RNF114

导语 靶向蛋白降解技术，特别是蛋白水解靶向嵌合体（PROTAC），作为一种新兴的抗癌策略，近年来发展迅速。本文发表于《Annual Review of Cancer Biology》，由Dundee大学靶向蛋白降解中心的Vesna Vetma、Suzanne O'Connor和Alessio Ciulli撰写，综述了PROTAC药物的研发进展及其在癌症治疗中的应用前景。文章详细介绍了目前已进入临床试验的30余种PROTAC药物，涵盖雄激素受体、雌激素受体、布鲁顿酪氨酸激酶等多个重要靶点，并深入探讨了PROTACs的设计思路、作用机制、临床前及临床研究数据，以及面临的挑战和未来发展方向。该文为深入了解PROTACs在抗癌领域的应用提供了全面而及时的参考。 当然由于综述时效性，因此个人也在此基础上做一些相应的增补。 一、背景介绍 尽管近年来癌症治疗取得了显著进展，但药物毒性、疗效不足和耐药性仍然是临床治疗的主要挑战。传统的药物研发主要集中于开发小分子抑制剂，这些抑制剂通过结合蛋白质的活性位点来阻断其功能。然而，许多致癌蛋白缺乏合适的结合位点，或者抑制剂无法完全阻断蛋白质的功能，导致治疗效果不佳。靶向蛋白降解技术，特别是PROTAC技术，为克服这些挑战提供了一种新的策略。 二、PROTAC作用机制 PROTAC 是双功能小分子，由三部分组成：E3 连接酶配体、连接体和靶蛋白 (POI) 配体。PROTAC 通过将 POI 与 E3 连接酶连接起来，形成三元复合物，从而促进泛素分子转移到 POI 上。泛素化的 POI 会被蛋白酶体识别并降解。由于 PROTAC 的催化作用机制，它可以在亚化学计量浓度下发挥作用，并且可以降解高丰度蛋白，从而在低剂量下达到显著的靶蛋白降解。 三、临床试验中的PROTAC 目前，超过30种PROTAC药物已进入临床试验，主要集中在癌症治疗领域，少数探索其他疾病的治疗。以下将对处于临床试验阶段、靶向不同癌症相关蛋白的PROTAC进行更详细的介绍，并对已公布的部分临床试验结果进行总结。 1. AR 作用机制： AR-PROTACs通过招募E3连接酶（例如CRBN）使AR泛素化，从而促进蛋白酶体降解AR，阻断AR信号通路，抑制前列腺癌细胞增殖。 代表药物： ARV-110 (Bavdegalutamide): 首个进入临床的PROTAC药物，靶向AR，用于治疗mCRPC。临床试验结果显示，ARV-110在携带AR T878X/H875Y突变的患者亚组中疗效最佳，凸显了患者分层的重要性。然而，在更广泛的mCRPC患者群体中，其疗效有限，可能与AR信号通路复杂的耐药机制有关。 ARV-766 (Luxdegalutamide): 第二代AR-PROTAC，具有更高的稳定性和更广的基因型覆盖范围，可降解野生型和突变型AR。早期临床数据显示，ARV-766在较低剂量下即可有效降低前列腺特异性抗原水平，展现出优于恩杂鲁胺的潜力。目前ARV-766正在进行激素治疗后mCRPC患者的临床试验，并计划开展一线治疗的临床试验。 CC-94676 (BMS-986365)：一种异双功能口服疗法，旨在通过 AR 降解和拮抗的一流双重机制来抑制 AR 活性，ESMO2024上展现的mCRPC一期临床数据出色，计划2025启动3期注册性临床【ESMO2024--BMS-986365数据出色，BMS计划2025启动3期注册性临床】。 其他AR-PROTAC: 包括HP518、AC-176和HRS-5041等，均处于早期临床试验阶段，靶向mCRPC。这些PROTAC大多基于CRBN或其他未公开的E3连接酶。其临床疗效和安全性数据还有待进一步公布。 未来展望： 开发更有效的AR-PROTACs，拓展适应症至激素敏感性前列腺癌，探索与其他疗法的联合应用。 2. ER 作用机制：ER-PROTACs通过介导ER降解，抑制ER信号通路，从而发挥抗肿瘤作用。 代表药物： ARV-471 (Vepdegestrant): 口服、高效的ER-PROTAC，用于治疗ER阳性/HER2阴性的局部晚期或转移性乳腺癌。临床前研究显示，ARV-471在多种乳腺癌细胞系中均能有效降解ER，并表现出优于氟维司群的肿瘤抑制活性。ARV-471已进入3期临床试验，并获得了FDA快速通道资格认定，有望成为治疗乳腺癌的新型有效疗法。 其他ER-PROTAC: 包括AC682 和HRS-1358等，处于早期临床试验阶段，主要用于治疗ER阳性的乳腺癌。 未来展望： 进一步评估ARV-471在不同乳腺癌亚型中的疗效和安全性，探索与其他疗法的联合应用，例如CDK4/6抑制剂或PI3K抑制剂。 3. BTK 作用机制：BTK-PROTACs通过诱导BTK降解，抑制BCR信号通路，从而治疗B细胞恶性肿瘤。 代表药物： NX-2127 (Zelebrudomide): 双重BTK和Ikaros降解剂，兼具分子胶和PROTAC的特性。它可以降解野生型和C481S突变型BTK，以及IKZF1和IKZF3。临床试验显示，NX-2127在CLL患者中取得了良好的疗效，与BTK突变状态无关。然而，由于生产工艺改进的需求，该药物的1期临床试验目前处于暂停状态。 NX-5948: 第二代BTK-PROTAC，具有更高的选择性和中枢神经系统渗透性。临床前研究显示，NX-5948比抑制剂和第一代降解剂更有效地抑制肿瘤生长。目前NX-5948正处于1期临床试验中，用于治疗B细胞恶性肿瘤，包括中枢神经系统肿瘤和原发性中枢神经系统淋巴瘤。 