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OTC2025论坛深度聚焦类器官与疾病建模、新药发现/研发、3D细胞培养、类器官培养及质控。展位咨询请联系：王晨 180 1628 8769。日本横滨国立大学Fukuda, J.教授团队在Science Advances期刊上发表一种基于细胞重编程的3D培养技术构建毛囊类器官新方法。重点围绕早期毛囊类器官形态发生过程中的重要发育机制和信号通路展开，并在此基础上利用体外毛囊系统对毛球内黑素体的生成与转运进行持续观测。该技术有望为深入探究毛囊新生与色素沉着的分子机制提供全新研究平台。实验步骤 -01- 毛囊类器官构建首先将上皮细胞与间充质干细胞分别悬浮于含2%（v/v）基质胶的DMEM/F-12培养基，接种于非粘附性圆底96孔培养板。体系经4℃预冷30分钟完成初始定位后，转移至37℃、5% CO₂培养箱中启动3D自组装过程。培养3天后，通过梯度转移策略将形成的毛囊样前体转移至基质胶富集环境：使用纯基质胶重悬后注入35 mm非粘附培养皿，经20天动态培养后获得成熟类器官。发育进程显示，第4天可见典型毛囊芽结构形成，至第23天毛干长度达3 mm。组织学对比证实，类器官在毛球3D构象、毛干角蛋白沉积模式等核心形态指标与天然毛囊保持高度一致性。毛囊类器官制备示意图-02- 毛囊类器官培养优化为了进一步优化毛囊形成，本文研究了可能影响毛囊发芽的几个因素，例如添加Matrigel的时间、两种细胞类型的混合比例、总细胞数以及第一步Matrigel的浓度。毛囊发芽对补充 Matrigel 的时间敏感。当播种后 0 至 6 h时观察到旺盛的发芽，但当超过 15 h时，在细胞形成哑铃形 HFG 的地方几乎没有观察到发芽。结果与我们的预期相反。由于细胞聚集对于诱导 EMI 至关重要，因此我们预计最好在细胞充分聚集后添加 Matrigel。在形成致密和压实的骨料之前，必须补充 Matrigel。这些结果表明，基质胶成分（如 ECM）在细胞之间的参与可能对于诱导核壳聚集和随后的毛囊发芽至关重要。在接下来的实验中，在细胞接种（0 小时）后立即加入Matrigel，并将培养物在 4°C 下保存 30 min。两种细胞类型的混合比例显著改变了发芽，当上皮细胞和间充质细胞的混合比相等时，发芽数达到峰值。通过以恒定混合比例增加细胞总数（上皮细胞和间充质细胞，1：1）来增加发芽数 。毛囊类器官构建时序特征培养 10 天后在生成的毛囊中观察到毛囊和周围组织的典型细胞标志物，包括脂肪组织标志物油红 O、直肠菌毛肌标志物 α 平滑肌肌动蛋白 （α-SMA）、毛囊干细胞标志物 CD34  和 Sox9 、基底角质形成细胞标志物 K5 、增殖细胞（毛基质细胞）标志物 Ki67 、真皮细胞标志物 versican、黑素体标志物gp100和酪氨酸酶相关蛋白 1 （TRP1）和黑素细胞干细胞标志物 c-Kit。生成的毛干具有毛干特定的特征，包括毛干角质层和髓质。在毛干的横截面中观察到毛质层和黑色素颗粒，与天然毛干中的相似。毛囊类器官及其毛干-03-  毛囊萌发信号转导与色素沉着Wnt信号通路作为胚胎发育的核心调控机制之一，在毛囊形态发生与分化过程中发挥关键作用。实时定量PCR阵列分析显示，基质胶培养体系内Apc、Axin1、Lef、Lrp5及Wnt10b等关键信号分子表达显著上调。该结果证实毛囊类器官成功模拟胚胎期毛囊发生的生物学特征。α-黑素细胞刺激激素（α-MSH）通过激活黑素细胞特异性酪氨酸酶活性，诱导皮肤及毛囊内黑素体的合成与转运。经α-MSH处理的毛囊类器官呈现深黑色毛干表型，总黑色素含量较对照组显著升高。结果表明毛囊类器官具备关键生理功能特征。毛囊类器官毛囊萌发机制与黑色素沉积参考文献：Kageyama, T., Shimizu, A., Anakama, R., Nakajima, R., Suzuki, K., Okubo, Y., & Fukuda, J. (2022). Reprogramming of three-dimensional microenvironments for in vitro hair follicle induction. Science Advances, 8(42), eadd4603.供稿 | 王   健编辑 | 吴   琰END免责声明：本文仅作知识交流与分享及科普目的，不涉及商业宣传，不作为相关医疗指导或用药建议。文章如有侵权请联系删除。OTC2025论坛深度聚焦类器官与疾病建模、新药发现/研发、3D细胞培养、类器官培养及质控。展位咨询请联系：王晨 180 1628 8769。戳“阅读原文”立即领取OTC2025免费参会名额!

摘要:生物反应调节剂疗法已被证明是当前时代管理癌症的重大进步。信使RNA（mRNA）在癌症免疫疗法中的使用因其能够刺激产生针对特定目标的抗体（Abs）而获得广泛接受。基于mRNA的疫苗旨在产生对抗癌症和相关状况的蛋白质。这些疫苗提供了显著的优势，如高效率、针对性作用、降低毒性、易于制造和方便管理，使它们优于已建立和传统的疫苗。基于mRNA的疫苗在预防COVID-19感染和其他类似状况方面表现出色。近年来，已进行了许多临床试验来评估mRNA疫苗在各种类型癌症患者中的有效性。然而，迄今为止，全球没有任何监管机构批准mRNA疫苗，无论是作为单独治疗还是作为癌症管理的辅助治疗。这主要是因为与mRNA的变异性和递送效果不佳相关的挑战，这阻碍了这项技术的广泛应用。为了解决这些问题，多年来对mRNA的结构和管理方法进行了重大修改。本综述将提供当前mRNA疫苗及其在癌症免疫疗法中递送的最新发展和改进的概述，以及需要解决的挑战和监管障碍，以便临床使用。它还将强调优化基于mRNA的疫苗的方法，以有效和成功地治疗癌症。 1.引言 免疫接种是全球健康最重要的进步之一，有助于延长人类寿命。天花的根除以及脊髓灰质炎和麻疹病例的显著减少是免疫领域的主要里程碑。虽然活减毒或灭活的传统疫苗已证明对各种感染有效，但它们不适用于癌症等非传染性疾病。传统疫苗的替代方法是核酸治疗，特别是基于DNA或RNA的疫苗。这些疫苗通过促进细胞内蛋白质翻译来刺激免疫反应，使它们成为一种免疫疗法。由于其非传染性、无污染以及对预防和治疗的良好耐受性，核酸衍生的疫苗受到青睐。尽管DNA和RNA疫苗具有相似的特性，但RNA疫苗提供了额外的好处。首先，它们不整合到基因组中，其次，它们只需要穿过质膜，而DNA疫苗必须穿过核膜。最近，在严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）大流行期间，mRNA疫苗受到了极大关注，展示了它们的治疗潜力并促进了基于mRNA的治疗。然而，mRNA疫苗的历史可以追溯到1961年，当时由Brenner等人首次发现。随后在小鼠中的研究表明，未配方的mRNA的肌肉内给药在几天内导致编码蛋白的表达。这些研究提供了证据，即遗传信息可以通过体外转录的mRNA传递，无需任何载体，消除了对mRNA体内不稳定的猜测。除了替代缺失的蛋白质外，还已证明mRNA可以方便地向抗原呈递细胞（APCs）提供所需的抗原信息。1995年，第一项临床前研究揭示了mRNA疫苗的抗癌效果。迄今为止，研究和开发已经为mRNA治疗的新候选者产生了期望。表5.1中简要概述了mRNA疫苗的演变。在本章中，我们将讨论mRNA疫苗的机制以及它们作为有利的癌症免疫疗法所提供的机会和挑战。 2.mRNA疫苗如何工作？ 开发mRNA疫苗的过程涉及对基因进行测序，并将基因复制成来自感兴趣病原体抗原的模板链。