CD27 x PDL1

摘要：过继免疫治疗使用嵌合抗原受体（CAR）重定向的T细胞是一种新的治疗范式，它使用一类新的治疗“药物”在某些迄今为止难以治疗的B细胞恶性肿瘤患者中产生完全且持久的缓解。CAR T细胞源自患者自身的免疫细胞，这些细胞在体外通过基因工程改造，带有能够结合特定目标并在目标结合时传递激活信号的CAR。CAR激活细胞毒性T细胞以有效、重复和持久的方式破坏和消除识别的癌细胞。然而，各种障碍限制了CAR T细胞在其他类型的癌症或其他疾病中的广泛应用。目前的挑战包括设计最优的CAR、积极穿透肿瘤病变，并在不诱导对健康组织产生毒性的情况下维持T细胞的抗肿瘤激活。本章回顾了CAR的代际、增强CAR T细胞效力和选择性的策略，以及为日益增多的患者建立高效的制造流程。 1.原型嵌合抗原受体（CAR，T-Body，免疫受体） 在20世纪80年代中期，Steven A. Rosenberg（美国国立卫生研究院）将从黑色素瘤活检中分离并大量体外扩增的肿瘤浸润性淋巴细胞（TILs）重新注入黑色素瘤患者体内时，患者T细胞识别和有效摧毁癌细胞的能力变得显而易见。这些以及随后的发展促使了采用自体免疫细胞治疗肿瘤患者的概念，这些免疫细胞有能力在大量患者中诱导肿瘤退缩和长期缓解。这些扩增的TILs被认为对特定肿瘤抗原具有特异性，并具有迁移能力以进入肿瘤病变；然而，抗原特异性大多仍然未知。 接下来的几年中，为了给患者的T细胞提供明确的靶向特异性，人们付出了巨大的努力；与T细胞受体（TCR）链或重组嵌合抗原受体（CAR）的遗传工程化，证明是成功的策略之一。与TCR不同，CAR是一个复合的、单多肽链跨膜受体，它在目标识别时提供靶向特异性和T细胞激活能力。原型CAR由四个主要结构域模块化组成：在细胞外末端是用于目标识别的单链可变区（scFv）抗体，一个连接到跨膜结构域的间隔区，以及主要来自TCR/CD3ζ或Fcε受体I（FcεRI）的细胞内信号传导结构域，有或没有连接的共刺激结构域（图1）。目标细胞表面的同源抗原的参与启动了CAR工程化免疫细胞的激活，导致持久的T细胞反应。每个CAR结构域都有独特的功能，并对重定向的T细胞激活产生影响；对于每个特定应用，CAR设计需要进行一些调整，以提供优化的靶向和T细胞激活，如下文详细描述。 图1 嵌合抗原受体（CARs）的世界在不断增长。第一代CAR在细胞外域（外域）中拥有抗原结合和间隔基团，在跨膜域中，在细胞内域（内域）中拥有来自CD3ζ或FcεRI γ链的激活基团。第二代CAR除了拥有一个共刺激域之外，第三代CAR在内域中拥有两个共刺激域。第四代CAR（“TRUCK”，“T细胞重定向用于通用细胞因子介导的杀伤”）由第二代或第三代CAR组成，该CAR在CAR信号传导后诱导转基因蛋白的表达。虽然在规范设计中描绘，但已经工程化了大量CAR变体，每种变体都针对不同的应用进行了优化。 原型CAR的基本设计最初由Zelig Eshhar及其同事（魏茨曼科学研究所）提出，他们展示了一个模块化复合受体，最初命名为“T-Body”或“免疫受体”，具有用于结合的抗体衍生结合域和用于T细胞激活的TCR信号域，为工程化T细胞提供了特异性识别和激活。在随后的几年中，引入了许多修改，允许靶向广泛的抗原，并通过各种细胞内结构域发送信号，以启动和重定向定义的免疫细胞功能（表1）。 表 1 CAR构建模块及其替代模块。 EMA（欧洲药品管理局）批准。其他使用其他宿主细胞和不同CAR设计的应用程序也在早期临床试验中越来越多地被研究。 规范的CAR由抗体衍生的结合域、间隔区、跨膜域和细胞内主要及共刺激信号域模块化组成。每个结构域可以通过不同的模块构建，这些模块影响不同的变量，并最终影响T细胞的激活和性能。 CAR工程化的细胞毒性T细胞重定向至癌细胞是该技术研究最多的应用；自体抗CD19 CAR T细胞的过继转移成为美国食品药品监督管理局（FDA）批准的首个基因工程细胞疗法；随后，欧洲药品管理局（EMA）也批准了。使用其他宿主细胞和不同CAR设计的其他应用也越来越多地在早期临床试验中研究。 2.CAR的模块化组成：细胞外CAR结构域 2.1.结合域 抗原结合域传统上由来自小鼠或人类单克隆抗体的单链可变区（scFv）组成。通过短柔性连接子（通常是(Gly4Ser)3肽）将重链（H）和轻链（L）抗体链的可变（V）区域连接起来，形成VH-linker-VL或VL-linker-VH的顺序。甘氨酸残基提供了灵活性，以允许VH和VL正确折叠形成抗原结合口袋，而丝氨酸则为连接子提供了一些溶解性。VH和VL链的空间位置和相互作用可以显著影响亲和力、特异性和溶解性。足够高的结合亲和力对于诱导T细胞激活至关重要；然而，存在一个亲和力上限，超过该上限CAR介导的T细胞激活不会改善，但会导致激活诱导的细胞死亡（AICD）。在CAR的背景下，一些scFvs通过张力信号独立于抗原参与诱导AICD、耗竭和T细胞的终端分化。除了亲和力和细胞表面的抗原密度外，目标表位在抗原内的位置也很重要；通常，靶向膜近端表位比靶向膜远端表位诱导更强的T细胞激活。 通过使用抗体进行靶向，CAR介导的识别是MHC独立的。这在靶向MHC-肽处理和呈递机制有缺陷的肿瘤时是有益的。此外，通过抗体识别目标，还可以识别传统T细胞看不见的抗原，如碳水化合物、脂质或抗原的结构变体。规范的CAR识别目标细胞表面的抗原；也可以通过使用特异性针对定义的MHC-肽复合物的抗体，工程化MHC-肽识别CAR，使其能够感知由MHC呈递的细胞内抗原。例如，一个scFv识别HLA-A2背景下的NY-ESO-1肽的CAR提供了与相应TCR类似的TCR样识别目标。 2.CAR的模块化组成：细胞外CAR结构域 2.2.间隔区 原型CAR经常在抗原结合域和跨膜域之间包含一个“间隔区”，以便接近目标抗原；连接的铰链区提供了一定的灵活性。间隔区的类型和长度对于最佳目标结合和信号传递至关重要。间隔区并非必需，因为有些CAR在scFv直接融合到跨膜域时是活跃的，而其他CAR只有在具有一定长度的间隔区时才活跃。间隔区通常来源于IgG1或IgG4恒定域或来自细胞外CD28、CD4或CD8（图2）。一般的想法是，间隔区在工程化T细胞和相应目标细胞之间提供最佳距离，以允许与目标细胞形成有效的接触区。基于TCR-MHC相互作用的知识，人们普遍认为CAR-目标相互作用需要在T细胞和目标细胞之间创建约15纳米的距离，以最佳形成接触区。因此，针对膜近端表位需要较长的间隔区，而较小的间隔区对更远离膜的表位是最佳选择；通过使用不同长度的间隔区可以轻松调整距离。在这个背景下，IgG衍生的间隔区具有可以通过结合一个、两个或三个CH1-CH2-CH3部分来调整长度的优势。IgG1衍生的间隔区还有利于CAR分子的稳定；然而，它可能与髓系细胞上的Fcγ受体（FcγR）（CD64）结合，介导CAR T细胞和髓系细胞的“非肿瘤”激活。这可以通过删除间隔区内的IgG1 CH2域或通过删除IgG1 Fc受体结合部分内的Asn297糖基化位点来预防。类似的修改也可以引入到IgG4间隔区。 图 2 第二代CAR设计的变体。由于模块化组成，可以使用各种替代域来构建CAR，其中一些示例性地列出。各个组分的变化允许调节CAR的结合和信号传导，最终调节细胞功能、代谢和工程化T细胞的抗肿瘤活性。其他变体旨在提高结合亲和力、目标的可及性、信号强度和细胞膜上的持久性等。最后，安全预防措施导致CAR设计中进一步的修改。 2.3.跨膜区 典型CAR的跨膜区来源于如CD3ζ、CD4、CD8α、CD28或OX40等类型1跨膜蛋白，由20-23个疏水性氨基酸组成，富含亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸（图2）。带有CD3ζ跨膜域的CAR似乎比其他CAR更有效地整合到TCR/CD3复合体中，因此在表达和信号传导方面更为稳健；带有CD28跨膜区域的CAR似乎同样稳定。另一方面，带有CD8α铰链和跨膜域的CAR不易于AICD；然而，它们通过减少促炎细胞因子的释放来介导较少的T细胞激活。 2.4.细胞内信号传导域 “第一代”CAR完全通过主要信号传导域（信号-1）进行信号传导。TCR/CD3ζ细胞内链含有三个免疫受体酪氨酸激活基序（ITAMs），FcεRI γ链含有一个ITAM，这些在磷酸化后作为下游信号蛋白的特定适配器。因此，CAR利用内源性TCR信号机制来启动T细胞激活事件的级联。下游激酶如Lck或Fyn也可以作为CAR介导的T细胞激活的主要信号，等等（图2）。CAR信号传导域本身足以与下游激酶结合并启动有效的激活级联，因为CAR在TCR敲除细胞和非T细胞如NK细胞中也是功能性的。然而，仅有主要信号的CAR不足以激活以允许长期持久；这样的CAR T细胞迅速进入凋亡。根据“双信号假说”，静息T细胞还需要一个共刺激信号以持续激活。这就是将主要信号与共刺激信号（信号-2），如CD28或4-1BB（CD137），结合在“第二代”CAR中的理由。也在临床前和临床上探索带有替代共刺激域的CAR，如OX40、ICOS、CD27、CD40-MyD88、CD2和CD244。为了方便下游激酶的接近，CD28通常位于膜近端位置，随后是远端位置的CD3ζ；OX40和4-1BB在膜远端和近端位置都活跃。与第一代CAR相比，第二代CAR T细胞在细胞因子释放、扩增和抗肿瘤活性方面显示出稳健和持久的反应。 CAR介导的共刺激以不同的方式影响T细胞效应功能、存活、持久性和代谢。例如，4-1BB CAR T细胞在患者血液中的持久性超过6个月，而CD28 CAR T细胞在3个月之后大多无法检测到。经过重复刺激后，CD28 CAR T细胞重新编程为CD45RO+ CCR7−效应记忆细胞，这些细胞随后需要OX40来延长持久性并避免快速耗竭；4-1BB CAR T细胞主要转化为CD45RO+ CCR7+中央记忆细胞，并在外围血液中长期持久。CD28 CAR信号激活PI3K/Akt/mTOR途径，刺激有氧糖酵解，增加葡萄糖摄取和ATP生成，而4-1BB CAR信号激活Wnt/β-catenin途径和脂肪酸氧化，增加代谢和线粒体呼吸链能力。典型的Wnt/β-catenin有利于中央记忆细胞的形成和T细胞的长期存活，而CD28诱导的PI3K/Akt信号维持效应细胞的即时响应。在高剂量下，CD28和4-1BB CAR T细胞都能在临床前模型中根除大型已建立的肿瘤；在低剂量下，CD28 CAR T细胞比4-1BB CAR T细胞表现出更大的耗竭程度，结果是4-1BB CAR T细胞在长期内更有效地根除大型肿瘤负荷。另一方面，带有4-1BB CAR的T细胞仍然对肿瘤介导的通过TGF-β的抑制敏感，这对CD28 CAR T细胞来说较少见。因此，选择CAR设计的标准取决于多个参数，包括T细胞持久性、抗抑制能力、共刺激和共抑制配体的模式、肿瘤细胞上的抗原密度、T细胞上的CAR密度等。 “第三代”CAR结合两个共刺激域以及主要激活信号。联合共刺激的好处只在少数情况下得到证明，例如，通过CAR提供CD28-OX40共刺激对T细胞在终端成熟中的进展有益。 3.TRUCK：“第四代”CAR T细胞 CAR T细胞可以用来按需将转基因蛋白输送到预定的、靶向的组织。因此，CAR T细胞被设计成带有CAR诱导表达盒的额外“有效载荷”。所谓的“第四代”CAR T细胞，即TRUCKs（“T细胞重定向用于通用细胞因子介导的杀伤”），旨在在靶向组织中沉积分泌型转基因蛋白，以实现治疗有效浓度（图3）。“有效载荷”的表达受NFAT6-IL-2最小启动子的控制，该启动子在CAR信号传导时被激活；有效载荷可以是转基因编码的任何蛋白或肽。这种策略特别有趣，因为它结合了重定向CAR T细胞攻击和局部沉积的生物活性蛋白的作用，同时避免了系统毒性。只要CAR T细胞保持激活状态，TRUCKs就会沉积转基因产物，例如，IL-12或IL-18作为转基因免疫调节剂，以特定方式塑造靶向肿瘤环境，而不引起系统毒性。累积的TRUCK产生的IL-12在CAR靶向的肿瘤组织中招募天然免疫细胞，如NK细胞和巨噬细胞，在那里反过来启动二次抗肿瘤免疫反应。IL-12 TRUCKs抵抗Treg细胞的抑制，并显示出增加的细胞因子释放和扩增。当快速进展的肿瘤积累抗原丢失的癌细胞，导致对CAR T细胞不可见的肿瘤复发时，这种策略特别有趣。释放IL-18的TRUCKs将CAR T细胞转化为T-bet高FoxO1低效应细胞，抵抗耗竭并显示出对大型已建立肿瘤的优越细胞毒性。IL-18 CAR T细胞治疗改变了整个肿瘤免疫细胞景观，特别是通过增加CD206− M1型巨噬细胞和NKG2D+ NK细胞的数量，减少抑制细胞如Tregs、抑制性CD103+ DCs和M2型巨噬细胞。其他例子包括释放过氧化氢酶以保护T细胞免受过氧化压力介导的抑制和释放肝素酶以改善T细胞通过肿瘤基质的穿透。 图 3 第四代CAR T细胞（“TRUCKs”）。在抗原结合时，第二代或第三代CAR诱导表达一种转基因蛋白，该蛋白在细胞内作用、整合到膜中或由CAR T细胞释放。释放的转基因蛋白旨在改变肿瘤环境、重塑肿瘤组织或吸引二次免疫反应。CAR T细胞被诱导仅在CAR与其靶标结合时释放蛋白质，从而将“有效载荷”在预定义的交付点作为“TRUCK”进行交付。这种CAR T细胞被理解为“活体工厂”，用于精确和持续地交付治疗性细胞产品。 所谓的“装甲CAR”通过产生4-1BB配体提供增加的共刺激通过刺激4-1BB途径。工程化的T细胞被设计为分泌Toll样受体（TLR）配体，可以刺激T细胞和抗原呈递细胞上的TLR途径，然后可以激活一组T细胞进行广泛的抗肿瘤攻击。靶向Muc16ecto（即黏蛋白-16（CA-125）的膜保留残余物）并分泌IL-12的CAR T细胞正在临床试验中评估（NCT02498912）。IL-15 TRUCK细胞显示出改善的扩增和抗肿瘤活性，但在未受控制的扩增情况下需要自杀基因，由于其白血病潜力。“装甲”CAR通过与CAR共表达IL-7受体-α链来恢复对IL-7的反应性，并促进Th1反应。类似地，在IL-4水平增加的前列腺癌中，共表达IL-4结合/IL-7信号传导受体提高了抗PSCA CAR T细胞的抗肿瘤活性。另一方面，CAR T细胞上共表达的显性负性TGF-β DNRII受体可以在TGF-β存在的情况下与TGF-β竞争，以改善T细胞的抗肿瘤活性。也可以设想提供细胞因子或细胞因子受体之外的应用，如输送可溶性HVEM外域，以靶向肿瘤血管，以维持肿瘤穿透。 4.具有双重特异性、组合抗原识别和条件性CAR的CAR T细胞 原型CAR通过一个scFv将特异性重定向到一个抗原；多种原因要求具有多重特异性的CAR：(1)肿瘤病变在可靶向抗原方面可能是异质的，或在肿瘤进展过程中丢失抗原；(2)靶向癌细胞和肿瘤基质或血管可能有益或需要增加治疗效果。将两种或更多CAR T细胞产品应用于癌症患者基本上是可行的，尽管需要在GMP条件下制造两种细胞产品。例如，通过顺序输注应用CD19和CD22 CAR T细胞目前正在评估治疗难治性B-ALL的试验中（NCT03620058）。或者，T细胞被设计为表达两个CAR，即所谓的双顺反子CAR，每个CAR针对不同的抗原（图4）。通过灵活的连接子将两个scFv相互连接，设计出具有双重特异性的CAR。这种串联排列的双特异性CAR（“串联CAR”，“Tan-CAR”）或环状结构，针对两种不同的抗原，并能够在结合任一抗原时提供T细胞激活（“或”门控）；具有其中一种相应抗原的目标细胞仍然被识别。除了两个连接的scFv外，双抗体、二合一抗体和双变量域抗体也可以用来设计具有两种特异性的CAR。三特异性CAR包含单价和/或多价CAR结构的组合，以针对三种抗原，进一步扩大靶向特异性。一个例子是设计了一种双特异性CAR，将针对CD20和CD19的scFv连接起来，旨在减轻在接受CD19 CAR T细胞治疗后经常发生的B细胞白血病/淋巴瘤的复发。CD19− CD20+白血病细胞的复发旨在通过CD20-CD19双特异性CAR T细胞得到控制。双特异性CAR中scFv的顺序取决于特定抗原中目标表位的空间可及性。CD20-CD19 CAR对CD19和CD20都具有相同的结合能力，并重定向T细胞激活，而CD19-CD20 CAR则效率要低得多。其他双特异性CAR的例子是针对CD19和CD123治疗B-ALL或CD19共靶向CD22、ROR1和免疫球蛋白κ轻链（Igκ）。多特异性CAR T细胞目前正在早期临床试验中评估。通过双顺反子表达盒设计了同时具有CD19和CD22 CAR的T细胞，正在进行治疗高风险B-ALL或干细胞移植后复发的试验（NCT03289455）。具有CD19和CD22特异性的双价CAR正在评估治疗B-ALL或B细胞淋巴瘤（NCT03241940, NCT03233854, NCT03330691, NCT03448393, NCT03019055）。目前正在进行的II期试验中评估了针对BCMA两个表位的双特异性CAR（NCT03758417）。 图4 基于逻辑门控的CAR介导的T细胞激活，以证明在肿瘤靶向中的选择性。共表达两种CAR，每种CAR在与相应的目标抗原结合时都能完全激活T细胞；双特异性CAR（串联CAR，Tan-CAR）也是如此。在这种情况下，通过表达抗原A或B或两者的细胞激活T细胞（"OR"门控）。为了仅通过同时表达A和B抗原的细胞激活CAR T细胞，识别A的CAR仅通过CD3ζ提供基本激活，这不足以实现完全和持续的激活，而识别B的CAR提供共刺激；通过两种CAR的同时信号传导诱导T细胞完全激活（"AND"门控）。识别抗原A的synNotch CAR驱动转录并表达第二种CAR，该CAR在识别抗原B时驱动T细胞完全激活。