单细胞RNA测序
单细胞RNA测序(scRNA-seq)已成为揭示细胞异质性的强大工具,但其成功在很大程度上依赖于高质量的单细胞悬液制备,而组织解离是其中最为关键的一步1、2、3。不当的组织解离方法可能引入技术偏差,影响细胞活力、细胞得率、转录组特征甚至后续的数据解读4、5、6、7、8。
以下是单细胞测序组织解离的常见组织操作注意事项,并结合了最新的研究进展:
01
组织新鲜度和处理时效性
新鲜组织是获取高质量单细胞悬液的首选材料5。组织从活体中取出后,应立即进行处理,以最大程度地减少RNA降解和细胞应激反应6、9。快速冷冻(如使用液氮或干冰)可以有效保存细胞核内RNA的完整性,这对于单核RNA测序(snRNA-seq)尤为重要,因为它能避免细胞解离过程中诱导的应激反应,从而提供更接近细胞体内状态的转录组信息10。若无法立即处理,组织应保存在适当的储存介质中(如含血清的培养基),并在冰上或4°C下运输和处理11。对于需要进行单核测序的组织,可以将新鲜组织快速冷冻并储存在-80°C,以维持细胞核的完整性及其RNA的质量12。
02
酶解与机械解离方法的优化
组织解离通常结合酶解和机械力。选择合适的酶和优化其浓度、孵育时间及温度至关重要4、6、11。
酶的选择与优化:
常用酶:胶原酶(I、II、III、IV型)、分散酶(Dispase)、木瓜蛋白酶(Papain)、中性蛋白酶(Pronase)、透明质酸酶(Hyaluronidase)和胰蛋白酶(Trypsin)等。不同的组织类型需要不同的酶组合。例如,肿瘤组织常需使用胶原酶/透明质酸酶混合物,有时还需加入DNA酶I来防止细胞裂解后释放的DNA导致细胞聚集2。(常用酶的组织解离问题及对策见之前写过的一篇组织解离干货)
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浓度与孵育时间:过高的酶浓度或过长的孵育时间会损害细胞活力和细胞膜完整性,导致细胞死亡和RNA降解6、2。例如,对于口腔黏膜组织,研究人员提供了三种不同的协议来优化细胞群体的分离4。肝母细胞瘤组织的解离方案通常包括组织处理、酶消化、Percoll密度梯度分离、细胞裂解和细胞悬液质量控制等步骤13。
温度控制:酶解通常在37°C进行,以确保酶活性,但为了减少细胞应激和RNA降解,整个过程应尽量保持在最短时间内完成6。在酶解完成后,应迅速将样品转移至冰上或4°C环境,以终止酶活性并维持细胞状态11。
机械解离:
轻柔操作:剪切力过大会损伤细胞,特别是神经元等脆弱细胞类型10。使用小剪刀、手术刀片或专用的组织研磨器(如gentleMACS解离器14)进行机械切割和研磨,能有效减少细胞损伤11。快速机械解离方法,如电场辅助解离,可以在几分钟内完成,并能保持细胞高活力15、16。
过滤:解离后的细胞悬液需要通过30-100微米的细胞筛网过滤,以去除未解离的组织块和细胞团块,防止堵塞后续的单细胞测序设备11。
品牌
货号
产品名称
规格
Corning falcon
352340
细胞滤网40μm/蓝色
1个/包,50包/箱
Corning falcon
352350
细胞滤网70μm/白色
1个/包,50包/箱
Corning falcon
352360
细胞滤网100μm/黄色
1个/包,50包/箱
Corning falcon
352360
细胞滤网100μm/黄色
1个/包,50包/箱
SPL
93040
细胞筛,PP/尼龙,蓝色,孔径40um,灭菌
1个/包,50包/箱
SPL
93070
细胞筛,PP/尼龙,自然色,孔径70um,灭菌
1个/包,50包/箱
SPL
93100
细胞筛,PP/尼龙,黃色,孔径100um,灭菌
1个/包,50包/箱
目前市面上也有很多经过条件摸索优化的试剂盒可以选择。元信生物凭借其多年的组织解离经验,已研发出一系列适用于人和动物组织单细胞悬液制备的试剂盒,以及细胞核提取试剂盒!
