一、行业现状与发展趋势
双特异性抗体 (BsAb) 和多特异性抗体 (msAb) 能同时结合多个表位,解锁新的作用机制 (MOA)。与传统mAb相比,BsAb/msAb的开发面临额外的结构复杂性挑战。
行业现状:
双抗已进入成熟期,三抗成为新风口
截至2026年5月底,全球已有 20款 双抗药物上市,三特异性抗体(三抗)尚无产品上市。中国管线数量全球领先,美国在进展上占优中国在研三抗管线数量占全球约 40%,美国虽数量略少,但临床进展更快。
发展趋势:
• T细胞衔接器(TCE)领域已有 32款TCE三抗进入临床。
• NK细胞衔接器(NKCE)如赛诺菲SAR443579(CD123×NKp46×CD16),已进入临床II期。
• 免疫检查点三抗/双免疫检查点组合:如PD-1/VEGF/CTLA-4三抗也展现出巨大潜力。
二、可开发性风险的全面评估与分析
商业化双抗药品的核心结构 &临床定位
商业化双抗药品的制剂参数
双/三抗因其结构复杂性具有较高的可开发性风险
对IgG抗体的改造可能会降低分子的稳定性,增加其免疫原性
常见的双/多特异性抗体结构:
01
对称结构的、类似IgG的双特异性抗体
02
含有scFv片段和sdAb片段的双特异性抗体
03
多价双特异性抗体
04
多特异性抗体
关键发现与风险提示:
• 几何结构或价态的变化并不会影响抗体的表达水平或热 稳定性。
• 增加scFv的数量则会导致更高的异质性以及更强的聚集 倾向。
• VHH纳米抗体具有优异热稳定性,可辅助稳定化。
• 非Fc结构抗体,半衰期短。
可开发性评估中工艺优化以提高分子稳定性
1. CE-SDS (NR and R)表明 HC 截断
2. 通过LC-MS进行肽图谱分析,确认了截短位点
3. UF/DF通过工艺优化解决截断问题
4. CE-SDS (NR and R)显示无截断
多抗结构域的pI是优化胶体稳定性与黏度的关键
NKp30×EGFR自然杀伤细胞衔接器NKCE
挑战:起始分子存在电荷不对称性,易引发静电驱动的 self-association,导致聚集和粘度升高。
• Fab域pI=8.4(正点)
• VHH域pI=4.5(负点)
• pH5.5-8.0下电荷相反
策略:构建pI变体库和进行组合验证
结果:
优化分子平衡Fab与VHH的pI至弱碱性范围,其性能显著提升(序列pI与kD相关性最强,Spearman r = 0.85)
结论:
建议在早期抗体发现阶段,将可变域pI纳入设计准则(目标7.5-9.0)
对表面疏水性和构象稳定性的工程改造可以改善搅拌引起的聚集
挑战:
• CMC阶段进行15升规模生产时,在搅拌条件下出现了显著的絮状蛋白质沉淀。
• 常规方法(更换不同的pH、缓冲液组成、赋形剂和表面活性剂)无法解决此问题。
调查:
• 两种亲本单抗X1和Y1,在摇晃后均出现沉淀。
• X1的表面疏水性HIC较强,表明胶体稳定性差。
• Y1的Tm1值偏低,表明热稳定性差,构象稳定性差。
• 空间聚集倾向性(SAP)分析与同类抗体的序列比对
工程优化
X2Y1-e被转移到CMC进行50L规模的生产。生产成功结束,总收率为61%,SEC纯度为98.4%。在整个生产过程中没有出现沉淀。
三、稳定性挑战与有效的控制策略
处方筛选提升双特异性抗体稳定性的案例研究
缓冲液的pH值较高,稳定性越好(与PI的差异<1)
对于一种双特异性抗体(等电点pI=6.67,且存在多个等电点)
• 当pH值较高时,产生的片段较少 (pH 6.0优于pH 5.0/5.3/5.5)
• icIEF峰值与片段的变化趋势相似。
• 除磷酸盐缓冲液(pH 7.5和8.0)外,高分子量组分(HMW)未见明显增加。
离子强度越低,稳定性越好
• 与蔗糖制剂和氯化钠制剂相比,蔗糖+氯化钠制剂的碎片化程度更高。
• icIEF峰值的变化趋势与碎片化程度相似。
• 这三种制剂的高分子量物质均未出现明显增加。
Duet mAb液体制剂的全面强制降解稳定性研究
🔬 研究背景与目的:
• Duet mAb:不对称单价双特异性IgG1抗体(两个不同Fab臂,两个不同表位)
• 结构特征:工程化二硫键 + knob-into-hole突变 + kappa/lambda轻链
• 问题:BsAb的结构复杂性是否导致额外降解途径?
