CEA x CD80

摘要：本章将介绍抗体及其类似分子在治疗、诊断和研究中的广泛应用。在本章的第一部分，你将了解到一些选定的批准治疗性抗体的适应症、分子靶标和作用方式。第二章节将讨论抗体在疾病诊断中的应用，包括传染病（特别是结核病和HIV）的诊断，以及在癌症诊断中提到的批准和商业化测试套件。本章的最后一节描述了在生物医学研究中常用的基于抗体的技术和检测格式，如流式细胞术、免疫组织化学和酶联免疫吸附测定（ELISA）。由于它们出色的特异性，许多基础和常规实验室应用都基于抗体与其相应抗原的相互作用。 1.抗体在治疗中的应用 在过去三十年中，单克隆抗体（mAbs）和类似抗体分子（如抗体片段或双特异性抗体，详见其他章节）在成为有效的人类治疗药物方面取得了巨大成功。第一个获批的单克隆抗体是1986年的穆罗莫纳布（Orthoclone OKT3®; Janssen-Cilag），针对CD3用于预防肾脏移植排斥。它与循环T细胞表面的CD3 epsilon链（T细胞受体复合体的一部分）结合，最终导致T细胞的无能和凋亡，从而保护移植体免受相应的免疫反应。这种分子仍然是完全小鼠源的，由于患者体内产生抗药物抗体，因此对患者构成了严重的免疫原性风险。1990年代分子生物学的重大进展以及基础生物医学科学向临床实践的转化，导致了第一个嵌合体（包含小鼠和人类区域）抗体利妥昔单抗（Rituxan®; Genentech）在1997年获批用于治疗低级别B细胞淋巴瘤。这项技术，随后是人源化和最终完全人类抗体，使得市场批准率大幅增加。第一个获批的完全人类抗体是2004年的阿达木单抗（Humira®; AbbVie），用于治疗类风湿性关节炎。现在大多数正在开发的治疗性抗体要么是人源化的，要么是完全人类。抗体目前也是临床试验中增长最快的生物技术衍生分子群体。2017年，全球单克隆抗体治疗药物市场估值约为950亿美元。目前大约有60种抗体获得FDA批准，并在临床试验的不同阶段用于治疗各种疾病和病症，包括癌症、慢性炎症性疾病、移植、传染病和心血管疾病。以下段落将概述治疗性抗体应用的不同适应症，并讨论一些突出的例子。 肿瘤学目前是治疗性抗体应用的最重要领域。最初仅作为致癌性受体酪氨酸激酶的拮抗剂使用，近年来其治疗应用已显著扩大，包括靶向递送化疗药物（所谓的ADCs—抗体药物偶联物—在本书的另一章中有详细描述）和操纵抗癌免疫反应。目前正在进行多项临床试验，研究这些靶向癌症疗法单独使用或与化疗或其他靶向疗法联合使用。 1.1.西妥昔单抗 受体酪氨酸激酶拮抗剂类别中的一个突出代表是西妥昔单抗（Erbitux®; Merck KGaA/Bristol-Myers Squibb），这是一种嵌合体人-小鼠单克隆IgG1抗体，针对EGFR（表皮生长因子受体）。它通过抑制内源性配体结合、细胞运动、侵袭性、转移和促进凋亡来发挥作用。西妥昔单抗获批用于头颈部鳞状细胞癌（SCCHN）与放疗联合治疗局部或区域性晚期疾病，与基于铂的疗法联合治疗局部或转移性疾病，或作为单药治疗在基于铂的疗法后进展的复发或转移性疾病。它还获批用于与伊立替康联合治疗转移性结直肠癌，用于对基于伊立替康的化疗耐药的患者，或作为单药治疗在患者已经接受过伊立替康和奥沙利铂方案或对基于伊立替康的化疗不耐受的患者，以及与伊立替康、5-FU、亚叶酸联合治疗一线治疗。 1.2.曲妥珠单抗 针对受体酪氨酸激酶的高效单克隆抗体的另一个例子是曲妥珠单抗（Herceptin®; Genentech）。它与人类表皮生长因子受体2蛋白（HER2/neu）结合，并引起免疫介导的反应和HER2的内化和下调以及细胞周期抑制因子的上调。这最终导致抑制细胞增殖和诱导凋亡。曲妥珠单抗还通过诱导抗血管生成因子和抑制促血管生成因子来介导抗血管生成效应。它获批用于HER2过表达的阳性淋巴结乳腺癌的辅助治疗，作为包含阿霉素、环磷酰胺和紫杉醇或多西他赛或与多西他赛和卡铂的方案的一部分，或作为单药治疗在多模式蒽环类基础治疗后。它也获批用于转移性乳腺癌，其中肿瘤过表达HER2蛋白，包括与紫杉醇联合的一线治疗和在患者已经接受过一种或多种化疗方案的转移性疾病的单药治疗。另一个适应症是转移性胃癌，用于一线治疗HER2过表达的胃癌或胃食管结合部腺癌患者，与顺铂和卡培他滨或5-氟尿嘧啶联合使用。 由曲妥珠单抗衍生的ADC药物ado-trastuzumab emtansine（Kadcyla®; Genentech）获批用于治疗HER2阳性转移性乳腺癌患者。该分子由与细胞毒素DM1（emtansine）共价连接的曲妥珠单抗组成。 1.3.利妥昔单抗  除了受体酪氨酸激酶，CD（分化群）抗原也是治疗性抗体的常见靶标。属于这一类的一个突出例子是利妥昔单抗（MabThera®; Roche）。这是一种针对正常B细胞和大多数低级别以及一些高级别B细胞淋巴瘤上发现的CD20的嵌合体单克隆抗体。它的作用机制包括诱导抗体依赖性细胞毒性（ADCC）和补体依赖性细胞毒性（CDC），以及诱导凋亡。利妥昔单抗获批用于复发或难治性低级别或滤泡性CD20阳性B细胞非霍奇金淋巴瘤（NHL）作为单药治疗，与一线化疗联合用于滤泡性CD20阳性B细胞NHL，以及在患者在接受利妥昔单抗联合化疗后取得完全或部分反应时作为单药维持治疗。其他适应症包括一线联合化疗后的非进展性低级别CD20阳性B细胞NHL作为单药治疗，以及与CHOP（环磷酰胺、羟基柔红霉素、Oncovin®, 强的松）或其他蒽环类基础化疗方案联合用于先前未治疗的弥漫性大B细胞CD20阳性NHL。它还获批用于慢性淋巴细胞白血病（CLL）与氟达拉滨和环磷酰胺联合用于先前未治疗和先前治疗过的CD20阳性CLL，以及其他免疫性疾病，如类风湿性关节炎和肉芽肿性多血管炎和显微镜下多血管炎。 肿瘤学领域的一个重要最新发现是免疫检查点分子，这些分子抑制抗癌免疫反应。这些蛋白质包括程序性细胞死亡蛋白-1（PD-1）、其配体程序性死亡配体1（PD-L1）和2（PD-L2），以及细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4（CTLA-4），等等。已经开发出免疫检查点蛋白的抑制剂，以“解除”通常受阻的抗癌免疫反应的“刹车”。这种免疫检查点的调节成为治疗多种实体恶性肿瘤的一种手段，因为在许多患者中看到了持久的反应和与传统化疗药物相比改善的副作用概况。 1.4.伊匹单抗  伊匹单抗（Yervoy®; Bristol-Myers Squibb）是目前唯一获得FDA批准的抗CTLA-4抗体。这种完全人类抗体结合并阻断CTLA-4与其配体CD80/CD86的相互作用，导致T细胞的激活和增殖，因此被认为在维持对癌细胞的积极免疫反应中发挥关键作用。伊匹单抗获批用于无法切除或转移性黑色素瘤（2011年），以及与Opdivo联合用于晚期肾细胞癌和转移性结直肠癌（2018年）。 2012年报道了第一个研究抗PD-1抗体的第一阶段I试验，此后该领域有了显著增长。最广泛研究的PD-1抑制剂由nivolumab（Opdivo®; Bristol-Myers Squibb）和pembrolizumab（Keytruda®; Merck Sharp & Dohme）代表，尽管这个类别中还存在其他几种mAbs。nivolumab和pembrolizumab都属于IgG4亚类，但每种的表位结合区域不同。两者都对PD-1具有高亲和力和高特异性，并阻断PD-L1的结合。 1.5.Nivolumab Nivolumab于2014年12月首次获得FDA批准，用于治疗伊匹单抗失败后的无法切除/转移性黑色素瘤（如果BRAF V600突变阳性，则还包括BRAF抑制剂）。进一步的皮肤癌相关适应症包括与伊匹单抗联合治疗BRAF V600野生型、无法切除/转移性黑色素瘤和完全手术切除后的III期黑色素瘤的辅助治疗。2017年，nivolumab获得批准，作为二线单药治疗转移性或手术无法切除的尿路上皮癌，这些患者在先前接受至少一种基于铂的化疗方案后进展或复发。其他适应症包括转移性DNA错配修复缺陷/微卫星不稳定性高结直肠癌；在化疗后进展或复发的复发性SCCHN；在先前接受过血管内皮生长因子抑制剂治疗后失败的肝细胞癌（HCC）；在自体干细胞移植和移植后brentuximab vedotin后进展的经典霍奇金淋巴瘤（cHL）；在先前接受基于铂的化疗后进展的转移性鳞状非小细胞肺癌（NSCLC）和非鳞状NSCLC；有先前抗血管生成治疗历史的晚期肾细胞癌（RCC）；与伊匹单抗联合用于先前未治疗的晚期肾细胞癌；在先前接受基于铂的化疗和另一种治疗线后疾病进展的小细胞肺癌（SCLC）。 1.6.Pembrolizumab Pembrolizumab于2014年9月首次获得FDA批准，用于治疗黑色素瘤。此后，适应症已扩大；包括在伊匹单抗治疗后疾病进展的转移性黑色素瘤，如果BRAF V600突变阳性，则还包括BRAF抑制剂，以及III期疾病切除后的辅助治疗。其他适应症包括作为二线治疗的宫颈鳞状细胞癌（CSCC）；在多种先前治疗后进展的复发性、晚期胃或胃食管结合部（GEJ）腺癌，已知肿瘤PD-L1表达；一线治疗转移性/不可切除复发性SCCHN，对于已知PD-L1表达的肿瘤单独使用和与基于铂的化疗和氟尿嘧啶联合使用；作为先前接受过索拉非尼治疗的患者的单药治疗的肝细胞癌（HCC）；在接受三线或更多线治疗后难治性或复发性cHL；成人和儿童局部晚期或转移性默克尔细胞癌（MCC）的一线治疗；已知肿瘤PD-L1表达的转移性NSCLC，在先前接受基于铂的化疗后进展；已知肿瘤PD-L1表达的转移性SCLC，在先前接受基于铂的化疗和至少一种其他治疗线后进展；在接受两线化疗后复发的复发性/难治性原发性纵隔B细胞淋巴瘤（rrPMBCL）；以及作为晚期疾病患者的一线治疗的肾细胞癌（RCC）。除此之外，FDA在2017年批准pembrolizumab作为第一个组织不可知的癌症治疗，用于表达MSI-H或dMMR的无法切除或转移性实体瘤，这标志着FDA首次基于生物标志物表达而非特定疾病进行批准。目前的批准适用于在治疗后进展且没有其他当前治疗选择的实体瘤。 1.7.Avelumab 虽然抗PD-1疗法为PD-1/PD-L1轴的调节铺平了道路，但针对PD-L1的mAbs研究紧随其后。Avelumab（Bavencio®; Merck/Pfizer）是一种治疗性抗PD-L1 mAb的例子。它于2017年3月首次获得FDA批准，用于治疗12岁及以上患者的转移性MCC，随后在2017年5月获得加速FDA批准，用于治疗对基于铂的化疗耐药12个月的转移性尿路上皮癌。它还于2019年5月获批与阿西替尼联合用于晚期RCC患者的一线治疗。 1.8.阿达木单抗 尽管肿瘤学显然是最重要的适应症，但治疗性抗体的临床应用领域并不仅限于此。治疗风湿性疾病的单克隆抗体中的一个突出例子是阿达木单抗（Humira®; AbbVie）。阿达木单抗是一种完全人类单克隆抗体，通过结合TNF-α并阻断其与p55和p75细胞表面TNF受体的相互作用，从而实现免疫抑制。它是FDA于2002年12月批准的第一种用于治疗中度至重度活动性成人类风湿关节炎的人类单克隆抗体。其他适应症包括银屑病性关节炎（2005年）、强直性脊柱炎（2006年）、克罗恩病（2007年）、幼年特发性关节炎（2008年）、慢性斑块状银屑病（2008年）、溃疡性结肠炎（2012年）和化脓性汗腺炎（2015年）。除了传统的单克隆抗体，人们对于开发双特异性抗体（BsAbs）用于治疗应用的兴趣日益增加。在过去十年中，致力于BsAbs的文章数量一直在稳步增加。《自然评论药物发现》杂志在2014年将BsAbs称为“下一代抗体”。双特异性抗体在本书的另一章中有详细讨论。然而，这里应简要提及两个临床应用中的BsAbs示例：blinatumomab（Blincyto®; Amgen）和emicizumab（Hemlibra®; Roche）。 1.9.Blinatumomab Blinatumomab（Blincyto®; Amgen）是一种双特异性CD19导向的CD3“T细胞引导器”。它结合在B细胞谱系来源的细胞和T细胞表面表达的CD19和CD3，分别导致内源性T细胞的激活和通过细胞毒性T细胞溶解CD19阳性的良性和恶性B细胞。它目前被批准用于B细胞前体急性淋巴细胞性白血病（ALL）在第一次或第二次完全缓解中，最小残留疾病大于或等于0.1%，以及复发或难治性B细胞前体ALL。 1.10.Emicizumab Emicizumab（Hemlibra®; Roche）是一种双特异性抗体，它结合在激活的凝血因子IX和因子X上，从而介导后者的激活。这实际上是健康个体中凝血因子VIII的功能，但在血友病A患者中缺失。Emicizumab于2017年11月获得批准，用于治疗对其他治疗产生抵抗的血友病A患者，随后于2018年4月获得批准，用于尚未对其他治疗产生抵抗的患者。 上述讨论的治疗性抗体的额外概览也见于表1。 表 1 列出了选定并批准的治疗性单克隆抗体，并参考了各自的抗体类型、靶点、适应症和作用机制。 2.抗体在诊断中的应用 由于抗体显示出高亲和力和高抗原特异性，它们是疾病诊断和预后评估中非侵入性体内成像和体外免疫测定的理想候选物。抗体应用于肿瘤学、免疫学、微生物学、血液学和病理学等多个学科。此外，它们是识别通过病毒、细菌或寄生虫传播的传染病、诊断代谢紊乱和癌症成像的有用工具。 明确识别给定的传染病病原体不仅对特定患者重要，对公共卫生也很重要。在这方面，对国家卫生研究所来说，区分人类群体中的大流行和仅局部感染是至关重要的。及早识别大流行细菌株或病毒，特别是当感染可以无症状或潜伏时，有助于及时采取所需行动，防止疾病传播。例如，检测由结核分枝杆菌引起的结核病（TB）的一种经过验证的方法是使用商业测试套件Xpert® MTB/RIF（Cepheid）进行特定的嵌套PCR（聚合酶链反应）方法，或者培养细菌，这可能需要数周时间才能获得可靠的结果。Xpert® MTB/RIF测试是一种完全自动化的核酸扩增测试。它极大地促进了控制全球结核感染和降低疾病流行率的目标，因为它是一种快速且敏感的诊断工具。与培养细菌的过程相比，它可以快速提供结果，但成本较高，需要特殊的处理设备（GeneXpert, Cepheid）来提供结果。已经有改进的早期结核病检测方法可用，如Qiagen的QuantiFERON®-TB Gold-Plus（QTF-Plus）干扰素-γ释放测定。QTF-Plus是一种两步测定，包括在全血样本中进行干扰素ɣ（IFNɣ）体外刺激步骤，随后进行酶联免疫吸附测定（ELISA），使用小鼠单克隆抗-INFɣ抗体来量化与M. tuberculosis感染相关的IFNɣ释放量。QTF-Plus需要熟练的操作员和实验室基础设施才能应用。新开发的现场检测试验利用单特异性或双特异性抗体在夹心型、一步法测定中结合拭子或尿液样本中的分枝杆菌脂阿拉伯聚糖（LAM）。基于这种方法的商业免疫学测试套件包括，例如，Determine®-TB Alere（Abott）和FujiLAM（Fujifilm）（www.who.int）。 另一个例子是对患者进行呼吸道合胞病毒（RSV）感染的检测。RSV是一种常见的呼吸道病毒，它引起的症状通常较轻，但对于1岁以下的儿童来说可能会很严重，它是细支气管炎和肺炎的主要原因。除了使用实时PCR（RT-PCR）方法作为检测RSV感染的黄金标准之外，还有CerTest RSV（CerTest Biotec S.L.）这样的定性测试套件可用，它不那么复杂。