Niclosamide

2016年，Nature发表了题为Identification of small molecule inhibitors of Zika virus infection and induced neural cell death via a drug repurposing screen的经典论文，该研究通过高通量药物重定位筛选，在6000余种化合物中鉴定出神经保护类（如Emricasan）和抗病毒类（如Niclosamide、CDK抑制剂）化合物，其单独或联合使用能有效保护人类神经祖细胞、星形胶质细胞及脑类器官免受Zika病毒诱导的损伤，为抗Zika病毒治疗药物开发提供了关键靶点与候选分子，同时彰显了类器官在病毒致病机制研究与药物筛选中的核心价值。 01 研究背景 2014年巴西Zika病毒爆发后，这种蚊媒传播的黄病毒迅速席卷全球60多个国家和地区，成为全球公共卫生紧急事件。与普通虫媒病毒不同，Zika病毒的致命威胁在于垂直传播能力。 孕妇感染后，病毒可穿透胎盘屏障攻击胎儿大脑，导致严重的先天性缺陷“小头症”（大脑体积显著缩小）；同时，成人感染还可能引发格林-巴利综合征、脑膜脑炎等神经系统并发症。 尽管科学家们很快明确了Zika病毒的核心攻击目标是人类神经祖细胞（hNPCs），但彼时面临两大关键难题： 一是无任何获批治疗药物，传统新药研发周期长达10年以上，远赶不上疫情传播速度； 二是研究模型局限，2D细胞培养无法模拟大脑3D发育环境，动物模型与人类大脑结构差异大，难以精准反映病毒致病机制。   02 实验设计思路 为快速找到有效化合物，研究团队采用了“药物重定位”策略，利用已有的药物或临床候选化合物库进行筛选，跳过药物安全性验证的前期步骤，大幅缩短研发周期。同时设计了“双测试体系”和“多模型验证”的严谨方案： 1. 核心筛选逻辑：瞄准病毒诱导的细胞凋亡 Zika病毒感染后会激活细胞凋亡通路，导致caspase-3酶活性升高，最终引发神经细胞死亡。 因此，研究团队以caspase-3/7活性检测作为主筛方法，快速锁定能抑制病毒诱导凋亡的化合物； 再通过ATP含量检测验证细胞活力，排除化合物自身的细胞毒性。 2. 多维度研究模型：从2D细胞到3D类器官 为确保化合物的广谱有效性，研究团队同时在三类细胞/模型中验证： 基础模型：人类神经祖细胞（hNPCs）、星形胶质细胞（大脑关键支持细胞）、SNB-19胶质母细胞瘤细胞（易感染且信号稳定，适合高通量筛选）； 核心模型：3D人脑类器官，模拟体内大脑发育环境，验证化合物在生理场景下的效果。 3. 化合物库与病毒株：覆盖临床相关性 筛选的6000种化合物涵盖“FDA获批药物、临床候选药物、药理活性化合物”，确保筛选结果的临床转化潜力； 同时采用3种不同地域来源的Zika病毒株（乌干达株、柬埔寨株、波多黎各株），避免化合物的菌株特异性局限。   03 关键结果 经过多轮筛选与验证，研究团队最终锁定了两类核心化合物，以及“1+1>2”的联合用药策略，每一项发现都兼具科学价值与临床潜力： 1.Emricasan守住细胞存活的最后防线 Emricasan是一种泛caspase抑制剂，原本用于治疗慢性丙肝相关的肝损伤，正处于临床II期试验阶段。 研究发现：它能在2D细胞和3D类器官中，以极低浓度（IC50 0.13-0.9μM）有效抑制Zika病毒诱导的caspase-3激活，显著减少神经祖细胞凋亡； 关键是它不抑制病毒复制（病毒仍能在细胞内存在），但能保住细胞性命，为后续抗病毒治疗争取时间； 临床优势是人体耐受性好，血液中浓度远高于体外有效浓度，具备快速转化的潜力。 2.Niclosamide与CDK抑制剂，直击病毒复制核心 Niclosamide（氯硝柳胺）：FDA批准的B类驱虫药且孕期使用安全，已有近50年临床应用史。 研究发现它能在病毒入胞后阶段抑制3种Zika病毒株的复制，IC50仅0.2-0.37μM，且对神经细胞毒性极低。 更重要的是，WHO和CDC（美国疾病预防控制中心）均推荐其孕期可使用，为孕妇这一高危人群提供了潜在治疗选项。 