然后是体外转录mRNA及其进入人体。宿主细胞机制随后将疫苗中的mRNA翻译成相应的抗原。当实际病毒感染在感染者中引发免疫反应时，这个过程自然发生。从虚拟序列设计、合成、递送mRNA疫苗到体内测试，它成为一种简单有效的治疗选择。Richner等人在2017年开发的寨卡mRNA疫苗也显示出增强的中和能力、最优的密码子使用和减少的非预期交叉反应性，这是一个额外的优势。图5.1详细描述了mRNA疫苗的机制。 图5.1 mRNA疫苗的作用机制。注：mRNA疫苗在树突状细胞（DCs）中的多步骤作用机制如下：(1) 抗原呈递细胞，如DCs，摄取mRNA疫苗。(2) 通过内吞作用促进mRNA疫苗的摄取。(3) mRNA从递送系统中释放到细胞质中。(4) mRNA随后被翻译成蛋白质。(5) 这种蛋白质在细胞外释放，并作为邻近细胞的外源性抗原。(6) 细胞溶胶中翻译的蛋白质被蛋白酶体处理以释放肽段。(7) MHC类I表位在内质网中处理。(8) 细胞表面的MHC类I上的抗原呈递激活CD8+ T细胞。(9) 抗原呈递细胞摄取外源性蛋白质。(10) 这种摄取通过内吞作用过程发生。(11) 细胞外蛋白质被摄取用于MHC类II表位处理。以及(12) 细胞表面的MHC类II呈递激活CD4+ T细胞，并共同激活B细胞产生特定抗体。[MHC：主要组织相容性复合体；CD4：分化群4；CD8：分化群8]。 2.1.mRNA疫苗诱导先天免疫反应 病原体相关分子模式（PAMPs）被模式识别受体（PRRs）检测到，最终导致宿主免疫机制的激活。在人体中施用mRNA后，宿主身体通过位于抗原呈递细胞（APCs）上的Toll样受体（TLRs）识别疫苗作为外源物质或PAMPs。具体来说，TLR3、TLR7和TLR8负责识别来自细胞质、内质网和细胞膜等不同部位的PAMPs，最终引发免疫反应。TLR3受体能够识别由单链RNA（ssRNA）形成的双链RNA（dsRNA），从而激活Toll/白细胞介素-1受体（TIR）结构域含适配器诱导干扰素-β（TRIF）途径，随后增加干扰素类型I（IFN-I）和干扰素-γ诱导蛋白10（IP-10）的表达。TLR7受体能够识别ssRNA和dsRNA，而TLR8仅与ssRNA结合。因此，TLR7刺激B细胞反应。疫苗中注入的mRNA被APCs上的TLRs识别，通过激活髓样分化初级反应88（MYD88）途径和增加IFN-I反应的释放来启动免疫反应。mRNA注射后抗原表达的早期关闭可能因PRRs的激活而变得有害。细胞质中还含有不同组的PRRs，它们特别区分非自身mRNA与自身mRNA。这些包括视黄酸诱导基因（RIG）-I和黑色素瘤分化相关蛋白5（MDA5），它们感应dsRNA并激活信号级联反应。当RIG-I和MDA5被激活时，它们都招募线粒体抗病毒信号蛋白（MAVS），最终导致核因子κB（NF-κB）和IFN-I的表达增加。炎症体是负责caspase-I活性和白细胞介素-1β（IL-1β）激活的生化复合物。由核苷酸结合寡聚化结构域（NOD）样受体（NLR）诱导的炎症体形成，导致IL-1β的产生，并触发凋亡过程。随后，释放的IFN-I调节旁分泌效应，并通过IFN刺激基因向邻近细胞发出抗肿瘤状态信号。 2.2.mRNA疫苗诱导适应性免疫反应 对于针对癌症的基于mRNA的疫苗，治疗效果预期来自抗肿瘤T细胞。树突状细胞（DCs）吸收疫苗中的mRNA，然后将其翻译，相应的抗原-主要组织相容性复合体（MHC）I/II复合物在细胞表面呈现（图5.1）。这些激活的DCs随后进入淋巴结，通过与T细胞上的CD8+/CD4+（分化簇）受体结合MHC I/II复合物，激活T细胞，导致T细胞的克隆扩增（图5.2）。肿瘤细胞释放趋化因子（CC）如CC配体（CCL）5和CC受体7（CC-7）以吸引细胞因子、穿孔素和颗粒酶。趋化因子还吸引激活的T细胞到肿瘤组织。细胞毒性T细胞由MHC I/II分子激活，它们通过直接破坏目标细胞来作用于目标细胞。体细胞突变产生的新表位作为肿瘤衍生的肽段。这些新表位被认为是癌症疫苗（CVs）的良好候选者，因为一旦它们与MHC分子结合，T细胞就能识别它们。 图5.2 mRNA疫苗激活适应性免疫反应的主要机制。注：为了在发展或进展期间刺激适应性免疫，疫苗需要一个病原体特异性免疫原以及一个佐剂。佐剂刺激适应性免疫反应，并为T细胞和B细胞的激活和增殖提供必要的第二信号。含有疫苗mRNA的树突状细胞（DCs）进行翻译以产生MHC I或II。然后它们迁移到淋巴结，在那里它们通过与T淋巴细胞表面的CD8+或CD4+复合的MHC-I或II分子，将mRNA分子呈递给T细胞。这导致T细胞的激活和增殖。激活的T细胞释放各种细胞因子、颗粒酶和穿孔素，这些因子负责杀死肿瘤细胞，而B细胞则产生针对目标细胞的抗体。 3.mRNA疫苗在临床前和临床环境中的进展 有效的疫苗应该将选定的抗原传递给宿主并启动免疫反应。这强调了选择适当的抗原纳入疫苗的重要性。抗原的类型在小节中讨论。 3.1.肿瘤相关抗原（TAAs） 在CVs的情况下，针对能够引发期望免疫原性的特定抗原至关重要。需要注意的是，这种抗原主要在癌细胞中表达，而不是在健康细胞中。虽然许多TAAs对癌症和正常细胞都是常见的，但它们在肿瘤细胞中过表达。然而，必须小心，因为这种抗原可能在负选择期间诱导耐受性，克服这种耐受性可能导致自身免疫疾病。例如，一个肿瘤胎儿抗原可能已经诱导了耐受性，并可能阻碍对TAAs的免疫反应。理想情况下，一个非突变的TAA能够引发T细胞反应将是一个合适的选择，但最近的临床试验显示TAAs的成功率有限。TAAs可以分为以下几类: 肿瘤精子细胞抗原（癌症/睾丸抗原（CTA））：通常发现在精子细胞上[黑色素瘤抗原基因（MAGE）、癌症/睾丸抗原G抗原（GAGE）、B黑色素瘤抗原（BAGE）、纽约食管鳞状细胞癌-1（NY-ESO-1）]。 分化抗原：在与肿瘤相同谱系的细胞上发现[酪氨酸酶相关蛋白1（TRP-1）、糖蛋白100（gp100）、T细胞识别的黑色素瘤抗原1（MART-1）、B淋巴细胞抗原CD20（CD20）]。 肿瘤胎儿抗原：在胎儿和胚胎组织中发现[甲胎蛋白、癌胚抗原（CEA）]。 过表达抗原：在癌细胞中上调的正常发现蛋白[前列腺特异性抗原（PSA）、野生型p53、人表皮生长因子受体-2（HER2/neu）、表皮生长因子受体（EGFR）]。癌症/睾丸抗原（CTA）在多种组织学起源的人类肿瘤中表达，但在正常组织中不表达，除了睾丸和胎盘。因此，识别仅在肿瘤细胞中发生，而不改变非癌细胞，因此，它不会引起任何自身免疫反应或疾病。 3.2.肿瘤特异性抗原（TSAs） 癌症疾病的特征是细胞中发生的突变。因此，每次突变都可视为潜在的治疗靶点。突变限于非正常或癌细胞，即肿瘤细胞。肿瘤特异性抗原（TSAs），也称为新抗原，特异于肿瘤细胞并且具有较低的耐受性。TSAs的发现使得针对特定抗原的CVs的开发成为可能。这也证明了在癌症治疗中使用肿瘤浸润性淋巴细胞（TIL）输注的合理性。据估计，只有10%的突变会导致具有更高结合MHC能力的突变肽。此外，这些高亲和力肽中只有1%能被癌症患者的T细胞检测到。除了它们的低耐受性外，TSAs还具有显著的突变水平，这对于肿瘤生长至关重要。针对这些蛋白质将提供双重益处。TSAs也被认为是免疫优势表位。例如，一项研究表明，与识别共享抗原的CD8+ T细胞相比，针对突变新抗原的CD8+ T细胞在黑色素瘤患者中主导了免疫反应。TSAs可以进一步分类，如研究中提出的： i. 突变TSA（mTSA）：源自典型基因的DNA序列。 ii. 