这是一种一步式彩色色谱免疫分析，通过检测鼻拭子、鼻咽冲洗液或抽吸物样本中的RSV抗原，非常快速地提供关于个人感染状态的信息。尽管这种测试能够快速得到结果，但在特定患者亚群中其敏感性要低得多。CerTest基于色谱免疫分析方法，用于检测来自患者呼吸道分泌物样本的RSV抗原。这种技术以及上述描述的检测结核感染的测试如Determine®-TB Alere背后的技术被称为侧流免疫分析（LFIA）。LFIAs不仅在医疗应用中有用，还用于检测药物滥用、农业安全、动物健康和食品质量。最早的测试之一是检测女性尿液中的人类绒毛膜促性腺激素（hCG），以确认或排除妊娠。LFIA的一个优点是患者可以直接应用，技术简单、快速且成本低。该测试甚至可以在没有熟练人员或实验室设施的情况下进行，这使得它对于没有健全卫生基础设施的发展中国家具有吸引力。根据WHO的特点，LFIAs被描述为ASSURED：负担得起、敏感、特定、用户友好、快速和稳健、无需设备、可交付给最终用户。本节重点介绍使用抗体识别的LFIAs。也在开发利用核酸探针的测试（NALFIA，核酸侧流免疫分析）。对于NALFIA，分析物是通过PCR产生的扩增子，在分析测试条之前。使用特定的引物在扩增子上附加两个不同的标签，随后通过测试条上特定标签的单克隆抗体进行检测。与传统PCR分析相比，这种联合方法更快，因为扩增子不再需要通过电泳分离了。例如，PCR混合物中的扩增子可以通过特定引物用生物素和FITC标记，并在NALFIA的样品垫上添加后，被金纳米粒子标记的单克隆抗FITC抗体结合。这个复合物通过膜迁移并在测试线被固定的抗生物素单克隆抗体结合，金纳米粒子集中并产生与混合物中扩增子浓度成比例的颜色信号。Pecchia和Da Lio描述了这种方法，并将其用于检测土壤样本中的真菌病原体Macrophomina phaseolina。 LFIAs可以用来检测抗体和其他抗原，如激素、肽或毒素，从血液、血清或其他液体和复杂样本中。该方法依赖于色谱和免疫染色的结合。在LFIA技术的初期，测试被设计为只给出定性结果，如信号的出现或缺失，转化为是或否的结果。现在正在开发的测试可以提供半定量结果，并与自动化读取设备结合使用。图1显示了一个典型的测试条构造。测试条由许多不同的元素组成，通常比看上去更复杂。含有分析物的液体样本被施加到样品垫上，在那里它与重组缓冲液、盐和表面活性剂或其他液体混合。这一步对样本准备很重要，确保恒定的流速和样本向结合垫和测试控制线的控制分布，对抗原-抗体相互作用至关重要，因为蛋白质的溶解度受pH影响。许多抗体的等电点（pI）在pH 5.5和7.5之间。因此，pH 7.0和7.5之间可能是最佳的，缓冲条件应相应调整。另一方面，流速由膜本身的材料决定。硝酸纤维素是一种常用的材料。其他如聚偏氟乙烯、改性尼龙和聚醚砜。有利的膜材料具有优越的毛细作用力和恒定的流速，并允许在测试和控制线上容易结合和固定抗体。结合机制主要是静电和疏水相互作用。固定能力由聚合物表面积、孔隙度、厚度和材料本身的结构特征定义。在施加液体样本后，它迁移到结合垫。这持有检测复合物并将样本和检测复合物传递到膜和测试控制线。与胶体金纳米粒子结合的识别抗体是通常用于结合垫的检测复合物。纤维素纳米珠、乳胶珠、顺磁性珠或荧光分子也可以使用。选择识别/捕获抗体是设计特定LFIA中最重要的部分，因为结合特性如抗体的结合常数（KD）和特异性对测试灵敏度和背景信号有很大影响。信号在其最简单的形式是一个比色信号，它是由分析物相关联的聚集（夹心测定）或解聚（竞争测定）产生的。识别抗体被吸收到金颗粒上，并且可以结合到复杂样本中的分析物。其他标签可以是荧光染料、发光分子和量子点。使用这些标签可能会提高LFIA的灵敏度，但不能再由操作员直接用肉眼检测，并且需要额外的设备，如荧光读取器。Shi等人使用超顺磁性纳米粒子和磁性读取器，将测定灵敏度提高了十倍。通过应用酶信号放大反应可以增强比色信号。辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AP）在提高ELISA灵敏度方面都有很好的效果，尽管也用于LFIAs。测试条的末端有一个吸收垫。它的主要功能是吸收液体，从而增加分析样本的体积。 图1 展示了标准侧流测定（侧面视图）的示意图。测试条通常位于一个塑料外壳内，外壳有一个或在多重格式下有不同数量的开口用于样本管理，以及一个窗口用于观察测试和控制线的结果。液体样本通过样本端口被施加到样本垫上，在那里它与重组缓冲液组分和化学品如洗涤剂、表面活性剂或封闭剂以及其他根据测试的具体应用而变化的物质混合。样本迁移到重叠的结合垫上，检测复合物就位于那里。复合物被重组并且随着样本移动到膜上，在那里它通过测试和控制区域。在测试条的末端，吸收垫吸收液体并增强测试条的整体容量。吸附垫通过这种方式增加测定的灵敏度。在测试和控制线测定中，特定的捕获抗体被固定，它们捕获分析物-检测器或控制复合物。 总的来说，LFIAs可以分为直接和间接测定。激素和其他蛋白质和肽类分析物通常通过夹心测定进行分析，因为这类分析物通常具有多个表位，分析物可以被不同的抗体种类结合，这对于双重抗体夹心测定是必要的。半抗原和小化学物质如药物及其代谢产物通常通过竞争或抑制测定进行分析。因此，LFIAs像其他免疫测定格式一样被设计。与其他复杂格式如ELISA不同，它们是简单的基于纸张的分析测试，并且可以设计成微阵列和多重格式，提供快速结果，无需训练有素和熟练的操作员。尽管它们有缺点，如定量结果较少和灵敏度通常较低，但它们在临床护理和近患者诊断领域做出了巨大贡献。 酶联免疫吸附测定（ELISA）非常特异和灵敏，能够检测和定量简单或复杂样本中非常低的分析物浓度。其原理基于抗原和抗体之间非常特异的相互作用。它的应用在科学和诊断中有许多，例如，检测自身免疫疾病生物标志物。这些可能是患者血清样本中的自身抗体。通常使用三种类型的ELISA，如图2所示：间接ELISA、夹心ELISA和竞争ELISA。在间接ELISA中，含有分析物的样本（例如，患者的血清）被包被到微孔板的孔中。在阻断剩余结合位点之后，添加检测抗体和与初级检测抗体特异性结合的酶标记的二抗。添加底物后，可以使用特定的ELISA读取设备测量转化为有色产物的过程。也可以开发基于化学发光和荧光的报告分子，并可能提高测定灵敏度。在这方面需要特殊设备。信号强度与样本中分析物浓度直接相关，并与标准曲线进行比较。为了准备标准曲线，必须有纯化的分析物样本，以便同时分析标准曲线和样本稀释液。分析物浓度与信号强度之间的线性关系受到狭窄动态范围的限制。间接ELISA通常用于识别和定量如抗体或人血清样本中的细胞因子水平，例如，诊断内分泌疾病（人类IL-13 Quantikine ELISA KIT, R&D Systems, Inc.）。间接ELISA方法容易受到基质效应的影响，如果分析物是血或血清等复杂基质的一部分，可能会抑制完整分析物的恢复。通过稀释血清样本可以限制不利的基质效应。通过使用特定的捕获抗体将分析物固定在板孔表面，ELISA可以非常特异。在夹心ELISA中，固定的捕获抗体从基质中结合分析物，然后可以使用酶标记的检测抗体检测针对不同表位的初级抗体。剩余结合位点的阻断不充分或洗涤不充分会导致假阳性结果，因为分析物会非特异性地结合到孔表面，或者未结合的检测抗体残留在溶液中。酶标记的二级检测抗体结合捕获的分析物，并在添加底物后实现比色读出。分析物被夹在两种抗体之间。PerkinElmer, Inc.的Alliance HIV-1 p24 ELISA测试是检测血清、血液和细胞培养样本中病毒标志物衣壳蛋白p24的常用测试套件。感染初期p24水平非常低，以及感染者血液样本中游离p24抗原和抗p24抗体的复合物，可能导致检测到的感染不一致。常规ELISA测试很难检测到复合抗原。可以应用基于HRP的光化学信号放大方法，将该ELISA的灵敏度提高多达40倍。在竞争ELISA中，样本中检测抗体和结合抗原的复合物被添加到孔中，孔表面包被重组纯化抗原。样本中的分析物（分析物）和包被抗原竞争与抗体结合。在这种设置中，信号强度的降低与分析物浓度相关。 此外，抗体在识别肿瘤疾病中的异常细胞和识别起源细胞谱系方面也很有帮助，这对于癌症类型的诊断和后续治疗的确定至关重要。例如，抗体用于通过流式细胞术免疫表型分类从淋巴结细针抽吸物、组织样本和其他体液中的淋巴瘤亚型。在这种方法中，可以通过同时应用几种与不同荧光团结合的特定单克隆抗体，平行检测多个生物标志物，例如细胞表面的抗原。例如，可以通过检测这些抗原的表达模式的修改来识别恶性细胞。在流式细胞术中，含有待评估活细胞的患者样本预先与抗原特异性荧光标记的单克隆抗体一起孵育。在流式细胞仪中，细胞被分散，并以悬浮状态逐个通过激光束。被标记的细胞被激光激发，并发射与荧光团光谱相对应的特定波长的光，由探测器测量。使用一套合适的标记抗体和激光源，可以分析复杂人群中每个细胞的各种物理参数，这些参数产生关于表面抗原表达模式和细胞的粒度和大小的信息。这与IHC相反，IHC一次只能评估一个或两个标记。为了亚型化淋巴瘤，分析白细胞标志物的表型表达是有利的。这些标志物的表达模式可以通知细胞类型的起源和分化阶段，可以预测肿瘤细胞克隆在治疗中的反应。在这方面，流式细胞术使得可以同时、多参数和定量分析几个表面标志物，并有助于区分，例如，慢性淋巴细胞性白血病（CLL）和更具侵略性的白血病类型。治疗后，流式细胞术用于分析在治疗期间未被消除的最小剩余恶性细胞的数量，这些细胞可以引发癌症复发。这称为最小残留病，是慢性淋巴细胞性白血病的可靠预后标志。 在治疗期间，监测治疗反应以及疾病进展和严重程度是有利的，通常也是必需的。一个重要的例子是乳腺癌肿瘤的分类。预后和治疗决策主要取决于肿瘤分期、肿瘤分级、激素受体状态和HER2状态。只有HER2阳性肿瘤才使用抗HER2抗体曲妥珠单抗进行治疗。通常使用两种不同的方法来分析乳腺癌肿瘤的HER2状态。FISH（荧光原位杂交）分析HER2基因扩增，而IHC（免疫组织化学）分析组织样本中HER2的表达和分布。HER2过表达通常与预后不良相关。FDA批准的测试套件包括，例如，HercepTest™ 、InSite® (BioGenex Laboratories Inc.)、Bond Oracle™ (Leica Biosystems)和Ventana HER2 Pathway® System (Ventana Medical Systems, Inc.) 。它使用兔单克隆抗HER2抗体（克隆4B5）和过氧化物酶结合的二抗，通过免疫组织化学测定半定量分析甲醛固定和石蜡包埋的乳腺癌组织样本的HER2状态。不幸的是，测试程序和样本处理中的变量会影响测试结果。这些是固定剂的类型、固定时间、石蜡块的存储和切片的厚度（手动 Agilent/DAKO）。甲醛处理通常对初级检测抗体的表位识别产生不利影响，这种影响可能对染色模式产生很大影响。事实证明，通过FISH分析HER2基因扩增是在这方面更可靠的诊断技术。 在免疫分析检测试剂的特殊类别中，双特异性抗体分子代表了一类。在诊断分析中使用双特异性抗体可以减少分析复杂性，通过减少程序步骤总数和提高单特异性抗体的灵敏度。这是通过它们固有的结合两个不同表位的能力实现的。在免疫分析中，双特异性检测抗体可以用一个臂结合分析物，用另一个臂结合报告分子。这种安排的优点是报告分子（例如，FITC（荧光素）或酶）和抗体不再彼此共价结合，这可能会对它们的功能产生不利影响。 免疫PET（基于免疫的正电子发射断层扫描）是癌症成像的应用之一。免疫PET用于分析体内肿瘤抗原的表达和分布，基于此，有助于选择最合适的靶向治疗。免疫PET探针通常由正电子发射放射性同位素标记的单克隆抗体组成，这些抗体特异性结合肿瘤相关抗原、肿瘤细胞表面分子或生物标志物，以及PET扫描仪。在这方面的一个关键方面是抗体分子的生物半衰期和放射性同位素的物理半衰期需要平衡。由于抗体由于其大尺寸（150 kDa）和FcRn（新生儿Fc受体）循环而在体内保留时间较长，它们与较小分子（如重组抗体片段）相比，肿瘤穿透性也较差。因此，它们需要与具有适当半衰期的放射性同位素耦合，因为成像通常在注射后1天进行，以实现探针的生物分布。抗体探针应用于循环中，并结合肿瘤相关抗原，对病变进行特异性标记。在那段时间里，患者会接触到一定量的辐射，这随着探针在体内的保留时间而增加。改进这种方法的一个例子是，将双特异性抗体的一个结合位点设计成对半抗原的特异性。半抗原本身被放射性同位素标记，例如，用68Ga或18F。另一个结合位点特异性结合肿瘤相关抗原CEA（癌胚抗原）。CEA 半抗原双特异性抗体显示出特异性肿瘤靶向和对CEA阴性组织的较小靶向。这种使用双特异性抗半抗原抗体的预靶向方法，从循环中更快地清除放射性同位素，没有非特异性标记，并且对肿瘤的可视化良好且快速。它减少了患者接触同位素的总体时间，这对患者可能是一个巨大的好处。另一种方法是使用较小的抗体片段，如F(ab)2或scFv片段，以提高靶向的清除率。 图2 展示了三种常用的ELISA格式，用于诊断应用。(a) 显示了直接ELISA的设置，其中感兴趣的抗原（分析物）被包被到ELISA板的孔表面。抗原通过酶标记的检测抗体结合，或者为了信号放大，通过检测抗体然后通过多克隆酶标记的二级抗体结合。在 (b) 中，以示意图形式展示了夹心型ELISA测定。分析物通过捕获抗体的结合附着到孔表面，并通过另一个表位被酶标记的检测抗体结合，或者再次通过使用多克隆酶标记的二级抗体进行信号放大。(c) 显示了竞争ELISA设置的一个例子。要检测的分析物被固定到孔表面，并且可以被酶标记的检测抗体结合。如果样本中分析物的浓度增加，检测抗体更有可能结合到可溶性分析物上，这转化为信号强度的降低。 3.抗体在科学中的应用  抗体对特定抗原的极高灵敏度和特异性也使它们成为许多研究应用的理想试剂。事实上，随着现代生物技术大规模生产的便利，抗体已经成为生物医学研究的主要工具。单克隆（均质同种型和抗原特异性）和多克隆（异质同种型和抗原特异性）抗体都可以从工业供应商那里获得。多克隆抗体是从免疫目标抗原的动物血清中分离出来的。它们包含针对同一抗原的不同表位的不同抗体的混合物，并且可能还含有针对不相关蛋白的抗体，这可能会影响测定结果。此外，多克隆抗体的供应依赖于来源动物，因此没有两批针对特定抗原的多克隆抗体是相同的。相比之下，单克隆抗体来自杂交瘤或通过表达载体重组制备，两者都确保了均质抗体的持续供应。 3.1.免疫沉淀  免疫沉淀（IP）是一种使用抗体从水溶液中沉淀或“拉下”其相应目标抗原的方法，例如细胞裂解物或生物流体。沉淀过程是通过使用特殊珠子来促进的，这些珠子与抗体的Fc区域结合（通常是通过抗Fc抗体或蛋白A/G的共价结合）。珠子本身通常由琼脂糖、琼脂糖或其他合成聚合物组成。通过离心、磁场力或其他机械方法实现珠子上抗体-抗原复合物的分离。IP测定通常用于许多生化、细胞或分子生物学应用。一个基本应用是简单地纯化目标蛋白以进行后续测定，如电泳或西方印迹（见下文）。IP也可以用来分析多种蛋白质的相互作用。在这些情况下，使用抗体沉淀目标蛋白，并使用后续测定（如质谱分析）来确定是否有其他蛋白被拉下复合物。 3.2.染色质免疫沉淀 染色质免疫沉淀（ChIP）是IP的一种特殊变体，用于分析蛋白质与核酸的相互作用。该方法最初是为评估RNA聚合酶II与其目标基因核苷酸序列而开发的。在这个过程中，细胞被固定以交联DNA与任何结合蛋白。在细胞裂解和DNA-蛋白质复合物裂解成100-300碱基对的片段后，使用针对感兴趣蛋白（例如，转录因子）的抗体按照标准IP协议进行免疫沉淀。