其他BTK-PROTAC: 包括BGB-16673、HSK-29116、ABBV-101、HZ-Q1070、UBX-303等，均处于早期临床试验阶段，主要用于治疗B细胞恶性肿瘤。 未来展望：进一步评估NX-5948的疗效和安全性，特别是其中枢神经系统活性；开发针对不同BTK突变的PROTACs，克服耐药性。 4. Bcl-xL 作用机制：DT-2216通过选择性降解Bcl-xL，诱导肿瘤细胞凋亡，而不会显著影响血小板存活，从而降低血小板减少症的风险。 代表药物： DT-2216: 1期临床试验正在进行中，用于治疗复发/难治性TCL和其他血液系统恶性肿瘤。初步数据显示，DT-2216在不引起严重血小板减少的情况下具有抗肿瘤活性。 未来展望：评估DT-2216的长期疗效和安全性，探索与其他疗法的联合应用。 5. BCL6 作用机制：BCL6-PROTACs通过降解BCL6，抑制其转录调控功能，从而抑制DLBCL细胞增殖。 代表药物： ARV-393, BMS-986458: 这两种BCL6-PROTACs均处于1期临床试验阶段，主要用于治疗DLBCL。 未来展望：评估ARV-393和BMS-986458的疗效和安全性，探索与其他疗法的联合应用，例如利妥昔单抗。 6. IRAK4 作用机制：IRAK4 是 TLR 和 IL-1R 信号通路的关键激酶，在多种炎症和癌症中发挥作用。IRAK4-PROTACs 通过降解 IRAK4 蛋白，阻断下游信号传导，从而发挥抗炎和抗肿瘤作用。 代表药物： KT-413: 由 Kymera Therapeutics 开发，是一种 CRBN E3 连接酶为基础的 IRAK4 降解剂。临床前研究显示，KT-413 能有效降解 IRAK4，并在多种疾病模型中显示出疗效。曾开展针对非霍奇金淋巴瘤、惰性淋巴瘤、B 细胞非霍奇金淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、弥漫性大 B 细胞淋巴瘤和原发性皮肤大 B 细胞淋巴瘤的 I 期临床试验。尽管达到了预期的降解水平且没有剂量限制性毒性，但由于战略原因，该项目已终止开发。 未来展望：尽管 KT-413 的开发终止，但 IRAK4 仍然是一个有吸引力的靶点。未来研究可能集中在寻找新的 IRAK4 降解剂，优化其理化性质和药代动力学特性，并探索新的联合治疗策略。 7. BRD9 作用机制：BRD9 是非经典 SWI/SNF 染色质重塑复合物的一个组成部分，在滑膜肉瘤和 SMARCB1 缺陷型肿瘤中发挥关键作用。BRD9-PROTACs 通过降解 BRD9 蛋白，破坏癌细胞的转录调控，从而抑制肿瘤生长。 代表药物： FHD-609: 由 Foghorn Therapeutics 开发，是一种 CRBN E3 连接酶为基础的 BRD9 降解剂。I 期临床试验显示 FHD-609 可有效降解 BRD9，但在较高剂量下出现 QTc 间期延长，导致试验暂停。 CFT-8634: 由 C4 Therapeutics 开发，是一款口服 BRD9 降解剂。I 期临床试验显示，尽管 BRD9 降解水平很高，但在滑膜肉瘤和 SMARCB1 缺陷型实体瘤患者中疗效不足，导致试验终止。 未来展望：尽管面临挑战，BRD9 仍然是一个有潜力的靶点。未来的研究可能需要关注滑膜肉瘤的关键驱动因素 SSX-SS19 融合蛋白。此外，也需要进一步优化 BRD9-PROTACs 的理化性质和药代动力学特性，并探索新的联合治疗策略。 8. STAT3 作用机制：STAT3 是一种参与肿瘤发生、发展和转移的转录因子。STAT3-PROTACs 通过降解 STAT3 蛋白，阻断其下游信号通路，从而抑制肿瘤生长。 代表药物： KT-333: 由 Kymera Therapeutics 开发，是一款 VHL E3 连接酶为基础的 STAT3 降解剂。I 期临床试验显示 KT-333 能够有效降解 STAT3，并在特定患者群体中观察到临床意义的缓解。该药物已获得治疗皮肤 T 细胞淋巴瘤和外周 T 细胞淋巴瘤的孤儿药资格认定，以及 FDA 快速通道资格认定。 未来展望：KT-333 的临床试验结果令人鼓舞，有望成为治疗 STAT3 驱动型癌症的新型疗法。未来需要进一步评估其长期疗效和安全性，并探索新的联合治疗策略。 9. MDM2 作用机制：MDM2 是 p53 肿瘤抑制蛋白的负调节因子。MDM2-PROTACs 通过降解 MDM2 蛋白，稳定 p53 蛋白水平，从而激活 p53 介导的细胞周期阻滞和凋亡，抑制肿瘤生长。 代表药物： KT-253: 由 Kymera Therapeutics 开发。临床前研究表明，KT-253 可以克服 MDM2 的负反馈回路，并在体内外均显示出抗肿瘤活性。I 期临床试验正在进行中，用于治疗多种血液系统恶性肿瘤和实体瘤。初步数据显示，在耐受剂量下，KT-253 具有良好的疗效，且未观察到中性粒细胞减少症或血小板减少症等血液学毒性。 未来展望：KT-253 的早期临床数据令人鼓舞，有望成为治疗 p53 失活型癌症的新型疗法。未来需要进一步评估其长期疗效和安全性，并探索新的联合治疗策略。 10. EGFR 作用机制：EGFR 是一种参与细胞生长、增殖和分化的受体酪氨酸激酶。EGFR-PROTACs 通过降解 EGFR 蛋白，阻断 EGFR 信号通路，从而抑制肿瘤生长。 代表药物： HSK-40118: 由 Haisco Pharmaceutical Group 开发，靶向 EGFR L858R 突变体。