具有ITIM（免疫受体酪氨酸基抑制基序）的抑制性CAR在其识别的抗原B结合时阻止通过激活CAR的信号传导。当抗原B不存在时，CAR可以在结合抗原A时激活T细胞（"A-not-B"门控）。 当结合两种抗原时，双特异性CAR比单特异性CAR具有更高的亲和力，理论上稳定了突触并改善了T细胞对低抗原水平目标细胞的反应。这种情况可以用来只将CAR T细胞重定向到表达两种抗原而不是一种的细胞（图4）。这种“与”门控的抗原模式旨在提高对癌细胞的靶向选择性，同时保留健康细胞。两个共表达的抗原被两个共表达的CAR识别，每个CAR识别特定的抗原，并分别提供主要或共刺激信号。这样，只有同时结合两种抗原才提供完全T细胞激活所需的两个信号；结合一种抗原是不足够的。组合抗原识别的例子是，通过CD3ζ CAR靶向ErbB2和通过CD28 CAR靶向Muc1，或通过CD3ζ CAR靶向间皮素和通过CD28 CAR靶向叶酸受体-α。靶向CD13和TIM3的双特异性和分裂CAR T细胞在临床前模型中根除患者衍生的急性髓性白血病细胞，减少了对骨髓和外周髓性细胞的毒性。 通过异二聚体化两个多肽链，可以加强两个CAR上的初级和共刺激信号的组合；一个链由细胞外和跨膜以及初级信号传导部分组成，第二个链提供共刺激信号传导部分，并通过添加“二聚体化剂”与第一个链相连。CAR在二聚体化剂允许异二聚体化和功能性CAR形成之前保持沉默。通过滴定二聚体化剂剂量可以微调T细胞活性；撤除二聚体化剂终止CAR信号。只有当每个CAR信号单独不足以驱动T细胞激活时，才能通过组合抗原识别实现清晰的“开-关”T细胞激活。由于预先激活的T细胞中的CD3ζ信号可能重新诱导T细胞反应，因此需要调整信号或降低结合亲和力以实现平衡的激活阈值。 可调CAR的另一种策略基于合成Notch（synNotch）受体。Notch由一个细胞外受体、一个跨膜域和一个细胞内转录调节器组成，激活后介导内部域的蛋白水解，释放细胞内转录调节器。这些特性用于控制与Notch受体不同特异性的真正CAR的转录。优点在于Notch受体的抗原识别基于逻辑“与”门控，并以空间定义的方式控制CAR T细胞功能。在CD19结合后，CD19特异性synNotch受体释放转录效应域Gal4-VP64或TetR-VP64以诱导抗间皮素CAR的表达。只有当在靶向组织中同时识别synNotch配体和CAR配体时，T细胞才被激活。另一个例子是通过CAR靶向ROR1和通过Notch受体靶向EpCAM或B7-H3。虽然CAR的“开开关”决定了靶向癌细胞的选择性，但这种策略可能受到诱导足够水平的CAR表达和在没有Notch信号进一步发生时衰减CAR所需的时间的限制。 工程化T细胞的TCR特异性也可以用来提供更复杂的识别轮廓。带有γδ TCR的T细胞识别肿瘤细胞特有的磷酸化抗原；转基因表达GD2特异性CAR和共刺激域只会在γδ TCR和CAR同时结合它们相应的抗原时提供完全的T细胞激活；由于缺乏γδ TCR激活，不会攻击GD2+的健康细胞。 虽然许多可靶向的抗原既表达于健康细胞也表达于癌细胞，但有些抗原仅由健康细胞表达，而癌细胞缺乏表达。在这种情况下，结合共同抗原“A”但在结合健康细胞上的抗原“B”时阻断，将阻止CAR T细胞激活对抗健康细胞（图4）。带有ITIM（免疫受体酪氨酸基抑制基序）的抑制性CAR只要结合其相应的抗原“B”，就阻止通过激活性CAR的信号传导。结合缺乏抗原“B”的“A”癌细胞允许CAR T细胞激活，因为缺乏通过抑制性CAR的信号传导（“A非B”门控）。 5.具有植入多重抗原特异性的通用CAR 目前，原型CAR具有一个确定的抗原特异性；改变特异性需要用新的CAR工程化T细胞。在这种情况下，开发了一种“通用”CAR，它识别一种抗体，该抗体转而提供癌症特异性（图5）。例如，抗癌抗体的免疫球蛋白Fc区域被具有CD16作为结合域的CAR结合。CD16 CAR T细胞结合抗癌抗体，从而获得对癌细胞的特异性。或者，CAR结合至与抗癌靶向抗体相关联的蛋白质表位。具有荧光素异硫氰酸酯（FITC）特异性CAR的T细胞识别FITC标记的叶酸，该叶酸与叶酸受体阳性癌细胞结合。也可以设想将其他表位与桥接抗体相关联，如亲和素。同时添加不同特异性的抗体，允许将相同的CAR T细胞产品（“UniCAR”）重定向至多种抗原，无需重新制造CAR T细胞。该策略的优点是同时使用不同的抗体靶向广泛的抗原，同时只应用一种制造的CAR T细胞产品。实际的特异性由应用的抗体混合物在治疗足够浓度下定义。随着应用的抗体的短半衰期，此外，意外的不良事件在抗体撤除后很快就会有限。从机制上讲，有效的肿瘤控制需要CAR T细胞和连接抗体都渗透到肿瘤病变中；目前尚不清楚这是否适用于晚期实体瘤。也尚未解决“通用”CAR T细胞是否能够建立对癌症抗原的持久免疫记忆，这被认为是长期控制癌症所需的。 图 5 “通用”CAR的概念。T细胞表达一种特异性针对标签的CAR，该标签与连接分子相连，最好是天然抗体、单链抗体(scFv)或双特异性T细胞导向抗体(BiTE)，这些分子能够识别肿瘤细胞上的目标抗原。通过添加不同的连接分子，无需工程化新的CAR T细胞，就可以为T细胞配备不同的特异性。这被认为在将CAR T细胞应用于患者后也是可行的；注入针对不同肿瘤抗原的抗体，为CAR T细胞提供不同的特异性。 6.转换抑制信号为激活信号的Switch CAR 在肿瘤病变中，重定向的T细胞攻击通常以各种方式受到抑制；抑制性配体如程序性细胞死亡配体-1（PD-L1）和PD-L2与激活的T细胞表达的程序性细胞死亡-1（PD-1）结合。一种结合这种抑制性配体但向工程化T细胞传递激活信号的CAR，不仅可以与抑制性受体竞争结合，还可以通过提供激活信号克服抑制（图6a）。理想情况下，PD-L1:CD28 “开关”CAR在工程化T细胞中克服PD-1介导的抑制信号。特别是，一个具有PD-1细胞外域结合PD-L1和CD28细胞内信号传导域的CAR，将抑制信号转换为激活信号，导致ERK磷酸化增加，促炎细胞因子释放，T细胞扩增和目标细胞的细胞溶解。由TIGIT（具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体）的外域与CD28共刺激域融合而成的嵌合受体，在结合TIGIT配体CD155时增强T细胞功能。鉴于肿瘤组织提供的大量抑制信号，确定需要克服的“关键”抑制因素以维持有效的T细胞反应仍然是一个挑战。 图 6 开关CAR和抑制性CAR（iCAR）。(a) 开关CAR与生理性T细胞抑制性受体的配体结合，但为工程化T细胞提供激活信号。(b) 抑制性CAR在与抗原结合后，通过ITIM信号向工程化T细胞提供负信号。抑制信号压倒了通过TCR或共表达的激活CAR的激活。 7.抑制性CAR：iCARs 虽然原型CAR向工程化T细胞提供激活信号，但具有抑制信号的CAR旨在在结合健康细胞时抑制CAR T细胞激活。理想情况下，抑制性CAR通过在面对健康组织时覆盖激活CAR信号来减轻非肿瘤毒性。与激活性、肿瘤特异性CAR共表达的具有优势抑制信号的CAR，识别健康细胞；从而CAR T细胞只在结合癌细胞时激活，抑制性CAR不结合健康细胞（图6b）。这种抑制性CAR提供PD-1或CTLA-4信号，并覆盖癌症特异性CAR的激活信号。 8.异体CAR T细胞和CAR NK细胞 到目前为止，CAR T细胞治疗是一种通过体外制造患者自己的T细胞的个性化治疗。这不仅繁琐、成本密集和耗时，而且在患者晚期疾病无法提供足够或足够活跃的T细胞进行CAR工程化时通常也不适用。在这种情况下，异体“现成的”CAR T细胞将为广泛的患者群体带来好处。为了避免移植物抗宿主病（GvHD），需要删除内源性的αβ TCR和HLA分子，这可以通过锌指核酸酶或CRISPR/Cas技术实现。随后清除剩余的TCRαβ T细胞，通过污染的异体TCR+细胞降低GvHD风险。T细胞通过转录激活样效应核酸酶（TALENs）技术在TCRα和CD52位点进行基因编辑，用于治疗无法生产自体CAR T细胞的患者的儿童CD19+ ALL。CD52存在于患者的恶性B细胞上，需要从CAR T细胞中删除，以允许消除恶性淋巴细胞，同时保留注入的CD52阴性CAR T细胞。对于工程化异体CAR T细胞，CRISPR导向RNA和Cas9目前由病毒载体编码以实现组成性表达；当前的研究旨在短暂提供基因编辑工具，而不持久的载体，以最小化非目标编辑。 针对BCMA治疗多发性骨髓瘤的异体CAR T细胞，通过BCMA CAR和基因编辑技术进行了改造，以限制TCR介导的免疫反应。通过将CD20模拟表位整合到CAR的细胞外域，使CAR T细胞能够通过利妥昔单抗消除，从而提供了异体BCMA CAR T细胞的安全性。 关于使用异体效应细胞，NK细胞也可以用于诱导有效的抗肿瘤反应，因为它们具有细胞毒性潜力和分泌促炎细胞因子。除了使用异体细胞，使用NK细胞进行癌症的过继细胞治疗有很强的生物学理由；NK细胞表现出广泛的抑制性和激活性受体库，以识别外来、感染或恶性细胞。两种信号的平衡最终诱导或阻断细胞毒性CD56dim NK细胞释放细胞毒性颗粒以杀死目标细胞。虽然可能存在广泛的NK细胞亚群多样性，基于激活和抑制受体的库，但通过CAR工程化NK细胞将为特定癌细胞提供预定的特异性。原型CAR具有CD28-CD3ζ信号也在NK细胞中活跃；具有NK细胞2DS2和DAP12信号蛋白的CAR产生了更强的抗肿瘤活性。为NK细胞工程化的CAR通常包含DAP10或DAP12用于激活，单独或与CD3ζ一起。具有NKG2D作为结合物和DAP10-CD3ζ用于激活的CAR有效地激活了小鼠模型中针对骨肉瘤的原代NK细胞。CD3ζ在NK细胞中作为激活域优于DAP10，而DAP12优于CD3ζ。 9.制造CAR T细胞用于临床应用 对于临床应用，CAR T细胞产品是根据良好生产规范（GMP）规则，使用预期接受患者的自体T细胞制造的（图7）。在大多数情况下，通过白细胞分离术收集血液，分离T细胞，通过病毒感染或电穿孔进行基因工程改造，并扩增到临床相关的数量。大多数临床试验使用通过γ-逆转录病毒或慢病毒基因转移修饰的T细胞；基于转座子的载体，如Sleeping Beauty和PiggyBac，越来越多地应用于临床，其好处是避免了成本和时间密集型的病毒生产。病毒和转座子介导的基因转移程序旨在永久性地修改患者的T细胞以表达CAR；一些试验使用通过RNA电穿孔修饰的T细胞进行短暂的CAR表达。在永久性基因改造后，插入突变和随后成熟T细胞的致癌转化的风险似乎很低，到目前为止在这方面还没有报告致癌事件。一个需要注意的问题是，通过慢病毒转移，CAR基因插入到Tet2位点导致T细胞的克隆扩增，然而，它们自发地收缩了。然而，白细胞分离产品中污染的恶性细胞也可能意外地被CAR改造，存在重新输注给患者后通过CAR介导的肿瘤促进的风险。 图7 CAR T细胞制造和患者治疗时间表。(a) 通过白细胞分离术从患者体内收集T细胞，并在体外处理以获得最终的CAR T细胞产品，包括T细胞工程化以携带CAR、扩增至临床相关数量，以及最终的质量控制程序（QC）。在输注CAR T细胞产品之前，患者需接受非清髓性淋巴细胞减少（“预处理”），以促进CAR T细胞的植入和体内扩增。随后需要院内护理以管理潜在的副作用，如CRS或神经毒性。(b) 体外CAR T细胞制造过程通常从白细胞分离产品开始，并涉及多个后续生产步骤，包括T细胞分离和激活、基因工程、CAR T细胞扩增、制剂、CAR T细胞产品的冷冻保存，以及最终的质量控制以供释放。整个过程可以手动运行，或在监督下（半）自动化进行。 经过基因改造后，CAR T细胞在细胞因子存在的情况下在体外广泛扩增到临床相关的细胞数量；目前使用手动处理的摇动反应器或袋子以及完全自动化和监督处理设备。自动化的目标是允许以高再现性和质量进行生产，并从越来越多的患者中并行生产细胞，并缩短静脉到静脉的时间。 最适合CAR治疗的T细胞群体被认为是具有急性炎症特征的原始或年轻中央记忆细胞。在IL-2存在下扩增CAR T细胞优先触发效应T细胞，而IL-7或IL-2加IL-15扩增具有持续细胞因子释放和抗肿瘤活性能力的中央记忆T细胞。添加IL-21使CAR T细胞保持较少分化状态。刺激方式不仅决定了扩增CAR T细胞的产量，还决定了代谢依赖性；IL-15增加氧化代谢以及肉碱棕榈酰转移酶，这是脂肪酸氧化的限速步骤。IL-7通过STAT5和Akt激活增加Glut1，并诱导甘油运输和甘油三酯合成，从而改善T细胞持久性和存活。在体外扩增期间抑制Akt触发具有高水平脂肪酸氧化的中央记忆表型，最终改善CAR T细胞的抗肿瘤活性。CD45RO+ CD62L+记忆CAR T细胞比更高级分化阶段的效应T细胞提供更持久的抗肿瘤反应，使富含CD62L的CAR T细胞成为进一步探索的有吸引力的选择。 因此，中央记忆CAR T细胞在临床应用中似乎更优越，因为响应的患者没有累积具有早期记忆和耗竭特征的T细胞，而非响应的患者则累积了。最终产品中工程化细胞的活性可能影响治疗效果。然而，基于制造的细胞产品的活性对CAR T细胞治疗结果的首次回顾性分析表明，当患者接受70-80%活性的产品与至少80%活性的产品相比，CD19 CAR T细胞扩增或患者存活没有差异的证据。 制造T细胞产品是一种个性化方法，当前程序有一些显著的限制： 一些癌症患者淋巴细胞减少或具有低数量的原始T细胞，导致生产延迟或失败，如在为儿科患者生产时所经历的。 生产过程耗时，这对急性或晚期疾病的患者不利。 由于疾病，患者的T细胞可能功能失调，如CLL和一些实体瘤所报告的，导致产品反应率低。 在某些情况下，工程化异体T细胞可能是另一种策略。在接受造血干细胞移植的患者中，使用移植的异体T细胞制造CAR T细胞产品。这样的异体CD19特异性CAR T细胞诱导了部分和完全缓解；然而，一些患者遭受了GvHD。病毒抗原特异性、部分HLA匹配的供体T细胞缺乏异体反应性，并且通过CAR工程化，显示出抗淋巴瘤活性。NK细胞以其MHC独立活性也是第三方供体细胞CAR工程化的来源；然而，它们在患者中表现出较差的持久性。 10.通过CAR T细胞的过继治疗在血液学恶性肿瘤中诱导持久缓解 过继转移CAR T细胞的治疗效果取决于多个参数，包括CAR设计、CAR信号传导、结合亲和力、目标细胞上的抗原数量、目标抗原表位的空间可及性、T细胞的成熟阶段、CAR T细胞的持久性和扩增、患者免疫系统的预处理等。目前的努力旨在优化特定疾病的状况；一些治疗方案已在CAR T细胞治疗恶性疾病的方面证明成功，特别是B细胞白血病/淋巴瘤；少数试验旨在治疗实体癌。 在迄今为止难以治疗的B细胞白血病和淋巴瘤的治疗中，使用“第二代”抗CD19 CAR T细胞的早期临床试验实现了完全且持久的缓解；使用“第一代”CAR T细胞的治疗大多失败，因为CAR T细胞从循环中迅速清除。目前，近600项早期阶段的CAR T细胞试验正在进行临床探索，主要由学术中心进行（截至2020年初，中国有268项，美国有227项，欧洲有67项）。用于治疗儿童B-ALL（Kymriah™，tisagenlecleucel，诺华）和成人大B细胞淋巴瘤（Yescarta™，axicabtagene ciloleucel，Kite-Gilead）的抗CD19 CAR T细胞已获得FDA和EMA的批准；其他将很快跟进。 CAR T细胞治疗的标准程序从患者的白细胞分离开始，分离T细胞，体外基因工程改造相应的CAR，CAR T细胞扩增，以及在非清髓性淋巴细胞减少和IL-2支持后，通过静脉输注将最终的细胞产品重新给患者（图7）。由于CAR T细胞的持久性对临床效果至关重要，目前在试验中使用的CAR具有一个或两个共刺激内域，其中大多数提供CD28或4-1BB共刺激。在持久性方面，4-1BB共刺激的CAR T细胞似乎优于CD28 CAR T细胞，在循环中持续4年以上，而CD28 CAR T细胞持续30天。由于CD19 CAR T细胞不区分健康和恶性B细胞，只要CD19 CAR T细胞持续存在，患者就会经历持久的B细胞耗竭。尽管B细胞耗竭在临床上是可管理的，但这种情况要求在靶向恶性B细胞时更具选择性。最近，Fcμ（IgM）受体被确定为治疗慢性淋巴细胞白血病（CLL）时可能更具肿瘤选择性的目标，由于目标表达水平较低，因此大多数健康B细胞免于被淘汰。目前也在探索其他替代靶标。 在缓解期间，大多数接受4-1BB CAR T细胞治疗的白血病/淋巴瘤患者没有接受进一步的癌症特异性治疗；接受CD28 CAR治疗的患者经常接受异体干细胞移植，这似乎是有益的，因为CD28 CAR T细胞的持久性不如4-1BB CAR T细胞。需要进一步探索以确定长期内更成功的策略。 迄今为止，患有DLBCL、CLL、B细胞急性淋巴细胞性白血病（B-ALL）和滤泡性淋巴瘤的患者已通过CD19 CAR T细胞成功治疗。值得注意的是，接受CD19 CAR T细胞治疗的多发性骨髓瘤患者也经历了缓解，尽管通过流式细胞术评估，骨髓瘤细胞是CD19low或CD19阴性。目前也在探索用于治疗B细胞恶性肿瘤的其他替代靶标，包括CD20、CD22、Igκ轻链、ROR-1和CD30。 由于缺乏标准化的试验设计、CAR组成、靶向抗原、预处理等方面，很难比较各种试验中CAR T细胞治疗的成功。然而，越来越明显的是，CAR T细胞剂量和淋巴细胞减少的程度或淋巴细胞减少方案对于允许广泛的T细胞扩增、持久性和最终治疗效果至关重要。应用后对CAR T细胞的重复再刺激可能改善它们在长期内的持久性和抗肿瘤效果。这是使用病毒特异性T细胞进行CAR植入的合理性，它们在接触病毒抗原时通过TCR重复再刺激；例如，Epstein-Barr病毒（EBV）特异性T细胞通过CAR工程化，并被EBV感染的细胞触发扩增。