DNA-蛋白质复合物最终通过解决交联来解离，并通过PCR扩增分析沉淀的DNA片段。ChIP也可以用来分析其他与DNA共沉淀的蛋白质，通过质谱分析。有时化学交联可能会改变抗原表位的结构，导致抗体结合的破坏。对于这种情况，可以进行NChIP，即省略交联步骤并在天然抗原上进行IP的ChIP变体。然而，这种策略仅限于与DNA强烈结合的目标蛋白。ChIP的最新进展是ChIP-chip，即基因组范围内的ChIP分离DNA的微阵列分析，以及ChIP-seq，即在免疫沉淀DNA后进行高通量测序。 3.3.西方印迹 西方印迹（WB）是一种方法，它将凝胶电泳的分辨率与抗体检测的特异性结合起来。在这个过程中，使用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离蛋白质，然后通过电荷转移到吸收性印迹膜上。对于那些在蛋白质变性后不识别其相应目标抗原的抗体，也可以应用原生PAGE（不含SDS）。蛋白质转移后，印迹膜被封闭以减少非特异性蛋白质结合，随后与目标蛋白特异性的初级抗体孵育。由于初级抗体通常没有标记，因此使用标记的二抗来检测，二抗特异性结合初级抗体的Fc部分。相应的标签通常是用于比色或化学发光反应的酶，或者是荧光团，这取决于后续分析的类型。WB可以用来检测抗原的存在和数量、其分子量以及抗原提取的效率。这种方法在处理不溶性、难以标记或容易降解的抗原时特别有用，因此不适合如免疫沉淀等程序。 3.4.酶联免疫吸附测定（ELISA） ELISA方法已在“抗体在诊断中的应用”部分描述，因为它是一种成熟且稳健的方法，用于检测和定量复杂生物样本（如人血清）中与疾病相关的极低量的分析物。一般来说，酶联免疫吸附测定是一种识别和分析流体中分子浓度的方法。它依赖于抗体与其特异性抗原的非常特异性和高亲和力的相互作用。用于ELISA的酶包括，例如，β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、过氧化物酶和碱性磷酸酶。如果添加了特定的可溶性底物，就会发生酶-底物反应，并产生在分光光度计上在400-600 nm处读取的比色产品信号，根据标准曲线通知分析物的浓度。ELISA通常用于肽和蛋白质分析。除了其他非常敏感和更现代的方法外，它仍然是一种稳健、简单且经常应用的测定系统，不需要太多的自动化。尽管如此，包含移液机器人、微孔板洗涤器和吸光度读数器的完整自动化系统是可用的（参见，例如，Hamilton公司）。在1975年Köhler和Milstein引入的杂交瘤技术用于单克隆抗体生产期间，ELISA用于分析免疫动物的血清抗体滴度。在抗体产生B细胞和不朽骨髓瘤细胞融合后，相应的杂交瘤细胞产生单克隆抗体。使用ELISA筛选细胞上清液，以识别产生抗体的杂交瘤细胞。在使用噬菌体展示进行重组抗体发现时，噬菌体-ELISA应用于筛选后富集噬菌体池的生化特征。 3.5.免疫组织化学/免疫细胞化学 免疫组织化学（IHC）和免疫细胞化学（ICC）通常是用于原位检测组织和细胞内蛋白质存在和位置的方法。虽然ICC是在从周围细胞外基质中移除的完整细胞上进行的，但IHC是在固定的整个组织切片上进行的（图3）。这两种方法都使用单克隆或多克隆抗体来检测目标结构。然而，重要的是要考虑后者是识别多个表位的抗体的异质混合物，这也可能导致非特异性结合。染色可以通过直接标记初级抗体或使用标记的二抗来完成，二抗特异性结合初级抗体的恒定部分。根据后续检测方法的不同，可以使用不同的染色报告器。使用酶联抗体和比色底物的比色染色通常使用。这种方法相对容易，幻灯片可以通过标准显微镜分析。缺点是可能由于内源性酶活性而导致更高的信号背景，以及每个样本只能针对一个或两个抗原。另一种方法是使用荧光标记抗体（免疫荧光），这允许同时标记和检测多个抗原。这可以通过使用来自不同物种或亚类的初级抗体以及相应的标记二抗来实现IHC和ICC。对于高分辨率分析，也可以应用免疫金染色（IGS）。这种方法使用与不同大小的金颗粒链接的抗体，允许在单个样本中检测不同的抗原。样本分析最终在高分辨率的电子显微镜扫描中进行，具有高灵敏度，允许在细胞和组织内非常精确地定位目标抗原。IHC和ICC在基础研究中广泛用于理解生物标记物和不同细胞或生物组织部分中差异表达蛋白的分布和定位。 图3 展示了免疫组织化学程序的示意图。组织样本被安装在载玻片上（a）。组织样本与特异性初级抗体孵育（b）。组织样本与标记有报告分子的二级抗体孵育，该二级抗体特异性结合初级抗体的恒定区域（c）。 3.6.免疫PCR和邻近连接测定 免疫PCR是ELISA和聚合酶链反应（PCR）的结合。在这种情况下，检测抗体与DNA寡核苷酸链接，该寡核苷酸通过PCR扩增。扩增的DNA分子可以使用标准荧光方法检测。邻近连接测定（PLA）是一种技术，它扩展了经典免疫PCR的能力，以包括以高特异性和灵敏度检测蛋白质相互作用。该方法基于使用带有寡核苷酸标记的二抗（称为PLA探针）。这些抗体结合针对目标抗原的不同初级抗体的恒定区域。当PLA探针彼此靠近（大约20-40 nm，例如，当两个分析的目标抗原相互作用或形成蛋白质复合物的一部分时），寡核苷酸探针可以杂交并在添加两个“连接寡核苷酸”和DNA聚合酶后参与循环DNA合成。产生的扩增的圆形结构仍然共价连接到其中一个PLA探针上，并且可以通过标准荧光方法再次检测。 3.7.流式细胞术 流式细胞术是一种高度复杂的方法，用于分析单个细胞（包括细菌和微生物细胞）的多个物理参数，这些细胞来自含有大量细胞的样本，并具有高通量。也可以分析人工颗粒，如可以装载蛋白质和荧光分子的聚合物珠子。因此，该方法在临床中用于支持细胞水平的疾病诊断，例如免疫表型（见“抗体在诊断中的应用”），以及在科学中筛选大型肽和基于蛋白质的文库，用于定向进化。流式细胞术的原理是通过被分析的细胞和颗粒散射和发射光。给定细胞的形态结构和荧光团装载与光散射和荧光发射相关。流式细胞术设备的重要组件包括流体学、光学、探测器、光电倍增器和计算机。它们共同工作，将含有细胞的液流和激光束聚焦到流动室，使细胞逐一通过激光，通过探测器检测发射和散射的光。检测荧光信号需要特殊的滤光片，这些滤光片依赖于发射荧光的波长。探测器下游的光电倍增器将光信号转换为放大的电子信号。 对于科学应用来说，将流式细胞术与分选单元耦合的可能性特别吸引人。通常，使用特殊的FACS（荧光激活细胞分选）机器。FACS能够从大型异质细胞群体中分离出具有定义参数的单个细胞。通过使含有细胞的液滴通过由两个偏转板产生的强电场来偏转液滴，从而实现单个细胞的分选。在抗体工程领域的定向进化方法中，可以从在微生物细胞上展示的大型基于抗体的文库中分离出具有改进特性的结合物，例如特异性或结合常数（KD）。 流式细胞术的重要发现是量子点，它在光谱分辨率方面显示出优越的特性，并减少了传统荧光团（如FITC（荧光素）或PE（R-藻红蛋白））所知的重叠光谱问题。量子点不褪色且非常光稳定。尽管如此，它们尚未成功建立一个稳健的工具产品系列，因此在二级染色分子领域仍然由抗体-荧光团缀合物主导。 3.8.质谱 质谱（MS）是一种分析方法，用于测量离子的质量-电荷（m/z）比，以识别和定量简单和复杂基质中的分子。MS是蛋白质组学、药物发现、环境分析和生物医学研究等广泛科学领域的主要工具。然而，MS的一个常见问题是高丰度蛋白的存在，这些蛋白掩盖了一些感兴趣的蛋白。克服这个问题的策略是将MS与基于抗体的亲和方法结合。在基于免疫沉淀的质谱（IP-MS）中，使用IP捕获和隔离感兴趣的分子，然后通过MS分析。已经开发了几种定量和定性应用，通过将MS与基于抗体的免疫分析结合，提高了MS的灵敏度和特异性。2004年引入的稳定同位素标准和通过抗肽抗体捕获（SISCAPA）是一种方法，其中感兴趣的肽（在使用例如酶胰蛋白酶进行蛋白水解后）通过使用固定在流穿柱或磁性珠子上的抗肽抗体富集。通过选择仅在选定目标蛋白中出现的序列的目标肽，目标肽可以直接作为目标蛋白的定量替代品。将含有稳定同位素标签的合成目标肽以已知量添加到消化样品中，作为内部标准。由于目标肽和标准品由于稳定同位素标签的质量差异可以分别测量，它们的比率提供了目标肽量的所需定量估计。SISCAPA在蛋白质组学领域的多种研究中使用，以及在临床血液检测中，例如，用于验证和定量乳腺癌患者中的生物标志物，如人血清转铁蛋白受体（sTfR）。与SISCAPA类似的方法是免疫-MALDI（iMALDI），其中蛋白水解肽也用抗肽抗体捕获，但富集的样本随后点到特定基质上，最终通过基质辅助激光解吸/电离（MALDI）MS分析。该方法已用于诊断不同病理，如高血压和阿尔茨海默病。另一种类似方法是免疫-MRM，将多反应监测质谱（MRM-MS）与基于抗体的肽混合物富集相结合。在MRM-MS中，串联质谱仪的第一阶段选择特定质量的离子，第二阶段选择前体离子的碎片反应的离子产物进行检测。质谱免疫分析（MSIA）是一种自上而下的基于MS的方法，结合了免疫亲和分离和质谱检测。针对目标蛋白的抗体附着在安装在移液器尖端入口的多孔微柱上，可直接从生物样本中进行蛋白亲和提取。亲和捕获后，蛋白可以直接洗脱到目标板上进行MALDI MS分析，或用少量洗脱溶液进行随后的液相色谱-MS（LC-ESI MS）分析。质谱细胞术是流式细胞术和元素质谱的融合。在这种方法中，细胞上的目标蛋白用与独特稳定重金属同位素缀合的抗体标记。随后将标记的细胞雾化，通过氩等离子体使金属缀合抗体离子化。然后通过飞行时间（TOF）质谱仪分析质量-电荷比。该方法克服了基于传统荧光团的宽发射光谱的流式细胞术中的光谱重叠限制。相反，元素质谱能够以高精度区分具有不同原子量的同位素。这一根本差异使得可以使用基于质量的平台同时检测更多的细胞特征。然而，质谱细胞术的当前限制是流速低和操作成本高（与传统流式细胞术相比）。 要点: 抗体是非常多功能的工具，已经成为治疗、诊断和生物医学科学中最重要的生物分子类别。 下章预告：双特异性抗体 往期内容： 第二章：抗体：发现及特性的历史 第三章：单克隆抗体和杂交瘤细胞 第四章：抗体展示系统 第五章：转基因动物用于产生人类抗体 为促进抗体行业的交流与创新，2024年10月16-17日第七届金秋十月抗体产业发展大会如约而至。会议旨在为研究人员提供一个互动交流的平台，有助于推动抗体产业的进一步发展。 会议内容 时间：2024年10月16-17日 地点：上海张江（酒店定向通知） 规模：600-800人 主办单位：生物制品圈、抗体圈 演讲支持：Entegris、瑞孚迪、AS ONE CORPORATION 会议费用：免费FREE!（仅收取100元报名定金，含参会学习、茶歇、会议手册，定金概不退还），先到先得，报完即止！ 报名方式：扫描下方二维码或点击文章最底部“阅读原文”→ 填写表格 → 报名成功（报名志愿者，承担一定工作，请慎重考虑，免交定金）！ 组委会获得报名信息后，根据报名信息进行初筛，并进一步与报名者沟通确认，实现精准邀请。最终有机会进入大会微信群（严格审核通过）。 日程安排 更多嘉宾正在邀请中 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

内容来源：小药说药 前言 在肿瘤免疫治疗中，免疫系统主要诱导细胞毒性淋巴细胞的细胞溶解作用来抑制疾病的进展。然而，肿瘤微环境中的CD8+T细胞往往因为持续的抗原刺激，发生耗竭。耗竭的CD8+T细胞持续存在，但逐渐失去其效应器功能、细胞毒性和增殖能力，导致免疫监视功能低下。 耗尽的CD8 T细胞通常表达一整套抑制性免疫检查点受体（ICR），由同源配体触发，通过下游信号通路调节T细胞反应。在耗竭的CD8+T细胞中，阻断ICR和免疫检查点配体（ICL）之间的相互作用是恢复CD8+T细胞的可行策略。考虑到肿瘤微环境中T细胞与其他免疫细胞之间的广泛相互作用，免疫细胞上的免疫检查点配体表达在促进抗肿瘤免疫应答方面与肿瘤细胞上的ICL表达同样重要。因此，有必要深入了解这些ICL，以及哪些因素导致ICL表达的患者间差异。 PD-1的配体 PD-1介导的T细胞抑制可归因于PD-1的两种众所周知的配体，即PD-L1和PD-L2（B7-DC、CD273）。 PD-L1 相比PD-L2，PD-L1是PD-1更主要的配体。肿瘤细胞的PD-L1表达通常发生在恶性转化过程中，然而，除了导致PD-L1在肿瘤细胞中组成性表达的内在因素外，肿瘤微环境中的外在因素也可促进PD-L1的表达，如营养缺乏、代谢物积累和缺氧。 炎症性肿瘤微环境提供了调节PD-L1表达的各种因子。IFN-γ主要由效应T细胞和NK细胞分泌，是各种肿瘤细胞PD-L1最有效的诱导剂。在机制上，IFN-γ诱导的PD-L1上调是通过JAK1/2–STAT1激活介导的，最终由干扰素调节因子1（IRF1）与PD-L1启动子直接结合。除干扰素外，其他炎症介质也调节PD-L1的表达，如TNF-α、IL-6、IL-27、TGFβ等。 肿瘤浸润性免疫细胞表达的PD-L1通过多种机制促进免疫逃逸。在抗原呈递细胞（APC）上表达的PD-L1，包括树突状细胞和巨噬细胞，与表达PD-1的T细胞或共刺激分子CD80顺式相互作用传递抑制信号。此外，来自活化T细胞的PD-L1与其他T细胞或巨噬细胞上表达的PD-1结合，后者促进M2极化。T细胞上表达的PD-L1本身作为受体，可导致活化T细胞的无能状态或凋亡。 PD-L2 作为PD-1的第二配体，PD-L2也赋予PD-1抑制功能，尽管其机制尚不完全清楚。PD-L2以比PD-L1更高的亲和力与PD-1结合，PD-L2的表达最初被认为仅限于树突状细胞或巨噬细胞，但最近的研究表明PD-L2的表达没有以前认为的那么受限制，已有报道表明其表达在许多人类恶性肿瘤中。 与PD-L1一样，PD-L2在肿瘤细胞中通过IFN-γ诱导上调，IFN-β通过促进STAT3与PD-L2启动子的相互作用也具有类似的作用。此外据报道，Th2型细胞因子IL-4和IL-13也可诱导食管腺癌中PD-L2的表达。 在免疫细胞中，IFN-γ和Th2细胞因子参与PD-L2的表达。粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）是巨噬细胞和树突状细胞中PD-L2的诱导剂。此外，常见的γ链细胞因子，如IL-2、IL-15和IL-21，可在单核细胞或巨噬细胞中诱导PD-L2表达。 TIGIT的配体 TIGIT是一种抑制性受体，主要由NK细胞、调节性T细胞、记忆性T细胞和耗竭的CD8 +T细胞表达。人TIGIT可与三种配体结合，即脊髓灰质炎病毒受体（PVR，NECL5，CD155）、PVR相关2（PVRL2，NECIN2，CD112）和PVR相关3（PVRL3，NECIN3，CD113），其中PVR对TIGIT的亲和力最高。PVR/TIGIT结合通过磷酸化TIGIT胞内段的免疫受体酪氨酸基抑制基序（ITIM）或干扰PVR/DNAX相关分子1（DNAM-1，CD226）结合抑制T细胞反应。 PVR是一种粘附分子，在许多类型的实体和血液系统恶性肿瘤中过度表达，其过度表达与不良预后相关。PVR是连接蛋白和连接蛋白样（Necl）分子家族的成员，并参与各种生理过程，包括细胞间粘附、运动、增殖和分化，其过度表达可能以肿瘤细胞固有的方式产生促肿瘤作用。同时，致癌的RAS/RAF/MEK/ERK信号通路通过激活蛋白-1（AP-1）与小鼠成纤维细胞中PVR启动子的直接结合来上调PVR的表达，但尚不清楚RAS/RAF/MEK/ERK信号是否也增加了人类肿瘤细胞中PVR的表达。 