I2R

需要指出的是，尽管9087及其类似物的镇静副作用更低，但是其有效剂量要远高于dex，而且其作用机理和靶标也需要更深入的研究来解释。 近日，由蒙特利尔大学的Michel Bouvier，香港中文大学（深圳）的杜洋，加利福尼亚大学旧金山分校的Brian K. Shoichet和Allan I. Basbaum，以及埃朗根-纽伦堡大学的Peter Gmeiner联合领衔的研究团队，在《科学》期刊上发表了有关止痛药的重要研究成果[1]。 他们将目光聚焦于α2AAR，通过分子对接，从超过3亿个分子中，筛选出了若干个特异性靶向α2AAR的激动剂。在小鼠模型中，这些分子通过注射或者口服均能达到镇痛效果，且在有效剂量下没有镇静的副作用。 论文首页截图 接下来我们就一起来看看这个研究是如何展开的。 研究人员首先进行了分子对接实验。由于目前还没有α2AAR晶体结构的报道，研究人员使用了与α2AAR具有相似活性位点，且晶体结构已知的α2B-肾上腺素受体（α2BAR）。 他们将人α2BAR的晶体结构与3.01亿个分子进行对接试验，得到了64个评分高的结构，之后合成了其中的48个分子。其中，有30个分子与α2BAR的结合常数（Ki）都低于10uM，成功率达到63%，表现最好的分子ZINC1173879087（之后简写为9087），Ki达到1.7nM。 实验显示大部分分子都是α2BAR和α2AAR部分或者完全激动剂。其中有四个激动效果最好的分子，编号分别为：9087、4622、2998、0172。 生物发光共振能量转移（BRET）等实验表明，它们能激活α2AAR-Gi通路，效果可以达到去甲肾上腺素（NorEpi）的60-95%，EC50能达到9.7-210nM。α2AAR作为G蛋白偶联受体（GPCR），其激动剂既可能激活下游G蛋白的α亚基（Gi、Go或者Gz），从而发挥止痛功效，也有可能通过募集β-抑制蛋白，产生受体内化等作用。 9087以及其类似物7075、PS75均为Gi的部分激动剂，与实验中用到的NorEpi、dex、氯压定（clon）等已知的α2AAR的激动剂相比，筛选出的新分子大多能特异性激活Gi、Go和Gz通路，在有效浓度下，对β-抑制蛋白的募集作用可以忽略不计（0172除外），并且没有受体内化现象。 新激动剂（下）与已知激动剂（上）的的结构比较 Gi1激活（左）和β-抑制蛋白募集（右）实验 在筛选出以上四个最有潜力的激动剂分子（9087、4622、2998、0172）之后，研究人员使用冷冻电镜解析出了9087-α2AAR-GoA和4622-α2AAR-GoA的晶体结构，阐明了这些新配体如何与α2AAR相互作用。 尽管9087与dex和NorEpi一样都能与保守位点D128形成相互作用，但是分子朝向和作用方式非常不一样，而这也预示着9087及其类似物很可能是与现存激动剂作用方式不同的新型α2AAR激动剂。 9087-α2AAR-GoA的晶体结构 接下来，研究人员开展了基于9087的结构优化和构效关系分析。 他们发现，替换掉吡啶环、二级胺或者双环结构都会降低激动效果，他们还通过变换取代基获得了若干EC50更低的分子。 基于0987的结构优化和构效关系分析 随后研究人员进行了特异性和药代动力学测试。他们测试了320个GPCRs、µ-阿片受体、hERG（心脏安全相关基因）以及其他肾上腺素受体，9087均未表现出高亲和力。这证明9087的脱靶效应低，可能引发的副作用小。 值得注意的是，咪唑啉-2受体（I2R）是α2AAR激动剂的常见脱靶靶标，9087对α2AAR的亲和力是I2R的6倍，证明了其良好的特异性。之后他们进行了药代动力学测试，让人惊喜的是，无论通过注射或者口服，9087均能透过血脑屏障，在脑脊液中达到有效浓度。 在证明了新分子具有良好的特异性和生物利用度之后，研究人员在小鼠模型上测试了其止痛效果。在健康小鼠上使用9087（5mg/kg），没有增加机械缩足阈值，证明9087不会改变健康小鼠的疼痛阈值。 随后，他们给保留性神经损伤小鼠模型（SNI模型，小鼠由于部分周围神经损伤，对机械痛更加敏感）皮下注射9087，发现机械缩足阈值呈现剂量依赖性增加，从3mg/kg到5mg/kg有大幅度增加，之后便不再增加，处于平稳状态。 低剂量时（<5mg/kg），9087能减轻SNI小鼠对机械痛的敏感程度；高剂量（≥5mg/kg）时，9087的镇痛效果能将机械缩足阈值提高到比损伤前还要高的程度。 新激动剂在健康小鼠（左边3列）和SNI小鼠（右边15列）内对机械痛的作用效果 在完全弗氏佐剂（CFA）诱发的炎症疼痛小鼠模型中，9087可以提高热刺激缩足反应潜伏期。 以上两个实验证明，在小鼠模型中，9087可以缓解由组织和神经损伤导致的疼痛。 除此之外，他们还通过热板和尾闪实验，证明了9078可以缓解急性热刺激疼痛。 新配体在尾闪实验（左）、热板实验（中）、炎症疼痛模型（右）中的效果 为了验证9087是否有镇静的副作用，研究人员让使用高剂量9087的小鼠进行了滚轮跑步机实验，结果发现20mg/kg的9087也未能影响小鼠的运动表现。这证明9087不像dex一样有镇静的副作用。 接下来研究人员研究了9087镇痛的机理。 他们发现，使用广谱α2-肾上腺素受体（α2AR）的拮抗剂阿替美唑之后，9087就不再有止痛效果。然而，在使用点突变使α2AAR失活后（D79N），9087仍有镇痛效果，但是效果不到未突变组的50%。 这些实验结果表明，9087的镇痛效果虽然大部分是由于激活α2AAR引发的，但是可能也存在着其他靶标。 使用广谱拮抗剂后（左）和点突变使α2AAR失活后（右）新激动剂的镇痛效果 最后，研究人员测试了9087是否有止痛药的一些常见副作用。 好消息是，9087（10mg/kg）没有导致体重增加或是便秘等常见的α2AAR激动剂的副作用。除此之外，研究人员也测试了其他待选分子，它们虽然也有镇痛效果，但是整体来说还是9087的效果更好，副作用更低。 总的来说，这个研究通过大型分子库的对接试验，筛选出了一系列与已知α2AAR激动剂结构有较大差异的配体结构。这些分子特异性靶向Gi/o/z通路，其中分子9087及其类似物具有良好的口服生物利用度和镇痛效果，并且没有镇静的副作用，是非常有潜力的镇痛药候选分子。 需要指出的是，尽管9087及其类似物的镇静副作用更低，但是其有效剂量要远高于dex，而且其作用机理和靶标也需要更深入的研究来解释。