Jiangsu Qinfen Pharmaceutical Co., Ltd.

品种名称 企业名称 I数量 A数量 总数 恩曲替尼 山东安弘制药有限公司 1 0 1 熊去氧胆小檗碱 浙江瑞博制药有限公司 1 0 1 盐酸特泊替尼 广东莱佛士制药技术有限公司 1 0 1 奥格特韦钠 杭州澳赛诺生物科技有限公司 0 1 1 度洛巴坦钠 吉林凯莱英医药化学有限公司 1 0 1 艾氟洛芬酯 宜昌天睿生物医药有限责任公司 1 0 1 氯苯唑酸 河北安健成益医药科技有限公司 2 0 2 玛仕度肽 江苏诺泰澳赛诺生物制药股份有限公司 1 1 2 赛沃替尼 九洲药业（台州）有限公司 1 1 2 地诺前列酮 KYOWA PHARMA CHEMICAL CO., LTD.;北京益铭远医药科技有限公司 2 0 2 沙库巴曲阿利沙坦钙 山东信立泰药业有限公司 1 1 2 交沙霉素 MicroBiopharm Japan   Co., Ltd. Yatsushiro Plant;北京亦度正康健康科技有限公司 2 1 3 甲磺酸奥希替尼 宜昌天睿生物医药有限责任公司 2 1 3 钆贝葡胺 四川科伦药业股份有限公司 1 2 3 酒石酸肾上腺素 浙江博崤生物制药有限公司 2 1 3 盐酸埃克替尼 湘北威尔曼制药股份有限公司 2 1 3 枸橼酸氯米芬 Dy-Mach Pharma;山东国茂企业管理有限公司 1 3 4 溴夫定 华润双鹤药业股份有限公司 1 3 4 硫酸鱼精蛋白 YUKI GOSEI KOGYO CO., LTD.;上海佰利源医药科技有限公司 2 2 4 溴化钠 湖南浩森制药有限公司 1 3 4 奋乃静 Trifarma S.p.A.;上海明仁医药科技有限公司 1 4 5 巴氯芬 浙江皓华制药有限公司 2 3 5 多替诺雷 山东济坤生物制药有限公司 5 0 5 上海迪赛诺化学制药有限公司 5 0 5 磷酸氢二钾三水合物 湖南福谦制药有限公司 4 1 5 环酯红霉素 安徽永生堂药业有限责任公司 4 1 5 亚硒酸 河北国龙制药有限公司 5 0 5 盐酸卡替洛尔 浙江赛默制药有限公司 2 3 5 普罗布考 河北广祥制药有限公司 3 2 5 江苏德源药业股份有限公司 3 2 5 阿贝西利 万洋衡水制药有限公司 6 0 6 神隆医药（常熟）有限公司 6 0 6 重庆博腾制药科技股份有限公司 6 0 6 甲苯磺酸奥马环素 连云港润众制药有限公司 5 1 6 维生素A棕榈酸酯 江苏天晟药业股份有限公司 1 5 6 钼酸钠 河北国龙制药有限公司 4 2 6 氢溴酸替格列汀 江苏天士力帝益药业有限公司 3 3 6 氯化铁 河北国龙制药有限公司 6 1 7 亚甲蓝 PHARMAZELL (INDIA) PRIVATE LIMITED;广州安信医药有限公司 5 2 7 西维来司他钠 广州绿十字制药股份有限公司 6 1 7 克唑替尼 重庆圣华曦药业股份有限公司 5 2 7 肝素钙 深圳市海普瑞药业集团股份有限公司 1 6 7 氯化铬 河北国龙制药有限公司 6 1 7 盐酸决奈达隆 重庆瑞泊莱制药有限公司 3 4 7 二硫化硒 北京北陆药业股份有限公司 4 3 7 氢醌 四川仁安药业有限责任公司 3 4 7 棕榈酸帕利哌酮 山东辰龙药业有限公司 3 5 8 乳果糖浓溶液 保龄宝生物股份有限公司 2 6 8 依伏卡塞 郑州泰丰制药有限公司 8 0 8 卡泊三醇 Cerbios-Pharma SA;百时益医药研发（北京）有限公司 3 5 8 布比卡因 浙江赛默制药有限公司 4 4 8 磷霉素钠 福安药业集团重庆博圣制药有限公司 2 6 8 氯化锰 河北国龙制药有限公司 5 3 8 盐酸氯普鲁卡因 白云山东泰商丘药业有限公司 4 4 8 福安药业集团重庆博圣制药有限公司 4 4 8 羟苯磺酸钙 浙江尚科生物医药有限公司 2 6 8 硫酸锰 河北国龙制药有限公司 8 0 8 司美格鲁肽 福建基诺厚普生物科技有限公司 9 0 9 艾瑞昔布 湖北赛奥生物制药有限公司 6 3 9 山东艾格林制药有限公司 6 3 9 奥卡西平 JUBILANT PHARMOVA LIMITED;颐德药业（上海）有限公司 3 6 9 马来酸噻吗洛尔 PCAS;PCAS FINLAND OY;广州安信医药有限公司 2 7 9 硝酸益康唑 PMC ISOCHEM;北京科威利华科技有限公司 1 9 10 碳[13C]-尿素 湖南华纳大药厂手性药物有限公司 3 7 10 贝美前列素 浙江奥翔药业股份有限公司 7 4 11 双氯芬酸二乙胺 珠海润都制药股份有限公司 3 8 11 Amoli Organics (A Division of Umedica Laboratories   Pvt. Ltd.);广州安信医药有限公司 3 8 11 玛巴洛沙韦 金鸿药业股份有限公司 9 2 11 吡罗昔康 河南优凯制药有限公司 2 9 11 