Jiangsu Qinfen Pharmaceutical Co., Ltd.

中文摘要目的    探讨不同标准品、样品预处理方式、稀释液对人凝血因子IX（human coagulation factor IX，FIX）制剂中FIX效价检测的影响，建立最优的FIX效价检测方法，并对该方法进行验证。方法    选用人凝血酶原复合物（human prothrombin complex，PCC）标准品和欧洲药典FIX标准品，分别采用生理盐水和乏FIX血浆预处理方式稀释标准品和FIX制剂，以及分别采用Owren-Koller稀释液和药典稀释液作为上机稀释液对FIX制剂效价进行检测，比较得出最优FIX效价检测方法，并对该方法的初步应用、专属性、准确度、中间精密度和线性进行检测。结果    采用PCC标准品和欧洲药典FIX标准品定标检测FIX效价时，FIX效价检测值与标示量的比值范围分别为0.94~1.14、0.96~1.03；乏FIX血浆预处理方式的FIX效价检测值相比生理盐水预处理方式更接近于标准值；Owren-Koller稀释液相比药典稀释液作为上机稀释液的检测结果更接近标示量，因此选用PCC标准品、乏FIX血浆预处理方式及Owren-Koller稀释液建立FIX效价检测方法。该方法对于广东双林生物制药有限公司FIX制剂样品和FIX上市产品同样适用，灭活后与未经灭活FIX制剂稀释的标准品溶液测得的效价比值为0.96，4组不同相对效价水平的FIX制剂效价检测值的相对偏倚均在±20%范围内，检测值的几何变异系数均≤20%，线性回归方程的相关系数均≥0.98，以上检测值均在可接受范围内。结论    采用PCC标准品、乏FIX血浆预处理方式及Owren-Koller稀释液建立了最优的FIX效价检测方法，该方法具有良好的专属性、准确度、中间精密度和线性。正文人凝血因子IX（human coagulation factor IX，FIX）是一种维生素K依赖型糖蛋白，相对分子质量为67 000，在体内由肝细胞合成并分泌到血液中，在健康人血浆中浓度约为5 μg/ml。该物质是人体凝血级联反应中的活性成分，参与人体凝血过程，FIX可以同时接收内源性和外源性凝血信号，促发凝血反应。当血浆中FIX含量或活性大幅下降时，内源性凝血途径会受到阻碍，无法进行正常的凝血。FIX制剂可用于预防和治疗因FIX缺乏而导致的出血，如乙型血友病。FIX效价是检测FIX制剂有效性的指标，是药品的关键质量检测项目。目前关于FIX效价检测影响因素的研究都是基于人凝血酶原复合物（human prothrombin complex，PCC）中的FIX效价检测展开的。如周仁花就活化部分凝血活酶时间（activated partial thromboplastin time，APTT）试剂、稀释液等因素对PCC中FIX效价测定的影响进行探讨，李青等就钙离子浓度、磷酸三丁酯/聚山梨酯-80试剂、硫酸鱼精蛋白中和肝素等因素对PCC中FIX效价测定的影响进行探讨，但关于FIX制剂中FIX效价检测方面的内容还未见报道。本研究基于PCC与FIX制剂的不同特征，就FIX制剂效价检测的影响因素展开研究，为因子类血液制品的效价检测提供参考。1材料与方法1.1主要材料与仪器PCC标准品（批号：20130306）购自中国食品药品检定研究院；欧洲药典FIX标准品（批号：11483）购自深圳市鼎盛佳生物科技有限公司；乏FIX血浆、APTT试剂、Owren-Koller稀释液均购自法国Stago公司；氯化钠（注射级）购自江苏省勤奋药业有限公司；FIX制剂样品（批号：202107M02、202107M03、202108M04）由广东双林生物制药有限公司（本公司）提供；FIX制剂上市产品（批号：20201110）购自山东泰邦生物制品有限公司。Eppendorf Reference 2移液器购自德国Eppendorf公司，STA R Max全自动凝血分析仪购自法国Stago公司。1.2FIX效价检测方法的建立1.2.1   FIX效价检测原理  将APTT试剂加入经适当稀释的待检FIX制剂样品中。APTT试剂中的微粒硅胶是血小板因子的表面活性剂，与脑磷脂一起作用于内源凝血系统，加入氯化钙后会产生纤维蛋白血凝块。通过确定血凝固时间来测定APTT，因FIX效价与APTT成反比，可进而推算出FIX效价。1.2.2   PCC标准品与欧洲药典FIX标准品对FIX效价检测的影响  目前，FIX制剂效价的检测方法已被欧洲药典收录，采用欧洲药典FIX标准品（药典FIX标准品）；国内一般参考中国药典收录的PCC的FIX效价检测方法来检测FIX制剂效价，采用PCC标准品。