HSP90B1

摘要：多发性骨髓瘤（MM）是一种以骨髓中浆细胞积累为特征的血液系统癌症。尽管治疗取得了进展，但大多数患者中的MM仍然无法治愈。与MM相关的免疫失调促进了疾病的进展，这促使研究者探索免疫疗法来对抗这种疾病。免疫疗法研究的一个领域是设计骨髓瘤疫苗疗法，以逆转与肿瘤相关的免疫抑制，并引发针对肿瘤的特异性免疫反应，有效地针对MM细胞。本文回顾了MM的疫苗免疫疗法，按抗原类型和递送方法对研究结果进行分类。抗原包括特异性抗原（Id）、肿瘤相关抗原（TAA）、肿瘤特异性抗原（TSA）和整个肿瘤裂解物。到目前为止，骨髓瘤疫苗在临床上显示出有限的疗效。然而，进一步的研究至关重要，以优化各个方面，包括抗原和患者选择、疫苗的时机和顺序，以及与新兴MM治疗的合理组合。 1.引言 多发性骨髓瘤（MM）是一种血液系统恶性肿瘤，其特征是克隆性浆细胞在骨髓（BM）中积累，并分泌单克隆免疫球蛋白，导致被称为CRAB（高钙血症、肾功能不全、贫血和骨病变）的特征性症状。尽管出现了许多新的治疗方法显著改善了治疗效果，但MM在很大程度上仍然无法治愈，对于大多数晚期患者来说，这种疾病仍然是致命的。越来越多的研究关注于利用宿主免疫系统针对MM细胞的免疫疗法。由于抗原呈递无效和效应细胞功能障碍，MM与免疫失调相关，创造了一个促进疾病进展的免疫抑制环境。研究的一个领域是设计骨髓瘤疫苗疗法。癌症疫苗接种是一种旨在激活免疫系统以识别和对抗癌细胞的治疗性方法。这些疫苗可以作为预防措施，称为预防性疫苗，或者作为已经诊断出癌症的个体的治疗选择，称为治疗性疫苗。任何癌症疫苗所针对的抗原的选择对其临床效果至关重要。肿瘤抗原被分为两大类：肿瘤相关抗原（TAAs）和肿瘤特异性抗原（TSAs）。TAAs是自身抗原，它们在肿瘤细胞中要么优先表达，要么异常表达，但也可能在正常细胞中以某种水平存在。TSAs，也称为新抗原，包括仅由癌细胞编码的抗原，并且是肿瘤特异性的，能引发高亲和力T细胞反应。疫苗被分为共享和个性化疫苗。共享抗原是公共抗原，可以由相对常见的人类白细胞抗原（HLA）等位基因在患者中呈递。这些疫苗是现成的免疫疗法的有希望的候选者。另一方面，个性化癌症疫苗由于高通量基因测序、质谱（MS）和生物信息学的进步而最近获得了更多的关注，这些技术使得能够识别HLA结合肽和预测独特的个性化新抗原。此外，癌症疫苗可以通过各种平台递送，如肽疫苗、RNA疫苗、DNA疫苗、病毒疫苗和抗原呈递细胞（APC）/树突细胞（DC）疫苗。如今，大多数正在临床研究中的疫苗涉及递送肿瘤抗原与佐剂或其他共刺激因子的组合。佐剂是癌症疫苗的重要组成部分，因为它们通过激活先天免疫途径来增强免疫反应。各种佐剂，如Toll样受体（TLR）激动剂和细胞因子被用来提高癌症疫苗的效果。有关癌症疫苗的更详细信息，请参考文献3-7。本文旨在回顾针对MM的疫苗免疫疗法的主要发现，根据抗原类型及其递送方式（无论是肽、蛋白质、DNA或DC基础疫苗）进行分类。讨论的肿瘤抗原包括特异性抗原（Id）、TAA、TSA和整个肿瘤裂解物。在MM中，恶性浆细胞分泌含有称为Id的肿瘤特异性抗原决定簇的单克隆免疫球蛋白（副蛋白）。Id是通过B细胞成熟和体细胞超突变期间的基因重排形成的。尽管Id抗原是TSA的一个子集，但由于研究针对骨髓瘤Id抗原的疫苗的历史意义，本综述中包括了对这些抗原的专门部分。 2.特异性疫苗 2.1.基于Id蛋白/肽或DNA的疫苗 Id疫苗的最初研究之一可以追溯到1995年Kwak等人的一项研究，他们用接受者血浆中的骨髓瘤免疫球蛋白免疫了一个健康的兄弟姐妹BM供体。检测到淋巴增殖反应，恢复了对骨髓瘤Id具有独特特异性的接受者CD4+ T细胞系，这证明了用Id免疫可能代表一种增强特异性抗肿瘤效应的新策略。后来，更多的研究调查了Id疫苗作为治疗策略的潜力。一组I-III期MM患者接受了用明矾作为佐剂的自体血清M组分的重复免疫。虽然在三名患者中成功，但引起的免疫反应幅度适中且短暂。随后的研究引入了免疫原性载体蛋白，如钥孔帽螺血蓝蛋白（KLH）或丝状噬菌体，单独或与粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）、白细胞介素（IL）-2、IL-12等佐剂一起使用，以增强Id蛋白的抗肿瘤免疫。尽管这些策略能够引起肿瘤特异性免疫反应，但临床反应适中。例如，在Osterborg等人的研究中，Id疫苗与GM-CSF一起用于五名II期MM患者。所有患者都发展了Id特异性T细胞免疫，但只有一名个体的M组分浓度显著降低。Massaia等人用KLH和低剂量的佐剂细胞因子GM-CSF或IL-2对接受高剂量化疗（HDT）后最小残留病（MRD）的患者进行了疫苗接种。在75%的患者中记录了特异性T细胞反应，但没有减少肿瘤负担。另一项研究探讨了在HDT和外周血祖细胞输注后的第一个缓解期使用与KLH结合的特异性蛋白和低剂量GM-CSF作为维持治疗。回顾性病例匹配分析显示，疫苗组和用干扰素（IFN）-α和/或地塞米松作为维持治疗的对照组之间的生存和无进展生存（PFS）持续时间相似。 在非随机的I期临床试验中，更多的努力被投入到研究基于Id DNA的疫苗，该疫苗编码患者特异性的单链可变片段，或将Id与破伤风毒素的片段C（FrC）链接。14名患者接受了至少在自体干细胞移植（ASCT）/高剂量治疗（HDT）后6个月开始的疫苗接种。在为期52周的研究期间，10名患者（71%）的血清副蛋白无法检测到、减少或保持稳定，而11名患者（79%）维持了持续的完全反应（CR）/部分反应（PR）。此外，对于13名患者，中位无进展生存期（TTP）为38.0个月。然而，由于之前的ASCT/HDT，很难区分疫苗效果和延迟治疗反应，因为在疫苗接种开始后，7名、6名和1名患者已经分别达到了CR、PR和稳定病状（SD）。在Qazilbash等人最近发表的一项研究中，采用了另一种Id疫苗接种策略。在这项随机的2期试验中，采用了初免和增强策略，通过收集已经用患者特异性Id-KLH在体内初免的T淋巴细胞，然后使用CD3/CD28磁珠在体外激活这些T细胞，并在HDT和自体造血干细胞移植（AHCT）后重新注入这些细胞，并随后增强剂量的指定疫苗。尽管疫苗引发了持续至+180天的强烈免疫反应，但与仅接种KLH的对照组相比，接种Id-KLH的组别在临床上没有益处。表1显示了使用Id蛋白/肽或基于DNA的Id疫苗的试验总结。 2.2.基于DC的Id疫苗 专业的APCs，DCs，在启动和调节先天和适应性免疫反应中发挥着关键作用。通过利用它们增强宿主效应器和记忆CD8 T细胞反应的能力，这些反应对于抗肿瘤免疫至关重要，DC疫苗已成为癌症免疫疗法的主要策略之一。DC疫苗首次在MM的Id抗原背景下进行了测试。历史上，基于Id的DC疫苗在MM试验中已经测试了十多年，但没有明确的临床益处。已经提出了几种优化方法，用于生成、给药途径和疫苗接种的时间。原始方法涉及从通过白细胞分离术收集的外周血液中分离DCs，随后进行密度梯度离心。随后，添加细胞因子，即GM-CSF和IL-4，成为培养要么粘附的单核外周血细胞，CD34+或CD14+细胞的标准实践。在Id脉冲后提出了各种成熟方案以增强有效性，包括单独暴露于肿瘤坏死因子α（TNF-α），TNF-α和IL1-B，CD40配体或TNF-α、IL-6、IL-1和前列腺素E2的组合。研究了不同的疫苗接种途径，包括皮下、皮内、静脉内和淋巴结内。在I/II期试验中，Curti等人比较了通过顺序皮下和静脉内途径的Id脉冲DCs。每位患者都作为自己的对照，接受顺序皮下和静脉内给药。结果表明，皮下给药诱导了更强的T细胞反应，表明其在引发免疫反应方面比静脉输注重建。此外，疫苗在不同的患者群体中进行了测试，包括晚期骨髓瘤患者，化疗后的患者，未经预处理的个体，在ASCT后肿瘤负担较低的患者和冒烟型骨髓瘤（SMM）。如上所述，尽管付出了巨大努力，基于Id的DC疫苗并未产生令人满意的临床结果。Wen等人在1998年进行的一项研究是对DC基础Id疫苗针对MM的首批试验之一，涉及一名43岁的晚期难治性骨髓瘤患者。