A Clinical Study on the Safety and Efficacy of in Vivo CAR-T Cell Therapy (TI-0032-III Injection) for the Treatment of Relapsed and Refractory Autoimmune Diseases

This is an open-label, dose escalation study in patients with relapsed and refractory autoimmune diseases. Study drug, TI-0032-III injection, is composed of lipid nanoparticles (LNPs) targeting T cells that encapsulate circular RNA encoding the CD19 chimeric antigen receptor (CAR), which is a therapeutic biological product. It is clinically intended for the treatment of various relapsed and refractory B cell-related autoimmune diseases, such as systemic lupus erythematosus, sjögren's syndrome, systemic sclerosis, idiopathic inflammatory myositis, and antiphospholipid syndrome.

开始日期2026-01-22

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圆因（北京）生物科技有限公司

NCT07081984

/ Recruiting临床1期

A Phase I Clinical Study to Evaluate the Safety, Tolerability, Efficacy and Immunogenicity of TI-0093 Injection in Patients With Recurrent/Metastatic HPV-16 Positive Solid Tumors

This is a phase I, open-label, dose escalation study to assess the safety, tolerability, efficacy and immunogenicity of TI-0093 injection in patients with recurrent or metastatic HPV-16 positive solid tumors.
The primary objectives of the study are to assess safety and tolerability of TI-0093 injection in patients with recurrent or metastatic solid tumors, and to determine the maximum tolerated doses (MTDs) and recommended Phase 2 doses (RP2Ds) of TI-0093 injection.

开始日期2025-11-11

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圆因（北京）生物科技有限公司

NCT06205524

/ Unknown status临床1期IIT

An Exploratory, Randomized, Double-Blind, Dose-Ranging Study to Evaluate the Safety and Immunogenicity of TI-0010 Vaccine to Prevent COVID-19 Caused by SARS-CoV-2 in Healthy Adults Aged 18-59 Years

This study is a randomized, double-blind, placebo controlled clinical exploratory study to evaluate the safety, tolerability and immunogenicity of TI-0010 vaccine in healthy adults aged 18-59. TI-0010 was manufactured by Therorna Inc. TI-0010 is a novel lipid nanoparticles (LNP) -encapsulated circRNA-based vaccine targeting RBD of SARS-CoV-2. Up to one hundred subjects will be enrolled into one of 4 cohorts. Low-dose(Dose Level 1) is for Cohort 1 and Cohort 2 , and the high dose (Dose Level 2) for Cohort 3 and Cohort 4. Cohort 1 and Cohort 3 receive 2 doses (with a 28 day interval) via intramuscular injection respectively, and Cohort 2 and Cohort 4 receive 1 dose via intramuscular injection respectively. Participants are randomized to receive TI-0010 or placebo in a 4:1 ratio.

开始日期2023-07-10

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圆因（北京）生物科技有限公司

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Nature Communications

Self-splicing RNA circularization facilitated by intact group I and II introns

Article

作者: Ren, Jiwu ; Zheng, Wenjuan ; Gao, Lu ; Shen, Yong ; Chen, Feng ; Dong, Lei ; Yu, Ying ; Tang, Wei ; Wei, Wensheng ; Li, Bohan

Circular RNA (circRNA) has gained significant attention in RNA therapeutics due to its enhanced stability and protein-coding potential. In this study, we present two in vitro RNA circularization techniques, namely Permuted Intron-Exon through Trans-splicing (PIET) and Complete self-splicing Intron for RNA Circularization (CIRC). PIET leverages the second step of group I intron splicing, offering an alternative circularization strategy. CIRC utilizes the natural, intact forms of group I and group II introns, eliminating the need for intron engineering. Compared to Permuted Intron-Exon (PIE), CIRC exhibits enhanced RNA circularization efficiency and speed under mild conditions. Using CIRC, we successfully circularize large RNA constructs encoding full-length dystrophin, a protein whose deficiency is linked to Duchenne muscular dystrophy (DMD), thus overcoming size limitations typically associated with circRNA platforms. Notably, CIRC enables the production of scarless circRNA and circRNA with minimal immunogenicity. Additionally, CIRC supports streamlined circRNA purification using ribonuclease R (RNase R) or oligo(dT)-based methods. These advancements significantly expand the potential of the circRNA platform for both research and therapeutic applications.

