PSMA x TGF-β

摘要：双特异性抗体（bsAbs）能够实现传统基于IgG的抗体无法达到的新型作用机制和/或治疗应用。因此，这些分子在过去十年中引起了极大的兴趣，并且截至2023年底，已有14种bsAbs获得批准：11种用于治疗癌症，3种用于非肿瘤学指征。bsAbs有不同格式，针对不同的目标，并通过不同的分子机制介导抗癌功能。在这里，我们提供了bsAbs在癌症治疗领域最新进展的概述。我们专注于已批准或处于临床开发中的bsAbs，包括bsAb介导的信号通路双重调节剂、肿瘤靶向受体激动剂、bsAb-药物偶联物、双特异性T细胞、自然杀伤细胞和先天免疫细胞的招募者，以及双特异性检查点抑制剂和共刺激因子。最后，我们对处于更早开发阶段的下一代bsAbs进行了展望，包括三特异性抗体、bsAb前药、诱导肿瘤目标降解的bsAbs以及作为细胞因子模拟物的bsAbs。 引言  bsAbs用于双重受体抑制 bsAbs用于配体-受体抑制 bsAbs用于受体激活 bsAbs用于靶向载荷递送 bsAbs用于癌症免疫治疗、 新兴概念 、展望，双特异性抗体通过新生儿Fc受体（FcRn）循环利用。Fc部分的突变可以改变与FcRn的结合，从而改变抗体的半衰期。在不包含Fc部分的bsAbs中，可以通过其他方式实现类似IgG的药代动力学，例如结合到人血清白蛋白（HSA）或其他可以延长半衰期的分子。目前有超过几百种不同类型的bsAb格式，其中多种格式在已批准和处于临床开发中的分子中使用。目前，大多数已批准的bsAbs和处于药物开发高级阶段的分子主要用于癌症免疫治疗。其他针对新型药物递送的实体也在开发中，例如基于bsAb的抗体-药物偶联物（bsADCs）或双重靶向与癌症相关的信号通路（图1）。我们最近在ClinicalTrials.gov、Cortellis和The Antibody Society的数据搜索显示，有超过200种不同的双特异性分子的300多项临床试验正在进行中，其中约75%用于治疗实体瘤，25%用于治疗血液恶性肿瘤（图1）。目前有十种bsAb药物已获批准用于癌症治疗，其中九种在美国和/或欧洲获批准，卡多尼利单抗在中国获批准。在这十种bsAbs中，有九种可以归类为TCEs。卡塔莫单抗是首个获批准的bsAb，于2013年退出市场（表1和图2）。值得注意的是，今天在临床开发中的相当一部分bsAbs已经处于后期阶段（第二阶段和第三阶段）。我们发现，用于治疗实体瘤的bsAbs主要由免疫调节剂主导，包括双重CPIs（约45%）和TCEs（约33%），其次是针对双重通路的bsAbs、ICEs和双重ADCs。相比之下，TCEs是用于治疗血液恶性肿瘤的主要bsAbs类别（约75%），其次是ICEs、双重CPIs和NKCEs（图3）。我们数据集中的bsAbs针对60多个不同的目标，使用超过50种不同的bsAb格式，涉及100多种目标组合。然而，我们承认，该领域的增长速度很快，新的bsAbs，可能具有新的目标和格式，已经进入临床试验，自我们分析以来。尽管如此，本综述旨在提供一份基于MoA的全面概述，介绍作为癌症治疗开发的bsAbs的最新进展，重点关注截至2023年底在同行评审出版物中描述的bsAbs。 双受体抑制的bsAbs  许多参与细胞信号传导的细胞表面蛋白，如RTKs及其相关受体，是抗体基疗法的验证目标。几十年前，对这些蛋白的研究，包括历史上的先行者表皮生长因子受体（EGFR；也称为HER1）、HER2、血管内皮生长因子（VEGF）和针对它们的抗体，为几乎所有后续的抗体基治疗发展奠定了基础。尽管结合一个定义的信号实体的抗体基疗法相当有效，但与疾病相关的表现型通常由多个通路触发。这种冗余允许细胞通过使用其他补偿性信号通路来克服单一目标或通路的药理学生长抑制或诱导细胞毒性。同时调节不同的与疾病相关的信号受体和/或通路的bsAbs可以减少或克服这种限制。Amivantamab（JNJ-61186372）靶向EGFR和肝细胞生长因子受体（MET）。两种受体都会触发非小细胞肺癌（NSCLC）的增殖，因此，阻断两者可以比仅阻断一个通路更有效地抑制NSCLC的生长。Amivantamab已获批准用于治疗携带EGFR外显子20插入突变的NSCLC亚型。 图1 | 用于癌症治疗的双特异性抗体在临床开发中。目前有200多种双特异性抗体（bsAbs）正在进行临床开发，根据癌症类型、临床阶段和作用模式进行分组。正在进行临床开发的bsAbs中有50%处于II期和III期或已经获批。大约四分之三的bsAbs被开发用于治疗实体瘤，实体瘤治疗主要由T细胞招募剂（TCEs；32.9%）和具有检查点抑制和/或免疫调节作用机制（MoAs）的bsAbs（45.1%）所主导。相比之下，血液系统恶性肿瘤的治疗主要由TCEs（75%）和其他MoAs（21.9%）所主导，这些MoAs涉及免疫学活动，如通过检查点抑制和/或免疫调节激活自然杀伤细胞和其他免疫细胞，这归功于高度肿瘤选择性或谱系特异性抗原的可用性。值得注意的是，约有10%用于实体瘤治疗的bsAbs采用双重信号抑制。迄今为止，正在开发的bsAb抗体-药物偶联物（ADCs）用于治疗实体瘤。CPI，检查点抑制剂；ICE，先天细胞招募剂；NKCE，自然杀伤细胞招募剂。 双特异性抗体用于配体-受体抑制  受体激活可以通过干扰受体二聚体化或复合物形成，或通过阻断受体的配体结合位点来抑制。在癌症中，通常来自几个互补或补偿通路的配体和受体有助于肿瘤进展和治疗抗性。bsAbs可以同时阻断两种不同的配体，无论是可溶的还是细胞膜结合的，或者是配体和受体的组合。这种方法不仅用bsAbs来解决，也用双特异性或双位点基于支架的结合剂来解决，这里我们不包括。双重靶向VEGF和血管素2（ANG2）以阻断分别参与血管生成的VEGFR和血管素-1受体（TIE2）的激活，已成为包括微转移的血管生成转换在内的实体瘤中几项临床试验的主题。BI836880是一种三特异性纳米抗体（Nb）融合蛋白，由三个靶向VEGFA、ANG2和HSA的纳米抗体组成，后者用于延长其血清半衰期。这种化合物目前正在对头颈鳞状细胞癌、NSCLC和其他实体瘤患者进行I期研究。值得注意的是，vanucizumab，一种靶向VEGFA和ANG2的bsAb，在与化疗联合使用的临床前模型中显示出抗肿瘤、抗血管生成和抗转移效应，但在与化疗联合使用时，并未在结直肠癌患者中提高无进展生存期，超过VEGF抑制。将VEGF抑制与另一种拮抗活性相结合的概念进一步应用于靶向VEGF和Delta样规范Notch配体4（DLL4）的bsAbs。DLL4是一种细胞表面配体，激活Notch-1受体通路，该通路在肿瘤血管生成中起着核心作用。几种靶向VEGF和DLL4的双特异性抗体已经进入临床试验，包括navicixizumab、dilpacimab和CTX009/ABL001。Navicixizumab是一种四价双特异性抗体，具有四个结合位点，其中两个基于单链可变片段（scFv）融合，它在与紫杉醇联合使用时在铂类耐药卵巢癌患者中展示了有希望的临床活性，并具有可管理的毒性，表明这种方法可能在某些适应症中提供临床益处。相比之下，另一项针对四价双特异性抗体dilpacimab的II期研究，与亚叶酸、氟尿嘧啶和伊立替康（FOLFIRI）联合使用，揭示了安全问题。 表1 | 批准用于癌症治疗的双特异性抗体 ADCC，抗体依赖性细胞毒性；ALL，急性淋巴细胞性白血病；BCMA，B细胞成熟抗原；BiTE，双特异性T细胞招募剂；bsAb，双特异性抗体；DLBCL，弥漫性大B细胞淋巴瘤；EGFR，表皮生长因子受体；EpCAM，上皮细胞粘附分子；GPRC5D，G蛋白偶联受体C类5成员D；MoA，作用机制；NSCLC，非小细胞肺癌；NHL，非霍奇金淋巴瘤；scFv，单链可变片段；TCR，T细胞受体；TDCC，T细胞依赖性细胞毒性。批准区域限于美国、欧洲联盟（EU）、日本和中国；产品也可能在其他国家获得批准。状态截至2023年底。 靶向VEGF和PDL1或PD1的双特异性抗体  基于VEGF抗体和免疫检查点抑制剂（CPI）联合治疗的积极结果，上述概念进一步适应于设计靶向VEGF和肿瘤细胞上的PDL1或T细胞上的PD1的双特异性抗体，从而将抗血管生成与免疫肿瘤学方法相结合。使用这种方法最先进的分子是ivonescimab（AK112），它针对PD1和VEGF。目前，ivonescimab的上市申请正在中国接受监管审查。其他双特异性抗体靶向PDL1和VEGF，包括PM8002，目前正在进行II/III期研究（NCT05756972），针对NSCLC患者。 受体激活的双特异性抗体  许多抗肿瘤反应是通过激活细胞表面受体介导的，包括免疫反应或通过诱导凋亡的细胞死亡。癌症治疗的一种方法是通过将受体激活配体（如生长因子、细胞因子和（共）免疫刺激配体）融合到抗体或抗体片段上，实现受体激活配体的靶向递送，以诱导局部或组织特异性的激动活性，从而引发细胞反应。越来越多的这些抗体-配体融合蛋白正在进入临床试验。受体激活也可以通过激动性抗体来实现。肿瘤坏死因子（TNF）超家族的成员，包括死亡配体（如TNF配体超家族成员10（TNFSF10）；也称为TRAIL）及其各自的死亡受体（如TRAIL受体1和2；也称为DR4和DR5），或具有免疫细胞共刺激活性的配体（如TNFSF9；也称为4-1BBL）及其受体（如TNFRSF9；也称为4-1BB或CD137）在癌症治疗中引起了特别关注。然而，单克隆抗体在临床试验中取得了相当令人失望的结果。原因是许多TNFRSFs需要超过两个受体的交联以激活，这只能通过Fc-FcγR介导的抗体在细胞表面的超聚集来实现，因此依赖于TME中表达足够数量FcγR的先天免疫细胞。作为替代方案，针对目标抗原和TNFRSF成员的双特异性抗体已被证明可以作为强大且肿瘤选择性的激动分子，模仿表面展示配体的活性。这尤其适用于DR4和DR5，DR5需要多个受体的聚集才能激活。值得注意的是，针对DR5和表面抗原的双特异性抗体，如成纤维细胞激活蛋白-α（FAPα；也称为脯氨酸内肽酶FAP）、钙粘蛋白17（CDH17）或叶酸受体-α（FRα），不仅有效地诱导受体激活，还避免了通过诱饵受体的隔离50。RG7386（RO6874813），一种针对癌症相关成纤维细胞上的FAPα和DR5的四价双特异性抗体，在体外和体内在表达FAPα的基质的小鼠中触发了强效且选择性的肿瘤细胞杀伤，并已进入临床测试，但由于战略投资组合优先级而随后中止。此外，BI905711，一种针对DR5和CDH17的四价双特异性IgG-scFv融合蛋白，目前正在进行I期临床研究，显示出在CDH17阳性目标细胞上的效力比单克隆抗体提高了1000倍以上，转化为在结直肠癌模型中的强效且选择性的抗肿瘤活性。相同的格式用于针对DR5和FOLR1的双特异性抗体，FOLR1是一种富集于卵巢癌的受体，已被证明介导顺式（在同一细胞上）和反式（在两个不同细胞上）的细胞毒性，其中FOLR1作为有效DR5激活的聚集点。从概念上讲，这种MoA也可以转移到依赖于受体聚集的TNFRSF家族的共刺激成员，包括4-1BB、OX40和CD40（见图3），使用针对肿瘤相关抗原（TAAs）的双特异性抗体，但也针对其他目标，如PDL1，从而将共刺激与检查点抑制相结合（见下文）。 用于靶向载荷递送的双特异性抗体  存在两种概念上不同的方法，用于使用双特异性抗体进行有效载荷（如细胞毒素或放射性）的靶向递送。第一种方法，预靶向治疗，使用双特异性抗体的一个结合特异性来靶向肿瘤细胞，另一个结合特异性随后捕获肿瘤上的载荷。这类双特异性抗体结合到肿瘤上的癌症靶标，如癌胚抗原（CEACAM5）或HER2，然后捕获由双特异性抗体的第二个结合特异性识别的放射性标记载荷/复合物。 图2 | 已批准用于癌症治疗的双特异性抗体概览。a, 双特异性T细胞招募剂（TCEs）。b, 其他双特异性抗体（bsAbs）（非T细胞招募剂（非TCEs））。11种已批准的bsAbs中有6种具有IgG样结构，由2条重链（恒定区域以深灰色显示，Vh结构域以深蓝色或深红色显示）和2条轻链（恒定结构域以浅灰色显示，Vl结构域以浅蓝色或浅红色显示）组成。它们大多数具有1+1的化学计量比 —— 每个抗原一个结合位点 —— 还有一个TCE通过将一个额外的Fab片段融合到一条重链上，利用2+1的化学计量比。其他的bsAbs要么是不含Fc的融合蛋白，由两个单链可变片段（scFv）片段组成（blinatumomab），要么是将scFv片段与T细胞受体（TCR）片段融合，或者是具有2+2化学计量比的IgG-scFv融合蛋白。除了由小鼠和大鼠杂交瘤细胞技术生产的catumaxomab外，所有其他的bsAbs都是通过重组技术生产的。对于IgG样异二聚体分子，通过在CH3域使用突变来强制异二聚体化 —— 如旋钮-入洞技术 —— 或控制的Fab臂交换（cFAE），解决了两种不同重链的正确组装问题，cFAE还允许从两种不同的单特异性IgG组装IgG样分子。cFAE还解决了轻链问题，即轻链和重链的配对。或者，如CrossMab方法所示，对Fab臂进行进一步的修改，以强制正确的轻链和重链配对。值得注意的是，所有重组IgG样bsAbs都包含一个具有沉默或减少效应功能的Fc区域，这是通过在铰链/CH2域引入突变来避免或减少Fcγ受体和补体结合来实现的。BCMA，B细胞成熟抗原；EGFR，表皮生长因子受体；EpCAM，上皮细胞粘附分子；GPRC5D，G蛋白偶联受体C类5成员D。 最近，被称为SADA的双特异性抗体利用改良的p53四聚体化域来延长GD2×DOTA在肿瘤中的滞留时间。GD2×DOTA是一种双特异性抗体，能够识别在癌症中高表达的二唾液酸神经节苷脂GD2，以及放射性载荷177Lu-DOTA，在肿瘤微环境中组装并滞留在那里，但没有四聚体化，它会迅速从周围清除，因为它缺乏半衰期延长。到目前为止，很少有临床试验中的双特异性抗体使用这种MoA，可能是由于与预靶向放射性相关的复杂物流限制了其普遍适用性。 图3 | 目前正在临床试验中的双特异性抗体的作用机制。a, 通过受体阻断两种不同的信号受体（以不同颜色表示）来抑制信号传导。b, 通过抑制可溶性配体（蓝色）和受体来抑制信号。c, 通过双重阻断两种不同的配体来抑制信号。d, 通过双特异性抗体（bsAb）药物偶联物（偶联物以浅蓝色表示）进行药物传递。e, 针对性阻断“别吃我信号”（CD47–SIRPα相互作用），导致巨噬细胞的吞噬作用。f, 结合检查点抑制，阻断“别吃我信号”。g, 通过T细胞受体（TCR）上的CD3或自然杀伤细胞上的CD16（FcγRIIIa）激活效应细胞。h, 肿瘤细胞结合介导的免疫细胞（共）刺激。i, PDL1结合介导的免疫细胞（共）刺激。j, 双重免疫细胞共刺激。k, 肿瘤靶向PDL1途径抑制。l, 肿瘤靶向PD1途径抑制。m, 检查点结合介导的免疫细胞（共）刺激。n, 双重检查点抑制。o, 通过配体阻断实现双重检查点和可溶性转化生长因子-β（TGFβ）信号的抑制。展示了用于实体瘤和血液系统恶性肿瘤的目标分子和肿瘤相关抗原（TAAs）的例子。注意：bsAbs可以同时发挥多种作用机制（MoAs）。Ang2，血管生成素2；APC，抗原呈递细胞；BCMA，B细胞成熟抗原；CDH17，钙粘蛋白17；DLL4，典型Notch配体4；EGFR，表皮生长因子受体；EpCAM，上皮细胞粘附分子；FRα，叶酸受体α；GPRC5D，G蛋白偶联受体C类5成员D；HLA，人类白细胞抗原；ICOS，诱导性T细胞共刺激因子；LAG3，淋巴细胞相关基因3；TIGIT，具有免疫球蛋白和ITIM结构域的T细胞免疫受体；VEGF，血管内皮生长因子。 双特异性抗体药物偶联物  第二种方法通过同时靶向肿瘤细胞表面的两个表位或两个目标，实现了通过双特异性抗体药物偶联物（bsADCs）传递细胞毒素载荷的特异性靶向。处于临床开发中的bsADCs的例子包括zanidatamab zovodotin（ZW49），这是一种双特异性HER2结合抗体zanidatamab与auristatin衍生的细胞毒素载荷偶联，双特异性MET×MET bsADC REGN5093或izalontaxab brengitecan（BL-B01D1），一种EGFR×HER3 bsAb与一种新型TOPO-I抑制剂偶联（NCT05194982）（表2）。 双特异性抗体用于癌症免疫治疗  大多数用于癌症免疫治疗的双特异性抗体通过T细胞驱动的自然或内源性免疫发挥作用，例如通过增强现有的抗肿瘤反应和/或克服检查点抑制，或通过提供合成免疫，例如通过bsAb驱动的免疫细胞的参与、激活和招募（图3）。在这一部分中，我们提供了包括CPIs、效应细胞招募剂（包括TCEs和ICEs）和共刺激双特异性抗体在内的最突出的MoAs的概述。 双重CPIs  许多干扰免疫检查点（如CTLA4或PD1/PDL1）的单特异性抗体已获批准用于癌症免疫治疗，包括ipilimumab、tremelimumab、nivolumab、pembrolizumab、atezolizumab、avelumab、durvalumab或cemiplimab。将免疫检查点抑制抗体治疗扩展到包括双特异性抗体可能会减少不良副作用并提高观察到的单特异性抗体治疗的疗效。第一个方面，检查点抑制的安全性，包括预防自身免疫相关事件和/或不希望的免疫细胞激活。为了实现这一目标，正在开发针对检查点抑制功能和TAAs（如RTKs）的双特异性抗体，目的是将其活动更优先地集中在肿瘤上，正在开发中。第二个方面，检查点免疫治疗的疗效，通过双特异性抗体同时靶向两种不同的检查点蛋白来提高疗效并降低抗性的可能性，或提供互补的免疫刺激信号。值得注意的是，这些双特异性抗体的共同设计原则是提高对表达两种检查点蛋白的T细胞的选择性，如CTLA4/PD1或PD1/淋巴细胞相关基因3（LAG3），这些蛋白可能更具肿瘤反应性，目标是提供比单独检查点阻断更优越的治疗指数。 