通过一系列密度梯度离心从单核细胞中分离出DCs。尽管临床反应有限，但这项研究通过产生Id特异性免疫反应，证实了体外生成的骨髓瘤DCs的功能能力。后来，通过对DC生成的一些优化，通过培养粘附的单核细胞与GM-CSF和IL-4等细胞因子。在1999年，两名晚期难治性MM患者接受了用Id抗原和KLH装载的自体DC疫苗，并以GM-CSF作为佐剂。结果表明，两名患者都发展了Id特异性T细胞增殖反应，其特征是产生干扰素γ（IFN-g）。然而，在这两名病例中没有临床益处。尽管如此，考虑到这些患者患有晚期疾病，预计疫苗可能不会对这一特定群体产生最佳效果。因此，对免疫系统受损较小或肿瘤负担较低的患者群体进行了额外的试验，预期这可能会增强疫苗的效果。六名早期/早期复发的骨髓瘤患者接种了自体DCs（静脉内）准备如前述研究并装载Id抗原和KLH。然而，只有3名患者的Id血清水平稳定期，2名患者在疫苗接种后疾病进展。在另一项研究中，在26名预期肿瘤负担较低的患者中，在HDT和外周血祖细胞移植（PBPCT）后测试了基于DC的Id疫苗。值得注意的是，只有四名患者发展了Id特异性增殖性T细胞反应。这些免疫反应者中有三名在疫苗接种时处于CR状态。在移植后平均随访30个月，共有17名患者存活。这些发现表明，较低的肿瘤负担可能导致更好的免疫反应。然而，由于缺乏对照组进行比较，将这些结果完全归因于疫苗是具有挑战性的。还在未经治疗的I期患者中进行了基于DC的Id疫苗接种的调查。在这项试验中，九名患者接受了用Id和KLH脉冲的自体单核细胞衍生的DCs。疫苗在56%的患者中导致了T细胞增殖。与其他研究一样，临床反应适中，三名患者的M蛋白略有减少。 为了增强基于DC的Id疫苗的效力，对DC生成进行了优化。在早期的基于DC的疫苗接种研究中，未成熟的DCs被脉冲抗原。然而，未成熟的DCs激活T细胞的能力次优。因此，引入了在成熟诱导细胞因子存在下暴露于抗原的DCs。这首先在5名在HDT后稳定部分缓解的患者中进行了测试。此外，有人建议将给药途径从静脉内改为皮下，以克服与静脉内疫苗接种相关的潜在限制，例如DCs可能在肺、肝和脾等器官中的积累。即使对DC生成进行了修改，并将给药途径转移到皮下，临床效益仍然不明显。此外，将临床反应仅归因于DC疫苗仍然具有挑战性，特别是考虑到化疗/自体HCT后四个月开始的时机。 尽管探索了DC生成、给药途径、疫苗接种时机以及添加免疫原性载体蛋白/佐剂的优化，但未观察到显著结果。Bendandi等人假设缺乏临床意义可能是由于从MM患者获得的DC在数量和质量上的缺陷。因此，他们进行了一项试点研究，其中4名MM患者接受了异体树突细胞（alloDC）随后是Id-KLH。疫苗仅诱导了可检测的抗KLH效应T细胞和B细胞反应，而没有诱导针对肿瘤特异性Id的T细胞增殖。从临床角度来看，结果并不令人印象深刻，一名患者在停止疫苗接种后出现SD，而其中3名患者在研究随访期间进展。表2显示了在MM中使用基于DC的Id疫苗的试验总结。 3.肿瘤相关抗原 3.1.基于肽的TAA疫苗 尽管Id疫苗能诱导可检测的免疫反应，但未能显示出临床效力。这可能归因于高水平循环Id蛋白对T细胞的抑制作用，导致耐受性，以及Id蛋白本身是一个弱抗原的事实。作为Id疫苗的替代品，开发了具有TAA的疫苗。在临床、临床前和体外环境中研究了多种TAA在MM中的作用，如Mucin-1（MUC1）、透明质酸介导的运动受体（RHAMM）、B细胞淋巴瘤2（BCL-2）家族、Wilms肿瘤1（WT1）、X盒结合蛋白1（XBP1）、syndecan-1（CD138）、CS1（SLAM7）、癌症睾丸抗原（CTA）、Dickkopf-1（DKK1）、甲基丙二酸半醛脱氢酶（MMSA-1）、热休克蛋白（HSP）、端粒酶逆转录酶（hTERT）和Survivin。表3显示了在MM中使用TAA作为抗原的试验总结。 糖蛋白MUC1存在于包括MM在内的各种癌症中。ImMucin，一种21肽合成长肽疫苗，在15名骨髓瘤患者的I/II期研究中进行了测试。ImMucin诱导了显著的T细胞反应，并增加了针对MUC1的抗体滴度。然而，临床效力次优，中位PFS为17.5 ± 3.9个月。 RHAMM衍生的肽R3在I/II期研究中作为另一种潜在的血液学恶性肿瘤的免疫原性抗原进行了调查，包括MM。在10名HLA-A2阳性患者中进行的300 mg疫苗的初步研究，包括4名MM患者，显示出积极的临床和免疫学反应。在接受300 mg疫苗的MM患者中，3/4显示出特异性CD8+ T细胞增加，2/4显示出克隆标记减少。然而，有限的样本量需要谨慎得出明确结论。 BCL-2家族蛋白在1期试验中作为MM的另一个靶标抗原进行了研究。复发的MM患者接受了与montanide ISA-51作为佐剂混合的Bcl-2、Bcl-XL和Mcl-1肽的疫苗接种，以及bortezomib。由于肽HLA限制，患者根据他们的HLA-A阳性性接受肽，即HLA-A1、HLA-A2和/或HLA-A3。在7名患者中，3名显示出与基线（疫苗接种前）相比的疫苗诱导的肽抗原特异性T细胞反应。然而，小样本量阻碍了对临床效力的结论性评估。与儿童肾肿瘤Wilms肿瘤相关的WT1基因，作为癌基因和某些正常细胞过程的关键组成部分，发挥着双重作用。它在造血恶性肿瘤和实体癌中高度表达，包括骨髓瘤，其表达随着疾病进展而增加。研究已经鉴定了WT1中的各种表位，可以以人类HLA限制的方式引发WT1特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）反应。因此，基于WT1肽的免疫疗法可能是恶性疾病患者的一个选项。在Tsuboi等人的案例研究中，一名57岁的耐化疗MM患者每周接受HLA-A*2402限制的9肽WT1肽和montanide ISA51作为佐剂的皮内疫苗接种。疫苗接种后，骨髓癌细胞减少了60%，尿液M蛋白水平从3.6降至0.6 g/天。此外，C-X-C趋化因子受体类型（CXCR）4阳性细胞有显著变化，表明WT1特异性CTLs有效地迁移到肿瘤部位。 为了应对单一抗原肽疫苗的局限性，包括潜在的抗原逃逸和目标抗原的下调，还研究了多肽疫苗。PVX-410是一种基于肽的疫苗，由来自XBP1、CD138和CS1三个不同抗原的4个9肽组成。在一项研究中，22名中度至高风险HLA-A2阳性的SMM患者接受了PVX-410皮下注射和佐剂poly-ICLC，有或没有lenalidomide。PVX-410一致地产生了特定、持久的免疫反应，特别是与lenalidomide一起使用时。然而，总体临床反应仍然适中。单独使用时，所有患者的最佳反应为SD，其中5/12在12个月内进展。在联合治疗组中，一名患者实现了PR，四名患者有最小反应或SD。 DKK1、MMSA-1和HSP作为TAA被研究，它们有潜力作为针对MM的疫苗疗法。DKK1，一个Wingless相关整合位点（Wnt）/β-连环蛋白信号抑制剂，能诱导肽特异性CTLs，这些CTLs能识别并溶解表达HLA-A0201的骨髓瘤细胞。MMSA-1是一种在MM细胞中特异表达的膜蛋白。当与DKK1结合在疫苗中时，它以HLA-A0201限制性方式增强CTL反应，改善存活，并在临床前模型中减轻骨破坏。肿瘤细胞衍生的HSPs，如gp96，已被作为小鼠骨髓瘤的TAA进行研究。来自已建立的小鼠骨髓瘤细胞系的混合HSPs，显示出作为现成疫苗的潜力，有效治疗具有大骨髓瘤肿瘤负担的小鼠，HSP与抗B7H1或抗-IL-10单克隆抗体结合使用。然而，需要进一步的研究来确认它们在临床环境中的效力。 此外，最初在黑色素瘤患者中发现的CTA抗原，由于在正常组织上的有限表达，成为免疫疗法的靶点。Andrade等人的研究表明，骨髓瘤细胞上表达超过六个CTA抗原具有预后价值，与MM患者的较短总生存期（OS）相关。像NY-ESO-1、LAGE-1、MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3和MAGE-C1（CT-7）这样的突出CTA抗原已显示出刺激T细胞反应的潜力，使它们成为癌症免疫疗法的候选者。