NF-κB x ERα

引言 2型糖尿病（T2D）是一种常见的慢性代谢性疾病，其特点是身体不能有效利用胰岛素（胰岛素抵抗）或胰腺无法分泌足够的胰岛素，导致血糖水平升高【1-3】。胰岛素是一种由胰腺β细胞分泌的激素，帮助细胞摄取和利用血糖。当身体对胰岛素不敏感时，胰腺必须分泌更多的胰岛素来维持正常的血糖水平。随着时间的推移，胰腺可能无法跟上这种需求，导致胰岛素不足，进而引发高血糖。T2D的主要风险因素包括不健康的饮食、缺乏运动、超重或肥胖、遗传因素和年龄的增长。该疾病通常起病缓慢，可能无明显症状，但长期高血糖可引发心脏病、中风、肾病、视力丧失等严重并发症。由于遗传和环境因素共同作用导致T2D的发病，因此GWASs研究已经将超过600个序列突变与T2D关联起来【4,5】。这些变异大多位于非编码区，与胰腺β细胞的顺式调控元件（CREs）高度富集有关，表明这些变异可能通过改变CRE功能和效应基因表达，导致胰岛β细胞功能障碍和衰竭。T2D的发病过程涉及遗传变异与环境应激因素（如内质网（ER）应激和炎性细胞因子应激）的动态交互作用。然而，目前关于非编码区变异如何在这些应激条件下影响胰岛的转录反应，了解仍十分有限。 近日，来自美国杰克逊基因组医学实验室的Michael L. Stitzel和Duygu Ucar合作在Cell Metabolism上发表了Resource类论文Multi-omic mapping of human pancreatic islet endoplasmic reticulum and cytokine stress responses provides type 2 diabetes genetic insights。在本研究中，作者利用多组学分析揭示了胰岛细胞在应对环境压力时的转录反应，并将这些转录反应与非编码区变异关联起来，这项研究为理解T2D的发病机制提供了新的见解。 为了揭示环境应急对胰岛细胞的基因转录影响，作者首先使用来自非糖尿病供体的胰岛细胞，将其暴露在ER应激（thapsigargin）和促炎性细胞因子（IL-1b + IFN-g）中，作为研究胰岛应激反应的模型，然后通过RNA-seq分析胰岛细胞的基因表达变化。数据表明，约30%的基因（5131个基因）对ER应激或促炎细胞因子应激产生响应，这些基因中有85%单独对某个应激条件发生反应。其中ER应激激活了与未折叠蛋白反应（UPR）和ER蛋白处理通路相关的基因，如ATF4、ERN1/IRE1a、DDIT3/CHOP等，这些基因与β细胞功能和存活密切相关。另外，ER应激还显著诱导了胆固醇合成、氨基酸生物合成等代谢通路，表明ER应激对细胞功能的影响比单纯的蛋白质折叠更为广泛。与促炎性细胞因子相关的基因主要涉及细胞因子和趋化因子信号传导途径（如NF-kB通路），这些通路与胰岛β细胞功能障碍有关。促炎性应激还激活了多个固有免疫途径（如NLRP3炎症小体和RIG-I样受体信号通路），这些通路与早期1型糖尿病（T1D）的自身免疫激活有关。 为了进一步解读胰岛中不同细胞类型（尤其是α细胞和β细胞）对ER应激和促炎性细胞因子的反应，作者继续利用同样的方法处理非糖尿病供体的胰岛细胞，随后进行scRNA-seq分析。研究表明，β细胞表现出比α细胞更强的对ER应激和促炎性细胞因子的敏感性，β细胞对ER应激的反应中有98个基因被激活，而α细胞仅有35个，其中30个基因是两者共有的。在应激处理的胰岛细胞中，DDIT3、S100A6和MT1F等基因显著在β细胞中诱导表达，而α细胞中没有明显变化。β细胞在ER应激下可分为两个不同的亚群：β簇1（BC1）：占94%的β细胞，显示出较为常规的应激响应；β簇2（BC2）：占6%的β细胞，表现出更为强烈的与细胞死亡相关的基因表达，如蛋白酶体超家族基因PSMB8、PSMB9、PSMB10，这些基因与蛋白质降解和凋亡密切相关。这表明β细胞在T2D的病理机制中可能起着更重要的作用。 接下来，作者利用ATAC-seq绘制胰岛细胞在ER应激和细胞因子应激条件下的CRE的可及性图谱，旨在找出与这些应激反应相关的CREs，并解析它们如何调控基因表达。研究发现，大约14%的CREs（14,968个CREs）在应激处理后发生了显著变化，大多数应激响应的CREs是特异性的，仅有393个CREs在两种应激条件下共同响应。对这些应激响应CREs进行基因组注释发现，约91%的应激响应CREs位于距离最近的基因转录起始位点（TSS）1 kb之外，表明这些CREs可能是增强子，调控基因在应激条件下的表达。通过将这些CREs与胰岛细胞中表达的基因联系起来，研究发现应激响应的CRE的开放或关闭与相应基因表达的变化一致。转录因子结合位点的富集分析显示，ATF4、CHOP和NFIL3等UPR介导因子在ER应激条件下显著富集，而IRF8、IRF3以及NF-kB家族成员p65（RELA）的结合位点在促炎细胞因子应激下富集，表明不同的应激通过不同的转录因子调控其特定的基因表达。此外，这些应激反应不仅影响胰岛细胞的染色质结构和基因表达，还可能通过下调关键转录因子如PDX1和MAFA，削弱胰岛细胞的功能，进而导致葡萄糖代谢失调，促进T2D的发生。 作者还分析了与糖尿病相关的遗传变异和胰岛细胞在ER应激或促炎细胞因子应激条件下的CRE变化之间的关系。通过分析多个GWASs数据集，作者共发现161个与T2D、1型糖尿病或相关血糖性状相关的变异与应急反应 CRE的开放或关闭有关。其中，21个T2D相关变异与ER应激特异性开放的CRE重叠，24个T2D相关变异与细胞因子应激特异性开放的CRE重叠。例如，rs4744423通过增强FOSB/JUNB的结合来调控ER应激下AOPEP基因的表达，而rs6444081则通过破坏NRF2的结合位点，减少ETV5基因的表达，削弱胰岛功能。 文章的最后，作者选择了一个T2D相关的遗传变异rs6917676进行细致的研究。结果表明，rs6917676-T风险等位基因通过增强ER应激反应，增加MAP3K5表达，促进胰岛β细胞凋亡的分子机制。通过药物抑制MAP3K5，可能为减少T2D患者胰岛细胞凋亡、保护β细胞功能提供新的治疗策略。