异常表达的TSA（aeTSA）源自癌症特异性表达的未突变非典型转录本，这些转录本在正常组织中未观察到。TSAs为患者提供个性化治疗，但这种方法可能成本高昂且耗时。然而，组学技术的持续发展和进步将进一步减少与使用TSAs的定制治疗相关的时间和成本。 4.当前进展和新视角 目前，癌症是mRNA基础治疗最有希望的领域之一。在癌症的总试验数量中，近一半集中在黑色素瘤、脑肿瘤和前列腺癌。这些试验大多处于研究的早期阶段，由于缺乏癌症的基准治疗方案，无法评估疫苗的有效性。几个临床前研究（表5.2）和mRNA编码TAAs（表5.3）、TSAs（表5.4）以及以DCs为载体的mRNA疫苗（表5.5）的临床试验的表格视图如下所示。 5.mRNA癌症疫苗的递送载体 在开始递送系统之前，讨论mRNA及其衍生疫苗结构（图5.3）的基本结构是必要的，详细信息在裸RNA部分提供，尽管mRNA疫苗不需要核穿透，但它必须穿越电子负性的磷脂双层膜才能到达细胞质。实现mRNA疫苗的有效进入是一个关键且具有挑战性的任务。当给药时，裸露的mRNA被宿主免疫迅速识别为外源性核酸，并迅速被核酸酶降解，最终降低疫苗效力。大约1,000道尔顿大小的分子可以通过被动运输轻松穿过脂质膜。然而，裸露的mRNA尺寸要大得多，因此需要载体穿过并进入目标细胞的膜。因此，翻译与降解的比率保持在较低水平。注射裸露的mRNA疫苗还可能引起炎症和不期望的免疫反应。化学修饰和载体介导的递送显著延长了货架寿命和翻译潜力，例如通过脂质衍生和聚合物衍生材料增强RNAs的细胞摄取。疫苗中的mRNA可以通过病毒和非病毒载体递送，如图5.4所示。在本章的以下部分，我们将讨论疫苗中mRNA递送的各种方法。 图5.3 mRNA的示意图结构。注：结构从5'帽开始，它作为保护剂防止外切酶切割。紧接着是5'非翻译区（UTR），它参与翻译过程的启动。接下来是开放阅读框架（ORF），即被翻译成蛋白质的片段。之后是3'非翻译区（UTR），它参与翻译过程的终止。最后是3'聚A尾，它在mRNA的稳定性中起作用。 图5.4 用于mRNA疫苗递送的各种载体。注：该图展示了用于mRNA疫苗递送的多种载体。第一种载体是裸露的mRNA，由5'帽、5'和3'非翻译区（UTR）、开放阅读框架（ORF）段和聚A尾组成。第二种载体涉及基因改造病毒作为载体将mRNA运输到细胞质中。第三种载体是基于聚合物的递送系统，使用聚乙烯亚胺（PEI）和聚β氨基酯（PBAEs）等聚合物。第四种载体是脂质基载体，这是最常用的方法，其中利用脂质体纳米颗粒或脂质体复合物来促进递送。第五种载体是脂质-聚合物混合纳米颗粒，结合脂质和聚合物形成聚合物矩阵和层状脂质结构。最终的载体是基于肽类的，使用如精氨酸作为mRNA递送的载体。 5.1.裸mRNA 裸mRNA疫苗（图5.3）是通过将它们配制在缓冲液中并直接注射到体内来递送的。mRNA扩散的机制尚不清楚，因为它们不能穿过细胞内膜。最初，人们提出内部化是通过微囊泡作用发生的。其他研究表明，内部化是由机械力促进的，如静水压力。膜的破坏允许mRNA渗透到细胞质中。通过肌肉内（IM）、皮下（SC）和皮内注射（ID）给药的裸mRNA已被证明是有效的。然而，通过SC给药的高效翻译已经得到证实，这消除了对载体的需求并降低了成本。SC给药的mRNA诱导了细胞和体液免疫，提供了额外的优势。裸mRNA强烈刺激TLR和蛋白激酶受体（PKR）。裸mRNA的降解强调了更好地工程化递送系统以保护mRNA和屏蔽其电荷的需求。在最近的一项I期临床试验中，研究了个体化肿瘤突变签名，在III/IV期黑色素瘤患者中为每个患者选择了10个新表位。试验观察到只有8%的患者完全反应，另有8%的部分反应（NCT02035956）。另一项I期试验研究了TAAs，如酪氨酸酶和gp100，在切除的黑色素瘤患者中。疫苗在40%的低剂量患者和33%的高剂量患者中诱导了免疫反应（NCT03394937）。 5.2.病毒载体 mRNA疫苗递送利用基因修饰的病毒作为载体。基因部分或完全修饰，如模型或治疗基因。优势在于RNA病毒的复制发生在细胞质中，其中正RNA链可用于翻译感兴趣的蛋白。用于mRNA递送的病毒包括阿尔法病毒、小RNA病毒和黄病毒。然而，阿尔法病毒有时可能导致细胞病理效应，这可以通过战略性修改来克服。免疫原性、细胞毒性和基因组整合的发生代表了病毒载体的重大缺点，强调了开发非病毒载体进行mRNA递送的需求。 5.3.基于聚合物的载体 聚合物是能够递送mRNA疫苗并提供保护以防止mRNA降解的功能材料。目前，聚酰胺胺（PAA）、聚β氨基酯（PBAEs）和聚乙烯亚胺（PEI）等聚合物被用作递送系统。PEI是第一个被证明能够将DNA递送到小鼠大脑中的聚合物，突出了其作为递送载体的效率。使用PEI的配方通常是通过直接混合RNA溶液和PEI溶液来准备的。例如，含有编码HIV gp120的mRNA的PEI配方通过鼻内接种，在小鼠中诱导了针对人类免疫缺陷病毒（HIV）感染的特异性抗体。PEI也被证明是体外转染和体内效力的mRNA载体。然而，其潜在的毒性和不良反应阻碍了其发展。另一种选择是聚酰胺胺（PAMAM），这是一种带正电荷的聚合物，通过肌肉注射携带针对弓形虫、埃博拉病毒和H1N1流感病毒的基于mRNA的疫苗显示出前景。除了阳离子聚合物，阴离子聚合物如聚D,L-乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）也被用作多项研究中的载体。然而，带负电荷的mRNA分子不能有效地适应阴离子聚合物，因此添加阳离子脂质材料以实现脂质-聚合物混合配方。虽然聚合物已被发现是有用的递送载体，但结构和生物活性之间的相关性尚未令人满意。这一领域的研究继续集中在具有改进的生物可降解性和高效递送的新候选策略上。 5.4.基于脂质的载体 非病毒载体，如基于脂质的载体，是最受欢迎的载体。合成和天然脂质都可以用来有效地递送mRNA，无论是通过形成脂质体复合物还是脂质体纳米颗粒（LNP）。脂质通常由三个主要部分组成：头部、连接体和尾部。尾部是疏水性的，而头部是亲水性或极性的。 5.4.1.脂质体复合物 脂质体是由外层磷脂层组成的球形结构。脂质有一个头部和一个尾部，这两个相反极性组分之间的相互作用促进了囊泡的形成。这导致形成了一个含有感兴趣基因的水环境的核心的囊泡。最初，阳离子脂质体被用作mRNA疫苗的递送材料。带正电荷的阳离子脂质和带负电荷的mRNA通过静电相互作用形成聚集体，这些多层囊性复合物被称为脂质复合物。脂质复合物使RNase难以降解封装的mRNA。然而，由于可能与体液中的负电荷分子阻碍，也可以观察到递送效果不佳。当以1:1的比例使用时，像1,2-二油酰-3-三甲基铵丙烷（DOTAP）和二油酰磷脂酰乙醇胺（DOPE）这样的聚合物有效地转移了HIV-1抗原Gag的核酸，成功地在小鼠中诱导了抗原特异性反应。在黑色素瘤患者的I期临床试验中，脂质复合物配方在至少75%的受试者中展示了免疫反应（NCT02410733）。另一项针对Claudin-6（CLDN6）的临床研究显示，所有患者中嵌合抗原受体（CAR）-T细胞的植入。 5.4.2.脂质体纳米颗粒（LNPs） 最初作为siRNA载体使用的LNPs是核酸治疗或mRNA疫苗的知名递送系统。LNPs是通过使用带正电的脂质、胆固醇和聚乙二醇（PEG）的双层壳以及放置目标mRNA基因的水核心形成的。LNPs的设计必须确保快速代谢和消除，以防止组织积累。LNPs的优势在于能够一起封装多个mRNA目标基因和免疫刺激剂，以增强整体免疫原性。