巴瑞替尼 兰西哈三联制药有限公司 5 6 11 苯磺酸美洛加巴林 烟台万润药业有限公司 12 0 12 碘帕醇 浙江海洲制药股份有限公司 3 9 12 帕利哌酮 石药集团欧意药业有限公司 7 5 12 右莰醇 江苏天晟药业股份有限公司 10 2 12 精氨酸布洛芬 重庆朗天制药有限公司 4 8 12 比拉斯汀 Symed Labs Limited;颐德药业（上海）有限公司 9 3 12 亚硒酸钠 PURITY CHEMICALS S.L.;广州安信医药有限公司 7 5 12 盐酸曲唑酮 山东安信制药有限公司 5 8 13 那屈肝素钙 重庆伊诺生化制品有限公司 4 9 13 甲硫酸新斯的明 云鹏医药集团有限公司 3 11 14 磷酸二氢钾 湖南福谦制药有限公司 6 8 14 硫酸艾沙康唑 山东益康药业股份有限公司 9 5 14 甲磺酸萘莫司他 安徽悦康凯悦制药有限公司 10 5 15 枸橼酸铋钾 新明珠药业（兰溪）有限公司 1 15 16 阿维巴坦钠 重庆天地药业有限责任公司 6 10 16 乌帕替尼 山东安弘制药有限公司 16 2 18 上海迪赛诺化学制药有限公司 16 2 18 阿帕他胺 连云港贵科药业有限公司 11 9 20 玻璃酸钠 山东焦点福瑞达生物股份有限公司 3 17 20 美阿沙坦钾 安徽艾立德制药有限公司 16 6 22 盐酸甲氧氯普胺 白云山东泰商丘药业有限公司 13 10 23 河南省康华药业股份有限公司 13 10 23 盐酸贝尼地平 汉瑞药业（荆门）有限公司 6 17 23 硫酸镁 江苏省勤奋药业有限公司 7 17 24 美洛昔康 河南优凯制药有限公司 3 22 25 艾拉莫德 浙江东亚药业股份有限公司 16 10 26 艾普拉唑 焦作丽珠合成制药有限公司 24 3 27 硫酸钾 湖南福谦制药有限公司 7 21 28 富马酸喹硫平 日照正济药业有限公司 11 19 30 布立西坦 四川汇宇制药股份有限公司 29 1 30 非奈利酮 江苏润安制药有限公司 34 1 35 常州市阳光药业有限公司 34 1 35 山东锐顺药业有限公司 34 1 35 磷酸奥司他韦 新天地药业股份有限公司 7 30 37 2025年临近收官之际，CDE原料药受理名单再度更新。本月数据中，除了几款重磅慢病药物的仿制热度持续攀升外，细分领域的注射用微量元素原料药申报出现了一波小高潮。以下是本月申报亮点速递。 1. 核心厂家：河北国龙“霸屏”微量元素赛道 本月申报企业中，河北国龙制药的表现尤为抢眼，单月集中申报了大量无机盐类品种。 仔细梳理其申报清单：亚硒酸、钼酸钠、氯化铁、氯化铬、氯化锰、硫酸锰。清一色的微量元素/电解质补充剂原料。这类品种虽然单价不如创新药中间体，但在肠外营养（PN）及特定制剂领域属于刚需，且对杂质控制要求极高。河北国龙此番密集申报，意在通过多品种打包策略，在注射剂辅料及微量元素原料药这一细分蓝海中建立护城河，其在微量元素领域的布局深度值得关注。 2. 热门品种：非奈利酮开启“内卷”模式 在热门仿制药方面，非奈利酮（Finerenone） 的热度在11月达到顶峰。 江苏润安制药 常州市阳光药业 山东锐顺药业 三家企业同台竞技，作为拜耳的重磅炸弹（Kerendia），非奈利酮作为第三代高选择性非甾体盐皮质激素受体拮抗剂（MRA），在糖尿病肾病领域的市场潜力巨大。如此高的申报基数，预示着该品种的专利挑战或首仿争夺战已进入白热化阶段，未来集采预备役名单中必有其一席之地。 此外，CDK4/6抑制剂阿贝西利也迎来了万洋衡水、神隆医药、重庆博腾三家企业的集中申报，抗肿瘤药物赛道的拥挤程度依旧不减。 3. 老药新做：奥司他韦的“长尾”效应 流感神药磷酸奥司他韦在本月依然有新动作，新天地药业申报了该品种，且已转A数量高达30，总数37。 尽管奥司他韦市场已是一片红海，但在流感季的刚性需求下，原料药的消耗量依然惊人。新天地药业此时切入，或许是看中了后疫情时代呼吸道用药市场的常态化放量，亦或是为了配合下游制剂的成本优化。 总结 11月的申报风向标十分清晰：一方面是非奈利酮这类大品种的“研发布局战”，各家都在抢占时间窗口；另一方面是如河北国龙这样在细分无机盐赛道的“差异化突围”。对于原料药企而言，与其在红海中硬碰硬，不如像国龙一样，在特定的高壁垒小品种上做深做透。 本文仅供行业研究参考，不构成投资建议。（关注“原料情报局”，获取更多API硬核数据）