这些发现表明，特定的遗传变异可能通过改变胰岛细胞的应激反应，从而影响糖尿病的发生和发展。 模式图（Credit: Cell Metabolism） 总的来说，作者通过多组学研究剖析了ER应激和促炎症细胞因子应激对人类胰岛细胞转录调控网络的全基因组影响，并激发了将rs6917676风险等位基因与增强的ER应激反应性MAP3K5介导的β细胞凋亡联系起来的变异到功能研究。这项研究将遗传突变和环境因素的变化与胰岛细胞的转录影响关联起来，为理解T2D发病机制以及开发潜在的治疗方法提供了重要的借鉴意义。 参考文献 1. Halban, P.A., Polonsky, K.S., Bowden, D.W., Hawkins, M.A., Ling, C., Mather, K.J., Powers, A.C., Rhodes, C.J., Sussel, L., and Weir, G.C. (2014). b cell failure in type 2 diabetes: postulated mechanisms and prospects for prevention and treatment. Diabetes Care 37, 1751–1758. 2. Lawlor, N., Khetan, S., Ucar, D., and Stitzel, M.L. (2017). Genomics of islet (Dys)function and type 2 diabetes. Trends Genet. 33, 244–255. 3. Ashcroft, F.M., and Rorsman, P. (2012). Diabetes mellitus and the b cell: the last ten years. Cell 148, 1160–1171. 4. Suzuki, K., Hatzikotoulas, K., Southam, L., Taylor, H.J., Yin, X., Lorenz, K.M., Mandla, R., Huerta-Chagoya, A., Rayner, N.W., Bocher, O., et al. (2023). Multi-ancestry genome-wide study in >2.5 million individuals reveals heterogeneity in mechanistic pathways of type 2 diabetes and complications. Preprint at medRxiv. 5. Vujkovic, M., Keaton, J.M., Lynch, J.A., Miller, D.R., Zhou, J., Tcheandjieu, C., Huffman, J.E., Assimes, T.L., Lorenz, K., Zhu, X., et al. (2020). Discovery of 318 new risk loci for type 2 diabetes and related vascular outcomes among 1.4 million participants in a multi-ancestry meta-analysis. Nat. Genet. 52, 680–691. https://doi.org/10.1016/j.cmet.2024.09.006 责编|探索君 排版|探索君 来源|BioArt End 往期精选 围观 一文读透细胞死亡(Cell Death) | 24年Cell重磅综述（长文收藏版） 热文 Cell | 是什么决定了细胞的大小？ 热文 Nature | 2024年值得关注的七项技术 热文 Nature | 自身免疫性疾病能被治愈吗？科学家们终于看到了希望 热文 CRISPR技术进化史 | 24年Cell综述

摘要：近年来，免疫疗法在乳腺癌（BC）治疗中显示出鼓舞人心的结果。程序性细胞死亡配体1（PD-L1）跨膜蛋白被认为是免疫反应中的共抑制因子，它与程序性细胞死亡蛋白1（PD-1）合作，刺激凋亡，抑制PD-1阳性细胞释放细胞因子，并限制PD-1阳性细胞的生长。此外，在许多恶性肿瘤中，PD-L1降低了免疫系统对肿瘤细胞的反应。这些观察结果表明，PD-1/PD-L1轴在癌症治疗和调节癌症免疫逃逸机制中发挥着重要作用。本综述旨在概述PD-1和PD-L1在BC癌症治疗中的功能。方法：本研究设计为文献综述。风格是关于PD-1/PD-L1通路相关主题或变量的传统综述。使用三个在线数据库进行了文献搜索。结果：使用关键词进行搜索，共得到248项研究。根据纳入和排除标准再次筛选每个结果，最终共有4项研究纳入文献综述。结论：PD-1/PD-L1的结合对许多恶性肿瘤至关重要。根据所提供的证据，这种结合在癌症治疗中既提供了机会也带来了挑战。由于许多实体癌症，特别是BC，表达高水平的PD-1/PD-L1，癌症治疗主要涉及靶向疗法。 1.引言 乳腺癌（BC）的治疗取决于个体情况。肿瘤学研究（基因组学、转录组学、代谢组学和蛋白质组学）、设备开发（诊断和治疗）以及药物发现在BC治疗中扮演着重要角色。手术仍然是主要的治疗方式，并且已经发展出许多创新的乳房切除技术。癌症研究传统上关注癌细胞和癌症作为一种基因疾病；然而，对这种疾病作为系统性疾病的广泛调查已经确定癌症是一种具有多种表现的复杂疾病。因此，研究已经从关注癌细胞发展到基于宿主体内的免疫系统功能及其起源环境的全面方法。与免疫系统相关的癌症两个特征是慢性炎症，它鼓励肿瘤发展，以及癌细胞逃避免疫系统破坏的能力。免疫系统可能无法抑制癌细胞的增殖并诱导这些细胞的进一步发展，这被称为免疫编辑假说。逃避免疫系统的能力是Hanahan和Weinberg概述的癌细胞十个属性中的一个重要组成部分（图1）。近年来，免疫疗法在乳腺癌（BC）治疗中显示出鼓舞人心的结果。程序性细胞死亡蛋白1（PD-1）通过防止调节性T细胞的凋亡、触发抗原特异性T细胞的凋亡和控制T细胞活性来促进自我耐受并抑制免疫反应。