在胃肠癌患者上进行的1/2期试验研究表明，针对新抗原特异性mRNA的四分之三（75%）患者发展了针对预测的突变特异性新表位的CD4+和CD8+ T细胞反应（NCT03480152）。另一项涉及针对实体瘤的个性化CV编码多个新抗原的LNPs配方的研究显示了可检测的新抗原T细胞反应（NCT03313778）。 5.4.3.脂质-聚合物混合纳米颗粒（LPNs） 脂质-聚合物混合纳米颗粒（LPNs）已证明在体内有效治疗转染和体外siRNA功能转染。这种混合配方通过疏水性、范德华力和静电相互作用展现热力学稳定性。聚己内酯、聚乳酸和PLGA是LPNs配方中常用的聚合物。DOTAP、卵磷脂、1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-（DSPE）和PEG是LPNs常用的脂质。LPNs的关键组成部分是层状脂质结构和聚合物基质核心。核酸嵌入在核心和冠层中。基于脂质的载体克服了诸如mRNA稳定性问题的各种障碍，得益于它们与细胞膜的高融合能力、长循环时间、内体逃逸和生产的可扩展性。然而，挑战在于由于它们的炎症性质可能导致的潜在副作用。未来的研究将有助于克服这些不足。 5.5.基于肽的载体 已有多种肽用于mRNA疫苗的递送。通常，带正电的肽作为mRNA递送的主要载体。赖氨酸和精氨酸残基的存在赋予了正电荷，并促进了与带负电的mRNA的静电相互作用，形成了一个基质。精蛋白，一种阳离子肽，被广泛用作众多实验中mRNA递送的载体。精蛋白提供两个优势：首先，它保护mRNA免受RNase的降解，从而增强其体外稳定性；其次，它具有佐剂活性，由于其与浓缩的病毒基因组的相似性，激活TLR7。精蛋白还在波动的储存条件下保持稳定。研究表明，精蛋白能够保护狂犬病病毒糖蛋白编码的mRNA在较高温度下长时间保持稳定。然而，mRNA-精蛋白复合物的可行性受到质疑，因为一项研究表明，当含有β-半乳糖苷酶的复合物注入胶质母细胞瘤肿瘤时，翻译效果不佳。目前，精蛋白仍然是唯一作为载体在mRNA疫苗临床试验中被评估的肽。尽管患者耐受性良好，但它未能引起预期的宿主免疫反应。在转移性去势抵抗性前列腺癌（PC）的临床试验中，使用精蛋白作为载体递送mRNA抗原没有显示出无进展生存期（PFS）的显著差异（NCT01817738）。另一项非小细胞肺癌（NSCLC）的1期研究表明，84%的患者检测到抗原特异性免疫（NCT01915524）。 6.当前给药途径 mRNA疫苗的效力、稳定性和安全性在很大程度上取决于给药途径，除了它们的组成。疫苗可以通过系统给药或局部应用。对于某些疾病，可能更倾向于特定的给药途径。例如，肝脏疾病可以通过静脉（IV）、肌肉内、皮下或腹膜内给药，而肺部疾病需要鼻内或气管内途径。最终，有效地递送到引流淋巴结至关重要。这是因为更多的免疫细胞存在，使得mRNA容易被抗原呈递细胞（APCs）通过微囊泡作用摄取，导致免疫反应。在小节中描述了各种给药途径。 6.1.静脉（IV）注射 mRNA在IV注射后被运输到淋巴结。一旦mRNA进入淋巴结，免疫系统被激活，随后通过糖基化依赖的相互作用成熟DCs，增强抗原呈递。肿瘤坏死因子（TNF）-α的增加也导致DCs迁移到淋巴结，最终导致激活标记CD69的上调，支持免疫反应。 6.2.皮内（ID）注射 由于表皮层存在抗原呈递细胞（APCs）如朗格汉斯细胞和真皮层的树突状细胞（DCs），因此更倾向于通过ID途径注射mRNA。ID注射后，mRNA最初在局部表达。在小鼠耳朵的耳垂中注射含有珠蛋白未翻译区域（UTR）稳定的荧光素酶编码mRNA后，大约17小时后观察到亮度峰值。这种亮度在3天后仍然可以检测到，表明适当地激活了免疫反应。 6.3.皮下注射（SC） 皮下注射将mRNA疫苗输送到皮肤下的皮下组织区域，该区域由松散的脂肪组织和较少的免疫细胞组成，与真皮层相比。松散的脂肪组织允许比ID层更大的注射体积，从而减少疼痛但降低了穿透率。 6.4.肌肉注射（IM） 由于注射体积可调且注射部位反应风险降低，肌肉注射（IM）途径是疫苗的首选给药途径。含有佐剂的疫苗会在注射部位引起炎症，最终导致免疫细胞的招募和激活。通过此途径给予的mRNA疫苗首先被局部肌细胞吸收，并通过T细胞最终产生免疫反应。IM注射的体积高于ID途径，并且与ID或SC途径相比，其不良反应较少。 6.5.淋巴结内注射（IN） 当mRNA直接注入外周淋巴器官时，抗原呈递细胞（APCs）与激活的T细胞或B细胞之间会立即发生相互作用。因此，鼻内（IN）注射是APCs直接吞噬mRNA的更有效途径。然而，IN注射是一个复杂的过程，需要在人类中使用超声引导，限制了其使用。尽管SC或肌肉注射（IM）被认为是mRNA CVs最受欢迎和安全的两种途径，但人们还必须考虑IV给药可能引起的潜在毒性。尽管如此，IN或鼻内途径现在被广泛研究用于mRNA疫苗的输送。与ID注射相比，使用TriMix作为佐剂的OVA mRNA通过IN注射引起了显著更高的体内由抗原特异性T细胞介导的细胞毒性。 6.6.肿瘤内注射 mRNA CV的肿瘤内给药是一种非传统途径。肿瘤内给药的mRNA疫苗编码IL-23、IL-36和OX40L显示出比ID或皮下（SC）给药更好的抗肿瘤活性，但效果也取决于给药频率。表5.6提供了各种给药途径优缺点的简要讨论。 7.mRNA基础癌症疫苗的当前趋势和挑战 许多CVs的临床试验一直在进行中。美国食品药品监督管理局（USFDA）已经批准了三种显示出治疗效果的CVs。这些包括用于非肌层浸润性膀胱癌的含有活减毒牛分枝杆菌疫苗、用于转移性去势抵抗性前列腺癌的DC疫苗，以及用于晚期黑色素瘤的溶瘤性单纯疱疹病毒疫苗。mRNA疫苗的开发受到内在和外在因素、肿瘤异质性、HLA和肿瘤微环境（TME）的影响。稳定性和有效性等内在因素可以通过完善mRNA结构和序列、增强制备和纯化技术以及改进给药方法来提高。 另一个重要方面是不同地理人群中HLA等位基因的多态性导致的HLA异质性。因此，新抗原的生产仍然是实现更强大、更具体效果的关键焦点，同时最小化不良反应。然而，存在某些限制阻碍了新抗原的发展。克服这些限制可以加快mRNA疫苗的实现： 1.抗原数量有限：肿瘤包含许多突变，但只有少数符合抗原的要求。选择特定的突变变得重要，因为它们主要发生在非编码区域。因此，这个领域的研究变得至关重要。 2.筛选方法：疫苗生产的另一个障碍是筛选新抗原的方法稀缺。机器学习和生物信息学领域的最新发展可能有助于解决这一挑战。 3.制备和给药：除了有不同的给药方法外，这仍然是一个挑战，尤其是对于核酸疗法。 4.肿瘤的异质性特征：每一步进化中突变的差异使得疫苗的开发变得困难。 肿瘤细胞产生TGF-β，这可以将效应T细胞转化为调节性T细胞（TRegs），最终抑制肿瘤中浸润的其他效应T细胞。Tregs可以表达CD4和CD25，从而在TME中抑制细胞毒性T淋巴细胞（CTL）。这导致对肿瘤免疫的抑制。TME中存在如CD4+ Tregs和抑制性CD8+ T细胞等免疫抑制细胞，促进大量可溶性免疫抑制因子如TGF-β、IL-10和血管内皮生长因子（VEGF）释放到微环境中。 基于免疫的mRNA疫苗的开发利用了与佐剂或免疫检查点抑制剂（ICIs）结合的概念。因此，CVs的当前趋势旨在以更具体的方式优化抗癌活性，并通过结合mRNA疫苗和ICIs或向mRNA疫苗中添加佐剂同时减少毒性。有时，mRNA疫苗不能产生所需的适应性免疫反应，导致耐受而不是免疫反应。在mRNA疫苗中添加佐剂有助于在注射部位引流免疫细胞。将佐剂与mRNA疫苗结合的策略特别有助于老年癌症患者，因为老年DCs对刺激产生炎症反应的能力降低。 慢性炎症还会导致共刺激受体CD28的表达减少，从而导致免疫反应降低。