表2 | 晚期临床开发中选择的双特异性抗体概览 BiTE，双特异性T细胞招募剂；BCMA，B细胞成熟抗原；bsAb，双特异性抗体；BTC，胆管癌；cL，普通轻链；DART，双亲和重定向；DLL4，类似Delta的典型Notch配体4；EGFR，表皮生长因子受体；EpCAM，上皮细胞粘附分子；Fchet，异二聚体化Fc；LAG3，淋巴细胞相关基因3；Nb，纳米抗体；NHL，非霍奇金淋巴瘤；NSCLC，非小细胞肺癌；PDC，胰腺导管腺癌；scFv，单链可变片段；TIGIT，具有免疫球蛋白和ITIM结构域的T细胞免疫受体；TGFβ，转化生长因子β；VEGF，血管内皮生长因子。a晚期包括关键性II期、II/III期和III期临床研究。 例如，通过降低自身免疫不良事件的发生率 —— 而不是与联合检查点阻断相比。探索肿瘤靶向检查点抑制的工作包括开发双特异性抗体，这些抗体靶向肿瘤细胞表面的HER家族RTKs，并结合PD1/PDL1信号通路的阻断作为第二功能，从而将PDL1结合剂定向到肿瘤细胞。这些分子的特定肿瘤靶向导致了对表达EGFR的肿瘤细胞更具特异性和增强的活性。类似地，一种特别结合HER2和PDL1的双特异性抗体被证明可以在HER2表达的肿瘤细胞中特异性阻断PDL1活性，从而比单独使用每个实体或在不作为双特异性抗体结合时联合应用产生更大的治疗效果。 另一种双特异性抗体介导的靶向免疫治疗方法包括将PDL1阻断与识别黑色素瘤上的软骨素硫酸蛋白聚糖4（CSPG4）的结合物相结合。特定的肿瘤靶向增强了抗肿瘤T细胞的特异性、激活状态和疗效。概念上相关的方法包括将PDL1结合物与黑色素细胞刺激激素化学偶联。通过这种方式，PDL1抑制活性被定向到黑色素瘤细胞上的黑色素皮质素-1受体。同时靶向两个检查点蛋白而不额外包括常见的肿瘤细胞表面靶标的双特异性抗体的例子包括同时结合肿瘤细胞上的PD1和PDL1的双特异性抗体。Wan等人分析了这种双特异性抗体在高级别浆液性卵巢癌类器官与免疫细胞共培养中引发的联合活性。与单特异性结合物相比，双特异性抗体介导了优越的疗效，并在T细胞和自然杀伤细胞中诱导了表型变化，包括激活状态和细胞毒性的改变。双特异性抗体LY3434172也采用了这种方法。通过完全抑制PD1/PDL1途径，LY3434172显示出比每个亲本抗体或两者组合更大的抗肿瘤活性，再次证明以双特异性抗体形式的结合很重要，并且可以增加疗效。超越PD1/PDL1方法的界限，包括CTLA4在内的其他免疫受体的双特异性抗体正在开发或已获批准。同时靶向PD1和CTLA4是双特异性抗体cadonilimab的作用机制。Cadonilimab由于四价性，介导了对高密度PD1和CTLA4的增加亲和力驱动的目标结合，这与Fc突变以废除FcγR结合相结合，可能是其有利的治疗指数的基础。值得注意的是，cadonilimab还在PD1+和CTLA4+ T细胞之间介导了跨结合。在晚期实体瘤患者的I/Ib期研究中，cadonilimab显示出抗肿瘤活性和有利的安全性概况，免疫相关不良事件的发生率低。Cadonilimab已在中国获批准用于治疗在铂类化疗后或化疗期间进展的复发或转移性宫颈癌。其他在高级临床试验中结合相同特异性的双特异性抗体是MGD019和MEDI5752。MGD019结合了PD1和CTLA4结合物，在进行中的临床研究中观察到可接受的安全性和组合阻断以及在多种实体瘤中的客观反应。MEDI5752目前正在进行临床评估，它结合了PD1和CTLA4，并显示了PD1介导的靶向，因为它优先饱和了PD1+ T细胞上的CTLA4，并引起了PD1的快速内化和降解。与cadonilimab相比，MGD019和MEDI5752似乎对双阳性T细胞显示出更强的亲和力驱动的选择性增益。双重失活也在探索中，通过结合PD1/PDL1阻断与LAG3或TIM3抑制。例子是IBI323和FS118，它们都结合了PDL1和LAG3，并在临床前模型中显示出增强的双重功效。LY3415244结合了PDL1和TIM3的阻断，作为一种不同的免疫调节剂，但由于在I期研究中观察到的免疫原性，该分子的开发被终止。最近，I期剂量递增和扩展数据的临床试验显示，PD1×LAG3双特异性抗体tebotelimab在实体瘤或血液系统恶性肿瘤患者中作为单药治疗以及与HER2抗体margetuximab联合治疗时显示出有希望的活性。双配体抑制是另一种基于双特异性抗体的检查点抑制方法。PDL1和转化生长因子-β（TGFβ）是具有互补且非冗余免疫抑制活性的受体结合配体。TGFβ不仅具有免疫抑制作用，还可以进一步诱导促血管生成因子的上调和癌症相关成纤维细胞的激活。目前正在开发几种靶向PDL1和TGFβ的双特异性抗体，如类似双特异性抗体融合蛋白的bintrafusp alfa（M7824）。在这种情况下，PDL1的结合是通过一个“标准”的抗体结合模块实现的，而TGFβ则被人类TGFβ受体II的细胞外域捕获。Bintrafusp alfa在临床前研究中显示了激活先天和适应性免疫系统，从而比单独使用抗PDL1抗体或TGFβ陷阱模块更好地抑制肿瘤生长和转移，目前正在进行临床试验。Retlirafusp alfa（SHR-1701），另一种以类似方式靶向PDL1和TGFβ的双功能融合分子，正在对宫颈癌和胃癌或胃食管结合部癌症患者进行III期研究（表2）。YM101是一种TGFβ×PDL1双特异性抗体，目前处于临床前开发阶段。YM101的一个替代品，Y101D，正在对晚期实体瘤患者进行评估（NCT05028556）。所有同时对抗抑制性TGFβ和PD1/PDL1途径的方法在体内模型中显示出比单独使用各自结合物更高的抗肿瘤活性，但迄今为止尚未在临床上证明概念。针对性的TGFβ信号阻断也已经在临床前研究中通过阻断CD4+ T细胞中的TGFβ信号的双特异性抗体实现。为此，将非免疫抑制性的CD4靶向抗体ibalizumab与TGFβ陷阱以类似于上述的双特异性抗体方式结合。这导致在辅助T细胞中针对性阻断TGFβ信号，可以释放抗肿瘤反应。通过双特异性抗体招募磷酸酶抑制PD1是一种最近报道的新型MoA88。这是通过一个单域（Vhh）融合到一个scFv实现的，将PD1连接到细胞表面磷酸酶CD45，这反过来触发细胞内去磷酸化。这种方法与单独使用PD1抗体介导的配体阻断相比，增强了检查点阻断的抑制。按照同一原则，双特异性抗体可以将细胞表面磷酸酶CD45与抑制性自然杀伤细胞表面受体NKG2A或Ly49连接，以进行后续去磷酸化。这样的双特异性抗体可以阻断并同时去磷酸化它们的目标，可能比相应的单特异性抗体及其抑制信号的组合更有效的拮抗剂，以增强自然杀伤细胞和T细胞的抗肿瘤活性。使用双特异性抗体对CD73的不同表位进行双位点靶向是另一种双特异性抗体相关方法，以抵消免疫抑制活性或增强针对肿瘤的免疫能力。CD73产生免疫抑制性腺苷，其通过内化的双特异性抗体介导的抑制和耗尽比单一位点CD73抗体更有效。 效应细胞招募剂 T细胞招募剂 在过去二十年中，专门结合肿瘤表面抗原和TCR的CD3ε链的T细胞招募剂（TCEs）在这一类双特异性抗体中占据主导地位，描述了数百种TCEs，并且有100多种进入临床开发。事实上，第一个获准上市的双特异性抗体是鼠/大鼠嵌合的上皮细胞粘附分子（EpCAM）×CD3ε双特异性抗体catumaxomab，它在2009年被欧洲联盟（EU）批准用于恶性卵巢腹水的腹腔内治疗，但后来因商业原因退出市场。目前正在中国再次进行临床试验，用于腹腔内给药。系统应用的catumaxomab显示出严重的输注反应和高免疫原性发生率，可能由于其鼠/大鼠嵌合的恒定区域和保留的FcγR结合，导致在没有抗原结合的情况下非特异性FcγR和TCR激活。随后，下一代TCEs被设计为缺乏Fc部分，如基于串联scFv的CD19×CD3ε双特异性T细胞招募剂（BiTE）blinatumomab，它在2014年首次被批准用于治疗B细胞前体急性淋巴细胞性白血病（B-ALL）。然而，由于缺乏通过FcRn的循环，这种疗法需要持续输注，FcRn通过从分拣内体循环到细胞表面，从内溶酶体降解中挽救IgG。基于blinatumomab的成功，针对血液和实体瘤的各种目标的BiTEs被开发出来，但最终没有进入晚期临床试验，由于BiTEs和相关短半衰期的药代动力学特性不佳。人们尝试通过纳入FcγR结合惰性Fc结构域（沉默Fc）或HSA结合部分来实现bsAbs的IgG样半衰期，目前大多数处于开发中的TCEs是基于IgG和/或具有IgG样药代动力学的。值得注意的是，大多数TCEs使用单个单价结合位点用于CD3作为T细胞上的触发分子，以避免在没有同时目标结合的情况下TCR交联引起的系统性T细胞激活。然后它们使用一个（1+1）或两个（2+1）肿瘤目标的结合位点，因为双价结合可以在肿瘤选择性和效力方面提供优势。CD20×CD3ε双特异性抗体mosunetuzumab106和B细胞成熟抗原（BCMA）×CD3ε双特异性抗体teclistamab是第一批异二聚体1+1 IgG基TCEs，分别在2022年被批准用于治疗复发/难治性滤泡性非霍奇金淋巴瘤（NHL）或多发性骨髓瘤。在2023年，异二聚体2+1 CD20-TCE glofitamab104,108和1+1 CD20-TCE epcoritamab109被批准用于治疗复发/难治性弥漫大B细胞淋巴瘤（DLBCL），以及1+1 G蛋白偶联受体C类5成员D（GPRC5D）-TCE talquetamab110和BCMA-TCE elranatamab111用于复发/难治性多发性骨髓瘤（表1）。CD20-TCE odronextamab112和BCMA-TCE linvoseltamab的上市申请正在等待监管决定。鉴于它们在复发/难治性B细胞和浆细胞恶性肿瘤患者中显示出的有希望的临床疗效和完全缓解率 —— 包括在CAR-T细胞治疗后复发的患者中的活性 —— 以及它们作为现成疗法的简单可用性以及皮下给药的可能性，可以预期TCEs将成为CAR-T细胞疗法的主要替代品，特别是随着它们开始被开发用于更早期的治疗线并且可以让患者轻松获得。免疫动员单克隆T细胞受体针对癌症（ImmTACs）是结合了工程化TCR以识别人类白细胞抗原（HLA）呈递的肽抗原与抗CD3 scFv的TCEs，实现对细胞内TAAs的靶向。值得注意的是，短暂存在的ImmTAC tebentafusp，它包含一个针对由HLA-A*02:01呈递的黑色素细胞谱系特异性抗原糖蛋白（gp100）表位的可溶性TCR融合到CD3靶向scFv，已在2022年被批准用于治疗葡萄膜黑色素瘤，为TCEs在实体瘤中的细胞内靶标空间开辟了新的领域。值得注意的是，tebentafusp介导了总体生存益处，尽管它只诱导了少数临床反应，因此直接杀死肿瘤细胞可能不是其唯一的MoA。与此同时，各种基于重组TCR或使用类似TCR的抗体（TCR模拟物）的TCEs已进入临床开发，包括针对WT1和突变新抗原如KRAS122或p53的TCEs。重要的是，高通量动力学筛选和通用TCR类似库可以促进高度选择性的TCR和TCR模拟物的开发，用于TCEs。有趣的是，使用共价KRASG12C抑制剂sotorasib，可以产生一种类似TCR的TCE，可以特异性识别HLA呈递的sotorasib-肽共轭物，并随后诱导KRASG12C突变细胞的T细胞杀伤。细胞因子释放综合征的发生，主要是由于靶向T细胞激活，一直是TCEs临床开发的一个主要挑战。尽管在许多情况下，这可以通过使用类固醇预处理和逐步剂量增加来管理，但最近的努力已经研究了使用具有降低CD3ε亲和力的CD3ε抗体，目标是将T细胞杀伤与细胞因子分泌解耦。与CAR-T细胞一样，由于TCEs的杀伤效力非常高，因此需要严格肿瘤特异性和/或谱系特异性表达目标抗原，以避免靶向非肿瘤毒性。对于血液癌症中的B细胞和浆细胞抗原，如CD19、CD20、CD79b、BCMA140141和FcRH5，通常认为它们只存在于B细胞和浆细胞恶性肿瘤以及非必需的B细胞和浆细胞谱系中。然而，即使对于CD19等抗原，其在正常组织中的表达可能并非绝对不存在，有报道称CD19在围绕内皮细胞的壁细胞/血管周细胞上表达，这些细胞对血脑屏障完整性至关重要，作为一种靶向非肿瘤机制与神经毒性有关。相比之下，在急性髓系白血病中，典型的抗原如CD33或CD123也存在于髓系造血谱系上，使得它们的临床开发更具挑战性。类似地，许多主要的（上皮）实体瘤抗原如EGFR、HER2、EpCAM、肿瘤相关钙信号转导蛋白2（也称为细胞表面糖蛋白Trop-2）、MUC1、CEACAM5和glypican 3也可以在（必需的）正常组织中找到。因此，由于更免疫抑制性的肿瘤微环境，TCEs（和CAR-T细胞）在实体瘤的开发在过去几年中进展较少。重要的是，必须认识到对于TCEs，与ADCs150相比，由于更高的效力，对肿瘤选择性的要求更严格，固体瘤ADC靶标如HER2和TROP-2可能无法用传统的TCEs靶向。与此同时，与TCEs相比，ADCs可能由于在肿瘤微环境中释放有毒载荷而受益于更强的旁观者杀伤效应，对抗原阴性肿瘤细胞进行杀伤。因此，很少有肿瘤选择性抗原似乎是TCEs的可行靶标，包括新抗原如p95-HER2和EGFRvIII，或者MUC16、claudin 18.2、DLL3和STEAP1等靶标。对于DLL3靶向的TCE tarlatamab，目前正在美国食品药品监督管理局（FDA）的优先审查中，已在小细胞肺癌中报告了有希望的I期临床数据，总反应率达到23%。随后的II期研究证实了活动性，持久的客观反应和有希望的生存结果，使用每2周10毫克剂量治疗的患者。基于这些数据，已启动了一项随机关键研究，比较tarlatamab与标准护理（NCT05740566）。同样，xaluritamig，一种2+1 STEAP1 TCE，具有亲和力驱动的活性，能够选择性地针对高表达STEAP1的肿瘤细胞与正常细胞相比，已在转移性去势抵抗性前列腺癌患者的I期剂量递增研究中展示了有希望的临床活性。综上所述，这些概念验证数据表明，TCEs仅限于血液癌症活跃的共同假设，特别是B细胞恶性肿瘤，并不适用，并且TCEs也有可能治疗某些实体瘤，只要能够管理靶向非肿瘤活性。正在使用多种方法来克服实体瘤选择性挑战。例如，在双特异性抗体中使用具有降低亲和力的肿瘤抗原结合物（2+1格式）可以实现亲和力介导的选择性增益（也称为亲和力调节），目标是利用肿瘤和正常组织之间的表达差异，如CEACAM5、HER2和FOLR1，以提高肿瘤选择性。或者，双重靶向和亲和力介导的选择性增益应用于三特异性TCEs，这些TCEs选择性地杀死共同表达这些靶标的肿瘤细胞，但不会影响只表达这些靶标中一个的正常细胞。此外，针对两种不同的肿瘤抗原如CD19和CD22的三特异性TCEs可以防止通过抗原丢失的免疫逃逸。尽管大多数传统的TCEs可以招募常规T细胞和非传统先天样γδ T细胞（表达TCRγ/δ而非TCRα/β的T细胞），但一类特定的γδ TCEs已被设计为通过TCRγδ特别招募γδ T细胞，目标是通过只针对可以在患者中进一步扩展的T细胞亚群来提高安全性和有效性。在临床前研究中，γδ TCEs作为单一药物显示出强大的抗肿瘤活性。或者，为了此目的，制造了针对肿瘤的双特异性异二聚体BTN2A1和BTN3A1抗体融合蛋白。由于γδ T细胞生物学在小鼠模型中没有完全反映，这种方法的最终概念验证将不得不依赖于正在进行的临床试验的临床数据，如针对PSMA的γδ TCE LAVA-1207（NCT05369000）。而不是针对CD3ε或TCRα/β的双特异性抗体，肽-MHC复合物可以被应用来特别招募特定pMHC复合物的T细胞，如由于自然发生和普遍的巨细胞病毒感染而存在的巨细胞病毒衍生肽。在另一种方法中，病毒表位可以被传递到肿瘤细胞中，以便加载相应的MHC分子，并招募病毒特异性T细胞攻击这些细胞。还描述了用于更有效介导双特异性抗体介导的聚集和补体依赖性细胞毒性的双特异性抗体。有趣的是，通过应用两对独立的抗体，可以建立一种逻辑门，通过补体依赖性细胞毒性选择性地消除共表达两种抗原的细胞。例如，使用这种方法，可以消除共表达CD20和CD52的B细胞，而单独表达这些抗原的细胞则不会被杀死。随着对采用CAR-T细胞疗法的极大兴趣，一类特定的TCEs，作为CAR-T细胞和肿瘤细胞之间的双特异性适配器，已被设计为特别招募采用转移的T细胞用于治疗各种癌症，同时不涉及自然T细胞。其中一个例子是合成激动性受体（SAR）-T细胞系统，其中一种双特异性抗体识别肿瘤抗原和一个引入到采用转移的T细胞中的合成抗原受体。这种在合成生物学背景下的方法提供了多种方式。 进一步工程化和控制采用T细胞疗法方法，超出了传统抗体疗法或经典CAR-T细胞疗法所能提供的范围。另一种结合细胞疗法和双特异性抗体的方法是体外武装T细胞与多种TCEs，目标是克服肿瘤异质性。为此，T细胞在体外与针对肿瘤抗原如GD2、HER2、PSMA和STEAP1的TCEs孵育，并给药于肿瘤携带动物，在这些动物中，由于抗原丢失，它们阻止了肿瘤进展。 固有细胞招募剂  尽管TCEs在效应细胞招募剂领域占据主导地位，但正在大力开发下一代ICEs，包括NKCEs和双特异性抗体，这些抗体招募髓系衍生细胞（MDCs）进行吞噬作用，包括中性粒细胞和巨噬细胞/单核细胞。介导ADCC的单克隆抗体，如利妥昔单抗、西妥昔单抗或曲妥珠单抗，因为ADCC/抗体依赖性细胞吞噬作用对其MoA至关重要，除了其他作用如信号抑制外，可以被视为第一代ICEs。基于这种经验，已经批准了几种与常规单克隆抗体相比具有增强ADCC功能的Fc工程化IgG1抗体，包括obinutuzumab、mogamulizumab、tafasitamab、margetuximab和amivantamab。基于这种经验和目标，进一步增强ADCC功能，超越Fc工程化IgG1抗体，已经开发了各种双特异性NKCEs，它们针对自然杀伤细胞上的不同表面分子，如CD16、NKG2D、NKp46或NKp30，作为免疫疗法。这些NKCEs中最先进的是一种短半衰期的CD30×CD16双特异性抗体，用于治疗霍奇金淋巴瘤，可以作为单一疗法、与检查点抑制联合或与自然杀伤细胞输注联合使用。最近，开发了针对抗原如EGFR或BCMA的半衰期延长的四价IgG基双特异性抗体，以及利用双重靶向实现肿瘤选择性的三特异性抗体。对称的三特异性NKCEs通过ADCC特别针对通过其CD16结合区域共表达EGFR和PDL1的细胞，使用两种合一抗体技术。