UNC Systems AB

接上篇，我们继续介绍生物大分子可视化的历程。 ——Richardson视角—— 2.计算机图形学：丝带和全原子接触点 我们首次接触用于晶体学的计算机图形交互设备是在北卡罗来纳大学教堂山分校计算机系的图形实验室。如图1A所示，GRIP-75系统能够实现结构的立体显示和平滑旋转，还配备了有五个按钮和滑动条的控制台。这是首个能够将原子模型嵌入电子密度图的计算机系统。相应的计算由填满身后房间的IBM360完成。我们是其开发过程中的实验对象，而我们的2Å分辨率Cu,Zn超氧化物歧化酶（2sod; “SOD”）结构是第一个直接通过计算机而非物理模型搭建的蛋白质晶体学模型。图1B展示的是SOD结构中一对二硫键的截图。后来，越来越多的用户开始使用这套系统。再后来，GRIP-75逐渐被能够在实验室独立运行的Frodo取代。 图1. 第一套用于模型搭建的计算机图形系统GRIP-75 当我们有了自己的Evans&Sutherland PS300矢量显示器时，人们已经开始尝试各种带状的结构表示方法，但大多数都过于刻板且生硬。第一个我们喜欢的方法是Mike Carson开发的Ribbons程序[1]。他为我们提供了B-splines算法，并针对螺旋和转角半径做了偏移调整，Dave随后将其编码为多股矢量带状结构。如图2A展示的就是带状的色氨酸阻遏蛋白的二聚体结构。 图2. 早期的计算机显示蛋白结构图形 在1990年，我们意识到第一台苹果家用桌面电脑能够平滑地旋转500个矢量——足以实现分子3D可视化或简单的构象变化动画。一次在Sierras的徒步旅行中，我们构思了“kinemage”格式的框架，包括它可编辑和可点选的特性。Dave随后编写了Mage程序以显示kinemages，提供了许多交互式查看和编辑选项。大约在同一时间，RasMol也被开发用于家用电脑。Kinemages当时随每月的《Protein Science》新刊一起通过4K软盘分发，成为了重要的电子补充材料。开始的样例都非常简单：一般是蛋白的一个活性位点或整体Cα轨迹，比如T4溶菌酶结构域的铰链运动的动画（图2B）。随着个人计算机性能的快速发展，越来越大的模型甚至带状结构都可以以交互方式显示（图2C）。 如今，计算机能够显示的图形的尺寸和复杂性已经不再受到性能限制，而主要受观众感知效率的限制。对于非常大的分子、复合物甚至整个细胞，其他新的表示方式已逐渐取代了带状图形（参见Goodsell的相关论述）。图3A-F展示了一些我们最喜欢的中等大小蛋白质和复合物的带状图形，从小型三聚体到蛋白质- DNA复合物以及膜蛋白。这些图形中的前两个是用Mage创建的，其余则使用了KiNG程序。它是一种能够在线和本地使用的kinemage查看器，具有许多额外的编辑和重建功能。 图3.计算机绘制的丝带风格蛋白结构 3.全原子接触分析 在早期的蛋白质设计工作中，我们能够实现正确的二级结构和拓扑结构，但未能达到有序的、类似天然状态的结构。然后我们意识到：如果我们将标准的隐式“统一原子”处理方式转变为显式地包含所有氢原子，并关注它们的相互接触，我们就可以进行更加量化且直观的原子-原子间堆积分析。我们的原子-原子间接触点在一定程度上正和刻画溶剂可及表面的Connolly点相反[2]。我们的Reduce程序能够显式地放置所有氢原子，并优化它们的旋转和相互作用网络，考虑了氢键、范德华相互作用（vdW）和碰撞等因素。这种全原子接触分析可视化了原子表面是如何接触的，而传统的从原子中心出发的能量分析由于是数值化的，相比之下并不直观。 图4. 用全原子接触点分析相互作用 图4A展示了在高分辨率下弹性蛋白酶（PDB: 1EZM）脯氨酸侧链氢原子周围的范德华接触，点状图呈现出起伏交错的模式。绿色点表示完美的原子-原子接触，蓝色点表示非常接近但没有接触，黄色点表示接触稍有些紧密。图4B显示了一个过渡态抑制剂通过13对氢键（浅绿色点组成的圆片）紧密结合在核糖核酸酶中（PDB: 1RUV）。