程序性细胞死亡配体1（PD-L1）跨膜蛋白被认为是免疫反应中的共抑制因子，它与PD-1合作，刺激凋亡，抑制PD-1阳性细胞释放细胞因子，并限制PD-1阳性细胞的生长。此外，在许多恶性肿瘤中，PD-L1降低了免疫系统对肿瘤细胞的反应。这些观察结果表明，PD-1/PD-L1轴在癌症治疗和调节癌症免疫逃逸机制中发挥着重要作用。本综述旨在概述PD-1和PD-L1在BC中的功能，以增强癌症治疗。 图1. 癌细胞的特征。使用Biorender.com创建。 2.方法 本研究设计为文献综述。风格是关于PD-1/PD-L1通路相关主题或变量的传统综述。使用三个在线数据库（PubMed、Crossref和Google Scholar）进行了文献搜索。搜索词包括主要关键词“程序性细胞死亡1受体”和“程序性细胞死亡1配体1”，以及几个辅助关键词“乳腺癌”和“免疫系统”。包括的文章是那些有全文可用且用英语发表的文章。 3.结果 使用主要关键词“程序性细胞死亡1受体”和“程序性细胞死亡1配体1”，以及之前描述的几个辅助关键词进行搜索，共得到248项研究。根据文章的标题和摘要筛选每个结果，并根据纳入和排除标准再次筛选，最终共有4项研究纳入文献综述（图2）。 图2. 本研究中使用了PRISMA流程图。 4.讨论 4.1.癌症免疫系统 为了有效地消除癌细胞，免疫反应必须包括一系列连续和重复的过程，建立癌症免疫的循环（图3）。癌细胞最初产生新抗原，随后释放并被抗原呈递细胞（APCs）捕获。为了引发抗肿瘤反应并减轻对产生的肿瘤抗原的外周抵抗，这一阶段需要一个独特的信号。这些免疫原性信号包括由凋亡肿瘤细胞释放的炎症细胞因子和化学物质。当APCs附着在主要组织相容性复合体（MHC）分子上时，处理过的抗原被呈递给T细胞。然后效应T细胞识别癌症特异性抗原作为潜在的有害入侵者，此时效应和调节性（T reg）T细胞之间的比例决定了激活的免疫反应类型。一旦激活，效应T细胞就前往肿瘤部位并与肿瘤细胞上的抗原相互作用，之后它们绑定到这些细胞并杀死它们。随着肿瘤细胞被破坏，反应循环随着更多肿瘤特异性抗原的增加而加强。这个过程并不理想，这个系统可能会出现几个问题。例如，肿瘤抗原可能未被检测到；APCs和T细胞可能将肿瘤抗原误认为是自身抗原，导致T reg反应而不是抗肿瘤反应；肿瘤微环境可能会抑制产生的效应细胞。癌症免疫循环需要多个组件的协调作用，包括激活免疫系统对抗癌细胞的免疫刺激因子和调节这种活动的抑制因子。这些因素在循环的每一步中协作。刺激因子促进免疫，而抑制因子监控正在进行的过程，减少免疫反应活动和/或防止自身免疫。像PD-L1这样的检查点蛋白，被称为免疫调节剂，表现出抑制功能以调节肿瘤组织中活跃的免疫反应。例如，当T细胞表面的PD-1受体与癌细胞表达的PD-L1结合时，T细胞功能受到抑制。PD-L1的过表达在各种类型的癌症中很常见，并因其对抗癌反应的抑制作用而与预后不良相关。 图3. 癌症免疫系统。使用Biorender.com创建。 4.2.免疫编辑 免疫编辑过程阐明了免疫系统在乳腺癌的发展和演变中的作用。免疫系统有助于预防癌症以及疾病的发生、侵袭和转移。目前，许多癌症治疗方法专注于如何更有效地利用免疫系统，例如使用适应性免疫疗法和单克隆抗体来阻止T细胞接收到的抑制信号，如抗PD-1。 免疫编辑的三个主要阶段是消除、平衡和逃逸（图4）。消除阶段涉及适应性免疫系统识别和根除癌细胞。细胞毒性免疫细胞释放穿孔素以触发癌细胞溶解。通过消除阶段的癌细胞过渡到平衡阶段，它们利用免疫系统的负向调节动态。在这个阶段，免疫反应有效地调节癌细胞的增殖、扩散和程序性细胞死亡（凋亡）。然而，癌细胞之间的异质性和遗传变异使它们能够从这种平衡中逃逸，此时激活免疫抑制机制。 图4. 免疫编辑过程的阶段。使用Biorender.com创建。 4.3.免疫反应对肿瘤发展的影响 循环肿瘤细胞（CTCs）的生长和转移涉及癌细胞的释放、逃避免疫系统以及通过粘附和渗出血管产生远距离转移。免疫系统与CTCs的相互作用对这些过程至关重要。原发肿瘤平均每天向血液中释放数千个肿瘤细胞；然而，很少测量CTCs的数量。这是因为从原始免疫抑制微环境中释放出来的肿瘤细胞变得容易受到免疫细胞的攻击。图5展示了CTCs免疫逃逸的图示。 图5. 基于免疫系统的转移级联的主要阶段。使用Biorender.com创建。 免疫反应高度依赖于免疫系统识别触发免疫反应的抗原的能力。免疫反应细胞源自多能干细胞，它们通过淋巴途径分化，产生淋巴细胞及其亚群，或通过髓系途径形成吞噬细胞和其他细胞。主要的免疫活性细胞是T淋巴细胞，而次要成分包括T辅助细胞、T细胞毒性细胞和T调节细胞，每种细胞都发挥不同的功能。 免疫编辑是肿瘤进展的重要组成部分。在平衡阶段，通过产生抑制信号等方法，消除转化细胞可以诱导产生免疫原性低且对效应T细胞更具抵抗力的肿瘤变体。此外，肿瘤衍生的可溶性因子（TDSF）可以诱导多种机制，允许在肿瘤微环境中逃避免疫细胞攻击。 免疫细胞未能消除原发肿瘤细胞导致这些细胞增殖并进行有丝分裂。细胞增殖通常与快速肿瘤生长和更具侵略性的生物学和临床行为相关，这种活动可以通过计算有丝分裂指数来识别。有丝分裂指数是确定包括BC在内的多种肿瘤的侵略性和分化程度的金标准。 由于免疫反应失败，肿瘤进展增加在观察到肿瘤增大时变得明显。肿瘤细胞的增殖和有丝分裂数量显著增加，导致体积加速增长，这可以通过临床检查和成像评估。实体癌症治疗涉及移除原发肿瘤和消除转移；因此，在临床实践中理解和控制转移很重要。转移从单个实体肿瘤开始，经历多个转移阶段，导致已经扩散且难以治愈的癌症。 在每个阶段，宿主免疫系统可以识别癌细胞。在原发肿瘤阶段，一些免疫细胞作为促转移剂，如T调节细胞，通过分泌IL 10提供免疫抑制，从而抑制细胞毒性T细胞和NK细胞的反应。其他免疫细胞，包括巨噬细胞，参与血管生成过程，其中M2肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）产生CCL-2和IL-10以促进血管生成；通过表达精氨酸酶阻断DCs、T细胞和NK细胞来增强免疫抑制；并使用基质金属蛋白酶通过改变基质促进侵袭。一些免疫细胞作为抗转移剂，如细胞毒性NK细胞、T细胞和M1 TAMs，它们杀死癌细胞。 