然而，就抗肿瘤免疫反应而言，PVR过度表达是否具有促肿瘤或抗肿瘤作用仍不确定。在调节抗肿瘤免疫反应时，PVR可与三种不同的受体结合——DNAM-1、TIGIT和CD96，根据其结合的受体，可能会产生矛盾的效应。许多研究表明PVR是NK细胞功能的刺激因子，然而，鉴于TIGIT与PVR的结合亲和力高于DNAM-1，且TIGIT在肿瘤浸润淋巴细胞上高度表达，因此，肿瘤细胞上的PVR表达如何影响体内效应细胞需要进一步研究。 TIM-3的配体 TIM-3是T细胞耗竭的标志，是免疫治疗中最常见的靶点之一。Tim-3有四种配体：半乳糖凝集素-9（Gal-9）、磷脂酰丝氨酸（PtdSer）、高迁移率族蛋白盒1（HMGB1）和癌胚抗原相关细胞粘附分子1（CEACAM1）。 其中，Gal-9和CEACAM1通过从TIM-3分离HLAB相关转录物3（BAT3）来减弱TCR信号，并最终导致细胞凋亡。此外，TIM-3和CEACAM1之间的细胞内相互作用支持TIM-3的成熟和表面转运。因此，T细胞内缺乏CEACAM1会导致TIM-3在细胞内积聚，并且无法与配体相互作用，从而使T细胞从TIM-3介导的抑制中释放出来。 另一方面，暴露在凋亡细胞外小叶上的PtdSer可触发CD8+树突状细胞或巨噬细胞亚群上表达的TIM-3并诱导吞噬作用。而HMGB1，一种报警蛋白，可以释放到肿瘤微环境中，与游离DNA形成复合物，复合物的形成有助于DNA内化到树突状细胞中以激活内体TLR。而TIM-3结合HMGB1可抑制复合物的形成和随后的树突状细胞激活。迄今为止，已知TIM-3与PtdSer或HMGB1之间的相互作用间接影响T细胞功能，但PtdSer或HMGB1是否直接影响表达TIM-3的T细胞还有待研究。 LAG-3的配体 迄今已发现了五种LAG-3配体：MHC II、半乳糖凝集素-3（Gal-3）、肝窦内皮细胞凝集素（LSECtin）、α-突触核蛋白原纤维（α-syn）和纤维蛋白原样蛋白1（FGL1）。与其他配体不同，LAG-3结合α-syn与神经系统中病理性α-syn纤维的细胞间传递有关，与免疫反应无关。 尽管有报道称，LAG-3可以高亲和力结合MHCII，并通过阻止MHCII和CD4之间的相互作用来调节CD4+T细胞，但最近的研究表明，LAG-3与MHCII/肽复合物（pMHCII）的结合通过转导抑制信号抑制CD4+T细胞。 此外，研究还发现，大量表达pMHCII的APC通过LAG-3依赖机制抑制CD8+T细胞的激活。另外，其他配体包括Gal-3、LSECtin和FGL1与LAG-3结合，都可以对肿瘤微环境中的CD8+T细胞进行负性调节。 肿瘤内CD8+T细胞和基质细胞是Gal-3的主要来源，但Gal-3也可由多种类型的肿瘤细胞分泌。LSECtin或FGL1在正常生理条件下在肝脏中表达，在一些肿瘤细胞中高度上调。在肿瘤细胞中通过IL-6或IL-10可诱导LSECtin表达，或通过IL-4也可以在人类单核细胞来源的树突状细胞中诱导LSECtin表达。此外，L-6还增加人肝癌细胞中的FGL1的表达。未来的研究需要验证这些配体的精确分子机制以及它们在LAG-3介导的T细胞抑制中的作用。 VISTA的配体 对于VISTA配体的研究长期处于空白状态。然而，目前多个已发表的研究都强调了潜在的VISTA配体。最近，一项研究确定VSIG3（或 IgSF11）为VISTA配体，这种相互作用有助于抑制T细胞反应。由于VSIG3在造血细胞中的表达是无法检测到的，这种相互作用在体内的生理相关性仍有待验证。 此外，有研究发现，VISTA和P-选择素糖蛋白配体-1（PSGL-1）之间存在pH依赖性相互作用。研究人员强调了VISTA细胞外结构域的一个独特特性，它富含组氨酸残基。组氨酸的侧链在酸性pH条件下发生脱质子化，例如在TME中发现的侧链，这种翻译后修饰允许与 PSGL-1 结合。鉴于VISTA多聚体（包括 VISTA-Fc）只在酸性条件下与白细胞结合，这种翻译后修饰在决定VISTA配体相互作用中的重要性是不可低估的。 对这一发现的热情有多种原因。首先，PSGL-1和VISTA在调节T细胞活性和肿瘤免疫方面的作用越来越受到重视。其次，pH 和离子环境是调节免疫受体相互作用的一个新的和有价值的概念。这在离子环境在明显影响T细胞免疫命运的肿瘤中尤为重要。更重要的是，这项研究提出了一种创新的策略来构建pH选择性抗体，即配体只针对pH失调的部位（如肿瘤）。 小结 在肿瘤微环境中，肿瘤细胞通过诱导表达和调控不同的ICR和ICL，建立了一个适宜生长的环境。随着肿瘤的发展，ICRs同时受到共同因素的诱导，而相应ICLs的表达具有重叠但独立的调控。此外，肿瘤微环境中存在多种调节因子，每种调节因子都可能对ICL表达产生不同的影响。 由于ICL表达模式可能指示免疫检查点途径的活动，个体间ICL的差异表达谱可用于预测免疫检查点阻断的治疗反应。例如，许多研究表明PD-L1表达与PD-1阻断剂的治疗反应相关。因此，通过识别基于ICL的稳健生物标记物，有可能实现更高的应答率和精确的免疫治疗。 参考文献： 1.Perspectives on immunecheckpoint ligands: expression, regulation, and clinical implications. BMB Rep. 2021Aug 31; 54(8): 403–412. 药渡媒体商务合作 媒体公关 | 新闻&会议发稿 张经理：18600036371（微信同号） 点击下方“药渡“，关注更多精彩内容 免责声明 “药渡”公众号所转载该篇文章来源于其他公众号平台，主要目的在于分享行业相关知识，传递当前最新资讯。图片、文章版权均属于原作者所有，如有侵权，请及时告知，我们会在24小时内删除相关信息。 微信公众号的推送规则又双叒叕改啦，如果您不点个“在看”或者没设为"星标"，我们可能就消散在茫茫文海之中~点这里，千万不要错过药渡的最新消息哦！👇👇👇

摘要：癌症治疗中最大的挑战是以最小的损伤正常细胞来根除癌细胞。靶向治疗已经发展起来以应对这一挑战，与传统癌症治疗相比，显示出显著增加的治疗指数。由于其对目标抗原的非凡高特异性，抗体成为靶向治疗代理家族中的重要成员。治疗性抗体使用一系列机制直接或间接杀死癌细胞。早期的抗体被开发出来直接对抗癌细胞上的目标。随后是连接技术的进步，使得抗体-药物偶联物（ADCs）的生产成为可能，这些偶联物将细胞毒性有效载荷引导到癌细胞。我们对T细胞生物学的理解的提高，导致了免疫检查点抑制抗体的生产，这些抗体通过激活T细胞间接杀死癌细胞。甚至最近，双特异性抗体被设计合成，以重定向患者的T细胞杀死癌细胞。在这篇综述中，我们总结了治疗性抗体用来靶向癌细胞的不同方法。我们讨论了它们的作用机制、目标特异性的结构基础、临床应用以及正在进行的研究以提高疗效和减少毒性。 1. 引言 在过去的一个世纪中，发展了诸如化疗和放疗等有效的治疗手段来治疗癌症。不幸的是，这些方法通常缺乏足够的特异性，无法在不引起难以忍受的毒性的情况下，使用足够高的剂量来根除癌细胞。单克隆抗体可以提供所需的特异性水平，从而大幅扩大治疗窗口，有些抗体甚至能够区分相差一个氨基酸或经过翻译后修饰的两种抗原。20世纪70年代发展的杂交瘤技术首次允许生产和筛选针对人类抗原的高度特异性小鼠单克隆抗体。其次，将人类抗体恒定区嫁接到小鼠抗体可变区的能力，产生了具有更好治疗效果和较少副作用的嵌合抗体（图1）。第三，20世纪90年代转基因小鼠模型和噬菌体展示系统的应用，使得能够针对癌症靶点产生全人源抗体。随着这些技术进步和临床需求的增加，过去25年见证了基于抗体治疗的爆炸性增长。自1997年以来，已有50多种基于抗体的肿瘤治疗药物获得了美国食品药品监督管理局（FDA）和欧洲药品管理局（EMA）的批准（补充表1）。除了基于抗体的治疗外，抗体片段也被用来生成嵌合抗原受体（CARs）进行T细胞工程。在这篇综述中，我们专注于FDA和EMA批准的基于抗体的治疗以及正在临床前和临床开发中进展的抗体。我们讨论了用于产生嵌合、人源化和人源抗体的相继使用的方法的演变。我们详细说明了正在开发用于靶向癌细胞的一系列格式，如单特异性抗体、免疫检查点抑制剂、双特异性抗体和偶联抗体。最后，我们总结了为应对当前癌症靶向抗体开发中的挑战而进行的新兴研究。 2. 抗体生成 用于识别针对肿瘤抗原的治疗性单克隆抗体或抗体片段的一系列技术。这些技术包括使用目标抗原对啮齿动物进行免疫、噬菌体或酵母展示技术、从人类和小鼠中克隆单B细胞，以及从骆驼科动物中识别单域抗体（称为纳米抗体）。抗体的进一步临床应用开发涉及抗体工程，使其与人类免疫系统越来越兼容。 2.1 嵌合抗体和人源化抗体 单克隆抗体传统上是通过1975年Cesar Milstein和Georges Kohler开发的杂交瘤技术生产的。在这个过程中，B细胞是从免疫特定抗原的小鼠脾脏或淋巴结中分离出来的，然后与Sp2/0这样的骨髓瘤细胞系融合，形成称为杂交瘤细胞系的杂交细胞。通常通过酶联免疫吸附测定（ELISA）筛选杂交瘤克隆以检测蛋白结合，并通过流式细胞术检测细胞结合。杂交瘤技术能够稳健且成本有效地生成一系列小鼠单克隆抗体。然而，注入人体的小鼠抗体会产生人抗鼠抗体（HAMA）免疫反应，限制了它们的疗效并增加了不良反应。因此，获得监管批准的大多数小鼠抗体后来都被撤回（图1）。Blinatumomab（一种双特异性T细胞激活剂，靶向CD19），使用两个小鼠衍生的单链可变片段（scFv）格式，缺乏可结晶片段（Fc），是唯一在临床上广泛采用的小鼠抗体。 为了减少在患者中诱导免疫反应，小鼠抗体的恒定区被替换为人类恒定区，以产生嵌合抗体（图1）。利妥昔单抗（抗CD20）和西妥昔单抗（抗表皮生长因子受体（EGFR））（表1）是最早通过将小鼠抗体2B8和225的可变区连接到人类免疫球蛋白G1（IgG1）重链和人类κ轻链恒定区而产生的嵌合抗体之一。然而，带有小鼠可变区的嵌合抗体仍可被识别为外来物质，导致可能清除治疗性抗体的人抗嵌合抗体（HACA）免疫反应。这可能限制了嵌合抗体的重复应用并阻碍了它们的临床开发。为了进一步减少不必要的免疫反应，通过1980年代开发的称为“人源化”的过程增加了小鼠单克隆抗体的人类含量。人源化涉及将小鼠抗体的互补决定区（CDR）仅嫁接到人类抗体的框架区域（图1）。曲妥珠单抗是通过将小鼠人类表皮生长因子受体2（HER2）抗体mumAb4D5的CDR移植到人类抗体框架中而开发的首批人源化抗体之一，类似的策略被用于开发奥比妥珠单抗（抗CD20）、帕博利珠单抗（抗程序性细胞死亡蛋白1（PD1））和阿特珠单抗（抗PD1配体1（PDL1））（表1）。 除了小鼠杂交瘤技术外，还开发了兔杂交瘤技术，用于生产针对肿瘤抗原（如间皮素）的兔单克隆抗体。CDR嫁接方法已被调整以人源化兔单克隆抗体，如针对间皮素的YP218，用于临床开发。监管机构批准的大多数治疗性抗体是使用杂交瘤方法生成的，随后工程化成嵌合或人源化形式，并广泛用于癌症治疗（图1）。 2.2 全人抗体 1990年代开发的两种技术使得生成全人抗体成为可能：人类抗体噬菌体展示和表达人类抗体的转基因小鼠模型。为了生成产生人类抗体的转基因小鼠，人类Ig基因座或可变区被插入到小鼠基因组中，同时破坏小鼠Ig基因。从小鼠中分离出免疫目标抗原的B细胞，用于单B细胞克隆和测序。转基因小鼠平台XenoMouse（Abgenix/Amgen）、VelocImmune（Regeneron）和HuMab（Medarex/Bristol Myers Squibb）产生了9种获批的针对癌症靶标的人类抗体：daratumumab（抗CD38）、ipilimumab（抗细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4（CTLA4））、nivolumab（抗PD1）、ofatumumab（抗CD20）、panitumumab（抗EGFR）、durvalumab（抗PDL1）、cemiplimab（抗PD1）、tisotumab（抗组织因子（TF））和relatlimab（抗淋巴细胞激活基因3（LAG3））（表1）。这些抗体的成功临床开发导致了KyMouse（Kymab）、OmniRat（Ligand）、H2L2 Mouse（Harbour Antibodies）、Trianni Mouse（Trianni Inc/AbCellera）和RenMab（Biocytogen）等多个转基因小鼠平台的快速崛起。 图1 | 抗体组分。a, 抗体由两个相同的轻链和重链组成，它们通过二硫键连接在一起，呈现出Y字形结构。每个轻链和重链都包含一个可变区（VL和VH），负责抗原结合，以及恒定区（CL和CH），决定抗体的半衰期和效应功能。酶促处理可以将抗体分解成两个片段，分别命名为片段抗原结合（Fab）和可结晶片段（Fc）。轻链和重链的可变区共同构成可变片段（Fv），是保留抗原结合能力的最小片段。制造的Fv片段通过柔性肽连接起来，形成一个称为单链可变片段（scFv）的单一链。根据来自每个物种的肽序列量，抗体被分为小鼠、嵌合、人源化和人类抗体。a Belantamab mafodotin 被撤回，但可能会根据正在进行的试验重新获得批准。Teclistamab（一种人源化和人类抗体的组合）在此图中被视为人源化抗体。CDRs，互补决定区。 展示技术为人类抗体开发提供了另一种平台。使用噬菌体展示，可以从多样性超过10^10的大型文库中分离出人类单链可变区（scFv）或片段抗原结合（Fab）片段（图1）。噬菌体展示技术通常使用M13丝状噬菌体来表达与噬菌体pIII外壳蛋白融合的抗体片段，如scFv。噬菌体文库用固定在微孔板或珠子上的目标抗原进行筛选。非特异性噬菌体结合物被洗去，剩余的特异性结合物被收集用于下一轮筛选。通常需要3到5轮筛选来分离特异性结合物。这个过程称为噬菌体淘选，它模仿体外免疫选择。使用下一代测序的新方法有助于快速识别稀有结合物。Dyax生产的噬菌体展示系统产生了三种获得监管批准的全人抗体：ramucirumab（抗血管内皮生长因子受体2（VEGFR2））、necitumumab（抗EGFR）和avelumab（抗PDL1）（表1）。此外，由Dyax、Cambridge Antibody Technology、MorphoSys等产生的多个噬菌体展示衍生的人类抗体目前正在进行临床试验。转基因小鼠和噬菌体展示技术都有其独特的优势。通常，转基因小鼠平台倾向于产生具有更理想生物物理特性和在临床试验中表现更好的抗体，而噬菌体展示允许选择针对特定表位的抗体。除了噬菌体展示，细胞表面展示（酵母、细菌和哺乳动物）、核糖体展示和mRNA展示技术已被用于抗体生成。酵母和哺乳动物细胞表面展示允许在真核细胞的细胞表面表达重组抗体片段。这使得可以通过流式细胞术分离抗原特异性细胞，并发现高亲和力结合物。Sintilimab，一种特异性针对PD1的人类IgG4抗体（表1），是通过酵母细胞表面展示分离的，目前正在接受FDA监管审查以获得批准。 2.3 比较嵌合、人源化和全人抗体 生产嵌合、人源化或全人抗体的目标是减少针对抗体的免疫反应，这种反应带有中和风险和不良反应（例如，输注反应和过敏反应），并随着重复给药而增加。对各种抗体治疗的人类临床试验的大规模分析显示，使用嵌合、人源化和全人抗体时，免疫原性逐渐下降。然而，该研究没有检查较低的免疫原性是否会导致更好的肿瘤消退或患者生存。几种FDA批准和EMA批准的嵌合、人源化和全人抗体针对常见的癌症抗原，如CD20、HER2和EGFR，尽管它们在不同的表位上具有不同的结合特性（表1）。 