10种CDK抑制剂：细胞周期依赖激酶（CDK）是细胞分裂的关键调控因子，研究团队发现10种结构无关的CDK抑制剂（如PHA-690509、Seliciclib）能有效抑制Zika病毒复制，其中Seliciclib的IC50低至24nM。 进一步研究证实，Zika病毒复制依赖宿主细胞的CDK活性，这类抑制剂通过靶向宿主细胞通路，从根源上阻断病毒增殖，同时还能部分恢复Zika病毒抑制的神经祖细胞增殖能力。 3.联合用药1+1>2的协同防护 研究团队尝试将Emricasan与抗病毒化合物（如PHA-690509）联合使用，发现两者呈现协同效应：既能通过抗病毒药物抑制病毒复制，减少病毒对细胞的持续损伤；又能通过Emricasan阻断凋亡通路，保护未被完全清除病毒的细胞存活； 最终在神经祖细胞和星形胶质细胞中，实现了比单独用药更强的保护效果，为临床治疗提供了更优策略。   04 论文图片解读 图1：埃米卡森（Emricasan）在2D单层培养体系和3D脑类器官中，抑制寨卡病毒（ZIKV）感染诱导的人类星形胶质细胞和神经祖细胞（hNPCs）死亡 （a）上：埃米卡森的化学结构。下：剂量-反应曲线显示，埃米卡森处理对感染3种不同寨卡病毒株的SNB-19胶质母细胞瘤细胞的半胱天冬酶（caspase）活性（左图）和细胞活力（右图）的影响。曲线为拟合最优曲线，用于计算半数抑制浓度（IC₅₀），每个面板的插图中列出了针对各病毒株的IC₅₀计算值。 （b）左：前脑特异性人类神经祖细胞（hNPCs）2D单层培养的代表性免疫染色图像。细胞暴露于寨卡病毒FSS13025株（感染复数/MOI=0.04-0.08）后72小时，检测寨卡病毒包膜蛋白（ZIKVE；绿色）、活化的半胱天冬酶3（Cleaved-caspase-3，Cas3；红色）和细胞核染料DAPI（灰色），并设置未感染对照组（mock）和埃米卡森处理组。适用于（b）中所有图像面板。右：定量分析未感染组、寨卡病毒感染组及不同浓度埃米卡森处理组中，Cas3阳性细胞占DAPI染色总细胞的百分比。 （c）左：3D人类前脑特异性类器官（体外培养28天）的代表性免疫染色图像。类器官暴露于寨卡病毒FSS13025株后10天，检测ZIKVE（绿色）、Cas3（红色）和DAPI（灰色）。适用于（c）中所有图像面板。右：定量分析脑室区中Cas3阳性细胞占DAPI染色总细胞的百分比。 图2：鉴定PHA-690509和氯硝柳胺（Niclosamide）为抗寨卡病毒（ZIKV）化合物 （a）上：代表性蛋白质印迹（western blot）图像，显示PHA-690509梯度浓度处理对SNB-19胶质母细胞瘤细胞的抗寨卡病毒活性。SNB-19细胞在接种寨卡病毒FSS13025株、PRVABC59株或MR766株（感染复数/MOI=1）前1小时，用指定浓度的PHA-690509处理，感染后24小时收集细胞进行蛋白质印迹分析。下：NS1/GAPDH蛋白条带强度的量化结果，数据以二甲基亚砜（DMSO）处理组为基准进行归一化。插图为PHA-690509的化学结构。 （b）上：代表性蛋白质印迹图像，显示埃米卡森（Emricasan）梯度浓度处理对SNB-19细胞的抗寨卡病毒活性，实验设计与（a）一致。 （c）上：氯硝柳胺（Niclosamide）的化学结构，及该化合物梯度浓度处理对感染寨卡病毒PRVABC59株（MOI=1）的SNB-19细胞的抗寨卡病毒活性代表性蛋白质印迹图像。下：与（a）一致的量化结果。 （d）酶联免疫吸附试验（ELISA）量化结果汇总：感染细胞经不同剂量氯硝柳胺（上图）或PHA-690509（下图）处理24小时后，培养基中分泌型寨卡病毒NS1蛋白的含量。 （e）氯硝柳胺和PHA-690509梯度浓度处理对寨卡病毒颗粒产生的影响汇总。SNB-19细胞在接种寨卡病毒PRVABC59株（MOI=0.5）前1小时，用递增浓度的各化合物处理，感染后24小时收集细胞培养上清液，采用非洲绿猴肾细胞（Vero细胞）进行蚀斑形成单位（FFU）检测，量化感染性病毒颗粒数量。曲线为拟合最优曲线，用于计算半数抑制浓度（IC₅₀），插图中列出了每种化合物的IC₅₀计算值。 