I 期临床试验正在进行中，用于治疗 EGFR 突变的晚期或转移性 NSCLC。 CFT-8919: 由 C4 Therapeutics 和 Betta Pharmaceuticals 合作开发，是一款变构的、口服生物可利用的 EGFR L858R 突变体选择性降解剂。临床前研究显示，CFT-8919 能够降解 EGFR L858R 及其继发突变体，并在对第三代 EGFR 抑制剂耐药的小鼠模型中显示出抗肿瘤活性，包括 EGFR L858R T790M 脑转移模型。 HJ-002-03（和径医药）、BG-60366（百济神州）：EGFR C797S PROTAC，处于临床一期。 未来展望：EGFR-PROTACs 为治疗 EGFR 突变型 NSCLC 提供了新的治疗选择，特别是对于那些对现有抑制剂产生耐药性的患者。未来需要进一步评估 HSK-40118 和 CFT-8919 的临床疗效和安全性，并探索新的联合治疗策略。 11. SMARCA2   作用机制：SMARCA2 和 SMARCA4 是 SWI/SNF 染色质重塑复合物的 ATP 依赖性解旋酶。SMARCA4 功能缺失突变在多种恶性肿瘤中富集。SMARCA2-PROTACs 通过选择性降解 SMARCA2，利用 SMARCA2 和 SMARCA4 之间的合成致死关系，从而杀死肿瘤细胞。 代表药物： PRT3789: 由 Prelude Therapeutics 开发，是一款 VHL E3 连接酶为基础的 SMARCA2 降解剂。目前正在 I 期临床试验中，作为单一疗法和与多西紫杉醇联合使用，用于治疗 SMARCA4 突变的 NSCLC。但一期初步临床结果不佳【SMARCA2降解剂：靶向增强子重编程，治疗SMARCA4突变型肺癌的新策略】。 PRT7732：Prelude Therapeutics 开发，是一款口服SMARCA2 降解剂，可能是基于CRBN。目前正在 I 期临床试验中。 未来展望：SMARCA2-PROTACs 为治疗 SMARCA4 突变型癌症提供了一种新的治疗策略。未来需要进一步评估 PRT3789 的临床疗效和安全性，并探索新的联合治疗策略。 12. KRAS 作用机制：KRAS 是一种在多种癌症中 häufig 突变的癌基因。KRAS-PROTACs 通过降解 KRAS 蛋白，阻断 KRAS 信号通路，从而抑制肿瘤生长。 代表药物： ASP3082: 由 Astellas Pharma 开发，是一款靶向 KRAS G12D 突变体的 VHL E3 连接酶为基础的降解剂，目前处于 I 期临床试验阶段，但初步临床结果不佳【ESMO2024--安斯泰来的KRASG12D PROTAC令人失望】。FDA 已授予 ASP3082 快速通道资格认定，用于治疗胰腺导管腺癌。 ASP4396：Astellas Pharma另一个靶向 KRAS G12D 突变体的PROTAC，目前处于 I 期临床试验阶段，可能是基于CRBN。 未来展望：KRAS 长期以来被认为是“不可成药”的靶点，KRAS-PROTACs 的出现为 KRAS 突变型癌症的治疗带来了新的希望。未来需要进一步评估 ASP3082 和其他 KRAS 降解剂的临床疗效和安全性，并探索新的联合治疗策略。 13. BRAF 作用机制：BRAF 是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，是 RAS-RAF-MEK-ERK 信号通路的重要组成部分。BRAF V600E 突变在多种癌症中常见。BRAF-PROTACs 通过降解突变型 BRAF 蛋白，阻断下游信号通路，从而抑制肿瘤生长。 代表药物： CFT1946: 由 C4 Therapeutics 开发，是一款靶向 BRAF V600E 突变体的 CRBN E3 连接酶为基础的降解剂。目前正在 I/II 期临床试验中，用于治疗 BRAF V600 突变驱动的癌症，包括对抑制剂耐药的癌症。该试验将评估 CFT1946 单药治疗和与 MEK 抑制剂曲美替尼联用的疗效。 未来展望：BRAF-PROTACs 为治疗 BRAF 突变型癌症，特别是对 BRAF 抑制剂耐药的癌症，提供了新的治疗选择。未来需要进一步评估 CFT1946 的临床疗效和安全性，并探索新的联合治疗策略。 四、PROTAC 的优势和挑战 PROTAC的优势 完全消除蛋白功能: 传统的抑制剂通常只阻断蛋白质的特定功能或相互作用，而PROTACs则通过降解目标蛋白，从根本上消除其所有功能，包括催化功能、支架功能以及蛋白-蛋白相互作用等。这对于那些具有多种功能或难以通过抑制单个活性位点来有效控制的蛋白靶点尤为重要，例如转录因子、支架蛋白和致癌融合蛋白等。 靶向“不可成药”靶点: 许多疾病相关蛋白缺乏明确的结合口袋或活性位点，传统的小分子抑制剂难以靶向。而PROTACs不需要与蛋白的活性位点结合，可以靶向蛋白表面任何可及的位点，从而拓展了可成药靶点的范围，为开发靶向“不可成药”靶点的药物提供了新的途径。 催化作用机制: PROTACs以催化方式发挥作用，即一个PROTAC分子可以介导多个目标蛋白的降解，因此在亚化学计量浓度下即可有效发挥作用。这使得PROTACs药物在较低剂量下即可达到治疗效果， potentially 降低脱靶效应和毒副作用，并提高药物的治疗窗口。 更高的选择性: 即使使用对同源蛋白没有选择性的配体，PROTACs也可能实现选择性降解。