ADCC，抗体依赖性细胞介导的细胞毒性；ADCP，抗体依赖性细胞介导的吞噬作用；ASPS，肺泡软组织肉瘤；BCC，基底细胞癌；CDC，补体依赖性细胞毒性；dMMR，错配修复缺陷；HCC，肝细胞癌；HNC，头颈癌；IgG，免疫球蛋白G；MCC，默克尔细胞癌；MSI-H，微卫星高度不稳定性；NA，数据不可用；PMBCL，原发性纵隔大B细胞淋巴瘤；RCC，肾细胞癌；SCC，鳞状细胞癌；TNBC，三阴性乳腺癌。 比较针对CD20（利妥昔单抗与奥比妥珠单抗或利妥昔单抗与奥法木单抗）、HER2（曲妥珠单抗与马格图珠单抗）和EGFR（西妥昔单抗与帕尼图珠单抗）的抗体的III期临床试验已经证明，总生存率相似，治疗相关治疗中断的比率也相似，表明具有等效的治疗效力。然而，大量的HAMA免疫反应阻碍了针对二唾液神经节苷GD2的小鼠抗体的开发，并且在使用利妥昔单抗治疗自身免疫性疾病的患者中观察到了强烈的HACA免疫反应。对HACA免疫反应的担忧，加上简化了人源化和全人抗体生成的技术进步，增加了这两种格式的使用。进入当前临床试验的抗体要么是人源化的，要么是全人产品（图1和补充表2），根据以前的试验结果，人源化和全人抗体在患者中倾向于展示相似的治疗效力。 2.4 不同格式的抗体治疗 根据它们的结构和功能机制，抗体治疗可以分为三种主要格式——单特异性抗体、双特异性抗体和与有效载荷（如药物、毒素或放射性同位素）偶联的抗体（图2）。 2.5 单特异性抗体格式 单特异性抗体格式涉及全长免疫球蛋白，它们结合到目标抗原上。在五种免疫球蛋白亚型（IgG、IgM、IgA、IgE和IgD）中，只有IgG能够结合到新生儿Fc受体（FcRn），从而带来长半衰期（大约21天）。针对癌症的抗体利用IgG亚型来利用这一延长的半衰期，通常每21天给药一次。大多数FDA批准和EMA批准的抗体以及正在开发的抗体都使用单特异性IgG抗体格式（见图1自然发生的IgG抗体的基本结构）。IgG抗体有四个亚类（IgG1、IgG2、IgG3和IgG4），大多数治疗性抗体使用IgG1亚类。单特异性抗体格式的目标抗原是细胞表面蛋白，主要是在实体癌中过度表达的生长因子受体（例如，在乳腺癌、胃癌和胃食管癌中过度表达的HER2；在结肠癌中过度表达的EGFR；在肺癌中过度表达的MET）。对于血液恶性肿瘤，抗体通常针对由不同免疫细胞亚群表达的细胞表面糖蛋白（也称为簇分化（CD）标记），例如B细胞恶性肿瘤中的CD19和CD20；T细胞恶性肿瘤中的CD52和CC基序趋化因子受体4（CCR4；也称为CD194）；浆细胞恶性肿瘤中的CD38和B细胞成熟抗原（BCMA；也称为TNFRSF17）。目标及其相应的抗体列在表1中。 2.5.1 作用机制 抗体与癌细胞结合通过多种机制导致癌细胞死亡。直接阻断生长因子的生存信号和阻断血管生成导致肿瘤血液供应中断是这些抗体对实体肿瘤消退的两个主要机制。相比之下，血液恶性肿瘤中针对的CD标记通常在促进癌细胞存活方面没有重要作用，尽管一些研究表明针对CD20或CD52的抗体可以诱导非caspase依赖性的程序性细胞死亡。相反，抗体通过招募和激活免疫效应细胞来诱导细胞毒性。每个IgG抗体亚类赋予抗体不同的效应功能。IgG1亚类Fc片段对巨噬细胞和自然杀伤（NK）细胞表达的激活Fcγ受体（FcγRs；FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIIa和FcγRIIIb）有很强的亲和力。FcγR结合导致巨噬细胞和NK细胞介导的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）和抗体依赖性细胞吞噬作用（ADCP），直接杀死癌细胞（见图2）。最早获得FDA批准的两种抗体是针对恶性B细胞表达的CD20的利妥昔单抗和针对过度表达HER2的乳腺癌细胞的曲妥珠单抗，这两种抗体都使用常见的IgG1亚类。IgG1诱导ADCC和ADCP的能力最终导致癌细胞死亡，并且可以通过Fc工程进一步增强。支持这一作用机制的是，例如携带FcγRIIIa等位基因中纯合子158缬氨酸/缬氨酸的患者对利妥昔单抗和曲妥珠单抗的反应更高。IgG1亚类还结合补体蛋白C1q，导致通过补体依赖性细胞毒性（CDC）的癌细胞死亡。 图2 | 抗体格式和作用机制。a, 根据结构和作用机制，治疗性抗体可以分为三种不同的格式：单特异性抗体、双特异性抗体，以及与药物、毒素或放射性同位素偶联的抗体。b, 单特异性抗体结合癌细胞上的抗原，通过多种机制导致细胞死亡，包括破坏生长因子受体（如人类表皮生长因子受体2（HER2））的生存信号，激活免疫细胞（如通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）的自然杀伤（NK）细胞介导的杀伤和通过抗体依赖性细胞吞噬作用（ADCP）的巨噬细胞介导的杀伤），以及通过激活补体级联反应（补体依赖性细胞毒性（CDC））。免疫检查点阻断抗体结合并激活免疫细胞，如T细胞，导致免疫介导的癌细胞死亡。双特异性抗体结合两种不同的抗原。大多数双特异性抗体设计为结合T细胞（T细胞激活剂）和癌细胞，并将T细胞重定向以杀死癌细胞。非T细胞激活的双特异性抗体结合癌细胞表面的两种不同抗原，导致直接杀死癌细胞。抗体-药物偶联物（ADCs）、免疫毒素和放射性同位素偶联抗体携带有毒载荷，增强了抗体杀死癌细胞的能力。BCMA，B细胞成熟抗原；EGFR，表皮生长因子受体；gp100，糖蛋白100；GPRC5D，G蛋白偶联受体家族C组5成员D；FcγR，Fc γ受体；PD1，程序性细胞死亡蛋白1；PDL1，PD1配体1；scFv，单链可变片段；TCR，T细胞受体。 尽管大多数直接介导癌细胞死亡的癌症靶向抗体更倾向于使用IgG1亚类（见表1），但一个例外是帕尼图珠单抗，一种IgG2 EGFR抗体。IgG2抗体只能弱激活NK细胞和补体，而是通过招募髓系细胞来介导癌细胞死亡。目前市场上的单克隆抗体主要是IgG1。除了效应功能外，IgG亚类的选择还基于结构稳定性、循环半衰期、制造经验以及监管批准、缺乏免疫原性或意外副作用，以及公司开发组合中特定IgG亚类的可用性。 研究了曲妥珠单抗的Fab片段与HER2胞外域复合物的结构，为治疗机制提供了首个结构基础。曲妥珠单抗结合HER2的第四个亚域，阻止其同源二聚体形成，进而减少细胞增殖（蛋白质数据银行（PDB）：1N8Z；见图3a）。结构技术的进步促成了首个应用冷冻电镜（cryo-EM）技术获得的HER2与两种靶向HER2的抗体曲妥珠单抗和帕妥珠单抗复合物的结构[61]。与曲妥珠单抗不同，帕妥珠单抗通过与HER2的第二亚域相互作用，抑制HER2与HER3配体诱导的异源二聚体形成，破坏下游信号传导（见图3a）。曲妥珠单抗和帕妥珠单抗的结合表位相隔约60埃（Å），HER2-曲妥珠单抗-帕妥珠单抗复合物结构指导了双特异性抗体Zanidatamab的设计，该抗体与两种HER2表位相互作用，具有改善的治疗效力。 结构生物学技术也被用来理解利妥昔单抗的治疗机制；具体来说，利妥昔单抗如何促进CD20的聚集。在最初的高分辨率结构中，似乎CD20形成了同源二聚体，利妥昔单抗的Fab片段结合到每个CD20单体的胞外区域（PDB：6VJA；见图3b）。利妥昔单抗两个Fab片段之间的距离表明单一利妥昔单抗IgG分子无法结合CD20同源二聚体。使用全长IgG利妥昔单抗进行的额外电子显微镜研究提供了首个证据，表明利妥昔单抗交联两个CD20同源二聚体，结果形成一个大的超分子复合物，确立了利妥昔单抗的结合机制。 2.5.2 单特异性抗体Fc工程 大多数IgG1抗体的效应功能由Fc域介导。数十年的研究增进了我们对Fc域与不同Fc受体相互作用的理解，并协助工程化具有理想效应功能的抗体。在临床前研究中显示增加活性的常见Fc域修饰包括去岩藻糖基化（从Fc区域去除岩藻糖以增加FcγRIIIa结合）或关键残基的氨基酸替代（例如S239D和I332E，增加与Fc受体的结合），两者都导致增强的ADCC和ADCP。两种在临床使用的抗体具有去岩藻糖基化的Fc（靶向CD20的奥比妥珠单抗和靶向CCR4的莫加木单抗）以增强它们的免疫效应功能（见表1）。随机临床试验（GALLIUM和GOYA研究）评估了利妥昔单抗（未经Fc修饰的CD20抗体）或奥比妥珠单抗（Fc去岩藻糖基化的CD20抗体）在不同淋巴瘤亚型中的益处。在GOYA研究中，两组患者的结果相似。GALLIUM研究显示接受奥比妥珠单抗治疗的患者有更好的无进展生存期（PFS），但未能证明总体生存益处，这是肿瘤学中的重要基准。此外，GALLIUM研究也因使用比利妥昔单抗更高剂量的奥比妥珠单抗而受到批评，这可能混淆了PFS结果。两种在Fc域具有氨基酸替代以增加ADCC的抗体已获得FDA批准：HER2抗体Margetuximab和CD19抗体Tafasitamab（见表1）。III期试验比较了Margetuximab与曲妥珠单抗（Fc未经修饰的HER2抗体）在乳腺癌患者中的疗效。尽管早期分析显示Margetuximab减少了癌症进展，但最终分析中两组的总体生存率相同。基于这些临床试验结果，Fc工程化抗体治疗癌症患者的益处仍然不清楚。 2.5.3 免疫检查点抑制剂 在过去十年中，另一组靶向免疫细胞调节检查点的单特异性抗体对癌症患者显示出显著的临床疗效。目前11种FDA批准和EMA批准的免疫检查点抑制抗体现在被用于治疗20多种不同类型的癌症，包括肺癌、黑色素瘤、肾细胞癌、头颈鳞状细胞癌（见图4a,b），预计近期将有更多的这些抑制性抗体获得批准（见表1）。免疫检查点抑制剂在大多数癌症类型中显示出20-30%的响应率。然而，某些恶性肿瘤如霍奇金淋巴瘤和皮肤癌、微卫星高度不稳定性（MSI-H）癌症、PDL1表达升高的癌症、突变负担高（每兆碱基≥10个突变），以及与病毒相关的一些癌症的响应率显著更高。 2.5.4 作用机制 免疫检查点阻断抗体抑制了对T细胞起负向调节作用的途径，从而重新激活细胞毒性T细胞以杀死癌细胞（见图2）。在临床试验中正在研究的20多个免疫检查点中，治疗性抗体已经获得FDA或EMA批准的三个蛋白或途径是CTLA4、PD1-PDL1和LAG3。免疫检查点抑制剂的作用机制已在其他综述文章中广泛讨论，因此这里只简要提及。CTLA4、PD1和LAG3的表达是在T细胞刺激后诱导的，其主要目的是限制T细胞激活的程度。PD1与其配体PDL1和PDL2相互作用，这在癌细胞表面经常过度表达。PD1与其配体的结合导致招募酪氨酸磷酸酶，该磷酸酶去磷酸化T细胞受体（TCR）下游的信号分子。这阻止了TCR介导的T细胞增殖（信号1），并减弱了T细胞对癌细胞的响应，使肿瘤能够逃避免疫系统。CTLA4与T细胞共刺激受体CD28竞争结合抗原呈递细胞（APCs）上的CD80和CD86。CTLA4与这些配体的结合阻止了CD28共受体信号传导（信号2），从而抑制T细胞激活并损害对癌症的免疫反应。同样，当LAG3与主要组织相容性复合体（MHC）II类分子或纤维蛋白原样蛋白1（FGL1）结合时，LAG3表达对T细胞和NK细胞功能的负向调节作用。破坏这些相互作用的抗体通过降低激活阈值允许增强的T细胞激活，使耗尽的T细胞“重新激活”，并将新的T细胞克隆招募到肿瘤中。免疫检查点抑制剂也可能对调节性T细胞（Treg细胞）有不同的影响，这是一群在肿瘤微环境中抑制免疫活动的T细胞亚群。一些使用小鼠模型和人类体外模型的研究表明，PD1和CTLA4阻断可以选择性地耗尽Treg细胞并增强抗肿瘤免疫。然而，在接受免疫检查点抑制剂治疗的患者中并未观察到这种Treg细胞耗竭，因此，与Treg细胞失活相比，细胞毒性T细胞的压倒性重新激活可能是推动免疫检查点抑制剂介导的肿瘤回归。 图3 | 抗体-抗原相互作用的结构基础。a, 针对人表皮生长因子受体2 (HER2) 的抗体结合不同的HER2表位。冷冻电镜 (cryo-EM) 结构显示了与曲妥珠单抗和帕妥珠单抗的片段抗原结合 (Fab) 域结合的HER2胞外域 (ECD)（PDB ID: 8Q6J）。b, CD20同源二聚体与两个利妥昔单抗Fab域复合物的冷冻电镜结构（PDB ID: 6VJA）显示每个CD20分子与一个利妥昔单抗Fab结合。利妥昔单抗通过交联CD20二聚体形成大的超分子复合物来促进CD20的聚集。c, 针对程序性细胞死亡蛋白1 (PD1) 的抗体结合不同的PD1表位。Pembrolizumab Fab（橙色和金色；PDB ID: 5GGS）和Nivolumab Fab（洋红色和粉色；PDB ID: 5GGR）与PD1配体1 (PDL1)（白色）在PD1（青绿色）上的结合位点重叠，阻止了PD1-PDL1相互作用。所有蛋白质分子都显示了表面表示。d, PD1-PDL2（PDB ID: 6UMT）和PDL1抗体Atezolizumab（PDB ID: 5XXY）结构的对齐。结构分析表明，PDL2的残基Trp100适合PD1内部的口袋并有助于PD1-PDL2结合。PDL2中同样的残基（Trp100）扰乱了Atezolizumab与PDL2的结合。e, Ipilimumab（PDB ID: 5TRU）和Tremelimumab（PDB ID: 5GGV）Fab域与细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4 (CTLA4)的复合物结构显示出具有大的埋藏表面积的类似结合表位，有效地竞争天然配体CD80和CD86的结合。f, p53(R175H)多肽-主要组织相容性复合物 (MHC) 结合抗体平行于MHC分子内部的肽结合槽结合（PDB ID: 6W51）。相比之下，p53(R175H)特异性T细胞受体 (TCR) 垂直于肽结合槽结合（PDB ID: 6VQO）。 PD1阻断抗体是目前使用最广泛的免疫检查点抑制剂。七种获批的PD1阻断抗体（nivolumab、pembrolizumab、cemiplimab、dostarlimab、retifanlimab、tislelizumab和toripalimab）和两种目前正在临床试验中的抗体（见表1）使用IgG4格式，该格式不能有效地激活补体级联反应，并且与IgG1亚型相比具有较弱的Fc受体结合。因此，IgG4格式可能保护表达PD1的效应T细胞不被意外地通过ADCC或CDC杀死。针对LAG3的抗体relatlimab也使用类似的IgG4格式。所有IgG4抗体都带有S228P突变以防止Fab臂交换（见表1）。在获批的PD1抗体中，只有pembrolizumab的全长结构已被确定。该结构揭示了Fc域内CH2域旋转，完全暴露了糖蛋白。与其他报道的Fc域结构相比，这种CH2域构象是这些IgG亚类的分子灵活性的新描述，并且可以进一步研究以了解这种构象如何有助于较弱的Fc受体结合。相比之下，PDL1和CTLA4阻断抗体使用IgG1格式。尽管atezolizumab和durvalumab使用修饰过的Fc域限制了FcR介导的效应功能，avelumab和ipilimumab使用未修饰的Fc域保留了CDC和ADCC活性。尽管在临床试验中没有PD1和PDL1阻断抗体的直接比较以确定它们的效力，但对PD1途径阻断抗体的临床试验的荟萃分析得出结论，PD1抗体比PDL1抗体略为有效，可能是因为PD1抗体阻断了PD1与PDL1和PDL2的相互作用。值得注意的是，使用具有功能性Fc区域的IgG1格式的avelumab在肺癌、卵巢癌、胃癌和头颈癌患者中未能表现出益处，尽管其他免疫检查点抑制剂在这些相同癌症类型的患者中表现出成功。