图4C展示了在1.35Å分辨率下（PDB: 4FEN）RNA双螺旋中的碱基堆叠的范德华接触和碱基对的氢键。高分辨率实验结构中有序的部分几乎没有碰撞，氢键密度高，氢原子指向明确且形成了良好的范德华接触，这证实了全原子接触体系的有效。因此，全原子接触分析提供了一种强大的方法，用于发现实验模型中不合适的局部构象。这些不合适的构象以≥0.4Å的原子间重叠（碰撞）为特征。这一发现促使我们建立了MolProbity验证网络服务，后续会对此进行讨论。 4.RNA的七维结构 2000年，首个核糖体结构被解析后，我们的学生Laura Murray带领我们重新回到对RNA的研究。在1960年代，我们的朋友Sung-Huo Kim解析了第一个复杂折叠的RNA结构（图5A），极大改变了人们对tRNA类三叶草结构的认识。核糖体的研究又为RNA主链构象的研究提供了更多的数据。由于RNA每个PO4基团到下一磷酸基团间有六个可变的二面角，因此RNA个主链构象具有内在的高维特性，我们发现七维的糖环到糖环的整体分析方法能够展示出更好的聚类效果，因为它比核苷酸包含了更多的主链相互作用，并且受到连续碱基相互作用的直接影响。 之后Dave和Vincent Chen分别在Mage和KiNG程序中开发了一种集成的高维技术，用于显示和分析这些数据。该方法通过为特定的参数三重组定义“视图”，选择并为显现出的聚类点着色（图5B），然后在其他3D组合和平行坐标系中检查聚类的有效性（图5C）。这一工作最终促成了五个不同实验室的合作，达成了一个RNA主链构象的共识库，其中每个构象以两字符的名称表示，异常情况则以"!!"（bang-bang）表示。这一工具帮助研究者能够有意义地命名和可视化RNA结构特征，如stack switch、S-motif或GNRA四核苷酸环（图5D）。当这些结果与全原子接触分析结合时，图像更加信息丰富，并可以指导对RNA结构中异常值的修正。 图5. RNA结构和骨架构象的可视化 5.DiVE中的虚拟现实：NMR RDC曲线 在Duke沉浸式虚拟环境（DiVE）中，我们探索了沉浸式虚拟现实能否应用于分子研究并增强研究人员的直觉感知。通过与杜克大学的可视化技术小组合作，我们建立了DiVE环境下的KinImmerse系统。它能够显示kinemage格式的数据文件，具备原子选择、识别和测量的功能（图6A）。我们的测试案例是将NMR结构系综和晶体学模型直接进行比较。 基础的NMR数据主要测量局部原子间关系：其通过核Overhauser效应（NOE）值测量原子对距离，通过剩余偶极耦合（RDC）值测量原子对相对于磁场的方向，因此非常适合在结构系综内进行结构比较。通过我们设计的共中心化功能（cocentering），研究者可以对特定类型的原子进行比较，观察每个残基中模型与局部数据的契合程度。图6B展示了围绕Glu 36中的N原子的RDC曲线（PDB: 2JNG）。在这种情况下，某些模型肯定是错误的，因为H原子应该都位于RDC曲线的同一分支上。至于具体哪个模型是正确的，需要通过其他验证标准（如氢键、碰撞和φ,ψ值）来判断。这一系统后来被移植回单屏幕查看，但如果没有虚拟现实环境的启发，可能不会被想到。 图6. 在虚拟显示中进行模型搭建和验证 6.结构模型的标记和修正 我们的MolProbity程序在全原子接触分析的基础上添加了包括键长、键角、Cβ偏差、Ramachandran φ,ψ二面角、侧链构象异构体、RNA的糖翻转和主链构象在内的其他各类验证指标。将结构模型提交给MolProbity进行分析后，MolProbity会在输出的模型中对局部的异常值进行可视化标记（图7A）。 如今，MolProbity已经成为广泛使用的结构模型验证工具。它不仅能够检测出模型的局部异常，也能为模型的改进提供方向。图7B是图7A所示的1LPL结构的左上角部分的放大视图，可以看出这部分存在碰撞和侧链构象异常。