720

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2026-06-08

·同写意

睿研生命・智汇赣南｜江西睿智盛大启航！深耕赣鄱沃土，构筑产业新标杆

2026-06-08

·同写意

动物模型"失灵"的纤维化赛道，淇嘉递出了一把新的标尺

2026-06-07

·蛋白制剂及质量研究

质粒构建技术全景指南——从概念到入门，从入门到精通

重组蛋白 | 双/多特异抗体 | mRNA/环形mRNA | In vivo CAR-T | AAV基因治疗目录第一章质粒构建基础概念 1.1 质粒构建的定义与核心原理 1.2 质粒的基本结构要素 1.3 质粒构建的主要方法 1.4 质粒构建的一般工作流程第二章质粒构建在重组蛋白中的应用 2.1 应用概述 2.2 表达系统与载体选择策略 2.3 质粒构建的关键考量因素 2.3.1 启动子选择与表达调控 2.3.2 密码子优化 2.3.3 信号肽设计 2.3.4 融合标签选择 2.4 主要难点与挑战难点一：蛋白不表达或表达量低难点二：包涵体形成 2.5 具体案例案例1：人胰岛素在大肠杆菌中的重组表达案例2：EPO在CHO细胞中的表达案例3：单克隆抗体在CHO细胞中的稳定表达第三章质粒构建在双/多特异抗体中的应用 3.1 应用概述 3.2 双/多特异抗体的主要结构形式 3.3 质粒载体系统的演进 3.3.1 四质粒系统（传统方案） 3.3.2 双质粒系统 3.3.3 单质粒系统（Quad Vector） 3.3.4 转座子整合系统 3.4 解决链错配的工程技术 3.5 质粒设计优化策略策略一：启动子组合优化策略二：多链比例精准调控策略三：载体系统适配选择 3.6 主要难点与挑战 3.7 具体案例案例1：罗氏Faricimab（Vabysmo）案例2：百济神州的链表达定制质粒设计案例3：金斯瑞TurboCHO平台第四章质粒构建在mRNA和环形mRNA中的应用 4.1 应用概述 4.2 mRNA生产中的质粒构建 4.2.1 质粒模板设计要点 4.2.2 质粒制备与线性化工艺 4.2.3 Poly(A)尾的序列稳定性问题 4.3 环形mRNA（circRNA）的质粒构建 4.3.1 circRNA概述 4.3.2 circRNA体外合成中的质粒构建 4.3.3 circRNA体内合成中的质粒构建 4.4 主要难点与挑战 4.5 具体案例案例1：辉瑞/BioNTech COVID-19 mRNA疫苗案例2：Orna Therapeutics的circRNA药物案例3：圆因生物circRNA疫苗案例4：环码生物CirCode技术第五章质粒构建在In vivo CAR-T中的应用 5.1 应用概述 5.2 两大技术路线对比 5.3 慢病毒载体包装中的质粒构建 5.3.1 四质粒包装系统 5.3.2 CAR分子设计的质粒构建要点 5.3.3 多质粒瞬转的技术瓶颈 5.4 mRNA-LNP路线中的质粒构建 5.4.1 质粒模板设计 5.4.2 LNP靶向递送策略 5.5 主要难点与挑战. 5.6 具体案例案例1：Interius BioTherapeutics INT2104 案例2：Umoja Biopharma VivoVec平台案例3：EsoBiotec ENaBL平台案例4：Capstan Therapeutics tLNP平台第六章质粒构建在AAV基因治疗中的应用 6.1 应用概述 6.2 AAV质粒系统 6.2.1 三质粒包装系统（最常用） 6.2.2 二质粒系统 6.2.3 单质粒系统 6.3 ITR不稳定性——AAV质粒的核心挑战 6.3.1 ITR的功能与结构 6.3.2 ITR不稳定的原因 6.3.3 ITR突变的后果 6.3.4 解决ITR不稳定性的策略 6.4 AAV质粒的GMP级生产与质控 6.4.1 质粒质控关键指标 6.5 主要难点与挑战 6.6 具体案例案例1：Zolgensma（onasemnogene abeparvovec）案例2：Luxturna（voretigene neparvovec-rzyl）案例3：Hemgenix（etranacogene dezaparvovec）案例4：中国首款AAV基因治疗产品案例5：金唯智AAV Hi-Fi技术第七章从入门到精通——质粒构建全流程教程 7.1 入门篇：基础概念与技能准备 7.1.1 必备知识储备 7.1.2 必备工具与软件 7.1.3 入门实验流程（以pET载体为例） 7.2 进阶篇：面向应用的质粒构建策略 7.2.1 重组蛋白质粒构建进阶 7.2.2 双/多特异抗体质粒构建进阶 7.2.3 mRNA/circRNA质粒构建进阶 7.2.4 In vivo CAR-T质粒构建进阶 7.2.5 AAV质粒构建进阶 7.3 精通篇：跨领域整合与前沿趋势 7.3.1 跨领域质粒构建共性挑战与解决方案 7.3.2 前沿技术趋势 7.3.3 质粒构建最佳实践总结附录附录A：五大领域质粒构建对比总结附录B：常用菌株与适用场景附录C：参考文献与推荐阅读第一章质粒构建基础概念1.1 质粒构建的定义与核心原理质粒构建（Plasmid Construction），又称分子克隆（Molecular Cloning），是将目的基因片段通过体外重组技术插入到质粒载体的特定位置，形成能够在宿主细胞中自主复制和表达的重组DNA分子的过程。质粒构建是现代分子生物学和生物制药工业的基石技术，贯穿了从基础研究到工业化生产的全链条。质粒（Plasmid）是一种独立于宿主染色体之外的双链环状DNA分子，具有自主复制能力。在生物制药领域，质粒不仅是基因转移的载体，更是mRNA体外转录的模板、病毒载体包装的原料、以及细胞治疗基因编辑工具的基础。1.2 质粒的基本结构要素一个完整的表达质粒通常包含以下核心功能元件：元件名称功能描述常见选择复制起点（ORI）控制质粒在宿主细胞中的复制，决定拷贝数pUC ori（高拷贝）、p15A ori（低拷贝）、f1 ori（单链DNA制备）启动子（Promoter）驱动目的基因转录的调控序列T7（原核）、CMV（真核）、EF1α（真核稳定表达）、CAG（强组成型）多克隆位点（MCS）含多个限制性内切酶位点的插入区域pET系列MCS、pCDNA3.1 MCS筛选标记用于筛选含有质粒的宿主细胞氨苄青霉素（AmpR）、卡那霉素（KanR）、Zeocin、GS信号肽序列引导分泌蛋白转运至胞外或特定细胞器PelB（原核）、IgK/Mel（真核）、天然信号肽标签序列便于蛋白纯化与检测His-tag、FLAG、HA、Myc、GST、MBP转录终止子终止转录，防止通读T7 terminator、BGH polyA、SV40 polyA增强子/WPRE增强基因表达效率CMV增强子、WPRE（Woodchuck肝炎病毒转录后调控元件）1.3 质粒构建的主要方法构建方法原理优势局限限制性内切酶克隆利用II型限制性内切酶切割载体和插入片段，T4 DNA连接酶连接经典可靠、成本低、适用性广依赖特定酶切位点、多片段组装效率低Gibson Assembly利用5'外切酶产生粘性末端，DNA聚合酶补平，连接酶封口无酶切位点限制、可多片段同时组装对片段末端序列有要求、成本较高Golden Gate