在M2循环阶段，TAMs和T调节细胞作为促转移剂，其中T调节细胞减少并抑制循环中的NK细胞和T细胞，这允许转移细胞存活。虽然细胞毒性T细胞和NK细胞识别并杀死癌细胞，M1 TAM细胞产生CXCL9、IL-6和IL-12来表达iNOS并通过产生一氧化氮直接破坏肿瘤细胞。在转移生态位阶段，成熟的NK细胞促进转移生态位生长，当这些细胞具有低免疫能力时。 相反，未成熟的NK细胞抑制转移生态位形成。在这个阶段，巨噬细胞（M2）通过诱导局部免疫抑制环境参与准备转移生态位，而M1刺激局部免疫。此外，当细胞毒性T细胞进入转移生态位时，它们可以识别并杀死癌细胞。 5.PD-L1  5.1.PD-L1结构  当T淋巴细胞通过识别主要组织相容性复合体（MHC）在特定细胞上的抗原时，炎症细胞因子被分泌到循环系统中。通过特定细胞因子的作用，T细胞上的程序性死亡-1（PD-1；CD279）蛋白激活促进组织中程序性死亡配体1（PD-L1）的产生。用户包括了引用，建议包含引用或来源。 抑制性共受体PD-1存在于包括B淋巴细胞、CD8+和CD4+ T细胞、NK细胞以及其他亚型的肿瘤浸润性淋巴细胞（TILs）在内的几种细胞类型表面。用户提供的数字引用没有文本描述。鉴于长期抗原暴露可能会诱导PD-1表达的选择性增加，T细胞PD-1表达可能表明T细胞疲劳。由于缺乏信息，无法对用户的材料进行学术改写。类型1跨膜蛋白PD-1由程序性细胞死亡蛋白1（PDCD1）基因编码。 PD-1分子由三个主要结构元素组成：外部免疫球蛋白可变区（IgV）结构域、一个疏水性跨膜区域，以及几个细胞内区域。细胞内尾部组分包括免疫受体酪氨酸基开关基序（ITSM）和免疫受体酪氨酸基抑制基序（ITIM），两者都有可能发生磷酸化。免疫受体PD-1的激活被认为需要活性免疫受体酪氨酸基开关基序（ITSMs）的存在以调节T细胞反应。 PD-L2（也称为B7-DC或CD273）和PD-L1（也称为B7-H1或CD274）是作为共抑制因子并构成PD-1受体的配体。PD-L1是由CD274基因编码的蛋白质，包含290个氨基酸，分子量为40 kDa（图6）。PD-L1是适应性免疫反应的关键调节因子，可能位于染色体9 p24。 图6. PD-L1蛋白结构域、mRNA和基因的图解表示。使用Biorender.com创建。 CD274基因的启动子区域包含许多对IFN-γ有反应的成分；因此，CD274在IFN-γ诱导的PD-L1表达上调中起着关键作用。PD-L1作为一种跨膜蛋白运作，由两个细胞外域（Ig-V和Ig-C）和一个单一的跨膜区域组成。PD-L1是一个简短的细胞质域，传递细胞内信号；它由CD274基因编码，由7个外显子组成（图7），每个外显子都编码蛋白质的特定部分。 外显子1编码细胞内和跨膜域、信号序列以及IgC样和IgV样域，而外显子7编码3' UTR和细胞内域。PD-L1基因包含七个外显子（图7），PD-L1蛋白由一个跨膜域、两个类似于免疫球蛋白C和免疫球蛋白V的细胞外域，以及一个单独的细胞内域组成。 图7. PD-L1蛋白结构、mRNA和基因。使用Biorender.com创建。 5.2.PD-L1调控 包括肿瘤细胞、巨噬细胞和T细胞和B淋巴细胞在内的各种细胞表达CD40配体1（PD-L1）。然而，并非所有肿瘤或恶性细胞都表达PD-L1，尽管它存在于癌细胞的细胞质和质膜中。图8A显示了许多启动PD-L1表达的促炎分子、VEGF、GM-CSF、LPS、TNF-α、I型和II型IFN-γ、IL-4和IL-10细胞因子。其中，活化的T细胞释放最有效的触发因子，即IFN-γ，而TGF-β、PTEN和p53抑制PD-L1表达（图8B）。与PD-L1不同，PD-L2的表达仅限于APCs。研究表明，PD-L1表达受多种信号通路、转录因子和表观遗传因素的调控。 图8. PD-L1调节信号通路。使用Biorender.com创建。 5.2.1.信号通路 A.MAPK通路 丝裂原激活蛋白激酶（MAPK）信号通路的激活可能导致PD-L1表达水平的增加。MAPK通路是非小细胞肺癌（NSCLC）中的一个致癌机制，通过激活表皮生长因子受体（EGFR）上调PD-L1。化疗药物诱导的癌细胞PD-L1上调可能是由于MAPK通路的激活。例如，MEK抑制剂U0126消除了紫杉醇诱导的PD-L1表达，而顺铂浓度通过MAPK激活触发PD-L1表达。 B.PI3K/Akt通路 磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）/Akt通路已被涉及在癌细胞中PD-L1的调控，因为已确定PI3K抑制剂降低了BRAF抑制剂耐药黑色素瘤细胞中的PD-L1表达。例如，Akt抑制消除了PTEN耗竭时发生的PD-L1增加。通过PI3K/Akt信号通路的PD-L1增加伴随着转录上调以及翻译后过程；在结肠癌细胞中，Akt的刺激导致PD-L1蛋白过表达，与PD-L1 mRNA表达水平无关。ePI3K/Akt通路的转录和翻译后机制调节各种细胞和组织以控制PD-L1表达。尽管下游效应子mTOR/S6尚未被证明介导Akt对PD-L1表达的作用，但Akt的抑制导致PD-L1表达减少。相比之下，PD-L1表达由Akt的下游靶标核因子NF-B调节，PD-L1的转录增加是由于Akt激活NF-B。 C.JAK-STAT信号通路 STAT通路被生长因子、IFNs、细胞因子和类似化学物质激活，并被认为是一个进化上保守的过程。这种策略为细胞提供了一个控制基因表达的关键工具，并代表了细胞如何响应其环境并解释信号以调节增殖和分裂的基本示例。最近的研究表明，肿瘤通过JAK/STAT系统制造PD-L1，根据Doi等人的研究，PD-L1表达可能通过使用JAK2抑制剂AG490在蛋白和mRNA水平上被阻断。这些结果支持JAK/STAT通路调节PD-L1表达的观点。此外，成纤维细胞生长因子受体（FGFR）2信号通过JAK/STAT3信号通路的有效激活与体外PD-L1表达的升高相对应。结直肠癌的异种移植模型揭示了FGFR2的过表达加速了肿瘤发展，并导致PD-L1表达激增。减轻这种影响的一种可能策略是使用JAK抑制剂来阻碍JAK/STAT3通路。 