将模型和电子密度图比对可以看出，是136号Cα原子的主链和侧链放置颠倒，将136号和137号残基进行局部修正之后，这些表示异常的标记消失，且之前未被占据的密度中延伸出了一圈α螺旋。再次进行验证，可以发现模型的Rwork降低了1%，而Rfree则降低了4%，表明了模型的改变是真正的改进。 图7. 使用MolProbity分析标注指导结构修正 在过去20年里，这种验证和可视化系统显著地提升了wwPDB中常见分辨率（从亚1Å到大约2.5Å）的条目的数据质量。然而，最近基于冷冻电镜（cryo-EM）方法成功解析了大量巨大的、动态的“分子机器”，其分辨率大多低于2.5Å。这些新结构为我们对生物学的理解做出了革命性的贡献，但较低的分辨率引入了传统验证指标难以检测的新系统性错误。我们与其他研究者正在开发新的验证系统，希望能够检测出传统异常值被人为调整到合格但仍不正确的构象里的局部错误。到目前为止，最有效的新指标是CaBLAM，它检测的是所建模的肽段方向是否与周围五个残基的Cα主链是否一致。 在2020年，结构生物学家迅速动员起来，以前所未有的速度解析并发布了SARS-CoV-2相关的蛋白结构。我们与Tristan Croll合作，利用所有工具识别并纠正这些结构中重要位点的可修正错误。发现的问题包括序列错位、离子电荷数错误、二硫键扭曲，抗体结合界面扭曲，以及许多肽段的定位错误或顺式-反式颠倒。 当前最喜欢的可视化工具 ChimeraX的快速环境遮蔽（图8A）[3] ISOLDE中的可视化模型重建（图8B）[4] Ribosolve对RNA模型不确定性的可视化（图8C）[5] KiNG中的全原子接触 David Goodsell的表示方法 图8. 当前最喜欢的可视化工具的可视化效果 全文完。Richardson视角结束[6]。下期将介绍Goodsell教授视角的大分子可视化历程。 参考资料： [1] Carson, M., and Bugg, C. E. (1986) Algorithm for ribbon models of proteins. J. Mol. Graph. 4, 121–122 [2] Connolly, M. (1983) Solvent-accessible surfaces of proteins and nucleic acids. Science 221, 709–713 [3] Goddard, T. D., Huang, C. C., Meng, E. C., Pettersen, E. F., Couch, G. S.,Morris, J. H., and Ferrin, T. E. (2018) UCSF ChimeraX: Meeting modern challenges in visualization and analysis. Protein Sci. 27, 14–25 [4] Croll, T. I. (2018) Isolde: A physically realistic environment for model building into low-resolution electron-density maps. Acta Crystallogr. D Struct. Biol. 74, 519–530 [5] Kappel, K., Zhang, K., Su, Z., Watkins, A. M., Kladwang, W., Li, S., Pintilie, G., Topkar, V. V., Rangan, R., Zheludev, I. N., Yesselman, J. D., Chiu, W., and Das, R. (2020) Accelerated cryo-EM-guided determination of three-dimensional RNA-only structures. Nat. Methods 17, 699–707 [6] 看来两位Richardson教授是一点不用Pymol。 译者：郭   政 审稿：钟书辰 编辑：黄志贤 GoDesign ID：Molecular_Design_Lab （ 扫描下方二维码可以订阅哦！）