Assembly利用IIS型限制性内切酶（BsaI/BsmBI）实现一锅法无缝组装高效无缝、可高通量自动化需消除内部酶切位点、设计复杂In-Fusion/Homologous Recombination基于15-20bp同源序列在体外或体内的重组连接操作简便、无需酶切位点同源序列需精确设计TA克隆利用Taq聚合酶添加的3'-A和T载体的3'-T互补配对PCR产物直接克隆、简单快速仅适用于PCR产物、方向不可控无缝克隆（SLIC）利用T4外切酶处理产生单链突出端，通过同源序列退火连接高效率、低成本对片段长度和GC含量敏感1.4 质粒构建的一般工作流程无论应用于哪个领域，质粒构建都遵循以下标准流程： •序列设计与优化：包括密码子优化、去除不稳定序列、添加功能元件 •基因合成或PCR扩增：获取目的基因片段 •载体与片段的酶切或处理：线性化载体、末端处理 •连接与组装：将目的基因插入载体 •转化与筛选：导入宿主细胞（大肠杆菌），抗性筛选 •菌落PCR与测序验证：确认序列正确性 •质粒大量制备与质量控制：中/大规模发酵、纯化、质控放行第二章质粒构建在重组蛋白中的应用2.1 应用概述重组蛋白表达是质粒构建最经典、最广泛的应用场景。通过将编码目标蛋白的基因插入表达载体，转化至宿主细胞中实现蛋白的异源表达，从而获得治疗性蛋白、工业酶、诊断试剂等产品。从胰岛素、EPO等第一代生物药到现代的复杂融合蛋白、抗体药物，质粒构建都是不可或缺的上游环节。2.2 表达系统与载体选择策略选择合适的宿主-载体系统是重组蛋白表达成功的关键。不同表达系统各有优劣：表达系统代表载体优势劣势适用场景大肠杆菌（E. coli）pET系列、pQE系列、pGEX系列成本低、周期短、产量高、操作简便缺乏翻译后修饰、易形成包涵体、内毒素问题非糖基化蛋白、酶、抗原片段酵母（P. pastoris/S. cerevisiae）pPICZ系列、pYES2有一定糖基化能力、可分泌表达、成本低糖基化与哺乳动物不同（过度甘露糖化）抗体片段、疫苗抗原、工业酶CHO细胞pcDNA3.1、pCHO1.0、pXLG接近人体天然糖基化、可稳定表达、工业标准成本高、周期长、表达量需优化治疗性抗体、复杂糖基化蛋白、EPOHEK293细胞pCDNA3.1、pCAGGS、pTT5瞬时表达效率高、糖基化模式优良不适合大规模稳定细胞株、成本高快速筛选、小规模蛋白制备、病毒载体昆虫细胞（Sf9/Sf21）pFastBac、pIEX系列表达量高、有翻译后修饰、适合大分子糖基化不完全、成本较高疫苗抗原、膜蛋白、病毒样颗粒无细胞表达系统多种线性模板超快速、可表达毒性蛋白成本极高、产量有限膜蛋白、毒性蛋白、快速筛选2.3 质粒构建的关键考量因素2.3.1 启动子选择与表达调控原核系统中，T7启动子配合BL21(DE3)宿主是最经典的组合，通过IPTG诱导实现严格的表达调控。真核系统中，CMV启动子是瞬时表达的首选，而EF1α、UBC等启动子更适合稳定细胞株的长期表达。近年来，研究表明对称排列的双增强型CMV（eCMV）启动子单质粒系统可实现轻链优先表达，显著提升抗体的正确装配率。2.3.2 密码子优化密码子偏好性是影响蛋白表达效率的重要因素。不同宿主生物的tRNA丰度差异导致同一密码子的翻译效率不同。密码子优化通过将稀有密码子替换为宿主偏好的同义密码子，可显著提升翻译效率和蛋白产量。需要特别注意： •GC含量控制在30-70%之间，避免极端GC区域 •消除mRNA二级结构，特别是5'端的发夹结构 •避免串联稀有密码子（特别是脯氨酸） •维持合理的密码子适应指数（CAI > 0.8） •避免隐含的限制性内切酶位点和终止信号2.3.3 信号肽设计对于分泌表达的蛋白，信号肽的选择直接影响蛋白的分泌效率和正确折叠。常用策略包括： •原核系统：PelB、OmpA、DsbA等信号肽 •真核系统：IgK、Mel、tPA信号肽，或使用蛋白天然信号肽 •筛选策略：构建多种信号肽载体进行平行测试 •注意不同信号肽对表达效率差异显著，科学设计或筛选信号肽是优化表达的关键步骤2.3.4 融合标签选择标签类型代表标签主要用途注意事项亲和标签His6、GST、MBP、Strep-tag蛋白纯化His-tag可能影响蛋白活性，需评估是否去除增溶标签MBP、NusA、Trx、Sumo提高可溶性表达标签较大（40kDa+），需蛋白酶切除检测标签FLAG、HA、MycWestern Blot、ELISA检测通常不干扰功能，可保留切割位点TEV、Thrombin、Factor Xa、HRV 3C去除融合标签TEV蛋白酶最常用，切割效率高且特异性好2.4 主要难点与挑战难点一：蛋白不表达或表达量低可能原因：密码子不兼容、mRNA二级结构阻碍翻译、蛋白毒性导致宿主死亡、启动子强度不合适。解决方案： •密码子优化（宿主特异性优化） •更换启动子（如从T7换为T7lac或araBAD） •降低诱导温度（18-25°C）以促进正确折叠 •使用低拷贝数载体减轻宿主代谢负担 •选用特殊宿主菌株（如Rosetta补充稀有tRNA、Origami促进二硫键形成） •尝试不同表达系统（如从大肠杆菌切换至酵母或CHO）难点二：包涵体形成蛋白过快表达导致无法正确折叠，形成不溶性聚集体。解决方案： •降低诱导温度（16-25°C）和IPTG浓度（0.01-0.1 mM） •使用增溶标签（MBP、NusA、Sumo等） •更换为分泌表达载体（添加信号肽） •共表达分子伴侣（GroEL/GroES、DnaK/DnaJ） •包涵体复性（稀释复性、透析复性、柱上复性）难点三：蛋白降解蛋白酶降解目的蛋白，特别是在大肠杆菌中。解决方案： •使用蛋白酶缺陷型菌株（如BL21(DE3) pLysS缺乏Lon和OmpT蛋白酶） •添加蛋白酶抑制剂 •缩短诱导时间、降低温度 •添加N端或C端融合标签保护蛋白2.5 具体案例案例1：人胰岛素在大肠杆菌中的重组表达胰岛素是最早实现重组表达的治疗性蛋白之一。采用pET系列载体，分别表达A链和B链，通过体外二硫键配对形成活性胰岛素。关键要点包括：密码子优化以适应大肠杆菌偏好性、包涵体复性工艺优化、二硫键正确配对策略。案例2：EPO在CHO细胞中的表达促红细胞生成素（EPO）需要复杂的N-和O-糖基化修饰，必须在哺乳动物细胞中表达。采用含CMV启动子的表达载体，构建GS选择标记的CHO稳定细胞株。关键要点：信号肽选择对分泌效率的影响、糖基化质量控制、DHFR/GS双选择系统优化。案例3：单克隆抗体在CHO细胞中的稳定表达治疗性单抗通常采用双质粒系统（重链和轻链分别构建）或单质粒系统（含2A肽连接的重链和轻链），在CHO细胞中建立稳定细胞株。百济神州的研究表明，基于链表达定制的质粒设计可显著增强单克隆及双特异性抗体生产。第三章质粒构建在双/多特异抗体中的应用3.1 应用概述双特异性抗体（Bispecific Antibodies, bsAbs）是含有两种特异性抗原结合位点的人工抗体，能同时靶向两个不同的抗原表位，在肿瘤免疫治疗、自身免疫疾病等领域展现出独特优势。截至2024年，已有超过14款双特异性抗体获批上市，超过100种双抗结构形式被设计出来。质粒构建在双/多特异抗体开发中扮演核心角色——载体设计直接决定了轻重链的表达比例、正确配对效率以及最终产物的产量和纯度。