mRNA疫苗广泛研究的一种佐剂是PAMPs，它通过如TLRs和NLRs等PRRs刺激免疫反应。TLR和NLR的配体已被证明作为疫苗佐剂是有效的，最终增强免疫反应。在小鼠肿瘤模型中，使用TLR3、TLR7和TLR9激动剂作为疫苗佐剂展示了由抗原特异性CD8+ T细胞介导的强大免疫反应。涉及环状GMP-AMP合成酶和干扰素基因刺激因子（STING）的cGAS-STING途径在免疫系统中扮演着至关重要且新颖的角色。将STING激动剂与其他癌症免疫疗法共同给药的临床前研究，如CVs和ICIs（如抗程序性死亡1（PD-1）和细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4（CTLA-4）抗体）以及过继T细胞转移疗法，已显示出有希望的结果。目前，一项早期临床试验正在进行中，以评估ADU-S100和MK-1454与ICIs在晚期/转移性实体瘤或淋巴瘤患者中的组合。另一方面，细胞因子也可以作为佐剂。例如，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）在临床前设置中已被证明能有效招募DCs到注射部位。然而，在临床设置中，它产生了令人失望的结果。通过直接注射给药的mRNA疫苗已被证明是最具成本效益的方法。然而，mRNA疫苗也可以通过各种途径成功给药，如ID、肌肉内（IM）、鼻内（IN）、静脉内（IV）和鼻内给药。在黑色素瘤患者中进行的mRNA疫苗的初始临床试验涉及裸RNA的给药，但未能证明其有效性。在I期试验中成功研究的自佐剂RNActive®疫苗利用了CureVac开发的一项新技术。与传统疫苗生产相比，mRNA疫苗的生产方法更简单，但它缺乏制造框架。总结过程，它可以被分为上游处理，涉及mRNA的酶促生成，以及下游处理，包括纯化、LNP形成和填充到最终产品。一旦mRNA产品生成，就需要纯化，因为反应混合物含有酶、残留的核苷酸三磷酸（NTPs）和DNA模板。去除杂质至关重要，因为它们可能会阻碍mRNA疫苗的效率。例如，使用反相高效液相色谱（HPLC）纯化修饰的mRNA导致蛋白质生产效率提高了10-1000倍。mRNA疫苗的制造过程包括三个步骤：合成、纯化和配方。具体来说，体外转录（IVT）的DNA模板储存在-20°C。然后在相同温度下生产、纯化和测试mRNA。随后与LNPs配方，并装入小瓶。整个过程需要在受控条件下运输，这对mRNA疫苗的大规模生产构成了挑战。连续制造可以通过重复使用酶等原材料来帮助实现成本效益生产。mRNA在构象上比DNA更灵活。分子内转酯化作用，即核糖的2'-羟基团断裂磷酸骨架，最终导致链断裂。因此，大多数mRNA疫苗配方需要在冻干条件下储存。根据研究结果，冻干自扩增RNA在4°C下保持稳定10个月。含有RNA的冻干LNP在4°C下保留了21个月的生化特性。由于缺乏数据，可以用来估算mRNA疫苗稳定性的LNPs包含小干扰RNA（siRNA）的热稳定性数据。体外研究表明，LNP复合物在2°C下保持稳定5个月。对含有不同冻干保护剂的冻干LNP-mRNA与不含mRNA的新鲜LNPs进行了比较研究。结果显示，在体内和体外研究中都有mRNA表达，但未建立机制基础。因此，冻干过程是实现稳定产品的重要考虑因素。或者，也可以考虑喷雾干燥、真空干燥或超临界流体干燥。 8.mRNA癌症疫苗的监管障碍 mRNA疫苗的开发是一段跨越近30年的漫长旅程。然而，直到20年前，这些疫苗才进入临床阶段。延迟向公众提供这些疫苗的主要原因包括反应原性或免疫原性不良反应、大规模生产和严格的监管要求。在mRNA疫苗在预防SARS-CoV-2感染方面取得显著的临床结果之后，开发针对其他疾病的新型mRNA疫苗的努力达到了顶峰。mRNA COVID-19疫苗的证明效果促使国际卫生机构加快监管流程，加快指导文件的发展，世界卫生组织（WHO）在这方面发挥了领导作用。 信使核糖核酸(CVs)疫苗的监管障碍在很大程度上与其他疫苗相似。这些包括确保辅料和佐剂的质量、保持统一的生产流程、进行临床前评估以确保安全性和有效性，以及开展临床试验和市场批准后的长期不良反应监测。尽管预计基于信使核糖核酸的疫苗的监管审批流程在不久的将来将保持一致，但重要的是要注意，信使核糖核酸疫苗属于免疫原的广泛类别。因此，有几项严格的监管指南专门针对产品的起始材料质量、一致性、安全性和有效性。在从动物测试过渡到人类测试时，考虑可能影响的监管方面至关重要，特别是考虑到信使核糖核酸疫苗开发中涉及的新技术。另一个挑战在于RNA的热稳定性，这影响了疫苗的开发。对冷链运输和储存的要求限制了信使核糖核酸疫苗的使用，特别是在第三世界国家。 在2021年10月举行的世界卫生组织(WHO)生物标准化专家委员会第74次会议上，委员会发布了一份名为“评估信使核糖核酸疫苗的质量、安全性和有效性以预防传染病：监管考虑”的文件。该指导文件强调了信使核糖核酸疫苗的生产和控制的技术要求，包括起始材料、原材料和辅料；流程开发和过程控制；产品特性；生产的一致性；原料纯化信使核糖核酸（药物）和最终配制疫苗（产品）的生产和控制，以及所有相关记录。因此，所有流程和生产记录也是监管考虑的一部分。如果对流程或组成进行任何更改，它们需要再次在临床前研究中进行测试。需要进行非临床评估以证明概念和安全研究。还需要参考其他几个指导文件，这些文件是任何疫苗的共同规定，即世界卫生组织关于疫苗非临床评估的指南、关于疫苗佐剂和佐剂疫苗的非临床评估指南，以及关于疫苗临床评估的指南：监管期望。 “关于疫苗佐剂和佐剂疫苗的非临床评估指南”为疫苗中使用的佐剂提供了非常具体的指导，这也适用于信使核糖核酸疫苗。这些考虑主要侧重于用于非临床药理学研究、非临床毒理学研究和首次人体临床试验的生产、特性和质量保证批次。它们还涵盖了使用佐剂的理由、选择非临床评估疫苗佐剂和佐剂疫苗的动物种类、动物的非临床安全评估，以及首次人体临床试验的考虑。 信使核糖核酸疫苗的非临床评估包括药理学/免疫学/概念验证研究和动物模型中的安全性/毒性研究。在批准信使核糖核酸CVs时，这一点尤为重要，因为已经显示出改变构象的非天然核苷类似物会引起线粒体毒性，导致多发性神经病、肌病、胰腺炎、脂肪肝、乳酸酸中毒、脂肪营养不良，甚至致命。 随着开发过程的进展，向监管机构提交文件的复杂性增加。因此，保持适当的记录和文件至关重要。根据世界卫生组织对信使核糖核酸疫苗临床评估的要求，这些疫苗应在人类中进行安全性、免疫原性和有效性评估。涉及信使核糖核酸CVs的临床试验应遵循世界卫生组织关于药品临床试验的良好临床实践(GCP)指南和关于疫苗临床评估的指南：监管期望。还应遵循世界卫生组织关于人用药品的良好生产规范(GMP)要求的疫苗指南。 除了世界卫生组织的考虑外，信使核糖核酸疫苗的制造商和市场授权持有人还应遵循国际药品技术要求协调委员会(ICH)关于人用药品的质量和安全性的指南。这些指南包括Q3C(R6)（杂质：残留溶剂指南）、Q3D(R1)（元素杂质指南）和S2(R1)（ICH关于人用药品遗传毒性测试和数据解释的指南）。 制定针对信使核糖核酸(CVs)的国家和国际指南对于向医疗保健利益相关者提供指导非常重要。这些指南应当反映当前的知识和观点。需要注意的是，基于信使核糖核酸或脱氧核糖核酸的CVs的市场授权的监管要求与药品不同。信使核糖核酸CVs被欧洲药品管理局(EMA)和美国食品药品监督管理局(USFDA)视为生物制品。2011年，USFDA为行业制定了一份关于核酸疫苗(NAVs)的指导文件，名为“治疗性CVs的临床考虑”。该文件为赞助商提交治疗性CV的研究性新药申请(IND)提供了具体指导。