Poly ICLC

聚乳酸（PLA）和聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)是一种可生物降解的功能性高分子聚合物，是长效制剂首选缓释高分子材料之一，其可通过影响药物降解速率、调控制剂释放行为达到缓慢释放药物的目的，具有良好的生物相容性。药典四部中《丙交酯乙交酯共聚物（供注射用）》提及的关键质量属性也仅有丙交酯乙交酯的摩尔比及特性黏数，然而影响药物释放的相关PLGA理化性质还包括:聚合物结构(如线形或星形)、聚合物端基、结晶度、玻璃化转变温度(Tg)、孔隙度、粒径、粒径分布、表面形貌、亲水性和水化率等。                                                    1丙交酯乙交酯摩尔比（LA:GA）PLGA的性质很大程度上取决于L:G比，L:G的微小差异，例如50:50 VS 65:35，会导致不同的溶解度、降解动力学和与药物的相互作用，乙醇酸的比例增加，可以提高水化速率，加速药物释放，理论上降解时间由慢至快的顺序为PLGA 8515 > PLGA 7525> PLGA 6535 >  PLGA 5050，选择正确的LA与GA比例，可以控制体内递送系统的降解动力学。PLGA的LA∶GA通常使用1H核磁共振（1HNMR）法测定，δ5.2和δ4.8处的积分分别对应LA的3°H和GA的2°H，通过峰面积相关的公式可推算出丙交酯乙交酯的摩尔比。2 玻璃化转变温度PLGA本质为无定型的，其玻璃化转变温度范围为40℃-60℃，LA含量的降低导致Tg降低，Tg的降低导致聚合物基体塑化从而导致PLGA的机械特性下降。此外PLGA的玻璃化转变温度也决定了制剂的微观结构和药物释放，采用比Tg更高的加工温度制备的PLGA微球具有致密的基体和光滑的表面，而当加工温度低于其Tg温度时，制备出的微球则是多孔的。通过DSC可以测试出聚合物的Tg、制剂的Tg等。3 分子量与分子量分布分子量影响药物的释放动力学及释放行为，通常MW较高的PLGA需要更多的时间水解成可溶性低聚物，固有具有较慢的降解速率和药物释放动力学，PLGA分子量增加，链长度变长，残留在微球等制剂表面的药物少，突释变低。PLGA的分子量一般通过凝胶渗透色谱(GPC)使用外部标准聚苯乙烯测量，由于不同的聚合物-溶剂相互作用，聚苯乙烯在给定溶剂中的分子尺寸与PLGA不同，因此用聚苯乙烯标准得到的分子只适用于相对比较。若想获得PLGA精确的分子量，可选择多角度静态光散射(MALS)技术。4 特性黏度PLGA的特性粘度与分子量密切相关。测定方法一般为将聚合物溶解于溶剂中，采用平氏或乌氏粘度计测定样品溶液在特定温度下的特性黏数。5 端基类型末端官能团主要包括酸封端和酯封端，酸封端比酯封端的PLA/PLGA具有更快的降解速度。测定PLGA末端官能团常使用的方法是13C NMR，若在δ 14 处存在甲基峰，则证明是酯封端的PLGA。6 粒径PLGA材料的粒径是指颗粒的尺寸大小，粒径的选择会影响PLGA的药物载体性能和药物释放性能，较小的粒径有助于提高药物的释放速率，因为较短的扩散直径导致其吸水性更高。对于较大粒径的PLGA，降解的低聚物从颗粒内部扩散到表面的路径较长，导致释放变慢，在此过程中PLGA的自催化作用也会对药物的稳定性产生影响。测定PLGA的粒径通常可以采用动态光散射法。7 分子结构与构型PLGA的结构有线形、星形和臂形，目前上市缓控释制剂大多采用线形PLGA，Sandostatin（注射用醋酸奥曲肽）采用的是以葡萄糖为引发剂的星形PLGA，星形聚合物的优点是其分子量可以相对较高，可增加药物递送系统的硬度。分子结构与构型的确定可采用1HNMR、红外光谱分析，对于支化度的测定可采用示差折光检测器、多角度激光散射仪、黏度计连接的检测系统进行测定。8 单体残留PLGA在合成过程中可能存在未完全反应的单体或者聚合度低的单体和聚合物，残留单体的存在会加快聚合物的降解速度，降低高分子聚合物的机强度和稳定性，从而影响其释放。同时某些药物包载于高分子聚合物中，会与其残留单体发生反应，进而影响药物稳定性。故应对PLGA的单体进行关注并控制，通常可采用气相色谱法对残留的单体进行检测。