与单克隆抗体相比，双/多特异抗体的质粒设计面临更为复杂的链配对挑战。3.2 双/多特异抗体的主要结构形式结构形式描述质粒设计复杂度代表药物/平台IgG-like双特异抗体保留完整IgG结构，通过工程化促进异二聚化高（需解决重链异二聚化和轻链错配）KIH（Rituxan）、CrossMab、DuoBody非IgG-like双特异抗体BiTE、DART、TandAbs等不含Fc的紧凑结构中等（链数少但需优化表达比例）Blinatumomab（Blincyto）多特异抗体三特异或更多靶向的复杂分子极高（多条链表达与配对控制）赛诺菲三特异抗体、罗氏四特异抗体Fab-scFv-Fc型一个Fab臂+scFv+Fc结构高（需精确调控多链比例）多种临床阶段候选分子3.3 质粒载体系统的演进3.3.1 四质粒系统（传统方案）将双抗的2条重链（HC1、HC2）和2条轻链（LC1、LC2）分别构建至4个独立质粒中，共转染宿主细胞。优点：各链表达可独立调控；缺点：4种质粒转染比例难以精准控制，极易导致轻重链错配，杂质产量高，操作繁琐，批次重复性差。某研究显示，非对称型bsAbs的错配杂质占比甚至高达90%。3.3.2 双质粒系统每个质粒编码1对重链+轻链，共构建2个质粒。大幅简化转染操作流程，降低了多质粒转染比例的控制难度。在瞬转表达体系中表现良好，但稳转阶段的错配控制能力弱于单质粒系统。3.3.3 单质粒系统（Quad Vector）将双抗的4条链全部整合至1个质粒中，每条链独立配备启动子和信号肽序列，同时整合GS选择标记。可同时支持瞬转表达和稳转CHO细胞株构建，彻底解决了多质粒转染比例不当带来的链错配问题。在稳转阶段具备更高的装配正确率、更低的错配产物比例，表达性能更稳定可控。3.3.4 转座子整合系统对于结构复杂的非对称bsAbs，采用四载体系统联合转座子技术（如Sleeping Beauty、Leap-In Transposase）将外源基因高效稳定地整合到宿主基因组。案例显示，优化质粒比例（HC1:HC2:LC1:LC2 = 1:1:2:2）后，正确异二聚体比例从35%提升至82%，CHO细胞滴度可达5-10 g/L。3.4 解决链错配的工程技术技术名称原理效果应用案例Knobs-into-Holes（KIH）在CH3域引入'旋钮'（T366W）和'孔洞'（T366S/L368A/Y407V）突变，促进异二聚化异二聚化率>90%Genentech/Roega平台，已用于多款获批药物CrossMab在一个Fab臂进行CL-CH1域交换，解决轻链错配错配杂质从45%降至<5%罗氏平台，用于Faricimab等可控Fab臂交换（cFAE）体外通过还原-氧化反应实现Fab臂交换灵活高效，无需复杂工程改造DuoBody平台，Glofitamab等共轻链（Common LC）两条重链共用同一条轻链从根本上消除轻链错配Regeneron、多家公司采用电荷对工程在CH1-CL界面引入电荷反转突变显著提高正确配对率可与KIH联合使用2A肽共表达利用2A肽(自剪切)特性从同一转录本释放不同链按比例表达、降低错配适用于复杂结构抗体IRES多顺反子通过内部核糖体进入位点实现多链表达灵活性高、但下游链表达量较低适合初步筛选3.5 质粒设计优化策略策略一：启动子组合优化采用对称排列的双增强型CMV（eCMV）启动子单质粒系统，可实现轻链优先表达，提升抗体正确装配率。该方案不依赖轻链类型（κ型、λ型抗体均适配），在Expi293-F、ExpiCHO-S细胞中均能显著提升蛋白表达水平。策略二：多链比例精准调控针对Fab-scFv-Fc类特殊结构双抗，采用基于2A肽的多顺反子载体设计，可灵活调控重链、scFv-Fc链、轻链的表达比例。验证显示当重链与scFv-Fc链按1:1比例表达、轻链过量时，目标产物产量最高，其中2A肽共表达策略的产物滴度、正确组装率均优于IRES、多启动子共表达方案。策略三：载体系统适配选择瞬转表达优先选择双质粒系统平衡效率与操作成本；稳转细胞株构建优先选择单质粒系统降低错配风险。3.6 主要难点与挑战挑战类别具体描述影响程度链错配多条链组装时发生重链-重链、重链-轻链错配，产生无活性杂质严重（部分非对称型错配杂质达90%）稳定性差/易聚集额外结构域和突变增加分子柔性，聚集风险上升中等（某些IgG-scFv型5mg/mL聚集率50%）下游纯化复杂错配产物与目标产物理化性质差异极小严重（传统单抗纯化工艺无法直接套用）表达量不确定性不同双抗格式表达量差异极大中等（需逐个优化）分析表征困难需全面覆盖结构完整性、结合活性、稳定性中等（需要多种互补分析方法）低pH敏感性部分双抗在Protein A洗脱条件（pH 3.0-3.5）下易降解中等（需开发温和洗脱策略）3.7 具体案例案例1：罗氏Faricimab（Vabysmo） Faricimab是首个获批的双特异性抗体眼病药物，靶向VEGF-A和Ang-2。采用CrossMab + KIH技术组合，通过质粒设计优化轻重链配对。在CHO细胞中采用单质粒系统表达，成功将错配杂质控制在5%以下。案例2：百济神州的链表达定制质粒设计百济神州的研究团队通过基于链表达定制的质粒设计，在细胞系开发中增强单克隆及双特异性抗体生产。研究比较了Dual vector与Quad vector在CHO细胞中表达双特异性IgG型抗体的性能，优化了质粒比例和表达调控元件。案例3：金斯瑞TurboCHO平台金斯瑞TurboCHO平台已成功生产70多种双特异性抗体构型。通过AI密码子优化、优化质粒比例、多种纯化策略组合，实现了多种双抗格式的高效表达和纯化。第四章质粒构建在mRNA和环形mRNA中的应用4.1 应用概述 mRNA药物和疫苗的兴起使质粒DNA（pDNA）模板的制备成为关键上游工艺。质粒作为体外转录（IVT）的DNA模板，是mRNA和环形mRNA（circRNA）生产的核心起始原料。质粒的质量（序列准确性、超螺旋比例、内毒素水平等）直接决定了下游mRNA的转录效率、完整性和纯度。与传统重组蛋白表达不同，mRNA领域对质粒有特殊要求：质粒需在特定位置线性化后才能作为IVT模板，且对poly(A)尾的序列稳定性、T7启动子区域的完整性有严格要求。4.2 mRNA生产中的质粒构建4.2.1 质粒模板设计要点设计要素具体要求原因T7启动子必须在转录起始位点上游，序列完整无误T7 RNA聚合酶识别并启动转录5' UTR优化设计以增强翻译起始效率影响核糖体招募和翻译效率编码序列密码子优化、替换修饰核苷酸（如N1-甲基假尿苷）降低免疫原性、提升翻译效率3' UTR含稳定元件（如α/β-珠蛋白UTR）延长mRNA半衰期Poly(A)尾固定长度（100-150 nt），分段设计（A30-linker-A70）防止发酵中poly(A)缩短，保证翻译效率限制性内切酶位点在poly(A)尾下游设置唯一的线性化酶切位点质粒线性化产生IVT模板4.2.2 质粒制备与线性化工艺 mRNA生产中的质粒制备工艺流程： •大肠杆菌发酵：使用特殊菌株（如Stbl3）扩增质粒，控制发酵条件维持高超螺旋比例 •质粒纯化：碱裂解法提取，经凝胶过滤、亲和层析、离子交换等多步纯化 •质量检测：OD260/280 = 1.8-2.0，超螺旋比例>80%，内毒素<0.005 EU/μg •质粒线性化：使用限制性内切酶在poly(A)尾下游位点切割，将环状质粒转为线性DNA •线性化质粒纯化：去除酶、缓冲液和未切割质粒，确保线性化完全 •体外转录（IVT）：以线性化质粒为模板，T7 RNA聚合酶催化合成mRNA4.2.3 Poly(A)尾的序列稳定性问题 poly(A)尾的稳定性是mRNA质粒构建中的特殊难题。