在CTA抗原中，MAGE-A3已在临床环境中进行了测试。在一个案例研究中，一个健康的捐赠者，即患者的同卵双胞胎，用MAGE-A3蛋白和AS02B作为佐剂进行免疫。在同种异体外周血干细胞移植后，将 primed捐赠细胞转移到患者体内。随后，患者接受了额外的MAGE-A3免疫接种，以及第二次外周骨髓单个核细胞输血。MAGE-A3免疫接种耐受性良好，并在两个双胞胎中产生了强大的MAGE-A3特异性抗体、CTLs和T辅助细胞反应。有趣的是，CTL反应针对一个以前未知的HLA-A*6801结合MAGE-A3肽，该肽在最后一次免疫接种后在患者体内保持可检测超过一年。检测到多个T辅助细胞反应，主要反应针对HLA-DR11限制的MAGE-A3表位。令人鼓舞的是，患者在第二次移植后2.5年仍处于缓解状态。这个案例研究表明，这种个性化的免疫治疗方法对MAGE-A3阳性MM患者具有潜在的疗效。在另一项II期研究中，评估了使用MAGE-A3多肽疫苗结合Poly-ICLC和GM-CSF在体内初次免疫，然后体外扩增的自体T细胞的安全性和效力，在27名骨髓瘤患者中。疫苗包括两个HLA-A2限制的类I表位和一个多类II表位。结果显示，在8名可评估的HLA-A2+患者中有7名检测到MAGE-A3特异性CD8 T细胞。此外，在25名患者中有19名产生了能产生细胞因子的疫苗特异性T细胞。2年OS为74%，2年无事件生存期（EFS）为56%。Cohen等人进行了类似的研究，其中13名MM受试者在接受ASCT前后以及早期SCT后疫苗初次自体淋巴细胞输注，接受了重组MAGE-A3和AS15免疫刺激剂。组合免疫疗法在所有受试者中产生了高滴度的体液免疫和持久且强大的抗原特异性CD4+ T细胞反应。然而，中位PFS为27个月，中位OS未达到，表明与标准护理没有差异。 在临床前环境中测试的其他CTA已被建议作为MM的可能免疫疗法靶点。自发的NY-ESO-1抗体和特异性CD8+ T细胞已在NY-ESO-1阳性MM病例中体内检测到。在临床前模型中，研究了一种名为NACH的复杂疫苗，该疫苗基于NY-ESO-1-alum-CpG ODN-HH2。NACH疫苗中使用的Alum-CpG ODN-HH2组合佐剂是一种新型免疫佐剂。疫苗在小鼠MM的预防和治疗模型中显示出有希望的抗肿瘤效果和免疫原性。NACH疫苗抑制了肿瘤生长，在小鼠中显著延长了存活时间。在治疗模型中，接受NACH疫苗的10只肿瘤小鼠中有7只存活至第90天，而对照组的所有小鼠在40天内死亡。LAG-1a是另一个在MM患者中经常表达的CTA抗原，与NY-ESO-1共享高mRNA序列相似性。In silico分析确定了在LAG-1a和NY-ESO-1中存在的七个肽段，这些肽段被不同肿瘤的T淋巴细胞识别。因此，假设针对NY-ESO-1的疫苗可能对表达LAG-1a但不表达NY-ESO-1的肿瘤的MM患者有益。MAGE-C1、SPAN-Xb和SP-17是其他能够引发CTL反应的CTA抗原，使它们成为基于疫苗的免疫疗法MM的靶点。 与Id疫苗类似，基于肽的肿瘤-TAA疫苗的实际应用到临床实践中尚未发生。Rapoport A.P等人的研究比较了54名MM患者中称为hTERT的端粒酶复合体的限速催化亚单位和抗凋亡蛋白Survivin作为目标抗原疫苗与肺炎球菌结合疫苗的免疫原性。HLA-A2阳性的患者（包括任何A2等位基因）被分配到A组，他们接受了hTERT/Survivin疫苗。研究表明，尽管这种多肽肿瘤抗原疫苗的免疫反应频率高于报道的Id疫苗，但TAA仍未达到微生物疫苗所诱导的水平。这表明，为了获得显著的长期临床益处，可能需要对癌症疫苗产生更大规模的免疫反应。 3.2.基于DC的TAA疫苗 使用与肿瘤相关抗原(TAA)相关的基于树突状细胞(DC)的疫苗也被视为替代Id抗原的选择。对12名至少接受了诱导化疗和造血细胞移植/自体造血干细胞移植(HCT/ASCT)后获得最小部分缓解(PR)的II期或III期骨髓瘤患者进行了疫苗接种。通过电穿孔法用MAGE3、Survivin和BCMA装载粘附的CD14+细胞生成DCs，并与或不与KLH一起脉冲。值得注意的是，所有患者都产生了强烈的抗KLH T细胞反应，这表明在高剂量美法仑治疗后免疫恢复，并且在两名患者的迟发型超敏反应活检中检测到了疫苗特异性T细胞。在最后一次随访时，12名患者中有10名在第一次接种后平均25个月（范围9-53个月）仍然存活。在这些患者中，5名病情稳定(SD)，5名病情进展。在另一项研究中，进行了DC的mRNA电穿孔，使用装载有CT7、MAGE-A3和WT1的朗格汉斯DC。这些从CD34+造血前体细胞衍生的朗格汉斯型DC被认为是体外对肿瘤抗原的CTLs更具潜力的刺激因子，与单核细胞衍生的DC相比。患者被随机分配在ASCT后100天内接受疫苗或被放置在没有疫苗的对照组。虽然该研究没有足够的能力来评估临床疗效，但治疗反应倾向于接受疫苗的组。在最近发表的一项研究中，Locke及其同事设计了一种针对抗凋亡蛋白Survivin的基于DC的疫苗，在1期临床试验中。通过腺病毒载体工程化DCs以表达包含两个突变的全长Survivin版本(Ad-S)，这些突变中和了野生型Survivin的抗凋亡功能。13名新诊断的MM患者，他们没有通过诱导治疗获得CR，接种疫苗的时间是在干细胞收集前7到30天，以及在ASCT后20到34天。疫苗与ASCT联合使用耐受性良好，仅观察到轻微的不良反应。值得注意的是，85%的患者表现出针对Survivin的T细胞反应或抗体反应。7名患者在第+90天表现出增强的临床反应，所有这些都与Survivin特异性免疫反应相关。令人印象深刻的是，在平均4.2年的随访后，这7名患者中有6名保持无病状态。估计的四年无病生存(PFS)为71%，超过了IFM 2009试验的历史数据，该数据大约为4.1年时PFS为50%，针对这类患者群体。Survivin已成为MM中一个显著的TAA。在8项正在进行的MM试验中，有两项专注于开发针对Survivin的疫苗。其中一种疫苗名为TXSVN，它使用了一种减毒的活沙门氏菌株，经过遗传改良以产生Survivin。第二种疫苗是一种基于肽的配方，称为SVN53-67/M57-KLH，源自Survivin蛋白(表4)。 4.肿瘤特异性抗原 4.1.基于肽的TSA疫苗 尽管某些关于TAA的研究显示出希望，但由于每个临床试验中患者数量有限，总体评估具有挑战性。需要对更大的队列进行进一步研究，以得出关于基于TAA的免疫疗法疗效的确定性结论。此外，由于它们作为非突变的自身抗原的地位，一般来说TAA可能表现出低免疫原性，这归因于中枢T细胞耐受的影响。因此，TSA，也称为新抗原，似乎是疫苗免疫疗法的另一种靶标抗原。癌细胞中的体细胞突变可以产生新的蛋白质序列，这些序列可以被APCs作为新抗原呈现给宿主免疫系统。肿瘤新抗原是免疫疗法的极好靶标，因为它们在癌症组织中特异性表达。通过下一代测序，在184名MM患者中识别出的新抗原景观，揭示了在复发患者中的NRAS、KRAS和干扰素调节因子4(IRF4)基因中共享的新抗原，以及在新诊断患者中的KRAS，支持在具有此类突变的MM患者中使用基于新抗原的疫苗的可能性。在MAPK途径中的扰动，特别是KRAS、NRAS和BRAF中的突变，在相当一部分MM病例中观察到，RAS突变在多达70%的复发/难治性病例中被检测到。这些与MAPK激活相关的突变，可能会影响预后，有助于从前期状况向骨髓瘤的转变，以及从髓内到髓外疾病的转变，随着疾病的进展，其患病率越来越高。针对共享的新抗原，如与RAS突变相关的新抗原，正在临床试验中探索，例如我们小组正在进行的研究，使用TG01癌症疫苗在高风险SMM或MM患者中(表4)，在≥1线治疗后有可测量疾病。TG01由7种合成肽组成，模仿RAS蛋白的突变形式，在胰腺癌患者中显示出有希望的结果。TG01研究的主要终点是安全性，关键的次要终点包括对疫苗的免疫反应、总体反应率、OS和PFS。 