它侧重于调查研究中关键临床考虑的建议。 该指导文件讨论了早期临床试验（第1和2阶段）和晚期临床试验（第3阶段）共有的考虑因素。它还解决了特定临床开发阶段治疗性CVs独有的考虑因素。该指南概述了早期临床试验的具体要求，如起始剂量和剂量计划、加强和维持疗法、剂量递增以及早期开发中单臂对比随机第2阶段试验。 对于晚期临床试验，指导涵盖了诸如早期临床试验中的安全概况数据、终点、统计问题、对照问题、疫苗延迟效应、自体疫苗试验和加速批准法规等考虑因素。 早期和晚期临床试验的共同考虑因素包括患者群体、监测免疫反应、作为疗效证据的生物标志物、用于刺激免疫反应的佐剂、多抗原疫苗、CVs初次给药后立即或短时间内疾病进展/复发，以及同时和随后的疗法。 此文件专门适用于旨在引发对肿瘤抗原特定反应以治疗已确诊癌症患者的治疗性CVs。它不适用于旨在预防或治疗传染病的疫苗、诱导或增强非特异性免疫反应的产品，或旨在预防或减少无癌症个体癌症发生率的产品。 欧盟(EU)和欧洲药品管理局(EMA)已经实施了更严格的CVs使用监管指南。欧盟和EMA都为CVs的非临床和临床开发阶段建立了多套指南。在非临床阶段，欧盟强调产品的GMP、疫苗的临床前药理学和毒理学测试，以及为药品进行人体临床试验的非临床安全研究。欧盟和EMA还有关于含有基因修饰细胞和基因治疗药品的质量、非临床和临床方面的专门指南。还必须遵循关于“新疫苗临床评估”和“有关生物研究药品临床试验质量文件要求”的专门指南。 自2009年首次信使核糖核酸CV试验以来，已开发出许多基于信使核糖核酸的CVs并进行了临床试验。临床试验.gov等数据库和其他资源显示，大多数CVs已进入第1或第2阶段。然而，有关人类第3或第4阶段临床疗效评估的数据有限。主要障碍可能是国家和国际机构严格的监管批准要求。 9.提高疫苗稳定性和递送策略的进步和优化 目前，根据其自动复制能力，有两种形式的信使核糖核酸疫苗：传统/非扩增型信使核糖核酸和自扩增信使核糖核酸。 9.1.传统信使核糖核酸 信使核糖核酸由包括帽结构、5'UTR、开放阅读框(ORFs)、感兴趣基因和聚(A)尾在内的多个单元组成。这些序列在顺式调控功能中发挥作用，控制基因表达和管理降解率和翻译。传统信使核糖核酸提供的优势包括简化的构建过程、小尺寸和缺乏额外编码蛋白。然而，它也有缺点，如RNA不稳定和短保质期。为了解决这些不足并增强信使核糖核酸的稳定性和表达，可以追求结构优化，如前一段所述。 9.2.自扩增信使核糖核酸 自扩增信使核糖核酸或复制体最初用于开发合理设计的西尼罗河病毒疫苗。这种方法在患者中单次免疫后产生了高滴度的病毒。另一项研究表明，通过引入病毒包装的自扩增信使核糖核酸，实现了47倍的基因表达水平条件控制。 目标是增强感兴趣基因的稳定性和表达量。自扩增信使核糖核酸由于额外的ORF片段编码非结构蛋白，因此比传统信使核糖核酸相对较大。自动复制的能力允许增加感兴趣基因的表达。此外，体内持续时间可以延长至2个月。因此，自复制信使核糖核酸疫苗保持了快速发展、方便的模块设计和完全无细胞合成的优势，即使在小剂量下，也得益于它们的自复制特性。 结构性修饰也可以增强mRNA疫苗的稳定性。mRNA的基本结构类似于真核mRNA，包括编码蛋白的开放阅读框（ORF）、5'和3'非翻译区（UTR）、5'帽状结构和3'聚(A)尾，如图5.3所示。所有这些结构组分都可以被修饰以实现增强的稳定性和改善的翻译效率。 9.2.1.5'-帽状结构 RNA经历翻译后修饰，如5'-帽状结构，其作为翻译的起始因子。天然mRNA在5'-帽状结构处含有7-甲基鸟嘌呤（m7G）基团，这也作为对抗外切酶切割的保护因子，并在区分自身与非自身mRNA分子中发挥关键作用。虽然可以对体外转录mRNA（IVT mRNA）进行加帽，但得到的RNA往往未能在大量mRNA转录本中被翻译。为解决这一问题，设计了抗反转帽类似物（ARCA）。当ARCA被整合到mRNA中时，与常规mRNA相比，其翻译效率显著提高，增加了一倍以上。此外，三磷酸酯键内的修饰可以阻碍相应mRNA的脱帽，并增强与启动因子4E的结合，后者参与核糖体的招募。然而，ARCA帽有一些限制。它们表现出相对较低的加帽效率60%-80%，在帽状结构中含有额外的C3位置的O'-甲基基团，作为外源性基团，并且转录必须以鸟嘌呤开始。另一种添加5'帽的方法是通过酶促方法，其中牛痘加帽系统是最广泛使用的。该系统提供100%的加帽效率和正确的方向，但对于大规模生产，需要纯化牛痘病毒加帽酶（VCE）。 9.2.2.5'-3'非翻译区（UTRs） UTRs不会被翻译，但包含重要的调控元素和蛋白表达。5'-UTR主要参与翻译过程的启动并招募核糖体，而3'-UTR负责mRNA的稳定性和半衰期。为了优化5'-UTR，可以避免出现起始密码子（AUG）和非经典起始密码子（CUG），因为这些可能会破坏正常的翻译过程。此外，可以消除可能减少核糖体招募的高稳定性结构，并整合更短的5'-UTR。通过在3'-UTR添加两个连续的β-珠蛋白头对尾排列，可以增强mRNA的稳定性。对于治疗性mRNA疫苗的UTRs的更好设计，了解细胞药理学很重要，因为效果取决于物种和细胞类型。 9.2.3.开放阅读框（ORFs） 密码子优化是提高翻译的一种有争议的方法。替换密码子可能提供更大的稳定性，但也可能导致形成具有未知生物活性的新肽在体内。序列可以被优化和设计，以保持每个密码子的相同比例或使用在目标细胞中高表达蛋白中常见的最佳密码子对。此外，避免ORF中的发夹环也很重要。通过将修饰核苷整合到mRNA转录本中，可以创建核苷修饰的mRNA，这些修饰具有较低的免疫刺激性，并增强翻译效率。实现低免疫刺激性和改善翻译效率最常用的修饰是5-甲基胞嘧啶（m5C）和伪尿苷核苷。此外，通过HPLC纯化可以消除dsRNA污染，减少促炎细胞因子的产生，并延长mRNA的作用。 9.2.4.聚(A)尾 聚(A)尾由大约250个核苷酸组成，尽管不同细胞中的数量有所不同。尾部的长度在翻译效率、降解和稳定性中起着关键作用。当3'端聚(A)尾与PABPs结合并通过起始因子与5'帽状结构相互作用时，会发生“闭环结构”的形成[121]。研究表明，较短的聚(A)序列可能会增强闭环结构和翻译效率。因此，评估聚(A)尾长度在IVT-mRNA表达中的作用是必要的。添加聚(A)尾有两种方法：一种涉及在DNA模板上编码尾部，另一种涉及在转录过程中使用重组聚(A)聚合酶。 9.3.基于mRNA的树突细胞癌症疫苗 对于mRNA CV的传递，有多种传递途径可用于注射式mRNA疫苗，这一点之前已经讨论过（表5.6）。本节将讨论在mRNA疫苗的开发和传递中使用DCs。DCs因其能够控制和调节免疫反应而被用作CV的载体。因此，重点仍然是产生体外抗原负载的DCs，这些DCs将在癌症患者中引发CD8+和CD4+ T细胞反应。在各种类型的癌症上进行的临床试验表明，基于DC的免疫疗法耐受性良好，并产生抗肿瘤免疫（表5.5）。这些研究还报告说，接受基于DC治疗的患者中有8.5%显示出与接受达卡巴嗪治疗的患者相似的结果。需要考虑的一些参数包括抗原装载、DC成熟和给药途径。 抗原装载或将mRNA传递到树突细胞（DCs）中涉及多种策略，例如电穿孔、脂质衍生载体和声穿孔。电穿孔因其高mRNA传递效率而常用。该方法应用高压电击破坏细胞膜，允许mRNA进入细胞。mRNA的快速传递保护其不受细胞外核糖核酸酶的降解。另一方面，基于脂质的载体通过内吞作用被摄取，其中脂质化合物融合并释放mRNA内容。声穿孔涉及使用超声响应性微泡，这些微泡进入细胞并内爆以将mRNA直接释放到细胞质中。 