• 目的:系统揭示Duet mAb在不同应力下的降解途径
🧪 实验方法:
• 处方: 50 mg/mL,20mM His, 240mM sucrose, 0.02% PS80,pH 6.0
• 强制降解:热应力(40°C 3个月)、pH应力(3.5, 8.5)、光应力、化学氧化(H₂O₂、AAPH)、加速生理条件、强制糖基化
• 多维分析表征:HPSEC、CE-SDS、CIEX、DLS、DSC、肽图LC-MS/MS、生物学活性
📊 主要研究结果:
• Duet mAb降解产物、降解途径和液体制剂稳定性与标准IgG1高度相似
• 观察到适度的大小变异、电荷变异、疏水性变异
• PTMs包括:脱酰胺、氧化、异构化、糖基化
• 各条件下生物活性基本保持
• 分级电荷变体(含脱酰胺)仍具有满意的生物活性
✅ 结论和意义:
该Duet mAb的全面强制降解研究与使用CrossMab技术生产的另一种不对称双特异性抗体的稳定性研究均表明BsAb开发者:结构复杂≠稳定性差,非对称BsAb格式可作为稳定生物药平台。
二硫键:在所有极端应力下,均未观察到错配或重排,保持完整。
冻干可以有效稳定双抗
• 一种易发生碎裂的双特异性抗体(bsAb)分子,这会导致其液体制剂中活性过高,从而产生不良影响。
• 冻干工艺可使该双特异性抗体外观良好且稳定性极佳。
添加EDTA 可防止PS80降解
• PS80的降解可能导致药物制剂中出现颗粒问题,并缩短保质期
• 通过在工艺或者处方中加入EDTA可减少PS80的降解
静脉输液袋在医院气动管道运输过程中双特异性抗体的聚集
❓问题:
医院广泛使用气动管道系统快速运输药品和样本,但其产生的剧烈机械应力(冲击、振动)可能破坏蛋白质药物的结构稳定性,导致蛋白聚集和亚可见颗粒形成,从而引发免疫原性风险,影响药物安全性和有效性。
应力表征:
使用加速度数据记录仪测量,产生短时、高强度的尖锐冲击,峰值加速度高达 ~17.6 G,显著高于人工运输和实验室振荡(250次/分钟,60分钟)。
抗体质量影响:
mAb形成大量小微粒(>2µm为主),BsAb形成较少但更大的微粒(>25µm)。
策略:
• 表面活性剂的保护作用:PS80的保护效果显著优于P188, PS80显著降低mAb微粒数量,对BsAb缓解作用有限。
• 去除顶空空间,可有效减少微粒形成,具有保护作用
• 包装材料PVC袋(DEHP增塑剂)产生圆形微粒;PO袋中此类微粒显著减少。
高活性药物的临床相容性研究平台
强效药物的临床应用经验,以及在输液袋、输液管等中防止蛋白质流失的策略。
(1)在输液袋中添加缓冲液以提高蛋白质的稳定性
(2)采用两步稀释法以提高给药准确性
1. Administration method: Syringe and Inject pump for Low dose, Infusion pump for high dose.
2. Consumable material: B.Braun(PO)/Baxter(PVC) IV bag; ICU(PE)/B.Braun(PVC) Infusion line.
3. Test Item: Visible Particle, Particulate matter, Clarity, Color, pH, Conc., SEC-HPLC, CEX, Potency.
基于CSTD系统的临床相容性研究平台
(1) 无论药物是否具有危险性,均建议在临床中使用封闭式输液装置(CSTD),原因包括无需操作针头以及能有效控制微生物污染。
(2) 临床相容性研究应评估药物的吸附损失、聚集、亚可见颗粒、可见颗粒以及滞留体积。对于低剂量药物(例如≤2 mL),需要额外的冲洗程序以确保剂量准确。
(3) 实验室配备了博朗(B. Braun)静脉注射注射泵,用于小容量输注。
Fig. Schematic of IV in-use study design using CSTD
CCSTD brand
ChemoLock - ICU medical
Tevadaptor - B.Braun
Arisure® - Yukon Medical
Halo® - Corvida Medical
ChemoClave - ICU medical
Chemfort - B.Braun
Phaseal - BD
Equashield®¹ - Equashield
四、机器学习辅助抗体发现与优化的展望
蛋白质数据(如结构、互作数据)的爆炸式增长、GPU计算能力的提升以及先进机器学习模型(如Transformer、蛋白质语言模型)的发展,共同为机器学习模型辅助抗体设计的变革创造了条件。
✅ 在候选抗体发现与可开发性评估中的应用
• 可开发性预测:基于氨基酸序列预测生物物理性质(如聚集倾向、粘度、溶解度、化学降解位点)。
• 稳定性预测:预测氧化(Met, Trp)、脱酰胺(Asn)、异构化(Asp)位点;预测热稳定性、pH稳定性。
• 高浓度制剂特性:预测高浓度下的粘度、聚集速率。
✅ 在制剂与稳定性中的应用
• 配方设计:预测不同缓冲液、辅料下的聚集、粘度、降解行为。
• 长期稳定性预测:基于加速稳定性数据预测长期储存稳定性。
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