另一种基于新抗原的疫苗是PGV-001。PGV-001是一种个性化的基因疫苗，针对基于患者HLA分型的多达10个预测的个人肿瘤新抗原。在辅助治疗环境中测试了PGV-001，包括3名接受了ASCT的MM患者在内的13名多种癌症类型的患者。疫苗肽在27周的过程中与聚肌胞（poly-ICLC）和破伤风辅助肽一起给药。一名患者失去了随访，但在剩下的12名患者中，平均随访了925天，其中四名没有疾病证据，四名接受了后续的治疗线，四名已经去世。值得注意的是，只有两名去世的患者有记录的恶性肿瘤复发。这篇摘要中没有描述患者的详细信息以及他们中哪些是MM患者。免疫监测免疫原性正在进行中。然而，初步分析表明诱导了针对新抗原的CD4和CD8 T细胞扩增。 如前所述，TSA由于缺乏胸腺选择和中枢耐受，可以激活高亲和力T细胞。尽管对Id有显著的关注，但由于其在骨髓瘤中的丰富性，显示出有限的临床疗效，对骨髓瘤中除了Id之外的其他新抗原的研究仍然有限。进一步的研究对于评估它们作为骨髓瘤疫苗治疗中的靶标抗原的潜力至关重要。 5.整个肿瘤抗原 5.1.基于DC的疫苗 单一抗原特异性疫苗容易受到因抗原表达下调而导致的免疫逃逸的影响。或者，也探索了整个细胞靶标作为一种策略，该策略寻求建立多克隆免疫反应。这样的疫苗可能包括广泛的抗原，包括新抗原。这在骨髓瘤中特别相关，因为存在大量的肿瘤突变负担。对664名新诊断的骨髓瘤患者的研究发现，每个患者的平均体细胞和错义突变负荷分别为405.84和63.90个突变。突变和新抗原负担之间存在正相关。此外，高剂量美法仑治疗，这是ASCT前的标准治疗，与高突变负担相关，并且可能在骨髓瘤患者的复发时有更多的新抗原。 Rosenblatt等人通过化学融合患者衍生的骨髓瘤细胞与自体DCs开发了一种肿瘤疫苗。这种疫苗的优势在于可能在DC介导的共刺激的背景下呈现多样化的骨髓瘤相关抗原。融合细胞是通过将DCs和骨髓瘤细胞与聚乙二醇共培养而创建的。在17名患者中测试了DC融合疫苗，其中大多数患有晚期疾病。疫苗接种耐受性良好，并在大多数评估的患者中导致与患者自己的骨髓瘤细胞反应的淋巴细胞扩增，以及记录的体液反应。晚期疾病的患者经历了疾病稳定，三名患者在12、25和41个月时分别显示持续的SD。在当前研究中，调节性T细胞水平在疫苗接种期间保持稳定。同一疫苗在ASCT后的患者中进一步测试，假设自体移植为融合疫苗提供了一个最佳环境，因为肿瘤细胞减少和调节性T细胞耗竭导致的免疫环境增强。该研究取得了有希望的结果，47%的患者实现了CR/近CR（nCR）作为最佳反应，78%的患者至少实现了VGPR。值得注意的是，近35%的CR发生在移植后超过100天，在接种疫苗后。尽管可能会观察到化疗的延迟效应，但在没有维持治疗的情况下，大量的晚期反应可能暗示了疫苗介导的效应。基于这些结果，该团队被鼓励检查融合疫苗与来那度胺作为自体HCT后维持治疗的联合疗效。然而，与来那度胺一起的DC/MM融合疫苗接种并没有在移植后1年显著增加CR率，但与循环MM反应性淋巴细胞的显著增加相关，这表明了肿瘤特异性免疫。该团队进行了另一项临床试验，涉及接受自体移植的MM患者，他们在接受DC/骨髓瘤融合细胞疫苗后接受了抗程序性细胞死亡蛋白1（PD-1）抗体（Pidilizumab）的联合治疗，目的是克服肿瘤细胞逃避宿主免疫的免疫抑制环境。这项试验涉及22名患者，并表明这种组合可以诱导抗肿瘤免疫反应，并且在一部分患者中，在移植后完全根除可测量的疾病。移植后，调节性T细胞水平显著下降，并在整个免疫治疗期间保持低水平。六名患者达到了VGPR的最佳反应，六名患者达到了nCR/CR。从移植起的中位PFS为19个月，随访正在进行中（表4）。其他整个细胞裂解物，如GVAX和DCOne疫苗，作为现货疫苗进行了测试，具有多样化的抗原库。MM-GVAX是一种疫苗，其中两个已建立的异质性骨髓瘤细胞系，H929和U266，与K562细胞系（GVAX®）一起给药，该细胞系被改造为过表达GM-CSF。H929表现出t(4;14)，并且NRAS突变，U266涉及BRAF和TP53途径的几个突变。注册的患者血清/尿液免疫固定阳性，并维持了至少4个月的nCR。在2021年的出版物中，15名患者中有8名（53.3%）加深了治疗反应并实现了真正的CR。中位OS为7.8年。MM-GVAX触发了克隆T细胞扩增和细胞因子反应，在所有患者中持续了长达7年。这项试验正在进行中（表4）。 DCOne是另一种现成的肿瘤疫苗，它源自人类急性髓系白血病（AML）细胞系，可以分化为完全功能的DCs的表型，并内源性地表达肿瘤相关抗原（TAA）。这些抗原与HLA分子以及对T细胞激活至关重要的各种共刺激分子一起呈现。尽管最初作为AML的癌症疫苗进行工程化，DCOne表达的肿瘤抗原也存在于包括MM在内的多种血液系统恶性肿瘤中。使用DCOne疫苗治疗MM导致激活的CD8+ T细胞扩增，这些细胞表达干扰素-γ和穿孔素。此外，将患者的肿瘤细胞与外周血单个核细胞和DCOne共培养，诱导了针对自体MM细胞的细胞毒性T淋巴细胞介导的杀伤，突出了DCOne在骨髓瘤治疗中的潜力。表5显示了使用整个肿瘤抗原治疗MM的试验总结。 6.结论和未来展望 尽管进行了广泛的研究，肿瘤疫苗尚未纳入骨髓瘤治疗。多年来，主要的研究重点是Id疫苗，这些疫苗偶尔产生免疫反应，但临床效果有限。随后的调查在临床试验中探索了不同的抗原靶标。然而，在早期试验中对各种抗原进行广泛测试，并限制了患者群体，这在建立明确结论方面带来了挑战。此外，即使在同一类型的抗原研究之间进行直接比较，也会因患者特征（如年龄、细胞遗传学/风险因素）的差异以及疫苗接种时的疾病阶段而受到阻碍。此外，许多疫苗研究是在化疗构成标准治疗的时期进行的，更多关注使用疫苗单独来根除肿瘤。然而，将疫苗接种与新建立的治疗方法（如IMiDs、蛋白酶体抑制剂和新一代免疫疗法，如嵌合抗原受体T（CAR-T）细胞和双特异性抗体）结合起来，尚未得到解决。 总的来说，疫苗的复杂性以及骨髓瘤作为疾病的复杂性，为将疫苗整合到骨髓瘤治疗策略中带来了挑战。疫苗治疗是复杂的，需要彻底的实验。这包括选择肿瘤抗原、制定疫苗、确定传递工具，决定给药途径和频率、确定疫苗接种的时间，以及考虑骨髓瘤肿瘤微环境的复杂性（图1）。优化所有这些因素可能是提高临床效果的必要条件。 图1：疫苗设计考虑因素。MM（多发性骨髓瘤）骨髓微环境由包括MDSCs（髓系来源的抑制细胞）、TAM（肿瘤相关巨噬细胞）和Tregs（调节性T细胞）在内的免疫抑制元素组成。MDSCs通过IL-10刺激TAM和Tregs。MDSCs还通过IL-10抑制CTLs（细胞毒性T淋巴细胞）。Tregs通过直接的细胞间相互作用以及通过分泌抑制性细胞因子，如TGF-b和IL-10，来抑制CTL和DC（树突状细胞）的功能。此外，MM细胞分泌包括IL-6、TGF-b和IL-10在内的多种细胞因子，这些因子抑制DCs、CTLs并刺激Tregs。多发性骨髓瘤患者表达多种免疫检查点受体，包括PD-1、CTLA-4、TIM-4、LAG-3、TIGIT。末端T细胞耗竭与CD4+和CD8+ T细胞亚群失去细胞毒性相关，这些细胞亚群产生IFN-g，这是肿瘤免疫的关键细胞因子。MM，多发性骨髓瘤；MGUS，未定意义的单克隆丙种球蛋白病；SMM，隐匿性MM；BM，骨髓；DC，树突状细胞；BMSC，骨髓基质细胞；CTL，细胞毒性T淋巴细胞；MDSCs，髓系来源的抑制细胞；TAM，肿瘤相关巨噬细胞；Treg，调节性T细胞；PD-1，程序性细胞死亡蛋白1；CTLA-4，细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4；TIM-3，T细胞免疫球蛋白黏蛋白-3；LAG-3，淋巴细胞激活基因3；TIGIT，T细胞免疫球蛋白和ITIM结构域；白细胞介素（IL）-10；TGF-b1，转化生长因子-b1；TAA，肿瘤相关抗原；TSA，肿瘤特异性抗原。