因此，使用IgG1格式及其介导效应T细胞杀伤的潜力可能导致其次优的试验结果。 已经确定了本文描述的几种免疫检查点抑制剂抗体与其目标蛋白复合物的结构基础。这些结构揭示了表位界面的多样性、复合物的埋藏表面积以及抗体结合后目标蛋白的构象变化。两种PD1阻断抗体，pembrolizumab（PDB ID：5GGS）和nivolumab（PDB ID：5GGR），尽管每种抗体与PDL1配体结合位点广泛重叠，但它们在不同的表位结合PD1（见图3c）。PDL1靶向抗体（atezolizumab、durvalumab、avelumab）与PDL1和PDL2复合物的晶体结构鉴定了一个关键残基PDL2（Trp100），它阻碍了抗PDL1抗体与PDL2的结合，并提供了PDL1和PDL2之间选择性的机制[92,95,96]（PDB ID：5XXY）（见图3d）。PDL1中相应的残基是丙氨酸，允许PDL1与atezolizumab结合。与PD1结合抗体相比，两种CTLA4靶向抗体，ipilimumab（PDB ID：5XJ3）和tremelimumab（PDB ID：5GGV），共享类似的结合表位，有效地与天然配体CD80和CD86竞争（见图3e）。与CD86相比，抗体与CTLA4复合物更大的埋藏表面积（约600 Ų）有助于这种作用机制。 2.5.5 免疫检查点抑制剂的毒性 免疫检查点阻断抗体通过普遍的免疫激活介导癌细胞的死亡，但有时这种激活可能会错误地针对健康组织。免疫检查点抑制抗体具有非常明显的不良反应谱，被称为免疫相关不良事件（irAEs）。这些irAEs包括各种表现，如皮肤、胃肠道、肝脏、内分泌、肺和心脏事件。尽管不常见，但严重的甚至可能致命的毒性偶尔可能会由于免疫检查点抑制而产生。在许多情况下，需要暂时使用糖皮质激素、肿瘤坏死因子（TNF）拮抗剂、麦考酚酸莫非尔或其他免疫调节剂进行免疫抑制以管理irAEs。 2.6 双特异性抗体格式 第二种格式包括多样化的双特异性抗体类别。与单特异性抗体不同，双特异性抗体结合两种不同的抗原或表位。这些抗原可以位于相同的目标细胞上，也可以位于不同的细胞上。针对两种不同细胞的双特异性抗体主要是T细胞激活剂，将癌细胞与效应T细胞交联；因此，它们被称为T细胞激活剂（TCE）双特异性抗体。在交联后，效应T细胞被激活，通过释放细胞毒性颗粒和淋巴因子来杀死结合的目标癌细胞（见图2）。另一类双特异性抗体作用于同一目标细胞表达的不同抗原，如两种不同的生长因子受体。这样的双特异性抗体通过阻断目标生长因子受体的增殖信号，并通过激活NK细胞和巨噬细胞对抗癌细胞来杀死目标细胞。 2.6.1 双特异性T细胞激活剂 2014年Blinatumomab的监管批准导致这种基于抗体治疗的类别爆炸性增长。原型TCE双特异性Blinatumomab是一种小型54-kDa融合蛋白，大约是IgG抗体的三分之一大小（见表2）。Blinatumomab由双特异性抗体所需的最小元素组成；一个针对癌症的scFv（抗CD19）通过甘氨酸-丝氨酸肽连接与一个T细胞结合scFv（抗CD3）连接。Blinatumomab通过抗CD19 scFv结合B细胞，并同时通过抗CD3 scFv连接并激活T细胞，导致B细胞死亡（见图2）。Blinatumomab在一系列B细胞恶性肿瘤中显示出活性（见图4c,d），并获得批准用于治疗B细胞前体急性淋巴细胞性白血病（B-ALL）。随后获得监管批准的TCE双特异性抗体采用了Blinatumomab的基本设计（见图5a）。 图4 | 使用免疫检查点抑制剂或双特异性抗体重新激活或重新定向T细胞对癌细胞的治疗效果。a,b, 来自一位患有头颈鳞状细胞癌（HNSCC）并涉及左侧舌边缘的个体的氟脱氧葡萄糖（FDG）-正电子发射断层扫描（PET）图像（a）和用苏木精和伊红（H&E）染色的肿瘤切片（b）。该患者接受了免疫检查点抑制剂nivolumab和ipilimumab的治疗，并经历了肿瘤负担的大幅减少。治疗中的H&E切片显示角蛋白碎片（KD）和周围的多核巨细胞（箭头）以及治疗中的FDG-PET图像显示舌边缘FDG摄取的减少。c, 一位患有B细胞淋巴瘤的患者的CT扫描，在治疗前和接受靶向CD19的双特异性抗体T细胞激活剂blinatumomab治疗4周后。该患者对blinatumomab有部分反应。箭头指向纵隔中受累的淋巴结肿瘤。d, 另一位患有B细胞淋巴瘤的患者的骨髓活检样本，在治疗前和接受blinatumomab治疗15天后。肿瘤细胞以蓝色显示（苏木精染色），T细胞以棕色显示（CD3染色）。部分a和b改编自，Springer Nature。部分c和d经，AAAS许可转载。 制药公司经常为使用不同架构和组装双特异性抗体的方法的独特TCE格式注册商标。常见的格式包括双特异性T细胞激活剂（BiTE）（Amgen）、Duobody（Genmab）、DART（MacroGenics）和Xmab（Xencor），Blinatumomab使用BiTE格式。Tebentafusp是一种独特的TCE双特异性格式，名为ImmTAC，它将针对黑色素瘤细胞中表达的糖蛋白-100（gp100）-人类白细胞抗原（HLA）-A02复合物的亲和增强型TCR与抗CD3 scFv连接。Tebentafusp在转移性葡萄膜黑色素瘤患者中显示出优越的总生存率，导致其在2022年获得批准。在过去的2年中，有六种针对血液恶性肿瘤的新型双特异性抗体获得了监管批准。这些包括teclistamab和elranatamab（BCMAxCD3），以及talquetamab（G蛋白偶联受体家族C组5成员D（GPRC5D）xCD3）用于多发性骨髓瘤，以及mosunetuzumab、epcoritamab和glofitamab（CD20xCD3）用于B细胞淋巴瘤（见表2）。然而，TCE双特异性抗体在实体瘤中的批准落后。然而，针对实体恶性肿瘤的TCE双特异性抗体的临床试验激增，让人们看到了这一策略将增加其效用的广度的希望。最近有关针对小细胞肺癌中delta样蛋白3（DLL3）的TCE双特异性抗体的I期试验的积极报告令人鼓舞，并表明实体瘤障碍将被突破。 2.6.2 双特异性抗体靶向同一细胞上的不同抗原 双特异性抗体也被设计为结合目标癌细胞上的两种不同的抗原或表位，而无需与效应T细胞结合。它们的抗癌效果是通过阻断两条增殖信号通路来介导的，从而最大化了抗肿瘤活性。除了它们的受体阻断活性外，这些双特异性抗体还可能被设计为包含一个功能性的IgG1 Fc域，使它们能够通过非T细胞的免疫效应途径如ADCC、ADCP和CDC杀死癌细胞。Amivantamab是首个靶向癌细胞表达的EGFR和MET（表2）的受体阻断双特异性抗体，并获得监管批准用于治疗带有外显子20插入突变的非小细胞肺癌。Amivantamab阻断了EGFR和MET通路的信号传导，这些通路驱动了一部分肺癌，比单一受体结合抗体的组合更有效。此外，Amivantamab的IgG1 Fc域被设计为低岩藻糖水平，这增强了FcγRIIIa的结合和NK细胞介导的ADCC。Zanidatamab采用了类似的双特异性设计，它用每个Fab臂结合两种不同的HER2表位（表2）。这些臂针对HER2的第二个和第四个亚域，分别是已批准用于治疗HER2阳性乳腺癌的HER2靶向抗体帕妥珠单抗和曲妥珠单抗的结合位点。临床前研究表明，与曲妥珠单抗、帕妥珠单抗或曲妥珠单抗和帕妥珠单抗的组合相比，Zanidatamab增强了HER2聚集、受体下调，并增加了CDC介导的HER2阳性癌细胞的杀伤。在I期临床试验中，Zanidatamab对一系列HER2阳性实体瘤显示出令人鼓舞的活性。 ADCC，抗体依赖性细胞介导的细胞毒性；ALL，急性淋巴细胞性白血病；CRS，细胞因子释放综合征；Ig，免疫球蛋白；irAEs，免疫相关不良事件；IV，静脉注射；kDa，千道尔顿；scFv，单链可变片段；TLS，肿瘤溶解综合征。带有Fc的双特异性抗体还带有Fc突变，这些突变使得异源重链能够配对（未显示）。 2.6.3 双特异性抗体Fc工程 Blinatumomab的血清半衰期很短，大约为2小时，因为这种小多肽可以快速被肾脏清除，并且缺乏FcRn介导的循环所需的Fc域。由于其半衰期短，Blinatumomab通过连续静脉输注给药，以维持一致的血清浓度。连续输注装置需要额外的医疗资源，增加成本，并且与间歇输注相比，对患者来说不够方便。在Blinatumomab之后获得监管批准的双特异性抗体具有更高的分子量，大多数包含一个延长半衰期的Fc域（见表2）。具体来说，Tebentafusp的分子量约为75kDa，高于肾脏滤过的截止值，因此不会被肾脏快速清除。然而，Tebentafusp缺乏Fc域，因此具有相对较短的半衰期为7.5小时。Mosunetuzumab、Teclistamab、Epcoritamab、Glofitamab和Elranatamab包含IgG1、IgG2或IgG4 Fc域（见表2），这增加了它们的分子量超过Tebentafusp（约145kDa），并使FcRn能够结合。这些修改延长了血清半衰期，并允许间歇（每周）剂量。添加这样的Fc域倾向于被包括在所有即将到来的双特异性抗体设计中。由于IgG1 Fc片段对巨噬细胞和NK细胞上的Fcγ受体有很强的亲和力，带有IgG1 Fc片段的TCE双特异性抗体可能通过抗CD3 scFv与巨噬细胞或NK细胞（通过IgG1 Fc片段）交联，导致巨噬细胞或NK细胞无意中杀死T细胞，反之亦然。已经在Fc域引入了氨基酸替代（例如，在Mosunetuzumab中的N297G或在Glofitamab中的P329G、L234A和L235A）以消除FcγR结合并减少无意中的免疫细胞杀伤（见表2）。使用IgG2或IgG4 Fc域的TCE双特异性抗体可能不需要这样的Fc域沉默，因为它们与FcγRs的相互作用较弱。 2.6.4 双特异性抗体的毒性 TCE双特异性抗体由于使用相同的抗癌机制——通过T细胞激活来杀死目标细胞（表2），因此具有类似的不良反应。毒性水平与携带TCE双特异性抗体靶标的细胞（肿瘤或正常细胞）的总身体负担有关。TCE双特异性抗体可诱导全身性炎症，特征为发热、不同程度的缺氧、低血压，偶尔多器官衰竭，统称为细胞因子释放综合征（CRS）。神经毒性是与TCE双特异性抗体相关的另一种独特的不良反应，表现为意识混乱和震颤，以及言语和行为的改变。CRS和神经毒性的病理生理学尚不完全清楚，可能与干扰素γ（IFNγ）、白细胞介素-6（IL-6）、IL-1和IL-10等细胞因子水平升高有关。接受TCE双特异性抗体治疗的患者需要密切监测，可能需要使用糖皮质激素或抗细胞因子药物如IL-6中和抗体tocilizumab进行免疫抑制。此外，为预防或减少CRS和神经毒性，已实施了几种策略，包括逐渐增加TCE双特异性抗体剂量、预防性糖皮质激素，以及在开始TCE双特异性抗体治疗前使用化疗减少肿瘤负担。受体阻断双特异性抗体无法激活T细胞，因此不会引起TCE双特异性抗体通常观察到的CRS或神经毒性。受体阻断双特异性抗体的不良反应与它们的单特异性抗体类似，如amivantamab引起的皮疹（也见于靶向EGFR的抗体cetuximab和panitumumab）和zanidatamab引起的心力衰竭（也见于靶向HER2的抗体trastuzumab）（表2）。 图5 | 双特异性抗体和偶联抗体的发展时间线。a, 双特异性抗体的时间线。b, 药物偶联、免疫毒素偶联和放射性同位素偶联抗体的时间线。a Catumaxomab，一种上皮细胞黏附分子(EpCAM)xCD3双特异性抗体，于2009年获得欧洲药品管理局(EMA)批准用于治疗恶性腹水，但后来因商业原因被制造商撤回。ADC, 抗体-药物偶联物；ALL, 急性淋巴细胞性白血病；B-ALL, B细胞前体急性淋巴细胞性白血病；BCMA, B细胞成熟抗原；AML, 急性髓系白血病；CEA, 癌胚抗原；EGFR, 表皮生长因子受体；FDA, 美国食品药品监督管理局；gp100, 糖蛋白100；HCL, 毛细胞白血病；MRD, 最小残留病；NHL, 非霍奇金淋巴瘤；NSCLC, 非小细胞肺癌；OS, 总生存期；PFS, 无进展生存期；TCR, T细胞受体。 2.7 偶联抗体格式 第三种主要格式涉及与有毒载荷连接的抗体，如细胞毒素（抗体-药物偶联物（ADCs））、细菌或植物毒素（免疫毒素）或放射性同位素，这增强了抗体杀死癌细胞的能力。在这一组中，ADCs迄今为止是最广泛使用的形式，而毒素偶联和放射性同位素偶联抗体尚未得到广泛采用（见图5b）。 2.7.1 抗体-药物偶联物 ADCs是通过将肿瘤靶向抗体与细胞毒素连接而构建的（见图2）。ADC分子与细胞表面抗原的结合导致它们的内化，随后在细胞内释放细胞毒素。这允许选择性地将细胞毒素输送到癌细胞，同时保留大部分健康组织。ADC的关键组成部分包括肿瘤靶向抗体、细胞毒素和连接抗体与细胞毒素的连接子（表3）。ADC的成功取决于这些关键组成部分的最佳选择，以及用于将连接子连接到抗体的偶联方法，这通常决定了药物-抗体比率（DAR）。 大多数ADC使用人源化或人类IgG1作为肿瘤靶向抗体（除了brentuximab使用嵌合IgG1，以及gemtuzumab和inotuzumab使用人源化IgG4）。如上所述，使用IgG1的普及是由于其长的血浆半衰期约为21天（例如，与IgG3的半衰期为7天相比），以及其能够结合Fc受体，通过ADCC和ADCP增强靶细胞的杀伤（例如，与在ADCC和ADCP中效率较低的IgG2和IgG4相比）。两种ADC，gemtuzumab和inotuzumab，使用IgG4，其对FcγRII和FcγRIII的亲和力较低，从而限制了ADCP，同时可能由于减少了ADC通过Fc受体进入免疫细胞的非特异性吸收，而减少了毒性。 大多数连接子将细胞毒素连接到IgG1抗体主链上的随机赖氨酸或半胱氨酸残基上。一个有效的连接子在血液中最小化细胞毒素的早期释放，同时促进在首选目标位置的活性药物的控制释放。连接子通常被分类为可裂解和不可裂解。十二种获批的ADC中有十种使用可裂解连接子，如肽连接子、腙连接子、二硫键连接子或CL2A连接子（表3）。最早开发的用于药物附着的连接子之一是使用腙键的可裂解连接子。这种连接子用于将抗肿瘤抗生素calicheamicin连接到gemtuzumab和inotuzumab ADCs。腙键设计为在靶细胞溶酶体内部的酸性条件下分解，以释放calicheamicin。然而，腙键可能在血浆中发生水解，导致药物分子的非预期释放，从而引起系统毒性。第二种可裂解连接子是肽连接子，需要在溶酶体内部通过cathepsin B选择性裂解。四种ADC使用mc-VC-PABC二肽连接子，由Seagen首次开发用于生成使用CD30靶向抗体连接到微管抑制剂单甲基auristatin E (MMAE)的ADC brentuximab（表3）。Brentuximab与化疗结合在几种不同类型的淋巴瘤患者中显示出显著的疗效，并被认为是霍奇金淋巴瘤和CD30+外周T细胞淋巴瘤的一线治疗标准。Brentuximab的成功导致了mc-VC-PABC二肽连接子的广泛采用。Seagen与Roche、Astellas和Genmab合作，分别使用mc-VC-PABC二肽连接子开发了靶向CD79B、nectin-4和TF的ADC。第三种可裂解连接子是二硫键连接子，其中连接子裂解是通过细胞内部高浓度的谷胱甘肽介导的。带有二硫键连接子的ADC包括mirvetuximab，在卵巢癌患者的III期临床试验中显示了生存益处。