案例分享：以此前与大家探讨过的原位凝胶剂型为例，该药物递送系统关键的缓释辅料则为高分子聚合物PLGA/PLA，在调节该类制剂的释放行为过程中，需要关注的PLGA的几个最关键属性包括聚合物的端基类型、丙交酯乙交酯摩尔比、分子量/特性粘度，在和大家探讨之前，首先想先要说明的是制剂的降解周期和聚合物的降解周期不能完全混为一谈，制剂的降解受到多种因素的影响，比如所包载药物的性质，PLGA/PLA的降解周期，注射部位的生理环境等，因此必须通过具体实验选择合适的缓释聚合物辅料。单纯就聚合物本身的降解周期和规律而言，在筛选过程中可以按以下思路进行筛选。初始即应该确定聚合物的端基类型，是选择酸封端还是酯封端，在该阶段可通过原研说明书、专利、厂家提供的COA推测所使用物料的特性及降解周期，如果可以确定厂家，尽量选择与参比制剂相同的供应厂家，如果无法获得该信息，则尽可能对不同厂家的聚合物均进行筛选考察。一般设计释药周期较长的制剂通常推荐可以使用酯封端的聚合物先进行尝试，但也应该综合所载药物的理化性质及体内外释放曲线共同考量确定。若选择PLGA作为缓释辅料，则应该进一步考察丙交酯与乙交酯的比例。而后筛选合适的分子量/特性粘度，可通过分子量/特性粘度的调节来调节药物的初始突释，一般情况下突释可通过增加聚合物分子量来降低（由于本文主要探讨聚合物自身的质量属性，故此处不探讨聚合物的浓度对释放的影响），但也应注意分子量提高同时会使得释放周期延长。在此前的研发过程中发现，还可以通过混合PLGA/PLA的方式，来调节制剂前期或后期的释放曲线，比如在PLGA制备的制剂中，加入一定比例的PLA后，可提高制剂产品后期的血药浓度。除上述提及的理化性质外，在研发过程中还应该关注聚合物的单体残留量，单体残留易与某些药物例如多肽类药物发生反应，在放置过程中导致其杂质显著增加，影响制剂的稳定性，所以在选定聚合物后应要求厂家控制单体残留以满足产品制备的需求。还应关注聚合物与药物的相互作用，部分多肽包裹与于PLGA中会与聚合物发生反应生成杂质，导致药物失活性甚至产生毒性；比如奥曲肽与PLGA的羧酸端形成盐进而催化奥曲肽的酰化。总之，在进行高分子聚合物辅料筛选过程中应密切关注上述理化性质对递送系统释放的影响，以获得符合预期的制剂释放曲线。[1]《中国药典》（2020年版四部丙交酯乙交酯共聚物（供注射用））[2] Wang X, Bao Q, Wang R, Kwok O, Maurus K, Wang Y, Qin B, Burgess DJ. In situ forming risperidone implants: Effect of PLGA attributes on product performance. J Control Release. 2023 Sep;361:777-791. doi: 10.1016/j.jconrel.2023.08.029. Epub 2023 Aug 22. PMID: 37591464.[3] 田虹,樊瑜波.聚丙交酯-乙交酯降解研究进展[J].现代生物医学进展, 2011, 11(1):3.DOI:CNKI:SUN:SWCX.0.2011-01-049.[4] Park K, Skidmore S, Hadar J, Garner J, Park H, Otte A, Soh BK, Yoon G, Yu D, Yun Y, Lee BK, Jiang X, Wang Y. Injectable, long-acting PLGA formulations: Analyzing PLGA and understanding microparticle formation. J Control Release. 2019 Jun 28;304:125-134. doi: 10.1016/j.jconrel.2019.05.003. Epub 2019 May 6. PMID: 31071374.[5] Lim YW, Tan WS, Ho KL, Mariatulqabtiah AR, Abu Kasim NH, Abd Rahman N, Wong TW, Chee CF. Challenges and Complications of Poly(lactic-co-glycolic acid)-Based Long-Acting Drug Product Development. Pharmaceutics. 