本研究对以上2种标准品进行比较，将PCC标准品与药典FIX标准品分别按照1.2.1检测方法定标检测样品的FIX效价，两者均检测5次。将两者的效价结果与样品包装标示量的比值进行比较，依据FIX企业质量标准，效价检测值与标示量比值范围应为0.8~1.4。1.2.3   不同样品预处理方式对FIX效价检测的影响  通过对1.2.2试验结果进行分析，选择最佳标准品，并将该标准品分别用乏FIX血浆和生理盐水稀释成约每毫升1个国际单位（international unit，IU）FIX的溶液上机，仪器自动稀释成以下浓度进行定标：1.00、0.50、0.25、0.13 IU/ml。定标后将FIX制剂样品（标示量为50 IU/ml）分别用乏FIX血浆和生理盐水稀释至约1.00 IU/ml，上机仪器用配套稀释液将样品自动稀释成适宜浓度，对FIX效价进行检测。以效价理论值的对数为横坐标，效价检测值的对数为纵坐标，对FIX效价检测值做回归分析，计算相关系数(r)，并分别计算FIX效价检测值及r的均值±标准差。可接受标准：r ≥0.98，标准差越小，效价检测值越接近于标准值。1.2.4  不同上机稀释液对FIX效价检测的影响  3批次FIX制剂样品均先用1.2.2选择的最佳标准品进行定标，再用乏FIX血浆将FIX制剂稀释成约1 IU/ml，上机仪器分别用Owren-Koller稀释液和药典稀释液将样品自动稀释成适宜浓度，对FIX效价进行检测。其中Owren-Koller稀释液是全自动凝血分析仪厂家配套的稀释液，药典稀释液按照中国药典2020年版三部（药典三部）通则3519方法配制。每批次样品均进行5次测试，得出相对标准偏差（relative standard deviation，RSD），RSD越高说明FIX效价检测值越不稳定。1.2.5  FIX效价检测方法的初步应用  选取最佳标准品、样品预处理方式和上机稀释液后，使用全自动凝血分析仪对本公司FIX制剂样品和FIX上市产品的FIX效价分别进行3次检测。两者的FIX制剂标示量均为50 IU/ml，比较本公司FIX制剂样品和FIX上市产品的FIX效价检测值与标示量的百分比，可接受标准：比值范围为80%~140%。1.3方法学验证1.3.1  专属性  将FIX制剂置于90 °C水浴4 h灭活，测定灭活样品的FIX效价。用灭活FIX制剂将标准品溶液应用全自动凝血仪自动稀释至适宜浓度，测定效价。分析其效价检测值与未经灭活FIX制剂稀释的标准品溶液测得的效价结果的比值，确认该分析方法的专属性是否符合要求。可接受标准：测得的比值在0.8~1.2之间。1.3.2  准确度  取PCC标准品，按说明书复溶，分别用乏FIX血浆将标准品溶液稀释至1.0 IU/ml，将待测溶液稀释至1.5、1.0、0.8、0.5 IU/ml。先将标准品溶液进行上机定标，待测溶液按照日常测定供试品要求上机测试，保证4组待测溶液的相对效价水平分别为150%、100%、80%、50%。每个效价水平的溶液独立测定3次FIX效价。以效价理论值的对数为横坐标，效价测定值的对数为纵坐标，进行线性回归，并计算每个效价水平的溶液效价测定值的相对偏倚以及直线回归方程的斜率。可接受标准：每个效价水平的溶液效价测定值的相对偏倚在±20%范围内，斜率在0.85~1.25范围内。1.3.3   中间精密度  按照1.3.2的方法将4组待测溶液的相对效价水平分别调为150%、100%、80%、50%，后由2名实验人员（甲与乙）每3天对每个效价水平溶液的FIX效价进行测试，2人9 d共测试3组，每个效价水平均被测试6次。计算每个效价水平的溶液测得的几何变异系数（geometric coefficient of variation，GCV）。可接受标准：每个效价水平溶液的相对效价测定值的GCV ≤20%。1.3.4  线性与范围  按照1.3.2的方法将4组待测溶液的相对效价水平分别调为150%、100%、80%、50%，每个效价水平的测试溶液独立测定FIX效价3次。以效价理论值的对数为横坐标，相应效价测定值的对数为纵坐标，进行线性回归，并计算回归方程的r。可接受标准：r ≥0.98。2结果2.1PCC标准品与欧洲药典FIX标准品对FIX效价检测的影响由表1可知，采用PCC标准品定标样品检测FIX效价时，FIX效价检测值与标示量的比值范围为0.94~1.14；采用欧洲药典FIX标准品定标样品检测FIX效价时，FIX效价检测值与标示量的比值范围为0.96~1.03，两者的检测结果均在标示范围内。由于PCC标准品在国内被普遍采用，且容易采购，因此后续试验选用PCC标准品。