另一种激活自然杀伤细胞的方法依赖于双特异性融合蛋白，该蛋白由NKG2D配体（例如UL-16结合蛋白2（ULBP2））与针对HER2的scFv融合，以实现有效的ADCC介导的肿瘤细胞杀伤。或者，保留FcγRIII结合的双特异性抗体，针对NKp46或NKp30和各种肿瘤抗原，可以提供强大的抗肿瘤效果。与TCEs不同，其中FcγR结合是不需要的，这些双特异性抗体依赖于保留或增强的FcγRIII结合，以实现有效的自然杀伤细胞参与。值得注意的是，当IL-2变体被融合到NKp46双特异性抗体上，产生四功能分子时，由于同时诱导自然杀伤细胞扩增，效果大大增强。另一个积极研究的领域是双特异性抗体，这些抗体通过结合，例如，巨噬细胞和中性粒细胞上的FcαRI受体（CD89）或通过双特异性IgE抗体的IgE受体，参与吞噬作用或MDCs以及中性粒细胞的杀伤。或者，肿瘤靶向双特异性抗体可以阻断肿瘤细胞上基于'不要吃我信号'的CD47–SIRP1α相互作用，以便这些细胞被MDCs攻击和吞噬。双特异性CD19 x CD47或间皮素x CD47抗体结合了肿瘤靶向和CD47抑制以及通过效应功能完整的Fc部分招募效应细胞。在这种情况下，对CD47具有低亲和力的双特异性抗体有利于克服不必要的结合到红细胞上的CD47。 各种团队应用这一概念进行PDL1×CD47共靶向。或者，SIRPα融合蛋白可以用来阻断CD47–SIRPα“不要吃我”信号。 共刺激双特异性抗体  有效、持久且局部限制的抗肿瘤免疫反应需要共刺激和共抑制信号来紧密调节细胞毒性T细胞、自然杀伤细胞和巨噬细胞的激活、分化和维持。TNFRSF家族成员（如4-1BB、CD40、OX40、TNFRSF18（也称为糖皮质激素诱导的TNFR相关蛋白（GITR））、CD27或CD30）以及CD28免疫球蛋白超家族（如CD28、CTLA4、PD1、诱导性T细胞共刺激因子（ICOS）和B淋巴细胞和T淋巴细胞衰减因子（BTLA））及其相应的配体，在通过细胞-细胞接触（如抗原呈递细胞（APCs）和T细胞之间）提供的局部免疫调节信号中发挥着显著作用。这些受体为T细胞提供了所谓的信号2，这对于维持TCR通过肽-MHC-TCR相互作用或通过TCE交联TCR所提供的信号1是必需的。针对这些免疫调节途径的靶向可能增强免疫疗法。研究表明，针对共刺激受体的激动性单克隆抗体通常只会导致微弱的激活，但这种激活可以通过FcγR介导的受体超聚集显著增加。此外，抗体与受体之间的化学计量比、结合亲和力和表位特异性等因素可以影响共刺激抗体的活性。因此，降低免疫调节抗体的亲和力可以作为一种策略，通过增加受体聚集来增强激动性活性，这一原则经常应用于双特异性抗体激动剂（见上文）。然而，由于增加的趋化因子和细胞因子产生导致的免疫相关系统性不良事件是共刺激抗体药物开发的限制因素。抗体-细胞因子融合蛋白和双特异性抗体能够以目标依赖的方式提供共刺激信号，通过双重靶向两种不同的共刺激受体或通过靶向共刺激受体和CPI来规避这一限制。 肿瘤靶向共刺激双特异性抗体  用一个臂结合到TAA上，另一个臂结合到免疫细胞上的共刺激受体上的双特异性抗体，可以通过在癌细胞和免疫细胞之间跨作用来局部介导受体聚集，从而提供信号2。目前正在临床试验中的共刺激双特异性抗体包括针对4-1BB、CD40和CD28的分子。T细胞激活后诱导表达的4-1BB使其成为增强CD8 T细胞反应的T细胞共刺激的有吸引力的靶标。使用针对4-1BB的激动性抗体（如urelumab和utomilumab）作为单一疗法在临床试验中的安全性问题和较差的疗效，使人们重新将努力集中在可以克服这些毒性的双特异性抗体上，通过引入肿瘤特异性共刺激。大约一半的癌症靶向共刺激双特异性抗体在临床试验中通过4-1BB发挥作用。先进的双特异性抗体包括PRS-343（cinrebafusp），一种针对HER2和4-1BB的四价双特异性抗体-抗钙蛋白融合蛋白，在IND使能研究中被发现耐受性良好，没有明显和相关药物相关毒性；FAP-4-1BBL（RG7872），作为单一疗法和与PDL1抑制联合使用时显示出药理活性；或englumafusp alfa，正在研究中作为与glofitamab联合用于DLBCL的信号2提供者。其他在临床试验中通过4-1BB进行肿瘤选择性共刺激的双特异性抗体目标包括EGFR、PSMA、CLDN18.2、B7H4、CEACAM5、HER2、PDL1（见下文）和FAP48。此外，使用CD28作为共刺激受体的双特异性抗体，目前在临床试验中。通过与APC上的CD80（也称为B7.1）或CD86（也称为B7.2）的结合，CD28为幼稚T细胞提供了必要的二次信号，以实现完全的T细胞激活和存活。这种信号也可以通过激动性CD28抗体提供，即使在没有初级TCR参与的情况下，如超激动剂TGN1412所示，它在I期研究中因大量细胞因子释放综合征而显著失败。后来发现，TGN1412特别在低剂量下作用于调节性T细胞（Treg细胞），而在高剂量下激活传统T细胞和Treg细胞，为选择性靶向T细胞亚群提供了窗口，但也突出了T细胞共刺激与超激活之间的微妙平衡。一些双特异性抗体可以以目标依赖的方式提供这种二次共刺激信号，以增强肿瘤限制性的抗肿瘤T细胞反应。值得注意的是，双特异性抗体可以被设计为单独使用时活性有限且无毒性，但可以增强T细胞激活和TCEs的抗肿瘤活性。REGN5837是一种针对CD22和CD28的双特异性抗体，已进入与针对CD20的TCE odronextamab联合用于NHL治疗的I期试验。肿瘤靶向CD28双特异性抗体也可以与PD1协同作用，提供长期抗肿瘤免疫反应，目前，多个针对TAAs如EGFR、MUC16、PSMA、B7-H3、CD19、CD22或PDL1的双特异性抗体正在进行临床试验，与检查点抑制联合使用或作为单一疗法。 MDCs和树突细胞激活双特异性抗体  CD40在包括APCs、其他MDCs和B细胞在内的多种细胞类型中表达，但也在广泛的恶性细胞上表达。单克隆激动性CD40抗体可以通过诱导APCs成熟和激活抗原特异性T细胞和其他免疫细胞来触发抗肿瘤效应，从而促进肿瘤特异性免疫反应，特别是通过启动细胞毒性T细胞。除了具有剂量限制毒性的激动性CD40抗体外，还开发了针对CD40和各种TAAs如CEACAM5、EpCAM或间皮素的双特异性抗体。与其他TNF超家族成员一样，受体聚集在受体激活中起着关键作用。将CD40激动性抗体与针对肿瘤靶向抗原的抗体结合在双特异性抗体中，允许共刺激活性定向到TME，从而提高安全性和有效性。例如，针对CD40和CEACAM5或EpCAM的四价双特异性抗体的概念验证表明，与单一CD40抗体相比，它们增强了T细胞交叉启动。针对间皮素和CD40的双特异性抗体（ABBV-428）在体外和体外模型中展示了增强的APC和T细胞激活，并且在I期试验中显示出可接受的安全性概况。为了在肿瘤内而不是外周选择性激活CD40，生成了FAP×CD40，一种包含两个CD40结合位点和一个FAP结合位点的双特异性抗体。该抗体提供了一个强烈的FAP依赖性CD40刺激信号，展示了良好的安全性概况以及肿瘤积聚和肿瘤内免疫激活，目前正在进行I期临床试验。MP-0317是一种多功能设计ankyrin重复蛋白（DARPin），应用相同的概念，针对FAP、CD40和HSA进行半衰期延长，目前正在进行I期临床研究。或者，双特异性抗体可以通过Clec12a标记物直接靶向树突细胞。 双特异性抗体的双重共刺激  在免疫细胞上双重靶向两种不同的共刺激受体已被用于诱导强大的抗肿瘤反应。FS120是一种针对活化T细胞上表达的4-1BB和OX40的四价双特异性抗体，以一种不依赖FcγR的方式激活CD4和CD8 T细胞。这种活性需要两个受体的共刺激才能有效激活免疫细胞并发挥抗肿瘤活性，支持使用四价双特异性抗体双重靶向共刺激受体以诱导有效的受体聚集和激活的概念。在动物研究中，FS120的替代品没有引起肝脏炎症和肝毒性，这是激动性4-1BB抗体观察到的限制。FS120目前正在进行I期临床试验。类似的方法中，开发了一种双价双特异性抗体，用于双重靶向4-1BB和CD40（BNT-312，tecaginlimab），因此靶向T细胞和APCs。APCs的CD40激活导致共刺激分子的上调和免疫刺激性细胞因子的分泌，从而在不依赖CD4 T细胞帮助的情况下，实现强大的CD8 T细胞介导的抗肿瘤免疫反应。 双特异性抗体用于双重检查点抑制和共刺激  抗共刺激受体的抗体还被与CPIs结合使用，以释放T细胞免受抑制信号的影响，同时增强T细胞反应，特别是在对检查点抑制有抵抗力或难治性的肿瘤中。大多数目前正在临床试验中的双特异性抗体使用跨作用的方式结合这些信号，通过靶向肿瘤细胞上的PDL1和免疫细胞上的共刺激受体，其中4-1BB是最突出的靶标。超过十种不同的针对PDL1和4-1BB的双特异性抗体正在进行I期或II期试验。II期候选物包括一种IgG-anticalin融合蛋白（PRS-344），其中配体结合anticalin框架代表第二特异性，一种双价双特异性IgG抗体（acasunlimab，也称为GEN1046）和一种三价，三特异性单链二抗体-scFv融合蛋白，进一步包含一个HSA结合位点以延长半衰期（NM21-1480）。这些类型的双特异性抗体可以增强免疫反应，超越单一抗体及其组合，进一步提供针对PDL1表达肿瘤细胞的靶向共刺激，以及TME中的MDCs和肿瘤引流淋巴结。与此一致，TME中表达4-1BB的肿瘤浸润CD8 T细胞亚群表达高水平的PD1，因此容易受到PDL1×4-1BB双特异性抗体的治疗。值得注意的是，由于4-1BB信号需要超聚集，与PDL1的结合可以导致TME中条件聚集和激活的4-1BB，减少肝脏毒性，如四价双特异性IgG-scFv（ABL503）所示。遵循这一概念的进一步双特异性抗体包括四价双特异性单克隆抗体（FS222）和双价双特异性IgGs，如MCLA-145。同样，CD28共刺激和检查点抑制可以通过在肿瘤内顺式作用的T细胞双重靶向进一步实现。ATOR-1015的可行性已得到证明，它是一种针对OX40的IgG，融合到针对CTLA4的优化版本的V型域的CD86上。与4-1BB类似，CTLA4和OX40在活化的T细胞上上调，并由Treg细胞表达，特别是在TME中。与GITR和ICOS不同，CD27由naive T细胞表达，因此有助于促进新的T细胞反应。 PDL1×CD27双特异性抗体在临床前研究中比PD1阻断和CD27共刺激的组合更有效，同时展现出良好的安全性概况。在概念上类似的方法中，PD1的结合位点与其他TNF超家族的共刺激成员结合，包括4-1BB（如与IBI319结合）、GITR和ICOS（XmAb23104）。GITR也在活化的T细胞上上调，并由Treg细胞恒定表达，在其中发挥着增强初始免疫反应的关键作用。PD1×GITR-L双特异性融合蛋白的概念验证已经展示。对于这些药物中的一些，与联合或分别协同效应相比，检查点抑制的相对贡献并不一定确立。 新兴概念  支持双特异性抗体开发的概念从早期探索性方法迅速发展到临床开发，双特异性抗体现在已确立为治疗原则。然而，双特异性抗体领域仍在不断进展，以进一步探索和扩展技术和应用。学术界以及生物技术和制药工业追求的各种早期探索性双特异性抗体方法是有希望的，其中一部分可能提供尚未由当前开发中的双特异性抗体解决的治疗概念。本综述的范围不允许我们涵盖所有或许多这样的早期方法，实际上在这个快速增长的领域中可能无法全面覆盖。因此，我们通过提及一些我们认为相关并有潜力进一步推动基于双特异性抗体的癌症治疗界限的新兴主题来结束我们的综述。 三特异性TCEs与集成共刺激  共刺激信号可以与双特异性TCEs结合，以促进有效的T细胞激活。这已经通过上述的双特异性TCEs和共刺激双特异性抗体的组合实现，但也通过在双特异性TCE中包含第三个结合位点来针对共刺激受体，从而生成三特异性抗体。目前有两种这样的三特异性TCE正在进行临床试验，它们针对TAA和CD3，并进一步包含一个针对CD28的结合位点。SAR443216是一种三价三特异性免疫球蛋白基抗体，针对HER2×CD3×CD28，包含一个突变的IgG4，缺乏Fc介导的效应功能。这种三特异性抗体目前正在I期临床试验中，能够激活初级CD4和CD8 T细胞，诱导T细胞增殖，释放细胞因子和颗粒酶B以及T细胞介导的HER2表达肿瘤细胞的杀伤，包括HER2表达低的细胞。类似地，一种针对在多发性骨髓瘤中过度表达的CD38的结合位点与CD3和CD28结合位点结合在三特异性抗体SAR442257中，目前也在I期临床试验中。 前药方法  一种新兴的方法旨在通过提供“安全关键”的特异性作为前药，在肿瘤处选择性激活，从而生成具有高度肿瘤特异性功能的双特异性抗体。一些应用于失活抗体以生成前药并在肿瘤处重新激活的概念如图4所示。前药转化为功能性双特异性抗体可以通过肿瘤微环境中存在的肿瘤特异性蛋白酶等环境触发因素来实现。例如，具有空间屏蔽的双特异性抗体可以通过蛋白酶激活。需要肿瘤特异性蛋白酶表达的蛋白酶激活TCEs，即所谓的probodies，需要肿瘤特异性蛋白酶在TME中的表达才能激活。另一种早期阶段的双重肿瘤靶向方法依赖于从两个具有分裂CD3ε结合基团的双特异性抗体中肿瘤特异性组装功能性CD3ε抗体片段。这些实体需要被设计为在循环中作为单独实体时不活跃，以便它们只在肿瘤抗原结合和随后的原位组装后被激活，如已经为半抗体或前药激活链交换（PACE）分子所描述的那样。这类分子面临的主要挑战仍然是以单体形式大规模生产它们，并防止在没有目标结合的情况下过早组装。通过目标链交换介导的分裂型I细胞因子的重建就是一个例子，说明如何实现肿瘤特异性组装。值得注意的是，最近开发了一种引入到抗4-1BB抗体结合位点的ATP依赖性开关，以增加肿瘤选择性并避免靶上、靶外毒性。这种开关使用肿瘤中升高的ATP水平作为触发因素，可能也适用于其他结合实体。 图4 | 双特异性抗体领域的新兴概念。a, 带有集成共刺激的三特异性T细胞招募剂（TCEs），用于通过CD3结合同时激活T细胞受体（TCR）（信号1）和通过结合CD28进行共刺激（信号2）。b, 双特异性抗体（bsAb）前药的作用方式。用于生成前药并重新激活所需作用位点的抗体的一般概念包括：阻断结合位点以使抗体失活，以及通过蛋白酶诱导激活被阻断的抗原结合位点，对目标环境（如酸性pH或ATP）的亲和性调节，以及由于通过高浓度局部富集互补前药而进行的组装或交换反应。c, 通过结合表面抗原（肿瘤相关抗原（TAA））和降解分子，例如膜E3连接酶，实现蛋白酶体靶向嵌合体（PROTAC）方法，这导致细胞表面目标的内化和蛋白酶体降解。d, 例如通过基因疗法将bsAb传递到CAR-T细胞中。e, 细胞因子模拟bsAb触发细胞因子受体途径，如通过将受体域引入立体接近性，模仿细胞因子作用的IL-2Rβ–IL-2Rγ异二聚体。 PROTAC双特异性抗体  另一个新兴概念和新的作用机制最近被描述，它使用双特异性抗体通过靶向降解来灭活与增殖相关的过程。类似于新兴的双特异性或多特异性小分子蛋白水解靶向嵌合体（PROTACs）领域，双特异性抗体可以被设计为触发内部化并随后降解参与癌症发展和/或进展的表面蛋白。这样的双特异性抗体同时结合到被靶向降解的蛋白质，以及触发结合目标蛋白的内部化和随后降解的因素，如膜可及的E3泛素连接酶或转铁蛋白受体。目前还没有已知的抗体-PROTAC概念进入临床研究，但这类实体的开发与“标准”双特异性抗体的开发完全兼容，并为靶向新途径并尽快将其概念带入临床提供了独特的可能性。 双特异性抗体的传递  双特异性抗体发展的另一个重要新兴概念是局部生产和随后的局部传递双特异性抗体，例如通过脂质纳米粒子介导的mRNA传递CLADN6 TCE，溶瘤病毒或类似基因疗法的方法，包括CAR-T细胞。 细胞因子模拟抗体  最后，双特异性抗体也可以作为细胞因子模拟物或所谓的合成细胞因子激动剂。在这种情况下，已经描述了scFvs或基于单一结构域Vhh的方法，通过模仿IL-2或IL-15、IL-18、I型干扰素和IL-10有效地触发细胞因子信号。或者，可以通过使用分裂方法使用新设计的IL-2模拟蛋白neoleukin实现肿瘤特异性细胞因子受体激动活性。这种基于抗体的细胞因子模拟物在癌症免疫疗法中可能有各种应用。 展望  双特异性抗体领域近年来取得了显著进展，到2023年底，已有十多种双特异性抗体获得批准，许多不同的方法正在临床测试中。然而，我们认为，由于癌症的异质性和适应性，这些方法中不太可能有一种成为通用的癌症免疫疗法。相反，抗体将需要为特定应用量身定制，并将依赖于与其他方法的结合，以最大化它们的疗效和安全窗口。具有多重特异性的抗体治疗的发展增长可能会在未来几个领域发生：针对具有明确依赖性的肿瘤的肿瘤相关RTKs的双特异性抗体；用于以增加的选择性靶向肿瘤的双特异性ADCs；用于靶向降解适用于各种途径的细胞表面蛋白的双特异性PROTACs；以及用于癌症免疫疗法的多特异性抗体。在后一个领域，特别是对于非常有效的基于T细胞的疗法，如TCEs或CAR-T细胞，识别高度肿瘤选择性抗原将是至关重要的，将需要能够通过肿瘤特异性蛋白酶激活和更好地调节效应功能来特别实现肿瘤特异性活性，同时保护正常组织。另一个重要方面是提供双重检查点抑制和/或补充共刺激信号给T细胞，以维持和延长T细胞反应，如已被证明对CAR-T细胞疗法的临床成功至关重要。重要的是，这种方法不仅适用于与TCEs的组合，也适用于与内源性免疫方法的组合。另一个重要方面是通过激活先天免疫系统，包括自然杀伤细胞、MDCs和树突细胞，促进二次免疫反应的产生。与其他癌症药物一样，通过改进的诊断方法和新的发展范式，使双特异性抗体和多特异性基于抗体的治疗能够在疾病早期应用于患者将是实现治愈癌症患者目标的关键。