这是因为PROTACs的作用依赖于三元复合物的形成，而不同蛋白与E3连接酶形成三元复合物的稳定性和空间构象可能存在差异，从而导致选择性降解。此外，可以通过合理设计PROTACs的结构，例如连接体的长度和组成，来进一步提高其选择性。 克服耐药性: 肿瘤细胞常常通过靶点蛋白突变的方式产生对抑制剂的耐药性。而PROTACs的降解机制使其对某些类型的突变不敏感，例如那些不影响PROTAC结合但影响抑制剂结合的突变。此外，PROTACs还可以降解那些导致耐药性的突变蛋白，从而克服耐药性。 作用持久: PROTAC介导的蛋白降解作用通常比抑制剂的抑制作用更持久。这是因为蛋白降解后需要一定时间才能重新合成，而抑制剂的抑制作用则会随着药物的清除而减弱。PROTACs的持久作用可以延长给药间隔，提高患者的依从性。 PROTACs面临的挑战 成药性挑战: PROTACs通常具有较高的分子量、较多的氢键供体和受体、较高的亲脂性和较多的可旋转键，这些特性使其难以满足Lipinski五规则等传统药物的理化性质要求，导致较差的细胞渗透性、溶解度和口服生物利用度，给药物的开发和临床应用带来挑战。 脱靶效应: PROTACs可能结合并降解非目标蛋白，导致脱靶效应和毒副作用。这需要在药物设计和开发过程中进行严格的筛选和优化，以提高PROTACs的特异性。 耐药性机制: 尽管PROTACs可以克服某些类型的耐药性，但肿瘤细胞也可能通过其他机制对PROTACs产生耐药性，例如E3连接酶的突变或表达下调、泛素-蛋白酶体系统的功能障碍等。需要进一步研究PROTACs的耐药机制，并开发相应的应对策略。 药物递送: 由于PROTACs的分子量较大，其在体内的递送和分布可能受到限制，特别是到达实体瘤内部。需要开发新的药物递送系统，以提高PROTACs在肿瘤组织中的浓度和疗效。 免疫原性: PROTACs作为一种新型的药物分子，其免疫原性尚不清楚。需要进行深入的研究，以评估PROTACs的免疫原性风险，并开发相应的解决方案。 生产成本: PROTACs的合成和纯化相对复杂，导致其生产成本较高。需要开发更有效、更经济的PROTACs合成方法，以降低药物的生产成本，提高其可及性。 尽管PROTACs技术面临一些挑战，但其巨大的潜力吸引了学术界和工业界的广泛关注。随着研究的不断深入和技术的进步，相信这些挑战将逐步得到解决，PROTACs技术将在未来为治疗癌症和其他疾病带来新的突破。 五、未来展望 PROTAC技术作为一种新兴的靶向蛋白降解策略，展现出巨大的潜力，但仍处于发展早期。为了充分发挥其治疗潜力，未来的研究需要关注以下几个方面： 1. 扩展E3连接酶库及优化配体: 目前，大多数PROTACs依赖于CRBN和VHL这两种E3连接酶。为了克服对这两种E3连接酶的耐药性，以及实现组织特异性降解，需要开发靶向其他E3连接酶的PROTACs，例如MDM2、cIAP1、KEAP1、RNF114等。这需要发现和鉴定新的E3连接酶配体，并深入研究其与靶蛋白相互作用的机制。 优化现有E3连接酶配体，提高其结合亲和力和选择性，降低脱靶效应。开发具有更好成药性的配体，例如口服生物利用度更高、组织分布更广的配体。 2. 优化连接体和靶蛋白配体: 连接体的长度、组成和柔性会影响PROTACs的成药性和降解效率。需要开发新的连接体设计策略，例如可裂解连接体、可控释放连接体等，以提高PROTACs的靶向性和疗效。 优化靶蛋白配体，提高其结合亲和力和选择性。开发共价结合的靶蛋白配体，提高PROTACs的降解效率和作用持久性。探索靶向蛋白-蛋白相互作用界面的配体，以更有效地干扰蛋白功能。 3. 提高PROTACs的成药性: PROTACs通常分子量较大，理化性质较差，导致其成药性较差。需要开发新的PROTACs设计策略，例如片段化的PROTACs、双PROTACs、杂合PROTACs等，以减小分子量，提高成药性。 利用计算辅助药物设计和人工智能技术，优化PROTACs的结构，提高其细胞渗透性、溶解度和口服生物利用度。 开发新的药物递送系统，例如纳米颗粒、抗体偶联药物等，以提高PROTACs在体内的递送效率和靶向性。 4. 深入研究PROTACs的作用机制和耐药机制: 深入研究PROTACs形成三元复合物的结构和动力学，揭示其降解靶蛋白的分子机制。 研究肿瘤细胞对PROTACs的耐药机制，例如E3连接酶的突变或表达下调、泛素-蛋白酶体系统的功能障碍等，并开发相应的应对策略，例如联合用药、开发新的PROTACs等。 5. 拓展PROTACs的应用领域: PROTACs技术不仅可以用于治疗癌症，还可以用于治疗其他疾病，例如神经退行性疾病、感染性疾病、自身免疫性疾病等。 探索PROTACs在疾病诊断和生物标志物开发中的应用。 6. 开发新型靶向蛋白降解技术: 除了PROTACs技术外，还可以开发其他靶向蛋白降解技术，例如分子胶、自噬靶向嵌合体（AUTAC）、溶酶体靶向嵌合体（LYTAC）等，以拓展靶向蛋白降解的范围和应用。 7. 加强产学研合作: 加强学术界和工业界的合作，推动PROTACs技术的临床转化和应用。 建立PROTACs技术平台，共享资源和技术，加速PROTACs药物的研发进程。 总而言之，PROTAC技术具有广阔的应用前景，但仍面临诸多挑战。通过持续的创新和研究，不断优化PROTACs的设计和开发，克服其面临的挑战，PROTACs技术有望在未来为治疗多种疾病带来新的突破，造福人类健康。 六、结论 PROTAC 技术在癌症治疗领域展现出巨大的潜力。随着研究的不断深入，PROTAC 有望成为治疗癌症和其他疾病的新型有效疗法。然而，要充分发挥 PROTAC 的潜力，仍需要克服一些挑战，例如优化其理化性质、探索新的 E3 连接酶、开发组织特异性 PROTAC 以及研究其耐药性机制。相信随着技术的不断进步，PROTAC 将在未来为癌症患者带来更多希望。 END 免责声明：本文仅作知识交流与分享及科普目的，不涉及商业宣传，不作为相关医疗指导或用药建议。文章如有侵权请联系删除。 OTC2024类器官前沿应用与3D细胞培养论坛圆满落幕，点击图片可查看会后报告，咨询OTC2025类器官论坛请联系：王晨 180 1628 8769