试剂盒种类
适用范围
肿瘤组织解离试剂盒
用于人和鼠的皮下瘤、骨肉瘤、心脏肿瘤、肝脏肿瘤、肺癌、肠道肿瘤、胆管癌、乳腺肿瘤、胰腺癌、鼻咽癌、头颈癌、甲状腺癌、阴茎癌、卵巢癌等组织的单细胞悬液制备
广谱动物组织解离试剂盒
用于包括人肝脏穿刺、肾脏、肺、胃、肠、胸腺、甲状腺、软骨、滑膜、胆囊、胎盘等正常组织;以及鼠类肝、肠、肺、胃、心脏、肌肉、卵巢、视网膜、滑膜、血管、气管、子宫内膜等正常组织的单细胞悬液制备
特定组织解离试剂盒
用于鼠类胰腺、全脑、肠、肺、皮肤、软骨等单一组织的单细胞悬液制备
小鼠组织提核试剂盒
小鼠全脑、脂肪、肝脏、肾脏、肺、肠等多组织细胞核的提取
无酶解离方法:
为了避免酶解对细胞转录组的潜在影响,一些研究开发了无酶机械解离方法17、18。例如,声悬浮和旋转(HLS)技术利用设计的声学谐振器探头,能够在不接触细胞的情况下实现快速组织解离,同时保留细胞活力和转录组完整性19。电场辅助解离也提供了一种快速有效的无酶解离方式,有助于维持细胞的高活力15、16。此外,对于某些组织,如小鼠结肠,手动压碎也可以作为一种有效的无酶解离方法20。
03
细胞悬液质量控制
细胞活力和计数:解离后,必须立即使用台盼蓝染色或荧光染料(如AO/PI)结合自动细胞计数仪评估细胞数量和活力。通常要求细胞活力高于80-85%才能进行高质量的单细胞测序21、2、11。低活力会导致死细胞和细胞碎片污染,影响测序数据质量,并引入环境RNA污染8。
去除死细胞和碎片:可以通过Percoll密度梯度离心13或流式细胞术(FACS)22、23等方法,也可以直接购买去碎片试剂产品(如元信生物货号YXBio-A021、YXBio-A022产品适用不同类型组织去碎片)进一步纯化活细胞,去除死细胞和细胞碎片。死细胞会释放游离DNA,导致细胞聚集,因此在解离过程中加入DNase I非常重要2。
红细胞裂解:对于富含血液的组织(如脾脏、骨髓),需要进行红细胞裂解。但裂解液(如ACK裂解液)对细胞具有细胞毒性,应严格控制处理时间,避免过度处理损伤目标细胞24。
双细胞识别:在单细胞测序过程中,两个或多个细胞可能被错误地包裹在同一个液滴中,形成“双细胞”(doublets)。这会导致假阳性的细胞类型或状态。可以通过调整细胞上样浓度、使用计算方法(如DoubletFinder)或流式细胞术进行双细胞去除。
04
样本保存与批次效应
固定与冷冻保存:新鲜样品通常是最佳选择,但有时需要对样品进行固定或冷冻保存。FixNCut是一种可逆的组织固定和解离方法,它能够在不影响RNA完整性的前提下,实现样品采集和后续处理的分离,提高了数据的鲁棒性和可重复性25。然而,不同的固定方法可能会影响RNA的完整性和细胞的表型9。
批次效应:不同批次样本间的技术差异(如解离时间、酶批次、操作人员差异)可能导致批次效应,从而掩盖真实的生物学差异5。应尽量在同一批次中处理对照组和实验组样本,或采用混样(multiplexing)策略,如使用细胞条形码区分不同样本来源,以最小化批次效应的影响。
5. 组织特异性考量
不同组织类型具有不同的细胞组成、细胞外基质(ECM)含量和细胞连接强度,因此需要定制化的解离方案1、4、6。
脑组织:脑组织结构复杂且脆弱,细胞(特别是神经元)对机械和酶解应激敏感。snRNA-seq是研究脑组织的常用方法,因其能够从冷冻组织中提取细胞核,避免了活细胞解离的难题10。
肿瘤组织:肿瘤组织通常具有高度异质性,并含有大量ECM,这使得解离更具挑战性2、26。需要优化的酶混合物和孵育条件,以获取高活力的肿瘤细胞和肿瘤微环境中的免疫细胞21、2、26、27、28。
皮肤组织:皮肤组织坚韧且富含胶原纤维,通常需要较强的酶解(如胶原酶)和机械剪切11、7。研究表明,优化消化方法对不同细胞类型(如T细胞亚群)的回收具有重要影响7。
消化道黏膜组织:肠道黏膜组织解离方案会影响细胞类型比例和基因表达水平,因此需根据研究目的选择和优化协议5、24。
肺组织:小鼠肺组织内皮细胞的回收和活力会受到不同解离方案(如胶原酶A和分散酶)的影响29。
不同单细胞组学方法的通用工作流程Source: 30
上图展示了不同单细胞组学方法的通用工作流程,其中组织解离是第一步,其质量直接影响后续的分析结果30。
综上所述,高质量的单细胞悬液是单细胞测序成功的基石。研究人员应根据研究目的、组织类型和可用的资源,精心设计和优化解离方案,并进行严格的质量控制,以确保获得准确可靠的单细胞数据3。
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参考文献:
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12 Oh, J.-M., An, M., Son, D.-S., Choi, J., Cho, Y. B., Yoo, C. E., & Park, W.-Y. (2022). Comparison of cell type distribution between single-cell and single-nucleus RNA sequencing: enrichment of adherent cell types in single-nucleus RNA sequencing. Experimental & Molecular Medicine, 54(12), 2128–2134. https://doi.org/10.1038/s12276-022-00892-z