部分图表使用了/改编自Servier Medical Art（Servier；https://smart.servier.com/）提供的图片，该图片在Creative Commons Attribution 4.0 Unported License（https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/）下授权使用。 6.1.抗原选择 理想情况下，靶标抗原必须具有免疫原性，在肿瘤中高度表达，在正常组织中低表达或不存在，并且具有肿瘤特异性，以避免脱靶效应。包括Id、TAA和TSA在内的几种抗原已在骨髓瘤研究中进行了探索。尽管努力增强它们的免疫原性，特别是通过将疫苗接种与免疫原和佐剂结合，但临床效果并不显著。对Id以外的TSA的研究仍然有限。预测TSA作为靶标既耗时又昂贵，需要先进的方法来预测能够引发新抗原特异性T细胞反应的新抗原。此外，准确的HLA分型对于可靠地预测免疫原性抗原和提高治疗效果至关重要，这为疫苗开发增加了另一层复杂性。这是由于人类HLA等位基因的多态性，涵盖了超过24,000个独特的基因复合体。尽管使用表达多种抗原的特定于患者的疫苗（如整个肿瘤裂解物）有很强的理论基础，但可能存在随着时间推移重新建立肿瘤耐受性，促进疾病进展的潜在担忧。这可能部分解释了整个肿瘤裂解物疫苗在骨髓瘤临床环境中采用的延迟。肠道微生物群抗原具有固有的强烈免疫原性属性，但在骨髓瘤研究中仍然是一个未被探索的领域。TAA和微生物抗原之间存在高度相似的抗原表位，表明可能存在强大的交叉反应性CD8+ T细胞反应。具体来说，由特定微生物抗原诱导的T细胞记忆可能转化为抗癌症T细胞记忆，对癌症生长进行长期控制。例如，在MAGE-A10和巨细胞病毒之间观察到的分子模拟。这一发现为探索骨髓瘤相关TAA和微生物抗原之间的交叉反应性开辟了途径，为提高骨髓瘤疫苗治疗的效果提供了新的见解。 6.2.疫苗传递平台 基于肽的疫苗接种已成为引发抗肿瘤T细胞反应的有希望的方法。然而，其有效性仍然有限，即使肽与强大的佐剂共传递时也是如此。这可能归因于DC的功能失调，DC在影响抗肿瘤免疫的质量和数量中起着重要作用。因此，通过基于DC的肽方法传递肿瘤抗原正被认识到作为一种潜在的癌症免疫治疗策略。 自从DC在骨髓瘤治疗中的使用开始以来，许多研究都集中在优化DC生成上，特别是使用 idiotype 作为抗原来源。一些研究表明，来源于CD34+造血前体细胞（HPC）的朗格汉斯型DCs在刺激CTL方面比单核细胞来源的DCs更为有效。然而，它们在骨髓瘤研究中的临床应用仍然有限。此外，对来源于骨髓瘤患者的DCs的体外生成也进行了巨大关注。Shinde等人从MM和健康供体样本中生成了DCs。尽管MM-DCs和健康供体衍生的DCs都显示出成熟的表型，但MM-DCs表现出较低的迁移能力和细胞因子分泌，使它们在诱导抗MM反应方面效果较差。此外，正在探索通过各种方法增强向DCs传递抗原的努力。这些包括用抗原肽库脉冲DCs，并采用基因编辑技术，如电穿孔、脂质纳米颗粒或病毒载体来改善抗原呈递。COVID-19大流行导致mRNA疫苗的显著进展，为它们在抗肿瘤治疗中的应用提供了机会。这些疫苗提供了强大的细胞和体液免疫，超越了传统的病原体或基于蛋白的疫苗。此外，mRNA疫苗提供了诸如快速开发、安全性、较少的副作用和灵活性等优势，从而促进了个性化疫苗策略的实施，特别是在TSA的背景下。mRNA疫苗用于抗原传递代表了一种新颖的方法，值得研究其在骨髓瘤治疗中的潜力。 6.3.给药途径和接种的最佳时间 给药途径和接种的最佳持续时间仍然是正在进行的辩论主题，临床试验中的比较不足。在骨髓瘤中被忽视的另一个因素是肿瘤疫苗接种的时机。在大量已发表的临床研究中，疫苗在系统性抗癌治疗后不久被给予。这个时机带来了挑战，因为自然免疫可能在疫苗接种时被化疗抑制。一个在许多试验中探索的建议方法是在ASCT后接种疫苗的潜在益处，特别是在达到深度反应状态时。在这个阶段的细胞免疫部分的植入提供了形成抗肿瘤免疫的机会。然而，这种方法的挑战包括延迟的免疫重建，T细胞数量至少需要3个月才能恢复正常，导致对疫苗治疗的反应次优。为了解决这个问题，一些研究已经研究了ASCT前疫苗接种，然后在淋巴耗尽环境中早期进行疫苗启动的T细胞转移。然后进行移植后增强疫苗接种以扩大疫苗特异性T细胞。尽管做出了这些努力，但这种策略并没有产生有利的临床结果。然而，这些研究是有限的，需要更多的调查才能得出任何结论性结果。另一种潜在的方法是针对疾病早期阶段的患者，特别是那些具有未定意义的单克隆丙种球蛋白病（MGUS）或SMM的患者。然而，实施这一策略将需要治疗大量患者并进行长期随访以建立临床效益。到目前为止，缺乏支持这一假设的结论性研究。目前有三项正在进行的试验正在研究SMM患者的疫苗，包括我们的针对RAS突变的TG-01研究、PVX-410（来自XBP1、CD138和CS1的多肽癌症疫苗）和由个人的血液和骨髓制成的个性化癌症疫苗（表4）。 6.4.疫苗外源性因素 疫苗外源性因素，包括肿瘤微环境和骨髓瘤中宿主免疫反应的功能障碍，强调了引发有效免疫反应的复杂性。骨髓瘤肿瘤微环境由免疫抑制细胞群组成，包括髓系来源的抑制细胞、调节性T细胞和肿瘤相关巨噬细胞。此外，不充分的抗原呈递、对自然杀伤（NK）细胞溶解的抵抗力、T细胞耗竭和/或衰老，与ASCT后较差的结果相关，并特征化为多次复发疾病。骨髓瘤衍生的细胞因子，如转化生长因子（TGF）-b、IL-6和IL-10，有助于免疫功能障碍。此外，由于与年龄相关的免疫系统变化导致的T细胞无反应性，疫苗的有效性随着年龄的增长而降低。这对于平均诊断年龄为70岁的骨髓瘤来说尤其重要。另一个在骨髓瘤患者中很少研究的外源性因素是肠道微生物群对肿瘤疫苗效力的潜在影响。Radojevic等人通过分析14名健康供体的粪便微生物群组成以及单核细胞衍生的DCs的表型和产生的细胞因子，报告了肠道微生物群组成与DCs的免疫原性之间的相关性。Calcinotto等人的另一项研究表明，Prevotella heparinolytica促进了定居在肠道并迁移到转基因Vk*MYC小鼠骨髓的Th17细胞的分化，在那里它们有利于MM的进展。这个主题是复杂的，因为许多因素可能影响肠道微生物群，包括通常给予骨髓瘤患者的抗生素治疗。 6.5.疫苗与新一代疗法的结合 需要注意的是，大多数肿瘤疫苗单独使用并不能直接消除肿瘤病灶，但肿瘤疫苗在消除微小残留病（MRD）方面具有潜在的前景。因此，需要进一步的试验来定义疫苗在新的药理疗法时代的角色，如免疫检查点抑制剂（ICI）、抗体药物偶联物、双特异性抗体和CAR-T细胞。这些治疗的持久反应不频繁，但与疫苗结合的策略可以增强反应或消除MRD。例如，疫苗与ICI的结合似乎是一种合理的途径，但在缺乏明确改善疗效信号的情况下，安全性问题已成为ICI在MM临床应用的主要障碍。在双特异性抗体构建之前进行疫苗接种，可以通过创建抗原经验丰富的T细胞池来增强治疗效力。疫苗还可以促进嵌合抗原受体T细胞的扩增和效力。此外，值得注意的是，尽管双特异性抗体和CAR-T目前在MM免疫疗法领域占据主导地位，但癌症疫苗提供了独特的优势。与主要针对细胞表面肿瘤特异性抗原的CAR-T细胞或双特异性抗体不同，癌症疫苗有潜力针对细胞内抗原。这种能力提供了解决更广泛肿瘤抗原的机会。 6.6.结论 总之，尽管迄今为止针对MM的疫苗接种尚未取得令人印象深刻的临床结果，但有必要进一步研究，重点关注选择合适的抗原、患者群体、优化疫苗的时机和序列，以及确定合理的组合。这些元素与其他针对肿瘤微环境免疫抑制活性的免疫干预措施相结合，可能会带来更大的益处，并实现改善和持久的临床反应。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