当前许多共价药物发现方案，包括共价 EGFR 和 BTK 抑制剂的计划，都涉及向确定的配体添加反应性官能团。然而，新兴技术使得从亲电试剂的角度来发现共价配体成为可能，其中在基于结构的优化之前识别出针对感兴趣的蛋白质靶标的共价配体。在本文，我们将讨论共价药物发现的新兴技术的工具。 1. 共价化合物筛选平台总结 许多新兴的共价配体筛选平台涉及基于质谱的检测，通过化合物和蛋白质之间的共价键形成来实现。还使用了其他表型筛选、DNA 编码库或计算方法，然后将其与基于 MS 的验证、基于 ABPP 的实验相结合，为选择性和结构生物学提供信息，从而实现共价药物苗头。表1 总结了最重要的共价筛选方法。商业化的亲电子片段类化合物库的增长是促成这些亲电子优先发现策略兴起的关键因素。 表1 共价药物发现筛选方法比较 ２. 完整蛋白质 MS 最初，基于 MS 的化合物筛选源于“束缚(tetehering)”，这是一种自 2000 年以来采用的技术，它使用与二硫化物连接的化合物库来识别与半胱氨酸相邻口袋结合的片段。结合的分子（可以是内源的、或工程化的）与半胱氨酸进行二硫键交换，与蛋白质形成加合物，并通过 MS 检测进行混合(pooled)筛选可以识别结合的化合物。结合片段可以以基于片段的方法，以鉴定高亲和力配体。该策略最初旨在识别具有挑战性的靶标的可逆配体，可以通过用丙烯酰胺等亲电子试剂替换二硫键来维持共价结合，就像最初的共价 KRAS(G12C) 抑制剂(10.1038/nature12796)的情况一样。这种方法还用于发现调节蛋白质-蛋白质相互作用的化合物，最近的一项研究采用了类似的束缚策略，即使用醛与赖氨酸残基形成亚胺(10.1002/anie.202008585) 。 KRAS(G12C) 共价抑制剂 基于亚胺的束缚实现蛋白质-蛋白质相互作用的基于片段的稳定剂 最近，使用完整 MS 筛选了 993 种丙烯酰胺和氯乙酰胺的商业化文库，以鉴定去泛素酶 OTUB2 和焦磷酸酶NUDT7 的共价配体 10.1021/jacs.9b02822。作者使用 OTUB2 和 NUDT7 与命中化合物的共晶结构来片段延伸片段以增加效力。 使用完整 MS 筛选方法结合结构引导设计来识别针对蛋白质靶标的共价片段配体。 相同的化合物库还用于筛选肽基脯氨酸顺反异构酶-Pin1，该酶在多种肿瘤类型中过表达或激活，但选择性靶向具有挑战性 10.1038/s41589-021-00786-7 。在共价抑制剂靶点识别 (CITe-Id) 化学蛋白质组学实验中，所得共价抑制剂对 Pin1 具有选择性，并且可有效抑制小鼠神经母细胞瘤的生长。 Sulfopin 是 Pin1 的共价抑制剂。 共价配体筛选的另一个例子是筛选了一系列共价化合物，导致了第一个批准的 KRAS(G12C) 抑制剂 sotorasib。通过三种测定法筛选了 3,300 种丙烯酰胺化合物文库：硫醇反应性测定法、RAF 偶联核苷酸交换测定法和完整 MS 测定法 10.1021/acsmedchemlett.9b00258 。结合共结晶结构显示配体结合如何KRAS口袋，这项工作为快速发现 KRAS(G12C) 抑制剂提供了基础。 KRASG12C 共价抑制剂 3. 共价 DNA 编码文库 DNA 编码文库(DEL, DNA-encoded libraries) 提供了一种替代方法，可以筛选大型小分子文库。与 MS 或 ABPP 方法不同，共价在 DEL 筛选方面没有特殊优势，但 DEL 允许通过固定、富集、扩增和测序的工作流程筛选更大的共价文库。在过去的 5 年中，半胱氨酸靶向 DNA 编码或蛋白-核酸编码文库已被用于识别溴结构域分子（PCAF 和 BRD4），以及 JNK1、MEK2 和 HER2。进一步的工作探索了共价 DEL 筛选工作流程的富集步骤的改进，其不同之处在于共价接合阻止了 DNA 标记分子的洗脱。通过针对 DNA 编码蛋白库筛选，还鉴定出了 MAP2K6 的共价配体10.1021/jacs.7b04880。随着共价 DEL 文库规模的扩大和 DEL 商业可用性的增加，包含亲电分子的 DEL 将在共价配体发现中变得更加广泛，尽管必须牢记富集工作流程和化合物稳定性方面的独特考虑。 从 DNA 编码的小分子文库 × 蛋白质文库 筛选发现共价激酶抑制剂 4. 共价分子对接 大多数共价对接计算程序依赖于在小分子配体和相应氨基酸位点之间的预定义键的约束下进行对接。共价对接平台 GOLD 使用的一个例子是虚拟筛选 NEDD8 激活酶 (NAE) 的共价抑制剂，其中三个命中化合物被确认为新型 NAE 抑制剂10.1021/ci5002058。 针对共价配体的有效虚拟筛选策略：新型 NEDD8 激活酶抑制剂的鉴定 用于虚拟筛选的 DOCKovalent 方法的开发促进了硼酸 AmpC β-内酰胺酶抑制剂以及 JAK3 的氰基丙烯酰胺抑制剂的发现169。 