在大肠杆菌中扩增时，poly(A)同聚物极易发生滑链错配（slippage），导致poly(A)长度缩短或缺失。解决方案包括： •分段设计：将poly(A)尾分为A30-linker-A70两段，中间插入稳定序列 •使用特殊大肠杆菌菌株：如Stbl2、Stbl3等，降低重组频率 •低温发酵（30°C而非37°C） •缩短培养时间，降低传代次数4.3 环形mRNA（circRNA）的质粒构建4.3.1 circRNA概述环形mRNA（circular RNA, circRNA）是一种首尾共价连接的闭合单链RNA，因共价闭合结构可阻止核酸酶降解，具有比线性RNA更长的半衰期和更高的稳定性。circRNA不需要5'帽结构和3' poly(A)尾，免疫原性更低，被视为mRNA药物的下一代技术。4.3.2 circRNA体外合成中的质粒构建 circRNA的体外合成需要特殊的质粒设计，主要环化技术路线如下：环化方法质粒设计要点优势劣势代表企业I型内含子自剪接（PIE法）将内含子片段分别置于目的序列两端（重排内含子和外显子），插入T7启动子下游最广泛应用、可环化大片段RNA、反应简单引入外源外显子序列，可能触发免疫反应Orna、圆因生物、LarondeClean-PIE系统基于T4 td基因I型内含子，自动化筛选最优剪接位点，实现无外源序列引入无外源序列残留、成环效率超90%设计复杂度较高科锐迈德II型内含子自剪接（CirCode）利用II型内含子的反向剪接，切割特定loop构建分裂内含子系统无外源序列残留、环化效率60-90%、适合工业放大技术门槛高环码生物T4 RNA连接酶法线性RNA前体需3'-OH和5'-单磷酸，使用T4 Rnl 1或T4 Rnl 2连接免疫原性最低（无外源序列）大片段效率低、存在分子间连接副反应Laronde、吉赛生物发夹状核酶（HPR）以单链环状DNA为模板滚环反应和自剪接适合生产较短环状RNA产物不稳定、包含HPR序列实验室研究4.3.3 circRNA体内合成中的质粒构建体内合成法通过在活细胞中过表达含有特定内含子顺式元件的质粒载体，使转录后的RNA通过反向剪接自然环化： •内含子互补序列（ICS）：利用两侧内含子上的反向互补序列（如Alu元件）拉近剪接位点距离促进成环 •RNA结合蛋白结合位点：引入MBL、QKI等蛋白的结合位点促进反向剪接 •tRNA内含子系统：利用tRNA内含子环状RNA的形成机制 •体内PIE系统：在质粒中插入改造过的I型内含子PIE序列4.4 主要难点与挑战挑战具体描述解决方案poly(A)尾不稳定大肠杆菌扩增时poly(A)同聚物发生滑链错配，长度缩短分段设计（A30-linker-A70）、特殊菌株、低温发酵质粒超螺旋比例下降大规模发酵中超螺旋比例降低，影响IVT效率优化发酵条件、缩短培养时间、控制传代次数线性化不完全限制性内切酶切割不完全，残留环状质粒模板优化酶切条件（酶量、时间、温度）、多步纯化circRNA外源序列免疫原性PIE法引入的外源外显子可能触发先天免疫反应采用Clean-PIE或II型内含子技术避免外源序列circRNA环化效率低不同序列导致成环结构差异大、效率不稳定自动化筛选最优剪接位点、优化内含子-外显子边界circRNA纯度与完整性线性RNA前体残留、多聚体副产物RNase R处理消化线性RNA、HPLC纯化大规模GMP生产质粒和mRNA的GMP级别生产要求高建立完整的GMP质控体系、从质粒到制剂的全链条质控4.5 具体案例案例1：辉瑞/BioNTech COVID-19 mRNA疫苗 BNT162b2疫苗的生产以质粒DNA为起始模板，将编码SARS-CoV-2刺突蛋白的基因插入含T7启动子的质粒中，在大肠杆菌中发酵扩增。经碱裂解、层析纯化后，用限制性内切酶线性化，再通过T7 RNA聚合酶体外转录合成修饰核苷mRNA，最后用LNP包封。案例2：Orna Therapeutics的circRNA药物 Orna Therapeutics采用I型内含子自剪接（PIE法）合成circRNA，并开发了FoRCE平台筛选新型IRES元件以提升翻译效率。其主打产品ORN-101是一种体内递送的circRNA-LNP产品，用于自身免疫疾病治疗。案例3：圆因生物circRNA疫苗圆因生物采用基于Anabaena的PIE法合成circRNA，已在Cell发表相关环状RNA疫苗研究。其circRNA新冠疫苗展示了良好的免疫原性和稳定性。案例4：环码生物CirCode技术环码生物采用自主研发的II型内含子自剪接系统（CirCode技术），实现无外源序列残留的高效环化，环化效率60-90%，适合工业放大生产。第五章质粒构建在In vivo CAR-T中的应用5.1 应用概述体内CAR-T（In vivo CAR-T）技术通过直接在患者体内对T细胞进行基因工程改造，消除了体外细胞处理和复杂物流的需求，是CAR-T疗法的革命性进展。质粒构建在这一领域扮演双重角色：一方面作为慢病毒载体包装的原料（生产LVV的质粒），另一方面作为mRNA体外转录的模板（生产mRNA-LNP的质粒）。截至2025年，全球已有超过20款in vivo CAR-T管线处于临床前或临床早期开发阶段，技术路线呈现多元化竞争格局。5.2 两大技术路线对比对比维度慢病毒载体（LVV）路线 mRNA-LNP路线基因整合方式整合到宿主基因组，长期稳定表达不整合，瞬时表达表达持久性长期（数月至数年）短期（数天至数周）CAR构建类型DNA型CAR（完整基因表达框）mRNA型CAR（编码CAR的mRNA）质粒角色四质粒系统包装慢病毒质粒线性化后作为IVT模板安全性存在插入突变风险无基因组整合风险重复给药受限（免疫反应）可重复给药适用方向肿瘤适应症（需持久疗效）自身免疫疾病（可控表达）生产工艺多质粒瞬转HEK293T→病毒纯化质粒线性化→IVT→LNP包封代表公司Interius、EsoBiotec、UmojaCapstan、Myeloid Therapeutics5.3 慢病毒载体包装中的质粒构建5.3.1 四质粒包装系统第三代慢病毒包装系统采用四质粒共转染方案，安全性高于前代系统：质粒类型功能关键元件转移质粒（Transfer Plasmid）携带CAR基因表达框5'LTR→Ψ→RRE→cPPT→启动子→CAR→WPRE→3'LTR（自失活）包装质粒（gag/pol）提供病毒结构蛋白和酶gag、pol基因，含RRE元件Rev表达质粒提供Rev蛋白，协助未剪接RNA出核Rev基因包膜质粒（VSV-G/靶向包膜）决定病毒嗜性VSV-G（广谱）或工程化包膜（靶向CD3/CD8等）5.3.2 CAR分子设计的质粒构建要点 •启动子选择：EF1α或MSCV启动子确保在T细胞中稳定表达 •信号域组合：scFv-铰链区-跨膜域-共刺激域（CD28/4-1BB）-CD3ζ •安全元件：自失活LTR（SIN-LTR）、cPPT/CTS增强转导效率、WPRE增强表达 •靶向策略：工程化包膜蛋白，识别T细胞表面分子（CD3、CD4、CD8）实现选择性转导 •多顺反子设计：可同时表达CAR和安全开关（如iCasp9）5.3.3 多质粒瞬转的技术瓶颈传统多质粒瞬转技术存在固有瓶颈： •四质粒共转染效率不一致，导致各组分比例失调 •批次间一致性差，影响病毒滴度和质量 •规模化放大困难，转染条件难以线性放大 •质粒质量要求极高，GMP级别质粒生产成本高昂解决方案：建立稳定包装细胞系，将gag/pol和Rev基因整合到宿主基因组，只需转染转移质粒和包膜质粒，大幅简化工艺。