D.WNT信号通路 以前的研究表明，WNT信号的失调与肿瘤的发展、细胞从癌症到恶性的转变以及对传统癌症治疗的抵抗密切相关。异常的WNT信号破坏了癌症免疫监测的过程，导致免疫逃逸和对免疫疗法的敏感性降低，包括免疫检查点抑制剂。例如，在缺乏WNT配体的情况下，非糖基化的PD-L1在乳腺癌小鼠模型中沿GSK3B-β-TrCP轴的活跃信号时显示出加速的蛋白酶体降解。然而，GSK3阻断剂通过降低动物黑色素瘤模型中PDCD1基因表达来增加肿瘤根除。WNT活性与PD-L1表达之间的功能相互作用允许使用特定的WNT抑制剂或激活剂来治疗三阴性乳腺癌，以分别降低或提高PD-L1表达。 E.NF-κB信号通路 已经提出，Toll样受体（TLRs）或IFN-γ驱动的核因子（NF）-κB刺激PD-L1基因表达。姜黄素是一种NF-κB抑制剂，当与抗CTLA-4检查点抑制药物联合使用时，可以抑制黑色素瘤、乳腺癌和结肠癌细胞系的生长。抑制肿瘤细胞的生存和增殖，并针对肿瘤内的免疫检查点可能抑制NF-κB，这可能涉及LMP1诱导的PD-L1表达，因为咖啡酸苯乙酯（一种NF-κB抑制剂）减少了PD-L1诱导。除了INF-γ，转录因子NF-κB是PD-L1表达的关键调节因子，已被证明成功减少IFN诱导的PD-L1表达，而STAT3、PI3K和MAPK抑制剂未能实现相同的结果。Peng等人发现，化疗导致卵巢癌患者PD-L1水平更高，这是由于NF-κB介导的局部免疫抑制。 5.2.2.Hedgehog信号通路 近期的治疗进展集中在使用小分子抑制剂，如SMO和GLI，来修改Hedgehog（Hh）信号通路。该通路被认为对基质细胞的增殖至关重要，其功能的偏差可能导致肿瘤的发展。此外，Hh信号可能在调节PD-L1生产中发挥作用，Hh信号的抑制可能在淋巴细胞中引起抗肿瘤活性。根据Chakrabarti等人的研究，特定患者应该接受一种联合治疗方法，既针对Hh信号也针对免疫学检查点，因为Hh信号参与了PD-1/PD-L1的抑制，这导致Gli2诱导的耐受性和胃癌中PD-L1表达的逆转。 5.3.PD-1/PD-L1信号 许多研究报告称，通过PD-L1和PD-1之间的相互作用传递免疫病理学和免疫耐受抑制信号。PD-1/PD-L1信号可以通过磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）、T细胞受体（TCR）和磷酸酶-1（SHP-1）信号通路阻碍免疫反应（图9）。PD-L1对效应T细胞的作用和PD-1抑制TCR信号传导，进而抑制T细胞的细胞毒性。当SHP-1被抑制时，免疫受体酪氨酸基开关基序（ITSM）和酪氨酸基抑制基序（ITIM）的活动可能增强，由钠钨酸盐控制的CD8+ T细胞活性。PD-1的ITSM基序可能被ITSM酪氨酸磷酸化，然后运送SHP-2和SHP-1到ITSM基序。在这种吸收之后，信号通路阻止树突细胞和T细胞的相互作用，并抑制停止信号。最后，阻断TCR信号传输抑制了MAPK和PI3K/Akt信号。此外，Akt的激活和PI3K的抑制减少了B细胞淋巴瘤超大（Bcl-xl）表达，进而增加了T细胞凋亡。 图9. PD-1/PD-L1信号减少CD8+ T细胞的增殖、存活和细胞因子产生 。使用Biorender.com创建。 PD-L1阻断了Ras/MEK/ERK和PI3K/Akt通路，这阻止了T细胞的激活和对T细胞存活至关重要的转录因子的运作。PD-1和PD-L1之间的相互作用可能抑制T-bet和GATA-3的表达。GATA-3转录因子参与Th2细胞的产生，而T-bet转录因子可能通过结合T盒区域增强T细胞增殖。 然而，目前尚不清楚所有类型的癌症是否都使用PD-L1信号的确切机制，因为一些癌症类型的预后不同，可能由于涉及不同的PD-L1机制。 6.PD-1/PD-L1在癌症中的功能  6.1.乳腺癌  PD表达已与人类乳腺癌干细胞（BCSCs）中的上皮-间质转化（EMT）相关联。与细胞系相比，MCF-7和BT-549肿瘤球中PD-L1表达的增加可能部分归因于PD-L1启动子区域内的去甲基化。此外，肿瘤中组蛋白乙酰转移酶的过表达可以加速PD-L1转录。与细胞系相比，PD-L1启动子区域内慢速组蛋白的分布不太明显。这些结果表明PD-L1在BCSCs中具有重要功能。 最近的病理学调查确定，多种亚型的雌激素受体（ER）α阴性BC含有增加的PD-L1水平。刘等人发现ERα阴性和ERα阳性乳腺癌细胞系之间PD-L1 mRNA的平均表达存在显著差异。因此，研究了ER阴性（MDA-MB-231和BT549）和ER阳性乳腺癌细胞系（MCF7和T47D）中PD-L1的表达。根据RT-qPCR和西方印迹研究，T47D和MCF7细胞中PD-L1的蛋白和mRNA水平显著低于MDA-MB-231和BT549细胞）。最近的研究表明，PD-L1抑制癌细胞的发展，当PD-L1被沉默时，BC细胞中阿霉素诱导的和自发的死亡增加。 7.癌症中PD-1/PD-L1的抑制剂 使用PD-1/PD-L1靶向疗法可能显著减缓癌症进展。图10概述了一些关键方案，以增强癌症治疗。 图10. 恶性肿瘤中的PD-1/PD-L1抑制剂 。使用Biorender.com创建。 1.Pembrolizumab Joseph等人发现，Pembrolizumab对肺转移的治疗有效性（62%）显著高于其对肝转移的治疗效果（22%）。肺和肝转移患者的一年总生存率分别为89%和53%。被诊断为转移性鳞状细胞癌（SCCHN）和/或头颈部复发的患者总体生存率有限，通常不超过六个月。在头颈部区域使用抗PD-1检查点药物进行免疫治疗已增加了生存率和肿瘤反应。在单臂II期KEYNOTE-055试验和Ib期KEYNOTE-012试验中，Pembrolizumab治疗的转移性和复发患者的反应率为18%，中位OS为6至8个月。此外，HER2阳性、曲妥珠单抗耐药和PD-L1阳性BC患者已用Pembrolizumab和曲妥珠单抗治疗。 2.Nivolumab 完全人源单克隆抗体Nivolumab可以抑制PD-L1和PD-1之间的相互作用。赵等人描述了一个案例，一名晚期肝肉瘤患者在阿帕替尼和Nivolumab治疗后部分缓解。