出显示。图5. 离线小规模模型证实了 sEV 引起的过滤器污染。从 CHO 细胞培养中分离出的 sEV 被掺入培养基中，并在小规模 HF-TFF 灌流模型中评估了 (a) TMP 和 (b) 产物筛分曲线。测试了三种不同的 sEV 掺入浓度。(a) 中显示了三阶多项式非线性拟合。讨论在生物制药的灌流生产过程中，过滤器的污染问题一直是导致产品筛分效率降低和生产周期提前结束的关键因素。尽管对此问题进行了长达数十年的研究，过滤器污染的具体原因仍然难以明确。然而，我们的研究揭示了一个可能的污染源头：中国仓鼠卵巢（CHO）细胞释放的小型细胞外囊泡（sEVs）可能在这一过程中起到了关键作用。本研究首次全面评估了中国仓鼠卵巢（CHO）细胞在单克隆抗体（mAb）灌流生产过程中释放的细胞外囊泡（EVs）的动态变化，并探讨了这些EVs对中空纤维切向流过滤（HF-TFF）过滤器污染的影响。我们采用纳米粒子跟踪分析（NTA）技术监测了灌流过程中CHO源性EVs的浓度变化，相较于传统的动态光散射技术，NTA能够更精确地测定颗粒浓度。我们的观察结果表明，生物反应器中的大细胞外囊泡（lEVs）浓度较高，但它们在滤液中的浓度几乎检测不到。生物反应器中lEVs的浓度在整个运行过程中稳步上升，这与过滤器对直径200-1000纳米的lEVs的截留作用一致，因为过滤器的标称孔径为200纳米。与此同时，小型细胞外囊泡（sEVs）的浓度在生物反应器中保持相对稳定，但滤液中的sEVs浓度随时间显著变化。在灌流初期，滤液中可以检测到sEVs，但其浓度远低于生物反应器中的水平，表明只有少量sEVs能够通过过滤器。通过模拟灌流实验，我们发现lEVs以每天约5个囊泡/细胞的恒定速率产生，而sEVs的产生速率更高，约为每天400个囊泡/细胞。生物反应器中没有sEVs积累的现象，这进一步支持了sEVs可能在HF-TFF过滤器内部滞留的观点。此外，在过滤器污染发生之前，我们观察到滤液中的sEV浓度突然下降了10倍，这一现象通过跨膜压（TMP）的增加得到了证实。我们的研究还表明，尽管四个生物反应器具有相同的设置和控制条件，但它们开始出现污染的时间存在显著差异。这可能与各个过滤器的孔径分布和总孔数不同有关，导致它们对CHO EVs堵塞孔的敏感性不同。值得注意的是，在生产即将结束时，滤液中的sEV数量在两次灌流运行中略有增加，这可能是由于高压条件下sEVs的突破造成的。基于这些发现，我们提出了一种新的中空纤维过滤器污染模型。该模型考虑了sEVs在过滤器孔隙中的积累，以及它们对过滤器孔径和错流的影响。这一模型不仅为理解过滤器污染机制提供了新的视角，而且为改进过滤器设计和优化灌流工艺提供了理论依据。我们对受污染的中空纤维切向流过滤（HF-TFF）过滤器进行了详尽的结构和元素分析，以评估小型细胞外囊泡（sEV）沉积对过滤器污染的影响。与新过滤器相比，所有受污染的HF-TFF过滤器内腔均出现了小于100微米的污染斑块，这些斑块的面积与相应生物反应器最终的跨膜压（TMP）呈现出相关性。通过高倍放大的扫描电子显微镜（SEM）和氦离子显微镜（HIM）观察，我们不仅在过滤器的孔隙中，而且在污染斑块上均能识别出sEV样颗粒。进一步的元素映射分析揭示了污染斑块中含有碳（C）、钠（Na）、磷（P）、氧（O）和氮（N），这些元素的存在暗示斑块中可能富含蛋白质、核酸和脂质。在对比先前研究中，Kelly等人在污染的中空纤维膜表面检测到了消泡剂胶束，但我们的研究中并未在污染斑块中发现硅元素的富集，硅是消泡剂的一个关键成分。Sundar等人的研究也未观察到硅的存在。值得注意的是，Kelly等人在成像前未对冷冻膜进行清洗，而Sundar等人和我们在成像前都对膜进行了清洗。