事实上，EBV特异性CAR T细胞的表现优于没有病毒特异性的CAR T细胞。 11.治疗实体癌的CAR T细胞面临的挑战 虽然血液学恶性肿瘤的治疗越来越成功，但实体癌的治疗仍然具有挑战性（表2）。作为“活药”的CAR T细胞基本上非常适合治疗实体癌，特别是由于T细胞固有的迁移和组织穿透能力，穿透血脑屏障，并在几乎所有组织中积累，包括睾丸和眼睛等特权组织，因此特别适合消除（微）转移。然而，大多数实体肿瘤具有大量策略，以非常有效的方式对抗CAR T细胞的迁移、渗透和激活。其中，改变的趋化因子环境损害了CAR T细胞向肿瘤的迁移；肿瘤内皮细胞上丢失了一些粘附因子，妨碍了T细胞的渗透。通过局部沉积TNF-α可以对抗后者，它增加了血管粘附分子，如血管细胞粘附蛋白-1和内皮细胞上的细胞间粘附分子-2。靶向血管内皮生长因子（VEGF）受体-2或阻断迁移抑制因子如内皮素B受体也改善了内皮细胞粘附和/或T细胞的跨内皮迁移。在T细胞上下调的趋化因子受体被重新表达，如CXCR2（CXCL1受体），以便于靶向黑色素瘤或CCR2b用于靶向神经母细胞瘤。 表 2 CAR T细胞疗法面临众多挑战。 为了绕过迁移障碍，CAR T细胞被瘤内植入或分别注入胸膜或腹膜以治疗间皮瘤和卵巢癌。通过内窥镜将抗CEA CAR T细胞应用于肝转移；抗c-Met CAR T细胞被注入乳腺癌转移。一旦进入肿瘤病变，CAR T细胞需要突破基质细胞和细胞外基质的障碍，才能接近癌细胞以执行它们的细胞毒性攻击。通过基因工程释放的肝素酶在基质中降解肝素硫酸蛋白多糖，改善T细胞的渗透；需要高水平的IFN-γ来消除基质细胞并根除大型已建立的肿瘤病变。通过直接针对基质细胞的CAR T细胞特异性针对成纤维细胞激活蛋白（FAP），一种参与细胞外基质重塑的丝氨酸蛋白酶，整体抗肿瘤活性得到改善。 许多过程使肿瘤病变对重定向的CAR T细胞产生敌意，使它们变成耗竭状态或进入凋亡。调节性T（Treg）细胞、髓源性抑制细胞（MDSCs）和肿瘤相关M2型巨噬细胞释放抑制性细胞因子，如IL-4、IL-10、白血病抑制因子（LIF）和TGF-β。MDSCs和巨噬细胞降低肿瘤内色氨酸水平；基质细胞释放吲哚胺2,3-双加氧酶（IDO）和犬尿氨酸，抑制T细胞效应功能并剥夺组织中的葡萄糖和其他营养物质。严重的酸中毒也对抗肿瘤活性的CAR T细胞产生反作用。由于MDSCs释放的精氨酸酶，低精氨酸水平抑制CD3ζ表达和TCR信号传导。 12.CAR T细胞治疗与毒性相关 作为“活药”的CAR T细胞治疗在一些试验中取得了显著的治疗效果；然而，CAR T细胞在初始应用后的几天甚至几周内可能导致严重的副作用，需要重症监护干预，甚至可能致命。大多数毒性是由于CAR T细胞的特殊生物学特性，其他与CAR T细胞相关的毒性目前尚未完全理解。从机制上讲，主要毒性是(1)由于大量T细胞激活、细胞因子释放和肿瘤溶解引起的全身毒性，以及(2)由于CAR T细胞与健康组织相互作用引起的特异性毒性（“靶上非肿瘤”毒性）。 12.1.系统性毒性 细胞因子释放综合征（CRS）：大量CAR T细胞与目标细胞的结合导致大量细胞因子释放，血清中促炎细胞因子（包括IFN-γ和TNF-α、IL-10和IL-6）的水平异常高，这本身会导致其他免疫细胞的交叉激活，以及进一步的细胞因子释放，直至达到有毒水平。这些毒性被称为细胞因子释放综合征（CRS），临床上伴有高烧、不适、疲劳、肌肉痛、恶心、厌食、心动过速、低血压、毛细血管渗漏、心脏功能障碍、肾功能损害、肝功能衰竭和弥散性血管内凝血。CRS常与血管渗漏综合征（VLS）一起出现，与巨噬细胞激活综合征（MAS）和巨噬细胞激活密切相关，临床上类似于噬血细胞性淋巴组织细胞增多症（HLH）。CRS的风险与T细胞激活和扩增有关，这可能与总体肿瘤负荷相关，但并非绝对。为了避免CRS，需要在肿瘤负荷高的患者中使用较低剂量的CAR T细胞，这是一个需要通过精确定义治疗窗口来解决的悖论，通过调整T细胞激活、细胞因子释放和抗肿瘤活性。 CRS的早期诊断和临床管理通过新建立的评分系统和治疗指南得到便利。C反应蛋白，即由肝细胞在IL-6水平增加时释放的蛋白质，目前作为CRS发作和严重程度的实验室标志物；成人的预测标志物还包括可溶性gp130（sgp130）、IFN-γ和IL-1Rα的增加，在儿科患者中，IFN-γ、IL-13和MIP1α的增加。目前CRS的治疗基于阻断IL-6/IL-6受体信号轴，通过阻断抗体如抗IL-6受体抗体tocilizumab或抗IL-6抗体siltuximab，这似乎不会干扰CAR T细胞的疗效。短期系统性皮质类固醇治疗也能迅速逆转CRS，且不影响最初的抗肿瘤反应；然而，它可能在长期内损害CAR T细胞反应。在CRS期间中和促炎细胞因子有助于减轻CRS的严重程度。在CRS期间，活化的单核细胞和/或巨噬细胞释放高水平的IL-1；通过IL-1受体拮抗剂中和可以改善临床模型中的CRS和神经毒性。通过给予lenzilumab抗体中和巨噬细胞-单核细胞激活细胞因子GM-CSF，降低了CRS的风险。通过阻断酪氨酸羟化酶减少儿茶酚胺，降低了小鼠模型中的细胞因子水平，暗示了临床干预的途径。 与CAR T细胞相关的HLH/MAS通常与CRS症状一起出现，伴有铁蛋白和肝酶血清水平升高、噬血细胞现象、细胞减少、肺水肿、脾肿大、肾功能衰竭和NK细胞丢失。治疗包括使用依托泊苷或阿糖胞苷进行系统性化疗，如果与神经毒性相关，也可以鞘内应用；在这种情况下，IL-6/IL-6R阻断大多无效。 神经毒性（ICANS）：CAR T细胞治疗相关的神经毒性现在被称为免疫效应细胞相关神经毒性综合征（ICANS）。神经系统效应包括失语症、幻觉、混乱、谵妄、表达性失语症、肌阵挛、谵妄、癫痫发作和脑水肿。这种神经毒性发生在大约40%的患者中，是可逆的，并且在CD19 CAR T细胞治疗期间频繁发生；其他CAR T细胞也可以引起神经毒性，指向由于活化CAR T细胞的浸润导致的弥漫性但暂时性脑病。神经毒性的机制尚不清楚，但与破坏血脑屏障和脑脊液中细胞因子水平增加有关。如果与CRS一起治疗，用IL-6阻断和类固醇治疗可以成功。 12.2.“靶上非肿瘤”毒性 由于大多数靶向抗原也由健康细胞表达，CAR T细胞治疗与攻击健康组织的风险相关，导致巨大的“靶上非肿瘤”毒性。治疗B细胞白血病的CD19靶向CAR T细胞也消除了健康的B细胞；持久的B细胞耗竭需要免疫球蛋白替代和抗生素及抗真菌保护，这在临床上是可管理的。当目标抗原由重要组织表达时，毒性更严重。在一项针对肾癌患者的碳酸酐酶IX特异性CAR T细胞治疗试验中，患者由于胆管上皮细胞上碳酸酐酶IX水平较低而出现肝毒性；通过预先给予阻断抗体，可以减少“非肿瘤”毒性的严重程度。避免“靶上非肿瘤”毒性的策略目前旨在增加肿瘤选择性，并以空间和时间的方式限制CAR活性。T细胞给药的替代途径可能是避免通过血液系统分布大量CAR T细胞的选项。通过内窥镜或胸膜内或腹膜内应用局部CAR T细胞给药，在肿瘤部位提供高剂量的CAR T细胞，并在一定程度上避免了非肿瘤毒性。然而，这种应用是有限的，因为在大多数情况下，肿瘤病变无法接触或肿瘤广泛扩散。 12.3.“靶外非肿瘤”毒性 大多数过去工程化的CAR在细胞外部分包含IgG1 CH2CH3结构域作为间隔区，这可能会与Fcγ受体（FcγR）（CD64）结合，从而激活NK细胞和巨噬细胞等先天细胞。尽管到目前为止在临床上并不突出，但理论上可以通过删除IgG1 CH2结构域或突变FcγR结合位点内的Asn297来减少风险。替代间隔区包括IgG4 Fc结构域或细胞外CD8结构域。 第三代曲妥珠单抗衍生的CAR T细胞靶向ErB2导致可能由于急性呼吸窘迫综合征和CRS导致的致命的心肺衰竭。同样，在用EGFR变体3特异性CAR T细胞和CEA特异性CAR T细胞治疗时记录了肺水肿，而没有直接证据表明CAR T细胞攻击肺上皮。由于使用针对同一目标的不同表位或传递不同信号的CAR可能产生显著不同的毒性，因此毒性概况更加复杂，例如，使用来自FRP5抗体的第二代ErB2 CAR的T细胞在肉瘤患者中并未诱导靶外非肿瘤毒性。 12.4.改善CRS的策略 基本上，当CRS在临床上显著时，需要对CAR T细胞进行下调或去激活；瞬时CAR表达、“关闭开关”和“自杀开关”是常用工具。 当存在严重CAR T细胞相关毒性的重大风险时，瞬时CAR表达可能有益。RNA转移产生瞬时表达的CAR。CAR在T细胞表面存在数天，并在目标细胞结合时介导有效的T细胞激活，然而，随着RNA降解和T细胞扩增时RNA稀释，CAR表达会下降。这种RNA修饰的T细胞在试验中显示出一些虽短暂但有效的效果。然而，由于CAR T细胞迅速清除，其缺点是短期效果。 然而，永久性修改的CAR T细胞需要在毒性不受控制的情况下主动消除这些细胞的策略。大剂量脉冲治疗类固醇在应用碳酸酐酶IX特异性CAR T细胞后停止了自身免疫。虽然这是非选择性地清除激活的T细胞，但可以通过特定靶向更有选择性地消除CAR T细胞。CAR结合域基本上也可以通过抗独特型抗体进行靶向，以诱导CAR T细胞的溶解性消除。通过给予识别细胞外CAR结构域中整合的表位的消耗性、FDA批准的抗体，也可以实现CAR T细胞的消耗。例子包括使用利妥昔单抗来消耗具有CD20表位或模拟表位的CAR T细胞，或使用西妥昔单抗来消耗具有EGFR表位的CAR T细胞。是否能够迅速实现足够的CAR T细胞清除以逆转正在进行的CRS，还有待在临床情况下证明。 诱导凋亡的CAR T细胞消除似乎是这种情况下更快速的解决方案。转基因脲酶-9（Cas9）与FKBP1A相连，在系统应用原本惰性的小分子AP1903后，会在工程化CAR T细胞中诱导凋亡，该分子促进二聚体化和激活诱导性Cas9（iCas9）。这种策略是有效的，因为供体T细胞介导的GvHD可以在实验系统中通过iCas9介导的T细胞凋亡在一小时内停止。 与其消除CAR T细胞，不如通过整合模块控制细胞表面的CAR。CAR被设计为融合蛋白，整合了一个自切割降解结构域，该结构域被可以被特定蛋白酶抑制剂特异性阻断的蛋白酶反向调节。在蛋白酶存在的情况下，产生的CAR融合蛋白从连接的降解结构域分离并表达在细胞表面；抑制蛋白酶导致CAR降解和缺乏表面表达。 CAR也可以通过添加酪氨酸激酶抑制剂dasatinib来降低其表达或调节其信号强度，该抑制剂可以迅速且可逆地阻断Lck激活；从而在小鼠模型中减少CRS的严重程度。该策略的好处是，只要存在dasatinib，CAR T细胞的信号强度就会减弱，但不会被清除；然而，该策略仍需临床验证。 需要进一步开发以降低细胞因子介导毒性风险的CAR。调节信号强度的一个关键是CAR共刺激。CD28-ζ CAR更快地诱导T细胞激活，并诱导更高的细胞因子释放、扩增和随后的耗竭，而4-1BB-ζ CAR则驱动较少的急性扩增，但具有较低的细胞因子水平，因此与严重CRS的风险较低。因此，4-1BB-ζ CAR可能更适用于肿瘤负荷和抗原密度高的患者，而CD28-ζ CAR可能需要用于肿瘤负荷低的情况。 降低CAR介导的T细胞激活的其他策略，例如，修改CD8跨膜和铰链区域，从而降低ICANS或高于1级CRS的风险。作为一种替代策略，“通用”CAR允许通过调整将CAR T细胞与目标细胞链接的适配器分子来动态控制T细胞激活。 13.CAR T细胞治疗的挑战 在过去的几年里，临床试验正致力于将CAR T细胞治疗确立为治疗几种类型的B细胞白血病和淋巴瘤；然而，在治疗其他恶性疾病的方面，仍然存在重大障碍。 13.1.如何选择最佳的肿瘤选择性抗原作为靶标？ 在CAR T细胞治疗中，肿瘤靶向的选择性对于长期兼容性至关重要。大多数可靶向的肿瘤相关抗原并不具有肿瘤选择性，这增加了CAR T细胞疗法中诱导靶上非肿瘤毒性的风险。肿瘤特异性的表面蛋白突变或肿瘤相关糖基化变体如Muc1或Muc16是罕见的。然而，有些抗原虽然由健康组织表达，但似乎是安全的靶标。例如，癌胚抗原（CEA，CD66e）严格表达在胃肠道和肺部健康上皮的腔面，而在癌细胞上以去极化方式表达。系统性应用CEA特异性CAR T细胞（NCT01212887, NCT02349724）和通过肝动脉输注局部给药的抗CEA CAR T细胞（NCT01373047）在减缓肿瘤进展的同时，并未诱发治疗相关结肠炎。其他如ErB2等抗原可能在高表达ErB2的肿瘤细胞被选择性靶向时是合适的靶标，同时保留中低表达的健康细胞。 为了增加肿瘤选择性，优先考虑靶向一组抗原模式而不是单一特定抗原。技术上，在同一T细胞中共表达两种具有不同特异性的CAR，以在两种CAR同时结合它们相应的抗原时仅诱导完全的T细胞激活；一种CAR提供主要信号，另一种CAR提供共刺激信号，从而仅在存在两种抗原的情况下补充完全T细胞激活所需的信号。该策略需要一个弱的主要信号，以避免在存在一种抗原的情况下进行一些基本的CAR T细胞激活，以及一个强的共刺激信号以驱动完全的T细胞激活。 为了在结合健康细胞时阻断CAR T细胞激活，与激活性CAR共表达具有细胞内PD-1或CTLA-4信号传导的抑制性CAR（iCAR）。iCAR识别健康细胞上存在但在癌细胞上不存在的抗原。因此，仅在结合缺乏iCAR识别的抗原的目标细胞时才发生CAR T细胞激活。 有些抗原在癌细胞上的表达水平高于健康细胞；“亲和力调节”CAR结合域可能有助于区分这两种组织。虽然在临床前模型中证明了可行性，但癌细胞可能通过下调相应抗原来逃避监视。亲和力调节的治疗窗口狭窄，因为增加亲和力可能导致识别健康细胞，如GD2特异性CAR在实验模型中诱发致命性脑炎。 13.2.如何优化CAR结构？ 目前临床评估中的大多数CAR基于近二十年前设计的原型CAR结构。临床前研究表明，对于每种抗原，特定CAR需要针对目标抗原表位、结合亲和力、间隔区长度以及信号传导和跨膜结构域等进行优化。由于各组分之间复杂的依赖性，目前无法预测特定抗原的最佳CAR组成。例如，结合亲和力和目标表位的位置为靶向高抗原负载的癌细胞同时保留低抗原负载的健康细胞提供了狭窄的亲和力窗口。 13.3.如何在CAR T细胞治疗后建立长期癌症控制？ 尽管在儿童B-ALL中可以高频率诱导完全缓解，但约40%的白血病患者在持续存在CAR T细胞的情况下仍然复发。多种原因导致复发频率高，包括整个CD19分子的丢失或表达缺乏目标外显子2的CD19异构体，从而使其对CAR T细胞不可见。在CD19 CAR治疗后，B-ALL的两个案例中通过转换为CD19阴性的髓系谱系丢失CD19。在这种情况下，靶向对癌细胞存活至关重要的抗原将是一个理想的策略。由于这样的抗原通常不可用，通过双特异性CAR共靶向第二种抗原（例如CD20或CD22）可能会增加对白血病细胞的治疗压力。在实体瘤中这种情况更为重要，因为它们在抗原表达上通常表现出深刻的异质性；在初始肿瘤消退后的早期肿瘤复发可能是由于选择抗原丢失的癌细胞。这些癌细胞可能以抗原非依赖性方式被先天免疫细胞反应识别和消除。为了吸引和激活先天细胞并启动更广泛的免疫反应，CAR T细胞在实验模型中被赋予了诱导释放转基因IL-12的能力，使抗肿瘤攻击更有效。有一些迹象表明，结合抗原依赖性和非依赖性免疫反应可能在长期内控制肿瘤。 13.4.哪种T细胞亚群提供长期肿瘤控制？ 临床前模型表明，具有增强扩增能力和长期持久性的原始或早期中央记忆T细胞是过继治疗最合适的细胞。沿着这条线，CD62L+记忆T细胞似乎表现出优越的性能。发现中央记忆干细胞（TSCMs），这是CD62L+中央记忆T细胞库的一部分，具有非凡的扩增潜力，激发了对这些细胞进行过继细胞治疗的探索。人们对识别和调节干细胞样T细胞形成和维持的因素和调控网络越来越感兴趣，因为这些细胞在过继转移到患者后似乎对长期治疗效果至关重要。另一种策略是基于预测性地诱导T细胞成熟。例如，4-1BB共刺激在年轻T细胞中启动中央记忆T细胞反应，这与CD28 CAR T细胞表现出更短暂的效应细胞反应形成对比。另一方面，更成熟的阶段的细胞在大多数肿瘤所在的外围显示出优先积累。然而，这些细胞需要不同的共刺激信号，即优先迁移到外围的CCR7− T细胞从联合CD28-OX40共刺激中受益。特定T细胞亚群的功能能力也可以通过与激酶抑制剂的联合治疗来调节；ibrutinib，一种布鲁顿酪氨酸激酶（BTK）抑制剂，降低了PD-1和CAR T细胞的耗竭，从而增加了持久性和抗肿瘤活性。 13.5.如何使CAR T细胞制造适应日益增长的患者数量？ 目前，大多数CAR T细胞由专门的GMP设施生产，冷冻并运送到患者的医院。生产越来越多的细胞产品将使当前程序达到极限，特别是当及时需要数千个自体细胞产品时。在医院内（半）自动化、完全控制和完全封闭系统的分散制造是解决这种情况的首选概念之一。这也将需要在制造过程中高度标准化，并避免血液和细胞产品运输中的复杂物流。作为另一种概念，一个高度专业化的、集中的生产设施，具有多个并行的自动化制造过程，可能作为患者细胞产品的区域供应商。 另一个限制是由患者自体T细胞治疗的需要设定的；对于每位患者来说，“通用”供体将使治疗在多个方面更容易。一个包含不同工程化CAR的“通用”供体T细胞产品库将在临床应用中提供更大的灵活性，根据患者的具体情况。此外，扩大生产规模将使更多的患者能够使用CAR T细胞产品。正在努力生成可以应用于众多患者的这种“通用”T细胞。这需要使CAR T细胞对宿主免疫细胞“隐形”，缺乏对患者健康组织的异体反应性，同时保留CAR介导的抗肿瘤活性。在这种情况下，通过基因组编辑技术获得的MHC缺陷、CAR修饰的病毒特异性T细胞和TCRα敲除T细胞，目前正在开发作为“现成的”或“第三方”细胞产品，GvHD风险低。CAR基因插入TCRα位点一步实现CAR的遗传工程和TCR表达的废除。