摘要:免疫细胞治疗作为一种革命性的治疗方式，显著改变了癌症护理。这是一种专业的免疫疗法，利用活的免疫细胞作为治疗癌症的疗法。与传统药物不同，细胞疗法被认为是“活药”，这些产品目前是定制的，需要先进的制造技术。尽管嵌合抗原受体（CAR）-T细胞疗法在治疗血液恶性肿瘤方面受到了行业的极大关注，但其在治疗实体瘤方面的有效性常常受限，导致替代性免疫细胞疗法的出现。肿瘤浸润性淋巴细胞（TIL）细胞疗法、细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK）细胞疗法、树突状细胞（DC）疫苗和DC/CIK细胞疗法旨在利用身体的自然防御机制来定位和消除癌细胞，通常具有较少的副作用或风险。另一方面，如嵌合抗原受体-T（CAR-T）细胞、T细胞受体（TCR）-T、嵌合抗原受体-自然杀伤细胞（CAR-NK）或CAR-巨噬细胞（CAR-M）等细胞疗法通常使用自体干细胞、同种异体或异种细胞，或基因修饰细胞，需要更高水平的操作，被认为是高风险的。这些高风险细胞疗法通常在肿瘤靶向和信号传导方面具有特殊特性，触发新的抗肿瘤免疫反应。最近，在抗肿瘤机制和细胞疗法产品设计的基本和临床研究以及技术创新方面取得了显著进展。随着技术的迅速整合和高创新格局，关键的未来发展方向已经出现。为了满足细胞疗法技术进步治疗癌症的需求，我们在本研究中全面系统地调查了免疫细胞疗法的技术创新和临床进展。基于免疫细胞疗法的治疗机制和方法学特点，我们分析了这些疗法的主要技术优势和临床转化风险。我们还分析和预测了应用前景，为相关企业提供必要的信息，以便他们做出关于研发方向选择的明智决策。 1.引言 癌症是一种利用多种逃逸机制来躲避抗癌免疫的全身性疾病，并且显著改变整个免疫系统的功能和组成。抗癌治疗的演变跨越了一百多年，其效果和特异性不断提高，旨在消除癌细胞的同时尽量减少对健康组织的损害。为了实现这一目标，免疫细胞治疗在现有方法中脱颖而出，成为了一种改变游戏规则的解决方案。2017年，食品药品监督管理局（FDA）批准了两种嵌合抗原受体-T（CAR-T）细胞疗法，即Kite Pharm的axicabtagene ciloleucel（Yescarta）和Novartis的tisagenlecleucel（Kymriah），用于治疗淋巴瘤。这些批准标志着抗癌治疗加速发展的一个重大里程碑。免疫细胞治疗的基本概念是通过外部供应具有所需功能的细胞来增强免疫反应，以帮助患者对抗癌症。它不仅重新激活了现有的免疫反应，还推动了新的免疫反应加入到抗肿瘤努力中。免疫细胞治疗的反应通常涉及多种免疫细胞类型的激活和协作，包括抗原呈递细胞，如树突状细胞（DCs）和巨噬细胞，T淋巴细胞（T细胞）和自然杀伤（NK）细胞。肿瘤负担的免疫系统不仅在免疫细胞数量上失衡，而且在调节抗癌免疫反应的分子和信号通路上也表现出功能异常。因此，精确施用适当的治疗策略是必要的，以防止免疫细胞治疗的效果不佳。 根据癌症类型及其机制，免疫过程的各个领域为治疗干预提供了途径。方法包括，例如，提取和扩增具有预先癌症识别能力的免疫细胞（例如，肿瘤浸润性免疫细胞），外部分化有效的细胞类型[例如，细胞因子诱导的杀伤（CIK）细胞]，以及基因修饰细胞以实现特定识别和肿瘤细胞消除[例如，T细胞受体（TCR）工程，嵌合抗原受体（CAR）]。在本综述中，我们将讨论最新的免疫细胞治疗，总结应用于实现和优化这些治疗类别的策略，并提供未来的展望。 2.用低风险免疫细胞治疗癌症 低风险免疫细胞治疗旨在使用患者自己的免疫细胞来消除癌细胞。需要注意的是，“低风险”强调的是细胞治疗领域内某些治疗相对更安全、副作用较少，属于再生医学或先进治疗药物产品（ATMPs）。低风险免疫细胞治疗包括四种关键技术：肿瘤浸润性淋巴细胞（TIL）疗法、CIK细胞疗法、DC疫苗和DC/CIK细胞疗法。为了更全面地理解这些方法，必须深入研究促进这些细胞治疗的基本机制和临床进展。 2.1.TIL细胞治疗 TILs是存在于实体肿瘤微环境（TME）中的天然单核细胞，包括肿瘤内肿瘤浸润性淋巴细胞（iTILs）和基质肿瘤浸润性淋巴细胞（sTILs）。与iTILs相比，sTILs主要是效应记忆T细胞，更容易被检测到。作为一群已经接触过肿瘤组织的异质性淋巴细胞，TILs“预训练”攻击癌细胞，同时留下健康的细胞。在小鼠肿瘤模型中，这些异质细胞已经显示出治疗晚期癌症的潜力，第一个人类TIL治疗导致转移性黑色素瘤显著消退。实体瘤缺乏理想的肿瘤标志物，使得靶向肿瘤相关抗原（TAAs）具有挑战性。TILs作为具有多样化受体的多克隆细胞，为实体瘤提供了独特的治疗选择。与基因修饰的免疫细胞相比，TILs在克服实体瘤的异质性方面表现出优越性，特别是像黑色素瘤这样高度异质性的肿瘤。此外，它们具有注射后迁移至TME的趋化因子受体，并且与CAR-T细胞相比，它们的非靶向毒性较低，这归因于T细胞成熟过程中的负选择。 TILs可以从切除的肿瘤组织中分离出来。鉴于TIL在原始TME中的稀缺性，可供扩增的TIL数量有限，以及阻碍TIL抗肿瘤细胞毒性的额外因素（例如，Treg，肿瘤相关巨噬细胞，髓系抑制细胞和各种免疫抑制分子）。TIL的生产和扩增是TIL治疗成功的至关重要步骤。TIL在体外的扩增涉及快速扩增协议（REP）。在REP前阶段，TILs在高剂量白细胞介素（IL）-2下进行初级扩增。一些方法涉及选择肿瘤特异性TILs进行进一步扩增，而其他方法则扩增大量TILs以保持疗效。在REP阶段，同时给予高剂量IL-2和抗CD3，并使用辐照的同种异体外周血单核细胞（PBMCs）作为饲养细胞，直到获得足够数量的细胞。然后，经过质量控制的扩增细胞产品准备用于患者给药后进行淋巴细胞减少。 自1988年Rosenberg等人成功将TIL治疗应用于转移性黑色素瘤患者以来，一系列临床试验相继出现。1996年，TIL治疗首次被引入用于治疗非小细胞肺癌（NSCLCs），在涉及113名患者的临床研究中。结果显示，TIL与IL-2联合使用对NSCLCs是一种有效的治疗方法，与II期或IIIa期相比，对IIIb期NSCLCs有选择性益处。在初步成功后，TIL治疗的后续发展一直朝着提高治疗其他肿瘤类型的疗效方向发展，包括皮肤、肾脏和胃癌。这些发展中的具体方法旨在阐明TIL细胞类型的组成及其与临床结果的相关性。例如，成功生成的肿瘤浸润性B淋巴细胞（TIBs）已被发现可以预测转移性肾细胞癌（mRCC）患者的临床结果改善。另一项关于胃癌TIL治疗的研究表明，TIL的组织学亚群与不同的存活时间相关。目前，TIL治疗的临床转化仍处于初步阶段，缺乏长期临床观察。然而，初步成功表明有机会开发具有更有效分离和扩增方法的有希望的治疗性TILs，并可能与其他抗肿瘤疗法结合使用。 2.2.CIK细胞疗法 CIK细胞是具有混合T和NK细胞样表型的异质免疫效应细胞。它们是通过将人的PBMC或脐带血单核细胞与干扰素γ（IFN-γ）、抗CD3抗体、重组人IL-1和IL-2一起体外培养产生的。CIK细胞独特地表现出对肿瘤的主要组织相容性复合体（MHC）不受限制的靶向性，减少异体反应性，并能够攻击各种肿瘤类型。在体外培养过程中，CIK细胞分泌各种细胞因子以激活巨噬细胞、NK细胞和CD8+ T细胞的细胞毒性活性，从而直接抑制肿瘤细胞的生长并促进间接杀伤效果。CIK细胞诱导凋亡基因和抗肿瘤基因的表达，进行细胞毒性活动并促进肿瘤细胞凋亡。它们主要通过粘附分子淋巴细胞功能相关抗原-1/认知配体细胞间粘附分子-1（LFA-1/cam-1）与肿瘤细胞上的抗原结合的机制来实现肿瘤杀伤效果。这促进了MHC-I或MHC-II分子的表达，导致增强的呈递、激活、识别和直接杀伤肿瘤细胞。 激活的CIK细胞分泌各种细胞因子，包括IL-2、IL-6、肿瘤坏死因子α（TNF-α）、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）和其他细胞因子，不仅直接增强细胞毒性效果和抑制肿瘤细胞，还通过调节免疫系统间接杀死肿瘤细胞。主要由CIK细胞产生的IFN-γ增强了NK细胞、巨噬细胞和细胞毒性T淋巴细胞（CTL）的活性。它还可以促进肿瘤细胞上MHC-I分子的表达，导致CTL杀伤增加。最近的研究指出，CIK细胞分泌的IFN-γ可以促进慢性淋巴细胞性白血病（CLL）细胞上ICAM-1的表达，对细胞毒性效应细胞的凋亡诱导产生积极影响。肿瘤细胞的凋亡基因也可以被CIK细胞激活，因为这些细胞表达FasL，一种属于TNF超家族的Fas配体，它诱导肿瘤细胞凋亡。Verneris指出，某些肿瘤细胞（如黑色素瘤和卵巢癌）通过诱导表达FasL的淋巴细胞凋亡来逃避免疫清除，但它们对CIK细胞敏感。这是因为，在CIK细胞的诱导过程中，Fas敏感或激活的T细胞被IFN-γ等细胞因子的作用或激活诱导的细胞死亡机制选择性地消除。结合CIK细胞中高水平的抗凋亡基因表达，这些因素使CIK细胞能够耐受表达FasL的肿瘤细胞诱导的凋亡。 尽管存在复发和无反应性的担忧，CIK细胞的异质性使它们能够靶向并杀死各种肿瘤细胞。自1991年引入CIK细胞疗法以来，已有超过5,000名患有多种肿瘤类型的患者，包括肺癌、乳腺癌、脑癌和结肠癌等，参与了CIK细胞疗法。全球CIK细胞（或CIK细胞与DC联合）的临床试验已超过80项。CIK细胞的治疗潜力超出了它们与NKG2D的相互作用，包括抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）轴。与其他免疫疗法、常规化疗或放疗一起，CIK疗法表明了协同的抗肿瘤效果，正在发展中，是治疗癌症的一条令人鼓舞的途径。虽然临床前景看好，但一些公开讨论是必要的。与其他免疫细胞相比，CIK细胞输注后的毒性效应、最小化额外的支持性护理、确定与其他免疫疗法的优势、了解与CIK细胞在癌症微环境中的串扰的关键决定因素，以及在多个中心推广这种方法需要探索。 2.3.DC疫苗 操纵患者的自体DCs进行“疫苗接种”以对抗肿瘤组织是一种有前景的方法。DC疫苗涉及用TAAs（如肽、蛋白质、DNA/RNA或病毒）处理体外培养的DCs。DCs将摄取抗原，然后在仔细控制的培养过程中激活。DCs作为强大的抗原呈递细胞，对影响免疫系统起着至关重要的作用。虽然未成熟的DCs处理外来抗原，触发成熟和迁移到淋巴结，成熟的DCs可以在TME内促进肿瘤耐受，可能导致T辅助型2反应。 DC疫苗，通常采用体外成熟的自体单核细胞并用抗原冲击，已在多种肿瘤患者中显示出良好的耐受性和最小的毒性。然而，抗原特异性免疫反应的幅度和持续时间普遍较弱，限制了客观的临床反应。尽管在儿童肿瘤中的反应有限，正在进行的研究集中在增强疫苗生产的每一步上。策略包括扩大DC来源、提高免疫原性、优化抗原选择、开发新的免疫佐剂以及探索同时进行的免疫调节或化疗。 Sipuleucel-T是唯一获得FDA批准的自体DC疫苗，为有效的成人恶性肿瘤治疗提供了希望，特别是对于去势抵抗性前列腺腺癌。通过培养患者的PBMCs与一种由TAA（前列腺酸性磷酸酶（PAP））和GM-CSF组成的重组蛋白（PAP-GM-CSF）来生产。这种开创性的疫苗代表了DC疫苗领域的一个重要进展，展示了在成人和儿童恶性肿瘤中改善结果的潜在途径。在临床试验中，DC主要用于与CIK细胞、免疫检查点抑制剂（ICI）以及化疗和放疗结合的免疫疗法中以改善结果。研究表明DC能够激活自然杀伤T（NKT）细胞，或同时激活CD4+和CD8+ T细胞。 2.4.DC/CIK细胞疗法 当多种低风险的免疫细胞疗法一起使用时，可以实现积极的综合协同效应，特别是在DC和CIK的共同应用中尤为明显，它们是可适应和协同的。这种协同作用旨在增强身体对疾病的免疫反应。CIK细胞以其广谱的肿瘤杀伤效果而闻名，但由于缺乏特定的识别能力而受到限制。DC目前被认为是最有效的抗原呈递细胞，最近的研究表明CIK和DC之间的相互作用会在两个群体内部引起免疫刺激性表面分子表达的变化。实际上，与CIK细胞共同培养DCs发挥了互补作用，相互促进成熟，共同增加抗肿瘤活性，并展现出有希望的协同效应，即使在之前对CIKs有抵抗力且之前未与DCs共同培养的肿瘤细胞系上也是如此。DC分泌的细胞因子，如IL-2、IL-12和IFN-γ增强了CIK细胞的成熟，导致CIK细胞中CD3+、CD8+和CD56+亚群的水平增加。值得注意的是，DCs显著增加的IL-12分泌显著增强了CIKs的细胞溶解功能。此外，这种合作环境还减少了IL-10的分泌和调节性T细胞（CD4+CD25+ Treg细胞）的数量，减弱了它们对肿瘤免疫的抑制作用，并增强了CIK细胞的肿瘤杀伤效果。同时，CIK细胞增强了DCs的抗原呈递特异性和共刺激分子的表达，有助于整体增加抗肿瘤活性。此外，DC和CIK细胞的共同培养抑制了人类端粒酶逆转录酶（hTERT）蛋白的表达，抑制了端粒酶活性，并阻碍了肿瘤细胞的增殖。 基于上述机制，DC-CIK疗法以相互适应和协同为特点，已成为近年来肿瘤治疗领域的研究焦点。基础和临床研究迅速发展，并证明了在显著增强抗肿瘤免疫方面的有效性。尽管存在轻度移植物抗宿主病（GvHD）的担忧，试验经验表明结果是可控的。案例研究已经证明了安全性和提高的疗效。DC/CIK细胞疗法针对免疫系统的多个方面，从而形成了更全面的对抗疾病的方法。这在复杂情况或难治性恶性肿瘤中尤为有益，其中多种免疫功能障碍发挥作用。总的来说，低风险的免疫细胞疗法可以帮助增强免疫系统识别和消除有害实体的能力，从而改善健康结果。这些疗法的协同效应有潜力显著提高基于免疫的治疗的有效性，并为患者提供更好的结果。然而，评估和定制这些疗法的确切组合和剂量以确保其对个体患者的安全性和有效性至关重要。 3.高风险免疫细胞治疗技术的进步 高风险免疫细胞治疗使用自体干细胞、异体或异种细胞，或基因修饰细胞，所有这些细胞都需要进一步的操作和评估。这些治疗的设计非常适合其预期目的。这些治疗刺激针对肿瘤的新免疫反应，通常有潜力重新激活已有的反应。在这里，我们描述了高风险免疫细胞治疗中的特征设计、转染方法、细胞来源，以及克服抑制性肿瘤微环境（TME）的方法，包括CAR-T、T细胞受体-T（TCR-T）、CAR-NK和CAR-巨噬细胞（CAR-M）。此外，我们提供了对未来趋势的见解。 3.1.CAR的设计 CAR是工程受体蛋白，为免疫细胞提供了识别癌细胞表面特定抗原的新能力，从而可能触发免疫细胞消除癌细胞的潜力。当前研究表明，即使是对CAR结构的微小修改也可能会显著影响治疗效果。它通常由三个模块化域组成：细胞外域、跨膜域和细胞内域。 细胞外域：靶向的艺术。细胞外域包括一个用于目标结合的单链可变片段（ScFv）和一个铰链区域，通常在CAR工程细胞中的免疫球蛋白（Ig）样域铰链，并通过跨膜域锚定到细胞膜。通过CAR的细胞外域引入了驱动免疫细胞激活的新功能，包括T细胞、NK细胞和巨噬细胞。CAR工程免疫细胞能够识别癌症特异性靶标表位，不受MHC和共受体的限制，使它们在寻找和杀死癌细胞方面更有效。 CAR工程免疫细胞已经从针对单一抗原发展到针对两种不同抗原，以优化治疗阴性抗原癌细胞逃逸或抗原丢失的复发，并且结合任一抗原都将触发CAR工程免疫细胞的激活。这可以通过几种方式实现（图1A-C），例如将编码两个独立CAR分子的单个双顺反子向量转导到单个细胞中，或将编码双价CAR分子的向量转导到细胞中，或共同给药两种不同的CAR工程免疫细胞产品，或共同转导两个向量到单个免疫细胞中编码不同的CAR。这些方法对于B细胞淋巴性白血病特别有前景，尤其是对于复发或难治性B细胞急性淋巴性白血病（B-ALL），因为临床研究表明CD19/CD22共转导CAR-T细胞具有显著的疗效，以及CD19/CD22双特异性CAR-T细胞。同样，I期临床试验表明，双特异性CD20/CD19 CAR-T也可用于治疗复发和难治性B细胞恶性肿瘤患者，治疗28天后的总体反应率为82%，显示出治疗目的的安全性和有效性。此外，Wang等人表明，CD19/CD22双顺反子CAR-T与单特异性CD19或CD20 CAR-T细胞相比，在体外和体内表现出相当或更好的功能。 除了ScFv的优化，细胞外区域也得到了改进。与传统CAR直接作用于靶细胞不同，研究人员提出了一个新概念：模块化CAR（modCAR）。这种CAR-T（图1D、E）通常与其适配器一起工作，适配器的一端结合到细胞上，另一端用于识别和结合肿瘤表面抗原。适配器分子可以是单克隆抗体、抗体片段（图1D）、小分子或任何结构（图1E），只要能针对至少一个所需的抗原并介导目标与效应细胞之间的交联。它提供了一种高度灵活、可定制和通用的方法，以快速优化效应细胞活性，潜在地实现智能抗原靶向。 图1. CAR的设计策略。针对肿瘤的CAR设计示意图。(A) 通过将编码两个独立CAR分子的双顺反子载体转导到单个细胞中，可以生成双顺反子CAR工程细胞。(B) 通过将编码串联CAR分子的载体转导到细胞中，生成双价CAR。(C) 通过共同给予两种不同的CAR工程免疫细胞产品（上图）或共同转导两种编码不同CAR的载体到免疫细胞中（下图），实现双特异性，但产品将复杂且昂贵。可以使用抗体（D）或其他适配器（E）生成modCAR。(F) 设计装甲CAR以共表达分子，包括细胞因子和/或趋化因子，以增加效果和持久性。(G) SynNotch CAR通过添加分泌蛋白和结合剂，并利用特设计对机制执行AND、NOT和OR布尔逻辑门。这也可以通过特设计的转录因子和转录机制（H）实现。CAR：嵌合抗原受体；modCAR：模块化CAR。 装甲CAR细胞（图1F）旨在分泌细胞因子或其他分子，以帮助抵消肿瘤微环境（TME）的免疫抑制特性，潜在地提高CAR工程细胞的持久性和有效性。有时被称为第四代CAR细胞或TRUCKs（T细胞重定向用于抗原无限制的细胞因子启动的杀伤），它们为CAR靶向组织提供了一种多功能治疗，超越了传统CAR-T细胞的能力。TRUCK概念目前正在通过共表达分子如趋化因子配体或基于第二代或第三代CAR的细胞因子组合进行探索。其中，IL-7、IL-12、IL-15、IL-18、IL-23以及这些分子的各种组合正在早期阶段试验中。值得注意的是，IL-7和IL-15已被发现可以促进CAR-T细胞的增殖，而IL-12和IL-18增强了T细胞的效应能力。此外，表达特定分子的工程CAR-T细胞，如CCL-19或CCL-21，能够趋化其他免疫细胞或CAR-T细胞向附近的癌细胞移动。这增强了免疫细胞的渗透和CAR-T细胞的存活，从而提高了CAR-T细胞的有效性。 