2022 Mar 11;14(3):614. doi: 10.3390/pharmaceutics14030614. PMID: 35335988; PMCID: PMC8955085.[6] Beig A, Feng L, Walker J, Ackermann R, Hong JKY, Li T, Wang Y, Qin B, Schwendeman SP. Physical-Chemical Characterization of Octreotide Encapsulated in Commercial Glucose-Star PLGA Microspheres. Mol Pharm. 2020 Nov 2;17(11):4141-4151. doi: 10.1021/acs.molpharmaceut.0c00619. Epub 2020 Oct 19. PMID: 32876463.[7] Kohno M, Andhariya JV, Wan B, Bao Q, Rothstein S, Hezel M, Wang Y, Burgess DJ. The effect of PLGA molecular weight differences on risperidone release from microspheres. Int J Pharm. 2020 May 30;582:119339. doi: 10.1016/j.ijpharm.2020.119339. Epub 2020 Apr 17. PMID: 32305366.药事纵横投稿须知：稿费已上调，欢迎投稿

我们已经进入一个单细胞实验的时代，通过将技术小型化和多重化，单细胞方法已经发展到高度可扩展。遗传学的一个核心目标是定义基因型和表型之间的关系。在过去几年，CRISPR-Cas系统逐渐成为一个成熟有效的基因操作工具箱。CRISPR筛选成为研究某些基因的定量表达如何影响复杂的细胞表型和过程的一种有效方法。在此基础上，人们越来越多地转向在单细胞水平上进行 CRISPR 筛选。这一趋势可能是由科学需求和技术进步共同推动的。一方面，科学上需要获悉更高精度并能解决细胞多样性的差异，这反映的是对基因功能、细胞行为和疾病机制更深入、更细致理解的需求；而另一方面，单细胞RNA 测序 (scRNA-seq)、流式细胞术和先进显微镜等工具的进步，实则推动了这一趋势。这篇文章我们就来更多关注单细胞CRISPR大规模筛选及其进展。为什么单细胞 CRISPR 筛选越来越多？传统筛选方法将大量细胞放在一起进行分析，得出的平均结果可能会掩盖单个细胞之间的显著差异。然而，即使在看似均匀的群体中，细胞的基因表达、蛋白质水平和行为也可能存在很大差异。单细胞筛选通过单独检查每个细胞来克服这一限制，干扰的基因在不同细胞内的细微变异，从而揭示具有生物学意义的异质性。在癌症研究等领域，肿瘤微环境异质性非常强，不同的人对同样的药物治疗有不同的响应，而究其原因与肿瘤细胞异质性和微环境其他细胞高度相关。目前单细胞测序技术发现了许多与药物响应和不响应相关联的一些基因，但是他们具体功能未知。因此CRISPRi+scRNAseq提供了强有力的解析手段。通过CRISPR敲除或修改单个细胞中的特定基因,再结合scRNA-seq，研究人员可以研究这些变化如何影响每个细胞的行为、基因表达或命运，有助于构建基因相互作用和调控关系的精确模型，这对于理解上述的疾病发生发展及耐药的细胞过程至关重要，可以提供机制洞见。单细胞 CRISPR 筛选能够将近年来发现很多相关性的结论进一步行程机制探索，因此逐渐也成为研究复杂生物系统所必不可少的一个工具。单细胞 CRISPR 筛选怎么做？单细胞 CRISPR 筛选，顾名思义，是将 CRISPR 基因编辑系统与单细胞分析技术相结合的一种方法。自2012 年发现CRISPR-Cas9 基因编辑技术以来，研究人员一直对其治疗人类疾病的潜力充满热情。CRISPR-Cas9系统提供了一种精确、靶向的基因修改方法，通过在CRISPR部分设计特定的单链向导RNA（sgRNA）片段，其序列与目标基因靶向互补。这个向导RNA将整个系统引导至 DNA 的特定区域，Cas9 核酸酶然后就会像剪刀一样切割 DNA。当细胞的天然修复途径启动时，目标基因就会得到有效编辑。因此对每个sgRNA加上序列标签，我们则可推测对每个细胞哪个基因受到影响及下游其他基因扰动情况。