在生物制药的灌流生产过程中，中空纤维过滤器的污染问题一直是业界面临的挑战。尽管过滤器污染的成因复杂且难以捉摸，本研究致力于揭示细胞培养介质中特定成分——特别是中国仓鼠卵巢 (CHO) 细胞释放的细胞外囊泡——在这一现象中扮演的角色。我们的研究发现，灌流过程中产生的直径介于 50 至 200 纳米的 CHO 源性小细胞外囊泡 (sEV) 的数量减少，往往预示着跨膜压 (TMP) 的升高和产品筛分效率的下降，这暗示 sEV 可能在过滤器内部积累，进而导致污染。 利用扫描电子显微镜和氦离子显微镜的观察，我们在中空纤维切向流过滤过滤器 (HF-TFF) 的膜孔隙和污染区域发现了类似 sEV 的结构。此外，我们还发现，在灌流培养的第 28 天，TMP 的升高与污染区域的面积百分比存在正相关性。通过能量色散 X 射线光谱分析，我们进一步确认了污染斑块中富含细胞成分，但并未检测到消泡剂的存在。荧光染色的实验结果进一步揭示了这些细胞成分可能包括 DNA、蛋白质，甚至是贴壁的 CHO 细胞。 在小规模的 HF-TFF 模型中，我们通过向 CHO 培养基中添加特定浓度的 CHO 特异性 sEVs，模拟了过滤器污染的行为。基于这些实验结果，我们提出了一种可能的 HF-TFF 污染机制：CHO sEVs 导致滤孔收缩，随后细胞物质在滤膜表面形成滤饼，从而引发污染。 中国仓鼠卵巢 (CHO) 细胞因其卓越的生产能力和能够执行类似人类的翻译后修饰，如糖基化，而在生物制药行业中被广泛用作宿主细胞。传统上，CHO 细胞培养主要采用批次或补料分批模式，但近期，连续灌流培养因其潜在的单位体积生产率提升、产品质量改善和成本降低而受到重视。在这种灌流培养模式中，细胞截留装置，如切向流过滤 (TFF) 或交替式切向流 (ATF) 中空纤维过滤器，被用来实现新鲜培养基的连续补充和含产物废培养基的移除（见图 1a）。然而，这些系统可能会遇到过滤器污染问题，这不仅影响产品筛分效率，还可能导致生产过程提前终止。 先前的研究指出，微滤膜能够截留与其孔径相匹配的颗粒，而直径约 100 nm 的颗粒被认为是导致工业级 0.2 μm 中空纤维过滤器污染的元凶。尽管如此，这些颗粒的具体性质尚未得到明确。最近的研究通过低倍横截面扫描电子显微镜 (SEM) 图像和能量色散 X 射线光谱 (EDS) 分析，揭示了 ATF 过滤器中蛋白质物质在中空纤维内腔表面的沉积，这是造成过滤器污染的原因之一。 此外，CHO 细胞释放的细胞外囊泡 (EV)，这些含有蛋白质、RNA 和 DNA 的膜包裹颗粒，大小范围从 50 到 1000 nm 不等。基于这些发现，我们提出一个假设：CHO EV 可能是引起中空纤维过滤器污染的关键因素。 图1. 四个灌流生物反应器中表达 mAb 的 CHO 细胞系的过滤器污染情况。（a）典型的 3 L 台式灌流生物反应器设置。四个 3 L 灌流生物反应器使用相同的表达 mAb 的 CHO 细胞系运行。显示了这些生产批次的 (b) VCD、(c) 活性、(d) TMP 和 (e) 产物筛分百分比。(d) 和 (e) 中的虚线表示过滤器污染（TMP ≥ 1.5 psi，产物筛分 ≤90%）。 细胞外囊泡（EV）是细胞分泌的小型膜囊泡，它们作为信号传递的多功能复合体，在细胞和生物体内多种基本功能中扮演着关键角色。EV 可以根据其大小和来源分为小细胞外囊泡（sEV）和大细胞外囊泡（lEV）。sEV，尺寸通常在 50 至 200 纳米之间，是由细胞内部的内陷形成的多囊泡结构。而 lEV，包括凋亡过程中产生的 EV，尺寸较大，范围在 200 至 1000 纳米，它们直接由细胞膜起泡形成。 在生物制药领域，中国仓鼠卵巢（CHO）细胞产生的 EV 浓度随着培养时间的延长而增加。有研究显示，将从 CHO 细胞培养中分离出的 EV 添加回培养基，能够抑制细胞凋亡并促进细胞生长。我们最近对 CHO 细胞源性的 sEV 和 lEV 中的 mRNA 和 miRNA 含量进行了详细分析。我们发现，与氧化磷酸化相关的 mRNA 在 lEV 中显著富集，而与细胞增殖、活性和生长相关的信号通路，如 TGFβ 和 PI3K/Akt 通路，其对应的 mRNA 在 sEV 和 lEV 中均有表达。特别是，miR-196a-5p 在两种类型的 EV 中均有富集，这表明 CHO 源性的 EV 可能通过细胞间的通讯机制发挥其抗凋亡和促进增殖的作用。 在本项研究中，我们对 CHO 细胞在灌流生产过程中产生的 EVs 进行了动态监测。我们发现，在灌流过程的中期，通过纳米粒子跟踪分析（NTA）观察到生物反应器滤液中的 sEV 数量显著减少，这与跨膜压（TMP）的升高和产品筛分效率的下降同步发生。利用扫描电子显微镜（SEM），我们观察到过滤器的多孔结构出现阻塞，这与 TMP 的升高具有定性的相关性。通过氦离子显微镜（HIM）和 SEM 的进一步表征，我们在污染膜的孔隙和斑块中发现了 sEV 状结构。元素映射和荧光染色的分析结果进一步揭示了这些污染斑块可能含有 DNA、蛋白质以及粘附的 CHO 细胞等生物材料。 为了深入探究 sEVs 在过滤器污染中的作用，我们采用了中空纤维切向流过滤（HF-TFF）灌流模型进行实验。实验结果表明，向培养基中添加分离的 sEVs 会导致 TMP 升高和产品筛分效率降低，并且这种效应呈现出浓度依赖性。这些发现表明，在 CHO 细胞培养过程中产生的 sEVs 可能与其他生物材料共同作用，导致 HF-TFF 过滤器的污染。 详细实验操作和结果，请参考原文。 图2. 通过纳米跟踪分析 (NTA) 观察灌流生物反应器细胞外囊泡的动力学。分析了四种灌流生物反应器培养物中的 CHO EVs 动力学（图 1）。分析了 (a) 生物反应器和 (b) 滤液中的培养物。白色虚线表示 200 nm 直径，用于区分 sEV 和 lEV 以便进行量化。图中显示了灌流生产过程中生物反应器中的 (c) sEVs、生物反应器中的 (d) lEVs 和滤液中的 (e) sEVs 的总数。 图3. 通过显微镜检查可发现 HF-TFF 过滤器内腔上的过滤器污染结构。（a）HF-TFF 过滤器及其中空纤维腔的示意图。在灌流生产过程中，细胞培养液流过纤维腔，但滤液以垂直于培养液流动的方向穿过腔壁上的小孔。（b）具有不同最终TMP和产物筛分（从左到右）的HF-TFF过滤器（来自图 1中相应的生物反应器）的扫描电子显微镜（SEM ）表征：新过滤器，过滤器A（第28天TMP：13.9 psi，产物筛分：73.1％），过滤器B（第28天TMP：5.83，产物筛分：73.9％），过滤器C（第28天TMP：12.0 psi，产物筛分：68.1％）和过滤器D（第28天TMP：10.4 psi，产物筛分：86.4％）。双箭头表示沿中空纤维腔的流动方向。虚线圆表示sEV在中空纤维腔上的沉积。 图4. 使用 SEM 能量色散 X 射线光谱 (EDS) 对 HF-TFF 过滤器进行元素映射。显示了 (a) 完整和 (b) 污染的 HF-TFF 过滤器的元素映射结果。a1 和 b1：映射区域的 SEM 图像；a2 和 b2：F（显示为红色）和 C（显示为蓝色）的元素映射；a3 和 b3：来自 S、P、O、N（显示为黄色）以及 F 和 C（显示为蓝色）的信号的元素映射；b4：来自 Si（显示为黄色）以及 F 和 C（显示为蓝色）的信号的元素映射。c1：完整过滤器内腔的能量色散 X 射线光谱。c2 和 c3：污染的 HF-TFF 过滤器内腔上微米级污染结构的能量色散 X 射线光谱。c2：b3 中的区域 1；C3：b3 中的区域 2。氟信号以白色箭头突出显示。 图5. 离线小规模模型证实了 sEV 引起的过滤器污染。从 CHO 细胞培养中分离出的 sEV 被掺入培养基中，并在小规模 HF-TFF 灌流模型中评估了 (a) TMP 和 (b) 产物筛分曲线。测试了三种不同的 sEV 掺入浓度。(a) 中显示了三阶多项式非线性拟合。 讨论 在生物制药的灌流生产过程中，过滤器的污染问题一直是导致产品筛分效率降低和生产周期提前结束的关键因素。尽管对此问题进行了长达数十年的研究，过滤器污染的具体原因仍然难以明确。然而，我们的研究揭示了一个可能的污染源头：中国仓鼠卵巢（CHO）细胞释放的小型细胞外囊泡（sEVs）可能在这一过程中起到了关键作用。 