CAR设计中的最新发展是合成Notch（SynNotch）受体（图1G，H），它提供了一种精确的靶向策略，允许精确控制CAR工程细胞的激活，同时通过引入可诱导的开关来最小化非靶向效应。一个典型的案例使用了布尔逻辑和逻辑门的原理，当所有条件满足时，通过构象变化激活的共定位依赖的蛋白开关（Co-LOCKR）可以执行AND、NOT和OR布尔逻辑门。在体外已经证明了针对癌细胞的特异性，但在临床应用中仍面临各种挑战。 细胞内域：信号和细胞功能。细胞内域由一系列共刺激域组成，CAR的分类基于共刺激域的数量。第一代CAR仅由CD3ζ组成，而第二代CAR除了CD3ζ外还含有一个共刺激域，第三代CAR则涉及一个以上的共刺激域以及CD3ζ。 在T细胞中，第一代CAR已构建包含编码针对2,4,6-三硝基苯酚（TNP）抗体的可变区域的重组基因片段，这些片段被拼接到α或β T细胞受体（α或β TCR）的C区之一。转导T细胞后，这种结构可以稳定地表达在T细胞表面，并能够识别MHC非限制性的肿瘤细胞，但在临床试验中显示出较弱的抗肿瘤效果。第二代CAR-T利用T细胞激活的经典信号，并增加了一个共刺激分子，如4-1BB（也称为CD137）或CD28，这显著提高了CAR-T细胞的激活水平和增殖能力。临床数据支持接受第二代CAR-T细胞治疗的患者对其肿瘤负担有延长和有效的控制。新发现的共刺激分子包括可诱导的共刺激分子（ICOS）、OX40（也称为CD134）和CD40等。第二代CAR结构在临床实践中最广泛使用。第三代CAR-T细胞包含两个共刺激分子，导致增强的细胞毒性。在临床试验中，当共同给予淋巴瘤患者CD19导向的第二代CAR-T细胞（带有CD28共刺激域）和第三代CAR-T细胞（带有CD28和4-1BB）时，观察到更长的持久性和优越的扩张。然而，目前评估仅第三代CAR-T的临床数据有限。在一个研究者发起的试验中，HD-CAR-1，一种第三代CAR-T治疗，在成人复发/难治性ALL患者中进行了评估。在90天的研究期结束时，80%的患者实现了完全缓解。此外，最近的研究表明，配备有4-1BB和CD28共刺激域的CAR-T细胞增强了T细胞记忆表型，与仅有一种共刺激分子的细胞相比，表现出更好的增殖和细胞因子释放水平。 迄今为止，大多数涉及CAR-NK细胞的研究都使用了最初用于T细胞的CAR构建。已经开发了包含CD28或4-1BB共刺激域的第二代CAR-NK。最近的研究报告称，含有细胞内域的CAR-NK，包含4-1BB和CD3ζ，克服了抑制信号并诱导了NK细胞特异性，导致杀死CD19+ aALL细胞。然而，已经为NK细胞特别创建了新的CAR设计，这些不同的CAR构建对NK细胞的细胞毒性和细胞因子产生有不同的影响。研究表明，包含NK特异性共刺激域2B4（也称为CD244）的CAR-NK细胞对肿瘤细胞有显著增强的细胞毒性活性，诱导快速增殖，增加细胞因子产生，并减少凋亡。这表明，与NK细胞上的常规4-1BB CAR相比，NK细胞特异性激活信号在CAR性能中起着至关重要的作用。此外，利用不同的信号域，如CD3ζ、DAP10和DAP12的CAR构建，在原代NK细胞或NK92细胞系中表现出不同的抗肿瘤活性。具体来说，与包含DAP10域的CAR相比，具有CD3ζ信号域的CAR表现出优越的性能，而使用DAP12域的CAR优于包含CD3ζ域的CAR。 CAR-M细胞与CAR-T细胞具有相同的结构和代级分类，但其细胞内信号域的功能不同，主要是为了增强吞噬作用。CAR-M细胞能够直接利用CD3ζ细胞内域传递吞噬信号。Fc受体（FcRγ）的γ亚基和多个表皮生长因子样域蛋白10（Megf10）也可以作为细胞内信号域。最近的研究结果表明，添加一个串联的PI3K招募域可以增加对癌细胞的吞噬。CAR-M的第一个临床试验产品是第一代产品，包含CD3ζ作为其细胞内域，并且第一阶段的临床试验结果显示了有希望的初步安全性和有效性结果，并获得了FDA的快速通道指定。 4.提高基因转移方法的效率 在免疫疗法中引入核酸，包括基因表达和CRISPR基因编辑，是一个至关重要但具有挑战性的步骤。近年来，非病毒转染技术因其在克服与病毒载体生产相关的劳动密集和昂贵程序以及cGMP合规性方面的经济利益而越来越受欢迎。例如，转座子或移动遗传元素被用来实现高效和持久的转基因表达，在产生稳定的CAR-T细胞方面引起了极大的兴趣。此外，电穿孔或机械穿孔能够使免疫细胞如T细胞短暂表达基因组编辑核酸酶，例如CRISPR-Cas9的表达，并已在基于mRNA的人类T细胞修饰中进行了探索。这些非病毒转染技术在程序简单性、容量和吞吐量以及有利的安全概况方面提供了优势。 与非病毒转染相比，病毒转导方法在临床环境中是主流模式，并被广泛认为是转染困难细胞类型（如免疫细胞）的一种高效方法。常用的病毒载体，如腺相关病毒载体和腺病毒载体，不能整合到宿主基因组中。然而，逆转录病毒载体和慢病毒载体可以整合，并且表现出高传递效率，使它们非常适合转导高度复制的细胞，如免疫细胞。Tecartus和Yescarta都是由Kite Pharma生产，依赖于γ逆转录病毒（GRV）载体将CAR构建体转导到T细胞中，而Kymriah则使用慢病毒（LV）载体进行转导。一般来说，γ逆转录病毒和LV系统经常用于将基因转移到T细胞中，研究表明它们通常可以获得30%-80%的转导效率。然而，安全性、效率和便利性问题是必须考虑的问题。 与T细胞相比，病毒基因传递到原代NK细胞已被证明既具挑战性又效率低下，可能由于NK细胞的固有特性。研究表明，使用逆转录病毒载体成功转染原代扩增的NK细胞，单轮转染效率范围为27%-52%，经过两轮转染后为47%-75.4%。虽然逆转录病毒已被广泛用于最近的临床前和临床研究中生产CAR-NK细胞，但缺乏有效的基因转移方法仍是NK细胞在免疫疗法中使用的主要障碍。此外，与逆转录病毒转染相关的插入性突变和对原代NK细胞活性的有害影响是临床应用中的主要限制。与逆转录病毒载体相比，基于慢病毒的转染具有较低的遗传毒性和插入性突变风险。然而，原代NK细胞在LV转导中的效率很低，需要多轮转染。最近，Bari等人表明，用狒狒包膜糖蛋白变体（BaEV-LV）伪型的LV载体的转导效率比用泡状口炎病毒糖蛋白（VSV-G-LV）伪型的高20倍以上，这是用于伪型LV载体的第一种且仍最广泛使用的糖蛋白。他们通过这种转染方法成功地在约70%的不同供体的原代人类NK细胞中表达了CD19-CAR，这些CD19-CAR NK细胞有效地且特异性地根除了CD19阳性肿瘤细胞。用BaEV-gp伪型的慢病毒带有肿瘤特异性CAR在NK92细胞中的转导率几乎达到100%，在iPSC衍生的NK细胞或激活的原代NK细胞中为50%-80%。因此，它可能是NK细胞CAR基因转移的有希望的载体。此外，用长臂猿白血病病毒（GaLV）包膜蛋白伪型的慢病毒可以有效转导原代NK细胞。电穿孔和脂质体介导的转染方法也用于在NK细胞中传递外源基因。与上述病毒转染相比，这些方法提供了更快的转基因表达、降低的凋亡水平、更小的个体间差异和更高的基因转移效率。然而，外源DNA通常不会整合到目标细胞的基因组中，导致转基因表达在转染后约3-5天内下降。但当与DNA整合技术结合时，这些方法可以产生稳定转染并表达转基因的细胞。DNA转座子是可以通过切割和粘贴机制在载体和染色体之间有效转座的移动DNA元素。PiggyBac（PB）和Sleeping Beauty（SB）是迄今为止最常用的两种转座子系统，与其他系统相比，在哺乳动物细胞中显示出最高的转座活性。通过将含有CAR的质粒和转座酶DNA转染到iPSC中，成功地稳定创建了表达CAR分子的CAR-iPSC-NK细胞。 与病毒载体相比，转座子系统提供了许多好处，例如较低的免疫原性、增加的生物安全性、降低的生产成本，以及能够转移基因片段，其载荷能力接近9-10 kb。这些优势使其成为将CAR整合到NK细胞基因组中以实现持久表达的一个有力选择。然而，要充分利用转座子系统对原代NK细胞进行转染，需要进行优化，例如通过电转染提高转导效率和细胞活性。 巨噬细胞比其他造血系统中的细胞更难转染和抵抗遗传操作，因为它们有能力识别并响应外来核酸。Bobadilla及其同事创建了一种基于HIV-1的慢病毒系统，该系统通过感染时Vpx诱导的SAMHD1降解，已被证明可以有效传递转基因到骨髓细胞。Klichinsky团队使用复制缺陷的嵌合腺病毒载体Ad5F35有效地传递CAR到巨噬细胞，并同时促进M1表型的表达，最终增强了肿瘤杀伤活性。这些结果强调了基因工程巨噬细胞在癌症免疫疗法中的潜力。与生成CAR-NK细胞的方法类似，转座子系统也被用来将感兴趣的基因整合到宿主基因组中。 4.1.新型细胞来源方法推动现成的免疫细胞治疗产品 迄今为止，所有商业批准的癌症免疫细胞疗法都依赖于自体使用，即使用的材料是患者自己的细胞。尽管这种方法已证明有效，但存在一些重要的限制，例如在处理快速癌症进展的患者时制造的不良等待时间，由于患者T细胞功能障碍可能导致的生产失败，与健康淋巴细胞一起提取的恶性白血病细胞污染产品的风险，高生产成本，标准化的复杂性，以及再剂量机会的限制。因此，当前的研究工作集中在开发同种异体疗法上，以克服自体疗法的限制。特别是，CAR-NK是一种有前景的同种异体细胞治疗，对实体瘤和血液系统恶性肿瘤均无重大毒性副作用。它是一种更简单、可再注射、更实惠的通用治疗。 然而，当前的治疗尚未显示出强大的疗效和/或长期持久性，并且NK细胞更难进行工程改造。CAR-NK细胞的研究主要在临床前和早期临床试验阶段，很少有临床试验报告。尽管如此，通用的同种异体CAR-NK细胞在癌症治疗中仍显示出巨大潜力。 目前，CAR-M主要是自体疗法，但“现成的”同种异体CAR-M已经出现并正在进行进一步研究。 在开发同种异体方法时，必须系统地解决最重大的风险：免疫排斥和GvHD（移植物抗宿主病）的发展。免疫排斥可能限制治疗的效力，因为接受者的免疫系统可能会排斥移植物。GvHD可能是致命的，由供体T细胞内源性的αβ TCR复合体识别宿主肽-人类白细胞抗原（HLA）复合体引起，导致组织损伤。为了解决同种异体风险，可以采用两种主要策略。第一种是在供体αβ T细胞上除了引入CAR转基因外，还进行额外的遗传修改。另一种是选择替代的细胞来源或亚群，如诱导多能干细胞（iPSCs）、脐带血（UCB）细胞、γδ T细胞、记忆T细胞亚群、病毒特异性T细胞（VST）等。 为了消除内源性αβ TCR介导的GvHD，最直接的方法是破坏编码T细胞受体恒定（TRAC）α链的基因。Eyquem等人开发了一个案例，通过腺病毒转染和CRISPR-Cas9敲入技术将CAR构建体整合到TRAC位点，同时诱导CAR表达和TCR失活。与随机整合相比，CAR表达可以由内源性TCR启动子调控，并在暴露于抗原时模仿TCR转录，防止恒定的和过度的T细胞激活，这可能导致T细胞分化和耗竭。此外，研究结果表明，这些TRAC-CD19 CAR-T细胞在ALL小鼠模型中显示出比用逆转录病毒编码的CAR的T细胞更大的抗肿瘤效力。 此外，除了CRISPR-Cas9，基因编辑技术，如TALENs和锌指核酸酶（ZFNs），也被发现在消除TCR表达以创建“通用”供体T细胞方面有效。然而，尽管TCR缺失的CAR-T细胞降低了GvHD的风险，但其长期持久性较短，可能是由于免疫排斥。因此，科学家们敲除了β2-微球蛋白（B2M）基因以限制HLA类I分子的表达。这种方法防止了异体CAR-T细胞通过它们的TCR被识别为外来物，但仍然容易受到宿主NK细胞的溶解。因此，一项研究使用突变的B2M融合蛋白来解决这个问题。为了在激活的异体CAR-T细胞生产过程中提高HLA-II消除的效率，一些学者提出抑制CIITA或HLA-DRA、HLA-DQA和HLA-DPA基因。 iPSCs具有无限的增殖和分化潜力，使它们成为创建众多同质HLA组合库的理想资源。通过从库中选择一个HLA匹配的iPSC来源，可以最小化宿主和移植物之间CAR-T细胞的免疫排斥风险，但必须进行严格的质量控制以确保安全，因为未分化的、增殖的iPSCs可能引发不良结果。Wang等人生成了缺乏HLA-I/II、B2M和CD155的低免疫原性iPSC衍生的CAR-T细胞。 研究通过体内发挥效应功能证明了它们抑制肿瘤进展的有效性。此外，iPSCs也为生产满足临床需求的CAR-NK和CAR-M细胞铺平了道路。与分化的NK细胞或巨噬细胞相比，iPSCs可以更有效地被工程化以稳定表达CARs。Li等人通过在培养基中添加各种细胞因子和促分化蛋白来分化CAR转染的iPSCs为CAR-NK细胞。这些iPSC衍生的CAR-NK细胞在体外和体内都显示出强大的抗肿瘤活性。Zhang等人建立了一个骨髓/巨噬细胞分化协议，诱导CAR-iPS向骨髓细胞系分化，成功产生了足够的CAR-iMac细胞（iPSC衍生的CAR-M细胞）。然而，当在小鼠模型中测试时，CAR-iMacs的有效性有限。总的来说，iPSC衍生的工程免疫细胞的发展涉及复杂的生产程序，需要精确的细胞产品制造和质量保证，以支持更广泛的临床应用。 γδ T细胞表达TCRγδ并以HLA独立的方式识别恶性细胞。它不需要消除TCR表达或信号，并且GvHD的风险低或不存在。研究表明，γδ CAR-T细胞显示出与传统的αβ CAR-T细胞相似或更大的细胞毒性效应，并且在体内没有观察到GvHD。然而，它们在体外的细胞毒性能力持续性较差。此外，针对CD20的γδ CAR-T细胞在B细胞淋巴瘤的动物模型中取得了有希望的结果，目前正在进行第一阶段的临床试验。 脐带血（UCB）提供了一个容易获得的NK细胞和同种异体T细胞来源。它们富含γδ T细胞和造血干细胞（HSCs），尽管总细胞数量有限。UCB衍生的CAR-T细胞在体内显示出增强的肿瘤抑制作用，减少了IL-10的分泌，并降低了调节性T细胞（Tregs）的比例，表明了改善的治疗潜力。Van Caeneghem等人从脐带血中分离出CD34+ HSCs，然后生成CAR-T细胞。这些CAR-T细胞具有原始表型（CD45RA+ CD62L+），并且不表达TCRαβ复合体，显著降低了GvHD的风险，并有效地消除肿瘤细胞。 记忆T细胞的特征是CD45RA−CD45RO+表型，它们不太可能发展为GvHD，也不太可能迁移到表现GvHD的器官。研究表明，T记忆干细胞（TSCM）和中央记忆T细胞（Tcm）与它们的分化对应物相比，具有优越的增殖和干细胞潜力，并且在T细胞转移后的临床研究中表现出高扩张和持久性。 VSTs拥有能够识别病毒抗原的TCR，如巨细胞病毒（CMV）、Epstein-Barr病毒（EBV）等。经过CAR改造的VSTs在实体瘤中显示出有希望的结果，但与CARs相比，工程化针对肿瘤的转基因TCR VSTs更具挑战性。在肿瘤细胞中表达EBV相关抗原的霍奇金淋巴瘤患者中，输注CAR-VST细胞取得了良好的耐受性和缓解率。针对HER2的CAR-VST细胞产品在CMV血清阳性和进行性胶质母细胞瘤患者的第一阶段临床试验中显示出既安全又临床有效。值得注意的是，可以建立VST库，以覆盖大多数患者，并促进CAR-T或TCR-T重定向到肿瘤的临床使用。 PBMCs通常来自外周循环或脐带血等。它是临床目的的主要NK细胞来源。PBMC衍生的NK（PB-NK）细胞可以从HLA匹配和不匹配的供体中分离出来，扩大了潜在供体池。通常，它们显示出成熟的表型，增殖能力降低，细胞毒性增加，没有GvHD的风险。Töpfer等人已经证明，表达CAR的NK细胞系YTS以及PB-NK细胞可以成功地重定向针对前列腺干细胞抗原（PSCA）阳性肿瘤，导致大部分治疗小鼠的肿瘤被完全根除。一种短暂表达针对间皮素的mRNA CAR，MCY-M11的CAR-PBMC细胞产品已进入临床试验，它是一种混合产品，包含不同的CAR工程T细胞亚群、单核细胞和B细胞群体，展现出理想的功能和免疫表型特征。 NKT细胞，也称为CD1d限制性T细胞，是一类同时具有T细胞和NK细胞特性的异质性T细胞群。这些细胞主要识别非多态性CD1d分子，这是一种结合自身和外来脂质以及糖脂的抗原呈递分子。I型NKT细胞或称为iNKT细胞不具有HLA限制性，可能作为通用供体细胞发挥作用，但其在体内的持久性尚未知晓。研究表明，CAR19-iNKT细胞表现出抗淋巴瘤活性，并且具有增强的消除脑淋巴瘤的能力。另一种异体NKT细胞，表达带有CD28和IL-15的抗CD19嵌合受体，目前正在进行临床试验，针对复发或难治性B细胞恶性肿瘤患者（NCT03774654）。 4.2.改善肿瘤微环境以增强治疗性免疫细胞的效果 免疫细胞治疗实体瘤的效果受限于低持久性和注入后的不充分增殖，这在很大程度上归因于免疫抑制微环境，它不是被动的旁观者，而是癌症进展的积极推动者。肿瘤细胞居住在这个由浸润和驻留宿主细胞（如T细胞和巨噬细胞）、分泌因子（如IL-10和转化生长因子-β（TGFβ））以及细胞外基质（ECM）组成的异质微环境中。这些组分可以相互作用，为恶性细胞的生长、迁移和转移创造支持性环境，从而逃避免疫系统和肿瘤特异性细胞毒性T细胞。为了根除肿瘤，科学家们开发了几种策略来促进CAR工程或TCR工程治疗性免疫细胞向癌症焦点的迁移和渗透，包括利用趋化因子受体如CCR2、CXCR2、CCR4、CXCR4等。这些研究表明，CAR-T、TCR-T和NK细胞显示出增加的肿瘤渗透率，导致肿瘤退缩和增强的抗肿瘤效果。然而，将基因工程免疫细胞渗透到肿瘤中只是抗癌的第一步。有时，可能需要直接转化方法来修改免疫抑制微环境。使用免疫检查点抑制剂，如抗PD-1、抗PD-L1抗体和抗CTLA4抗体，可以改善免疫抑制肿瘤微环境。然而，它可能导致药物抗性的出现、T细胞耗竭和复发，有时甚至会导致危及生命的毒性。在肿瘤微环境中阻断TGF-β信号是另一种提高检查点抑制剂效果和增强抗肿瘤反应的方法，因为它在肿瘤信号、重塑和代谢中起着至关重要的作用。临床证据也表明TGF-β信号与对检查点阻断剂无反应的患者之间存在相关性。为了解决这个问题，已经开发了双功能抗体-配体陷阱，使用针对CTLA-4或PD-L1的抗体与TGFβ受体II外域（TGFβRIIecd）融合。它可以在肿瘤微环境中隔离TGF-β，耗尽调节性T细胞，并促进CTL共刺激。