中文摘要 目的   探究应用DEAE Sephadex A-50凝胶吸附法从去冷沉淀血浆上清液（cryoprecipitate reduced plasma supernatant，CRPS）分离纯化人凝血酶原复合物（human prothrombin complex concentrate， PCC）的可行性。 方法   采用凝胶吸附法从CRPS中连续制备3批次PCC制品，对该工艺中PCC原液、半成品和成品的人凝血因子Ⅸ（human coagulation factor Ⅸ, FⅨ）效价回收率、杂蛋白含量、干热病毒灭活效果进行检测分析；对PCC成品进行检定分析和稳定性试验。 结果   以CRPS中FⅨ效价为100%，凝胶吸附工艺中PCC原液、半成品、成品的FⅨ效价回收率分别为（65.0±2.1）%、（56.3±4.2）%、（40.3±1.8）%；原液中杂蛋白含量较低；干热处理前后各项质量指标均合格。PCC成品检定显示，其物理、化学、效价与FⅨ比活性、活化凝血因子活性等质量指标均满足中国药典2020年版三部要求。加速和长期稳定性试验的各项质量指标检测结果与0个月相比虽有所浮动，但均合格。 结论   采用DEAE Sephadex A-50凝胶吸附法可成功从CRPS中分离纯化出PCC。 正文 人凝血酶原复合物（human prothrombin complex concentrate，PCC）是由维生素K介导、在肝脏内合成的糖蛋白。PCC制剂主要由人凝血因子（human coagulation factor ，F）Ⅱ、FⅦ、FⅨ和FⅩ 4种凝血因子组成，临床上常被用于乙型血友病、肝功能损伤等凝血功能障碍疾病的辅助治疗。 DEAE Sephadex A-50凝胶为弱碱性阴离子交换剂，在pH7.2~7.4的环境中能吸附大部分酸性蛋白，且该凝胶的蛋白结合能力强、稳定性好。本研究拟用该凝胶吸附方法分离纯化去冷沉淀血浆上清液（cryoprecipitate reduced plasma supernatant，CRPS）中的PCC，根据中国药典2020年版三部（药典三部）的要求检测相关质量指标，并对成品进行加速和长期稳定性试验，考察各项质量指标的变化情况，为PCC储存环境和有效期的研究提供依据。 1 材料与方法 1.1 样品 3批次CRPS（批号：1、2、3）均由国药集团上海血液制品有限公司制备并提供。 1.2 主要试剂与仪器 氯化钠购自江苏省勤奋药业有限公司；枸橼酸钠购自湖南尔康制药股份有限公司；吐温80购自德国Merck公司；磷酸三丁酯（tri-n-butyl phosphate，TNBP）、盐酸、醋酸和氢氧化钠均购自国药集团化学试剂有限公司；醋酸钠购自上海试四赫维化工有限公司；氨基酸购自上海味之素氨基酸有限公司；DEAE SephadexTM A-50型凝胶购自美国GE公司；GB150-1998型吸附罐A和吸附罐B均购自上海日泰医药设备工程有限公司；Pellicon-2型超滤系统购自美国Millipore公司；ACL TOP-300型全自动凝血仪购自美国沃芬公司。 1.3 PCC的制备 1.3.1　凝胶吸附　按照质量比1 000∶3将每批次CRPS和凝胶干粉加入吸附罐A中，搅拌吸附后排出滤液。然后用洗涤液（10 mmol/L枸橼酸钠溶液和100 mmol/L氯化钠溶液）反复洗涤吸附后的凝胶以去除杂蛋白，再使用解离液（10 mmol/L 枸橼酸钠和1 000 mmol/L氯化钠）将目标蛋白与凝胶分离。目标蛋白溶液经超滤脱盐得PCC，再加入有机溶剂/去污剂混合物灭活剂（质量分数50% 吐温80和15% TNBP），24~26 ℃灭活6 h。将灭活处理后的PCC转移至吸附罐B中，按照1 000 g CRPS 加入1 g凝胶干粉的比例，搅拌吸附后排出滤液，然后用洗涤液去除杂蛋白和残留的灭活剂，用解离液处理获取目标蛋白。 1.3.2　成品制备　对目标蛋白进行第2次超滤脱盐，得PCC原液。收集超滤滤液，加入氨基酸将pH调至7.0，即得PCC半成品。再将其除菌分装至模制瓶中，经冻干后置于80 ℃恒温箱中持续保温72 h进行干热病毒灭活，即得PCC成品。 1.4 凝胶吸附工艺检测 1.4.1　FⅨ效价回收率检测　采用药典三部通则3519的一期法测定凝胶吸附试验中CRPS、PCC原液、PCC半成品、PCC成品的FⅨ效价，以CRPS中FⅨ效价为100.0%，根据下列公式计算3批次中各级FⅨ效价回收率，并计算其均值。 1.4.2　杂蛋白含量检测　采用免疫散射浊度法对3批PCC原液中的IgG、IgA、IgM、人血白蛋白（human albumin，ALB）和纤维连接蛋白（fibronectin，Fn）等杂蛋白含量进行检测。 1.4.3　干热病毒灭活效果　采用1.4.1的方法分别测定3批次干热灭活处理前的PCC冻干品和经80 ℃干热灭活处理72 h后的PCC成品的FⅨ效价，干热灭活处理后FⅨ效价应为8.0~14.0 国际单位（international unit，IU）/mL；采用药典三部通则0731的第一法检测二者中的蛋白质含量，并计算其对应的FⅨ比活性，即FⅨ效价与蛋白质含量的比值，FⅨ比活性应不低于0.5 IU/mg蛋白质；肉眼观察二者的外观，加入20~30 ℃灭菌注射用水，轻轻摇动复溶后再次进行观察，干热灭活处理前后制品的外观均应为白色或灰绿色疏松体，加入20~30 ℃灭菌注射用水复溶后，均应为无色、淡黄色、淡蓝色或黄绿色澄明液体，可带轻微乳光；检测二者加入20~30 ℃灭菌注射用水的复溶时间，应在15 min内完全溶解；采用灯检法检查二者的可见异物指标，不得检出金属屑、玻璃屑、长度＞2 mm的纤维、最大粒径＞2 mm的块状物以及静置一定时间后轻轻旋转时肉眼可见的烟雾状微粒沉积物、无法计数的微粒群或摇不散的沉淀，以及在规定时间内较难计数的蛋白质絮状物等明显可见异物。 