图3：氯硝柳胺（Niclosamide）和PHA-690509在入胞后阶段抑制寨卡病毒（ZIKV）感染，且更多细胞周期依赖激酶抑制剂（CDKis）可阻断寨卡病毒感染 （a）氯硝柳胺和PHA-690509的时间添加实验示意图。 （b）上：代表性蛋白质印迹（western blot）图像。SNB-19细胞在接种寨卡病毒PRVABC59株（感染复数/MOI=1）前1小时或感染后4小时，分别用10μg/ml抗AXL抗体、2μM氯硝柳胺或92μM PHA-690509处理。下：NS1/GAPDH蛋白条带强度的量化结果，数据以二甲基亚砜（DMSO）处理组为基准进行归一化。 （c）CDKi处理对寨卡病毒感染的抑制作用。左：代表性蛋白质印迹图像。SNB-19细胞在接种寨卡病毒FSS13025株或PRVABC59株（MOI=1）前1小时，用92μM指定化合物处理。右：与（b）一致的量化结果。 （d）多种CDKi对寨卡病毒颗粒产生的影响。实验设计与Figure 2e一致，所有数据以各化合物0μM组为基准进行归一化。曲线为拟合最优曲线，用于计算半数抑制浓度（IC₅₀），右侧面板列出了各化合物的IC₅₀值。 图4：氯硝柳胺（Niclosamide）和PHA-690509在人类星形胶质细胞和前脑特异性神经祖细胞（hNPCs）中抑制寨卡病毒（ZIKV）感染 （a）上：代表性免疫染色图像。星形胶质细胞在接种寨卡病毒PRVABC59株（感染复数/MOI=0.5）前1小时，分别用2μM氯硝柳胺、92μM PHA-690509、9μM埃米卡森（Emricasan），或92μM PHA-690509与9μM埃米卡森的联合制剂处理；感染后24小时固定细胞，检测寨卡病毒包膜蛋白（ZIKVE；绿色）和细胞核染料DAPI（蓝色）。比例尺：50μm，适用于（a）中所有图像面板。下：定量分析寨卡病毒感染的星形胶质细胞占DAPI染色总细胞的百分比。 （b）上：代表性蛋白质印迹（western blot）图像。前脑特异性hNPCs以MOI=0.1的剂量感染寨卡病毒，感染后48小时收集细胞进行检测。下：NS1/GAPDH蛋白条带强度的量化结果，数据以DMSO处理组为基准进行归一化。 （c）经化合物处理的诱导多能干细胞（iPSC）来源人类星形胶质细胞的病毒产量检测，实验设计与Figure 2e一致。 （d-e）埃米卡森与PHA-690509联合使用的累加效应汇总：（d）感染寨卡病毒FSS13025株或MR766株的人类星形胶质细胞中，联合用药对caspase-3活性升高的抑制作用；（e）联合用药通过ATP含量检测反映的细胞活力改善效果。实验设计与Figure 1a一致。   05 小结 这篇论文之所以成为类器官领域的经典之作，不仅在于破解了Zika病毒的药物研发难题，更在于重新定义了类器官在生物医学研究中的核心价值： 1. 验证类器官的精准建模能力 研究证实，3D人脑类器官能完美复刻Zika病毒感染导致的“神经祖细胞减少、大脑体积缩小”等病理特征，其结果比2D细胞更贴近人体生理状态，这意味着类器官可作为“人体替代模型”，精准解析病毒对人类神经系统的致病机制，避免动物模型的物种差异局限。 2. 拓展类器官的高通量应用场景 此前类器官常被认为“操作复杂、难以规模化”，但本研究通过优化实验方案，将类器官整合进1536孔板的高通量筛选体系，证明类器官可用于大规模化合物筛选，这为其他复杂疾病（如神经退行性疾病、肿瘤）的药物研发提供了可借鉴的模板。 3. 搭建突发传染病应对的快速路径 面对Zika这类突发传染病，“类器官模型+药物重定位”的组合拳展现出惊人效率：短时间内完成化合物筛选、验证，并锁定具有临床转化潜力的候选药物，为全球公共卫生应急响应提供了新范式。 4. 为其他黄病毒研究提供参考 Zika病毒所属的黄病毒科还包括登革热病毒、西尼罗河病毒、寨卡病毒等，这些病毒均可能引发神经系统损伤。本研究发现的CDK抑制剂、Niclosamide等化合物具有广谱抗病毒潜力，为这类病毒的治疗药物研发提供了重要参考。 撰文 李蕊 审核 王子贤 排版 黄若琪 点击阅读原文，了解更多