此外，通过转导优势负性TGFβ受体-II（dnTGFβRII），开发了对TGFβ有抵抗力的肿瘤特异性T细胞，并已在动物模型和临床研究中显示出治疗益处。另一种新策略是利用肿瘤微环境中高浓度的免疫抑制信号分子，通过引入嵌合开关受体（CSR），如PD-1:CD28、TIGIT:CD28、CTLA-4:CD28、TGF-βRII:4-1BB、Fas:4-1BB。CSR由PD-1、CTLA-4或TGF-βRII的细胞外域和CD28或4-1BB的细胞内域组成。T细胞与CSR一起被转导，与CAR或TC共表达，以产生工程化CTL。这些工程化CTL仍然与肿瘤细胞上的免疫抑制分子相互作用，但通过细胞内域传递共刺激信号而不是抑制信号。最近，这一策略已经进行了临床测试。这些工程化细胞被发现能有效克服免疫抑制肿瘤微环境，例如分泌更多的IFN-γ，积聚在肿瘤中，并展现出优越的抗肿瘤功能。细胞外基质为各种抗癌疗法创造了物理屏障。然而，巨噬细胞在调节ECM和展示肿瘤归巢行为方面发挥着关键作用。CAR工程巨噬细胞被证明能主动迁移到肿瘤部位，可以作为药物递送系统在抗原特异性环境中局部递送细胞因子和/或细胞毒性物质，显著改变免疫抑制肿瘤微环境，并通过吞噬作用消除肿瘤细胞。张等人使用CAR修饰的巨噬细胞解决了ECM引起的免疫细胞渗透不足的问题。体外研究表明，CAR-147巨噬细胞能够重塑肿瘤的ECM，诱导CD3+ T细胞渗透，并提高肿瘤微环境中IL-12和IFN-γ的水平，最终展现出抗肿瘤效果。 4.3.临床研究进展 从临床进展的角度来看，自2017年FDA批准首个CAR-T细胞疗法产品以来，全球已有10个CAR-T产品获得批准（补充表1）。自2013年以来，CAR-T、CAR-NK和TCR-T疗法的临床研究迅速增加，到2022年CAR-T细胞疗法的数量达到258例，值得注意的是，2023年的数据来自1月至10月（图2A）。从国家角度看，高风险细胞疗法的临床研究主要分布在美国和中国，占全球研究的80%以上（图2B）。CAR-T疗法的主要临床治疗靶点是CD19、CD22、CD20和B细胞成熟抗原（BCMA）。在血液肿瘤中，增长最快的适应症是淋巴瘤和骨髓瘤。目前，TCR-T有一种治疗产品在市场上，用于转移性葡萄膜黑色素瘤。总的来说，TCR-T在实体瘤中的进展速度比血液肿瘤快（图2C）。TCR-T的靶抗原主要集中在MART-1、HPV16-E6、NYESO、HPV16-E7等。在病症方面，TCR-T的临床研究主要用于实体瘤的治疗。这些实体瘤大多与病毒感染有关，如与人类乳头瘤病毒（HPV）感染相关的宫颈癌。此外，TCR-T在头颈、肝脏和结肠癌症的临床研究正在迅速进展（图2C）。就CAR-NK病症而言，血液肿瘤仍然是进展最快的，其中淋巴瘤病症的进展速度更快（图2C）。 图2. CAR-T、TCR-T和CAR-NK疗法的临床试验。临床试验数据统计。(A) 2018年至2023年细胞疗法临床研究的数量，分为CAR-T、TCR-T和CAR-NK几组。(B) 按国家分组的细胞疗法临床研究数量，同样分为CAR-T、TCR-T和CAR-NK几组，Y轴在50到450之间中断。(C) 针对不同适应症的细胞疗法药物的临床进展，细胞疗法药物的分组与(A)相同，适应症分为液体和固体肿瘤两组。原始数据下载自https://classic.clinicaltrials.gov/，更新至2023年10月30日。CAR-T：嵌合抗原受体T细胞；CAR-NK：嵌合抗原受体自然杀伤细胞；CNS：中枢神经系统；HPV：人乳头瘤病毒；TCR-T：T细胞受体T细胞。 CAR-NK的临床治疗靶点主要是血液肿瘤的CD19、CD22和BCMA，以及实体瘤的PSMA、HER2、ROBO1和MUC1。总的来说，TCR-T和CAR-NK仍处于早期临床开发阶段。到目前为止，CAR-M的临床研究仍处于起步阶段，只有一个I期临床试验（NCT04660929）。图2的数据可从补充表2获得。 5.结论与展望 免疫细胞治疗在肿瘤治疗中变得越来越重要。与替代免疫治疗方法（如免疫检查点抑制剂和细胞因子）相比，免疫细胞治疗表现出了优越的疗效、特异性，并倾向于引起可接受的副作用。当作为某些癌症的独立治疗时，特别是采用性T细胞转移疗法，在血液系统恶性肿瘤如白血病和淋巴瘤中显示出了显著的成功。然而，由于免疫抑制肿瘤微环境、肿瘤异质性、靶标抗原表达低等因素，一些实体瘤对单独的免疫细胞治疗更具挑战性。在许多情况下，转向另一种免疫细胞治疗或将免疫细胞治疗与其他治疗策略（如化疗、放疗、其他免疫治疗或靶向治疗）结合起来被认为是有益的，可以通过不同的机制增强整体治疗效果。目前，全球已有10个CAR-T产品获批，而DC疫苗和TCR-T各有一个获批产品。在低风险免疫细胞治疗方面，TIL和DC疫苗在治疗实体瘤方面显示出了希望。此外，CIK治疗与其他免疫策略结合使用时显示出协同的抗肿瘤效果。这些方法通常由具有不同功能特征的异质细胞组成，在治疗相对高异质性的恶性肿瘤方面具有优势。另一方面，高风险免疫治疗如CAR-T和TCR-T通常是定向的和高度特异性的，使它们特别适合相对快速增殖的恶性肿瘤。在血液肿瘤中，CAR-T和TCR-T已经得到了临床验证，它们在治疗实体瘤方面的应用正在稳步进展。而基于其生物学特性，CAR-NK和CAR-M在治疗实体瘤方面具有固有优势。TCR-T专注于特定的肿瘤相关抗原和新抗原，使它们在外来抗原如病毒相关恶性肿瘤方面受益。研究人员目前正在努力突破包括CAR-T在内的细胞治疗技术的瓶颈。新的细胞来源和降低GvHD风险和其他风险的方法为“现成的”或同种异体细胞治疗创造了机会，这些治疗可以事先准备并在需要时轻松地给多个患者使用，实现更快的诊断和癌症治疗。此外，针对CAR的新颖设计最小化了对健康组织的损害，并与传统治疗相比减少了副作用。某些设计甚至为治疗实体瘤提供了可能性。此外，修改肿瘤环境和诱导记忆T细胞的策略使得实现长期效果成为可能。同时，由于这些疗法新颖、复杂和技术性，它们可能对公共卫生和个体患者构成以前未探索的风险。TIL细胞治疗、DC/CIK细胞治疗和DC疫苗被认为是低到中等风险。风险因素包括生产中使用的生物活性物质，如抗体、细胞因子、血清、生长因子和抗生素，以及在保存、冷冻、解冻和冷链运输过程中的产品稳定性和活性风险。此外，产品本身可能存在固有风险，如不完全去除肿瘤细胞或其他不需要的细胞，以及与归巢、植入、迁移和增殖相关的潜在并发症或降低的产品活性。然而，高风险免疫疗法需要更多的操作，使用基因修饰细胞、自体干细胞或同种异体或异种细胞，这需要额外的评估。在临床上，这些疗法有时可能引发细胞因子风暴和细胞因子释放综合征（CRS），这两种都是危及生命的全身性炎症综合征。因此，这些产品的风险管理考虑相应更具挑战性。必须仔细评估产品与患者相互作用产生的即时和延迟影响的潜在风险。这些风险包括不需要的免疫原性及其相关效应，包括CRS、GVHD、移植物排斥、过敏反应、超敏反应和免疫缺陷。此外，评估与患者细胞的预期和非预期遗传修饰相关的潜在风险也很重要，包括细胞功能、细胞凋亡、生长或分化的变化、插入性突变或遗传毒性以及恶性转化的可能性。然而，准确评估免疫细胞治疗的风险仍然具有挑战性。一些真正的风险超出了预期或在临床前研究中没有被揭示。重要的是要理解风险在临床研究中无处不在，它被定义为在特定时间框架内发生不利结果的可能性。评估可接受的免疫细胞治疗风险水平涉及权衡各种因素，而不仅仅是绝对风险，而是可能随之而来的潜在治疗益处。与患有较轻微肿瘤或癌症适应症且存在适当治疗方法的患者相比，患有危及生命的晚期或严重恶性肿瘤的患者可接受的风险水平要高得多。总的来说，免疫细胞治疗的技术障碍相对较高，创新动力强，技术发展多。近年来进展呈爆炸性增长。尽管CAR-T、TCR-T和DC疫苗已获批准，但其他免疫细胞治疗仍处于早期临床和临床前研究阶段。低风险疗法如TIL面临由于无法完全消除Tregs而有限的效力。CIK细胞治疗在获取和扩增方面遇到困难。DC肿瘤疫苗受到缺乏理想的肿瘤特异性抗原、TAA免疫原性弱、难以高效诱导免疫原性DC以及体外DC致敏方法的静脉回输无法有效激活DC分化和成熟的影响。高风险细胞治疗在克服肿瘤异质性的障碍方面仍有很长的路要走。CAR-T细胞仍面临效应T细胞耗竭、细胞因子风暴和免疫抑制微环境等挑战。TCR-T细胞治疗的挑战包括如何减少TCR不匹配和针对新抗原的最小选择。CAR-NK疗法正在经历遗传操作和细胞增殖困难。尽管CAR-M可能成为有希望的抗癌疗法，但它们尚未完全实现。临床研究需要确认肿瘤相关巨噬细胞在决定TME是否可以将肿瘤靶向CAR-M转化为肿瘤支持表型方面的高适应性。然而，免疫细胞治疗在抗癌疗法的未来开发中仍具有至高无上的潜力。人们普遍认为，快速的技术创新将使这些疗法成为高效的癌症治疗手段，显著改善治疗效果，推进人类医疗保健。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

摘要:免疫细胞治疗作为一种革命性的治疗方式，显著改变了癌症护理。这是一种专业的免疫疗法，利用活的免疫细胞作为治疗癌症的疗法。与传统药物不同，细胞疗法被认为是“活药”，这些产品目前是定制的，需要先进的制造技术。尽管嵌合抗原受体（CAR）-T细胞疗法在治疗血液恶性肿瘤方面受到了行业的极大关注，但其在治疗实体瘤方面的有效性常常受限，导致替代性免疫细胞疗法的出现。肿瘤浸润性淋巴细胞（TIL）细胞疗法、细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK）细胞疗法、树突状细胞（DC）疫苗和DC/CIK细胞疗法旨在利用身体的自然防御机制来定位和消除癌细胞，通常具有较少的副作用或风险。另一方面，如嵌合抗原受体-T（CAR-T）细胞、T细胞受体（TCR）-T、嵌合抗原受体-自然杀伤细胞（CAR-NK）或CAR-巨噬细胞（CAR-M）等细胞疗法通常使用自体干细胞、同种异体或异种细胞，或基因修饰细胞，需要更高水平的操作，被认为是高风险的。这些高风险细胞疗法通常在肿瘤靶向和信号传导方面具有特殊特性，触发新的抗肿瘤免疫反应。最近，在抗肿瘤机制和细胞疗法产品设计的基本和临床研究以及技术创新方面取得了显著进展。随着技术的迅速整合和高创新格局，关键的未来发展方向已经出现。为了满足细胞疗法技术进步治疗癌症的需求，我们在本研究中全面系统地调查了免疫细胞疗法的技术创新和临床进展。基于免疫细胞疗法的治疗机制和方法学特点，我们分析了这些疗法的主要技术优势和临床转化风险。我们还分析和预测了应用前景，为相关企业提供必要的信息，以便他们做出关于研发方向选择的明智决策。 1.引言 癌症是一种利用多种逃逸机制来躲避抗癌免疫的全身性疾病，并且显著改变整个免疫系统的功能和组成。抗癌治疗的演变跨越了一百多年，其效果和特异性不断提高，旨在消除癌细胞的同时尽量减少对健康组织的损害。为了实现这一目标，免疫细胞治疗在现有方法中脱颖而出，成为了一种改变游戏规则的解决方案。2017年，食品药品监督管理局（FDA）批准了两种嵌合抗原受体-T（CAR-T）细胞疗法，即Kite Pharm的axicabtagene ciloleucel（Yescarta）和Novartis的tisagenlecleucel（Kymriah），用于治疗淋巴瘤。这些批准标志着抗癌治疗加速发展的一个重大里程碑。免疫细胞治疗的基本概念是通过外部供应具有所需功能的细胞来增强免疫反应，以帮助患者对抗癌症。它不仅重新激活了现有的免疫反应，还推动了新的免疫反应加入到抗肿瘤努力中。免疫细胞治疗的反应通常涉及多种免疫细胞类型的激活和协作，包括抗原呈递细胞，如树突状细胞（DCs）和巨噬细胞，T淋巴细胞（T细胞）和自然杀伤（NK）细胞。肿瘤负担的免疫系统不仅在免疫细胞数量上失衡，而且在调节抗癌免疫反应的分子和信号通路上也表现出功能异常。因此，精确施用适当的治疗策略是必要的，以防止免疫细胞治疗的效果不佳。 根据癌症类型及其机制，免疫过程的各个领域为治疗干预提供了途径。方法包括，例如，提取和扩增具有预先癌症识别能力的免疫细胞（例如，肿瘤浸润性免疫细胞），外部分化有效的细胞类型[例如，细胞因子诱导的杀伤（CIK）细胞]，以及基因修饰细胞以实现特定识别和肿瘤细胞消除[例如，T细胞受体（TCR）工程，嵌合抗原受体（CAR）]。在本综述中，我们将讨论最新的免疫细胞治疗，总结应用于实现和优化这些治疗类别的策略，并提供未来的展望。 2.用低风险免疫细胞治疗癌症 低风险免疫细胞治疗旨在使用患者自己的免疫细胞来消除癌细胞。需要注意的是，“低风险”强调的是细胞治疗领域内某些治疗相对更安全、副作用较少，属于再生医学或先进治疗药物产品（ATMPs）。低风险免疫细胞治疗包括四种关键技术：肿瘤浸润性淋巴细胞（TIL）疗法、CIK细胞疗法、DC疫苗和DC/CIK细胞疗法。为了更全面地理解这些方法，必须深入研究促进这些细胞治疗的基本机制和临床进展。 2.1.TIL细胞治疗 TILs是存在于实体肿瘤微环境（TME）中的天然单核细胞，包括肿瘤内肿瘤浸润性淋巴细胞（iTILs）和基质肿瘤浸润性淋巴细胞（sTILs）。与iTILs相比，sTILs主要是效应记忆T细胞，更容易被检测到。作为一群已经接触过肿瘤组织的异质性淋巴细胞，TILs“预训练”攻击癌细胞，同时留下健康的细胞。在小鼠肿瘤模型中，这些异质细胞已经显示出治疗晚期癌症的潜力，第一个人类TIL治疗导致转移性黑色素瘤显著消退。实体瘤缺乏理想的肿瘤标志物，使得靶向肿瘤相关抗原（TAAs）具有挑战性。TILs作为具有多样化受体的多克隆细胞，为实体瘤提供了独特的治疗选择。与基因修饰的免疫细胞相比，TILs在克服实体瘤的异质性方面表现出优越性，特别是像黑色素瘤这样高度异质性的肿瘤。此外，它们具有注射后迁移至TME的趋化因子受体，并且与CAR-T细胞相比，它们的非靶向毒性较低，这归因于T细胞成熟过程中的负选择。 TILs可以从切除的肿瘤组织中分离出来。鉴于TIL在原始TME中的稀缺性，可供扩增的TIL数量有限，以及阻碍TIL抗肿瘤细胞毒性的额外因素（例如，Treg，肿瘤相关巨噬细胞，髓系抑制细胞和各种免疫抑制分子）。TIL的生产和扩增是TIL治疗成功的至关重要步骤。TIL在体外的扩增涉及快速扩增协议（REP）。在REP前阶段，TILs在高剂量白细胞介素（IL）-2下进行初级扩增。一些方法涉及选择肿瘤特异性TILs进行进一步扩增，而其他方法则扩增大量TILs以保持疗效。在REP阶段，同时给予高剂量IL-2和抗CD3，并使用辐照的同种异体外周血单核细胞（PBMCs）作为饲养细胞，直到获得足够数量的细胞。然后，经过质量控制的扩增细胞产品准备用于患者给药后进行淋巴细胞减少。 自1988年Rosenberg等人成功将TIL治疗应用于转移性黑色素瘤患者以来，一系列临床试验相继出现。1996年，TIL治疗首次被引入用于治疗非小细胞肺癌（NSCLCs），在涉及113名患者的临床研究中。结果显示，TIL与IL-2联合使用对NSCLCs是一种有效的治疗方法，与II期或IIIa期相比，对IIIb期NSCLCs有选择性益处。在初步成功后，TIL治疗的后续发展一直朝着提高治疗其他肿瘤类型的疗效方向发展，包括皮肤、肾脏和胃癌。这些发展中的具体方法旨在阐明TIL细胞类型的组成及其与临床结果的相关性。例如，成功生成的肿瘤浸润性B淋巴细胞（TIBs）已被发现可以预测转移性肾细胞癌（mRCC）患者的临床结果改善。另一项关于胃癌TIL治疗的研究表明，TIL的组织学亚群与不同的存活时间相关。目前，TIL治疗的临床转化仍处于初步阶段，缺乏长期临床观察。然而，初步成功表明有机会开发具有更有效分离和扩增方法的有希望的治疗性TILs，并可能与其他抗肿瘤疗法结合使用。 2.2.CIK细胞疗法 CIK细胞是具有混合T和NK细胞样表型的异质免疫效应细胞。它们是通过将人的PBMC或脐带血单核细胞与干扰素γ（IFN-γ）、抗CD3抗体、重组人IL-1和IL-2一起体外培养产生的。CIK细胞独特地表现出对肿瘤的主要组织相容性复合体（MHC）不受限制的靶向性，减少异体反应性，并能够攻击各种肿瘤类型。在体外培养过程中，CIK细胞分泌各种细胞因子以激活巨噬细胞、NK细胞和CD8+ T细胞的细胞毒性活性，从而直接抑制肿瘤细胞的生长并促进间接杀伤效果。CIK细胞诱导凋亡基因和抗肿瘤基因的表达，进行细胞毒性活动并促进肿瘤细胞凋亡。它们主要通过粘附分子淋巴细胞功能相关抗原-1/认知配体细胞间粘附分子-1（LFA-1/cam-1）与肿瘤细胞上的抗原结合的机制来实现肿瘤杀伤效果。这促进了MHC-I或MHC-II分子的表达，导致增强的呈递、激活、识别和直接杀伤肿瘤细胞。 激活的CIK细胞分泌各种细胞因子，包括IL-2、IL-6、肿瘤坏死因子α（TNF-α）、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）和其他细胞因子，不仅直接增强细胞毒性效果和抑制肿瘤细胞，还通过调节免疫系统间接杀死肿瘤细胞。主要由CIK细胞产生的IFN-γ增强了NK细胞、巨噬细胞和细胞毒性T淋巴细胞（CTL）的活性。它还可以促进肿瘤细胞上MHC-I分子的表达，导致CTL杀伤增加。最近的研究指出，CIK细胞分泌的IFN-γ可以促进慢性淋巴细胞性白血病（CLL）细胞上ICAM-1的表达，对细胞毒性效应细胞的凋亡诱导产生积极影响。肿瘤细胞的凋亡基因也可以被CIK细胞激活，因为这些细胞表达FasL，一种属于TNF超家族的Fas配体，它诱导肿瘤细胞凋亡。Verneris指出，某些肿瘤细胞（如黑色素瘤和卵巢癌）通过诱导表达FasL的淋巴细胞凋亡来逃避免疫清除，但它们对CIK细胞敏感。这是因为，在CIK细胞的诱导过程中，Fas敏感或激活的T细胞被IFN-γ等细胞因子的作用或激活诱导的细胞死亡机制选择性地消除。结合CIK细胞中高水平的抗凋亡基因表达，这些因素使CIK细胞能够耐受表达FasL的肿瘤细胞诱导的凋亡。 尽管存在复发和无反应性的担忧，CIK细胞的异质性使它们能够靶向并杀死各种肿瘤细胞。自1991年引入CIK细胞疗法以来，已有超过5,000名患有多种肿瘤类型的患者，包括肺癌、乳腺癌、脑癌和结肠癌等，参与了CIK细胞疗法。全球CIK细胞（或CIK细胞与DC联合）的临床试验已超过80项。