本研究首次全面评估了中国仓鼠卵巢（CHO）细胞在单克隆抗体（mAb）灌流生产过程中释放的细胞外囊泡（EVs）的动态变化，并探讨了这些EVs对中空纤维切向流过滤（HF-TFF）过滤器污染的影响。我们采用纳米粒子跟踪分析（NTA）技术监测了灌流过程中CHO源性EVs的浓度变化，相较于传统的动态光散射技术，NTA能够更精确地测定颗粒浓度。 我们的观察结果表明，生物反应器中的大细胞外囊泡（lEVs）浓度较高，但它们在滤液中的浓度几乎检测不到。生物反应器中lEVs的浓度在整个运行过程中稳步上升，这与过滤器对直径200-1000纳米的lEVs的截留作用一致，因为过滤器的标称孔径为200纳米。与此同时，小型细胞外囊泡（sEVs）的浓度在生物反应器中保持相对稳定，但滤液中的sEVs浓度随时间显著变化。在灌流初期，滤液中可以检测到sEVs，但其浓度远低于生物反应器中的水平，表明只有少量sEVs能够通过过滤器。 通过模拟灌流实验，我们发现lEVs以每天约5个囊泡/细胞的恒定速率产生，而sEVs的产生速率更高，约为每天400个囊泡/细胞。生物反应器中没有sEVs积累的现象，这进一步支持了sEVs可能在HF-TFF过滤器内部滞留的观点。此外，在过滤器污染发生之前，我们观察到滤液中的sEV浓度突然下降了10倍，这一现象通过跨膜压（TMP）的增加得到了证实。 我们的研究还表明，尽管四个生物反应器具有相同的设置和控制条件，但它们开始出现污染的时间存在显著差异。这可能与各个过滤器的孔径分布和总孔数不同有关，导致它们对CHO EVs堵塞孔的敏感性不同。值得注意的是，在生产即将结束时，滤液中的sEV数量在两次灌流运行中略有增加，这可能是由于高压条件下sEVs的突破造成的。 基于这些发现，我们提出了一种新的中空纤维过滤器污染模型。该模型考虑了sEVs在过滤器孔隙中的积累，以及它们对过滤器孔径和错流的影响。这一模型不仅为理解过滤器污染机制提供了新的视角，而且为改进过滤器设计和优化灌流工艺提供了理论依据。 我们对受污染的中空纤维切向流过滤（HF-TFF）过滤器进行了详尽的结构和元素分析，以评估小型细胞外囊泡（sEV）沉积对过滤器污染的影响。与新过滤器相比，所有受污染的HF-TFF过滤器内腔均出现了小于100微米的污染斑块，这些斑块的面积与相应生物反应器最终的跨膜压（TMP）呈现出相关性。通过高倍放大的扫描电子显微镜（SEM）和氦离子显微镜（HIM）观察，我们不仅在过滤器的孔隙中，而且在污染斑块上均能识别出sEV样颗粒。 进一步的元素映射分析揭示了污染斑块中含有碳（C）、钠（Na）、磷（P）、氧（O）和氮（N），这些元素的存在暗示斑块中可能富含蛋白质、核酸和脂质。在对比先前研究中，Kelly等人在污染的中空纤维膜表面检测到了消泡剂胶束，但我们的研究中并未在污染斑块中发现硅元素的富集，硅是消泡剂的一个关键成分。Sundar等人的研究也未观察到硅的存在。值得注意的是，Kelly等人在成像前未对冷冻膜进行清洗，而Sundar等人和我们在成像前都对膜进行了清洗。这种方法上的差异可能是导致消泡剂检测结果不同的原因。 我们的荧光染色分析揭示了污染膜上显著的DNA信号，这一发现支持了先前关于CHO DNA在灌流过滤器污染中发挥作用的假设。特别地，在一些污染斑块中，我们观察到了类似内质网（ER）的GP96信号，这些信号环绕着核状的DNA信号，暗示这些斑块可能包含CHO细胞。考虑到进入HF-TFF纤维的CHO细胞可能会受到高剪切力的影响，这种力量已知会导致CHO细胞粘附并在流动方向上形成极化，这为我们在扫描电子显微镜（SEM）图像中观察到的污染斑块的流动平行条纹状图案提供了一种可能的解释。Kelly等人的研究也通过SEM观察到了中空纤维滤膜上的CHO细胞，进一步证实了这一点。 DNA和贴壁CHO细胞对过滤器污染的具体贡献需要进一步的研究来明确。此外，我们注意到，滤膜上污染斑块的出现为Bolton等人提出的滤饼模型提供了实际的物理证据。已有研究表明，较小的颗粒更倾向于在膜表面形成滤饼，而这种滤饼通常包含大量的小颗粒。因此，sEV的沉积可能促进了滤膜上初始滤饼的形成。对灌流生产过程中不同阶段获得的过滤器进行物理和生化特性的深入表征，将有助于我们更深入地理解过滤器污染的发展机制。 Wang等人的研究利用了一个离线中空纤维灌流模型，以评估不同尺寸颗粒对产物筛分效率的影响。该研究发现，细胞培养上清液中主要含有约100纳米的颗粒，其筛分效果显著低于那些含有极小颗粒（约10纳米）或细胞（大于10微米）的滤液。然而，理论上细胞培养上清液应包含各种尺寸的颗粒，这表明Wang等人的实验结果可能受到了除sEVs之外的其他颗粒的干扰。 在本研究中，我们采用了一种经过验证的差速离心法来分离sEVs，并明确证实了这些sEVs在CHO细胞培养物中200纳米以下颗粒中占有相当大的比例。此外，我们在基于中空纤维的离线小规模模型中进一步证实了sEVs与过滤器污染之间的直接因果关系。 鉴于中空纤维切向流过滤（HF-TFF）污染在基于中国仓鼠卵巢（CHO）细胞的灌流培养过程中的重要性，识别sEVs作为污染的关键因素之一，为改进灌流工艺提供了新的视角。我们的研究结果表明，在灌流生物反应器中，那些产生较高细胞特异性sEV的CHO克隆体，其产物筛分效率相对较低。基于这一发现，选择sEV产量较低的CHO克隆体进行灌流生产，可能是一种有效的策略。 开发sEV产量较低的CHO宿主细胞系，可能有助于减轻过滤器污染的问题。然而，这一做法需要综合评估对细胞生长、活性、生产力和产物质量的潜在影响，考虑到sEVs在多种细胞途径中可能发挥的关键作用。有研究表明，使用较大孔径的中空纤维过滤器可以有效缓解过滤器污染的问题。我们假设，较大孔径的过滤器（如0.45微米）允许主要流体动力学尺寸约为300纳米的lEV相对自由地通过，即使部分较大EV开始收缩滤孔，较小的EV和产物仍可穿过，从而延迟了污染的发生。 然而，使用较大孔径过滤器的一个缺点是，在进行层析之前，可能需要增加一个额外的过滤步骤来进一步澄清滤液。此外，Pinto等人的研究显示，使用宽表面孔膜可以显著改善灌流培养中的筛分衰减，这可能是通过减少膜表面滤饼的形成实现的。Wang等人的研究表明，与TFF相比，ATF灌流展现出更好的产物筛分效果，他们认为TFF中使用的蠕动泵产生的高剪切应力是导致更严重污染的主要原因。使用低剪切力的离心泵替代蠕动泵，可以改善TFF的筛分效率。已知剪切应力可以显著促进sEV的分泌，因此在蠕动泵使用过程中，sEV浓度的升高可能导致过滤器污染的增加。 基于我们的实验数据，我们构建了一个描述中空纤维过滤器污染过程的机械模型（见图6）。在过滤器初始状态下，培养液及单克隆抗体（mAb）能够无阻碍地穿越过滤膜（图6左侧）。尺寸较小的sEVs亦能部分通过滤膜。正如Knutsen和Davids的早期研究所展示的，在恒定的滤液流速和壁面剪切率条件下，较大粒径的颗粒沉积量减少。那些粒径与HF-TFF过滤器孔径相近的sEVs会在膜表面沉积并逐渐缩小孔径。在这个阶段，尽管错流尚未受到显著影响，但滤液中的sEVs数量已经开始下降，因为它们被截留在滤膜内部。 随着灌流过程的持续，滤膜的有效孔径进一步减小，导致更小的sEVs也被困在过滤器中。这种积累损害了错流，进而增加了跨膜压（TMP）。然而，在TMP上升的情况下，抗体分子仍能够穿越孔隙（见图6中间）。只有当孔隙狭窄到连抗体分子也难以通过时，产物的筛分效率才会降低，这解释了为什么筛分效率下降会稍晚于TMP的增加。不同过滤器上高度收缩孔隙的比例不一，这可能解释了为什么在灌流生物反应器中TMP与产物筛分效率之间缺乏直接相关性。 同时，sEVs、DNA以及其他生物材料在滤膜表面累积，形成了所谓的“滤饼”，这进一步阻塞了孔隙和错流。在污染的后期阶段（见图6右侧），大部分管腔膜被小于100微米大小的污染斑块所覆盖，这些斑块可能包含EVs、DNA、细胞碎片，甚至粘附的CHO细胞。这些较大的结构严重阻碍了跨膜流动，导致产物筛分效率显著下降和TMP急剧升高。