1.5 PCC成品检定 1.5.1　物理检测　3批PCC成品的外观、复溶时间和可见异物指标检测及可接受标准参照1.4.3，渗透压摩尔浓度采用药典三部通则0632的冰点下降法检测，可接受标准：渗透压摩尔浓度为240～450 mOsmol/kg。 1.5.2　化学检测　按照药典三部的要求，采用通则0832库伦滴定法检测PCC成品的水分含量，应≤3.0%；采用通则0631电位法检测PCC成品pH值，应为6.5～7.5；采用通则3110火焰光度法检测PCC成品钠离子含量，应≤160 mmol/L；采用通则3108高效液相色谱法检测PCC成品枸橼酸离子含量，应≤25 mmol/L；采用通则3205气相色谱法检测PCC成品TNBP残留量，应≤10 μg/mL；采用通则3203比色法检测吐温80残留量，应≤100 μg/mL；采用通则3123高效液相色谱法检测氨基酸含量，应为0.10~0.30 mol/L。 1.5.3　效价和比活性检测　按1.4.1方法测定3批次PCC成品的FⅨ效价，并按照1.4.3的方法计算FⅨ比活性，要求FⅡ效价≥8.0 IU/mL，FⅦ效价≥5.3 IU/mL，FⅨ效价在8.0~14.0 IU/mL，FⅩ效价≥8.0 IU/mL。 1.5.4　其他项目检测　根据药典三部要求检测PCC成品的人凝血酶活性、凝血因子活性、无菌性、异常毒性、热原、HBV表面抗原（hepatitis B surface antigen， HBsAg）。将3批PCC成品分别和人纤维蛋白原充分混合后，肉眼观察判断其人凝血酶活性， PCC成品应无凝块或纤维蛋白析出；向PCC成品加适量pH 7.5的三羟甲基氨基甲烷缓冲液，至FⅨ效价为 20 IU/mL，并检定其活化的凝血因子活性，供试品稀释液凝固时间均应≥150 s；采用薄膜过滤法对PCC成品进行无菌检查，供试品管应澄清，或虽显浑浊但经确证无菌生长；采用小鼠试验法进行异常毒性检查，7 d观察期内，小鼠应全部健存，且无异常反应，7 d后每只小鼠体重应增加；采用家兔法进行热原检查， 3只家兔注射供试品后的体温变化均＜0.6 ℃且升温总和＜1.3 ℃为合格；采用ELISA检测HBsAg，应为阴性。 1.5.5　稳定性试验 1.5.5.1　加速稳定性试验　将3批PCC成品于（25±2） ℃、相对湿度（60±10）%的条件下放置6个月，第0、3和6个月月末分别取样，采用药典三部通则3519的一期法检测样品FⅡ、FⅦ、FⅨ和FⅩ效价，检测方法及结果标准参照1.4.3和1.5.3。 1.5.5.2　长期稳定性试验　将3批PCC成品存放于（5±3） ℃、相对湿度（60±10）%条件下24个月，第0、12和24个月月末分别取样，按1.5.5.1方法检测样品FⅡ、FⅦ、FⅨ和FⅩ效价，检测方法及结果标准参照1.4.3和1.5.3。 1.6 统计学分析 使用Excel 2020软件对实验数据进行统计分析，数据用均值±标准差表示。组间比较采用单因素方差分析，P＞0.05表示差异无统计学意义。 2 结果 2.1 FⅨ效价回收率 各工艺阶段FⅨ效价回收率呈递减趋势，以CRPS的FⅨ效价为100%，PCC原液、PCC半成品和PCC成品回收率分别为（65.0±2.1）%、（56.3±4.2）%和（40.3±1.8）%，见图1。这表明凝胶吸附过程中超滤截留、凝胶吸附、干热处理等操作对FⅨ效价均会造成一定损失。 2.2 杂蛋白含量 对PCC原液样品进行杂蛋白检测分析，结果如表1所示，IgG、IgA、IgM、ALB和Fn含量分别为≤0.6 、≤0.5 、＜0.2 、＜0.4 和≤0.2 g/L。各种杂蛋白残留量均保持较低的水平，表明2次凝胶吸附和超滤操作能够去除PCC中的大部分杂蛋白，降低了蛋白质含量，从而获得较高比活性的制品。 2.3 干热病毒灭活效果 各指标的检测结果见表2。3批次干热处理后PCC成品的FⅨ效价均在8.0~14.0 IU/mL之间，FⅨ比活性均不低于0.5 IU/mg蛋白质，且二者干热处理前后的检测值间的差异不具有统计学意义，F值分别为6.63、1.80，P值均＞0.05。干热处理前后制品的外观均为白色疏松体，复溶时间均小于10 min，可见异物检查正常，均未出现金属屑、玻璃屑、长度超过2 mm的纤维、以及白色絮状物或颗粒等现象。表明干热处理对PCC制品的质量影响不显著。 