筛选亲电性小分子大型虚拟库的通用方法（DOCKovalent） DOCKovalent 使用非共价对接方法预先生成亲电虚拟库的构象和状态，然后针对目标亲核试剂对每个状态进行采样。相同的方法已用于鉴定激酶 MKK7 的新共价抑制剂，以及结合 KRAS（G12C）以破坏蛋白质稳定性并加速核酸交换的化合物。 除了筛选之外，共价对接也是研究已知共价配体的结合模式的有用工具。例如，GOLD 已用于模拟含醛蛋白酶体抑制剂 MG132 的结合。AutoDock 使用灵活的侧链方法，将共价配体视为氨基酸侧链，并使用基于物理的评分函数对这种灵活的“侧链”的姿势进行评分，该评分函数评估配体-蛋白质相互作用的能量学，如蛋白质的其余部分保持刚性。另一种方法称为 CovDock，基于薛定谔GLIDE对接算法和 Prime 结构细化方法。CovDock 使用传统的非共价对接方法将配体与蛋白质靶标对接，然后对共价键连接进行建模并完善复合物。这种方法没有考虑亲电子试剂的反应性，这可能限制虚拟研究具有不同亲电官能团的对接配体差异的能力。 总的来说，当亲电子试剂的反应性和修饰位点已知时，共价对接软件可以提供有关配体-蛋白质相互作用的有用信息。 5. 化学蛋白质组学的发现 化学蛋白质组学平台能够直接在复杂的生物系统中鉴定共价化合物及其靶蛋白上相应的配位位点。化学蛋白质组学的进步促进了针对不可成药靶标的共价配体的药物发现，并能够对整个蛋白质组中的共价配体进行选择性分析，以识别这些配体的靶标和脱靶。接下来将讨论反应性配体热点的化学蛋白质组学分析、ABPP 筛选平台和靶点识别。 5.1 反应性配体热点的化学蛋白质组学 ABPP 有助于发现复杂生物样品中的共价配位位点和相应的配体。ABPP 是由 Cravatt 和 Bogyo 发明，使用活性位点定向化学探针，共价靶向各种酶类的催化残基，包括水解酶、蛋白酶和激酶。该技术通常使用基于凝胶的测定，用于获得生物环境中活性酶的功能读数。ABPP探针包含与亲核氨基酸（例如半胱氨酸）共价反应的弹头和用于监测探针结合的报告基团，例如用于后续点击化学应用的荧光团、生物素或炔部分（下图a ）。 同位素串联正交蛋白水解 - 基于活性的蛋白质分析。a|. 用于基于活性的蛋白质分析 (ABPP) 的反应探针。b|. 竞争性 isoTOP-ABPP（同位素串联正交蛋白水解 - 基于活性的蛋白质分析）方法的示意图。 最近的 ABPP 方法不再关注活性位点，而是使用 MS 和广泛反应的化学探针来绘制变构位点。在 isoTOP-ABPP（同位素串联正交蛋白水解 - 基于活性的蛋白质分析）方法中，使用带有炔烃的碘乙酰胺探针来识别蛋白质组中的高反应性半胱氨酸（图b） 。炔烃基团可用于将探针修饰的蛋白质连接到TEV 蛋白酶可切割标签，该标签包含由同位素轻或重缬氨酸分隔的叠氮基团和生物素部分。这些功能能够富集探针修饰的肽，并使用 MS 对轻质和重质样品进行串联分析，在控制运行间变异性后，可以在样品之间进行定量比较，包括共价化合物的竞争分析。使用这种方法，发现半胱氨酸的高反应性预测了它们在催化和翻译后修饰位点的功能。 总体而言，反应性分析生成了数千种蛋白质的大量信息，最终提供了亲核（通常是半胱氨酸）氨基酸反应性的图像。该信息可用于在药物发现计划中选择适当的蛋白质靶标，或识别先前可能被认为不可配体或不可成药的感兴趣蛋白质上的变构位点。 5.2 基于活性的蛋白质分析筛选平台 竞争性 isoTOP-ABPP 的使用扩展到通过将单个丙烯酰胺和氯乙酰胺片段与碘乙酰胺-炔探针竞争来识别小型共价片段库的蛋白质组中的靶标。在这项研究中，鉴定了 700 多个可配体半胱氨酸，并提供了有关文库中每个共价片段的蛋白质组选择性的信息。通过这种方法发现的共价配体及其相应的可结合位点被用来帮助阐明 caspase 8 和 caspase 10 在 T 细胞外源性细胞凋亡中的作用，表明这种方法可以快速识别靶向具有生物学意义的蛋白质的化合物。在此工作的基础上开展了多项研究，利用 isoTOP-ABPP 寻找新的共价配体。例如，在突变型  KEAP1 中绘制了半胱氨酸反应性和可配位位点，并与野生型 KEAP1 NSCLC 系中的进行比较。作者发现了与核受体 NR0B1 上可结合半胱氨酸结合的化合物，该受体受 NRF2（KEAP1 的底物）调节。 5.3 化学蛋白质组学平台的靶标识别 IsoTOP-ABPP 还可用于识别已知亲电子药物的蛋白质靶标。例如，这种方法应用于富马酸二甲酯，用于治疗自身免疫性疾病。尽管富马酸二甲酯用于治疗牛皮癣已有三十年的历史，并于 2013 年被 FDA 批准用于治疗多发性硬化症，但富马酸二甲酯的直接共价靶点直到最近仍不清楚。在一项研究中，化学蛋白质组学方法用于鉴定蛋白激酶 Cθ (PKCθ) 和 IRAK4 作为富马酸二甲酯的靶标。在这两种情况下，半胱氨酸残基的共价结合破坏了蛋白质-蛋白质相互作用以调节免疫细胞功能。破坏 PKCθ 与共刺激受体 CD28 的相互作用会减少 T 细胞活化，破坏 IRAK4-MYD88 相互作用会抑制浆细胞样树突状细胞中干扰素-α 的产生。 5.4 邻近诱导的共价配体发现 共价配体不仅可用作功能抑制剂，而且在新兴的邻近诱导中也具有重要作用。共价药物发现平台通过发现针对 E3 泛素连接酶的共价招募剂，促进了靶向蛋白质降解方法的扩展。尽管大多数双功能降解分子（蛋白水解靶向嵌合体 (PROTAC)）会招募 E3 连接酶 cereblon (CRBN) 或 von Hippel–Lindau (VHL) 蛋白来降解靶蛋白，但仍有超过 600 种具有不同底物范围的 E3 连接酶。