5.4 mRNA-LNP路线中的质粒构建5.4.1 质粒模板设计 mRNA型CAR的质粒设计要点： •T7启动子：驱动高效体外转录 •5' UTR：优化翻译起始效率 •CAR编码序列：密码子优化、N1-甲基假尿苷替换 •3' UTR：含稳定元件延长mRNA半衰期 •poly(A)尾：分段设计确保长度稳定 •线性化位点：poly(A)下游唯一酶切位点5.4.2 LNP靶向递送策略 mRNA-LNP路线的核心挑战是实现T细胞特异性递送： •表面连接抗CD3、CD5、CD7等抗体片段，选择性识别并转染T细胞 •离子化脂质组分优化，提升内体逃逸效率 •LNP粒径和表面电荷调控，优化组织分布 •新型核酸技术融合：circRNA/saRNA提升表达持久性5.5 主要难点与挑战挑战具体描述解决方案方向靶向递送效率如何精准递送CAR基因至体内T细胞，避免脱靶工程化包膜蛋白、抗体偶联LNP、配体修饰插入突变风险慢病毒随机整合可能激活原癌基因开发非整合型LVV、使用mRNA-LNP瞬时表达免疫原性病毒载体或LNP可能引发免疫反应工程化包膜、免疫抑制剂预处理、优化LNP组分CAR表达持续性mRNA瞬时表达无法维持长期疗效多次重复给药、circRNA延长表达时间安全性控制长期CAR表达可能带来on-target/off-tumor毒性安全开关（iCasp9）、自杀基因、可调控表达系统生产工艺复杂LVV生产涉及多质粒共转染，放大困难稳定包装细胞系、单质粒系统监管标准818号令要求从质粒到制剂全过程GMP建立全链条GMP质控体系预存中和抗体部分人群对AAV或慢病毒有预存免疫筛查预存抗体、开发新型血清型5.6 具体案例案例1：Interius BioTherapeutics INT2104 INT2104是全球首个进入人体临床试验的体内CAR-T疗法，采用慢病毒载体递送靶向CD20的CAR基因。该载体具有细胞靶向性，可选择性转导B细胞和T细胞。2024年10月在澳大利亚完成首例患者给药。案例2：Umoja Biopharma VivoVec平台 Umoja的VivoVec平台利用慢病毒载体在体内生成CAR-T细胞。在非人灵长类动物研究中，该平台有效和持久地生成CAR-T细胞，并表现出良好的耐受性。其技术特点是利用膜锚定纳米抗体实现靶向递送。案例3：EsoBiotec ENaBL平台 EsoBiotec构建了第三代ENaBL技术平台，可生成具有细胞靶向性以及免疫耐受的慢病毒载体（包膜病毒），用以实现细胞靶向递送。被阿斯利康以最高12.5亿美元收购。案例4：Capstan Therapeutics tLNP平台 Capstan采用mRNA-LNP路线开发体内CAR-T，其靶向脂质纳米颗粒（tLNP）可将编码CAR的mRNA精准递送至T细胞。2025年Science报道了其临床前数据，在人源化小鼠和食蟹猴模型中验证了体内CAR-T的有效性。第六章质粒构建在AAV基因治疗中的应用6.1 应用概述腺相关病毒（Adeno-Associated Virus, AAV）是目前基因治疗领域最常用的病毒载体，已有Zolgensma（SMA）、Luxturna（遗传性视网膜病变）、Hemgenix（B型血友病）等多款AAV基因治疗产品获批上市。质粒构建是AAV生产的起点和核心原料——AAV的包装需要多个质粒共转染宿主细胞，质粒的质量直接决定了病毒滴度、纯度和安全性。 AAV质粒构建的最大挑战是反向末端重复序列（ITR）的不稳定性，这是AAV质粒区别于其他质粒构建的独特难题。6.2 AAV质粒系统6.2.1 三质粒包装系统（最常用）质粒类型功能关键元件注意事项转移质粒（Transgene Plasmid）携带治疗基因表达框5'ITR→启动子→目的基因→polyA→3'ITRITR必须完整，目的基因<4.7kb辅助质粒（Helper/Cap/Rep Plasmid）提供Rep和Cap蛋白AAV2 Rep基因 + 指定血清型Cap基因Cap血清型决定组织嗜性腺病毒辅助质粒（Adenoviral Helper）提供AAV复制所需的辅助功能E2A、E4、VA RNA基因不含E1（由HEK293宿主提供）6.2.2 二质粒系统将辅助质粒和腺病毒辅助质粒合并为一个质粒，简化转染操作。降低了一种质粒的用量，但单一质粒更大，在大肠杆菌中扩增可能更不稳定。6.2.3 单质粒系统将所有元件整合到一个质粒中，进一步简化操作。适合小规模快速筛选，但质粒极大（>12kb），在大肠杆菌中稳定性差，不适合大规模GMP生产。6.3 ITR不稳定性——AAV质粒的核心挑战6.3.1 ITR的功能与结构 AAV基因组的两端各有一个145bp的反向末端重复序列（ITR），形成高度稳定的T型发夹结构。ITR是AAV的DNA自我复制的起点以及触发病毒包装的信号，在病毒的复制和包装过程中起着关键作用。缺失突变的ITR会降低完整AAV病毒的产量，增加非目的DNA包装率。6.3.2 ITR不稳定的原因 ITR区域在大肠杆菌扩增过程中极易发生突变或缺失，原因包括： •ITR的回文序列和高GC含量使其在细菌DNA复制过程中形成二级结构 •滑链错配（slippage）导致序列缺失 •大肠杆菌的重组修复系统可能错误处理ITR结构 •不同菌株和培养条件下ITR突变率差异显著研究表明，约40%的AAV质粒样本在ITR区域存在突变！这一惊人的数据说明ITR不稳定性是行业性难题。6.3.3 ITR突变的后果 •降低rAAV包装效率（ITR缺失导致无法起始复制和包装） •增加非目的DNA包装率（ITR缺失质粒仍可能被包装） •影响基因组完整性（5'ITR和3'ITR的功能不对称） •批次间一致性差，影响GMP生产6.3.4 解决ITR不稳定性的策略策略方法效果特殊大肠杆菌菌株使用Stbl2、Stbl3等重组缺陷型菌株降低ITR突变率，但不能完全消除低温发酵30°C而非37°C培养减缓DNA复制速度，降低二级结构形成缩短培养时间降低传代次数、缩短发酵周期减少突变积累Hi-Fi克隆技术Azenta/金唯智开发的特殊克隆方案更简单、灵活、快速，同时修复错误ITRMuteFree AAV云舟生物推出的ITR稳定载体从根本上解决ITR不稳定问题ITR测序验证长读长测序（Nanopore/PacBio）验证ITR完整性传统Sanger测序无法可靠测通ITR发夹结构稳定包装细胞系将Rep/Cap基因整合到宿主细胞基因组减少质粒种类，降低转染复杂度6.4 AAV质粒的GMP级生产与质控 AAV基因治疗产品要求从质粒到病毒制剂的全过程GMP标准：6.4.1 质粒质控关键指标质控项目标准要求检测方法超螺旋比例>80%琼脂糖凝胶电泳、HPLCOD260/2801.8-2.0紫外分光光度计内毒素<0.005 