2.4 PCC成品检定 2.4.1　物理检测结果　物理检测实验结果显示，3批PCC成品的外观成型均较好，为白色疏松体；复溶时间均在10 min以内，复溶后均为淡蓝色溶液且乳光较轻；可见异物检测中未发现絮状物或蛋白颗粒现象；渗透压摩尔浓度为（375.0±4.6） mOsmol/kg。 2.4.2　化学检测结果　对3批PCC成品进行化学检定，结果显示水分含量为（1.0±0.2）%、pH值为7.0±0.1、钠离子含量为（73.0±7.0） mmol/L、枸橼酸离子含量为（15.3±0.6） mmol/L、TNBP残留量为（0.3±0.4） μg/mL、吐温80残留量为（42.7±12.6） μg/mL、氨基酸含量为（0.2±0.0） mol/L。以上各指标的检定结果均符合药典三部标准，见表3。 2.4.3　效价与FⅨ比活性检测结果　对3批PCC成品的检测结果显示，FⅡ效价为（14.5±1.1） IU/mL，FⅦ效价为（10.8±1.2） IU/mL，FⅨ效价为（10.4±0.4） IU/mL，FⅩ效价为（13.9±0.4） IU/mL，FⅨ比活性计算结果为（0.7±0.1） IU/mg，见表4。各指标检测结果均符合药典三部的要求。 2.4.4　其他项目检测结果　3批PCC成品和人纤维蛋白原充分混合后均未观察到有凝块或纤维蛋白析出；活化凝血因子活性检查结果显示凝固时间为（394.9±18.6） s，均在150 s以上；无菌检查结果显示3批PCC成品的试管均澄清，无菌生长；异常毒性检查结果显示小鼠均无异常反应并健存，且体重增加；热原检查结果显示3只家兔升温值分别为（0.1±0.1） ℃、（0.2±0.1） ℃和（0.3±0.2） ℃，均＜0.6 ℃，且升温总和分别为（0.6±0.1） ℃、（0.6±0.2） ℃和（0.6±0.0） ℃，均＜1.3 ℃；ELISA显示，HBsAg结果均为阴性。 2.4.5　稳定性研究结果 2.4.5.1　加速稳定性试验结果   各指标检测结果均合格。FⅡ、FⅦ、FⅨ和FⅩ效价指标检测结果如表5所示，与0个月相比虽有所浮动，但均合格。FⅡ效价均≥8.0 IU/mL，FⅦ效价均≥5.3 IU/mL，FⅨ效价均在8.0~14.0 IU/mL之间，FⅩ效价均≥8.0 IU/mL。对效价进行单因素方差分析，比较批次间的差异性，结果显示差异均无统计学意义（P值均＞0.05）。 2.4.5.2　长期稳定性试验结果   FⅡ、FⅦ、FⅨ和FⅩ效价指标检测结果如表6所示，与0个月相比虽有所浮动，但均合格。FⅡ效价均≥8.0 IU/mL，FⅦ效价均≥5.3 IU/mL，FⅨ效价均在8.0~14.0 IU/mL之间，FⅩ效价均≥8.0 IU/mL。对效价进行单因素方差分析，比较批次间的差异性，结果显示差异均无统计学意义（P值均＞0.05）。 3 讨论 PCC的制备技术主要包括无机盐吸附法和离子交换吸附法，采用无机盐吸附法制备的PCC虽能满足临床需求，但原料血浆中的枸橼酸盐或柠檬酸盐会干扰PCC的吸附，且被无机盐处理过的血浆难以制备ALB、人免疫球蛋白等其他产品，不利于血浆的综合利用。目前由新乡华兰生物工程股份有限公司、上海莱士血液制品股份有限公司等生产的市售PCC产品主要通过凝胶吸附法获得，其具体制备工艺以及PCC成品的FⅡ、FⅦ、FⅨ和FⅩ含量各不相同。 本研究采用DEAE Sephadex A-50凝胶吸附法从CRPS中连续分离纯化并制备3批次PCC，在比较各阶段过程品的同时，根据药典三部要求对成品各项质量指标进行检测，并开展稳定性研究。首先分析了各工艺阶段的FⅨ效价回收率，结果表明，各级回收率均有损失，且逐级降低，可能原因为超滤过程存在的膜污染和浓差极化现象、除菌过滤过程中的高强度压差、以及冻干和干热处理等因素均会造成蛋白活性损失。然后对原液中的杂蛋白含量进行了检测与分析，发现凝胶吸附结合超滤工艺能实现较低的杂蛋白残留量。研究中还对干热处理前/后PCC制品的质量变化做了比较，结果发现FⅨ效价和比活性均有下降趋势。干热处理常用于凝血因子类产品的病毒灭活工艺，虽然已被证实可以灭活脂包膜和非脂包膜病毒，但对制品活性也会造成一定影响。对干热处理前/后FⅨ效价和比活性做单因素方差分析，结果表明差异不具有统计学意义。本研究还对PCC成品进行了检定分析，结果发现各项指标检测结果均满足药典三部规定，证明该工艺能去除绝大部分的化学物质残留，其中FⅨ的效价和比活性分别为（10.4±0.4） IU/mL和（0.7±0.1） IU/mg，与已有报道相仿。另外对各批次间FⅡ、FⅦ、FⅨ和FⅩ效价的差异性进行了统计学分析，结果表明均不具有统计学意义。 综上所述，本研究采用DEAE Sephadex A-50凝胶吸附法从CRPS中成功制备出安全、稳定的PCC制品，为未来PCC的商业规模化生产奠定了基础。 