自 2019 年以来，共价招募已被用于验证大部分用于靶向蛋白质降解的 E3 连接酶，包括 RNF114、RNF4、DDB1 和 DCAF16、DCAF11、 KEAP1 以FEM1B。在一项研究中，使用双功能 FKBP12 和 BRD4 降解剂，作者将 DCAF16 确定为负责降解的目标 E3 连接酶 。这些发现导致了现在可用的各种共价 E3 募集分子。 除了降解之外，非抑制性共价配体的鉴定还有可能有助于发现新的接近诱导分子。例如，使用共价去泛素酶招募剂开发了一种称为去泛素酶靶向嵌合体（DUBTAC）的靶向蛋白质稳定平台。一般来说，通过共价配体筛选鉴定非抑制性变构配体有可能促进其他酶（例如激酶和脱乙酰酶）的招募以靶向蛋白质并将蛋白质功能引导至新底物以获得治疗益处。 5. 亲核共价配体 大多数蛋白质反应性共价药物往往是亲电子的，以便能够与亲核氨基酸发生反应。相比之下，亲核药物可以与亲电辅因子和翻译后修饰发生反应。几种含肼化合物充当单胺氧化酶 (MAO) A 和 B 的基于机制的抑制剂，通过 MAO 的激活能够使黄素辅助因子烷基化，从而抑制该酶。ABPP 原理和“反极性”探针已用于研究亲电翻译后修饰，例如可与含肼化合物发生反应的 N 末端丙酮酰基和乙醛酰基修饰。基于肼的探针也被用来帮助鉴定和表征具有亲电辅因子或翻译后修饰的蛋白质的配体。 6. 靶向赖氨酸的共价配体 半胱氨酸的低丰度可以实现选择性，但限制了共价靶向特定目标蛋白质的机会。这个问题促使科学家们研究其他亲核氨基酸的靶向，特别是赖氨酸。由于赖氨酸的ε-氨基在生理条件下亲核性较低，发现有效的赖氨酸靶向共价配体需要鉴定异常反应性的赖氨酸。使用多种赖氨酸导向探针的 IsoTOP-ABPP 实验已证明在分析整个蛋白质组的赖氨酸反应性方面非常有效。通过 isoTOP-ABPP 实验，鉴定出超过 9,000 个可配位的赖氨酸，并且更精细的含五氟苯酚或含N-羟基琥珀酰亚胺酯的化合物可以选择性地标记感兴趣的特定蛋白质。在这些实验的基础上，合成了大约 180 个亲电子试剂的文库，然后进行 isoTOP-ABPP 实验以评估不同化学型的选择性并鉴定可与小分子配位的赖氨酸。这项研究产生了更广泛的反应性亲电子试剂，例如二醛，可用于进一步的赖氨酸分析实验，但也鉴定了反应性较低的亲电子试剂，包括N-酰基-N-烷基磺酰胺，其以前曾被用作生物共轭的工具。 人类蛋白质组中亲氨基化合物-赖氨酸相互作用的全局图。 大多数赖氨酸靶向配体都是使用基于结构的方法从现有配体设计的，通常是通过将亲电子磺酰氟、氟硫酸盐或乙烯基砜合理地放置在适当的方向与邻近已建立的结合位点的赖氨酸的ε-氨基反应。此类配体包括动力学运甲状腺素蛋白稳定剂 、异构体选择性PI3Kδ抑制剂以及细胞周期蛋白依赖性激酶2(CDK2) 和Hsp90的抑制剂。结合全面的亲电子分析、赖氨酸导向的化学蛋白质组学和结构引导的方法将使科学家能够利用配体结合位点附近丰富的赖氨酸残基来增强共价药物的发现。 参考: doi.org/10.1038/s41573-022-00542-z 声明：发表/转载本文仅仅是出于传播信息的需要，并不意味着代表本公众号观点或证实其内容的真实性。据此内容作出的任何判断，后果自负。若有侵权，告知必删！ 长按关注本公众号  粉丝群/投稿/授权/广告等 请联系公众号助手 觉得本文好看，请点这里↓

Rishi R. Shah等人的综述报道了首个共价 VHL 配体的设计和优化过程，以及将其纳入 PROTACs 以用于 TPD 应用的过程。已知 VHL 结合体的羟脯氨酸基团可以被磺酰氟分子取代，并通过结构指导优化生成了一种配体，将它们加入双功能降解剂中可诱导 BRD4 或雄激素受体的靶向蛋白降解，而无需进一步优化链接。文章要点如下：这是首次报道缺乏羟脯氨酸基团并通过磺酰氟分子与 VHL 共价结合的 VHL 配体也是首次通过设计而非筛选开发的共价 E3 连接酶结合剂扩大了共价 E3 连接酶 PROTAC 的底物范围01研究背景蛋白水解靶向嵌合体（PROTACs）是一种异多功能分子，通过利用细胞蛋白水解降解机制诱导靶向蛋白质降解（TPD）。（VHL）蛋白是 PROTAC 广泛使用的 E3 连接酶之一。以共价方式与 E3 连接酶配位的 PROTACs 引起了人们的浓厚兴趣，可将三元复合物转化为修饰 E3 与底物之间的简单二元相互作用（图 1A），因而比可逆配位的 PROTACs 具有潜在优势。迄今为止，已报道的共价 PROTACs 包括 DCAF1、DCAF11、DCAF16、RNF4、RNF114 和 FEM1B，每种都带有半胱氨酸靶向亲电弹头（如氯乙酰胺或 α、β-不饱和羰基），而且都是通过筛选而非设计发现的。然而，通过设计发现具有广泛兴趣蛋白（POI）范围的共价 PROTACs 具有挑战性。02第一代磺酰氟共价 VHL 配体VH032 是迄今为止在 PROTACs 中应用最广泛的 VHL 配体， VHL-SF1 是探究 VHL 共价修饰的合理起点。VHL-SF1 的合成首先通过一系列简短的反应生成 (S)-羟脯氨酸（方案 S1）。用硫代乙酸酯置换甲磺酸盐 1 得到化合物 2，化合物 2 通过磺酰氯 3 转化为磺酰氟 4（方案 1）。虽然这一反应生成了所需的磺酰氟，但脯氨酸环发生了外嵌合，导致 LC-MS 分析检测到非对映异构体混合物。为了避免这种情况，研究者开发了新的反应条件，直接从硫代乙酸酯 2 一步合成所需的磺酰氟，只得到所需的立体异构体 5。