这种方法上的差异可能是导致消泡剂检测结果不同的原因。我们的荧光染色分析揭示了污染膜上显著的DNA信号，这一发现支持了先前关于CHO DNA在灌流过滤器污染中发挥作用的假设。特别地，在一些污染斑块中，我们观察到了类似内质网（ER）的GP96信号，这些信号环绕着核状的DNA信号，暗示这些斑块可能包含CHO细胞。考虑到进入HF-TFF纤维的CHO细胞可能会受到高剪切力的影响，这种力量已知会导致CHO细胞粘附并在流动方向上形成极化，这为我们在扫描电子显微镜（SEM）图像中观察到的污染斑块的流动平行条纹状图案提供了一种可能的解释。Kelly等人的研究也通过SEM观察到了中空纤维滤膜上的CHO细胞，进一步证实了这一点。 DNA和贴壁CHO细胞对过滤器污染的具体贡献需要进一步的研究来明确。此外，我们注意到，滤膜上污染斑块的出现为Bolton等人提出的滤饼模型提供了实际的物理证据。已有研究表明，较小的颗粒更倾向于在膜表面形成滤饼，而这种滤饼通常包含大量的小颗粒。因此，sEV的沉积可能促进了滤膜上初始滤饼的形成。对灌流生产过程中不同阶段获得的过滤器进行物理和生化特性的深入表征，将有助于我们更深入地理解过滤器污染的发展机制。 Wang等人的研究利用了一个离线中空纤维灌流模型，以评估不同尺寸颗粒对产物筛分效率的影响。该研究发现，细胞培养上清液中主要含有约100纳米的颗粒，其筛分效果显著低于那些含有极小颗粒（约10纳米）或细胞（大于10微米）的滤液。然而，理论上细胞培养上清液应包含各种尺寸的颗粒，这表明Wang等人的实验结果可能受到了除sEVs之外的其他颗粒的干扰。在本研究中，我们采用了一种经过验证的差速离心法来分离sEVs，并明确证实了这些sEVs在CHO细胞培养物中200纳米以下颗粒中占有相当大的比例。此外，我们在基于中空纤维的离线小规模模型中进一步证实了sEVs与过滤器污染之间的直接因果关系。鉴于中空纤维切向流过滤（HF-TFF）污染在基于中国仓鼠卵巢（CHO）细胞的灌流培养过程中的重要性，识别sEVs作为污染的关键因素之一，为改进灌流工艺提供了新的视角。我们的研究结果表明，在灌流生物反应器中，那些产生较高细胞特异性sEV的CHO克隆体，其产物筛分效率相对较低。基于这一发现，选择sEV产量较低的CHO克隆体进行灌流生产，可能是一种有效的策略。开发sEV产量较低的CHO宿主细胞系，可能有助于减轻过滤器污染的问题。然而，这一做法需要综合评估对细胞生长、活性、生产力和产物质量的潜在影响，考虑到sEVs在多种细胞途径中可能发挥的关键作用。有研究表明，使用较大孔径的中空纤维过滤器可以有效缓解过滤器污染的问题。我们假设，较大孔径的过滤器（如0.45微米）允许主要流体动力学尺寸约为300纳米的lEV相对自由地通过，即使部分较大EV开始收缩滤孔，较小的EV和产物仍可穿过，从而延迟了污染的发生。然而，使用较大孔径过滤器的一个缺点是，在进行层析之前，可能需要增加一个额外的过滤步骤来进一步澄清滤液。此外，Pinto等人的研究显示，使用宽表面孔膜可以显著改善灌流培养中的筛分衰减，这可能是通过减少膜表面滤饼的形成实现的。Wang等人的研究表明，与TFF相比，ATF灌流展现出更好的产物筛分效果，他们认为TFF中使用的蠕动泵产生的高剪切应力是导致更严重污染的主要原因。使用低剪切力的离心泵替代蠕动泵，可以改善TFF的筛分效率。已知剪切应力可以显著促进sEV的分泌，因此在蠕动泵使用过程中，sEV浓度的升高可能导致过滤器污染的增加。基于我们的实验数据，我们构建了一个描述中空纤维过滤器污染过程的机械模型（见图6）。在过滤器初始状态下，培养液及单克隆抗体（mAb）能够无阻碍地穿越过滤膜（图6左侧）。尺寸较小的sEVs亦能部分通过滤膜。