编辑MHC I类以防止宿主识别和排斥供体T细胞可能通过NK细胞诱导消除，并不防止MHC II类介导的排斥。然而，目前探索的所有基因编辑程序在某种程度上都容易受到非目标修饰的影响，因此与意外的突变风险相关。该领域发展迅速，首次使用异体CAR T细胞治疗B细胞恶性肿瘤和实体瘤的试验已经启动。 13.6.如何平衡CAR T细胞的疗效和副作用？ 目前，一些CAR T细胞治疗与高风险的严重副作用相关，可能需要重症监护住院治疗。尽管各种CAR T细胞协议和治疗程序不同，并且没有在比较性的临床环境中进行评估，但一些临床管理规则变得明显。例如，CRS的早期诊断、分级和临床管理将标准化，建立共识的治疗方案。在毒性不受控制的情况下，可以通过各种手段选择性地和迅速地消除CAR T细胞。通过添加二聚体化剂AP1903二聚体化转基因诱导的脲酶-9（iCasp9），在30分钟内消除超过90%的T细胞。或者，通过给予针对CAR结构域或共表达表位的抗体，诱导抗体依赖性细胞毒性（ADCC）清除循环中的CAR T细胞。免疫介导的CAR T细胞消除的缺陷仍然是，癌症患者的潜在功能障碍免疫系统可能通过ADCC消除CAR T细胞的能力有限。 13.7.我们是否需要针对每种癌症类型的特定预处理？ 在大多数试验中，患者在过继T细胞治疗前接受非清髓性淋巴细胞减少，使用氟达拉滨和环磷酰胺；这种预处理的理由是暂时提供“空间”和细胞因子，以实现转移的CAR T细胞在体内的充分扩增。淋巴细胞减少还通过免疫调节提供抗肿瘤效果，因为它耗尽抑制细胞，并在肿瘤破坏时释放肿瘤相关抗原到免疫系统。尽管目前的预处理方案基本上是有效的，但基本方案可能需要针对每种癌症实体进行调整。例如，用于治疗Her2+肿瘤的调节方案通过应用nab-紫杉醇来耗尽间质性基质，并促进Her2呈递，并通过应用环磷酰胺耗尽Treg和MDSC，用于胆道和胰腺癌的修改。另一方面，预处理在CAR T细胞治疗的背景下可能具有高度毒性，通过诱导脑水肿和神经系统毒性，特别是在最近的一项试验（NCT02535364）中观察到的氟达拉滨治疗后。 13.8.如何激活免疫网络以诱导广泛的炎症性抗肿瘤反应？ CAR T细胞作为“活药”，越来越成为在目标器官产生和释放生物活性化合物的“活工厂”。使用CAR T细胞作为工厂的合理性基于实验肿瘤模型的证据，即宿主免疫系统在肿瘤排斥中起着重要且必要的作用，这使得在目标肿瘤组织内产生免疫刺激性条件成为必要。释放IL-12的CAR T细胞（IL-12 TRUCKs）可以通过吸引和激活M1型巨噬细胞来在肿瘤组织中诱发免疫反应，这些巨噬细胞可以消除CAR T细胞未能识别的癌细胞。其他具有特定影响局部免疫环境的细胞因子也可以使用；释放IL-18的CAR T细胞增加了肿瘤相关CD206+ M1型巨噬细胞和NKG2D+ NK细胞的数量，并减少了如Treg细胞、CD103+树突细胞和M2型巨噬细胞等抑制细胞。目前正在试验中探索使用靶向PD-1的检查点阻断，以激活CAR T细胞和浸润性淋巴细胞（NCT02650999）；其他检查点的阻断或组合，以重新激活肿瘤内源性免疫细胞，同样值得进行临床探索。 14.CAR T细胞用于其他疾病的治疗 将T细胞激活重定向的CAR不仅限于靶向癌细胞，还可以用于靶向任何由目标抗原定义的细胞。通过抗Dsg3 CAR靶向记忆B细胞的CAR T细胞被设计用来消除导致天疱疮病理的细胞。通过识别MHC呈递的自身抗原的CAR T细胞靶向自反应性T细胞。CAR被工程化以靶向病毒感染的细胞，如乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、巨细胞病毒和HIV感染的细胞。源自Dectin-1的CAR T细胞被用于破坏真菌Aspergillus的发芽。实验模型暗示，CAR重定向的Treg细胞可用于促进自身免疫疾病如结肠炎、过敏性哮喘和移植物抗宿主病的免疫耐受治疗，通过靶向HLA。最近，通过识别心脏成纤维细胞激活蛋白（FAP）的CAR T细胞靶向心脏纤维化，该蛋白在心肌损伤重塑时由心脏成纤维细胞高度表达。采用FAP特异性CAR的T细胞过继转移减少了心脏纤维化并恢复了小鼠的损伤后功能。该报告暗示CAR T细胞作为“活药”，在治疗目前疗法非常有限的心脏病中消除激活的心脏成纤维细胞。CAR T细胞用于治疗非恶性疾病其他应用的临床前开发正在进行中。 要点 采用嵌合抗原受体（CAR）重定向的T细胞的过继细胞治疗在某些血液学恶性肿瘤中取得了显著的治疗效果；然而，在其他疾病中的治疗效力仍然有限。 CAR是由结合域、跨膜域和细胞内信号传导域组成的模块化、重组的跨膜分子，用以激活工程化细胞。最佳分子设计需要通过变化组成域在每种情况下探索。 原型CAR设计可以通过使用各种靶向和信号传导元件进行修改，使CAR更加通用。此外，各种免疫细胞可以通过CAR重定向，提供方便的治疗细胞。 CAR T细胞治疗经常与毒性相关，这些毒性可以通过同时进行的治疗、改变CAR设计和靶向替代抗原来减少靶上非肿瘤毒性来减轻。 通过共同激活广泛的免疫反应、共同靶向肿瘤基质、癌症干细胞和其他与肿瘤相关的结构，可以提高CAR工程化免疫细胞的抗肿瘤效力。 生产CAR T细胞产品仍然具有挑战性，为所有患者提供个性化治疗；正在努力为广泛的患者群体制造异体细胞产品“现成”。 下章预告：抗体关键特性的改进 往期内容： 第二章：抗体：发现及特性的历史 第三章：单克隆抗体和杂交瘤细胞 第四章：抗体展示系统 第五章：转基因动物用于产生人类抗体 第六章：抗体在治疗、诊断和科学中的应用 第七章：双特异性抗体 第八章：抗体偶联药物 第九章：替代性结合框架：用于基础研究和治疗应用的多功能结合剂 为促进抗体行业的交流与创新，2024年10月16-17日第七届金秋十月抗体产业发展大会如约而至。会议旨在为研究人员提供一个互动交流的平台，有助于推动抗体产业的进一步发展。 会议内容 时间：2024年10月16-17日 地点：上海张江（酒店定向通知） 规模：600-800人 主办单位：生物制品圈、抗体圈 演讲支持：Entegris、瑞孚迪、AS ONE CORPORATION 会议费用：免费FREE!（仅收取100元报名定金，含参会学习、茶歇、会议手册，定金概不退还），先到先得，报完即止！ 报名方式：扫描下方二维码或点击文章最底部“阅读原文”→ 填写表格 → 报名成功（报名志愿者，承担一定工作，请慎重考虑，免交定金）！ 组委会获得报名信息后，根据报名信息进行初筛，并进一步与报名者沟通确认，实现精准邀请。最终有机会进入大会微信群（严格审核通过）。 日程安排 更多嘉宾正在邀请中 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

欢迎关注凯莱英药闻 本月，宜明昂科发布公告，公司IMM01(替达派西普)与替雷利珠单抗联用，治疗程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)抑制剂治疗后复发或病情有所进展的复发性或难治性(R/R)经典霍奇金淋巴瘤(cHL)患者的III期临床试验，已完成首例患者给药。IMM01是宜明昂科自主研发的新一代靶向CD47分子，是中国首个进入临床阶段的SIRPα-Fc融合蛋白，正被开发用于与其他药物联合治疗多种血液肿瘤和实体瘤。 CD47是一个关键的巨噬细胞检查点，在多种肿瘤细胞表面都有表达，其通过与巨噬细胞表面的SIRPα结合，传递“别吃我”信号，从而使其逃逸巨噬细胞的攻击；然而，在过去两年时间里，全球范围内不少药企都在CD47靶向药物的研发上折戟，其中包括吉利德、艾伯维、罗氏等MNC在内。 据不完全统计，宜明昂科官网目前共披露了14款药物，其中推进最为靠前以靶向CD47单抗和双抗为主。 宜明昂科的研发管线 从创立之初，宜明昂科就被认为是“All in CD47”，这样的底气和信心从何而来？我们将从以下几个方面对公司和现有产品进行阐述。 一 公司及财务情况 宜明昂科成立于2015年6月，是一家以科研为导向的生物技术公司，致力于开发肿瘤免疫疗法。公司利用先天和适应性免疫系统克服当前基于T细胞的免疫疗法的局限性，解决癌症患者大量未被满足的医疗需求。 2024年3月，宜明昂科公布2023年业绩，公司收入约38.6万元，研发开支增加5.3%至约2.92亿元，年内亏损约3.79亿元，同比收窄5.82%；每股亏损1.05元。这一业绩表明，‌尽管面临研发开支的增加，公司通过有效管理成本和资源，‌成功缩小了亏损额度；其研发开支增长主要归因于临床试验开支因临床候选药物的进展而增加，‌以及薪金及相关福利费用因临床团队的不断扩大而增加。‌这部分增加的开支部分被临床前及CMC开支减少所抵销。‌ 截至2023年12月31日，宜明昂科的现金及现金等价物（主要以美元、港元及人民币计值）、定期存款及按公允价值计量且其变动计入当期损益的金融资产合计为人民币6.09亿元。 二 研发平台 公司已建立一体化的内部研发平台，具备靶点选择与验证、药物发现、高通量筛选、测试及临床前研究、CMC及IND注册能力；其专有平台使其能够持续探索和开发新一代创新肿瘤疗法并推动它们进入临床阶段，包括专有的单克隆抗体受体重组蛋白双特异性分子平台、先进的杂交瘤技术、高通量筛选、免疫测定和生物检测技术、高效的细胞系开发和抗体产能，以及强大的CMC和产能，使公司能够有效地进行药物筛选和成药性分析，经济高效地自主生产高质量的候选药物，为药物开发工作提供坚定的支持。 三 重点产品介绍 1、靶向CD47融合蛋白：IMM01 IMM01（Timdarpacept）基于宜明昂科自有研发平台研发、经基因修饰，具有全球自主知识产权的新一代CD47靶向分子，具有“Best-In-Class”的潜力。IMM01具有双重机制，能够同时阻断来自肿瘤的“别吃我”信号，并通过IgG1激活患者免疫系统的“吃我”信号。 目前，IMM2520已获得中国NMPA、美国FDA批准开展临床试验；临床前毒性研究表明，IMM2520不与人体红细胞结合。在多种动物模型的体内试验中，IMM2520也展示出令人鼓舞的潜在疗效和安全性。 2024年6月，IMM01联合替雷利珠单抗治疗既往PD-(L)1抗体治疗失败后的cHL患者的II期更新数据显示：随访6.87个月，ORR达66.7%, CR 24.2%, DCR 93.9%，中位PFS和中位DOR未达到。在安全性上，绝大多数药物相关不良反应（TRAE）为1-2级的血液学的不良反应；其中3-4级的白细胞降低、血小板降低、中性粒细胞降低和贫血分别为12.1%、12.1%、12.1%和6.1%，在经过对症治疗后可完全恢复或者恢复至1级/基线水平；无溶血案例发生；无患者因TRAE导致永久停用研究药物或死亡。 2023 ASH上，公司更新了IMM01联合阿扎胞苷(AZA)治疗初治的CMML1-2型患者的数据，结果显示：ORR 72.7%，CRR 27.3%；治疗≥4个月的患者，ORR 达到87.5%，CRR 37.3%; 治疗超过≥6个月患者中, ORR达到83.3%, CRR 41.7%，疗效随着治疗时间延长而进一步提高。另外，IMM01联合AZA 治疗的安全性良好，不需要采用低剂量预激处理，对比AZA单药治疗数据，联合治疗没有增加毒性，没有出现新的药物安全信号。 2、靶向CD47/CD20双特异性分子：IMM0306 IMM0306（Amulirafusp alfa）是全球首个进入临床阶段的CD47×CD20双特异性分子，对CD20的亲和力高于CD47；相比起与CD47阳性的正常组织结合，该分子能优先同时与恶性B细胞上的CD20和CD47结合，并进一步减轻与CD47有关的毒性。目前，IMM0306正在开发用于治疗复杂性或难治性B细胞非霍奇金淋巴瘤(B-NHL)。 I期临床研究中，IMM0306单药显示出令人鼓舞的有效性和良好的安全性，8个剂量组中均没有观察到DLT。从0.8mg/kg开始至2.0mg/kg等四个剂量组，已观察到了5例CR，5例PR, 治疗复发难治性FL 的ORR 达到41%。同时，所有患者均没有出现明显的细胞因子风暴毒性。 此外，IMM0306联合来那度胺的II期临床研究正在快速进行中，初步的临床表现令人激动。 3、靶向VEGF/PD-L1双特异性分子：IMM2510 IMM2510是基于宜明昂科“mAb-Trap”技术平台研发的、具有自主知识产权的双抗类药物，通过靶向免疫调节靶点PD-L1，阻断了PD-L1和PD-1的结合，解除了肿瘤细胞免疫逃逸，并通过Fc介导的ADCC/ADCP激活NK细胞及巨噬细胞从而发挥强大的肿瘤免疫治疗作用；同时，通过阻断VEGF/VEGFR信号通路，抑制肿瘤血管生成从而抑制肿瘤的生长和转移。 临床前研究证实，IMM2510在多种肿瘤模型中均取得显著的治疗效果，IMM2510优于对应靶点的单药或针对两个靶点的联合用药，安全性上具有明显的优势。 临床I期显示，IMM2510在爬坡研究中观察到复发难治的非小细胞肺癌(腺癌、鳞癌)以及胸腺癌中显现初步积极的疗效信号，尤其是一例肺鳞癌患者经过PD-1抗体治疗以及联合化疗方案失败后，获得明显肿瘤缩小(PR)，且PR超过11个月，接受研究用药已经超过20个月，目前还在接受治疗中。 公司计划在单药以及联合不同治疗模式上，针对多个适应症做进一步开发，除软组织肉瘤外，还包括非小细胞肺癌、三阴乳腺癌，以及肝癌等常见肿瘤。 4、靶向CD47/HER2双特异性分子：IMM2902 IMM2902通过阻断HER2及CD47/SIRPα的抑制信号以及促进HER2降解，抑制肿瘤细胞的生长和增殖，并通过提高先天免疫反应进一步毁灭肿瘤细胞。2022年7月， IMM2902获得FDA授予针对乳腺癌的快速通道资格。 临床前研究表明，在多种乳腺肿瘤和胃肿瘤模型（包括HER2低表达和曲妥珠单抗耐药肿瘤模型）中，IMM2902均表现出强大的抗肿瘤活性。公司正在中国和美国分别进行I期临床试验，以评估IMM2902在晚期HER2阳性及HER2低表达实体瘤（包括乳腺癌、胃癌、非小细胞肺癌及胆管癌）的安全性及有效性。 5、靶向CD47×PD-L1双特异性分子：IMM2520 IMM2520通过靶向肿瘤细胞上的CD47和PD-L1及其独特设计，可同时激活巨噬细胞及T细胞，以实现强大的协同作用并触发持久的肿瘤免疫反应。目前，IMM2520处于I期临床试验剂量递增阶段，已出现1例既往治疗复发的小细胞肺癌PR患者，展示出令人鼓舞的潜在疗效。 临床前毒性研究表明，IMM2520不与人体红细胞结合。在多种动物模型的体内试验中，IMM2520也展示出令人鼓舞的潜在疗效和安全性。 6、靶向CD24单抗：IMM47 IMM47是一款具有全球首创潜力的靶向CD24用于癌症治疗的人源化单克隆抗体，凭借对肿瘤细胞上表达的CD24高特异性和高亲和力结合能力，IMM47能够阻断从CD24/Siglec-10通路传递至巨噬细胞、自然杀伤细胞(NK)和T细胞的免疫抑制信号。凭借基因工程技术改良的IgG1 Fc，IMM47通过强大的ADCP和ADCC有效激活巨噬细胞和自然杀伤细胞免疫反应。 临床前动物体内药效研究中，IMM47能够显著提高肿瘤组织中M1巨噬细胞的数量以及下调肿瘤细胞CD24表达，单药或者和PD-1/PD-L1免疫检查点抑制剂等药物联用都显示出了令人鼓舞的抑制肿瘤生长能力。 7、靶向CD47/CD24双特异性分子：IMM4701 IMM4701通过宜明昂科的单克隆抗体-受体重组蛋白平台开发，与公司其他基于CD47的双特异性分子具有类似的结构。IMM4701具有稳健的抗肿瘤活性，在多种实体瘤模型中，IMM4701在3.0 mg/kg（~0.3 mg/kg人体等效剂量）时可实现122%的肿瘤生长抑制率(TGI)。 8、靶向CTLA-4抗体：IMM27M IMM27M具有增强的ADCC活性，可诱导靶向CTLA-4过度表达、具有免疫抑制作用的调节性T细胞的强效免疫反应，促进调节性T细胞从肿瘤微环境中清除，从而增强T细胞的抗肿瘤反应。 临床前研究表明，IMM27M可诱导相比伊匹木单抗具有明显更强的抗肿瘤活性，且即使在低至0.3 mg/kg的剂量下达到肿瘤完全缓解，而该剂量伊匹木单抗仅表现出约50%的肿瘤生长抑制。 9、靶向CD70 单抗：IMM40H IMM40H可通过抑制CD70/CD27信号通路阻碍调节性T细胞的激活及增殖，是一款具有增强的ADCC活性的人源化单克隆抗体。体外细胞试验证明，IMM40H显示出较cusatuzumab更强的CD70结合亲和力，能够更有效地阻断CD70及CD27的相互作用。此外，IMM40H亦显示出强大的ADCC、补体依赖的细胞毒性(CDC)及ADCP活性，使对肿瘤细胞的强烈免疫攻击及潜在强效疗效。此外，临床前数据亦表明，IMM40H具有良好的安全性。 参考资料 1、公司官网 2、财通证券、每日经济新闻、智通财经、财联社 感谢关注、转发，转载授权、加行业交流群，请加管理员微信号“hxsjjf1618”。 “在看”点一下