安慰剂效应（Placebo effects）是身心相互作用的显著证明，在疼痛感知过程中，在没有任何治疗的情况下，对疼痛缓解的预期就可以减少疼痛体验，这一现象被称为安慰剂镇痛效应。 然而，尽管安慰剂效应的作用强大，对人类日常体验产生影响，且导致新疗法的临床试验失败，但安慰剂效应的神经回路基础仍然不清楚。  2024年7月24日，北卡罗来纳大学教堂山分校 Grégory Scherrer团队（陈冲博士为第一作者）在国际顶尖学术期刊 Nature 上发表了题为：Neural circuit basis of placebo pain relief 的研究论文。 该研究发现了安慰剂效应缓解疼痛的一个大脑神经回路——前扣带回皮质喙部（rACC）向脑桥核（Pn）的神经元投射（rACC→Pn）。 此前有研究显示，安慰剂镇痛效应与前扣带回皮质内的活动有关，这个脑区也与疼痛感受有关。但这种现象背后的生物学机制一直不明。 在这项最新研究中，研究团队设计了一个安慰剂镇痛效应小鼠模型，在小鼠中产生类似安慰剂的预期性疼痛缓解，来研究疼痛缓解是如何介导的。研究团队让小鼠与地面温度不同的两个房间条件性相关，一个热度舒适，另一个非常热。这些条件性小鼠暴露在更热的地面后，会在更凉的地面上停留更长时间，说明它们预期这能缓解疼痛，而且它们的疼痛缓解行为也会减少，例如舔脚。 研究团队发现，由疼痛缓解预期产生的镇痛作用是由前扣带回皮质喙部（rACC）向脑桥核（Pn）的神经元投射（rACC→Pn）所介导的，而脑桥核（Pn）此前并未被发现在疼痛中有作用。对神经活动的体内钙成像和脑切片中的电生理记录表明，对疼痛缓解的预期会提高rACC→Pn神经元的活性，并增强该通路中的神经传递。 对疼痛缓解的预期激活了rACC→Pn通路 对脑桥核（Pn）神经元的转录组学研究显示，脑桥核（Pn）中含有大量的阿片类受体，进一步表明了其在疼痛调节中的作用。 研究团队进一步发现，抑制rACC→Pn通路会破坏安慰剂镇痛作用并降低疼痛阈值，而在没有安慰剂条件作用的情况下激活则会引发镇痛作用。 最后，研究团队在小脑内发现了一个细胞簇——浦肯野细胞（Purkinje cell），这些细胞在疼痛缓解预期期间表现出类似于rACC→Pn神经元的活动模式，它们或许能编码rACC→Pn通路中的疼痛缓解预期，这为小脑在认知性疼痛调节中的作用提供了细胞水平的证据。 这些发现为使用药物、电极神经刺激或认知行为疗法靶向前额皮质-脑桥-小脑通路来治疗和缓解疼痛开辟了可能性。  论文链接： https://www.nature.com/articles/s41586-024-07816-z 封面图来源：123rf 版权声明/免责声明 本文为授权转载文章。 本文仅作信息交流之目的，不提供任何商用、医用、投资用建议。 文中图片、视频、字体、音乐等素材或为药时代购买的授权正版作品，或来自微信公共图片库，或取自公司官网/网络，部分素材根据CC0协议使用，版权归拥有者，药时代尽力注明来源。 如有任何问题，请与我们联系。 衷心感谢! 药时代官方网站:www.drugtimes.cn 联系方式: 电话:13651980212 微信:27674131 邮箱:contact@drugtimes.cn 对话诺和诺德全球高管！诺和诺德「中国研发日」报名通道开启 一个靶点，60年的“误解” 「肝炎」新药，下一个赛点在哪儿？ 点击这里，发现价值信息！