正如Knutsen和Davids的早期研究所展示的，在恒定的滤液流速和壁面剪切率条件下，较大粒径的颗粒沉积量减少。那些粒径与HF-TFF过滤器孔径相近的sEVs会在膜表面沉积并逐渐缩小孔径。在这个阶段，尽管错流尚未受到显著影响，但滤液中的sEVs数量已经开始下降，因为它们被截留在滤膜内部。随着灌流过程的持续，滤膜的有效孔径进一步减小，导致更小的sEVs也被困在过滤器中。这种积累损害了错流，进而增加了跨膜压（TMP）。然而，在TMP上升的情况下，抗体分子仍能够穿越孔隙（见图6中间）。只有当孔隙狭窄到连抗体分子也难以通过时，产物的筛分效率才会降低，这解释了为什么筛分效率下降会稍晚于TMP的增加。不同过滤器上高度收缩孔隙的比例不一，这可能解释了为什么在灌流生物反应器中TMP与产物筛分效率之间缺乏直接相关性。同时，sEVs、DNA以及其他生物材料在滤膜表面累积，形成了所谓的“滤饼”，这进一步阻塞了孔隙和错流。在污染的后期阶段（见图6右侧），大部分管腔膜被小于100微米大小的污染斑块所覆盖，这些斑块可能包含EVs、DNA、细胞碎片，甚至粘附的CHO细胞。这些较大的结构严重阻碍了跨膜流动，导致产物筛分效率显著下降和TMP急剧升高。在某些极端情况下，过滤器腔内可能形成足够大的结构，以捕获大颗粒和细胞。图6. 研究提出的灌流生产过程中 HF-TFF 污染机理。完好阶段：管腔膜表面形成最少的污染结构，mAb 和 sEVs 可以自由穿过滤膜。初始污染阶段：过滤器孔中累积的 sEV 沉积阻止 sEVs 穿过膜，导致更多 sEV 沉积在管腔表面，最终导致 TMP 增加。然而，mAb 仍然能够穿过膜，产物筛分受到的影响最小。后期污染阶段：大部分管腔表面被微米级污染结构覆盖，导致 TMP 高。污染的膜不允许 mAb 穿过，导致产物筛分低，灌流培养处于终末状态。总结我们首次对单克隆抗体(mAb)灌流生产过程中中国仓鼠卵巢(CHO)细胞释放的细胞外囊泡(EV)进行了全面的动态分析，并对受污染的中空纤维切向流过滤(HF-TFF)过滤器进行了结构和元素特性的深入研究。我们的研究结果揭示了滤液中小型细胞外囊泡(sEV)浓度的变化趋势，这表明sEV可能在HF-TFF过滤器的污染过程中扮演了重要角色。此外，通过扫描电子显微镜(SEM)和氦离子显微镜(HIM)成像以及能量色散X射线光谱(EDS)元素映射，我们进一步证实了sEV在过滤器污染中的潜在贡献。在小规模HF-TFF模型中进行的sEV加标实验进一步支持了这一发现。基于这些综合发现，我们构建了一个中空纤维过滤器污染的新模型。该模型不仅增进了我们对过滤器污染机制的理解，而且为过滤器设计和灌流工艺的优化提供了有力的理论支持。通过这些改进，我们期望能够缓解中空纤维过滤器的污染问题，从而提高生物制药过程的效率和可靠性。本文节选自来自Merck & Co., Inc.的研究人员发表的文章“Contributions of Chinese hamster ovary cell derived extracellular vesicles and other cellular materials to hollow fiber filter fouling during perfusion manufacturing of monoclonal antibodies”，由于水平有限，详细内容，请参考原文。识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入生物制品微信群！请注明：姓名+研究方向！版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。