作者 刘环1  张良1  曹璟1  杨帆1  方明阳2  江砚芳1 1国药集团上海血液制品有限公司血液制剂室，上海 200051；2国药集团昆明血液制品有限公司血液制剂室，昆明 650212 通信作者：江砚芳， Email：jiangyanfang@sinopharm.com 引用本文：刘环, 张良, 曹璟, 等. 人凝血酶原复合物的分离纯化工艺 [J]. 国际生物制品学杂志, 2025, 48(4): 241-246.   DOI: 10.3760/cma.j.cn311962-20241216-00088 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 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中文摘要目的    探讨不同标准品、样品预处理方式、稀释液对人凝血因子IX（human coagulation factor IX，FIX）制剂中FIX效价检测的影响，建立最优的FIX效价检测方法，并对该方法进行验证。方法    选用人凝血酶原复合物（human prothrombin complex，PCC）标准品和欧洲药典FIX标准品，分别采用生理盐水和乏FIX血浆预处理方式稀释标准品和FIX制剂，以及分别采用Owren-Koller稀释液和药典稀释液作为上机稀释液对FIX制剂效价进行检测，比较得出最优FIX效价检测方法，并对该方法的初步应用、专属性、准确度、中间精密度和线性进行检测。结果    采用PCC标准品和欧洲药典FIX标准品定标检测FIX效价时，FIX效价检测值与标示量的比值范围分别为0.94~1.14、0.96~1.03；乏FIX血浆预处理方式的FIX效价检测值相比生理盐水预处理方式更接近于标准值；Owren-Koller稀释液相比药典稀释液作为上机稀释液的检测结果更接近标示量，因此选用PCC标准品、乏FIX血浆预处理方式及Owren-Koller稀释液建立FIX效价检测方法。该方法对于广东双林生物制药有限公司FIX制剂样品和FIX上市产品同样适用，灭活后与未经灭活FIX制剂稀释的标准品溶液测得的效价比值为0.96，4组不同相对效价水平的FIX制剂效价检测值的相对偏倚均在±20%范围内，检测值的几何变异系数均≤20%，线性回归方程的相关系数均≥0.98，以上检测值均在可接受范围内。结论    采用PCC标准品、乏FIX血浆预处理方式及Owren-Koller稀释液建立了最优的FIX效价检测方法，该方法具有良好的专属性、准确度、中间精密度和线性。正文人凝血因子IX（human coagulation factor IX，FIX）是一种维生素K依赖型糖蛋白，相对分子质量为67 000，在体内由肝细胞合成并分泌到血液中，在健康人血浆中浓度约为5 μg/ml。该物质是人体凝血级联反应中的活性成分，参与人体凝血过程，FIX可以同时接收内源性和外源性凝血信号，促发凝血反应。当血浆中FIX含量或活性大幅下降时，内源性凝血途径会受到阻碍，无法进行正常的凝血。FIX制剂可用于预防和治疗因FIX缺乏而导致的出血，如乙型血友病。FIX效价是检测FIX制剂有效性的指标，是药品的关键质量检测项目。目前关于FIX效价检测影响因素的研究都是基于人凝血酶原复合物（human prothrombin complex，PCC）中的FIX效价检测展开的。如周仁花就活化部分凝血活酶时间（activated partial thromboplastin time，APTT）试剂、稀释液等因素对PCC中FIX效价测定的影响进行探讨，李青等就钙离子浓度、磷酸三丁酯/聚山梨酯-80试剂、硫酸鱼精蛋白中和肝素等因素对PCC中FIX效价测定的影响进行探讨，但关于FIX制剂中FIX效价检测方面的内容还未见报道。本研究基于PCC与FIX制剂的不同特征，就FIX制剂效价检测的影响因素展开研究，为因子类血液制品的效价检测提供参考。1材料与方法1.1主要材料与仪器PCC标准品（批号：20130306）购自中国食品药品检定研究院；欧洲药典FIX标准品（批号：11483）购自深圳市鼎盛佳生物科技有限公司；乏FIX血浆、APTT试剂、Owren-Koller稀释液均购自法国Stago公司；氯化钠（注射级）购自江苏省勤奋药业有限公司；FIX制剂样品（批号：202107M02、202107M03、202108M04）由广东双林生物制药有限公司（本公司）提供；FIX制剂上市产品（批号：20201110）购自山东泰邦生物制品有限公司。Eppendorf Reference 2移液器购自德国Eppendorf公司，STA R Max全自动凝血分析仪购自法国Stago公司。1.2FIX效价检测方法的建立1.2.1   FIX效价检测原理  将APTT试剂加入经适当稀释的待检FIX制剂样品中。APTT试剂中的微粒硅胶是血小板因子的表面活性剂，与脑磷脂一起作用于内源凝血系统，加入氯化钙后会产生纤维蛋白血凝块。