然而，在治疗过程中，3级氨基转移酶水平显著升高。因此，在考虑联合治疗时应谨慎，并在批准实施前进行全面评估潜在风险。CheckMate 275 2期临床试验的结果表明，先前治疗中对基于铂的化疗表现出耐药性的晚期尿路上皮癌患者可能在使用Nivolumab后有良好结果。与基于铂的化疗后可用的少数化疗选择相比，免疫治疗有许多优势之一是其治疗效果的持久性增加。其他试验的长期生存率证实了这一点，包括3期CheckMate 057（n=582）和CheckMate 017（n=272）试验。这些研究比较了先前治疗过的晚期非鳞状NSCLC中多西他赛和Nivolumab的有效性。在CheckMate 057和017试验组中，多西他赛的预测3年总生存率为8%，而非鳞状NSCLC患者为17%，预测的2年OS率，多西他赛为8%，而鳞状NSCLC分别为16%和29%，分别为多西他赛和Nivolumab。 3.JQ1 刘等人研究了JQ1对多种癌细胞系和从肾细胞癌衍生的原代培养细胞中PD-L1蛋白和mRNA表达的影响。这些癌细胞系包括多种恶性肿瘤，包括前列腺、肺和肝肿瘤。这些作者报告称，JQ1对细胞生长有剂量依赖性的抑制作用。在用JQ1处理后，肺、肝、前列腺和肾癌细胞系的原代培养中观察到PD-L1表达减少。此外，在用JQ1处理的细胞中还观察到PD-L2水平的下降。因此，JQ1似乎有能力调节PD-1/PD-L1轴。 4.Cemiplimab 使用PD-1抑制剂在治疗晚期皮肤鳞状细胞癌（cSCC）方面取得了积极成果。Cemiplimab是一种单克隆抗体，能够结合程序性死亡受体-1（PD-1），抑制其与PD-L2和PD-L1的相互作用。2018年9月，食品药品监督管理局（FDA）批准Cemiplimab用于治疗局部晚期转移性结直肠癌患者，这些患者不适合放射治疗或手术。 5.Atezolizumab Atezolizumab是一种经过人源化设计的单克隆抗体，旨在选择性地抑制PD-L1与其受体B7.1和PD-1之间的相互作用。这种化合物增强了T细胞对肿瘤状况的免疫反应。Atezolizumab单药治疗已成为转移性NSCLC和UC的潜在治疗选择。最近，IMmotion 151 3期研究比较了舒尼替尼与贝伐珠单抗（抗VEGF）和Atezolizumab作为结直肠癌可能的一线治疗。根据免疫组化，贝伐珠单抗/Atezolizumab实现了其共同主要目标之一，即在与舒尼替尼相比，表达PD-L1的肿瘤浸润免疫细胞≥1%的晚期结直肠癌患者中显示出更好的研究者评估的PFS。 6.Avelumab 单克隆人IgG1抗体Avelumab抑制PD-L1受体。1b期研究（JAVELIN Solid Tumor）显示，先前接受过治疗的复发或转移性NSCLC患者的肿瘤和免疫细胞中PD-L1表达减少。包括55名晚期肾细胞癌患者的1b期、非随机试验结果显示，阿西替尼和Avelumab的联合使用是有效的。具体来说，58%的患者有成功的反应，78%的患者病情得到控制。 8.结论 PD-1/PD-L1的结合对许多恶性肿瘤至关重要；因此，需要在这一领域进行更多的研究。根据所提供的证据，这种结合在癌症治疗中既提供了机会也带来了挑战。由于许多实体癌症，特别是乳腺癌，表达高水平的PD-1/PD-L1，癌症治疗主要涉及靶向疗法。免疫疗法的有希望的发现表明，这种治疗可能会延长特定患者的生存期。PD-1/PD-L1免疫疗法阻断可能是各种癌症类型的下一个合理的进展；然而，还有许多因素尚待确定，包括剂量、持久性、有效性和安全性。 为促进抗体行业的交流与创新，2024年10月16-17日第七届金秋十月抗体产业发展大会如约而至。会议旨在为研究人员提供一个互动交流的平台，有助于推动抗体产业的进一步发展。 会议内容 时间：2024年10月16-17日 地点：上海（酒店定向通知） 规模：600-800人 主办单位：生物制品圈、抗体圈 演讲支持：Entegris、瑞孚迪、AS ONE CORPORATION 会议费用：免费FREE!（仅收取100元报名定金，含参会学习、茶歇、会议手册，定金概不退还），先到先得，报完即止！ 报名方式：扫描下方二维码或点击文章最底部“阅读原文”→ 填写表格 → 报名成功（报名志愿者，承担一定工作，请慎重考虑，免交定金）！ 组委会获得报名信息后，根据报名信息进行初筛，并进一步与报名者沟通确认，实现精准邀请。最终有机会进入大会微信群（严格审核通过）。 日程安排 更多嘉宾正在邀请中 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

感谢关注转发，欢迎学术交流 回复药渡Cyber，领取文献原文 请点击此处链接观看CyberSAR系统详细使用教程 快看版 炎症性肠病（IBD）的特点是免疫反应异常，包括胃肠道（GI）中促炎细胞因子升高，例如肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白细胞介素6（IL-6）。本研究介绍了2,4,5-三甲基吡啶-3-醇类似物的合成和抗炎活性评估，该类化合物对TNF-α和IL-6诱导的炎症具有双重抑制作用。基于3D形状的靶点识别、建模和对接，确定了化合物6-26是G蛋白偶联雌激素受体1（GPER）最有效类似物，该类似物在改善炎症和恢复结肠粘膜完整性方面表现出显著功效。SPR测定结果进一步验证了这一点，该结果显示与GPER直接结合，并且发现GPER敲低消除了化合物6-26对TNF-α和IL-6作用的抑制作用。值得注意的是，化合物6-26无细胞毒性，与G1和G15（分别是众所周知的GPER激动剂和拮抗剂）不同，G1和G15分别诱导独立于GPER的坏死性凋亡。这些发现表明GPER选择性化合物6-26有希望作为IBD的候选治疗药物。 药渡CyberSAR系统在本研究中发挥了关键作用，提供了对GPER1靶点分子的深入解析。系统通过聚类结构视图和原始结构视图，展示了与靶点相关的活性分子，并以研发阶段时光轴的形式呈现了潜力Hit。此外，CyberSAR还提供了适应症和试验设计的可视化分析，帮助研发人员快速获取靶向结构信息，开拓研究思路。