2.2不同样品预处理方式对FIX效价检测的影响由表2可知，不同样品预处理方式对FIX制剂效价检测影响较大，乏FIX血浆预处理方式的FIX效价检测值相比生理盐水预处理方式更接近于标准值，标准偏差为0.300 IU/ml，远低于生理盐水组的0.917 IU/ml。另外乏FIX血浆预处理组的平均r为0.999，符合r≥0.98的标准。综上说明，乏FIX血浆预处理组的相关性更好，检测波动范围更小，更稳定。2.3不同上机稀释液对FIX效价的影响不同上机稀释液处理样品后FIX制剂效价的检测结果如表3所示。采用PCC标准品、乏FIX血浆预处理方式、药典稀释液上机处理样品时，平均RSD是Owren-Koller稀释液处理组的1.603~2.514倍， 说明采用Owren-Koller稀释液作为上机稀释液的检测结果更接近标示量，更为稳定。2.4FIX效价检测方法的初步应用基于上述实验，采用PCC标准品，乏FIX血浆预处理方式，Owren-Koller稀释液作为上机稀释液为FIX效价检测的最优方法。应用此方法检测本公司FIX制剂样品（批号：202108M04）和FIX上市产品（批号：20201110）效价。由表4数据可知，两者的FIX效价检测值与标示量的百分比数值均在可接受标准范围内。说明此方法对于本公司FIX制剂样品和FIX上市产品同样适用，分析方法可靠稳定。2.5方法学验证2.5.1   专属性  灭活FIX制剂样品、未经灭活FIX制剂稀释的PCC标准品、经灭活FIX制剂稀释后的PCC标准品的效价检测值见表5。经灭活FIX制剂稀释后的PCC标准品与未经灭活FIX制剂稀释的标准品溶液测得的效价比值为0.96，在可接受范围内，表明该方法具有良好的专属性。2.5.2   准确度  3次测定4组相对效价水平的FIX制剂效价检测值见表6。由表可知，每组测定值的相对偏倚均在±20%范围内，且对应的回归方程的斜率也在0.85~1.25范围内，表明该方法具有良好的准确度。2.5.3   中间精密度  甲、乙 2 名实验人员9 d内分别测试4组不同相对效价水平溶液的FIX效价，检测值见表7。每组效价水平检测值的GCV均≤20%，在可接受范围内。表明FIX效价检测方法中间精密度良好。2.5.4  线性与范围  如表8所示，FIX效价检测值在相对效价水平50%~150%范围时，3次检测值的线性回归方程的r均≥0.98，在可接受范围内，表明该检测方法在相对效价水平为50%~150%范围内，具有良好的线性关系。3讨论国家药品标准物质是国家药品标准的物质基础，它是用来检查药品质量的一种特殊的专用量具，是测量药品质量的基准，也是校正测试仪器与方法的物质标准。在药品检验中，它是确定药品真伪优劣的对照，是控制药品质量必不可少的工具。目前，国内FIX效价检测标准品采用的是中国食品药品检定研究院提供的PCC标准品，依据欧洲药典FIX检测方法的国外FIX上市产品采用的是欧洲药典FIX标准品，本研究对2种标准品进行了对比研究，发现无明显差异。FIX制剂与PCC制剂存在不同的物理化学特征，对于FIX效价的检测，需要进行分析方法学的研究与验证才能进行分析方法的制定。结合前期的研究成果，本研究对重点影响因素进行研究，探究不同预处理方式（生理盐水、乏FIX血浆）对FIX效价检测的影响。研究结果显示，采用乏FIX血浆预处理方式的检测结果更贴近上市产品的标示量，相关性和稳定性更好。探究不同上机稀释液（Owren-Koller和药典稀释液）对FIX制剂效价的影响，结果显示，采用Owren-Koller作为上机稀释液测试结果更接近标示量，也更稳定。采用优选方法（乏FIX血浆预处理和Owren-Koller作为上机稀释液）将本公司FIX制剂样品和FIX制剂上市产品进行测试对比。结果显示，此优选方法对于本公司FIX制剂样品和FIX上市产品同样适用，分析方法可靠稳定。本研究建立的FIX制剂效价检测方法经方法学验证，专属性、准确度、中间精密度、线性均良好，可为FIX制剂效价的质量控制提供可靠依据。作者庾昌文  肖雅芳  刘郴  郑炎广东双林生物制药有限公司研发中心，湛江  524076通信作者：郑炎，Email：zhengyan@slbiop.com引用本文：庾昌文，肖雅芳，刘郴，等.  人凝血因子IX制剂效价检测影响因素研究 [J]. 国际生物制品学杂志, 2024, 47(1): 33-38.  DOI: 10.3760/cma.j.cn311962-20230524-00049识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入生物制品微信群！请注明：姓名+研究方向！版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。