摘要：癌症治疗中最大的挑战是以最小的损伤正常细胞来根除癌细胞。靶向治疗已经发展起来以应对这一挑战，与传统癌症治疗相比，显示出显著增加的治疗指数。由于其对目标抗原的非凡高特异性，抗体成为靶向治疗代理家族中的重要成员。治疗性抗体使用一系列机制直接或间接杀死癌细胞。早期的抗体被开发出来直接对抗癌细胞上的目标。随后是连接技术的进步，使得抗体-药物偶联物（ADCs）的生产成为可能，这些偶联物将细胞毒性有效载荷引导到癌细胞。我们对T细胞生物学的理解的提高，导致了免疫检查点抑制抗体的生产，这些抗体通过激活T细胞间接杀死癌细胞。甚至最近，双特异性抗体被设计合成，以重定向患者的T细胞杀死癌细胞。在这篇综述中，我们总结了治疗性抗体用来靶向癌细胞的不同方法。我们讨论了它们的作用机制、目标特异性的结构基础、临床应用以及正在进行的研究以提高疗效和减少毒性。 1. 引言 在过去的一个世纪中，发展了诸如化疗和放疗等有效的治疗手段来治疗癌症。不幸的是，这些方法通常缺乏足够的特异性，无法在不引起难以忍受的毒性的情况下，使用足够高的剂量来根除癌细胞。单克隆抗体可以提供所需的特异性水平，从而大幅扩大治疗窗口，有些抗体甚至能够区分相差一个氨基酸或经过翻译后修饰的两种抗原。20世纪70年代发展的杂交瘤技术首次允许生产和筛选针对人类抗原的高度特异性小鼠单克隆抗体。其次，将人类抗体恒定区嫁接到小鼠抗体可变区的能力，产生了具有更好治疗效果和较少副作用的嵌合抗体（图1）。第三，20世纪90年代转基因小鼠模型和噬菌体展示系统的应用，使得能够针对癌症靶点产生全人源抗体。随着这些技术进步和临床需求的增加，过去25年见证了基于抗体治疗的爆炸性增长。自1997年以来，已有50多种基于抗体的肿瘤治疗药物获得了美国食品药品监督管理局（FDA）和欧洲药品管理局（EMA）的批准（补充表1）。除了基于抗体的治疗外，抗体片段也被用来生成嵌合抗原受体（CARs）进行T细胞工程。在这篇综述中，我们专注于FDA和EMA批准的基于抗体的治疗以及正在临床前和临床开发中进展的抗体。我们讨论了用于产生嵌合、人源化和人源抗体的相继使用的方法的演变。我们详细说明了正在开发用于靶向癌细胞的一系列格式，如单特异性抗体、免疫检查点抑制剂、双特异性抗体和偶联抗体。最后，我们总结了为应对当前癌症靶向抗体开发中的挑战而进行的新兴研究。 2. 抗体生成 用于识别针对肿瘤抗原的治疗性单克隆抗体或抗体片段的一系列技术。这些技术包括使用目标抗原对啮齿动物进行免疫、噬菌体或酵母展示技术、从人类和小鼠中克隆单B细胞，以及从骆驼科动物中识别单域抗体（称为纳米抗体）。抗体的进一步临床应用开发涉及抗体工程，使其与人类免疫系统越来越兼容。 2.1 嵌合抗体和人源化抗体 单克隆抗体传统上是通过1975年Cesar Milstein和Georges Kohler开发的杂交瘤技术生产的。在这个过程中，B细胞是从免疫特定抗原的小鼠脾脏或淋巴结中分离出来的，然后与Sp2/0这样的骨髓瘤细胞系融合，形成称为杂交瘤细胞系的杂交细胞。通常通过酶联免疫吸附测定（ELISA）筛选杂交瘤克隆以检测蛋白结合，并通过流式细胞术检测细胞结合。杂交瘤技术能够稳健且成本有效地生成一系列小鼠单克隆抗体。然而，注入人体的小鼠抗体会产生人抗鼠抗体（HAMA）免疫反应，限制了它们的疗效并增加了不良反应。因此，获得监管批准的大多数小鼠抗体后来都被撤回（图1）。Blinatumomab（一种双特异性T细胞激活剂，靶向CD19），使用两个小鼠衍生的单链可变片段（scFv）格式，缺乏可结晶片段（Fc），是唯一在临床上广泛采用的小鼠抗体。 为了减少在患者中诱导免疫反应，小鼠抗体的恒定区被替换为人类恒定区，以产生嵌合抗体（图1）。利妥昔单抗（抗CD20）和西妥昔单抗（抗表皮生长因子受体（EGFR））（表1）是最早通过将小鼠抗体2B8和225的可变区连接到人类免疫球蛋白G1（IgG1）重链和人类κ轻链恒定区而产生的嵌合抗体之一。然而，带有小鼠可变区的嵌合抗体仍可被识别为外来物质，导致可能清除治疗性抗体的人抗嵌合抗体（HACA）免疫反应。这可能限制了嵌合抗体的重复应用并阻碍了它们的临床开发。为了进一步减少不必要的免疫反应，通过1980年代开发的称为“人源化”的过程增加了小鼠单克隆抗体的人类含量。人源化涉及将小鼠抗体的互补决定区（CDR）仅嫁接到人类抗体的框架区域（图1）。曲妥珠单抗是通过将小鼠人类表皮生长因子受体2（HER2）抗体mumAb4D5的CDR移植到人类抗体框架中而开发的首批人源化抗体之一，类似的策略被用于开发奥比妥珠单抗（抗CD20）、帕博利珠单抗（抗程序性细胞死亡蛋白1（PD1））和阿特珠单抗（抗PD1配体1（PDL1））（表1）。 除了小鼠杂交瘤技术外，还开发了兔杂交瘤技术，用于生产针对肿瘤抗原（如间皮素）的兔单克隆抗体。CDR嫁接方法已被调整以人源化兔单克隆抗体，如针对间皮素的YP218，用于临床开发。监管机构批准的大多数治疗性抗体是使用杂交瘤方法生成的，随后工程化成嵌合或人源化形式，并广泛用于癌症治疗（图1）。 2.2 全人抗体 1990年代开发的两种技术使得生成全人抗体成为可能：人类抗体噬菌体展示和表达人类抗体的转基因小鼠模型。为了生成产生人类抗体的转基因小鼠，人类Ig基因座或可变区被插入到小鼠基因组中，同时破坏小鼠Ig基因。从小鼠中分离出免疫目标抗原的B细胞，用于单B细胞克隆和测序。转基因小鼠平台XenoMouse（Abgenix/Amgen）、VelocImmune（Regeneron）和HuMab（Medarex/Bristol Myers Squibb）产生了9种获批的针对癌症靶标的人类抗体：daratumumab（抗CD38）、ipilimumab（抗细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4（CTLA4））、nivolumab（抗PD1）、ofatumumab（抗CD20）、panitumumab（抗EGFR）、durvalumab（抗PDL1）、cemiplimab（抗PD1）、tisotumab（抗组织因子（TF））和relatlimab（抗淋巴细胞激活基因3（LAG3））（表1）。这些抗体的成功临床开发导致了KyMouse（Kymab）、OmniRat（Ligand）、H2L2 Mouse（Harbour Antibodies）、Trianni Mouse（Trianni Inc/AbCellera）和RenMab（Biocytogen）等多个转基因小鼠平台的快速崛起。 图1 | 抗体组分。a, 抗体由两个相同的轻链和重链组成，它们通过二硫键连接在一起，呈现出Y字形结构。每个轻链和重链都包含一个可变区（VL和VH），负责抗原结合，以及恒定区（CL和CH），决定抗体的半衰期和效应功能。酶促处理可以将抗体分解成两个片段，分别命名为片段抗原结合（Fab）和可结晶片段（Fc）。轻链和重链的可变区共同构成可变片段（Fv），是保留抗原结合能力的最小片段。制造的Fv片段通过柔性肽连接起来，形成一个称为单链可变片段（scFv）的单一链。根据来自每个物种的肽序列量，抗体被分为小鼠、嵌合、人源化和人类抗体。a Belantamab mafodotin 被撤回，但可能会根据正在进行的试验重新获得批准。Teclistamab（一种人源化和人类抗体的组合）在此图中被视为人源化抗体。CDRs，互补决定区。 展示技术为人类抗体开发提供了另一种平台。使用噬菌体展示，可以从多样性超过10^10的大型文库中分离出人类单链可变区（scFv）或片段抗原结合（Fab）片段（图1）。噬菌体展示技术通常使用M13丝状噬菌体来表达与噬菌体pIII外壳蛋白融合的抗体片段，如scFv。噬菌体文库用固定在微孔板或珠子上的目标抗原进行筛选。非特异性噬菌体结合物被洗去，剩余的特异性结合物被收集用于下一轮筛选。通常需要3到5轮筛选来分离特异性结合物。这个过程称为噬菌体淘选，它模仿体外免疫选择。使用下一代测序的新方法有助于快速识别稀有结合物。Dyax生产的噬菌体展示系统产生了三种获得监管批准的全人抗体：ramucirumab（抗血管内皮生长因子受体2（VEGFR2））、necitumumab（抗EGFR）和avelumab（抗PDL1）（表1）。此外，由Dyax、Cambridge Antibody Technology、MorphoSys等产生的多个噬菌体展示衍生的人类抗体目前正在进行临床试验。转基因小鼠和噬菌体展示技术都有其独特的优势。通常，转基因小鼠平台倾向于产生具有更理想生物物理特性和在临床试验中表现更好的抗体，而噬菌体展示允许选择针对特定表位的抗体。除了噬菌体展示，细胞表面展示（酵母、细菌和哺乳动物）、核糖体展示和mRNA展示技术已被用于抗体生成。酵母和哺乳动物细胞表面展示允许在真核细胞的细胞表面表达重组抗体片段。这使得可以通过流式细胞术分离抗原特异性细胞，并发现高亲和力结合物。Sintilimab，一种特异性针对PD1的人类IgG4抗体（表1），是通过酵母细胞表面展示分离的，目前正在接受FDA监管审查以获得批准。 2.3 比较嵌合、人源化和全人抗体 生产嵌合、人源化或全人抗体的目标是减少针对抗体的免疫反应，这种反应带有中和风险和不良反应（例如，输注反应和过敏反应），并随着重复给药而增加。对各种抗体治疗的人类临床试验的大规模分析显示，使用嵌合、人源化和全人抗体时，免疫原性逐渐下降。然而，该研究没有检查较低的免疫原性是否会导致更好的肿瘤消退或患者生存。几种FDA批准和EMA批准的嵌合、人源化和全人抗体针对常见的癌症抗原，如CD20、HER2和EGFR，尽管它们在不同的表位上具有不同的结合特性（表1）。 ADCC，抗体依赖性细胞介导的细胞毒性；ADCP，抗体依赖性细胞介导的吞噬作用；ASPS，肺泡软组织肉瘤；BCC，基底细胞癌；CDC，补体依赖性细胞毒性；dMMR，错配修复缺陷；HCC，肝细胞癌；HNC，头颈癌；IgG，免疫球蛋白G；MCC，默克尔细胞癌；MSI-H，微卫星高度不稳定性；NA，数据不可用；PMBCL，原发性纵隔大B细胞淋巴瘤；RCC，肾细胞癌；SCC，鳞状细胞癌；TNBC，三阴性乳腺癌。 比较针对CD20（利妥昔单抗与奥比妥珠单抗或利妥昔单抗与奥法木单抗）、HER2（曲妥珠单抗与马格图珠单抗）和EGFR（西妥昔单抗与帕尼图珠单抗）的抗体的III期临床试验已经证明，总生存率相似，治疗相关治疗中断的比率也相似，表明具有等效的治疗效力。然而，大量的HAMA免疫反应阻碍了针对二唾液神经节苷GD2的小鼠抗体的开发，并且在使用利妥昔单抗治疗自身免疫性疾病的患者中观察到了强烈的HACA免疫反应。对HACA免疫反应的担忧，加上简化了人源化和全人抗体生成的技术进步，增加了这两种格式的使用。进入当前临床试验的抗体要么是人源化的，要么是全人产品（图1和补充表2），根据以前的试验结果，人源化和全人抗体在患者中倾向于展示相似的治疗效力。 2.4 不同格式的抗体治疗 根据它们的结构和功能机制，抗体治疗可以分为三种主要格式——单特异性抗体、双特异性抗体和与有效载荷（如药物、毒素或放射性同位素）偶联的抗体（图2）。 2.5 单特异性抗体格式 单特异性抗体格式涉及全长免疫球蛋白，它们结合到目标抗原上。在五种免疫球蛋白亚型（IgG、IgM、IgA、IgE和IgD）中，只有IgG能够结合到新生儿Fc受体（FcRn），从而带来长半衰期（大约21天）。针对癌症的抗体利用IgG亚型来利用这一延长的半衰期，通常每21天给药一次。大多数FDA批准和EMA批准的抗体以及正在开发的抗体都使用单特异性IgG抗体格式（见图1自然发生的IgG抗体的基本结构）。IgG抗体有四个亚类（IgG1、IgG2、IgG3和IgG4），大多数治疗性抗体使用IgG1亚类。单特异性抗体格式的目标抗原是细胞表面蛋白，主要是在实体癌中过度表达的生长因子受体（例如，在乳腺癌、胃癌和胃食管癌中过度表达的HER2；在结肠癌中过度表达的EGFR；在肺癌中过度表达的MET）。对于血液恶性肿瘤，抗体通常针对由不同免疫细胞亚群表达的细胞表面糖蛋白（也称为簇分化（CD）标记），例如B细胞恶性肿瘤中的CD19和CD20；T细胞恶性肿瘤中的CD52和CC基序趋化因子受体4（CCR4；也称为CD194）；浆细胞恶性肿瘤中的CD38和B细胞成熟抗原（BCMA；也称为TNFRSF17）。目标及其相应的抗体列在表1中。 2.5.1 作用机制 抗体与癌细胞结合通过多种机制导致癌细胞死亡。直接阻断生长因子的生存信号和阻断血管生成导致肿瘤血液供应中断是这些抗体对实体肿瘤消退的两个主要机制。相比之下，血液恶性肿瘤中针对的CD标记通常在促进癌细胞存活方面没有重要作用，尽管一些研究表明针对CD20或CD52的抗体可以诱导非caspase依赖性的程序性细胞死亡。相反，抗体通过招募和激活免疫效应细胞来诱导细胞毒性。每个IgG抗体亚类赋予抗体不同的效应功能。IgG1亚类Fc片段对巨噬细胞和自然杀伤（NK）细胞表达的激活Fcγ受体（FcγRs；FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIIa和FcγRIIIb）有很强的亲和力。FcγR结合导致巨噬细胞和NK细胞介导的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）和抗体依赖性细胞吞噬作用（ADCP），直接杀死癌细胞（见图2）。最早获得FDA批准的两种抗体是针对恶性B细胞表达的CD20的利妥昔单抗和针对过度表达HER2的乳腺癌细胞的曲妥珠单抗，这两种抗体都使用常见的IgG1亚类。IgG1诱导ADCC和ADCP的能力最终导致癌细胞死亡，并且可以通过Fc工程进一步增强。支持这一作用机制的是，例如携带FcγRIIIa等位基因中纯合子158缬氨酸/缬氨酸的患者对利妥昔单抗和曲妥珠单抗的反应更高。IgG1亚类还结合补体蛋白C1q，导致通过补体依赖性细胞毒性（CDC）的癌细胞死亡。 图2 | 抗体格式和作用机制。a, 根据结构和作用机制，治疗性抗体可以分为三种不同的格式：单特异性抗体、双特异性抗体，以及与药物、毒素或放射性同位素偶联的抗体。b, 单特异性抗体结合癌细胞上的抗原，通过多种机制导致细胞死亡，包括破坏生长因子受体（如人类表皮生长因子受体2（HER2））的生存信号，激活免疫细胞（如通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）的自然杀伤（NK）细胞介导的杀伤和通过抗体依赖性细胞吞噬作用（ADCP）的巨噬细胞介导的杀伤），以及通过激活补体级联反应（补体依赖性细胞毒性（CDC））。免疫检查点阻断抗体结合并激活免疫细胞，如T细胞，导致免疫介导的癌细胞死亡。双特异性抗体结合两种不同的抗原。大多数双特异性抗体设计为结合T细胞（T细胞激活剂）和癌细胞，并将T细胞重定向以杀死癌细胞。非T细胞激活的双特异性抗体结合癌细胞表面的两种不同抗原，导致直接杀死癌细胞。抗体-药物偶联物（ADCs）、免疫毒素和放射性同位素偶联抗体携带有毒载荷，增强了抗体杀死癌细胞的能力。BCMA，B细胞成熟抗原；EGFR，表皮生长因子受体；gp100，糖蛋白100；GPRC5D，G蛋白偶联受体家族C组5成员D；FcγR，Fc γ受体；PD1，程序性细胞死亡蛋白1；PDL1，PD1配体1；scFv，单链可变片段；TCR，T细胞受体。 尽管大多数直接介导癌细胞死亡的癌症靶向抗体更倾向于使用IgG1亚类（见表1），但一个例外是帕尼图珠单抗，一种IgG2 EGFR抗体。IgG2抗体只能弱激活NK细胞和补体，而是通过招募髓系细胞来介导癌细胞死亡。目前市场上的单克隆抗体主要是IgG1。除了效应功能外，IgG亚类的选择还基于结构稳定性、循环半衰期、制造经验以及监管批准、缺乏免疫原性或意外副作用，以及公司开发组合中特定IgG亚类的可用性。 研究了曲妥珠单抗的Fab片段与HER2胞外域复合物的结构，为治疗机制提供了首个结构基础。曲妥珠单抗结合HER2的第四个亚域，阻止其同源二聚体形成，进而减少细胞增殖（蛋白质数据银行（PDB）：1N8Z；见图3a）。结构技术的进步促成了首个应用冷冻电镜（cryo-EM）技术获得的HER2与两种靶向HER2的抗体曲妥珠单抗和帕妥珠单抗复合物的结构[61]。与曲妥珠单抗不同，帕妥珠单抗通过与HER2的第二亚域相互作用，抑制HER2与HER3配体诱导的异源二聚体形成，破坏下游信号传导（见图3a）。曲妥珠单抗和帕妥珠单抗的结合表位相隔约60埃（Å），HER2-曲妥珠单抗-帕妥珠单抗复合物结构指导了双特异性抗体Zanidatamab的设计，该抗体与两种HER2表位相互作用，具有改善的治疗效力。 结构生物学技术也被用来理解利妥昔单抗的治疗机制；具体来说，利妥昔单抗如何促进CD20的聚集。在最初的高分辨率结构中，似乎CD20形成了同源二聚体，利妥昔单抗的Fab片段结合到每个CD20单体的胞外区域（PDB：6VJA；见图3b）。利妥昔单抗两个Fab片段之间的距离表明单一利妥昔单抗IgG分子无法结合CD20同源二聚体。使用全长IgG利妥昔单抗进行的额外电子显微镜研究提供了首个证据，表明利妥昔单抗交联两个CD20同源二聚体，结果形成一个大的超分子复合物，确立了利妥昔单抗的结合机制。 2.5.2 单特异性抗体Fc工程 大多数IgG1抗体的效应功能由Fc域介导。数十年的研究增进了我们对Fc域与不同Fc受体相互作用的理解，并协助工程化具有理想效应功能的抗体。在临床前研究中显示增加活性的常见Fc域修饰包括去岩藻糖基化（从Fc区域去除岩藻糖以增加FcγRIIIa结合）或关键残基的氨基酸替代（例如S239D和I332E，增加与Fc受体的结合），两者都导致增强的ADCC和ADCP。两种在临床使用的抗体具有去岩藻糖基化的Fc（靶向CD20的奥比妥珠单抗和靶向CCR4的莫加木单抗）以增强它们的免疫效应功能（见表1）。随机临床试验（GALLIUM和GOYA研究）评估了利妥昔单抗（未经Fc修饰的CD20抗体）或奥比妥珠单抗（Fc去岩藻糖基化的CD20抗体）在不同淋巴瘤亚型中的益处。在GOYA研究中，两组患者的结果相似。GALLIUM研究显示接受奥比妥珠单抗治疗的患者有更好的无进展生存期（PFS），但未能证明总体生存益处，这是肿瘤学中的重要基准。此外，GALLIUM研究也因使用比利妥昔单抗更高剂量的奥比妥珠单抗而受到批评，这可能混淆了PFS结果。两种在Fc域具有氨基酸替代以增加ADCC的抗体已获得FDA批准：HER2抗体Margetuximab和CD19抗体Tafasitamab（见表1）。