尽管CyberSAR在分子的初步开发中未被使用，但其在解析和优化药物分子方面显示出巨大的应用潜力。 图1.化合物6-26发现和分子优化过程 正文版 炎症性肠病（IBD）是胃肠道的慢性复发性炎症。根据病理特征，它大致分为两种主要类型：克罗恩病（CD）和溃疡性结肠炎（UC）。IBD的确切病因尚不清楚，认为是多因素造成的。然而，固有免疫和适应性免疫的缺陷性免疫功能是IBD发病的主要因素。尽管不同类型的T细胞参与CD（Th1/Th17相关）和UC（Th2相关），是IBD中引发白细胞浸润和随后肠道损伤的关键因素，异常高水平的促炎细胞因子，尤其是肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白介素-6（IL-6）。TNF-α和IL-6引起的肠上皮炎症反应具有与复发性炎症和上皮损伤相关的共同信号通路。该通路涉及NF-κB和STAT3的激活，诱导各种炎症相关基因表达，包括TNF-α和IL-6。用抗TNF-α抗体药物的靶向治疗策略已被证明对治疗IBD非常有效。这些成功的开发继续延伸到IL-6抑制剂，例如抗IL-6受体抗体（Sarilumab、Tocilizumab）和抗IL-6抗体（司妥昔单抗）。然而，一些IBD患者在最初或最初有反应后（初次和继发性无反应患者）对这些药物没有反应。此外，这些昂贵的抗体疗法可能导致不良反应，包括严重感染、免疫抑制和淋巴瘤。 越来越多的证据表明，雌激素受体有助于IBD的发病机制，与它们在其他慢性炎症性疾病（如关节炎、实验性自身免疫性脑脊髓炎、系统性红斑狼疮和结肠炎）中的作用类似。流行病学研究表明，与非HRT使用者相比，绝经后激素替代疗法（HRT）可减少IBD患者发生慢性复发性炎症活性。雌激素受体α（ERα）和β（ERβ）在IBD中发挥重要作用。IBD结肠中高表达的ERβ减少，导致其抗炎作用丧失，这是通过自噬促进和P2X7R下调介导的。此外，雌激素的抗炎作用还通过G蛋白偶联雌激素受体1（GPER，也称为GPR30）（快速调节的膜结合受体）介导信号分子。GPER的抗炎作用已在研究中得到证实，其中小鼠中的GPER敲除导致血浆炎症细胞因子水平增加，对化学诱导的IBD小鼠用GPER激动剂G1可改善结肠炎。GPER已被广泛应用在许多细胞中表达，包括免疫细胞、大脑、心脏、肾脏和肠道。根据细胞类型，GPER通过不同的G蛋白发出信号，包括Gαs、Gαi、Gαq/11和Gβγ蛋白。除了cAMP和ERK的激活外，GPER信号还与其他信号分子相互作用，例如JAK/STAT3、YAP/TAZ、CREB、Elk1和NF-κB。NF-κB参与多种促炎细胞因子的基因表达，包括TNF-α和IL6，进而通过受体信号转导诱导磷酸化STAT3的核转位。对NF-κB和STAT3敲除或过度表达的细胞进行的研究也支持TNF-α或IL-6诱导NF-κB和STAT3的核转位。NF-κB 和STAT3彼此独立。总而言之，越来越多的证据表明，激活GPER可抑制TNF-α和IL-6信号传导，这对于难治性IBD患者来说是一种有效的治疗策略。 此前，采用基于表型的药物发现策略，在体外IBD模型中报道了6-烷基酰胺-2,4,5-三甲基吡啶-3-醇作为双重抑制剂，可对抗TNF-α和IL-6诱导的炎症活性。苯乙基类似物（6-29），连接到6-酰胺基的苄基和环己基侧链表现出高活性，可能是由于这些侧链提供了一定程度的平坦性。在本研究中，为了更好的双重抑制，扩大了侧链的范围以增加其平坦度并将其直接连接到酰胺基官能团上。在IBD药物发现的背景下，针对单个分子可能无法完全解决该疾病的多方面发病机制。为了克服这个问题，作者建立了基于细胞的筛选系统。该系统模拟由炎症细胞（如单核细胞和巨噬细胞）持续流入引起的结肠组织损伤，这些细胞被TNF-α或IL-6（IBD中主要的促炎细胞因子）激活。化合物对细胞因子诱导的单核U937巨噬细胞（TPA处理的U937细胞）-上皮细胞（HT-29）粘附的抑制活性通过测量附着细胞发出的荧光信号来确定。然后，使用CADD（例如基于3D形状的对齐、建模和对接）将GPER识别为有希望的分子靶标。通过SPR测定和一系列细胞功能分析，验证了该化合物与GPER的直接结合。 结构-活动构效关系研究 化合物（6-01~6-28）对TPA处理的单核U937细胞（U937巨噬细胞）与结肠上皮样HT-29细胞粘附的抑制活性在表1中以％抑制表示。黏附由TNF-α和IL-6诱导。一般来说，针对TNF-α诱导的粘附系统的活性与针对IL-6诱导的系统的活性高度相关。 在TNF-α诱导的测定中，在6-01的苯环（Ar=Ph）的邻位和对位引入甲基使活性增加2.5倍和3.5倍（分别为6-02和6-03），但在IL-6诱导的系统中则不然。而大的叔丁基取代基并没有增强活性（6-04）。苯环引入邻位F和间位F取代基使TNF-α诱导的粘附活性增加两倍和三倍（分别为6-05和6-06），而对位F取代该活性丧失。当氟和甲基取代基（6-08和6-09）活性增加。具有氟化物取代基的类似物（6-05~6-09）显示TNF-α诱导系统和IL-6诱导系统之间存在相当大的相关性。与邻-F相反，邻-Cl降低了活性，而邻位、对位双取代增加了活性（分别为6-10和6-11）。给电子甲氧基提供低活性，除非位于邻位（6-12 vs 6-13和 6-14）。在五元芳环中，含噻吩类似物的活性高度依赖于结构化学（6-17 vs 6-20），而呋喃则不依赖于结构化学（6-18 vs 6-21）。异恶唑表现出非常高的活性（6-22），而苯基取代基的引入降低了活性（6-23）。相反，呋喃环上的类似取代保持了非常高的活性（6-18vs 6-19）。联芳基的作用似乎相当复杂（6-19和6-23），这引发了对双环的探索。萘基团普遍表现出较高的活性（6-15和6-16）。未取代的3-氯苯并[b]噻吩的活性可忽略不计（6-24和6-25）。然而，6位的额外取代产生了广泛的活性。最强的吸电子氟在TNF-α和IL-6诱导的测定中产生最好的活性（6-26），分别达到90.3%和79.2%。IC50值揭示了有趣的结果。