在 2016 年 12 月的《细胞》杂志上，Jonathan Weissman和Aviv Regev小组联合发表了两篇论文，分别描述了这样的技术，并称之为Perturb-seq。这两篇文章及随后的文章都证实了，Perturb-seq这种单细胞 CRISPR 筛选可以产出丰富的数据，可以帮助识别导致特定行为的遗传扰动。Perturb-seq技术需要预先设计进行筛选使用的CRISPR文库，这可以针对特定的目标基因或者是全基因组来设计，针对每个基因可以设计一个或多个sgRNA，这可以通过在线工具来设计，也可以从验证过的数据库中直接挑选使用。相应的sgRNA序列需要组装到慢病毒载体中，用于转染进入细胞；当然这里也可以选择已有的sgRNA慢病毒文库进行后续的工作。慢病毒库感染细胞，实现sgRNA的递送和基因组整合插入；之后通过FACS或者抗生素耐药来选择表达了相应sgRNA的细胞。这里也可以进行细胞的操控，添加特定的小分子药物或者施加相应的刺激，以根据预期的表型信息进行相应的筛选。随后就是常见的scRNA-seq工作流程。比如通过微液滴的方式来捕获单细胞，其中捕获的sgRNA、mRNA转录本甚至是细胞表面蛋白等将共享一个细胞条形码，这样就将向导RNA与扰动的细胞表型联系了起来。Perturb-seq越来愈多成为一个通用术语，涵盖了将 CRISPR 与 scRNA-seq 相结合的各种策略。2017年7月，Christoph Bock小组在《自然方法》杂志上发表了CROP-seq（CRISPR droplet sequencing）方法，专门为基于液滴系统流程的优化而开发，成为Perturb-seq这一更广泛框架内的另一种具体实现。传统Perturb-seq和CROP-seq目标都是将 CRISPR 诱导的变化与单个细胞中的基因表达谱联系起来，但它们的技术方法有所不同，特别是在如何检测向导 RNA (gRNA) 以及它们与特定 scRNA-seq 平台的兼容性方面。Perturb-seq中，每个 gRNA 都与一个独特的条形码相关联。这些条形码在 scRNA-seq 期间被捕获，可以通过与细胞转录组一起测序，或者通过扩增在单独的步骤中被测序。Perturb-seq 可以适应各种 scRNA-seq 平台，包括基于液滴的系统和基于板的方法，使其适用于不同的实验设置。与 Perturb-seq 一样，CROP-seq中的gRNA也是通过整合到基因组中的慢病毒载体递送。然而，在 CROP-seq 中，gRNA 由与 Cas9 酶相同的构建体表达，通常在 RNA 聚合酶 II 启动子下表达。与 Perturb-seq不同的是，CROP-seq 不依赖于单独的条形码。相反，在 scRNA-seq 期间，gRNA 转录本本身与细胞 mRNA 一起直接捕获。gRNA 序列充当其自身的标识符，将扰动与转录组联系起来。这种方式直接捕获 gRNA 转录本，通过将扰动和读取整合到单个测序步骤中，简化了实验设计，降低了实验复杂性。CROP-seq 的简化方法对于使用基于液滴的平台的实验室来说可能更高效、更具成本效益，因为它避免了单独进行条形码检测的需要。然而，它需要足够的 gRNA 表达才能在 scRNA-seq 中被检测到，如果表达水平较低，这可能会成为一种限制。单细胞CRISPR筛选所面临的挑战单细胞Perturb-seq在实施中依然面临着许多技术、分析及生物学等的挑战，包括如CRISPR组件的有效递送、可能的脱靶效应、编辑效率、数据分析的复杂性/噪声、数据的解读、可能的基因旁路补偿机制等等。除此之外，大规模、高通量的单细胞筛选还涉及可扩展性及资源成本的直接限制。分析数千个单个细胞需要大量资源，需要大量时间、成本和人力。传统方法可能无法有效扩展到大型筛选。虽然基于液滴的微流体或微孔阵列等单细胞技术不断发展，且自动化的工作流程也不断提升了效率，但持续的上规模、提升通量依然是这个领域的追求和挑战。由于单细胞 CRISPR 筛选涉及到sgRNA合成、慢病毒、细胞转染等操作，因此需要专门的试剂，这在高通量测序及计算基础设施之外带来了额外的成本。这其中每一步的设计考虑和成本控制对于整体方案的实施都至关重要。由于缺乏标准化协议，不同实验室之间及同一个实验室的不同实验之间可能存在不小的差异，影响了实验结果的可重复性。标准化的实施可能需要单细胞Perturb-seq专门产品及整体解决方案的提供和透明化。