通过确定血凝固时间来测定APTT，因FIX效价与APTT成反比，可进而推算出FIX效价。1.2.2   PCC标准品与欧洲药典FIX标准品对FIX效价检测的影响  目前，FIX制剂效价的检测方法已被欧洲药典收录，采用欧洲药典FIX标准品（药典FIX标准品）；国内一般参考中国药典收录的PCC的FIX效价检测方法来检测FIX制剂效价，采用PCC标准品。本研究对以上2种标准品进行比较，将PCC标准品与药典FIX标准品分别按照1.2.1检测方法定标检测样品的FIX效价，两者均检测5次。将两者的效价结果与样品包装标示量的比值进行比较，依据FIX企业质量标准，效价检测值与标示量比值范围应为0.8~1.4。1.2.3   不同样品预处理方式对FIX效价检测的影响  通过对1.2.2试验结果进行分析，选择最佳标准品，并将该标准品分别用乏FIX血浆和生理盐水稀释成约每毫升1个国际单位（international unit，IU）FIX的溶液上机，仪器自动稀释成以下浓度进行定标：1.00、0.50、0.25、0.13 IU/ml。定标后将FIX制剂样品（标示量为50 IU/ml）分别用乏FIX血浆和生理盐水稀释至约1.00 IU/ml，上机仪器用配套稀释液将样品自动稀释成适宜浓度，对FIX效价进行检测。以效价理论值的对数为横坐标，效价检测值的对数为纵坐标，对FIX效价检测值做回归分析，计算相关系数(r)，并分别计算FIX效价检测值及r的均值±标准差。可接受标准：r ≥0.98，标准差越小，效价检测值越接近于标准值。1.2.4  不同上机稀释液对FIX效价检测的影响  3批次FIX制剂样品均先用1.2.2选择的最佳标准品进行定标，再用乏FIX血浆将FIX制剂稀释成约1 IU/ml，上机仪器分别用Owren-Koller稀释液和药典稀释液将样品自动稀释成适宜浓度，对FIX效价进行检测。其中Owren-Koller稀释液是全自动凝血分析仪厂家配套的稀释液，药典稀释液按照中国药典2020年版三部（药典三部）通则3519方法配制。每批次样品均进行5次测试，得出相对标准偏差（relative standard deviation，RSD），RSD越高说明FIX效价检测值越不稳定。1.2.5  FIX效价检测方法的初步应用  选取最佳标准品、样品预处理方式和上机稀释液后，使用全自动凝血分析仪对本公司FIX制剂样品和FIX上市产品的FIX效价分别进行3次检测。两者的FIX制剂标示量均为50 IU/ml，比较本公司FIX制剂样品和FIX上市产品的FIX效价检测值与标示量的百分比，可接受标准：比值范围为80%~140%。1.3方法学验证1.3.1  专属性  将FIX制剂置于90 °C水浴4 h灭活，测定灭活样品的FIX效价。用灭活FIX制剂将标准品溶液应用全自动凝血仪自动稀释至适宜浓度，测定效价。分析其效价检测值与未经灭活FIX制剂稀释的标准品溶液测得的效价结果的比值，确认该分析方法的专属性是否符合要求。可接受标准：测得的比值在0.8~1.2之间。1.3.2  准确度  取PCC标准品，按说明书复溶，分别用乏FIX血浆将标准品溶液稀释至1.0 IU/ml，将待测溶液稀释至1.5、1.0、0.8、0.5 IU/ml。先将标准品溶液进行上机定标，待测溶液按照日常测定供试品要求上机测试，保证4组待测溶液的相对效价水平分别为150%、100%、80%、50%。每个效价水平的溶液独立测定3次FIX效价。以效价理论值的对数为横坐标，效价测定值的对数为纵坐标，进行线性回归，并计算每个效价水平的溶液效价测定值的相对偏倚以及直线回归方程的斜率。可接受标准：每个效价水平的溶液效价测定值的相对偏倚在±20%范围内，斜率在0.85~1.25范围内。1.3.3   中间精密度  按照1.3.2的方法将4组待测溶液的相对效价水平分别调为150%、100%、80%、50%，后由2名实验人员（甲与乙）每3天对每个效价水平溶液的FIX效价进行测试，2人9 d共测试3组，每个效价水平均被测试6次。计算每个效价水平的溶液测得的几何变异系数（geometric coefficient of variation，GCV）。可接受标准：每个效价水平溶液的相对效价测定值的GCV ≤20%。1.3.4  线性与范围  按照1.3.2的方法将4组待测溶液的相对效价水平分别调为150%、100%、80%、50%，每个效价水平的测试溶液独立测定FIX效价3次。以效价理论值的对数为横坐标，相应效价测定值的对数为纵坐标，进行线性回归，并计算回归方程的r。可接受标准：r ≥0.98。2结果2.1PCC标准品与欧洲药典FIX标准品对FIX效价检测的影响由表1可知，采用PCC标准品定标样品检测FIX效价时，FIX效价检测值与标示量的比值范围为0.94~1.14；采用欧洲药典FIX标准品定标样品检测FIX效价时，FIX效价检测值与标示量的比值范围为0.96~1.03，两者的检测结果均在标示范围内。