与可裂解连接子相比，不可裂解连接子对各种分解机制都有抵抗力。有效载荷在靶细胞的溶酶体内降解抗体后释放。两种ADC，trastuzumab emtansine和belantamab mafodotin使用不可裂解连接子进行药物附着。临床前研究表明，由于不可裂解连接子的血浆稳定性增加，对非靶细胞的毒性较低。然而，可裂解和不可裂解连接子尚未在临床试验中直接比较，一个比另一个的优势仍然不清楚。 肿瘤细胞杀伤过程由附着在肿瘤靶向抗体上的细胞毒素执行。药物通常是一种具有高细胞杀伤效力的小分子（半数最大抑制浓度（IC50）≤5纳摩尔），通过三种机制之一诱导细胞死亡——直接DNA损伤、破坏微管网络或抑制拓扑异构酶活性（表3）。目前使用的药物IC50差异很大，从5纳摩尔（Dxd，一种拓扑异构酶抑制剂）到5皮摩尔（pyrrolobenzodiazepines (PBDs)，一类DNA损伤剂）。然而，ADC的效力取决于药物的IC50和DAR。因此，带有强效PBD载荷和相对较低DAR约2.3的loncastuximab tesirine，以及带有效力较低的载荷Dxd但相对较高DAR约8.0的trastuzumab deruxtecan，都能在几种体内模型中诱导完全的肿瘤回归。在临床试验中也观察到了带有高DAR的ADC结合新型连接子设计的益处。Trastuzumab emtansine和trastuzumab deruxtecan共享相同的HER2靶向抗体。然而，尽管trastuzumab emtansine携带微管抑制剂DM1（IC50为2纳摩尔，DAR 3.5）通过不可裂解连接子结合，trastuzumab deruxtecan使用药物Dxd（IC50为5纳摩尔，DAR 8.0）与可裂解连接子结合。在比较两种ADC的III期临床试验中，trastuzumab deruxtecan显示出更高的反应率（79.7%对34.2%）和总生存率（94.1%对85.9%，在12个月时）。此外，trastuzumab deruxtecan延长了表达低水平HER2的乳腺癌患者的生存期，使其成为第一种在HER2低表达乳腺癌中有效的ADC。最近，fam-trastuzumab deruxtecan在一系列高HER2表达的实体瘤中显示了肿瘤回归，并获得了FDA对肿瘤不可知论HER2导向治疗的首次批准。 2.7.2 ADCs 的毒性 ADCs被认为是靶向药物，比传统的细胞毒素化疗药物有更好的耐受性。然而，大多数患者在使用ADCs时会经历某种形式的毒性。大多数ADCs共有的毒性包括输液反应、细胞减少症、感染、肝酶升高、胃肠道症状（腹泻、呕吐和便秘）和胚胎-胎儿毒性（表3）。 DM1和DM4是美登素1的衍生物。DXd是Exatecan的衍生物，用于ADC。SN38是伊立替康的活性代谢产物。ADC，抗体-药物偶联物；ALL，急性淋巴细胞性白血病；AML，急性髓系白血病；BCMA，B细胞成熟抗原；DAR，药物-抗体比率；FRα，叶酸受体α；GSK，葛兰素史克；HER2，人表皮生长因子受体2；mc，马来酰亚胺己酰；mc-VC-PABC，马来酰亚胺己酰-缬氨酸-对氨基苄氧羰基；MMAE，单甲基奥瑞他汀E；MMAF，单甲基奥瑞他汀F；PBD，吡咯并苯并二氮杂环；PTCL，外周T细胞淋巴瘤；SMCC，琥珀酰亚胺-4-(N-马来酰亚甲基)环己烷-1-羧酸酯；TF，组织因子；TNBC，三阴性乳腺癌。 a 2023年，FDA撤销了belantamab mafodotin的生物制品许可，EMA建议不更新其市场授权，因为确证性DREAMM-3试验未能证明无进展生存期的改善。正在进行的试验表明，belantamab可能会重新获得批准。b Trastuzumab deruxtecan获得FDA批准用于HER2低表达乳腺癌（免疫组织化学评分1+）和所有高HER2表达的实体瘤（免疫组织化学评分3+）。 某些毒性与使用特定有效载荷有关，例如与微管抑制剂（MMAE、DM1、DM4）相关的周围神经病变和与calicheamicin相关的肝毒性。其他毒性是针对共同抗原的ADCs共有的。例如，靶向HER2的ADCs可能导致心力衰竭和介导间质性肺病。 2.7.3 免疫毒素偶联物或免疫毒素 免疫毒素有两个组成部分，一个靶向抗体或抗体的Fv片段，以及通常来自细菌或植物毒素的细胞毒素。靶向抗体或Fv片段结合到目标细胞，允许选择性地输送毒素。毒素来自细菌，如假单胞菌外毒素A（PE）和白喉毒素（DT），或来自植物，如蓖麻毒素。从理论上讲，任何用于生成ADC的靶向抗体都可以用于免疫毒素。然而，尽管在过去几年中有12种ADC获得批准，只有一种免疫毒素，moxetumomab pasudotox，获得了FDA和EMA的批准，用于治疗毛细胞白血病（图2和5b）。Moxetumomab是一种融合蛋白，结合了CD22结合Fv与截断的假单胞菌外毒素A（PE38），由国家癌症研究所（NCI）的I. Pastan开发。当进入目标细胞时，PE38毒素与延伸因子2（EF2）结合并阻断蛋白质合成。Moxetumomab在毛细胞白血病患者的临床试验中展示了41%的高完全反应率，并在2018年获得监管批准。然而，由于临床采用率低，moxetumomab的生产在2023年停止。Moxetuzumab和其他研究性免疫毒素面临了几个挑战，包括高免疫原性导致治疗效力丧失和狭窄的治疗窗口导致毒性，如毛细血管渗漏综合征（CLS）和溶血性尿毒症综合征（HUS）。Moxetumomab的低采用率也可能是由于其复杂的管理过程，包括毒性预防、预处理和后处理水化、需要安全监测以避免不良反应以及在毛细胞白血病中有替代疗法的可用性。尽管过去几年的几项临床试验已经评估了靶向BCMA、间皮素和其他与癌症相关的抗原的免疫毒素的疗效，但目前没有一种正在进行监管审查，也没有预计将在不久的将来获得批准。 2.7.4 抗体-放射性同位素偶联物 抗体-放射性同位素偶联物由一个靶向抗体与一个放射性同位素链接而成。放射性同位素发射α粒子或β粒子，导致目标细胞DNA链断裂，从而导致细胞死亡。抗体-放射性同位素偶联物不需要内化就能诱导细胞死亡，这提供了与ADCs和免疫毒素相比的独特优势，包括旁观者效应。α粒子是大型带正电荷的粒子，由两个质子和两个中子组成，具有相对短的有效范围约为50-100微米。相比之下，β粒子是小型带负电荷的电子（比α粒子小约8000倍），具有较长的有效范围约为0.5-10毫米，但具有较少的DNA损伤能量。β粒子发射体的例子包括碘-131、镥-177和钇-90。两种获得FDA批准和/或EMA批准的抗体-放射性同位素偶联物，90Y-ibritumomab和131I-tositumomab，将β粒子发射放射性核素连接到靶向CD20的抗体上（图2和5b），用于治疗B细胞淋巴瘤。90Y-ibritumomab和131I-tositumomab在临床试验中展示了65-80%的总反应率和20-30%的完全反应率。两项研究都观察到了一些可预测的治疗相关不良效果，包括由于健康骨髓暴露于辐射而导致的长期严重细胞减少症，131I-tositumomab的放射性碘引起的甲状腺功能减退症，以及继发性恶性肿瘤，如骨髓增生异常综合征（MDS）和白血病。尽管有高反应率，这些药物并未得到广泛的临床使用，2012年只有75名患者接受了131I-tositumomab治疗。因此，131I-tositumomab在2013年自愿撤回。90Y-ibritumomab仍然适用于复发或难治性低级别B细胞淋巴瘤患者，但报告表明只有少数患者正在接受这种治疗。批准数量有限和临床采用率低可能是因为需要一个多学科团队，包括医学肿瘤学家、放射肿瘤学家、药理学家和物理学家，来开发并在临床上部署这些分子。很少有中心具备这样的能力，因此，抗体-放射性同位素偶联物的使用落后于ADCs。 3. 挑战与未来展望 肿瘤药物开发是一个艰难的过程，成功率为3-7%。目前尚缺乏针对肿瘤学中抗体基础治疗的成功率数据，但大约18%进入I期临床试验的治疗性抗体（包括肿瘤学在内的所有适应症）会继续进行药物上市146。这些低数字反映了药物开发过程中遇到的众多障碍。治疗性抗体的开发是一个资源密集型的多步骤操作。它需要针对目标抗原生成一定数量的抗体，然后选择几个具有理想结合和生物物理特性的领先候选物。然后，领先的抗体会在体内使用小鼠模型进行有效性测试，使用非人灵长类动物进行毒性和药代动力学测试，随后进行人体首次临床试验。尽管在小鼠模型中显示出有希望的有效性，但多种抗体由于在非人灵长类动物或人体首次临床试验中的毒性而未能通过临床开发。尽管存在这些障碍，但以下描述的几种抗体显示出令人鼓舞的临床前和临床数据，可能会在未来几年改变患者护理。 3.1 新靶点  实体瘤构成了新癌症患者的大多数。与实体瘤相关的患者中有相当一部分以转移性疾病出现，需要系统性治疗，这种治疗很少是治愈性的。因此，转移性肺、结肠、胰腺、乳腺、前列腺、肝脏和胆管癌共同导致了大多数癌症死亡（见图6）。然而，与血液恶性肿瘤相比，实体瘤的抗体开发滞后主要是因为缺乏可靶向的抗原。不同的淋巴瘤亚型约占所有癌症死亡的3%，并且有五种肿瘤抗原（CD19、CD20、CD79b、CD30、CCR4和PD1）被治疗性抗体靶向。相比之下，约占癌症死亡21%的肺癌只有一个可靶向的肿瘤抗原（EGFR-MET）。此外，约占癌症死亡8%的胰腺癌、6%的前列腺癌和3%的脑癌完全没有FDA批准和/或EMA批准的治疗性抗体。这种差异很大程度上是因为淋巴瘤和骨髓瘤起源于正常的B细胞，这些细胞表达明显的可靶向抗原（见图6）。此外，正常的B细胞可以在不产生不可忍受的后果的情况下被根除。不幸的是，在实体瘤中，目标抗原的发现很少带来线索。因此，新的靶点鉴定可能需要涉及对大量患者样本进行单细胞测序，以寻找在癌症和正常组织中差异表达的抗原。 图6 | 常见实体瘤和血液瘤的抗体靶点。这些图表显示了美国前15位癌症类型的死亡百分比与批准的抗体及晚期临床试验中的抗体所靶向的独特抗原数量。抗原靶点在每种癌症组织旁边展示。注意，非小细胞和 小细胞肺癌被归类在“肺”下；霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病（CLL）和中枢神经系统（CNS）淋巴瘤被归类在“淋巴瘤”下；急性髓系白血病（AML）、急性淋巴细胞白血病（ALL）、慢性髓系白血病（CML）和其他白血病被归类在“白血病”下。不论组织类型，微卫星高度不稳定（MSI-H）癌症都有资格接受免疫检查点抑制剂治疗，HER2阳性实体瘤有资格接受HER2导向治疗的trastuzumab deruxtecan，并未包括在分析中。镥Lu177 vipivotide tetraxetan用于前列腺癌的治疗没有被包括在内，因为靶向部分不是抗体。癌症死亡百分比和批准的靶点数量的数据分别来自 https://www.cancer.org/research/cancer-facts-statistics/all-cancer-facts-figures/2023-cancer-facts-figures.html 和抗体协会。a 程序性细胞死亡蛋白1（PD1）治疗仅在霍奇金淋巴瘤中获批。b B7-H3被认为是肿瘤相关抗原，可能是免疫检查点抗原。 此外，最近针对claudins、HER3、成纤维细胞生长因子受体2B (FGFR2B)、DLL3、结缔组织生长因子（CTGF，亦称CCN2）和前列腺六跨膜上皮抗原1 (STEAP1)的临床试验显示出令人鼓舞的结果。目前正在II/III期临床试验中的抗体靶点列在图6和补充表2中。最后，一种创新的方法来绕过缺乏肿瘤特异性抗原是通过多种抗原的组合靶向。大多数癌症缺乏在健康组织中不存在的真正特异性抗原的表达。因此，靶向只在肿瘤中共同表达而不在健康组织中表达的抗原组合，可能提供一条可行的治疗途径。利用布尔逻辑AND门的临床前研究，需要两个或三个目标激活细胞毒性机制，已经展示了肿瘤回归，但它们尚未在临床试验中得到测试。 一些细胞表面蛋白聚糖，如软骨素和肝素，是癌症和其他人类疾病中信号通路的重要调节因子。软骨素蛋白聚糖已被证明促进肿瘤血管化，并调节与肿瘤生长相关的信号传导途径，它们在多种癌症类型中表达。糖磷脂酰肌醇 (GPI) 锚定的细胞表面HSPGs，如glypicans，在癌症中过度表达，表明它们是潜在的肿瘤相关抗原。已经开发了针对GPC1、GPC2和GPC3的抗体和CAR T细胞，分别用于治疗胰腺癌、神经母细胞瘤和肝癌。 3.1.1 肿瘤特异性抗原 大多数目前批准的基于抗体的治疗针对肿瘤相关抗原或组织特异性抗原。肿瘤相关抗原，如HER2，在癌细胞中过度表达，但也由正常组织的一个亚群表达，尽管表达水平较低。癌症和正常组织之间表达水平的差异提供了治疗窗口。组织特异性抗原，如CD20，在癌细胞（B细胞淋巴瘤）和正常细胞（B细胞）中表达水平相似。针对这类组织特异性抗原的治疗旨在同时消除正常细胞和癌细胞，因为正常B细胞的耗尽可能在临床上是可以接受的。针对B细胞谱系癌症的CD19、CD20、CD38和BCMA的治疗代表了组织特异性治疗性抗体最成功的例子。对于起源于较少可有可无的组织如T细胞的癌症，针对TCR β链恒定区 (TRBC) 和TCR β链可变区 (TRBV) 的抗体已经开发出来，以靶向所有克隆性癌细胞，但只针对正常T细胞的一部分，从而保留足够的正常组织以执行其功能。一些新兴的抗体靶点包括肿瘤特异性抗原，这些抗原仅由癌细胞表达，不由正常细胞表达。肿瘤特异性抗原的主要例子是新抗原，它们是由MHC分子呈递的突变肽。这些突变肽是携带来自癌症细胞标志性突变（点突变、小插入/删除、移码突变、融合和剪接变体）的蛋白质的氨基酸变化的短蛋白质水解产物。来自诸如BRAF、RAS、PIK3CA、TP53和异柠檬酸脱氢酶（IDH）等突变癌症驱动基因的公共新抗原，为癌细胞提供了极其独特的靶点，可以用来造福患者。这些公共新抗原目前正在被双特异性抗体靶向，并且在针对携带TP53和RAS突变的癌症的临床前研究中显示出令人鼓舞的活性。已经有多方面的努力描述了抗体识别新抗原的结构基础。p53(R175H)突变肽-MHC与p53(R175H)特异性TCRs和抗体复合物的晶体结构已经确定。TCRs共享一个明显的“规范”垂直结合取向至肽-MHC分子，偏向突变位点。相比之下，p53(R175H)新抗原特异性抗体使用一种非规范的并行结合模型沿肽的长度（见图3f）。此外，抗体对p53(R175H)新抗原的亲和力比相应的TCR高约100倍。不同的结合模式可能有助于抗体的特异性和高亲和力。 3.1.2 细胞内抗原 抗体无法穿透细胞膜，因此只能靶向细胞表面抗原。细胞内抗原可以与MHC分子相关联地呈现在细胞表面，使它们成为可靶向的。以这种方式，tebentafusp靶向细胞内抗原gp100，该抗原在黑色素瘤中过度表达，并与HLA-A*02:01相关联呈现在细胞表面。目前正在开发抗体以靶向诸如人类端粒酶逆转录酶（hTERT）、MUC1、NY-ESO1、TCR γ替代阅读框蛋白（TARP）、p53、WT1和黑色素瘤优先表达抗原（PRAME）等癌细胞特异性过度表达的细胞内蛋白，其中针对PRAME的靶向在临床试验中显示出令人鼓舞的初步结果。 3.1.3 肿瘤微环境中的抗原 癌症发展于一个复杂的免疫细胞、成纤维细胞和细胞外基质的混合物中，这被称为肿瘤微环境。早期基于抗体的针对癌症相关成纤维细胞或细胞外基质的靶向尝试未能产生临床效益。