EU/μg DNALAL法基因组DNA残留<1%qPCRRNA残留<1%琼脂糖凝胶电泳蛋白质残留不可检出BCA法ITR完整性5'ITR和3'ITR均完整长读长测序、限制性酶切图谱序列验证100%正确Sanger测序+ITR专项测序6.5 主要难点与挑战挑战具体描述解决方案ITR不稳定性约40%的AAV质粒样本ITR区域存在突变特殊菌株、低温发酵、Hi-Fi技术、MuteFree载体ITR测序困难ITR发夹结构导致Sanger测序无法可靠测通长读长测序（Nanopore/PacBio）、限制性酶切图谱包装容量限制AAV单链基因组仅约4.7kb优化启动子和调控元件大小、使用微型基因大规模生产三质粒共转染难以放大稳定包装细胞系、HEK293悬浮培养空壳率控制空壳AAV颗粒影响安全性和疗效优化质粒比例、CsCl/层析纯化去除空壳生产成本高GMP级质粒和病毒生产成本极高二质粒系统、稳定细胞系、连续生产技术衣壳蛋白异质性VP1/VP2/VP3比例影响感染性优化辅助质粒中Rep/Cap表达比例6.6 具体案例案例1：Zolgensma（onasemnogene abeparvovec）诺华的Zolgensma是全球首款获批的系统性给药AAV基因治疗药物，用于治疗脊髓性肌萎缩症（SMA）。采用AAV9血清型，将功能性SMN1基因递送至运动神经元。三质粒系统在HEK293细胞中包装，质粒的ITR完整性对病毒产量至关重要。案例2：Luxturna（voretigene neparvovec-rzyl） Spark Therapeutics/Roche的Luxturna是首个获批的AAV基因治疗产品（2017年FDA批准），用于治疗RPE65突变相关的遗传性视网膜病变。采用AAV2血清型，通过视网膜下注射递送RPE65基因。案例3：Hemgenix（etranacogene dezaparvovec） CSL Behring的Hemgenix是2022年获批的B型血友病AAV基因治疗药物，采用AAV5血清型递送人Factor IX Padua变体。该药物标价350万美元，是迄今最昂贵的药物之一，凸显了AAV生产成本控制的行业挑战。案例4：中国首款AAV基因治疗产品 2025年4月，中国首款AAV基因疗法获批上市。生产环节面临工艺放大难、纯化难度大、稳定性欠佳等问题。从质粒到转染的全流程质控是生产成功的关键。案例5：金唯智AAV Hi-Fi技术金唯智（现Azenta）开发的AAV Hi-Fi技术，针对rAAV质粒构建、错误ITR修复和大量制备提供了系统解决方案。该方法的核心不仅是制定了更简单、灵活和快速的克隆方案，更重要的是发明了一种特殊菌株，可在扩增过程中保持ITR完整性。第七章从入门到精通——质粒构建全流程教程7.1 入门篇：基础概念与技能准备7.1.1 必备知识储备知识领域核心内容推荐学习资源分子生物学基础DNA复制、转录、翻译、中心法则Molecular Biology of the Cell (Alberts)基因工程原理限制性内切酶、DNA连接酶、PCR、转化Molecular Cloning (Sambrook)载体与宿主系统质粒、噬菌体、病毒载体、大肠杆菌、CHOCurrent Protocols in Molecular Biology生物信息学工具序列设计、引物设计、密码子优化SnapGene、Benchling、Geneious实验室操作规范无菌操作、电泳、转化、测序验证实验室标准操作规程（SOP）7.1.2 必备工具与软件 •SnapGene：质粒设计与可视化，最常用的克隆设计软件 •Benchling：云端序列设计与管理，团队协作首选 •Primer Premier/Oligo：引物设计 •GenSmart Codon Optimization：密码子优化 •Benchling/Benchling Biology：序列管理、注释、引物设计一体化 •NCBI BLAST：序列比对与验证 •UniProt：蛋白序列数据库 •Addgene：质粒共享数据库，查找和获取载体7.1.3 入门实验流程（以pET载体为例）第一步：序列设计与获取 •确定目的蛋白序列（从UniProt获取） •密码子优化（选择对应宿主的优化算法） •设计引物（添加酶切位点和保护碱基）第二步：基因合成或PCR扩增 •基因合成（推荐，可同时进行密码子优化和去除不利序列） •PCR扩增（从模板中扩增目的片段）第三步：载体与片段的酶切 •选择合适的限制性内切酶（双酶切） •酶切载体和插入片段，凝胶电泳回收第四步：连接与转化 •T4 DNA连接酶连接载体和片段 •转化至大肠杆菌感受态细胞 •抗性平板筛选阳性克隆第五步：验证与确认 •菌落PCR初步筛选 •测序验证序列正确性 •小量制备质粒用于后续实验7.2 进阶篇：面向应用的质粒构建策略7.2.1 重组蛋白质粒构建进阶步骤关键考量优化策略表达系统选择根据蛋白特性选择最适系统需翻译后修饰→CHO/HEK293；快速筛选→大肠杆菌载体选择启动子、筛选标记、标签系统大肠杆菌→pET系列；CHO→pcDNA3.1或pXLG密码子优化宿主特异性优化，避免稀有密码子聚集使用AI优化工具，CAI>0.8，GC 30-70%信号肽筛选不同信号肽对分泌效率影响显著构建3-5种信号肽变体并行测试融合标签选择纯化便利性与功能保持的平衡His-tag（简单快速）、MBP（增溶）、GST（大标签纯化好）表达条件优化温度、诱导剂浓度、时间温度梯度（16-37°C）、IPTG梯度（0.01-1mM）7.2.2 双/多特异抗体质粒构建进阶步骤一：链配对工程选择 •根据抗体格式选择合适的链配对技术（KIH、CrossMab、共轻链等） •在分子设计阶段就考虑质粒设计策略 •建议优先选择KIH+CrossMab或KIH+共轻链组合步骤二：载体系统选择 •瞬转筛选：双质粒系统（操作简便） •稳转建株：单质粒系统（错配控制好） •复杂格式：四质粒+转座子系统步骤三：表达比例优化 •构建多种质粒比例的瞬转测试 •2A肽策略优于IRES（更精确的比例控制） •轻链通常需过量表达步骤四：质量评估 •CE-SDS分析纯度与错配比例 •SEC-MALS分析聚集体 •质谱确认正确组装7.2.3 mRNA/circRNA质粒构建进阶步骤一：质粒模板设计 •mRNA：T7启动子→5'UTR→编码序列→3'UTR→poly(A)→线性化位点 •circRNA：T7启动子→重排I型内含子/II型内含子结构步骤二：poly(A)尾稳定性保障 •采用分段设计（A30-linker-A70） •使用Stbl3菌株、30°C发酵 •每次使用前验证poly(A)完整性步骤三：质粒线性化 •选择poly(A)下游的唯一酶切位点 •优化酶切条件确保完全线性化 •HPLC或凝胶纯化去除未切割质粒步骤四：IVT与环化 •mRNA：线性化质粒→T7聚合酶IVT→加帽→纯化 •circRNA：IVT→PIE法/II型内含子环化→RNase R消化线性RNA→HPLC纯化7.2.4 In vivo CAR-T质粒构建进阶步骤一：技术路线选择 •需要长期表达（肿瘤）→慢病毒载体 •需要可控表达（自免）→mRNA-LNP 步骤二：CAR分子设计 •选择合适的scFv、铰链区、跨膜域、共刺激域 •添加安全开关（iCasp9、EGFRt等） •整合WPRE增强表达步骤三：质粒构建（LVV路线） •构建转移质粒（CAR表达框+安全开关） •选择包膜蛋白（VSV-G或靶向性包膜） •四质粒共转染HEK293T，48-72h收获病毒上清步骤四：质粒构建（mRNA路线） •构建含T7启动子的CAR-mRNA模板质粒 •线性化→IVT→LNP包封 •表面修饰抗体片段实现T细胞靶向7.2.5 AAV质粒构建进阶步骤一：血清型与组织嗜性选择 •AAV9（全身系统性递送）、AAV2（视网膜）、AAV5（肝脏）等 •也可考虑衣壳工程化改造的新型血清型步骤二：转移质粒设计 •目的基因必须位于两个ITR之间 •总包装容量不超过4.7kb（含ITR） •启动子选择需权衡表达强度与大小步骤三：ITR稳定性保障 •使用Stbl3菌株，30°C发酵 •限制传代次数（<5代） •每次使用前验证ITR完整性（长读长测序） •考虑使用MuteFree AAV或Hi-Fi技术步骤四：三质粒共转染与包装 •载体质粒:辅助质粒:腺病毒辅助质粒 ≈ 1:1:1 •HEK293/293T细胞，钙磷共沉淀或PEI转染 •48-72h收获，冻融或裂解释放病毒 •CsCl梯度离心或层析法纯化7.3 精通篇：跨领域整合与前沿趋势7.3.1 跨领域质粒构建共性挑战与解决方案共性挑战在重组蛋白中的表现在双抗中的表现在mRNA中的表现在CAR-T中的表现在AAV中的表现序列稳定性长基因易突变多链载体大易重组poly(A)尾不稳定大质粒难维护ITR极度不稳定表达效率密码子偏好性链配对效率低IVT产量不足CAR表达量不足包装产量低质量控制序列正确性错配产物分析mRNA完整性病毒滴度/纯度ITR完整性与空壳率工艺放大发酵条件优化转染比例控制线性化完全性LVV规模化生产三质粒转染放大7.3.2 前沿技术趋势 •AI辅助设计：利用AI预测链配对效率、优化密码子、预测聚集风险（筛选效率可提升10倍） •单质粒系统整合：从多质粒到单质粒，简化工艺、提高一致性 •稳定细胞系替代瞬转：稳定包装细胞系用于慢病毒和AAV生产 •长读长测序质控：Nanopore/PacBio解决ITR和poly(A)测序难题 •circRNA融合技术：在in vivo CAR-T中使用circRNA延长表达时间 •连续生产工艺：从批次生产到连续生产，提升效率降低成本 •基因编辑整合：CRISPR技术实现更精准的基因改造 •衣壳工程化：定向进化或计算设计新型AAV衣壳，提升靶向性和效率7.3.3 质粒构建最佳实践总结最佳实践详细说明设计先行在动手构建前完成完整的设计方案：元件选择、酶切策略、验证方案多重验证测序验证+酶切验证+功能验证，不依赖单一方法保留备份每次构建保留原始质粒和中间产物，避免从头开始记录详实详细记录每个步骤的条件和结果，便于问题追溯定期质检定期验证存储质粒的完整性，特别是含ITR或poly(A)的质粒标准操作建立并遵循SOP，确保批次间一致性提前规划考虑下游需求（如GMP生产）提前设计可放大的工艺路线附录附录A：五大领域质粒构建对比总结对比维度重组蛋白双/多特异抗体 mRNA/环形mRNA In vivo CAR-T AAV基因治疗质粒用途蛋白表达载体抗体表达载体IVT DNA模板LVV包装/LNP模板病毒包装原料核心挑战蛋白不表达/包涵体链错配poly(A)不稳定靶向递送ITR不稳定特殊要求信号肽/标签多链比例调控线性化完全性安全开关ITR完整性宿主系统大肠杆菌/CHOCHO为主大肠杆菌（质粒）HEK293T（包装）HEK293（包装）质控重点序列正确性错配产物比例超螺旋+线性化完全病毒滴度/纯度ITR完整性+空壳率典型载体pET/pcDNA3.1Quad vector/双质粒pUC+T7系统三/四质粒系统三质粒系统GMP要求高（生物药）高（生物药）极高（疫苗/药物）极高（细胞治疗）极高（基因治疗）附录B：常用菌株与适用场景菌株基因型特点适用场景DH5αrecA1, endA1, gyrA96常规克隆、质粒扩增BL21(DE3)lon, ompT, DE3溶原体T7系统蛋白表达Rosetta(DE3)补充7种稀有tRNA表达含真核稀有密码子的蛋白Stbl2recA-, 降低重组频率含ITR/长重复序列质粒Stbl3recA-, endA-, 降低重组频率AAV质粒、mRNA模板质粒JM109recA, endA常规克隆TOP10recA1, endA1高通量克隆Origami(DE3)trxB, gor突变促进二硫键形成附录C：参考文献与推荐阅读 •Molecular Cloning: A Laboratory Manual (4th Edition), Green & Sambrook •Li YR et al. In vivo CAR engineering for immunotherapy. Nat Rev Immunol. 2025;25(10):725-744. •Chen Y et al. In vivo CAR-T cell engineering. Exp Hematol Oncol. 2025;14(1):133. •Wang Z et al. Circular RNA engineering and applications. Cell. 2022. •Gene Therapy with AAV Vectors: From Discovery to Clinical Application. Nat Rev Drug Discov. •Bui TA et al. Advancements in challenges in developing in vivo CAR T cell therapies. EBioMedicine. 2024;106:105266. •云舟生物MuteFree AAV技术白皮书, 2026 •金唯智AAV载体构建与质粒制备技术方案, 2022 •康日百奥复杂抗体表达平台化策略白皮书, 2025 •金斯瑞TurboCHO双特异性抗体表达技术资料

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组织架构

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管线布局

2026年06月14日管线快照

管线布局中药物为当前组织机构及其子机构作为药物机构进行统计，早期临床1期并入临床1期，临床1/2期并入临床2期，临床2/3期并入临床3期

药物发现

临床前

临床1期

其他

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当前项目

药物(靶点)	适应症	全球最高研发状态

TI-0032-III ( CD19 )	系统性硬皮病更多	临床1期
TI-0093	HPV16阳性实体瘤更多	临床1期
Circular RNA-encoded CD19×CD3 T-cell engager (Therorna) ( CD19 x CD3 )	自身免疫性疾病更多	临床前
CircRNA based SARS-CoV2 vaccines (Therorna Inc)	新型冠状病毒感染更多	药物发现
TI-0010	新型冠状病毒感染更多	无进展