III期试验比较了Margetuximab与曲妥珠单抗（Fc未经修饰的HER2抗体）在乳腺癌患者中的疗效。尽管早期分析显示Margetuximab减少了癌症进展，但最终分析中两组的总体生存率相同。基于这些临床试验结果，Fc工程化抗体治疗癌症患者的益处仍然不清楚。 2.5.3 免疫检查点抑制剂 在过去十年中，另一组靶向免疫细胞调节检查点的单特异性抗体对癌症患者显示出显著的临床疗效。目前11种FDA批准和EMA批准的免疫检查点抑制抗体现在被用于治疗20多种不同类型的癌症，包括肺癌、黑色素瘤、肾细胞癌、头颈鳞状细胞癌（见图4a,b），预计近期将有更多的这些抑制性抗体获得批准（见表1）。免疫检查点抑制剂在大多数癌症类型中显示出20-30%的响应率。然而，某些恶性肿瘤如霍奇金淋巴瘤和皮肤癌、微卫星高度不稳定性（MSI-H）癌症、PDL1表达升高的癌症、突变负担高（每兆碱基≥10个突变），以及与病毒相关的一些癌症的响应率显著更高。 2.5.4 作用机制 免疫检查点阻断抗体抑制了对T细胞起负向调节作用的途径，从而重新激活细胞毒性T细胞以杀死癌细胞（见图2）。在临床试验中正在研究的20多个免疫检查点中，治疗性抗体已经获得FDA或EMA批准的三个蛋白或途径是CTLA4、PD1-PDL1和LAG3。免疫检查点抑制剂的作用机制已在其他综述文章中广泛讨论，因此这里只简要提及。CTLA4、PD1和LAG3的表达是在T细胞刺激后诱导的，其主要目的是限制T细胞激活的程度。PD1与其配体PDL1和PDL2相互作用，这在癌细胞表面经常过度表达。PD1与其配体的结合导致招募酪氨酸磷酸酶，该磷酸酶去磷酸化T细胞受体（TCR）下游的信号分子。这阻止了TCR介导的T细胞增殖（信号1），并减弱了T细胞对癌细胞的响应，使肿瘤能够逃避免疫系统。CTLA4与T细胞共刺激受体CD28竞争结合抗原呈递细胞（APCs）上的CD80和CD86。CTLA4与这些配体的结合阻止了CD28共受体信号传导（信号2），从而抑制T细胞激活并损害对癌症的免疫反应。同样，当LAG3与主要组织相容性复合体（MHC）II类分子或纤维蛋白原样蛋白1（FGL1）结合时，LAG3表达对T细胞和NK细胞功能的负向调节作用。破坏这些相互作用的抗体通过降低激活阈值允许增强的T细胞激活，使耗尽的T细胞“重新激活”，并将新的T细胞克隆招募到肿瘤中。免疫检查点抑制剂也可能对调节性T细胞（Treg细胞）有不同的影响，这是一群在肿瘤微环境中抑制免疫活动的T细胞亚群。一些使用小鼠模型和人类体外模型的研究表明，PD1和CTLA4阻断可以选择性地耗尽Treg细胞并增强抗肿瘤免疫。然而，在接受免疫检查点抑制剂治疗的患者中并未观察到这种Treg细胞耗竭，因此，与Treg细胞失活相比，细胞毒性T细胞的压倒性重新激活可能是推动免疫检查点抑制剂介导的肿瘤回归。 图3 | 抗体-抗原相互作用的结构基础。a, 针对人表皮生长因子受体2 (HER2) 的抗体结合不同的HER2表位。冷冻电镜 (cryo-EM) 结构显示了与曲妥珠单抗和帕妥珠单抗的片段抗原结合 (Fab) 域结合的HER2胞外域 (ECD)（PDB ID: 8Q6J）。b, CD20同源二聚体与两个利妥昔单抗Fab域复合物的冷冻电镜结构（PDB ID: 6VJA）显示每个CD20分子与一个利妥昔单抗Fab结合。利妥昔单抗通过交联CD20二聚体形成大的超分子复合物来促进CD20的聚集。c, 针对程序性细胞死亡蛋白1 (PD1) 的抗体结合不同的PD1表位。Pembrolizumab Fab（橙色和金色；PDB ID: 5GGS）和Nivolumab Fab（洋红色和粉色；PDB ID: 5GGR）与PD1配体1 (PDL1)（白色）在PD1（青绿色）上的结合位点重叠，阻止了PD1-PDL1相互作用。所有蛋白质分子都显示了表面表示。d, PD1-PDL2（PDB ID: 6UMT）和PDL1抗体Atezolizumab（PDB ID: 5XXY）结构的对齐。结构分析表明，PDL2的残基Trp100适合PD1内部的口袋并有助于PD1-PDL2结合。PDL2中同样的残基（Trp100）扰乱了Atezolizumab与PDL2的结合。e, Ipilimumab（PDB ID: 5TRU）和Tremelimumab（PDB ID: 5GGV）Fab域与细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4 (CTLA4)的复合物结构显示出具有大的埋藏表面积的类似结合表位，有效地竞争天然配体CD80和CD86的结合。f, p53(R175H)多肽-主要组织相容性复合物 (MHC) 结合抗体平行于MHC分子内部的肽结合槽结合（PDB ID: 6W51）。相比之下，p53(R175H)特异性T细胞受体 (TCR) 垂直于肽结合槽结合（PDB ID: 6VQO）。 PD1阻断抗体是目前使用最广泛的免疫检查点抑制剂。七种获批的PD1阻断抗体（nivolumab、pembrolizumab、cemiplimab、dostarlimab、retifanlimab、tislelizumab和toripalimab）和两种目前正在临床试验中的抗体（见表1）使用IgG4格式，该格式不能有效地激活补体级联反应，并且与IgG1亚型相比具有较弱的Fc受体结合。因此，IgG4格式可能保护表达PD1的效应T细胞不被意外地通过ADCC或CDC杀死。针对LAG3的抗体relatlimab也使用类似的IgG4格式。所有IgG4抗体都带有S228P突变以防止Fab臂交换（见表1）。在获批的PD1抗体中，只有pembrolizumab的全长结构已被确定。该结构揭示了Fc域内CH2域旋转，完全暴露了糖蛋白。与其他报道的Fc域结构相比，这种CH2域构象是这些IgG亚类的分子灵活性的新描述，并且可以进一步研究以了解这种构象如何有助于较弱的Fc受体结合。相比之下，PDL1和CTLA4阻断抗体使用IgG1格式。尽管atezolizumab和durvalumab使用修饰过的Fc域限制了FcR介导的效应功能，avelumab和ipilimumab使用未修饰的Fc域保留了CDC和ADCC活性。尽管在临床试验中没有PD1和PDL1阻断抗体的直接比较以确定它们的效力，但对PD1途径阻断抗体的临床试验的荟萃分析得出结论，PD1抗体比PDL1抗体略为有效，可能是因为PD1抗体阻断了PD1与PDL1和PDL2的相互作用。值得注意的是，使用具有功能性Fc区域的IgG1格式的avelumab在肺癌、卵巢癌、胃癌和头颈癌患者中未能表现出益处，尽管其他免疫检查点抑制剂在这些相同癌症类型的患者中表现出成功。因此，使用IgG1格式及其介导效应T细胞杀伤的潜力可能导致其次优的试验结果。 已经确定了本文描述的几种免疫检查点抑制剂抗体与其目标蛋白复合物的结构基础。这些结构揭示了表位界面的多样性、复合物的埋藏表面积以及抗体结合后目标蛋白的构象变化。两种PD1阻断抗体，pembrolizumab（PDB ID：5GGS）和nivolumab（PDB ID：5GGR），尽管每种抗体与PDL1配体结合位点广泛重叠，但它们在不同的表位结合PD1（见图3c）。PDL1靶向抗体（atezolizumab、durvalumab、avelumab）与PDL1和PDL2复合物的晶体结构鉴定了一个关键残基PDL2（Trp100），它阻碍了抗PDL1抗体与PDL2的结合，并提供了PDL1和PDL2之间选择性的机制[92,95,96]（PDB ID：5XXY）（见图3d）。PDL1中相应的残基是丙氨酸，允许PDL1与atezolizumab结合。与PD1结合抗体相比，两种CTLA4靶向抗体，ipilimumab（PDB ID：5XJ3）和tremelimumab（PDB ID：5GGV），共享类似的结合表位，有效地与天然配体CD80和CD86竞争（见图3e）。与CD86相比，抗体与CTLA4复合物更大的埋藏表面积（约600 Ų）有助于这种作用机制。 2.5.5 免疫检查点抑制剂的毒性 免疫检查点阻断抗体通过普遍的免疫激活介导癌细胞的死亡，但有时这种激活可能会错误地针对健康组织。免疫检查点抑制抗体具有非常明显的不良反应谱，被称为免疫相关不良事件（irAEs）。这些irAEs包括各种表现，如皮肤、胃肠道、肝脏、内分泌、肺和心脏事件。尽管不常见，但严重的甚至可能致命的毒性偶尔可能会由于免疫检查点抑制而产生。在许多情况下，需要暂时使用糖皮质激素、肿瘤坏死因子（TNF）拮抗剂、麦考酚酸莫非尔或其他免疫调节剂进行免疫抑制以管理irAEs。 2.6 双特异性抗体格式 第二种格式包括多样化的双特异性抗体类别。与单特异性抗体不同，双特异性抗体结合两种不同的抗原或表位。这些抗原可以位于相同的目标细胞上，也可以位于不同的细胞上。针对两种不同细胞的双特异性抗体主要是T细胞激活剂，将癌细胞与效应T细胞交联；因此，它们被称为T细胞激活剂（TCE）双特异性抗体。在交联后，效应T细胞被激活，通过释放细胞毒性颗粒和淋巴因子来杀死结合的目标癌细胞（见图2）。另一类双特异性抗体作用于同一目标细胞表达的不同抗原，如两种不同的生长因子受体。这样的双特异性抗体通过阻断目标生长因子受体的增殖信号，并通过激活NK细胞和巨噬细胞对抗癌细胞来杀死目标细胞。 2.6.1 双特异性T细胞激活剂 2014年Blinatumomab的监管批准导致这种基于抗体治疗的类别爆炸性增长。原型TCE双特异性Blinatumomab是一种小型54-kDa融合蛋白，大约是IgG抗体的三分之一大小（见表2）。Blinatumomab由双特异性抗体所需的最小元素组成；一个针对癌症的scFv（抗CD19）通过甘氨酸-丝氨酸肽连接与一个T细胞结合scFv（抗CD3）连接。Blinatumomab通过抗CD19 scFv结合B细胞，并同时通过抗CD3 scFv连接并激活T细胞，导致B细胞死亡（见图2）。Blinatumomab在一系列B细胞恶性肿瘤中显示出活性（见图4c,d），并获得批准用于治疗B细胞前体急性淋巴细胞性白血病（B-ALL）。随后获得监管批准的TCE双特异性抗体采用了Blinatumomab的基本设计（见图5a）。 图4 | 使用免疫检查点抑制剂或双特异性抗体重新激活或重新定向T细胞对癌细胞的治疗效果。a,b, 来自一位患有头颈鳞状细胞癌（HNSCC）并涉及左侧舌边缘的个体的氟脱氧葡萄糖（FDG）-正电子发射断层扫描（PET）图像（a）和用苏木精和伊红（H&E）染色的肿瘤切片（b）。该患者接受了免疫检查点抑制剂nivolumab和ipilimumab的治疗，并经历了肿瘤负担的大幅减少。治疗中的H&E切片显示角蛋白碎片（KD）和周围的多核巨细胞（箭头）以及治疗中的FDG-PET图像显示舌边缘FDG摄取的减少。c, 一位患有B细胞淋巴瘤的患者的CT扫描，在治疗前和接受靶向CD19的双特异性抗体T细胞激活剂blinatumomab治疗4周后。该患者对blinatumomab有部分反应。箭头指向纵隔中受累的淋巴结肿瘤。d, 另一位患有B细胞淋巴瘤的患者的骨髓活检样本，在治疗前和接受blinatumomab治疗15天后。肿瘤细胞以蓝色显示（苏木精染色），T细胞以棕色显示（CD3染色）。部分a和b改编自，Springer Nature。部分c和d经，AAAS许可转载。 制药公司经常为使用不同架构和组装双特异性抗体的方法的独特TCE格式注册商标。常见的格式包括双特异性T细胞激活剂（BiTE）（Amgen）、Duobody（Genmab）、DART（MacroGenics）和Xmab（Xencor），Blinatumomab使用BiTE格式。Tebentafusp是一种独特的TCE双特异性格式，名为ImmTAC，它将针对黑色素瘤细胞中表达的糖蛋白-100（gp100）-人类白细胞抗原（HLA）-A02复合物的亲和增强型TCR与抗CD3 scFv连接。Tebentafusp在转移性葡萄膜黑色素瘤患者中显示出优越的总生存率，导致其在2022年获得批准。在过去的2年中，有六种针对血液恶性肿瘤的新型双特异性抗体获得了监管批准。这些包括teclistamab和elranatamab（BCMAxCD3），以及talquetamab（G蛋白偶联受体家族C组5成员D（GPRC5D）xCD3）用于多发性骨髓瘤，以及mosunetuzumab、epcoritamab和glofitamab（CD20xCD3）用于B细胞淋巴瘤（见表2）。然而，TCE双特异性抗体在实体瘤中的批准落后。然而，针对实体恶性肿瘤的TCE双特异性抗体的临床试验激增，让人们看到了这一策略将增加其效用的广度的希望。最近有关针对小细胞肺癌中delta样蛋白3（DLL3）的TCE双特异性抗体的I期试验的积极报告令人鼓舞，并表明实体瘤障碍将被突破。 2.6.2 双特异性抗体靶向同一细胞上的不同抗原 双特异性抗体也被设计为结合目标癌细胞上的两种不同的抗原或表位，而无需与效应T细胞结合。它们的抗癌效果是通过阻断两条增殖信号通路来介导的，从而最大化了抗肿瘤活性。除了它们的受体阻断活性外，这些双特异性抗体还可能被设计为包含一个功能性的IgG1 Fc域，使它们能够通过非T细胞的免疫效应途径如ADCC、ADCP和CDC杀死癌细胞。Amivantamab是首个靶向癌细胞表达的EGFR和MET（表2）的受体阻断双特异性抗体，并获得监管批准用于治疗带有外显子20插入突变的非小细胞肺癌。Amivantamab阻断了EGFR和MET通路的信号传导，这些通路驱动了一部分肺癌，比单一受体结合抗体的组合更有效。此外，Amivantamab的IgG1 Fc域被设计为低岩藻糖水平，这增强了FcγRIIIa的结合和NK细胞介导的ADCC。Zanidatamab采用了类似的双特异性设计，它用每个Fab臂结合两种不同的HER2表位（表2）。这些臂针对HER2的第二个和第四个亚域，分别是已批准用于治疗HER2阳性乳腺癌的HER2靶向抗体帕妥珠单抗和曲妥珠单抗的结合位点。临床前研究表明，与曲妥珠单抗、帕妥珠单抗或曲妥珠单抗和帕妥珠单抗的组合相比，Zanidatamab增强了HER2聚集、受体下调，并增加了CDC介导的HER2阳性癌细胞的杀伤。在I期临床试验中，Zanidatamab对一系列HER2阳性实体瘤显示出令人鼓舞的活性。 ADCC，抗体依赖性细胞介导的细胞毒性；ALL，急性淋巴细胞性白血病；CRS，细胞因子释放综合征；Ig，免疫球蛋白；irAEs，免疫相关不良事件；IV，静脉注射；kDa，千道尔顿；scFv，单链可变片段；TLS，肿瘤溶解综合征。带有Fc的双特异性抗体还带有Fc突变，这些突变使得异源重链能够配对（未显示）。 2.6.3 双特异性抗体Fc工程 Blinatumomab的血清半衰期很短，大约为2小时，因为这种小多肽可以快速被肾脏清除，并且缺乏FcRn介导的循环所需的Fc域。由于其半衰期短，Blinatumomab通过连续静脉输注给药，以维持一致的血清浓度。连续输注装置需要额外的医疗资源，增加成本，并且与间歇输注相比，对患者来说不够方便。在Blinatumomab之后获得监管批准的双特异性抗体具有更高的分子量，大多数包含一个延长半衰期的Fc域（见表2）。具体来说，Tebentafusp的分子量约为75kDa，高于肾脏滤过的截止值，因此不会被肾脏快速清除。然而，Tebentafusp缺乏Fc域，因此具有相对较短的半衰期为7.5小时。Mosunetuzumab、Teclistamab、Epcoritamab、Glofitamab和Elranatamab包含IgG1、IgG2或IgG4 Fc域（见表2），这增加了它们的分子量超过Tebentafusp（约145kDa），并使FcRn能够结合。这些修改延长了血清半衰期，并允许间歇（每周）剂量。添加这样的Fc域倾向于被包括在所有即将到来的双特异性抗体设计中。由于IgG1 Fc片段对巨噬细胞和NK细胞上的Fcγ受体有很强的亲和力，带有IgG1 Fc片段的TCE双特异性抗体可能通过抗CD3 scFv与巨噬细胞或NK细胞（通过IgG1 Fc片段）交联，导致巨噬细胞或NK细胞无意中杀死T细胞，反之亦然。已经在Fc域引入了氨基酸替代（例如，在Mosunetuzumab中的N297G或在Glofitamab中的P329G、L234A和L235A）以消除FcγR结合并减少无意中的免疫细胞杀伤（见表2）。使用IgG2或IgG4 Fc域的TCE双特异性抗体可能不需要这样的Fc域沉默，因为它们与FcγRs的相互作用较弱。 2.6.4 双特异性抗体的毒性 TCE双特异性抗体由于使用相同的抗癌机制——通过T细胞激活来杀死目标细胞（表2），因此具有类似的不良反应。毒性水平与携带TCE双特异性抗体靶标的细胞（肿瘤或正常细胞）的总身体负担有关。TCE双特异性抗体可诱导全身性炎症，特征为发热、不同程度的缺氧、低血压，偶尔多器官衰竭，统称为细胞因子释放综合征（CRS）。神经毒性是与TCE双特异性抗体相关的另一种独特的不良反应，表现为意识混乱和震颤，以及言语和行为的改变。CRS和神经毒性的病理生理学尚不完全清楚，可能与干扰素γ（IFNγ）、白细胞介素-6（IL-6）、IL-1和IL-10等细胞因子水平升高有关。接受TCE双特异性抗体治疗的患者需要密切监测，可能需要使用糖皮质激素或抗细胞因子药物如IL-6中和抗体tocilizumab进行免疫抑制。此外，为预防或减少CRS和神经毒性，已实施了几种策略，包括逐渐增加TCE双特异性抗体剂量、预防性糖皮质激素，以及在开始TCE双特异性抗体治疗前使用化疗减少肿瘤负担。受体阻断双特异性抗体无法激活T细胞，因此不会引起TCE双特异性抗体通常观察到的CRS或神经毒性。