CIK细胞的治疗潜力超出了它们与NKG2D的相互作用，包括抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）轴。与其他免疫疗法、常规化疗或放疗一起，CIK疗法表明了协同的抗肿瘤效果，正在发展中，是治疗癌症的一条令人鼓舞的途径。虽然临床前景看好，但一些公开讨论是必要的。与其他免疫细胞相比，CIK细胞输注后的毒性效应、最小化额外的支持性护理、确定与其他免疫疗法的优势、了解与CIK细胞在癌症微环境中的串扰的关键决定因素，以及在多个中心推广这种方法需要探索。 2.3.DC疫苗 操纵患者的自体DCs进行“疫苗接种”以对抗肿瘤组织是一种有前景的方法。DC疫苗涉及用TAAs（如肽、蛋白质、DNA/RNA或病毒）处理体外培养的DCs。DCs将摄取抗原，然后在仔细控制的培养过程中激活。DCs作为强大的抗原呈递细胞，对影响免疫系统起着至关重要的作用。虽然未成熟的DCs处理外来抗原，触发成熟和迁移到淋巴结，成熟的DCs可以在TME内促进肿瘤耐受，可能导致T辅助型2反应。 DC疫苗，通常采用体外成熟的自体单核细胞并用抗原冲击，已在多种肿瘤患者中显示出良好的耐受性和最小的毒性。然而，抗原特异性免疫反应的幅度和持续时间普遍较弱，限制了客观的临床反应。尽管在儿童肿瘤中的反应有限，正在进行的研究集中在增强疫苗生产的每一步上。策略包括扩大DC来源、提高免疫原性、优化抗原选择、开发新的免疫佐剂以及探索同时进行的免疫调节或化疗。 Sipuleucel-T是唯一获得FDA批准的自体DC疫苗，为有效的成人恶性肿瘤治疗提供了希望，特别是对于去势抵抗性前列腺腺癌。通过培养患者的PBMCs与一种由TAA（前列腺酸性磷酸酶（PAP））和GM-CSF组成的重组蛋白（PAP-GM-CSF）来生产。这种开创性的疫苗代表了DC疫苗领域的一个重要进展，展示了在成人和儿童恶性肿瘤中改善结果的潜在途径。在临床试验中，DC主要用于与CIK细胞、免疫检查点抑制剂（ICI）以及化疗和放疗结合的免疫疗法中以改善结果。研究表明DC能够激活自然杀伤T（NKT）细胞，或同时激活CD4+和CD8+ T细胞。 2.4.DC/CIK细胞疗法 当多种低风险的免疫细胞疗法一起使用时，可以实现积极的综合协同效应，特别是在DC和CIK的共同应用中尤为明显，它们是可适应和协同的。这种协同作用旨在增强身体对疾病的免疫反应。CIK细胞以其广谱的肿瘤杀伤效果而闻名，但由于缺乏特定的识别能力而受到限制。DC目前被认为是最有效的抗原呈递细胞，最近的研究表明CIK和DC之间的相互作用会在两个群体内部引起免疫刺激性表面分子表达的变化。实际上，与CIK细胞共同培养DCs发挥了互补作用，相互促进成熟，共同增加抗肿瘤活性，并展现出有希望的协同效应，即使在之前对CIKs有抵抗力且之前未与DCs共同培养的肿瘤细胞系上也是如此。DC分泌的细胞因子，如IL-2、IL-12和IFN-γ增强了CIK细胞的成熟，导致CIK细胞中CD3+、CD8+和CD56+亚群的水平增加。值得注意的是，DCs显著增加的IL-12分泌显著增强了CIKs的细胞溶解功能。此外，这种合作环境还减少了IL-10的分泌和调节性T细胞（CD4+CD25+ Treg细胞）的数量，减弱了它们对肿瘤免疫的抑制作用，并增强了CIK细胞的肿瘤杀伤效果。同时，CIK细胞增强了DCs的抗原呈递特异性和共刺激分子的表达，有助于整体增加抗肿瘤活性。此外，DC和CIK细胞的共同培养抑制了人类端粒酶逆转录酶（hTERT）蛋白的表达，抑制了端粒酶活性，并阻碍了肿瘤细胞的增殖。 基于上述机制，DC-CIK疗法以相互适应和协同为特点，已成为近年来肿瘤治疗领域的研究焦点。基础和临床研究迅速发展，并证明了在显著增强抗肿瘤免疫方面的有效性。尽管存在轻度移植物抗宿主病（GvHD）的担忧，试验经验表明结果是可控的。案例研究已经证明了安全性和提高的疗效。DC/CIK细胞疗法针对免疫系统的多个方面，从而形成了更全面的对抗疾病的方法。这在复杂情况或难治性恶性肿瘤中尤为有益，其中多种免疫功能障碍发挥作用。总的来说，低风险的免疫细胞疗法可以帮助增强免疫系统识别和消除有害实体的能力，从而改善健康结果。这些疗法的协同效应有潜力显著提高基于免疫的治疗的有效性，并为患者提供更好的结果。然而，评估和定制这些疗法的确切组合和剂量以确保其对个体患者的安全性和有效性至关重要。 3.高风险免疫细胞治疗技术的进步 高风险免疫细胞治疗使用自体干细胞、异体或异种细胞，或基因修饰细胞，所有这些细胞都需要进一步的操作和评估。这些治疗的设计非常适合其预期目的。这些治疗刺激针对肿瘤的新免疫反应，通常有潜力重新激活已有的反应。在这里，我们描述了高风险免疫细胞治疗中的特征设计、转染方法、细胞来源，以及克服抑制性肿瘤微环境（TME）的方法，包括CAR-T、T细胞受体-T（TCR-T）、CAR-NK和CAR-巨噬细胞（CAR-M）。此外，我们提供了对未来趋势的见解。 3.1.CAR的设计 CAR是工程受体蛋白，为免疫细胞提供了识别癌细胞表面特定抗原的新能力，从而可能触发免疫细胞消除癌细胞的潜力。当前研究表明，即使是对CAR结构的微小修改也可能会显著影响治疗效果。它通常由三个模块化域组成：细胞外域、跨膜域和细胞内域。 细胞外域：靶向的艺术。细胞外域包括一个用于目标结合的单链可变片段（ScFv）和一个铰链区域，通常在CAR工程细胞中的免疫球蛋白（Ig）样域铰链，并通过跨膜域锚定到细胞膜。通过CAR的细胞外域引入了驱动免疫细胞激活的新功能，包括T细胞、NK细胞和巨噬细胞。CAR工程免疫细胞能够识别癌症特异性靶标表位，不受MHC和共受体的限制，使它们在寻找和杀死癌细胞方面更有效。 CAR工程免疫细胞已经从针对单一抗原发展到针对两种不同抗原，以优化治疗阴性抗原癌细胞逃逸或抗原丢失的复发，并且结合任一抗原都将触发CAR工程免疫细胞的激活。这可以通过几种方式实现（图1A-C），例如将编码两个独立CAR分子的单个双顺反子向量转导到单个细胞中，或将编码双价CAR分子的向量转导到细胞中，或共同给药两种不同的CAR工程免疫细胞产品，或共同转导两个向量到单个免疫细胞中编码不同的CAR。这些方法对于B细胞淋巴性白血病特别有前景，尤其是对于复发或难治性B细胞急性淋巴性白血病（B-ALL），因为临床研究表明CD19/CD22共转导CAR-T细胞具有显著的疗效，以及CD19/CD22双特异性CAR-T细胞。同样，I期临床试验表明，双特异性CD20/CD19 CAR-T也可用于治疗复发和难治性B细胞恶性肿瘤患者，治疗28天后的总体反应率为82%，显示出治疗目的的安全性和有效性。此外，Wang等人表明，CD19/CD22双顺反子CAR-T与单特异性CD19或CD20 CAR-T细胞相比，在体外和体内表现出相当或更好的功能。 除了ScFv的优化，细胞外区域也得到了改进。与传统CAR直接作用于靶细胞不同，研究人员提出了一个新概念：模块化CAR（modCAR）。这种CAR-T（图1D、E）通常与其适配器一起工作，适配器的一端结合到细胞上，另一端用于识别和结合肿瘤表面抗原。适配器分子可以是单克隆抗体、抗体片段（图1D）、小分子或任何结构（图1E），只要能针对至少一个所需的抗原并介导目标与效应细胞之间的交联。它提供了一种高度灵活、可定制和通用的方法，以快速优化效应细胞活性，潜在地实现智能抗原靶向。 图1. CAR的设计策略。针对肿瘤的CAR设计示意图。(A) 通过将编码两个独立CAR分子的双顺反子载体转导到单个细胞中，可以生成双顺反子CAR工程细胞。(B) 通过将编码串联CAR分子的载体转导到细胞中，生成双价CAR。(C) 通过共同给予两种不同的CAR工程免疫细胞产品（上图）或共同转导两种编码不同CAR的载体到免疫细胞中（下图），实现双特异性，但产品将复杂且昂贵。可以使用抗体（D）或其他适配器（E）生成modCAR。(F) 设计装甲CAR以共表达分子，包括细胞因子和/或趋化因子，以增加效果和持久性。(G) SynNotch CAR通过添加分泌蛋白和结合剂，并利用特设计对机制执行AND、NOT和OR布尔逻辑门。这也可以通过特设计的转录因子和转录机制（H）实现。CAR：嵌合抗原受体；modCAR：模块化CAR。 装甲CAR细胞（图1F）旨在分泌细胞因子或其他分子，以帮助抵消肿瘤微环境（TME）的免疫抑制特性，潜在地提高CAR工程细胞的持久性和有效性。有时被称为第四代CAR细胞或TRUCKs（T细胞重定向用于抗原无限制的细胞因子启动的杀伤），它们为CAR靶向组织提供了一种多功能治疗，超越了传统CAR-T细胞的能力。TRUCK概念目前正在通过共表达分子如趋化因子配体或基于第二代或第三代CAR的细胞因子组合进行探索。其中，IL-7、IL-12、IL-15、IL-18、IL-23以及这些分子的各种组合正在早期阶段试验中。值得注意的是，IL-7和IL-15已被发现可以促进CAR-T细胞的增殖，而IL-12和IL-18增强了T细胞的效应能力。此外，表达特定分子的工程CAR-T细胞，如CCL-19或CCL-21，能够趋化其他免疫细胞或CAR-T细胞向附近的癌细胞移动。这增强了免疫细胞的渗透和CAR-T细胞的存活，从而提高了CAR-T细胞的有效性。 CAR设计中的最新发展是合成Notch（SynNotch）受体（图1G，H），它提供了一种精确的靶向策略，允许精确控制CAR工程细胞的激活，同时通过引入可诱导的开关来最小化非靶向效应。一个典型的案例使用了布尔逻辑和逻辑门的原理，当所有条件满足时，通过构象变化激活的共定位依赖的蛋白开关（Co-LOCKR）可以执行AND、NOT和OR布尔逻辑门。在体外已经证明了针对癌细胞的特异性，但在临床应用中仍面临各种挑战。 细胞内域：信号和细胞功能。细胞内域由一系列共刺激域组成，CAR的分类基于共刺激域的数量。第一代CAR仅由CD3ζ组成，而第二代CAR除了CD3ζ外还含有一个共刺激域，第三代CAR则涉及一个以上的共刺激域以及CD3ζ。 在T细胞中，第一代CAR已构建包含编码针对2,4,6-三硝基苯酚（TNP）抗体的可变区域的重组基因片段，这些片段被拼接到α或β T细胞受体（α或β TCR）的C区之一。转导T细胞后，这种结构可以稳定地表达在T细胞表面，并能够识别MHC非限制性的肿瘤细胞，但在临床试验中显示出较弱的抗肿瘤效果。第二代CAR-T利用T细胞激活的经典信号，并增加了一个共刺激分子，如4-1BB（也称为CD137）或CD28，这显著提高了CAR-T细胞的激活水平和增殖能力。临床数据支持接受第二代CAR-T细胞治疗的患者对其肿瘤负担有延长和有效的控制。新发现的共刺激分子包括可诱导的共刺激分子（ICOS）、OX40（也称为CD134）和CD40等。第二代CAR结构在临床实践中最广泛使用。第三代CAR-T细胞包含两个共刺激分子，导致增强的细胞毒性。在临床试验中，当共同给予淋巴瘤患者CD19导向的第二代CAR-T细胞（带有CD28共刺激域）和第三代CAR-T细胞（带有CD28和4-1BB）时，观察到更长的持久性和优越的扩张。然而，目前评估仅第三代CAR-T的临床数据有限。在一个研究者发起的试验中，HD-CAR-1，一种第三代CAR-T治疗，在成人复发/难治性ALL患者中进行了评估。在90天的研究期结束时，80%的患者实现了完全缓解。此外，最近的研究表明，配备有4-1BB和CD28共刺激域的CAR-T细胞增强了T细胞记忆表型，与仅有一种共刺激分子的细胞相比，表现出更好的增殖和细胞因子释放水平。 迄今为止，大多数涉及CAR-NK细胞的研究都使用了最初用于T细胞的CAR构建。已经开发了包含CD28或4-1BB共刺激域的第二代CAR-NK。最近的研究报告称，含有细胞内域的CAR-NK，包含4-1BB和CD3ζ，克服了抑制信号并诱导了NK细胞特异性，导致杀死CD19+ aALL细胞。然而，已经为NK细胞特别创建了新的CAR设计，这些不同的CAR构建对NK细胞的细胞毒性和细胞因子产生有不同的影响。研究表明，包含NK特异性共刺激域2B4（也称为CD244）的CAR-NK细胞对肿瘤细胞有显著增强的细胞毒性活性，诱导快速增殖，增加细胞因子产生，并减少凋亡。这表明，与NK细胞上的常规4-1BB CAR相比，NK细胞特异性激活信号在CAR性能中起着至关重要的作用。此外，利用不同的信号域，如CD3ζ、DAP10和DAP12的CAR构建，在原代NK细胞或NK92细胞系中表现出不同的抗肿瘤活性。具体来说，与包含DAP10域的CAR相比，具有CD3ζ信号域的CAR表现出优越的性能，而使用DAP12域的CAR优于包含CD3ζ域的CAR。 CAR-M细胞与CAR-T细胞具有相同的结构和代级分类，但其细胞内信号域的功能不同，主要是为了增强吞噬作用。CAR-M细胞能够直接利用CD3ζ细胞内域传递吞噬信号。Fc受体（FcRγ）的γ亚基和多个表皮生长因子样域蛋白10（Megf10）也可以作为细胞内信号域。最近的研究结果表明，添加一个串联的PI3K招募域可以增加对癌细胞的吞噬。CAR-M的第一个临床试验产品是第一代产品，包含CD3ζ作为其细胞内域，并且第一阶段的临床试验结果显示了有希望的初步安全性和有效性结果，并获得了FDA的快速通道指定。 4.提高基因转移方法的效率 在免疫疗法中引入核酸，包括基因表达和CRISPR基因编辑，是一个至关重要但具有挑战性的步骤。近年来，非病毒转染技术因其在克服与病毒载体生产相关的劳动密集和昂贵程序以及cGMP合规性方面的经济利益而越来越受欢迎。例如，转座子或移动遗传元素被用来实现高效和持久的转基因表达，在产生稳定的CAR-T细胞方面引起了极大的兴趣。此外，电穿孔或机械穿孔能够使免疫细胞如T细胞短暂表达基因组编辑核酸酶，例如CRISPR-Cas9的表达，并已在基于mRNA的人类T细胞修饰中进行了探索。这些非病毒转染技术在程序简单性、容量和吞吐量以及有利的安全概况方面提供了优势。 与非病毒转染相比，病毒转导方法在临床环境中是主流模式，并被广泛认为是转染困难细胞类型（如免疫细胞）的一种高效方法。常用的病毒载体，如腺相关病毒载体和腺病毒载体，不能整合到宿主基因组中。然而，逆转录病毒载体和慢病毒载体可以整合，并且表现出高传递效率，使它们非常适合转导高度复制的细胞，如免疫细胞。Tecartus和Yescarta都是由Kite Pharma生产，依赖于γ逆转录病毒（GRV）载体将CAR构建体转导到T细胞中，而Kymriah则使用慢病毒（LV）载体进行转导。一般来说，γ逆转录病毒和LV系统经常用于将基因转移到T细胞中，研究表明它们通常可以获得30%-80%的转导效率。然而，安全性、效率和便利性问题是必须考虑的问题。 与T细胞相比，病毒基因传递到原代NK细胞已被证明既具挑战性又效率低下，可能由于NK细胞的固有特性。研究表明，使用逆转录病毒载体成功转染原代扩增的NK细胞，单轮转染效率范围为27%-52%，经过两轮转染后为47%-75.4%。虽然逆转录病毒已被广泛用于最近的临床前和临床研究中生产CAR-NK细胞，但缺乏有效的基因转移方法仍是NK细胞在免疫疗法中使用的主要障碍。此外，与逆转录病毒转染相关的插入性突变和对原代NK细胞活性的有害影响是临床应用中的主要限制。与逆转录病毒载体相比，基于慢病毒的转染具有较低的遗传毒性和插入性突变风险。然而，原代NK细胞在LV转导中的效率很低，需要多轮转染。最近，Bari等人表明，用狒狒包膜糖蛋白变体（BaEV-LV）伪型的LV载体的转导效率比用泡状口炎病毒糖蛋白（VSV-G-LV）伪型的高20倍以上，这是用于伪型LV载体的第一种且仍最广泛使用的糖蛋白。他们通过这种转染方法成功地在约70%的不同供体的原代人类NK细胞中表达了CD19-CAR，这些CD19-CAR NK细胞有效地且特异性地根除了CD19阳性肿瘤细胞。用BaEV-gp伪型的慢病毒带有肿瘤特异性CAR在NK92细胞中的转导率几乎达到100%，在iPSC衍生的NK细胞或激活的原代NK细胞中为50%-80%。因此，它可能是NK细胞CAR基因转移的有希望的载体。此外，用长臂猿白血病病毒（GaLV）包膜蛋白伪型的慢病毒可以有效转导原代NK细胞。电穿孔和脂质体介导的转染方法也用于在NK细胞中传递外源基因。与上述病毒转染相比，这些方法提供了更快的转基因表达、降低的凋亡水平、更小的个体间差异和更高的基因转移效率。然而，外源DNA通常不会整合到目标细胞的基因组中，导致转基因表达在转染后约3-5天内下降。但当与DNA整合技术结合时，这些方法可以产生稳定转染并表达转基因的细胞。DNA转座子是可以通过切割和粘贴机制在载体和染色体之间有效转座的移动DNA元素。PiggyBac（PB）和Sleeping Beauty（SB）是迄今为止最常用的两种转座子系统，与其他系统相比，在哺乳动物细胞中显示出最高的转座活性。通过将含有CAR的质粒和转座酶DNA转染到iPSC中，成功地稳定创建了表达CAR分子的CAR-iPSC-NK细胞。 与病毒载体相比，转座子系统提供了许多好处，例如较低的免疫原性、增加的生物安全性、降低的生产成本，以及能够转移基因片段，其载荷能力接近9-10 kb。这些优势使其成为将CAR整合到NK细胞基因组中以实现持久表达的一个有力选择。然而，要充分利用转座子系统对原代NK细胞进行转染，需要进行优化，例如通过电转染提高转导效率和细胞活性。 巨噬细胞比其他造血系统中的细胞更难转染和抵抗遗传操作，因为它们有能力识别并响应外来核酸。Bobadilla及其同事创建了一种基于HIV-1的慢病毒系统，该系统通过感染时Vpx诱导的SAMHD1降解，已被证明可以有效传递转基因到骨髓细胞。Klichinsky团队使用复制缺陷的嵌合腺病毒载体Ad5F35有效地传递CAR到巨噬细胞，并同时促进M1表型的表达，最终增强了肿瘤杀伤活性。这些结果强调了基因工程巨噬细胞在癌症免疫疗法中的潜力。与生成CAR-NK细胞的方法类似，转座子系统也被用来将感兴趣的基因整合到宿主基因组中。 4.1.新型细胞来源方法推动现成的免疫细胞治疗产品 迄今为止，所有商业批准的癌症免疫细胞疗法都依赖于自体使用，即使用的材料是患者自己的细胞。