这些挑战可以通过技术创新（例如高保真 Cas9、高效单细胞生成）、优化的实验设计、先进的计算工具和协作努力来解决。值得指出的是，随着该领域的发展，开发经济高效的方法和标准化协议将进一步增强这种变革性方法的可及性和影响力。PIPseq-CRISPR 单细胞筛选之前的文章，我们已经介绍过PIPseq基于模板乳化的无微流体单细胞基因组学方法，其通过使用水凝胶颗粒 (PIP) 来创建均匀的液滴进行测序，从而无需复杂的微流体系统。这种只需要涡旋就能实现的单细胞制备方法具有很好的可扩展性，每次反应可处理多达100 万个细胞，远远超过通常处理约一万个细胞的传统方法。这种良好的可扩展性适合于高通量分析，对于单细胞 CRISPR 筛选而言，这种能力至关重要。PIPseq的原理使得研究人员在细胞收集点现场准备样品，无需专门的设备或复杂的工作流程。对于单细胞 CRISPR 筛选，这种可访问性减少了后勤障碍，使更多实验室能够采用该技术并简化从样品制备到分析的过程。而通过最大限度地减少对昂贵的基础设施和耗材的需求，单细胞CRISPR 筛选的总体费用也会相应降低。在PIPseq的概念验证文章中，背后的技术开发商（Fluent Bioscience，后被Illumina收购）就展示了PIPseq可以兼容用于CROP-seq的单细胞全基因组筛选，其通量可以助力实现大规模扰动研究。他们使用CRISPRi 慢病毒文库转导含有稳定 dCas9-KRAB 的 K562 细胞，并进行 PIP-seq 捕获单个细胞的转录谱和 sgRNA 身份，这是的能够将测量的基因表达与每个基因的预期敲低效率进行比较。结果显示，对于具有单个 gRNA 分配的细胞，先前报道的敲低效率与靶基因的标准化计数相关，并且对于高表达基因最为显着。此外，基因的敲低产生了已知的转录变化。这些结果验证了 PIPseq 可用于 CROP-seq 实验，为在基因组规模上绘制基因型-表型关系的常规百万细胞实验铺平了道路。事实上，Fluent在被收购之前就计划商业化PIPseq-CRISPR单细胞筛选的产品，这本质上就是CROP-seq的方法，已集成到 Illumina 的单细胞 RNA 制备试剂盒目前已经在中国大陆正式上市。该产品系列包含了为了提高检测的灵敏度的SEA 试剂盒（补充富集和扩增试剂盒）对低丰度靶标（例如sgRNA标签）并富集特定序列以确保在测序过程中进行稳健检测，简化了工作流程并提高了功能基因组学研究的准确性。Illumina将PIP单细胞制备技术与自己的测序和信息学解决方案（例如在DRAGEN单细胞分析管线中支持PIPseq CRISPR 模式）进行集成。在 CRISPR 筛选的背景下，这种增强的数据分析能力对于提升技术的可及性、降低进入门槛来说都是很关键的。两个月前，Illumina宣布推出用于 CRISPR 研究的端到端单细胞解决方案，这将用于与 Broad Clinical Labs宣布的合作。Illumina 的单细胞CRISPR制备、NovaSeq X Plus 平台、25B 流动槽和 DRAGEN分析软件的组合将创建无缝的端到端工作流程，实现单细胞样本的高通量处理。Broad Clinical Labs 将结合Illumina的工作流程以及 Perturb-seq、CRISPR 筛选等技术，在三年内实现 50 亿单细胞图谱生态系统，为单细胞研究树立新标准和大型参考数据集。在随后的AGBT大会上，Illumina展示了创新路线图，计划在今年底推出这一新款试剂盒Illumina Single Cell CRISPR Prep，这正是与Broad单细胞合作的核心产品。Illumina Single Cell CRISPR Prep将提供三种新试剂盒格式，每个样本兼容 10,000、100,000 和 100 万个细胞，有助于从使用 100 个sgRNA序列的靶向筛选研究到每个实验使用超过 10,000 个 sgRNA 的全基因组规模筛选发现。然而，与前面所描述的CROP-seq不同，Illumina Single Cell CRISPR Prep将基于Perturb-seq。本质上，Perturb-seq具有更好的兼容性，其对条形码（可单独扩增）的使用可以提供更大的灵活性和灵敏度，特别是对于复杂的扰动实验（例如，组合 sgRNA 筛选）。Perturb-seq 已扩展到用于研究基因相互作用的多路复用设计，而这一特性在 CROP-seq 中较少见到。