单克隆抗体生产的细胞培养工艺

2023-10-18

核酸药物临床研究

动物细胞培养技术在过去的数十年得到了迅猛发展，现在已经被认为是比较可靠和相对成熟的技术。不管是在商业应用还是临床研究，大量的生物药物都是通过细胞培养的方法进行大规模生产。这一技术的应用实施，往往需要优化以下几点：（1）低成本、高产率的细胞株；（2）能够满足产品产量和质量要求的培养基与生物反应器培养条件；（3）合适的过程控制；（4）逐级工艺放大。本文主要从细胞培养的几个关键方面概述了当前抗体生产的技术。由于产量低和培养基复杂性等诸多因素的限制，哺乳动物细胞曾经一度被认为很难应用到工业生产中。随着在细胞株、培养基以及反应器等方面的快速发展，现有报道中生产细胞株的QP已经很容易达到20pg/cell/day以上；在流加培养中，最高产量达到约10g/L，并且最高细胞密度超过20mc/ml。目前细胞培养工艺开发的着重点已经从单纯追求产量和生产力向产品质量控制和工艺一致性方面转移。哺乳动物细胞表达系统不同的宿主细胞表达的重组蛋白其稳定性和糖基化类型不同，需根据要表达的目的蛋白选择合适的宿主细胞。NS0细胞属于胆固醇营养缺陷型，由于其内源 GS 缺乏活性，因而常与 GS 筛选系统联用获得稳定高产的细胞株。它能够产生非人源的糖基化修饰，如 N-羟乙酰基神经氨酸（N-glycolyl neuraminic acid，NGNA）唾液酸结构，在人体内会产生免疫原性，虽然NS0细胞已经应用于治疗性抗体的工业生产，但是其潜在的免疫原性很可能会成为了其广泛应用的限制因素。人胚胎视网膜细胞（PER.C6®）作为一种新型的宿主细胞，已用于表达抗体药物，并能够获得与人类更为接近的糖基化结构。但迄今为止，治疗用生物制品大规模生产的哺乳动物细胞主要还是CHO细胞，主要为DUXB11，DG44和CHO K1。DUXB11和DG44细胞由于不具有二氢叶酸还原酶（DHFR）活性，两者通常采用 DHFR 筛选系统获得生产用细胞株。而 CHOK1 则恰恰相反，常与谷氨酰胺合成酶（GS）筛选系统联用。细胞株构建稳定细胞株的开发通常包括表达载体的构建，细胞转染以及克隆筛选。真核生物基因高表达载体必须具有如下调控元件：①原核DNA序列；②启动子和增强子；③剪切信号；④终止信号和⑤Poly A加尾信号。目前常用的启动子包括人巨细胞病毒早期启动子（hCMV），人延伸因子1-亚基启动子（EF1α）等。3’端常用的PolyA有SV40的早期和晚期Poly A，牛生长激素基因（BGH）Poly A。转染后细胞的筛选依赖于不同的选择标记，常用的标记基因可分为代谢选择标记和抗性选择标记，详见下表1。双重筛选的方法则将细胞同时转入两个分别带有不同筛选标记质粒，将细胞转染后用MTX和MSX同时加压筛选。用这种方法筛选出的细胞克隆的产量相比单一方法要高，如下图1所示。细胞株基因工程改造为提高生产细胞株稳定性及其产品质量，人们采取了很多基因工程的手段对细胞株进行改造。比如，过表达半乳糖基转移酶、唾液酸转移酶、N-乙酰葡萄糖胺转移酶Ⅲ可以提高目的蛋白糖基化水平。过表达一些抗凋亡的基以提高细胞在压力环境下的生存能力，延长细胞培养时间。为克服基因重组的位置效应，利用定点重组系统是Cre/loxP系统和Flp/FRT系统，将外源基因定点整合至转录活跃区。所有的这些努力与尝试均是为了能够更高效的筛选出高表达的细胞株，同时为了后期工艺开发缩短时间。平台工艺开发生物制药平台工艺开发通常分为前期和后期两个阶段（如图2）。前期工艺开发的目的是快速的开发工艺以产生用于动物毒理学研究的材料及临床1期的样品。利用成熟的平台工艺，可以加快前期工艺开发的进程，例如克隆筛选、工艺锁定等。但是在产品进入临床阶段后，往往需要进一步优化生产工艺，以提高产品的产量、保证生产工艺的稳定性等。无论是前期还是后期开发过程中，如果工艺发生改动，都需要严格监控产品的质量和相似性。克隆筛选在细胞培养工艺开发过程中，最终生产细胞株的确定被认为是最重要的步骤之一。如果在后期工艺开发阶段更换细胞株，产品的相似性以及相关临床研究都需要重新验证。因此尽早的确定合适的克隆显得特别的重要。这就需要在前期筛选阶段去模拟后期的大规模生产条件和检测产品质量（表2），以确保筛选出最优的克隆。同时，细胞株的稳定性也是一个重要的筛选因素。培养基和补料流加工艺开发哺乳动物细胞对营养的需求差别很大，即使基于同一宿主细胞所构建的不同克隆，其代谢特点与营养需求也不尽相同。因此，在培养基的开发过程中需特别强调“个性化培养基”的概念，即：生产细胞系所使用的培养基应根据其代谢特点进行优化、定制。在培养基开发过程中常用到以下几种方法：（1）组分滴定法；（2）消耗组分分析法；（3）培养基混合法。于此同时，进行培养基优化时不仅需要考虑单一组分的影响，还要关注组分间可能存在的交互作用，这就使得培养基优化成为耗时且复杂的工作。还有一种较好的策略就是将培养基成分首先分成若干“亚类”，针对“亚类”进行筛选和组合，而后针对“亚类”内组分进行详细优化。流加培养基的开发最简单的做法是直接浓缩基础培养基，同时考虑培养过程中的营养消耗、副产物生成、细胞生长速率与蛋白产量平衡等复杂因素，针对性设计培养基以及补料流加策略。细胞培养的工艺放大细胞培养工艺的放大与转移过程中，首先应保证工艺变更前后细胞活性、产物收率以及产品质量等主要技术指标维持不变。培养工艺放大原则多采取非体积依赖参数保持不变（温度、溶氧、pH等），体积依赖参数（工作体积、流加体积、通气量等）线性放大。同时还要考虑溶氧供应和二氧化碳的去除等因素是否满足培养工艺的要求。细胞培养工艺表征与工艺验证产业化阶段需要对细胞培养工艺进行充分的定性研究。对诸多工艺参数（接种量、培养温度、pH、DO等）进行风险排序，确定关键工艺参数及操作范围。此外，细胞培养工艺满足药物上市评审要求还需有生产规模的实验数据进行支撑，即所谓的“工艺验证”。FDA和EMEA分别要求连续3或5批连续的生产规模试验数据，并以此为“生物制品许可申请”（BLA）文件的重要内容。结语与展望在过去的二十多年里，细胞培养技术得到了快速发展。目前的细胞培养工艺开发，已经从简单的工艺参数优化，进入系统的组学研究深度。同时，业内随着“QbD”理念的深入，越来越多的“过程分析技术（PAT）”开始应用于细胞培养过程，旨在通过加强关键过程参数的监控来确保蛋白药物的最终质量。这些日益成熟的技术为生物药品的研发提供更为有利的支撑。近期直播推荐参考文献：Li, F., et al. (2010). MAbs 2(5): 466-479. PMID:20622510识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入生物制品微信群！请注明：姓名+研究方向！版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。