受体阻断双特异性抗体的不良反应与它们的单特异性抗体类似，如amivantamab引起的皮疹（也见于靶向EGFR的抗体cetuximab和panitumumab）和zanidatamab引起的心力衰竭（也见于靶向HER2的抗体trastuzumab）（表2）。 图5 | 双特异性抗体和偶联抗体的发展时间线。a, 双特异性抗体的时间线。b, 药物偶联、免疫毒素偶联和放射性同位素偶联抗体的时间线。a Catumaxomab，一种上皮细胞黏附分子(EpCAM)xCD3双特异性抗体，于2009年获得欧洲药品管理局(EMA)批准用于治疗恶性腹水，但后来因商业原因被制造商撤回。ADC, 抗体-药物偶联物；ALL, 急性淋巴细胞性白血病；B-ALL, B细胞前体急性淋巴细胞性白血病；BCMA, B细胞成熟抗原；AML, 急性髓系白血病；CEA, 癌胚抗原；EGFR, 表皮生长因子受体；FDA, 美国食品药品监督管理局；gp100, 糖蛋白100；HCL, 毛细胞白血病；MRD, 最小残留病；NHL, 非霍奇金淋巴瘤；NSCLC, 非小细胞肺癌；OS, 总生存期；PFS, 无进展生存期；TCR, T细胞受体。 2.7 偶联抗体格式 第三种主要格式涉及与有毒载荷连接的抗体，如细胞毒素（抗体-药物偶联物（ADCs））、细菌或植物毒素（免疫毒素）或放射性同位素，这增强了抗体杀死癌细胞的能力。在这一组中，ADCs迄今为止是最广泛使用的形式，而毒素偶联和放射性同位素偶联抗体尚未得到广泛采用（见图5b）。 2.7.1 抗体-药物偶联物 ADCs是通过将肿瘤靶向抗体与细胞毒素连接而构建的（见图2）。ADC分子与细胞表面抗原的结合导致它们的内化，随后在细胞内释放细胞毒素。这允许选择性地将细胞毒素输送到癌细胞，同时保留大部分健康组织。ADC的关键组成部分包括肿瘤靶向抗体、细胞毒素和连接抗体与细胞毒素的连接子（表3）。ADC的成功取决于这些关键组成部分的最佳选择，以及用于将连接子连接到抗体的偶联方法，这通常决定了药物-抗体比率（DAR）。 大多数ADC使用人源化或人类IgG1作为肿瘤靶向抗体（除了brentuximab使用嵌合IgG1，以及gemtuzumab和inotuzumab使用人源化IgG4）。如上所述，使用IgG1的普及是由于其长的血浆半衰期约为21天（例如，与IgG3的半衰期为7天相比），以及其能够结合Fc受体，通过ADCC和ADCP增强靶细胞的杀伤（例如，与在ADCC和ADCP中效率较低的IgG2和IgG4相比）。两种ADC，gemtuzumab和inotuzumab，使用IgG4，其对FcγRII和FcγRIII的亲和力较低，从而限制了ADCP，同时可能由于减少了ADC通过Fc受体进入免疫细胞的非特异性吸收，而减少了毒性。 大多数连接子将细胞毒素连接到IgG1抗体主链上的随机赖氨酸或半胱氨酸残基上。一个有效的连接子在血液中最小化细胞毒素的早期释放，同时促进在首选目标位置的活性药物的控制释放。连接子通常被分类为可裂解和不可裂解。十二种获批的ADC中有十种使用可裂解连接子，如肽连接子、腙连接子、二硫键连接子或CL2A连接子（表3）。最早开发的用于药物附着的连接子之一是使用腙键的可裂解连接子。这种连接子用于将抗肿瘤抗生素calicheamicin连接到gemtuzumab和inotuzumab ADCs。腙键设计为在靶细胞溶酶体内部的酸性条件下分解，以释放calicheamicin。然而，腙键可能在血浆中发生水解，导致药物分子的非预期释放，从而引起系统毒性。第二种可裂解连接子是肽连接子，需要在溶酶体内部通过cathepsin B选择性裂解。四种ADC使用mc-VC-PABC二肽连接子，由Seagen首次开发用于生成使用CD30靶向抗体连接到微管抑制剂单甲基auristatin E (MMAE)的ADC brentuximab（表3）。Brentuximab与化疗结合在几种不同类型的淋巴瘤患者中显示出显著的疗效，并被认为是霍奇金淋巴瘤和CD30+外周T细胞淋巴瘤的一线治疗标准。Brentuximab的成功导致了mc-VC-PABC二肽连接子的广泛采用。Seagen与Roche、Astellas和Genmab合作，分别使用mc-VC-PABC二肽连接子开发了靶向CD79B、nectin-4和TF的ADC。第三种可裂解连接子是二硫键连接子，其中连接子裂解是通过细胞内部高浓度的谷胱甘肽介导的。带有二硫键连接子的ADC包括mirvetuximab，在卵巢癌患者的III期临床试验中显示了生存益处。与可裂解连接子相比，不可裂解连接子对各种分解机制都有抵抗力。有效载荷在靶细胞的溶酶体内降解抗体后释放。两种ADC，trastuzumab emtansine和belantamab mafodotin使用不可裂解连接子进行药物附着。临床前研究表明，由于不可裂解连接子的血浆稳定性增加，对非靶细胞的毒性较低。然而，可裂解和不可裂解连接子尚未在临床试验中直接比较，一个比另一个的优势仍然不清楚。 肿瘤细胞杀伤过程由附着在肿瘤靶向抗体上的细胞毒素执行。药物通常是一种具有高细胞杀伤效力的小分子（半数最大抑制浓度（IC50）≤5纳摩尔），通过三种机制之一诱导细胞死亡——直接DNA损伤、破坏微管网络或抑制拓扑异构酶活性（表3）。目前使用的药物IC50差异很大，从5纳摩尔（Dxd，一种拓扑异构酶抑制剂）到5皮摩尔（pyrrolobenzodiazepines (PBDs)，一类DNA损伤剂）。然而，ADC的效力取决于药物的IC50和DAR。因此，带有强效PBD载荷和相对较低DAR约2.3的loncastuximab tesirine，以及带有效力较低的载荷Dxd但相对较高DAR约8.0的trastuzumab deruxtecan，都能在几种体内模型中诱导完全的肿瘤回归。在临床试验中也观察到了带有高DAR的ADC结合新型连接子设计的益处。Trastuzumab emtansine和trastuzumab deruxtecan共享相同的HER2靶向抗体。然而，尽管trastuzumab emtansine携带微管抑制剂DM1（IC50为2纳摩尔，DAR 3.5）通过不可裂解连接子结合，trastuzumab deruxtecan使用药物Dxd（IC50为5纳摩尔，DAR 8.0）与可裂解连接子结合。在比较两种ADC的III期临床试验中，trastuzumab deruxtecan显示出更高的反应率（79.7%对34.2%）和总生存率（94.1%对85.9%，在12个月时）。此外，trastuzumab deruxtecan延长了表达低水平HER2的乳腺癌患者的生存期，使其成为第一种在HER2低表达乳腺癌中有效的ADC。最近，fam-trastuzumab deruxtecan在一系列高HER2表达的实体瘤中显示了肿瘤回归，并获得了FDA对肿瘤不可知论HER2导向治疗的首次批准。 2.7.2 ADCs 的毒性 ADCs被认为是靶向药物，比传统的细胞毒素化疗药物有更好的耐受性。然而，大多数患者在使用ADCs时会经历某种形式的毒性。大多数ADCs共有的毒性包括输液反应、细胞减少症、感染、肝酶升高、胃肠道症状（腹泻、呕吐和便秘）和胚胎-胎儿毒性（表3）。 DM1和DM4是美登素1的衍生物。DXd是Exatecan的衍生物，用于ADC。SN38是伊立替康的活性代谢产物。ADC，抗体-药物偶联物；ALL，急性淋巴细胞性白血病；AML，急性髓系白血病；BCMA，B细胞成熟抗原；DAR，药物-抗体比率；FRα，叶酸受体α；GSK，葛兰素史克；HER2，人表皮生长因子受体2；mc，马来酰亚胺己酰；mc-VC-PABC，马来酰亚胺己酰-缬氨酸-对氨基苄氧羰基；MMAE，单甲基奥瑞他汀E；MMAF，单甲基奥瑞他汀F；PBD，吡咯并苯并二氮杂环；PTCL，外周T细胞淋巴瘤；SMCC，琥珀酰亚胺-4-(N-马来酰亚甲基)环己烷-1-羧酸酯；TF，组织因子；TNBC，三阴性乳腺癌。 a 2023年，FDA撤销了belantamab mafodotin的生物制品许可，EMA建议不更新其市场授权，因为确证性DREAMM-3试验未能证明无进展生存期的改善。正在进行的试验表明，belantamab可能会重新获得批准。b Trastuzumab deruxtecan获得FDA批准用于HER2低表达乳腺癌（免疫组织化学评分1+）和所有高HER2表达的实体瘤（免疫组织化学评分3+）。 某些毒性与使用特定有效载荷有关，例如与微管抑制剂（MMAE、DM1、DM4）相关的周围神经病变和与calicheamicin相关的肝毒性。其他毒性是针对共同抗原的ADCs共有的。例如，靶向HER2的ADCs可能导致心力衰竭和介导间质性肺病。 2.7.3 免疫毒素偶联物或免疫毒素 免疫毒素有两个组成部分，一个靶向抗体或抗体的Fv片段，以及通常来自细菌或植物毒素的细胞毒素。靶向抗体或Fv片段结合到目标细胞，允许选择性地输送毒素。毒素来自细菌，如假单胞菌外毒素A（PE）和白喉毒素（DT），或来自植物，如蓖麻毒素。从理论上讲，任何用于生成ADC的靶向抗体都可以用于免疫毒素。然而，尽管在过去几年中有12种ADC获得批准，只有一种免疫毒素，moxetumomab pasudotox，获得了FDA和EMA的批准，用于治疗毛细胞白血病（图2和5b）。Moxetumomab是一种融合蛋白，结合了CD22结合Fv与截断的假单胞菌外毒素A（PE38），由国家癌症研究所（NCI）的I. Pastan开发。当进入目标细胞时，PE38毒素与延伸因子2（EF2）结合并阻断蛋白质合成。Moxetumomab在毛细胞白血病患者的临床试验中展示了41%的高完全反应率，并在2018年获得监管批准。然而，由于临床采用率低，moxetumomab的生产在2023年停止。Moxetuzumab和其他研究性免疫毒素面临了几个挑战，包括高免疫原性导致治疗效力丧失和狭窄的治疗窗口导致毒性，如毛细血管渗漏综合征（CLS）和溶血性尿毒症综合征（HUS）。Moxetumomab的低采用率也可能是由于其复杂的管理过程，包括毒性预防、预处理和后处理水化、需要安全监测以避免不良反应以及在毛细胞白血病中有替代疗法的可用性。尽管过去几年的几项临床试验已经评估了靶向BCMA、间皮素和其他与癌症相关的抗原的免疫毒素的疗效，但目前没有一种正在进行监管审查，也没有预计将在不久的将来获得批准。 2.7.4 抗体-放射性同位素偶联物 抗体-放射性同位素偶联物由一个靶向抗体与一个放射性同位素链接而成。放射性同位素发射α粒子或β粒子，导致目标细胞DNA链断裂，从而导致细胞死亡。抗体-放射性同位素偶联物不需要内化就能诱导细胞死亡，这提供了与ADCs和免疫毒素相比的独特优势，包括旁观者效应。α粒子是大型带正电荷的粒子，由两个质子和两个中子组成，具有相对短的有效范围约为50-100微米。相比之下，β粒子是小型带负电荷的电子（比α粒子小约8000倍），具有较长的有效范围约为0.5-10毫米，但具有较少的DNA损伤能量。β粒子发射体的例子包括碘-131、镥-177和钇-90。两种获得FDA批准和/或EMA批准的抗体-放射性同位素偶联物，90Y-ibritumomab和131I-tositumomab，将β粒子发射放射性核素连接到靶向CD20的抗体上（图2和5b），用于治疗B细胞淋巴瘤。90Y-ibritumomab和131I-tositumomab在临床试验中展示了65-80%的总反应率和20-30%的完全反应率。两项研究都观察到了一些可预测的治疗相关不良效果，包括由于健康骨髓暴露于辐射而导致的长期严重细胞减少症，131I-tositumomab的放射性碘引起的甲状腺功能减退症，以及继发性恶性肿瘤，如骨髓增生异常综合征（MDS）和白血病。尽管有高反应率，这些药物并未得到广泛的临床使用，2012年只有75名患者接受了131I-tositumomab治疗。因此，131I-tositumomab在2013年自愿撤回。90Y-ibritumomab仍然适用于复发或难治性低级别B细胞淋巴瘤患者，但报告表明只有少数患者正在接受这种治疗。批准数量有限和临床采用率低可能是因为需要一个多学科团队，包括医学肿瘤学家、放射肿瘤学家、药理学家和物理学家，来开发并在临床上部署这些分子。很少有中心具备这样的能力，因此，抗体-放射性同位素偶联物的使用落后于ADCs。 3. 挑战与未来展望 肿瘤药物开发是一个艰难的过程，成功率为3-7%。目前尚缺乏针对肿瘤学中抗体基础治疗的成功率数据，但大约18%进入I期临床试验的治疗性抗体（包括肿瘤学在内的所有适应症）会继续进行药物上市146。这些低数字反映了药物开发过程中遇到的众多障碍。治疗性抗体的开发是一个资源密集型的多步骤操作。它需要针对目标抗原生成一定数量的抗体，然后选择几个具有理想结合和生物物理特性的领先候选物。然后，领先的抗体会在体内使用小鼠模型进行有效性测试，使用非人灵长类动物进行毒性和药代动力学测试，随后进行人体首次临床试验。尽管在小鼠模型中显示出有希望的有效性，但多种抗体由于在非人灵长类动物或人体首次临床试验中的毒性而未能通过临床开发。尽管存在这些障碍，但以下描述的几种抗体显示出令人鼓舞的临床前和临床数据，可能会在未来几年改变患者护理。 3.1 新靶点  实体瘤构成了新癌症患者的大多数。与实体瘤相关的患者中有相当一部分以转移性疾病出现，需要系统性治疗，这种治疗很少是治愈性的。因此，转移性肺、结肠、胰腺、乳腺、前列腺、肝脏和胆管癌共同导致了大多数癌症死亡（见图6）。然而，与血液恶性肿瘤相比，实体瘤的抗体开发滞后主要是因为缺乏可靶向的抗原。不同的淋巴瘤亚型约占所有癌症死亡的3%，并且有五种肿瘤抗原（CD19、CD20、CD79b、CD30、CCR4和PD1）被治疗性抗体靶向。相比之下，约占癌症死亡21%的肺癌只有一个可靶向的肿瘤抗原（EGFR-MET）。此外，约占癌症死亡8%的胰腺癌、6%的前列腺癌和3%的脑癌完全没有FDA批准和/或EMA批准的治疗性抗体。这种差异很大程度上是因为淋巴瘤和骨髓瘤起源于正常的B细胞，这些细胞表达明显的可靶向抗原（见图6）。此外，正常的B细胞可以在不产生不可忍受的后果的情况下被根除。不幸的是，在实体瘤中，目标抗原的发现很少带来线索。因此，新的靶点鉴定可能需要涉及对大量患者样本进行单细胞测序，以寻找在癌症和正常组织中差异表达的抗原。 图6 | 常见实体瘤和血液瘤的抗体靶点。这些图表显示了美国前15位癌症类型的死亡百分比与批准的抗体及晚期临床试验中的抗体所靶向的独特抗原数量。抗原靶点在每种癌症组织旁边展示。注意，非小细胞和 小细胞肺癌被归类在“肺”下；霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病（CLL）和中枢神经系统（CNS）淋巴瘤被归类在“淋巴瘤”下；急性髓系白血病（AML）、急性淋巴细胞白血病（ALL）、慢性髓系白血病（CML）和其他白血病被归类在“白血病”下。不论组织类型，微卫星高度不稳定（MSI-H）癌症都有资格接受免疫检查点抑制剂治疗，HER2阳性实体瘤有资格接受HER2导向治疗的trastuzumab deruxtecan，并未包括在分析中。镥Lu177 vipivotide tetraxetan用于前列腺癌的治疗没有被包括在内，因为靶向部分不是抗体。癌症死亡百分比和批准的靶点数量的数据分别来自 https://www.cancer.org/research/cancer-facts-statistics/all-cancer-facts-figures/2023-cancer-facts-figures.html 和抗体协会。a 程序性细胞死亡蛋白1（PD1）治疗仅在霍奇金淋巴瘤中获批。b B7-H3被认为是肿瘤相关抗原，可能是免疫检查点抗原。 此外，最近针对claudins、HER3、成纤维细胞生长因子受体2B (FGFR2B)、DLL3、结缔组织生长因子（CTGF，亦称CCN2）和前列腺六跨膜上皮抗原1 (STEAP1)的临床试验显示出令人鼓舞的结果。目前正在II/III期临床试验中的抗体靶点列在图6和补充表2中。最后，一种创新的方法来绕过缺乏肿瘤特异性抗原是通过多种抗原的组合靶向。大多数癌症缺乏在健康组织中不存在的真正特异性抗原的表达。因此，靶向只在肿瘤中共同表达而不在健康组织中表达的抗原组合，可能提供一条可行的治疗途径。利用布尔逻辑AND门的临床前研究，需要两个或三个目标激活细胞毒性机制，已经展示了肿瘤回归，但它们尚未在临床试验中得到测试。 一些细胞表面蛋白聚糖，如软骨素和肝素，是癌症和其他人类疾病中信号通路的重要调节因子。软骨素蛋白聚糖已被证明促进肿瘤血管化，并调节与肿瘤生长相关的信号传导途径，它们在多种癌症类型中表达。糖磷脂酰肌醇 (GPI) 锚定的细胞表面HSPGs，如glypicans，在癌症中过度表达，表明它们是潜在的肿瘤相关抗原。已经开发了针对GPC1、GPC2和GPC3的抗体和CAR T细胞，分别用于治疗胰腺癌、神经母细胞瘤和肝癌。 3.1.1 肿瘤特异性抗原 大多数目前批准的基于抗体的治疗针对肿瘤相关抗原或组织特异性抗原。肿瘤相关抗原，如HER2，在癌细胞中过度表达，但也由正常组织的一个亚群表达，尽管表达水平较低。癌症和正常组织之间表达水平的差异提供了治疗窗口。组织特异性抗原，如CD20，在癌细胞（B细胞淋巴瘤）和正常细胞（B细胞）中表达水平相似。针对这类组织特异性抗原的治疗旨在同时消除正常细胞和癌细胞，因为正常B细胞的耗尽可能在临床上是可以接受的。针对B细胞谱系癌症的CD19、CD20、CD38和BCMA的治疗代表了组织特异性治疗性抗体最成功的例子。对于起源于较少可有可无的组织如T细胞的癌症，针对TCR β链恒定区 (TRBC) 和TCR β链可变区 (TRBV) 的抗体已经开发出来，以靶向所有克隆性癌细胞，但只针对正常T细胞的一部分，从而保留足够的正常组织以执行其功能。