在某些极端情况下，过滤器腔内可能形成足够大的结构，以捕获大颗粒和细胞。 图6. 研究提出的灌流生产过程中 HF-TFF 污染机理。完好阶段：管腔膜表面形成最少的污染结构，mAb 和 sEVs 可以自由穿过滤膜。初始污染阶段：过滤器孔中累积的 sEV 沉积阻止 sEVs 穿过膜，导致更多 sEV 沉积在管腔表面，最终导致 TMP 增加。然而，mAb 仍然能够穿过膜，产物筛分受到的影响最小。后期污染阶段：大部分管腔表面被微米级污染结构覆盖，导致 TMP 高。污染的膜不允许 mAb 穿过，导致产物筛分低，灌流培养处于终末状态。 总结 我们首次对单克隆抗体(mAb)灌流生产过程中中国仓鼠卵巢(CHO)细胞释放的细胞外囊泡(EV)进行了全面的动态分析，并对受污染的中空纤维切向流过滤(HF-TFF)过滤器进行了结构和元素特性的深入研究。我们的研究结果揭示了滤液中小型细胞外囊泡(sEV)浓度的变化趋势，这表明sEV可能在HF-TFF过滤器的污染过程中扮演了重要角色。此外，通过扫描电子显微镜(SEM)和氦离子显微镜(HIM)成像以及能量色散X射线光谱(EDS)元素映射，我们进一步证实了sEV在过滤器污染中的潜在贡献。在小规模HF-TFF模型中进行的sEV加标实验进一步支持了这一发现。 基于这些综合发现，我们构建了一个中空纤维过滤器污染的新模型。该模型不仅增进了我们对过滤器污染机制的理解，而且为过滤器设计和灌流工艺的优化提供了有力的理论支持。通过这些改进，我们期望能够缓解中空纤维过滤器的污染问题，从而提高生物制药过程的效率和可靠性。 本文节选自来自Merck & Co., Inc.的研究人员发表的文章“Contributions of Chinese hamster ovary cell derived extracellular vesicles and other cellular materials to hollow fiber filter fouling during perfusion manufacturing of monoclonal antibodies”，由于水平有限，详细内容，请参考原文。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

该研究鉴定了在小鼠胚胎干细胞（mESCs）中特异表达的全新长非编码RNA-LncRNA NONMMUT028956（简写为Lnc956）。对该LncRNA的系统研究发现，它不仅参与复制压力下mESCs 多能干细胞（Pluripotent stem cells，PSCs）因在体外具无限增殖和分化为不同类型细胞的潜能，在再生医学领域中颇具应用前景，也成为目前临床上最具潜能的成药细胞。PSCs制备过程中的标准化、规模化及细胞质量稳定性是走向临床应用的先决条件，但人PSCs在体外扩增培养过程中，易出现遗传和表观遗传的变异，严重阻碍了PSCs的临床应用。因此，研究PSCs遗传物质稳定性维持机理，是寻找改善策略、突破应用瓶颈的关键。 PSCs基因组的突变率远低于分化细胞。中国科学院昆明动物研究所郑萍团队与合作者的前期研究表明，PSCs利用不同于体细胞的特殊机制，有效调控基因组稳定。郑萍团队前期已鉴定了PSCs在DNA复制、DNA损伤修复中的一些特殊分子及作用机制。 近日，中国科学院昆明动物研究所郑萍团队在 Science 子刊 Science Avances 上发表了两篇研究论文，论文分别以：Lnc956-TRIM28-HSP90B1 complex on replication forks promotes CMG helicase retention to ensure stem cell genomic stability and embryogenesis 和 Lnc956 regulates mouse embryonic stem cell differentiation in response to DNA damage in a p53-independent pathway 为题。 该研究鉴定了在小鼠胚胎干细胞（mESCs）中特异表达的全新长非编码RNA-LncRNA NONMMUT028956（简写为Lnc956）。对该LncRNA的系统研究发现，它不仅参与复制压力下mESCs复制小体稳定的维持，而且还监控mESCs基因组的质量，从而确保mESCs基因组稳态。 长非编码RNA（lncRNA）在多种生物学功能中起重要作用。由于技术手段的限制，目前尚未有发现复制叉上具功能性长非编码RNA的报道。研究团队利用前期研发的分离新生DNA链上（即复制叉）RNA技术（isolate RNAs on nascent DNA，iROND），首次鉴定了ESCs复制叉上特异的新的功能性LncRNA-Lnc956。 对该LncRNA的研究发现，当复制压力发生时，Lnc956能有效聚集到复制叉上，并大量招募Trim28和Hsp90b1聚集于复制叉形成复合体。Trim28直接与DNA复制解旋酶复合体MCM2-7相互作用，拉近了Lnc956-Trim28-Hsp90b1复合体与MCM2-7复合体之间的物理距离，使分子伴侣Hsp90b1通过GTP水解活性作用于MCM7，阻碍MCM7进行K48和K63泛素化（MCM7泛素化会导致复制小体解离），从而使复制小体能在一定程度复制压力情况下得以稳定，保持了基因组的完整性。 研究团队还发现Lnc956缺失会导致小鼠胚胎部分致死。致死原因主要是胚胎细胞大量扩增过程中，细胞出现明显基因组不稳定现象，并导致胞质DNA水平显著增加，引起较严重的炎症反应。总之，该研究成果迄今首次发现了小鼠多能干细胞复制叉上特异性功能性长非编码RNA-Lnc956，并揭示了Lnc956维持多能干细胞基因组稳定和促进胚胎发育的分子机制。 Lnc956维持复制叉稳定促进多能干细胞基因组稳定的分子机制 有效清除基因组损伤的细胞个体，是干细胞维持群体基因组稳定的重要方式。p53是目前已知唯一的干细胞基因组质量监控分子。p53通过在转录水平上抑制多能性调控网络关键基因的表达，激活分化调控网络基因的转录，使PSCs快速启动分化和凋亡，确保PSCs的基因组质量。除了p53通路，是否还存在其他独立的机制调控损伤干细胞的清除，值得进一步研究。 研究团队针对新鉴定的LncRNA-Lnc956在干细胞质量控制中发挥的作用做了深入探索。利用多种DNA损伤药物处理、分化、凋亡、单克隆形成、克隆竞争性和转录组学等方法对该LncRNA功能研究后，研究团队发现缺失Lnc956的ESCs在受到DNA损伤后不易启动分化和凋亡，提示Lnc956参与DNA损伤后ESCs的分化和凋亡。但是，Lnc956缺失的ESC中，p53通路的激活和功能未受影响，提示p53没有介导Lnc956的调控作用。 为探究Lnc956分子水平上具体作用机理，研究团队利用In vitro/in vivo RNA pull down、蛋白质质谱及RNA免疫共沉淀等技术鉴定出与Lnc956相互作用的靶蛋白-KLF4。通过机制分析发现，在未受DNA损伤时，Lnc956与KLF4无相互作用。而在基因组受损后，DNA损伤反应通路的核心激酶ATM激活，ATM活化Mettl3（调控RNA m6A修饰），使Lnc956发生m6A修饰。发生m6A修饰的Lnc956大量结合干性维持关键蛋白KLF4。Lnc956-KLF4结合体滞留KLF4蛋白，阻止KLF4蛋白对ESCs多能性的调控，阻止KLF4蛋白结合到DNA上行使干性调控功能，使基因组损伤的干细胞快速发生分化，得以清除。 Lnc956-KLF4通路不依赖p53，和p53通路平行，共同对干细胞基因组质量进行监控。因此，当ESCs受到DNA损伤应激时，磷酸化的ATM信号通路可分别激活p53和Lnc956-KLF4两条通路，使未受DNA损伤修复的ESCs快速发生分化和凋亡，高效清除受损ESCs，防止受损ESCs传递到子代，确保了ESCs遗传物质的稳定性和安全性。 p53和Lnc956协调调控ESCs质量控制的工作模型