装载mRNA的DCs的给药途径主要是通过皮内（ID）、皮下（SC）、静脉（IV）和鼻内（IN）注射。在小鼠上进行的各种研究表明，疫苗的皮内和皮下给药途径优于静脉注射。然而，一项比较研究并未揭示鼻内和皮内传递DCs在黑色素瘤患者之间的显著差异。由于缺乏表明明确胜出者的数据，可以使用联合给药途径的方法。例如，一项研究发现，与仅通过皮内途径给药相比，通过静脉和皮内途径给药的mRNA修饰的Trimix-DCs引发了广泛的免疫反应。这表明，除了抗原外，给药途径也影响疫苗效率。 10.结论和未来展望 基于mRNA的免疫治疗作为蛋白质的替代治疗方法。在与mRNA给药到临床前模型相关的首要研究之后，相关领域迅速发展，并显示出作为疫苗进步的后代生物制药的潜力。由于它们快速的进步能力、巨大的有效性、后安全性状态和较低的生产成本，mRNA疫苗被认为是非常重要并确认为免疫治疗领域下一代疫苗。近年来，这些产品显著增加了研究进展的推动力，导致该领域的显著成就。市场上最近推出的COVID-19疫苗为癌症和其他方式的广泛认可铺平了道路。与癌症和传染病相关的mRNA疫苗的临床试验数据显示了有希望的结果。因此，下一个十年对于扩大创新的基于mRNA的治疗将非常重要。很可能，mRNA疫苗将被开发用于除传染病和癌症之外的其他方式，因为技术已经迅速进步并变得精炼和优化。然而，mRNA疫苗技术中的某些领域仍需要进步和评估。 观察到，基于mRNA的疫苗是创新疗法和预防疫苗的鼓舞人心的手段，这一点通过提交给监管机构的众多临床前和临床试验申请（CTAs）得到了证明。然而，与mRNA的电荷、庞大尺寸、关键不稳定性以及对酶破坏的脆弱性相关的多种困难阻碍了疫苗从基础研究到市场可用性的发展。这些障碍限制了这些疫苗的更广泛应用，并证明了需要更高质量的载体、适用的疫苗传递系统和材料。 最近，mRNA COVID-19疫苗已经以显著的效力被引入市场。因此，研究人员现在表示希望开发用于广泛应用的mRNA疫苗。在过去的几年中，已经对少数患者进行了癌症的临床试验，显示出有希望的结果。目前正在进行许多临床试验以评估各种类型的癌症的mRNA疫苗。然而，美国FDA尚未批准任何mRNA CV作为独立治疗或癌症治疗的辅助手段。通过正在进行的CV试验，初步结果将有助于确定mRNA CVs的安全概况和效力。最终，需要额外的广泛和详细的临床试验来增强我们对这些疫苗的免疫原性和安全性的理解。 mRNA由我们身体的细胞每天自然产生，用于蛋白质生产。生理细胞具有调节机制来控制产生的蛋白质数量，确保只产生所需的数量，并防止过量的蛋白质生产。mRNA疫苗的分解由身体的细胞通过聚(A)尾有效确认和控制。目前，研究人员主要专注于设计疫苗，使其在细胞中的停留时间不超过诱导免疫所需的必要时间，同时避免短期和长期的不良反应。 医学界非常重视疫苗的长期安全性。疫苗的过去数据显示，接种后可能会发生延迟效应。然而，这些效应通常在疫苗接种后的六周内观察到。不同国家的监管机构要求在授予市场批准之前提供至少八周的疫苗后安全概况数据。mRNA疫苗已经开发多年，并经过了广泛的评估。几十年来对mRNA疫苗的审查没有发现任何长期的接种后副作用。mRNA COVID-19疫苗已经使用了两年多，使超过95亿人受益，没有观察到显著的毒性。然而，这些疫苗的长期效应仍需要评估。生理细胞具有调节机制来控制蛋白质的生产，确保只产生所需的数量，并防止过量的蛋白质生成。身体细胞及时分解mRNA疫苗由聚(A)尾以高效的方式确认和控制。目前，研究人员主要专注于设计疫苗，使其在细胞中的停留时间不超过诱导免疫所需的必要时间。 这是为了避免任何短期或长期的药物不良反应。医学界特别关注疫苗的长期安全性，因为过去的数据显示接种后可能会发生延迟效应。然而，这些效应通常在疫苗接种后的六周内观察到。因此，不同国家的监管机构要求在授予市场批准之前，必须有至少八周的疫苗接种后安全数据。mRNA疫苗已经研发多年，并经过了广泛的审查。几十年来对mRNA疫苗的审查没有发现任何长期接种后副作用。mRNA COVID-19疫苗已经使用了两年多，惠及超过95亿人，没有观察到显著的毒性。尽管如此，这些疫苗的长期效应仍需要评估。 mRNA疫苗相对简单直接的制造过程是其相对于传统产品的最大优势。疫苗的每剂成本和制造价格可能会受到过程中使用的具体单元操作的影响。最终，每剂RNA的数量、产品滴度和生产规模对疫苗的成本有重大影响。因此，采用可持续且成本效益高的制造工艺至关重要。目前，生物合成疫苗产品的回收和纯化在建立方面存在不足，依赖于缺乏商业可扩展性和经济可行性的方法。解决这些问题的一个潜在方案是转向连续制造。通过实施创新的生产方法，允许材料回收和循环，以及高通量纯化方法和独特的分析过程，可以实现适应性强、可持续和盈利的mRNA疫苗生产。总之，mRNA疫苗的制造过程需要进一步的可扩展性和优化。 不充分的热稳定性和冷冻储存对市场上的mRNA疫苗构成了重大挑战。保持适当的温度对于临床效果至关重要，这突出了需要具有高治疗效果的热稳定疫苗。这仍然是研究人员和科学家面临的挑战。通过更深入地了解不稳定性的根本原因和机制，以及选择适当的专家稳定化过程，我们可以朝着开发高度稳定的mRNA疫苗取得进展。这些具有增强稳定性的先进mRNA疫苗将便于整个疫苗供应链的轻松运输和高效储存。它们还将使制造商能够在未来更快速地向全球分发疫苗。 在生物制药行业，mRNA疫苗正引领潮流。投资者、赞助商和研究机构必须为新疾病的mRNA疫苗市场可用性进行调整。增加社区和私人合作可以为mRNA疫苗的扩展创造更有利的环境。未来的临床试验应该关注分层的患者群体。总之，疫苗开发的前景看起来很有希望。mRNA疫苗有潜力克服这些挑战，并为临床环境中的更多mRNA疫苗铺平道路。mRNA CV的快速发展将为癌症治疗带来新的可能性，并确立mRNA CV作为免疫疗法家族的自豪成员。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

导读：癌症疫苗驱动肿瘤反应性免疫细胞的激活和增殖，进而引发杀死肿瘤细胞的特异性免疫。鉴于LNP递送系统的成熟，体外转录（IVT）RNA在肿瘤免疫治疗方面具有显著的优势，包括线性、环状和自扩增mRNA疫苗。其中自扩增mRNA疫苗可在低剂量下高水平表达抗原且持续时间长，同时可刺激特定的细胞免疫。 2023年，中国食品药品检定研究院（简称中检院）研究团队在Frontiers in Immunology（IF:5.7）上发表综述《Amplifying mRNA vaccines: potential versatile magicians for oncotherapy》，总结了自扩增mRNA疫苗的研究进展及其在肿瘤治疗中的前景和未来方向。 01 背景介绍 肿瘤免疫疗法指通过激活免疫系统进行癌症治疗的一系列方法，如免疫检查点抑制剂、治疗性抗体和癌症疫苗等。癌症疫苗在肿瘤的主动免疫疗法中显示出积极作用，包括根除肿瘤细胞和预防肿瘤转移及复发，但癌症疫苗（如肽疫苗和细胞疫苗）抗原单一，抗肿瘤免疫激活效果差，生产成本高。 1995年，Conry等人首次提出使用mRNA进行肿瘤免疫治疗的概念。与传统疫苗相比，mRNA疫苗（线性、环状和自扩增mRNA疫苗）具有可快速编辑、生物安全风险低、激活T细胞及诱导更强免疫原性等优点。其中，自扩增mRNA疫苗具有以下优势： （1）依赖于能利用RNA依赖性RNA聚合酶（RdRp）在宿主细胞内自扩增的RNA（saRNA），使载体携带的肿瘤抗原基因高水平、长时间表达； （2）可在扩增过程中形成双链RNA（dsRNA），具刺激免疫反应的潜力，进一步增强疫苗效果； （3）同时表达多种抗原，诱导针对不同抗原的体液和细胞免疫应答。