目前的研究表明，肿瘤微环境中的免疫细胞如肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）、树突细胞和骨髓源抑制细胞（MDSCs）是众所周知的驱动对免疫检查点抑制剂的抗性的因素。因此，耗尽或阻断这些免疫抑制细胞的功能可能使肿瘤对免疫检查点抑制剂敏感。早期阶段的临床试验已经证明了通过靶向巨噬细胞集落刺激因子1受体（CSF1R）、髓细胞表达触发受体1（TREM1）和TREM2的抗体介导的TAMs抑制的安全性和可行性。临床前研究也表明，使用激动性CD40单克隆抗体增强肿瘤微环境中树突细胞的功能可以增强T细胞介导的肿瘤回归。针对胰腺癌患者的CD40抗体的临床试验患者耐受性良好，并已显示出增强的T细胞激活和渗透到肿瘤中。T细胞免疫球蛋白结构域和黏蛋白结构域3（TIM3）受体由一系列免疫细胞如淋巴细胞、树突细胞、单核细胞和巨噬细胞表达，TIM-3拮抗性抗体同样可以通过调节肿瘤微环境促进肿瘤杀伤。TIM-3拮抗性抗体与目前批准的免疫检查点抑制剂联合在实体瘤患者中展示了可控的安全概况。所有这些抗体抵消肿瘤微环境中的免疫抑制状态，目前正在进行II/III期试验，将确定它们的最终效用。 3.2 针对低密度抗原 目前批准的ADCs和双特异性抗体靶向相对丰富的抗原，如CD19、CD20和BCMA，每个癌细胞上有大约1,000到50,000份拷贝。针对新抗原的主要挑战来自于它们在癌细胞表面的低丰度，有些细胞表达的靶标抗原只有1-10份拷贝。除了新抗原，有效的靶向肿瘤相关或组织特异性抗原也可能因为它们可变的细胞表面密度而受到影响。此外，治疗压力也可能选择表达靶标抗原低的癌细胞克隆。临床前研究表明，双特异性抗体能够杀死每个细胞表达低至1-10个抗原的癌细胞，而ADCs需要1,000份或以上才能杀死细胞。未修饰的全长抗体可能需要更高目标抗原表达。针对这种低密度抗原仍然是一个挑战，优化的抗体工程使得在临床前研究中有效地靶向个位数水平的新抗原成为可能。 3.3 新型免疫检查点抑制剂 2011年ipilimumab的批准标志着免疫疗法时代的到来。免疫检查点阻断剂具有在一些复发的实体瘤患者中诱导长期缓解的前所未有的能力，这导致了大量临床试验的开展。FDA和EMA已经批准了11种不同的针对CTLA4、PD1和PDL1的抗体，用于20多种癌症类型的65多个不同的适应症。继CTLA4、PD1和PDL1靶向初步成功后，还有许多其他免疫检查点如LAG3、T细胞免疫受体含有免疫球蛋白和ITIM结构域(TIGIT)、V型免疫球蛋白抑制T细胞激活(VISTA)、TIM3、PVRIG、自然杀伤组2A(NKG2A)和OX40等被探索它们在多种癌症类型中诱导缓解的能力。除了针对黑色素瘤的LAG3的relatlimab外，其他都尚未在III期试验中展示所需的治疗活性以获得监管批准。同样，针对CD47的巨噬细胞检查点抑制剂magrolimab在早期试验中显示出令人鼓舞的活性，但在MDS和急性髓系白血病(AML)患者的III期试验中因缺乏效力而停止。目前新型免疫检查点阻断剂的表现低于预期，导致制药行业专注于PD1-PDL1领域，除了现有的九种抗体外，还有五种新的药物正在进行监管审查。尽管PD1-PDL1靶向取得了成功，但只有少数(~20%)的患者对免疫检查点阻断剂有反应，甚至更少的比例(~13%)实现持久缓解。此外，目前的免疫检查点抑制剂与相当大的并发症相关，其中约1%是致命的，约40%是慢性毒性。因此，我们需要超越PD1-PDL1抑制。这将需要改变癌症生物学研究方向和监管机构对抗体药物的批准方法。我们应该优先考虑针对新型免疫检查点调节剂的基础和转化研究，如B和T淋巴细胞衰减剂(BTLA)、B7-H3(亦称CD276)、CD27和4-1BB，而不是重新审视已经广泛探索的PD1-PDL1轴和联合疗法。监管机构可能考虑修订批准流程，使新的PD1-PDL1阻断剂在初步III期试验中展示与竞争产品相当的疗效和毒性概况后，获得所有现有适应症的批准。 3.4 新型抗体格式 3.4.1 IgM抗体 所有全长治疗性抗体使用IgG亚型。临床前研究和早期试验正在探索五聚体IgM格式，与IgG格式中可用的两个结合位点相比，它有十个抗原结合位点。这比针对同一表位的IgG抗体提供了更高的结合亲和力。一个例子是IGM-8444，一种高亲和力的五聚体IgM激动剂抗体，针对死亡受体5 (DR5)，在小鼠模型中展示了肿瘤回归，并已进入I期试验。 3.4.2 新型双特异性格式 TCE双特异性格式不断发展，旨在提高疗效，同时减少不良反应。现在有200多种双特异性抗体正在进行临床开发，大多数使用TCE方法针对实体瘤。Glofitamab(一种CD20xCD3双特异性抗体，用于淋巴瘤)和xaluritamig(亦称AMG 509)(一种STEAP1xCD3双特异性抗体，用于前列腺癌)在临床试验中都显示出疗效，并共享一个独特的2:1 T细胞结合双特异性格式，对目标双价结合，对CD3单价结合。这种格式可能比传统的1:1目标至CD3结合设计提供增加的肿瘤细胞杀伤能力。IgM格式的TCE双特异性抗体由于使用五聚体IgM，有一个更令人印象深刻的10:1目标至CD3结合比率。高目标至CD3结合比率设计允许高亲和力目标结合，可能引发增加的目标细胞毒性，同时减少细胞因子分泌。Imvotamab(亦称IGM-2323)，一种CD20xCD3 IgM双特异性抗体的I期试验，在晚期B细胞恶性肿瘤患者中展示了几个完全反应。 3.4.3 双特异性免疫检查点阻断剂 双特异性格式也被用于同时抑制两个免疫检查点，以增强T细胞激活，超出两种单一免疫检查点阻断剂组合所能实现的。针对PD1xLAG3、PD1xCTLA4和PDL1xCTLA4的双特异性免疫检查点阻断剂在早期临床试验中显示出令人鼓舞的疗效。尽管最初的双特异性免疫检查点阻断剂组专注于抑制临床确立的免疫检查点，临床前研究正在调查是否类似的双特异性免疫检查点阻断剂可以通过靶向新型免疫受体如OX40、TIGIT和C型凝集素结构域家族9成员A (CLEC9A)来诱导抗肿瘤免疫。 3.4.4 三特异性抗体 三特异性抗体具有同时与三种不同抗原相互作用的能力。这一功能使三特异性抗体能够与两种不同的癌症相关抗原，如B细胞恶性肿瘤背景下的CD19和CD20，同时通过第三个结合域结合CD3，与细胞毒性T细胞相互作用。这种创新方法有助于减轻由于单一抗原如CD19或CD20的丢失而引起的治疗抗性，因为癌细胞必须同时下调两种抗原才能逃避杀伤。或者，三特异性抗体被设计为与两种T细胞受体，如CD3和CD28相互作用，从而对癌细胞提供更强的激活信号。 3.4.5 纳米抗体 可能引领抗体工程领域重要范式转变的一个研究领域是单域抗体（也称为纳米抗体）的开发。纳米抗体主要来源于驼类重链抗体，它们体积小、易于生产、稳定，并且能够穿透肿瘤或病毒抗原中的隐蔽位点。纳米抗体通常从驼类衍生的噬菌体展示库中分离出来，最近也从转基因小鼠如RenNano和nanomouse中分离得到。纳米抗体有一个长的CDR3环，可以穿透抗原表面的空腔。首个基于纳米抗体的靶向BCMA的CAR T细胞已获得FDA批准，并与基于抗体的CAR T细胞相比显示出改善的疗效。针对CD19或CD20和HER2的纳米抗体衍生药物目前正在临床试验中，分别用于治疗淋巴瘤和乳腺癌患者。纳米抗体是否会提供比当前基于抗体的药物更好的疗效，还有待观察。 3.4.6 可激活抗体 肿瘤微环境通常表现出较低的pH值，含有活跃的蛋白酶酶，并具有在正常组织中缺乏的特定抗原组合。这些独特的属性被用来利用可激活抗体选择性地靶向癌细胞，这些抗体会根据其环境条件的变化而获得或失去功能。在抗体序列的特定位置添加组氨酸残基，使其能够根据pH值的变化与其目标抗原结合。这一原理被用来生成一种靶向HER2的抗体，与正常组织相比，在实体肿瘤的酸性微环境中与HER2的结合更强。类似的工程导致了在酸性溶酶体内从目标抗原（HER2和CTLA4）增加抗体解离，从而促进抗原再循环和在细胞膜上的呈现，并增强抗肿瘤效果。可激活抗体还使用蛋白酶可切割的掩蔽基团来阻断表位结合位点。在肿瘤微环境中掩蔽基团的切割使抗体-抗原结合和抗肿瘤活性成为可能。具有这种掩蔽机制的抗体通常被称为前体疗法，并且正在被用来改善PDL1、CTLA4、EGFR、CD166和CD71在多种实体瘤和血液瘤中的靶向。 最后，癌细胞经常显示一种独特的抗原组合，可以区分癌细胞和非癌细胞组织。正在设计一系列抗体或类似抗体的肽，以实现针对半相合骨髓移植后产生的CD45+ HLA-A2+癌症，以及EGFR+ HER2+乳腺癌的组合性抗原靶向。 3.5 新型偶联抗体 提高ADCs的效力。目前的研究正集中在改进ADC的组成部分（靶向抗体、连接子和药物载荷），以提高ADC的疗效。临床前研究表明，IgG抗体的大分子量（约150 kDa）可能会降低组织穿透力。因此，使用缺少Fc片段的抗体或用小肿瘤靶向肽替换抗体，可能提高ADC的活性。调节连接子设计和增加药物-抗体比率（DAR）可能增强治疗效益。例如，针对细胞表面糖蛋白TROP2（sacituzumab govitecan）的ADC，由于具有高DAR，是首个提高三阴性乳腺癌患者生存率的ADC。Daiichi Sankyo开发的创新四肽连接子，用于trastuzumab deruxtecan，掩盖了载荷DXd的疏水性，并允许均匀连接大量药物，同时保持有利的药代动力学，并最小化药物过早释放到血浆中。这种连接子-载荷组合现在正被几个即将获批的ADC（datopotamab deruxtecan和patritumab deruxtecan）或正在进行临床试验的ADC（ifinatamab deruxtecan）采用。针对叶酸受体α（FRα）的Rinatabart sesutecan，也使用一种新型可裂解连接子来掩盖更具疏水性的有效载荷，即拓扑异构酶-1抑制剂exatecan，从而允许生成更强效的ADC。正在进行晚期临床试验的ADC列在补充表2中。预计这种连接子-载荷组合可以改善对肺癌和结直肠癌患者的HER2靶向，这些患者对HER2靶向ADC trastuzumab deruxtecan的反应率较低。最后，新的药物载荷，如蛋白质降解剂、RNA聚合酶抑制剂、BCL-xL抑制剂、Toll样受体（TLR）激动剂和干扰素基因刺激因子（STING）激动剂，预计将通过使用新的杀伤机制来改进ADC。连接子和偶联技术的进步有助于推动ADC相对于其他偶联格式（如毒素或放射性同位素偶联物或双特异性TCE格式）在临床上的更多采用。目前正在进行临床试验，测试新型ADCs作为单一药物或与化疗或免疫疗法联合使用，其中一些已经取得了有希望的结果。 3.5.1 免疫毒素偶联物 免疫毒素的一个明显限制是产生针对毒素的免疫反应，这降低了半衰期和效力。目前的工作集中在通过去除被宿主免疫细胞识别的表位来减少假单胞菌外毒素的免疫原性。这样的改良免疫毒素可能会提高效力，并允许免疫毒素靶向多种恶性肿瘤。白介素-毒素偶联物的产生是该领域的另一个发展，它利用癌细胞中白介素受体的过度表达。白介素-毒素偶联物的行为类似于抗体-毒素偶联物。Tagraxofusp是一种针对白介素-3受体亚单位α（IL3RA；亦称为CD123）的细胞毒素，由IL-3与白喉毒素融合而成，已被证明对患有浆细胞样树突状细胞肿瘤（BPDCN）的患者有效。同样，denileukin diftitox（2014年撤回以进行制造改进），一种针对IL-2R的细胞毒素，由IL-2与白喉毒素融合而成，对患有皮肤T细胞淋巴瘤（CTCL）的患者有效。然而，这些IL-毒素偶联物不被视为基于抗体的药物，因为它们使用受体配体而不是scFv进行肿瘤靶向。 3.5.2 放射性同位素偶联物 在小分子偶联和肽偶联放射性同位素在实体瘤中的成功后，对放射性同位素偶联物重新产生了一些兴趣。将镥-177与一种结合前列腺特异性膜抗原（PSMA）的小分子或与生长抑素受体结合的肽类似物偶联，在前列腺癌和神经内分泌肿瘤患者中展示了显著的肿瘤回归，分别获得了FDA的批准。这种肿瘤靶向小分子-放射性同位素或肽-放射性同位素偶联物的行为类似于抗体-放射性同位素偶联物，但具有不同的结构和药代动力学特征。目前正在进行临床试验，测试针对肾细胞癌患者的碳酸酐酶IX（CAIX）的肽-放射性同位素偶联物，以及针对脑肿瘤患者的GD2、AML患者的CD33、前列腺癌患者的PSMA以及血液恶性肿瘤患者的CD45和CD37的抗体-放射性同位素偶联物。其他方法涉及将肿瘤靶向抗体与α粒子发射体如锕-225（225Ac）偶联。α粒子具有更高的DNA损伤能量加上较短的范围，可能会增加肿瘤特异性细胞毒性，同时限制对周围健康组织的辐射引起的不良反应。 3.6 选择最佳格式 目前批准的基于抗体的治疗针对由癌细胞和正常细胞亚群表达的肿瘤相关抗原。这些抗体需要一个治疗窗口，允许杀死癌细胞，同时限制对正常细胞的非肿瘤毒性。需要谨慎选择抗体格式来利用这个治疗窗口，使用不当的格式可能由于降低的治疗效力或不可接受的毒性而无效。尽管缺乏明确的定量研究和直接比较，但人们普遍认为未经修饰的抗体杀死细胞需要高抗原表达（每个细胞>10,000份拷贝），而ADCs（每个细胞>1,000份拷贝）和TCE双特异性抗体或CAR T细胞（每个细胞>10-100份拷贝）可以杀死表达较低抗原的细胞。因此，对于给定目标，从未修饰的抗体转换为ADC或TCE双特异性抗体格式可以提高效力，但也可能同时增加毒性。这种效应在HER2靶向上得到了体现。HER2由一部分乳腺癌和小胃癌以及一系列正常人类组织表达。使用裸抗体（曲妥珠单抗和帕妥珠单抗）以及后来的ADC（曲妥珠单抗emtansine）对HER2进行靶向治疗，患者耐受性良好，并在HER2高表达的患者中导致肿瘤回归。最近，trastuzumab deruxtecan，一种具有高DAR的HER2靶向ADC，甚至在对以前的HER靶向抗体无反应的低HER2表达癌症中诱导了肿瘤回归。然而，进一步降低HER2靶向阈值的抗HER2 CAR T细胞由于对肺部低HER2表达细胞的靶向、非肿瘤毒性，导致致命的呼吸衰竭。抗HER2 CAR T细胞的致命毒性提出了可能性，即可以类似地靶向低水平HER2表达细胞的HER2靶向TCE双特异性抗体，也可能带来不可接受的毒性。因此，通过双特异性抗体zanidatamab进行HER2靶向采用了双HER2结合策略，而不是TCE方法，并已证明在没有致命毒性的情况下有效。因此，“干净”的目标，即在至关重要的组织中表达最小非肿瘤（如CD19）和低密度目标（如肽-MHC分子）是TCE基础治疗的最佳选择。在非可有可无组织中有一定水平的非肿瘤表达（如HER2）的目标，最好通过未修饰的抗体、ADCs或非TCE双特异性抗体进行靶向。 需要注意的是，特定设计的非肿瘤毒性和效力也取决于目标和药物载荷。例如，DLL3由一部分小细胞肺癌患者表达。在这种情况下，由于与PBD载荷相关的高水平毒性和缺乏生存益处，rovalpituzumab tesirine，一种DLL3靶向ADC的临床开发被停止。然而，I期试验表明，通过TCE双特异性抗体tarlatamab进行DLL3靶向会导致肿瘤回归，并且患者耐受性良好。最终，选择的目标及其抗原密度可能对最佳治疗格式至关重要。 4. 结论 总结来说，由于抗体在与其目标结合时可以提供精确度，基于抗体的治疗在肿瘤领域具有巨大前景。尽管仍存在重大挑战，但新目标以及各种新设计和工程策略预计将为这些挑战提供许多解决方案。更有效的基于抗体的治疗获得监管批准的爆炸性增长可能会继续遵循过去25年的趋势。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。