尽管这种方法已证明有效，但存在一些重要的限制，例如在处理快速癌症进展的患者时制造的不良等待时间，由于患者T细胞功能障碍可能导致的生产失败，与健康淋巴细胞一起提取的恶性白血病细胞污染产品的风险，高生产成本，标准化的复杂性，以及再剂量机会的限制。因此，当前的研究工作集中在开发同种异体疗法上，以克服自体疗法的限制。特别是，CAR-NK是一种有前景的同种异体细胞治疗，对实体瘤和血液系统恶性肿瘤均无重大毒性副作用。它是一种更简单、可再注射、更实惠的通用治疗。 然而，当前的治疗尚未显示出强大的疗效和/或长期持久性，并且NK细胞更难进行工程改造。CAR-NK细胞的研究主要在临床前和早期临床试验阶段，很少有临床试验报告。尽管如此，通用的同种异体CAR-NK细胞在癌症治疗中仍显示出巨大潜力。 目前，CAR-M主要是自体疗法，但“现成的”同种异体CAR-M已经出现并正在进行进一步研究。 在开发同种异体方法时，必须系统地解决最重大的风险：免疫排斥和GvHD（移植物抗宿主病）的发展。免疫排斥可能限制治疗的效力，因为接受者的免疫系统可能会排斥移植物。GvHD可能是致命的，由供体T细胞内源性的αβ TCR复合体识别宿主肽-人类白细胞抗原（HLA）复合体引起，导致组织损伤。为了解决同种异体风险，可以采用两种主要策略。第一种是在供体αβ T细胞上除了引入CAR转基因外，还进行额外的遗传修改。另一种是选择替代的细胞来源或亚群，如诱导多能干细胞（iPSCs）、脐带血（UCB）细胞、γδ T细胞、记忆T细胞亚群、病毒特异性T细胞（VST）等。 为了消除内源性αβ TCR介导的GvHD，最直接的方法是破坏编码T细胞受体恒定（TRAC）α链的基因。Eyquem等人开发了一个案例，通过腺病毒转染和CRISPR-Cas9敲入技术将CAR构建体整合到TRAC位点，同时诱导CAR表达和TCR失活。与随机整合相比，CAR表达可以由内源性TCR启动子调控，并在暴露于抗原时模仿TCR转录，防止恒定的和过度的T细胞激活，这可能导致T细胞分化和耗竭。此外，研究结果表明，这些TRAC-CD19 CAR-T细胞在ALL小鼠模型中显示出比用逆转录病毒编码的CAR的T细胞更大的抗肿瘤效力。 此外，除了CRISPR-Cas9，基因编辑技术，如TALENs和锌指核酸酶（ZFNs），也被发现在消除TCR表达以创建“通用”供体T细胞方面有效。然而，尽管TCR缺失的CAR-T细胞降低了GvHD的风险，但其长期持久性较短，可能是由于免疫排斥。因此，科学家们敲除了β2-微球蛋白（B2M）基因以限制HLA类I分子的表达。这种方法防止了异体CAR-T细胞通过它们的TCR被识别为外来物，但仍然容易受到宿主NK细胞的溶解。因此，一项研究使用突变的B2M融合蛋白来解决这个问题。为了在激活的异体CAR-T细胞生产过程中提高HLA-II消除的效率，一些学者提出抑制CIITA或HLA-DRA、HLA-DQA和HLA-DPA基因。 iPSCs具有无限的增殖和分化潜力，使它们成为创建众多同质HLA组合库的理想资源。通过从库中选择一个HLA匹配的iPSC来源，可以最小化宿主和移植物之间CAR-T细胞的免疫排斥风险，但必须进行严格的质量控制以确保安全，因为未分化的、增殖的iPSCs可能引发不良结果。Wang等人生成了缺乏HLA-I/II、B2M和CD155的低免疫原性iPSC衍生的CAR-T细胞。 研究通过体内发挥效应功能证明了它们抑制肿瘤进展的有效性。此外，iPSCs也为生产满足临床需求的CAR-NK和CAR-M细胞铺平了道路。与分化的NK细胞或巨噬细胞相比，iPSCs可以更有效地被工程化以稳定表达CARs。Li等人通过在培养基中添加各种细胞因子和促分化蛋白来分化CAR转染的iPSCs为CAR-NK细胞。这些iPSC衍生的CAR-NK细胞在体外和体内都显示出强大的抗肿瘤活性。Zhang等人建立了一个骨髓/巨噬细胞分化协议，诱导CAR-iPS向骨髓细胞系分化，成功产生了足够的CAR-iMac细胞（iPSC衍生的CAR-M细胞）。然而，当在小鼠模型中测试时，CAR-iMacs的有效性有限。总的来说，iPSC衍生的工程免疫细胞的发展涉及复杂的生产程序，需要精确的细胞产品制造和质量保证，以支持更广泛的临床应用。 γδ T细胞表达TCRγδ并以HLA独立的方式识别恶性细胞。它不需要消除TCR表达或信号，并且GvHD的风险低或不存在。研究表明，γδ CAR-T细胞显示出与传统的αβ CAR-T细胞相似或更大的细胞毒性效应，并且在体内没有观察到GvHD。然而，它们在体外的细胞毒性能力持续性较差。此外，针对CD20的γδ CAR-T细胞在B细胞淋巴瘤的动物模型中取得了有希望的结果，目前正在进行第一阶段的临床试验。 脐带血（UCB）提供了一个容易获得的NK细胞和同种异体T细胞来源。它们富含γδ T细胞和造血干细胞（HSCs），尽管总细胞数量有限。UCB衍生的CAR-T细胞在体内显示出增强的肿瘤抑制作用，减少了IL-10的分泌，并降低了调节性T细胞（Tregs）的比例，表明了改善的治疗潜力。Van Caeneghem等人从脐带血中分离出CD34+ HSCs，然后生成CAR-T细胞。这些CAR-T细胞具有原始表型（CD45RA+ CD62L+），并且不表达TCRαβ复合体，显著降低了GvHD的风险，并有效地消除肿瘤细胞。 记忆T细胞的特征是CD45RA−CD45RO+表型，它们不太可能发展为GvHD，也不太可能迁移到表现GvHD的器官。研究表明，T记忆干细胞（TSCM）和中央记忆T细胞（Tcm）与它们的分化对应物相比，具有优越的增殖和干细胞潜力，并且在T细胞转移后的临床研究中表现出高扩张和持久性。 VSTs拥有能够识别病毒抗原的TCR，如巨细胞病毒（CMV）、Epstein-Barr病毒（EBV）等。经过CAR改造的VSTs在实体瘤中显示出有希望的结果，但与CARs相比，工程化针对肿瘤的转基因TCR VSTs更具挑战性。在肿瘤细胞中表达EBV相关抗原的霍奇金淋巴瘤患者中，输注CAR-VST细胞取得了良好的耐受性和缓解率。针对HER2的CAR-VST细胞产品在CMV血清阳性和进行性胶质母细胞瘤患者的第一阶段临床试验中显示出既安全又临床有效。值得注意的是，可以建立VST库，以覆盖大多数患者，并促进CAR-T或TCR-T重定向到肿瘤的临床使用。 PBMCs通常来自外周循环或脐带血等。它是临床目的的主要NK细胞来源。PBMC衍生的NK（PB-NK）细胞可以从HLA匹配和不匹配的供体中分离出来，扩大了潜在供体池。通常，它们显示出成熟的表型，增殖能力降低，细胞毒性增加，没有GvHD的风险。Töpfer等人已经证明，表达CAR的NK细胞系YTS以及PB-NK细胞可以成功地重定向针对前列腺干细胞抗原（PSCA）阳性肿瘤，导致大部分治疗小鼠的肿瘤被完全根除。一种短暂表达针对间皮素的mRNA CAR，MCY-M11的CAR-PBMC细胞产品已进入临床试验，它是一种混合产品，包含不同的CAR工程T细胞亚群、单核细胞和B细胞群体，展现出理想的功能和免疫表型特征。 NKT细胞，也称为CD1d限制性T细胞，是一类同时具有T细胞和NK细胞特性的异质性T细胞群。这些细胞主要识别非多态性CD1d分子，这是一种结合自身和外来脂质以及糖脂的抗原呈递分子。I型NKT细胞或称为iNKT细胞不具有HLA限制性，可能作为通用供体细胞发挥作用，但其在体内的持久性尚未知晓。研究表明，CAR19-iNKT细胞表现出抗淋巴瘤活性，并且具有增强的消除脑淋巴瘤的能力。另一种异体NKT细胞，表达带有CD28和IL-15的抗CD19嵌合受体，目前正在进行临床试验，针对复发或难治性B细胞恶性肿瘤患者（NCT03774654）。 4.2.改善肿瘤微环境以增强治疗性免疫细胞的效果 免疫细胞治疗实体瘤的效果受限于低持久性和注入后的不充分增殖，这在很大程度上归因于免疫抑制微环境，它不是被动的旁观者，而是癌症进展的积极推动者。肿瘤细胞居住在这个由浸润和驻留宿主细胞（如T细胞和巨噬细胞）、分泌因子（如IL-10和转化生长因子-β（TGFβ））以及细胞外基质（ECM）组成的异质微环境中。这些组分可以相互作用，为恶性细胞的生长、迁移和转移创造支持性环境，从而逃避免疫系统和肿瘤特异性细胞毒性T细胞。为了根除肿瘤，科学家们开发了几种策略来促进CAR工程或TCR工程治疗性免疫细胞向癌症焦点的迁移和渗透，包括利用趋化因子受体如CCR2、CXCR2、CCR4、CXCR4等。这些研究表明，CAR-T、TCR-T和NK细胞显示出增加的肿瘤渗透率，导致肿瘤退缩和增强的抗肿瘤效果。然而，将基因工程免疫细胞渗透到肿瘤中只是抗癌的第一步。有时，可能需要直接转化方法来修改免疫抑制微环境。使用免疫检查点抑制剂，如抗PD-1、抗PD-L1抗体和抗CTLA4抗体，可以改善免疫抑制肿瘤微环境。然而，它可能导致药物抗性的出现、T细胞耗竭和复发，有时甚至会导致危及生命的毒性。在肿瘤微环境中阻断TGF-β信号是另一种提高检查点抑制剂效果和增强抗肿瘤反应的方法，因为它在肿瘤信号、重塑和代谢中起着至关重要的作用。临床证据也表明TGF-β信号与对检查点阻断剂无反应的患者之间存在相关性。为了解决这个问题，已经开发了双功能抗体-配体陷阱，使用针对CTLA-4或PD-L1的抗体与TGFβ受体II外域（TGFβRIIecd）融合。它可以在肿瘤微环境中隔离TGF-β，耗尽调节性T细胞，并促进CTL共刺激。此外，通过转导优势负性TGFβ受体-II（dnTGFβRII），开发了对TGFβ有抵抗力的肿瘤特异性T细胞，并已在动物模型和临床研究中显示出治疗益处。另一种新策略是利用肿瘤微环境中高浓度的免疫抑制信号分子，通过引入嵌合开关受体（CSR），如PD-1:CD28、TIGIT:CD28、CTLA-4:CD28、TGF-βRII:4-1BB、Fas:4-1BB。CSR由PD-1、CTLA-4或TGF-βRII的细胞外域和CD28或4-1BB的细胞内域组成。T细胞与CSR一起被转导，与CAR或TC共表达，以产生工程化CTL。这些工程化CTL仍然与肿瘤细胞上的免疫抑制分子相互作用，但通过细胞内域传递共刺激信号而不是抑制信号。最近，这一策略已经进行了临床测试。这些工程化细胞被发现能有效克服免疫抑制肿瘤微环境，例如分泌更多的IFN-γ，积聚在肿瘤中，并展现出优越的抗肿瘤功能。细胞外基质为各种抗癌疗法创造了物理屏障。然而，巨噬细胞在调节ECM和展示肿瘤归巢行为方面发挥着关键作用。CAR工程巨噬细胞被证明能主动迁移到肿瘤部位，可以作为药物递送系统在抗原特异性环境中局部递送细胞因子和/或细胞毒性物质，显著改变免疫抑制肿瘤微环境，并通过吞噬作用消除肿瘤细胞。张等人使用CAR修饰的巨噬细胞解决了ECM引起的免疫细胞渗透不足的问题。体外研究表明，CAR-147巨噬细胞能够重塑肿瘤的ECM，诱导CD3+ T细胞渗透，并提高肿瘤微环境中IL-12和IFN-γ的水平，最终展现出抗肿瘤效果。 4.3.临床研究进展 从临床进展的角度来看，自2017年FDA批准首个CAR-T细胞疗法产品以来，全球已有10个CAR-T产品获得批准（补充表1）。自2013年以来，CAR-T、CAR-NK和TCR-T疗法的临床研究迅速增加，到2022年CAR-T细胞疗法的数量达到258例，值得注意的是，2023年的数据来自1月至10月（图2A）。从国家角度看，高风险细胞疗法的临床研究主要分布在美国和中国，占全球研究的80%以上（图2B）。CAR-T疗法的主要临床治疗靶点是CD19、CD22、CD20和B细胞成熟抗原（BCMA）。在血液肿瘤中，增长最快的适应症是淋巴瘤和骨髓瘤。目前，TCR-T有一种治疗产品在市场上，用于转移性葡萄膜黑色素瘤。总的来说，TCR-T在实体瘤中的进展速度比血液肿瘤快（图2C）。TCR-T的靶抗原主要集中在MART-1、HPV16-E6、NYESO、HPV16-E7等。在病症方面，TCR-T的临床研究主要用于实体瘤的治疗。这些实体瘤大多与病毒感染有关，如与人类乳头瘤病毒（HPV）感染相关的宫颈癌。此外，TCR-T在头颈、肝脏和结肠癌症的临床研究正在迅速进展（图2C）。就CAR-NK病症而言，血液肿瘤仍然是进展最快的，其中淋巴瘤病症的进展速度更快（图2C）。 图2. CAR-T、TCR-T和CAR-NK疗法的临床试验。临床试验数据统计。(A) 2018年至2023年细胞疗法临床研究的数量，分为CAR-T、TCR-T和CAR-NK几组。(B) 按国家分组的细胞疗法临床研究数量，同样分为CAR-T、TCR-T和CAR-NK几组，Y轴在50到450之间中断。(C) 针对不同适应症的细胞疗法药物的临床进展，细胞疗法药物的分组与(A)相同，适应症分为液体和固体肿瘤两组。原始数据下载自https://classic.clinicaltrials.gov/，更新至2023年10月30日。CAR-T：嵌合抗原受体T细胞；CAR-NK：嵌合抗原受体自然杀伤细胞；CNS：中枢神经系统；HPV：人乳头瘤病毒；TCR-T：T细胞受体T细胞。 CAR-NK的临床治疗靶点主要是血液肿瘤的CD19、CD22和BCMA，以及实体瘤的PSMA、HER2、ROBO1和MUC1。总的来说，TCR-T和CAR-NK仍处于早期临床开发阶段。到目前为止，CAR-M的临床研究仍处于起步阶段，只有一个I期临床试验（NCT04660929）。图2的数据可从补充表2获得。 5.结论与展望 免疫细胞治疗在肿瘤治疗中变得越来越重要。与替代免疫治疗方法（如免疫检查点抑制剂和细胞因子）相比，免疫细胞治疗表现出了优越的疗效、特异性，并倾向于引起可接受的副作用。当作为某些癌症的独立治疗时，特别是采用性T细胞转移疗法，在血液系统恶性肿瘤如白血病和淋巴瘤中显示出了显著的成功。然而，由于免疫抑制肿瘤微环境、肿瘤异质性、靶标抗原表达低等因素，一些实体瘤对单独的免疫细胞治疗更具挑战性。在许多情况下，转向另一种免疫细胞治疗或将免疫细胞治疗与其他治疗策略（如化疗、放疗、其他免疫治疗或靶向治疗）结合起来被认为是有益的，可以通过不同的机制增强整体治疗效果。目前，全球已有10个CAR-T产品获批，而DC疫苗和TCR-T各有一个获批产品。在低风险免疫细胞治疗方面，TIL和DC疫苗在治疗实体瘤方面显示出了希望。此外，CIK治疗与其他免疫策略结合使用时显示出协同的抗肿瘤效果。这些方法通常由具有不同功能特征的异质细胞组成，在治疗相对高异质性的恶性肿瘤方面具有优势。另一方面，高风险免疫治疗如CAR-T和TCR-T通常是定向的和高度特异性的，使它们特别适合相对快速增殖的恶性肿瘤。在血液肿瘤中，CAR-T和TCR-T已经得到了临床验证，它们在治疗实体瘤方面的应用正在稳步进展。而基于其生物学特性，CAR-NK和CAR-M在治疗实体瘤方面具有固有优势。TCR-T专注于特定的肿瘤相关抗原和新抗原，使它们在外来抗原如病毒相关恶性肿瘤方面受益。研究人员目前正在努力突破包括CAR-T在内的细胞治疗技术的瓶颈。新的细胞来源和降低GvHD风险和其他风险的方法为“现成的”或同种异体细胞治疗创造了机会，这些治疗可以事先准备并在需要时轻松地给多个患者使用，实现更快的诊断和癌症治疗。此外，针对CAR的新颖设计最小化了对健康组织的损害，并与传统治疗相比减少了副作用。某些设计甚至为治疗实体瘤提供了可能性。此外，修改肿瘤环境和诱导记忆T细胞的策略使得实现长期效果成为可能。同时，由于这些疗法新颖、复杂和技术性，它们可能对公共卫生和个体患者构成以前未探索的风险。TIL细胞治疗、DC/CIK细胞治疗和DC疫苗被认为是低到中等风险。风险因素包括生产中使用的生物活性物质，如抗体、细胞因子、血清、生长因子和抗生素，以及在保存、冷冻、解冻和冷链运输过程中的产品稳定性和活性风险。此外，产品本身可能存在固有风险，如不完全去除肿瘤细胞或其他不需要的细胞，以及与归巢、植入、迁移和增殖相关的潜在并发症或降低的产品活性。然而，高风险免疫疗法需要更多的操作，使用基因修饰细胞、自体干细胞或同种异体或异种细胞，这需要额外的评估。在临床上，这些疗法有时可能引发细胞因子风暴和细胞因子释放综合征（CRS），这两种都是危及生命的全身性炎症综合征。因此，这些产品的风险管理考虑相应更具挑战性。必须仔细评估产品与患者相互作用产生的即时和延迟影响的潜在风险。这些风险包括不需要的免疫原性及其相关效应，包括CRS、GVHD、移植物排斥、过敏反应、超敏反应和免疫缺陷。此外，评估与患者细胞的预期和非预期遗传修饰相关的潜在风险也很重要，包括细胞功能、细胞凋亡、生长或分化的变化、插入性突变或遗传毒性以及恶性转化的可能性。然而，准确评估免疫细胞治疗的风险仍然具有挑战性。一些真正的风险超出了预期或在临床前研究中没有被揭示。重要的是要理解风险在临床研究中无处不在，它被定义为在特定时间框架内发生不利结果的可能性。评估可接受的免疫细胞治疗风险水平涉及权衡各种因素，而不仅仅是绝对风险，而是可能随之而来的潜在治疗益处。与患有较轻微肿瘤或癌症适应症且存在适当治疗方法的患者相比，患有危及生命的晚期或严重恶性肿瘤的患者可接受的风险水平要高得多。总的来说，免疫细胞治疗的技术障碍相对较高，创新动力强，技术发展多。近年来进展呈爆炸性增长。尽管CAR-T、TCR-T和DC疫苗已获批准，但其他免疫细胞治疗仍处于早期临床和临床前研究阶段。低风险疗法如TIL面临由于无法完全消除Tregs而有限的效力。CIK细胞治疗在获取和扩增方面遇到困难。DC肿瘤疫苗受到缺乏理想的肿瘤特异性抗原、TAA免疫原性弱、难以高效诱导免疫原性DC以及体外DC致敏方法的静脉回输无法有效激活DC分化和成熟的影响。高风险细胞治疗在克服肿瘤异质性的障碍方面仍有很长的路要走。CAR-T细胞仍面临效应T细胞耗竭、细胞因子风暴和免疫抑制微环境等挑战。TCR-T细胞治疗的挑战包括如何减少TCR不匹配和针对新抗原的最小选择。CAR-NK疗法正在经历遗传操作和细胞增殖困难。尽管CAR-M可能成为有希望的抗癌疗法，但它们尚未完全实现。临床研究需要确认肿瘤相关巨噬细胞在决定TME是否可以将肿瘤靶向CAR-M转化为肿瘤支持表型方面的高适应性。然而，免疫细胞治疗在抗癌疗法的未来开发中仍具有至高无上的潜力。人们普遍认为，快速的技术创新将使这些疗法成为高效的癌症治疗手段，显著改善治疗效果，推进人类医疗保健。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。