由于PCC标准品在国内被普遍采用，且容易采购，因此后续试验选用PCC标准品。2.2不同样品预处理方式对FIX效价检测的影响由表2可知，不同样品预处理方式对FIX制剂效价检测影响较大，乏FIX血浆预处理方式的FIX效价检测值相比生理盐水预处理方式更接近于标准值，标准偏差为0.300 IU/ml，远低于生理盐水组的0.917 IU/ml。另外乏FIX血浆预处理组的平均r为0.999，符合r≥0.98的标准。综上说明，乏FIX血浆预处理组的相关性更好，检测波动范围更小，更稳定。2.3不同上机稀释液对FIX效价的影响不同上机稀释液处理样品后FIX制剂效价的检测结果如表3所示。采用PCC标准品、乏FIX血浆预处理方式、药典稀释液上机处理样品时，平均RSD是Owren-Koller稀释液处理组的1.603~2.514倍， 说明采用Owren-Koller稀释液作为上机稀释液的检测结果更接近标示量，更为稳定。2.4FIX效价检测方法的初步应用基于上述实验，采用PCC标准品，乏FIX血浆预处理方式，Owren-Koller稀释液作为上机稀释液为FIX效价检测的最优方法。应用此方法检测本公司FIX制剂样品（批号：202108M04）和FIX上市产品（批号：20201110）效价。由表4数据可知，两者的FIX效价检测值与标示量的百分比数值均在可接受标准范围内。说明此方法对于本公司FIX制剂样品和FIX上市产品同样适用，分析方法可靠稳定。2.5方法学验证2.5.1   专属性  灭活FIX制剂样品、未经灭活FIX制剂稀释的PCC标准品、经灭活FIX制剂稀释后的PCC标准品的效价检测值见表5。经灭活FIX制剂稀释后的PCC标准品与未经灭活FIX制剂稀释的标准品溶液测得的效价比值为0.96，在可接受范围内，表明该方法具有良好的专属性。2.5.2   准确度  3次测定4组相对效价水平的FIX制剂效价检测值见表6。由表可知，每组测定值的相对偏倚均在±20%范围内，且对应的回归方程的斜率也在0.85~1.25范围内，表明该方法具有良好的准确度。2.5.3   中间精密度  甲、乙 2 名实验人员9 d内分别测试4组不同相对效价水平溶液的FIX效价，检测值见表7。每组效价水平检测值的GCV均≤20%，在可接受范围内。表明FIX效价检测方法中间精密度良好。2.5.4  线性与范围  如表8所示，FIX效价检测值在相对效价水平50%~150%范围时，3次检测值的线性回归方程的r均≥0.98，在可接受范围内，表明该检测方法在相对效价水平为50%~150%范围内，具有良好的线性关系。3讨论国家药品标准物质是国家药品标准的物质基础，它是用来检查药品质量的一种特殊的专用量具，是测量药品质量的基准，也是校正测试仪器与方法的物质标准。在药品检验中，它是确定药品真伪优劣的对照，是控制药品质量必不可少的工具。目前，国内FIX效价检测标准品采用的是中国食品药品检定研究院提供的PCC标准品，依据欧洲药典FIX检测方法的国外FIX上市产品采用的是欧洲药典FIX标准品，本研究对2种标准品进行了对比研究，发现无明显差异。FIX制剂与PCC制剂存在不同的物理化学特征，对于FIX效价的检测，需要进行分析方法学的研究与验证才能进行分析方法的制定。结合前期的研究成果，本研究对重点影响因素进行研究，探究不同预处理方式（生理盐水、乏FIX血浆）对FIX效价检测的影响。研究结果显示，采用乏FIX血浆预处理方式的检测结果更贴近上市产品的标示量，相关性和稳定性更好。探究不同上机稀释液（Owren-Koller和药典稀释液）对FIX制剂效价的影响，结果显示，采用Owren-Koller作为上机稀释液测试结果更接近标示量，也更稳定。采用优选方法（乏FIX血浆预处理和Owren-Koller作为上机稀释液）将本公司FIX制剂样品和FIX制剂上市产品进行测试对比。结果显示，此优选方法对于本公司FIX制剂样品和FIX上市产品同样适用，分析方法可靠稳定。本研究建立的FIX制剂效价检测方法经方法学验证，专属性、准确度、中间精密度、线性均良好，可为FIX制剂效价的质量控制提供可靠依据。作者庾昌文  肖雅芳  刘郴  郑炎广东双林生物制药有限公司研发中心，湛江  524076通信作者：郑炎，Email：zhengyan@slbiop.com引用本文：庾昌文，肖雅芳，刘郴，等.  人凝血因子IX制剂效价检测影响因素研究 [J]. 国际生物制品学杂志, 2024, 47(1): 33-38.  DOI: 10.3760/cma.j.cn311962-20230524-00049识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入生物制品微信群！请注明：姓名+研究方向！版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。