方案 1. 开发在 VHL-SF1 和 VHL-SF1 生物素中引入磺酰氟分子的新合成路线为了评估 VHL-SF1 对 VHL 进行共价修饰的能力，研究者首先开发了一种链霉亲和素转移试验，通过这项检测得出结论：室温下培养 2 小时后，10 μM VHL-SF1 生物素修饰了 32% 的 VHL，进一步证实这与探针的浓度有关。在竞争性荧光偏振（FP）试验中，浓度高达 100 μM 的 VHL-SF1 无法取代荧光团标记的 HIF1α 肽，而已知 HIF1α 肽同时占据了 VH032 结合位点和第二个 VHL 结构域。接下来开发第二代共价 VHL 结合剂，提高其效力和占据率。03第二代磺酰氟 VHL 共价配体为了提高共价配体的效力，优化羟脯氨酸外围基团可以增强对 VHL 的亲和力。研究 VHL-SF1 类似物的对接姿势，包括 VHL-SF2，其中的叔亮氨酸分子换成了甲基异噁唑，连接载体移到了苄基位置（图 2A）。与 VHL-SF1 不同的是，这一分析表明 VHL-SF2 可与 Ser110 共价结合，同时保持与 VH032 的许多非共价相互作用（图 2B）。VHL-SF2在链霉亲和素转移试验中显示出比第一代VHL-SF1更高的VHL修饰效率（44% vs 32%）。此外，VHL-SF2在荧光偏振（FP）试验中能够以35 μM的IC50值置换标记肽，表明其能够有效占据VHL的HIF1α结合位点。在活细胞中，VHL-SF2通过竞争性牵引试验进一步证实了其与VHL的结合，且这种结合可以通过预处理进行剂量依赖性竞争。磺酰氟弹头在生理pH和40°C下的稳定性降低可能是导致细胞试验中效力降低的原因之一。总体而言，VHL-SF2的开发和评估表明了其作为一种有效的共价VHL配体的潜力，能够在细胞内特异性地修饰VHL并诱导目标蛋白的降解。VHL-SF2 的合成分为 11 个步骤。04基于 VHL-SF2 的 PROTAC 可诱导蛋白酶体依赖性的 BRD4 TPD在离体蛋白和完整细胞中验证了 VHL-SF2 与 VHL 的接合后，研究者合成了一种 BRD4 靶向 PROTAC--BRD-SF2，其中包含 VHL-SF2 和一种已知的 BRD4 配体（图 3A），并使用 BRD4 HiBiT 检测法评估了靶蛋白降解情况。而 VHL-SF2 本身并不影响 BRD4 水平（图 3B），在这些条件下，BRD-SF2 和 VHL-SF2 没有显示出细胞毒性。用蛋白酶体活性抑制剂或 NEDDylation 抑制剂（分别为 epoxomicin 和 MLN4924）处理时，BRD4 在 BRD-SF2 存在的情况下不会被耗尽，这证明蛋白酶体和 Cullin E3 连接酶依赖机制与 VHL 的招募是一致的。05基于VHL-SF2的PROTACs诱导AR的TPD为了进一步证实 VHL-SF2 在加入 PROTAC 时招募 VHL 诱导靶蛋白降解的多功能性，研究者合成了两种 AR 配体衍生的 VHL-SF2 共轭物 AR-VHL-SF2 和 AR2-VHL-SF2，它们基于具有诱人细胞效力的已知 AR 配体，这些配体以前曾被加入 AR 双功能降解剂中（图 3F）。在 LNCaP 前列腺癌细胞中使用 AR HiBiT 检测法评估了这些化合物诱导 AR 降解的情况，其中内源性 AR 被标记了 HiBiT 肽（图 3G）。AR-VHL-SF2和AR2-VHL-SF2都能诱导AR降解，此外，Arvinas的AR降解临床候选药物ARV110也能诱导AR降解。根据 MLN4924 存在下的 AR 降解阻断，AR-VHL-SF2- 和 AR2-VHL-SF2- 介导的蛋白质降解都是蛋白酶体和 E3 连接酶依赖性的（图 3H、I），并且在这些条件下没有表现出细胞毒性。与非共价 PROTACs 的标准三元复合物相比，共价 E3 连接酶招募剂在催化效率和延长预测的二元复合物功效方面具有优势。未来，应通过全蛋白质组学进一步研究这种加合物群对 VHL 天然底物的影响，以确定最小的占有率是否足以在不改变 VHL 功能的情况下促进 TPD。06共价 VHL PROTACs 的优势  为了进一步研究共价 VHL 配体的潜在优势，在Washout实验中对 BRD-SF2 和 MZ-1 进行了正面比较。在该实验中，BRD-SF2 的降解活性相对于 MZ-1 的降解活性降低了（图 4A,B），分别为 27% 和 48%。在有竞争浓度的 VH032 正交存在的情况下进行的 BRD4 HiBiT 检测证实，在 6 小时后，MZ-1 降解 BRD4 受竞争者存在的影响更大。这些结果进一步支持了 BRD-SF2 的共价作用机制，并强调了在去除游离 PROTAC 或存在竞争性结合剂的情况下延长降解活性的潜力。总结本研究为羟脯氨酸中心的其他结构修饰铺平了道路，最终可改善针对 VHL 的 PROTAC 的药代动力学和药效学特性。并为进一步优化 VHL 共价配体以提高药效和稳定性的药物化学研究奠定了基础。本文还报告了 BRD4 和 AR 的新型双功能降解剂，这些降解剂可作为开发具有更好药代动力学和药效学特性的 PROTACs 的起点。参考文献https://doi.org/10.1021/acs.jmedchem.3c02123声明：发表/转载本文仅仅是出于传播信息的需要，并不意味着代表本公众号观点或证实其内容的真实性。据此内容作出的任何判断，后果自负。若有侵权，告知必删！长按关注本公众号   粉丝群/投稿/授权/广告等请联系公众号助手 觉得本文好看，请点这里↓