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14 Poon, G. F., Liang, A., Chenery, A. L., Thompson, J., Lee, S. R., Dixon, J., Molina, R., Zachkani, P., Nobles, A., El yassem, B., Ryan, C., Delorme, M., Martins, R., O’Keane, M., Kokaji, A. I., Eaves, A., Louis, S., & Antignano, F. (2025). Automate tissue processing with STEMprepTM for versatile sample preparation 3334. The Journal of Immunology, 214(Supplement_1). https://doi.org/10.1093/jimmun/vkaf283.1150
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21 Berube, L., Rivera, L. L., & Kimple, R. J. (2024). Tumor Dissociation to Single Cell Suspension.
22 Crouch, E. E., Diafos, L. N., Valenzuela, E. J., Wedderburn-Pugh, K., Birrueta, J. O., Caston, J., Joseph, T., Andrews, M. G., Bhaduri, A., & Huang, E. J. (2023). Profiling human brain vascular cells using single-cell transcriptomics and organoids. Nature Protocols, 19(3), 603–628. https://doi.org/10.1038/s41596-023-00929-1
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25 Jiménez-Gracia, L., Marchese, D., Nieto, J. C., Caratù, G., Melón-Ardanaz, E., Gudiño, V., Roth, S., Wise, K., Ryan, N. K., Jensen, K. B., Hernando-Momblona, X., Bernardes, J. P., Tran, F., Sievers, L. K., Schreiber, S., van den Berge, M., Kole, T., van der Velde, P. L., Nawijn, M. C., … Martelotto, L. G. (2024). FixNCut: single-cell genomics through reversible tissue fixation and dissociation. Genome Biology, 25(1). https://doi.org/10.1186/s13059-024-03219-5
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27 Kono, T., Matsuda, T., Fujimoto, M., Taki, Y., Sakuma, I., Hashimoto, N., Nakamura, Y., Horiguchi, K., Higuchi, Y., Onodera, A., Miki, T., & Tanaka, T. (2025). Protocol for characterizing craniopharyngioma subtypes and their microenvironments using single-cell RNA sequencing and immunohistochemistry. STAR Protocols, 6(2), 103760. https://doi.org/10.1016/j.xpro.2025.103760
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29 Palumbo, F., Gunjak, M., Lee, P. J., Günther, S., Hilgendorff, A., Vadász, I., Herold, S., Seeger, W., Mühlfeld, C., & Morty, R. E. (2024). Impact of different tissue dissociation protocols on endothelial cell recovery from developing mouse lungs. Cytometry Part A, 105(7), 521–535. https://doi.org/10.1002/cyto.a.24843
30 Palumbo, F., Gunjak, M., Lee, P. J., Günther, S., Hilgendorff, A., Vadász, I., Herold, S., Seeger, W., Mühlfeld, C., & Morty, R. E. (2024). Impact of different tissue dissociation protocols on endothelial cell recovery from developing mouse lungs. Cytometry Part A, 105(7), 521–535. https://doi.org/10.1002/cyto.a.24843
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