目前43种COVID-19 mRNA疫苗中有14种为自扩增mRNA疫苗。因此，自扩增mRNA疫苗为传染病、癌症疫苗研究及应用提供广阔前景。 02 自扩增mRNA疫苗的研究历史 自扩增mRNA疫苗的研究可追溯至1957年将从感染Mengo脑炎病毒的腹水癌细胞中提取的RNA导入细胞，可合成完整的感染性病毒颗粒。1994年Zhou等人通过使用塞姆利基森林病毒（SFV）复制子表达流感病毒核蛋白在小鼠中产生具高抗体滴度的体液反应，并首次提出使用合成自扩增mRNA作为疫苗。1999年，Ying等人提出裸露、非感染性saRNA可用于癌症疫苗的开发。2003年，编码前列腺特异性抗原（PSA）mRNA疫苗的临床试验发现其在体内有效诱发T细胞介导的抗肿瘤免疫反应。第一个自扩增mRNA治疗性癌症疫苗AVX701于2007年进入I期临床试验。 自扩增mRNA疫苗技术平台已应用于流感、呼吸道合胞病毒（RSV）、狂犬病、埃博拉病毒和HIV-1等感染性病毒疫苗及黑色素瘤等癌症疫苗的临床研究。 图1 自扩增mRNA癌症疫苗发展里程碑 03 自扩增mRNA疫苗作用机制 除帽、5′-UTR、3′-UTR和poly（A）尾等常规结构元件外，自扩增mRNA在5′ORF内包含一个编码RdRp复合体（复制酶）和亚基因组启动子的序列，编码目标疫苗抗原的基因序列常位于亚基因组启动子下游。SINV、VEEV、SFV等甲病毒基因组常用于自扩增mRNA疫苗的设计。自扩增mRNA进入宿主细胞后，以宿主核糖体依赖性方式翻译，在宿主细胞内进行加工以形成复制酶，因自扩增mRNA序列为（+）链RNA，可被复制酶作为模板形成（–）链mRNA。（–）链mRNA的扩增导致两类（+）链RNA的合成：一是原始全长基因组RNA副本，二是编码目标基因的亚基因组RNA。鉴于自扩增mRNA序列中存在亚基因组启动子和目标基因（GOI），病毒复制酶可识别（–）链mRNA中的亚基因组启动子，合成大量含有目标基因序列的（+）链mRNA，低剂量下经翻译获得高水平目标产物。 图2 自扩增mRNA作用机制 RNA稳定性与序列长度呈负相关，自扩增mRNA相较于非扩增线性mRNA额外包含编码复制酶（7-8kb）的序列，稳定性较差。为解决上述问题，采用分裂载体反式扩增RNA系统（编码RdRp复合体的序列和编码目标基因的序列分成两个独立的转录本）进行递送，有助于控制mRNA大小，增强稳定性。 图3 反式扩增mRNA作用机制 04 自扩增mRNA癌症疫苗进展 4.1 临床前研究进展 自扩增mRNA癌症疫苗用于肿瘤抗原的高水平表达，在动物模型中引发强烈的细胞和体液免疫反应，有效抑制黑色素瘤、宫颈癌和前列腺癌等。该领域临床前研究主要集中在肿瘤相关抗原（TAA）、肿瘤特异性抗原（TSA）和免疫调节分子。 （1）TAA：对肿瘤细胞不具有特异性，但致癌过程中表达增加，临床前阶段自扩增mRNA癌症疫苗的设计主要靶向TAA，如酪氨酸酶、pMEL17/gp100、gp75/TRP 1、MART-1/melan-A和多巴色素互变异构酶/TRP-2。Avogadri等人研究发现基于表达TRP-2的VEEV载体自扩增mRNA癌症疫苗可诱导体液免疫对抗TRP-2，在黑色素瘤的免疫治疗中发挥作用，并配合肿瘤特异性CD8 T细胞反应。 （2）TSA：不存在于正常细胞，是癌症疫苗的理想靶标。超99%的宫颈癌表达E6、E7癌基因，Daemen等人使用SFV载体携带E6E7融合蛋白免疫的小鼠相较于单E6、E7蛋白，表现出更强的细胞毒性T淋巴细胞（CTL）反应，导致肿瘤消退。 （3）免疫调节分子：Rodriguez Madoz等人使用表达IL-12的SFV载体治疗MC38细胞系结肠癌小鼠，显著增强小鼠的抗肿瘤免疫应答，导致肿瘤消退和完全根除。IL-18可促进NK和T细胞分泌IFN-γ和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF），并增强与抗肿瘤CTL反应相关的Th1型细胞因子的产生。 表1 临床前研究进展 4.2 临床研究进展 临床试验表明，自扩增mRNA癌症疫苗可增强T细胞免疫反应并改善患者预后和生存率。2022年11月9日，JCXH-211（编码人IL-12的新型samRNA治疗药物）被NMPA批准进入I期临床试验。Vvax001（治疗性疫苗）被评估在治疗HPV诱导的癌症中的免疫原性、安全性和耐受性。AVX701表达修饰的癌胚抗原基因（CEA（6D）），转移性结直肠癌患者I/II期临床试验结果表明，接种疫苗的患者表现出更强的T细胞免疫反应和更长的生存期。 表2 临床研究进展 05 自扩增mRNA癌症疫苗的优化策略 5.1 载体序列 Blakney等人开发用于编码多种抗原的分裂复制子（splitzicon）系统，为多价RNA疫苗的设计提供思路。Li等人开发基于VEEV复制子系统的体外进化策略，筛选出的两种突变复制子相较于野生型复制子，荧光素酶表达的强度和持续时间显著增加。总之，优化自扩增mRNA载体序列以减少宿主先天免疫反应可显著提高稳定性和表达效率。 5.2 抗原选择及组合 癌症疫苗应具备肿瘤特异性和诱导高水平且可控的抗肿瘤免疫反应的能力。TSA、TAA、免疫调节分子均用于癌症疫苗的抗原设计，现常采用联合疗法来增强癌症疫苗的效果，如多种抗原同时表达，与单抗原OVA1 mRNA相比，双抗原OVA1和OVA2 mRNA导致T细胞抗原特异性激活增加30%，增殖增加2倍。CD40L、CD70和组成型活性TLR4编码mRNA的共转染可增强人树突状细胞诱导的T细胞活化。 表3 临床和临床前研究中使用的癌症疫苗抗原 5.3 IVT系统 通过将质量源于设计（QbD）概念应用于IVT系统优化，可快速确定关键过程参数对关键质量属性（CQA）的影响。Samnuan等人采用实验设计方法研究影响IVT反应生产的自扩增mRNA产量的各种因素，确定最佳组分比，将其用于合成高产高质的自扩增mRNA。Moderna开发修饰的T7 RNA聚合酶，减少转录反应过程中的dsRNA杂质。新型嗜冷噬菌体VSW-3 RNA聚合酶能减少IVT过程中dsRNA副产物的产生。开发具高产率和低副产物形成的稳定IVT系统仍是未来研究的关键领域。 5.4 递送系统 Miao等人使用含环状脂质成分的LNP刺激干扰素基因通路的刺激剂用于封装OVA mRNA疫苗，结果抗肿瘤作用显著增强。但开发用于癌症疫苗的新型递送系统仍存在如提高自扩增mRNA稳定性、靶向递送效率及免疫系统激活的可控性等挑战。 06 自扩增mRNA疫苗的质量控制 世界卫生组织、国家药品监督管理局药品审评中心等已发布相关指南和文件，为监管机构提供关于mRNA疫苗质量控制的考量和mRNA质量分析的方法。序列和完整性、含量和纯度、加帽和包封效率是mRNA疫苗特有的关键质量参数，决定其有效性和安全性。 QbD概念的应用能够准确测定mRNA疫苗的CQA、关键工艺参数和操作空间，有助于为生产过程建立合理的控制策略。为实现自扩增mRNA疫苗的质量控制，应进一步研究关键的CQA，如其稳定性和体内复制酶活性。监管机构和疫苗制造商还应考虑建立参考标准，用于测量自扩增mRNA的核酸含量、纯度和生物活性。关注疫苗序列完整性标志物的质量控制也至关重要。 07 总结 mRNA疫苗是癌症治疗领域有前途的技术平台。但其面临稳定性差、抗原选择和优化及靶向效率等障碍，在研发、生产、质量控制和安全性（自扩增mRNA疫苗可在体内不断产生新mRNA，应注意引起强烈全身或局部炎症反应的可能性）方面仍有诸多问题有待解决。