*仅供医学专业人士阅读参考科学家们已经反反复复验证过了，安慰剂是真有用。在临床研究中，安慰剂原本只是作为药物或者治疗方法的对照组，为患者提供“假”治疗。但是由于大脑强大的“暗示”功能，本该没有治疗作用的“药物”或者“治疗方法”也提供了一定的症状改善。也因此，研究人员认为实际治疗组也在一定程度上因为“安慰剂效应”获益。这就给临床治疗研究创造了新的困难。所以，除了感叹“安慰剂”的神奇作用，搞清楚其中的生物学机制也十分重要。北卡罗来纳大学教堂山分校的学者们选择了安慰剂的镇痛效用进行研究。通过结合小鼠行为试验，他们发现了安慰剂缓解疼痛的神经机制。研究表明，当小鼠预期自己的疼痛会得到缓解时，前扣带回皮质喙部-脑桥核（rACC→Pn）通路上的神经元活动增强，Pn神经元表达大量阿片类受体，引发安慰剂的镇痛作用。研究发表在《自然》杂志上。疼痛是一种主观体验，身心互动对疼痛感知有强大的影响力，受试者的积极预期可以在没有镇痛药物的情况下减少疼痛感知。安慰剂镇痛更是在医疗实践和临床试验中都起着非常重要的作用。研究人员设计了一个为期7天的安慰剂镇痛条件化模型（PAC）。模型由两个房间组成，在适应阶段（第1-3天），两个房间的地板为30℃，小鼠可以在房间内自由探索，以第3天表现为基线探索模式；条件化阶段（第4-6天），1号房间地板设置为48℃，2号房间温度保持不变，小鼠从1号房间进入2号房间，并建立“疼痛会缓解”的预期；测试阶段（第7天），两个房间地板均设置为48℃，评估“预期疼痛会缓解”可能引起的镇痛效果。小鼠条件化模型条件化小鼠表现出对2号房间的显著偏好，在2号房间里似乎变得“更不怕痛”，即使房间温度升高，也可以比在1号房间内坚持更久时间，才出现舔爪、抬腿、搔抓等因疼痛产生的伤害性行为，测试期间的整体伤害行为也较少。这种条件化诱导的镇痛效果持续时间长达一周。研究人员还发现，非条件化阶段进行阿片受体拮抗剂给药，会消除条件化产生的镇痛效果，暗示内源性阿片信号在安慰剂镇痛效果中发挥了关键作用。疼痛缓解预期过程中rACC→Pn神经元活动增强人类大脑成像研究表明，rACC与安慰剂镇痛效用有关。但是rACC的细胞类型众多，研究人员利用腺相关病毒标记条件化期间活跃的rACC神经元，发现rACC轴突投射集中在介导皮层-小脑交流的脑桥区域——脑桥核（Pn）。研究人员比较了小鼠在进行房间交换时的神经元活动。当小鼠有疼痛缓解预期时，rACC→Pn神经元活动增加；当小鼠无疼痛缓解预期时，神经元活动保持不变；当小鼠逐渐发现房间交换不能带来疼痛缓解（违背预期）时，rACC→Pn神经元活动显著减少。对rACC→Pn通路的光遗传学调控影响条件化诱导镇痛效果和疼痛行为脑片电生理学实验显示，在条件化过程中，rACC→Pn神经元的Ca2+活动增加，自发兴奋性突触后电流振幅增加，但是频率不变，神经元长期增强（LTP）增加。利用光激活和光抑制调控rACC→Pn通路活性，可以发现rACC→Pn参与了疼痛阈值的调节，即通路活性增加，则小鼠疼痛反应减弱，通路活性被抑制，小鼠疼痛反应增加。大量Pn神经元表达δ和μ阿片受体（分别为Oprd1和Oprm1），81%的Oprd1+Pn神经元表达兴奋性神经元标记。经过验证，研究人员证实Oprd1+Pn神经元与rACC的单突触连接，并且通过调节Oprd1+Pn神经元活性，可以调控安慰剂的镇痛效果。研究人员还研究了Pn神经元的主要靶点——小脑。通过标记Oprd1+Pn神经元在小脑中的投射，发现浦肯野细胞在条件化期间Ca2+活动显著增加，表现出与疼痛缓解预期相关的行为变化。疼痛是一种复杂的体验，包括感觉-辨别、情感-动机和认知-评价三个维度。研究揭示了安慰剂镇痛以及认知-评价维度的神经通路，更加完善了对疼痛的理解。同时，也开辟了通过激活rACC→Pn通路调控疼痛感知的可能性，为探究其他身心相互作用和安慰剂效应的神经通路提供了新的框架。参考文献：Chen C, Niehaus J K, Dinc F, et al. Neural circuit basis of placebo pain relief[J]. Nature, 2024: 1-3.本文作者丨王雪宁