传统的CROP-seq实验中仍然需要poly(A)的gRNA报告基因，sgRNA序列的设计和制备稍显复杂。在一篇介绍Illumina Single Cell CRISPR Prep的博文中，Illumina透露通过修改PIP，使其能够识别CRISPR sgRNA骨架序列，可以直接捕获gRNA（设计特定的捕获序列，结合gRNA骨架结构中CRISPR-Cas9 的保守区域），这可以与更广泛的CRISPR检测方法相兼容。这样一来，与目前的单细胞产品相比，Illumina的单细胞CRISPR解决方案将具有几个明显的优势，包括增强的可扩展性（最多 100 万个细胞）、实现双重 mRNA/gRNA 直接捕获、使用最少的仪器简化工作流程、与其测序生态系统集成、降低成本以及提供灵活的实验选项等，这将有助于实现更大规模、更复杂且具有更高灵活性和更高灵敏度的CRISPR单细胞检测分析。在同一检测中同时测量 CRISPR gRNA 序列和 3' RNA 基因表达，将提供 CRISPR 激活、失活或靶向基因编辑Perturb-seq实验的单细胞读数，能够评估每个扰动的综合基因表达表型，能够识别与单个变异相关的功能机制或区分不同的致病模式，将在细胞图谱或药物筛选等研究应用中带来令人兴奋的全新见解。通过单细胞 Perturb-seq/CROP-seq和其他基于 CRISPR 的筛选，已经确定了特定的药物靶标，其中一些靶标已进入临床前研究阶段。除了科学界的探索，也有一些公司正在利用这种技术来识别新的药物靶点，提供筛选服务，加速药物开发。随着Illumina将这一方案交付到客户手中，预期将看到越来越多的全基因组 CRISPR 筛选的开展和因此产生的深入的生物学洞察。毫无疑问，单细胞和CRISPR技术的融合为科研及药物研发提供了全新的高效工具。不管是理解基因型-表型的关联、探索单细胞水平的生物学异质性及因此可能产生的疾病和治疗见解、实施正向或反向的遗传筛选、还是提升发现和识别新靶点及新型标识物的效率，单细胞CRISPR筛选都在发挥重要的价值。但就像其他新兴技术一样，随着越来越多的采用和实施，如何进一步拓展技术的应用边界、提升分析的效率、降低筛选和实验的成本、增加易用程度、不断降低新用户的进入门槛等类似的这些需求就会更加突出，这无疑也将成为各家商业化公司后续竞争的主要维度。参考https://doi.org/10.1146/annurev-genet-072920-013842https://doi.org/10.1038/s43586-022-00098-7http://dx.doi.org/10.1016/j.cell.2016.11.048http://dx.doi.org/10.1016/j.cell.2016.11.038https://doi.org/10.1016/j.cell.2022.05.013https://doi.org/10.1038/s42255-025-01233-whttps://doi.org/10.1038/nmeth.4177https://doi.org/10.1038/s41587-023-01685-zhttps://www.illumina.com/company/news-center/press-releases/press-release-details.html?newsid=15da9928-16c1-453a-b908-a4469a1fc91chttps://www.illumina.com/company/news-center/feature-articles/illumina-s-high-throughput-single-cell-crispr-prep-makes-gene-ed.htmlhttps://doi.org/10.1101/2025.01.30.635675https://www.illumina.com/content/dam/illumina/gcs/assembled-assets/marketing-literature/novaseq-x-perturb-seq-tech-note-m-gl-02890/novaseq-x-perturb-seq-tech-note-m-gl-02890.pdfhttps://doi.org/10.1038/nmeth.4196*本文转自我是建设者公众号.