一些新兴的抗体靶点包括肿瘤特异性抗原，这些抗原仅由癌细胞表达，不由正常细胞表达。肿瘤特异性抗原的主要例子是新抗原，它们是由MHC分子呈递的突变肽。这些突变肽是携带来自癌症细胞标志性突变（点突变、小插入/删除、移码突变、融合和剪接变体）的蛋白质的氨基酸变化的短蛋白质水解产物。来自诸如BRAF、RAS、PIK3CA、TP53和异柠檬酸脱氢酶（IDH）等突变癌症驱动基因的公共新抗原，为癌细胞提供了极其独特的靶点，可以用来造福患者。这些公共新抗原目前正在被双特异性抗体靶向，并且在针对携带TP53和RAS突变的癌症的临床前研究中显示出令人鼓舞的活性。已经有多方面的努力描述了抗体识别新抗原的结构基础。p53(R175H)突变肽-MHC与p53(R175H)特异性TCRs和抗体复合物的晶体结构已经确定。TCRs共享一个明显的“规范”垂直结合取向至肽-MHC分子，偏向突变位点。相比之下，p53(R175H)新抗原特异性抗体使用一种非规范的并行结合模型沿肽的长度（见图3f）。此外，抗体对p53(R175H)新抗原的亲和力比相应的TCR高约100倍。不同的结合模式可能有助于抗体的特异性和高亲和力。 3.1.2 细胞内抗原 抗体无法穿透细胞膜，因此只能靶向细胞表面抗原。细胞内抗原可以与MHC分子相关联地呈现在细胞表面，使它们成为可靶向的。以这种方式，tebentafusp靶向细胞内抗原gp100，该抗原在黑色素瘤中过度表达，并与HLA-A*02:01相关联呈现在细胞表面。目前正在开发抗体以靶向诸如人类端粒酶逆转录酶（hTERT）、MUC1、NY-ESO1、TCR γ替代阅读框蛋白（TARP）、p53、WT1和黑色素瘤优先表达抗原（PRAME）等癌细胞特异性过度表达的细胞内蛋白，其中针对PRAME的靶向在临床试验中显示出令人鼓舞的初步结果。 3.1.3 肿瘤微环境中的抗原 癌症发展于一个复杂的免疫细胞、成纤维细胞和细胞外基质的混合物中，这被称为肿瘤微环境。早期基于抗体的针对癌症相关成纤维细胞或细胞外基质的靶向尝试未能产生临床效益。目前的研究表明，肿瘤微环境中的免疫细胞如肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）、树突细胞和骨髓源抑制细胞（MDSCs）是众所周知的驱动对免疫检查点抑制剂的抗性的因素。因此，耗尽或阻断这些免疫抑制细胞的功能可能使肿瘤对免疫检查点抑制剂敏感。早期阶段的临床试验已经证明了通过靶向巨噬细胞集落刺激因子1受体（CSF1R）、髓细胞表达触发受体1（TREM1）和TREM2的抗体介导的TAMs抑制的安全性和可行性。临床前研究也表明，使用激动性CD40单克隆抗体增强肿瘤微环境中树突细胞的功能可以增强T细胞介导的肿瘤回归。针对胰腺癌患者的CD40抗体的临床试验患者耐受性良好，并已显示出增强的T细胞激活和渗透到肿瘤中。T细胞免疫球蛋白结构域和黏蛋白结构域3（TIM3）受体由一系列免疫细胞如淋巴细胞、树突细胞、单核细胞和巨噬细胞表达，TIM-3拮抗性抗体同样可以通过调节肿瘤微环境促进肿瘤杀伤。TIM-3拮抗性抗体与目前批准的免疫检查点抑制剂联合在实体瘤患者中展示了可控的安全概况。所有这些抗体抵消肿瘤微环境中的免疫抑制状态，目前正在进行II/III期试验，将确定它们的最终效用。 3.2 针对低密度抗原 目前批准的ADCs和双特异性抗体靶向相对丰富的抗原，如CD19、CD20和BCMA，每个癌细胞上有大约1,000到50,000份拷贝。针对新抗原的主要挑战来自于它们在癌细胞表面的低丰度，有些细胞表达的靶标抗原只有1-10份拷贝。除了新抗原，有效的靶向肿瘤相关或组织特异性抗原也可能因为它们可变的细胞表面密度而受到影响。此外，治疗压力也可能选择表达靶标抗原低的癌细胞克隆。临床前研究表明，双特异性抗体能够杀死每个细胞表达低至1-10个抗原的癌细胞，而ADCs需要1,000份或以上才能杀死细胞。未修饰的全长抗体可能需要更高目标抗原表达。针对这种低密度抗原仍然是一个挑战，优化的抗体工程使得在临床前研究中有效地靶向个位数水平的新抗原成为可能。 3.3 新型免疫检查点抑制剂 2011年ipilimumab的批准标志着免疫疗法时代的到来。免疫检查点阻断剂具有在一些复发的实体瘤患者中诱导长期缓解的前所未有的能力，这导致了大量临床试验的开展。FDA和EMA已经批准了11种不同的针对CTLA4、PD1和PDL1的抗体，用于20多种癌症类型的65多个不同的适应症。继CTLA4、PD1和PDL1靶向初步成功后，还有许多其他免疫检查点如LAG3、T细胞免疫受体含有免疫球蛋白和ITIM结构域(TIGIT)、V型免疫球蛋白抑制T细胞激活(VISTA)、TIM3、PVRIG、自然杀伤组2A(NKG2A)和OX40等被探索它们在多种癌症类型中诱导缓解的能力。除了针对黑色素瘤的LAG3的relatlimab外，其他都尚未在III期试验中展示所需的治疗活性以获得监管批准。同样，针对CD47的巨噬细胞检查点抑制剂magrolimab在早期试验中显示出令人鼓舞的活性，但在MDS和急性髓系白血病(AML)患者的III期试验中因缺乏效力而停止。目前新型免疫检查点阻断剂的表现低于预期，导致制药行业专注于PD1-PDL1领域，除了现有的九种抗体外，还有五种新的药物正在进行监管审查。尽管PD1-PDL1靶向取得了成功，但只有少数(~20%)的患者对免疫检查点阻断剂有反应，甚至更少的比例(~13%)实现持久缓解。此外，目前的免疫检查点抑制剂与相当大的并发症相关，其中约1%是致命的，约40%是慢性毒性。因此，我们需要超越PD1-PDL1抑制。这将需要改变癌症生物学研究方向和监管机构对抗体药物的批准方法。我们应该优先考虑针对新型免疫检查点调节剂的基础和转化研究，如B和T淋巴细胞衰减剂(BTLA)、B7-H3(亦称CD276)、CD27和4-1BB，而不是重新审视已经广泛探索的PD1-PDL1轴和联合疗法。监管机构可能考虑修订批准流程，使新的PD1-PDL1阻断剂在初步III期试验中展示与竞争产品相当的疗效和毒性概况后，获得所有现有适应症的批准。 3.4 新型抗体格式 3.4.1 IgM抗体 所有全长治疗性抗体使用IgG亚型。临床前研究和早期试验正在探索五聚体IgM格式，与IgG格式中可用的两个结合位点相比，它有十个抗原结合位点。这比针对同一表位的IgG抗体提供了更高的结合亲和力。一个例子是IGM-8444，一种高亲和力的五聚体IgM激动剂抗体，针对死亡受体5 (DR5)，在小鼠模型中展示了肿瘤回归，并已进入I期试验。 3.4.2 新型双特异性格式 TCE双特异性格式不断发展，旨在提高疗效，同时减少不良反应。现在有200多种双特异性抗体正在进行临床开发，大多数使用TCE方法针对实体瘤。Glofitamab(一种CD20xCD3双特异性抗体，用于淋巴瘤)和xaluritamig(亦称AMG 509)(一种STEAP1xCD3双特异性抗体，用于前列腺癌)在临床试验中都显示出疗效，并共享一个独特的2:1 T细胞结合双特异性格式，对目标双价结合，对CD3单价结合。这种格式可能比传统的1:1目标至CD3结合设计提供增加的肿瘤细胞杀伤能力。IgM格式的TCE双特异性抗体由于使用五聚体IgM，有一个更令人印象深刻的10:1目标至CD3结合比率。高目标至CD3结合比率设计允许高亲和力目标结合，可能引发增加的目标细胞毒性，同时减少细胞因子分泌。Imvotamab(亦称IGM-2323)，一种CD20xCD3 IgM双特异性抗体的I期试验，在晚期B细胞恶性肿瘤患者中展示了几个完全反应。 3.4.3 双特异性免疫检查点阻断剂 双特异性格式也被用于同时抑制两个免疫检查点，以增强T细胞激活，超出两种单一免疫检查点阻断剂组合所能实现的。针对PD1xLAG3、PD1xCTLA4和PDL1xCTLA4的双特异性免疫检查点阻断剂在早期临床试验中显示出令人鼓舞的疗效。尽管最初的双特异性免疫检查点阻断剂组专注于抑制临床确立的免疫检查点，临床前研究正在调查是否类似的双特异性免疫检查点阻断剂可以通过靶向新型免疫受体如OX40、TIGIT和C型凝集素结构域家族9成员A (CLEC9A)来诱导抗肿瘤免疫。 3.4.4 三特异性抗体 三特异性抗体具有同时与三种不同抗原相互作用的能力。这一功能使三特异性抗体能够与两种不同的癌症相关抗原，如B细胞恶性肿瘤背景下的CD19和CD20，同时通过第三个结合域结合CD3，与细胞毒性T细胞相互作用。这种创新方法有助于减轻由于单一抗原如CD19或CD20的丢失而引起的治疗抗性，因为癌细胞必须同时下调两种抗原才能逃避杀伤。或者，三特异性抗体被设计为与两种T细胞受体，如CD3和CD28相互作用，从而对癌细胞提供更强的激活信号。 3.4.5 纳米抗体 可能引领抗体工程领域重要范式转变的一个研究领域是单域抗体（也称为纳米抗体）的开发。纳米抗体主要来源于驼类重链抗体，它们体积小、易于生产、稳定，并且能够穿透肿瘤或病毒抗原中的隐蔽位点。纳米抗体通常从驼类衍生的噬菌体展示库中分离出来，最近也从转基因小鼠如RenNano和nanomouse中分离得到。纳米抗体有一个长的CDR3环，可以穿透抗原表面的空腔。首个基于纳米抗体的靶向BCMA的CAR T细胞已获得FDA批准，并与基于抗体的CAR T细胞相比显示出改善的疗效。针对CD19或CD20和HER2的纳米抗体衍生药物目前正在临床试验中，分别用于治疗淋巴瘤和乳腺癌患者。纳米抗体是否会提供比当前基于抗体的药物更好的疗效，还有待观察。 3.4.6 可激活抗体 肿瘤微环境通常表现出较低的pH值，含有活跃的蛋白酶酶，并具有在正常组织中缺乏的特定抗原组合。这些独特的属性被用来利用可激活抗体选择性地靶向癌细胞，这些抗体会根据其环境条件的变化而获得或失去功能。在抗体序列的特定位置添加组氨酸残基，使其能够根据pH值的变化与其目标抗原结合。这一原理被用来生成一种靶向HER2的抗体，与正常组织相比，在实体肿瘤的酸性微环境中与HER2的结合更强。类似的工程导致了在酸性溶酶体内从目标抗原（HER2和CTLA4）增加抗体解离，从而促进抗原再循环和在细胞膜上的呈现，并增强抗肿瘤效果。可激活抗体还使用蛋白酶可切割的掩蔽基团来阻断表位结合位点。在肿瘤微环境中掩蔽基团的切割使抗体-抗原结合和抗肿瘤活性成为可能。具有这种掩蔽机制的抗体通常被称为前体疗法，并且正在被用来改善PDL1、CTLA4、EGFR、CD166和CD71在多种实体瘤和血液瘤中的靶向。 最后，癌细胞经常显示一种独特的抗原组合，可以区分癌细胞和非癌细胞组织。正在设计一系列抗体或类似抗体的肽，以实现针对半相合骨髓移植后产生的CD45+ HLA-A2+癌症，以及EGFR+ HER2+乳腺癌的组合性抗原靶向。 3.5 新型偶联抗体 提高ADCs的效力。目前的研究正集中在改进ADC的组成部分（靶向抗体、连接子和药物载荷），以提高ADC的疗效。临床前研究表明，IgG抗体的大分子量（约150 kDa）可能会降低组织穿透力。因此，使用缺少Fc片段的抗体或用小肿瘤靶向肽替换抗体，可能提高ADC的活性。调节连接子设计和增加药物-抗体比率（DAR）可能增强治疗效益。例如，针对细胞表面糖蛋白TROP2（sacituzumab govitecan）的ADC，由于具有高DAR，是首个提高三阴性乳腺癌患者生存率的ADC。Daiichi Sankyo开发的创新四肽连接子，用于trastuzumab deruxtecan，掩盖了载荷DXd的疏水性，并允许均匀连接大量药物，同时保持有利的药代动力学，并最小化药物过早释放到血浆中。这种连接子-载荷组合现在正被几个即将获批的ADC（datopotamab deruxtecan和patritumab deruxtecan）或正在进行临床试验的ADC（ifinatamab deruxtecan）采用。针对叶酸受体α（FRα）的Rinatabart sesutecan，也使用一种新型可裂解连接子来掩盖更具疏水性的有效载荷，即拓扑异构酶-1抑制剂exatecan，从而允许生成更强效的ADC。正在进行晚期临床试验的ADC列在补充表2中。预计这种连接子-载荷组合可以改善对肺癌和结直肠癌患者的HER2靶向，这些患者对HER2靶向ADC trastuzumab deruxtecan的反应率较低。最后，新的药物载荷，如蛋白质降解剂、RNA聚合酶抑制剂、BCL-xL抑制剂、Toll样受体（TLR）激动剂和干扰素基因刺激因子（STING）激动剂，预计将通过使用新的杀伤机制来改进ADC。连接子和偶联技术的进步有助于推动ADC相对于其他偶联格式（如毒素或放射性同位素偶联物或双特异性TCE格式）在临床上的更多采用。目前正在进行临床试验，测试新型ADCs作为单一药物或与化疗或免疫疗法联合使用，其中一些已经取得了有希望的结果。 3.5.1 免疫毒素偶联物 免疫毒素的一个明显限制是产生针对毒素的免疫反应，这降低了半衰期和效力。目前的工作集中在通过去除被宿主免疫细胞识别的表位来减少假单胞菌外毒素的免疫原性。这样的改良免疫毒素可能会提高效力，并允许免疫毒素靶向多种恶性肿瘤。白介素-毒素偶联物的产生是该领域的另一个发展，它利用癌细胞中白介素受体的过度表达。白介素-毒素偶联物的行为类似于抗体-毒素偶联物。Tagraxofusp是一种针对白介素-3受体亚单位α（IL3RA；亦称为CD123）的细胞毒素，由IL-3与白喉毒素融合而成，已被证明对患有浆细胞样树突状细胞肿瘤（BPDCN）的患者有效。同样，denileukin diftitox（2014年撤回以进行制造改进），一种针对IL-2R的细胞毒素，由IL-2与白喉毒素融合而成，对患有皮肤T细胞淋巴瘤（CTCL）的患者有效。然而，这些IL-毒素偶联物不被视为基于抗体的药物，因为它们使用受体配体而不是scFv进行肿瘤靶向。 3.5.2 放射性同位素偶联物 在小分子偶联和肽偶联放射性同位素在实体瘤中的成功后，对放射性同位素偶联物重新产生了一些兴趣。将镥-177与一种结合前列腺特异性膜抗原（PSMA）的小分子或与生长抑素受体结合的肽类似物偶联，在前列腺癌和神经内分泌肿瘤患者中展示了显著的肿瘤回归，分别获得了FDA的批准。这种肿瘤靶向小分子-放射性同位素或肽-放射性同位素偶联物的行为类似于抗体-放射性同位素偶联物，但具有不同的结构和药代动力学特征。目前正在进行临床试验，测试针对肾细胞癌患者的碳酸酐酶IX（CAIX）的肽-放射性同位素偶联物，以及针对脑肿瘤患者的GD2、AML患者的CD33、前列腺癌患者的PSMA以及血液恶性肿瘤患者的CD45和CD37的抗体-放射性同位素偶联物。其他方法涉及将肿瘤靶向抗体与α粒子发射体如锕-225（225Ac）偶联。α粒子具有更高的DNA损伤能量加上较短的范围，可能会增加肿瘤特异性细胞毒性，同时限制对周围健康组织的辐射引起的不良反应。 3.6 选择最佳格式 目前批准的基于抗体的治疗针对由癌细胞和正常细胞亚群表达的肿瘤相关抗原。这些抗体需要一个治疗窗口，允许杀死癌细胞，同时限制对正常细胞的非肿瘤毒性。需要谨慎选择抗体格式来利用这个治疗窗口，使用不当的格式可能由于降低的治疗效力或不可接受的毒性而无效。尽管缺乏明确的定量研究和直接比较，但人们普遍认为未经修饰的抗体杀死细胞需要高抗原表达（每个细胞>10,000份拷贝），而ADCs（每个细胞>1,000份拷贝）和TCE双特异性抗体或CAR T细胞（每个细胞>10-100份拷贝）可以杀死表达较低抗原的细胞。因此，对于给定目标，从未修饰的抗体转换为ADC或TCE双特异性抗体格式可以提高效力，但也可能同时增加毒性。这种效应在HER2靶向上得到了体现。HER2由一部分乳腺癌和小胃癌以及一系列正常人类组织表达。使用裸抗体（曲妥珠单抗和帕妥珠单抗）以及后来的ADC（曲妥珠单抗emtansine）对HER2进行靶向治疗，患者耐受性良好，并在HER2高表达的患者中导致肿瘤回归。最近，trastuzumab deruxtecan，一种具有高DAR的HER2靶向ADC，甚至在对以前的HER靶向抗体无反应的低HER2表达癌症中诱导了肿瘤回归。然而，进一步降低HER2靶向阈值的抗HER2 CAR T细胞由于对肺部低HER2表达细胞的靶向、非肿瘤毒性，导致致命的呼吸衰竭。抗HER2 CAR T细胞的致命毒性提出了可能性，即可以类似地靶向低水平HER2表达细胞的HER2靶向TCE双特异性抗体，也可能带来不可接受的毒性。因此，通过双特异性抗体zanidatamab进行HER2靶向采用了双HER2结合策略，而不是TCE方法，并已证明在没有致命毒性的情况下有效。因此，“干净”的目标，即在至关重要的组织中表达最小非肿瘤（如CD19）和低密度目标（如肽-MHC分子）是TCE基础治疗的最佳选择。在非可有可无组织中有一定水平的非肿瘤表达（如HER2）的目标，最好通过未修饰的抗体、ADCs或非TCE双特异性抗体进行靶向。 需要注意的是，特定设计的非肿瘤毒性和效力也取决于目标和药物载荷。例如，DLL3由一部分小细胞肺癌患者表达。在这种情况下，由于与PBD载荷相关的高水平毒性和缺乏生存益处，rovalpituzumab tesirine，一种DLL3靶向ADC的临床开发被停止。然而，I期试验表明，通过TCE双特异性抗体tarlatamab进行DLL3靶向会导致肿瘤回归，并且患者耐受性良好。最终，选择的目标及其抗原密度可能对最佳治疗格式至关重要。 4. 结论 总结来说，由于抗体在与其目标结合时可以提供精确度，基于抗体的治疗在肿瘤领域具有巨大前景。尽管仍存在重大挑战，但新目标以及各种新设计和工程策略预计将为这些挑战提供许多解决方案。更有效的基于抗体的治疗获得监管批准的爆炸性增长可能会继续遵循过去25年的趋势。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。