化合物6-26的IC50值分别为0.23μM（TNF-α诱导测定）和0.35μM（IL-6诱导测定），而对照药物托法替布的IC50值分别为0.70μM和0.48μM。与另一种对照药物美沙拉嗪进行比较，发现了更显著的差异。临床实践中，美沙拉嗪通常用于治疗以轻至中度疾病活动为特征的UC。每天服用4g剂量，美沙拉嗪对肠上皮细胞发挥局部作用，主要是局部作用而不是全身吸收。化合物6-26所产生的IC50比美沙拉嗪高出几乎六个数量级。从F>Cl>Me（6-26、6-27、6-28），吸电子性降低，活性降低。还比较了最好的类似物（6-26）。与化合物6-29，6-烷基酰胺类似物我们之前报道为针对TNF-α和IL-6的最佳双抑制剂。在TNFα和IL-6诱导的测定中，化合物6-26的抑制活性均优于化合物6-29。 表1中的化合物显示，对TNF-α诱导的粘附的抑制活性与对IL-6诱导的粘附的抑制活性之间存在正相关性（图2A）。包括所有化合物的简单线性回归表明，x的1单位增加（对TNF-α诱导的粘附的抑制百分比）平均与y值增加0.76（IL-6诱导粘附的抑制百分比）（P<0.0001）。在亚组分析中，活性较高的化合物（对TNF-α诱导的抑制活性大于40%）表明两个变量之间的相关性较强。x的A1单位增加平均与y值增加0.98相关（图2C，P<0.0001，R2=0.9618）。在另一组活性较低的化合物中（TNF-α诱导的粘附抑制活性≤40%），虽然x和y之间的关系具有统计学意义（β=1.48，P=0.01），但回归模型的解释力相当弱（R2=0.4670），表明两个变量之间的相关性较弱（图2B）。 化合物6-26的体内药效 6-26在IBD大鼠和小鼠模型中改善结肠炎。测量了最佳双抑制剂6-26在IBD动物模型中的体内疗效。在2,4,6-三硝基苯磺酸（TNBS）诱导的大鼠结肠炎模型中，口服6-26（1mg/kg）显著逆转了TNBS诱导的体重下降以及结肠组织重量/长度的增加（3A）。6-26（1mg/kg）的恢复效果强于较高剂量的柳氮磺胺吡啶（300mg/kg），柳氮磺胺吡啶是一种抑制NF-κB的IBD药物，但药效非常弱。TNBS诱导的髓过氧化物酶（MPO）水平（图3B），中性粒细胞浸润的指标，和单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）水平（图3C）在结肠组织中通过口服给药6-26得到显著抑制，优于300倍高剂量的柳氮磺胺吡啶（SSZ）。同样，TNBS诱导的结肠组织中炎性细胞因子、TNFα、IL-6、IL-1β和ICAM-1的表达显著减少了6-26。相反，TNBS诱导的E-钙粘蛋白（稳定上皮连接的分子）表达的减少又恢复了6-26（图3D）。 此外，还研究了化合物6-26非慢性和复发性IBD模型的剂量依赖性改善活性，对小鼠使用两个周期的葡聚糖硫酸钠（DSS）治疗6天，随后14天给水。每天口服化合物6-26，持续5周，每周6天，显著阻断DSS引起的体重下降（图4A）和结肠炎症、出血性损伤和长度缩短（图4B）。化合物6-26的体重（图4A、D）和结肠重量（图4C、D）的恢复是剂量依赖性的，并且比使用托法替布（30mg/kg）和SSZ（300mg/kg）一致。化合物6-26以剂量依赖性方式抑制DSS诱导的结肠MPO水平，其效果强于托法替布和SSZ（图4E）。 化合物6-26对DSS引起的结肠粘膜损伤的功能性愈合作用 通过评估肠渗透性的变化来进一步评估化合物6-26在IBD模型中的剂量依赖性粘膜愈合效果。肠粘膜渗透性是肠屏障功能的一个关键方面，对于保护身体免受病原体和毒素的侵袭以及促进营养吸收至关重要。DSS诱导的肠道炎症会破坏紧密连接相关蛋白的表达，损害上皮屏障的完整性，这是在人类 IBD中观察到的一个标志。这种最初的破坏随后会加剧症状，包括通透性增加、出血和死亡。在评估化合物6-26治疗效果的急性结肠炎模型中（图5A），DSS诱导的结肠炎以糜烂、溃疡、隐窝丢失和苏木精和伊红（H&E）染色组织的组织病理学检查显示明显的中性粒细胞浸润为特征（图5B）。然而，这些病理学改变是严重的。通过化合物6-26依赖性改善（图5B、C）。来自DSS治疗组的血液样本表现出口服给予的异硫氰酸荧光素（FITC）右旋糖酐（4kDa）的水平显着升高（图5D），而在给予化合物6-26后该水平显著降低（图5D）。重要的是，化合物6-26的粘膜愈合效果超过了托法替尼和SSZ治疗组。 体外安全性评估 化合物6-26在10μM浓度下对五种主要的人肝细胞色素P450（CYP）酶（包括CYP1A2、CYP2C19、CYP2D6、CYP2C19和CYP3A4）的抑制作用进行了测试。如表2所示，通过这些主要CYP亚型潜在的药物相互作用，化合物6-26似乎可以忽略不计。此外，浓度为10μM时，6-26对hERG通道表现出非常弱的抑制作用（表2），表明心脏毒性（例如心律失常）的风险较低。 体内急性毒性研究 为了评估化合物6-26的安全性，通过以30和300mg/kg的剂量单次口服给予6-26，对ICR小鼠进行了急性毒性研究。给药后，在14天的过程中，与对照组（载体）相比，实验组中没有观察到体重减轻或不良反应情况，例如异常行为、食物和水摄入以及消化紊乱（图6A）。随后，对小鼠实施安乐死，并收集组织样本进行分析。通过H&Estaining进行的组织病理学检查显示，化合物6-26组没有明显的组织损伤或炎症反应（图 6B、C）。这些发现有力地支持了化合物6-26的良好安全性，值得考虑在药物开发工作中进一步推进。 药代动力学研究 在静脉内（IV，1mg/kg）和口服（PO，1mg/kg和5mg/kg）给药后，在大鼠中评估化合物6-26的药代动力学（PK）曲线。如表3所示，口服6-26（5mg/kg）显示AUC(0-t)为1849±714h·ng/mL，MRT(0-t)为5.0±0.7h，半衰期为3.3±0.4h，血浆中Cmax为760±684ng/mL，静脉注射6-26（1mg/kg）分别为1006±417h·ng/mL、1.2±0.1h、2.0±0.6h和1880ng/mL。5mg/kg口服给药显示生物利用度（F）为36.7%。AUC显示口服给药1和5mg/kg之间存在显著的剂量依赖性。综上所述，表明6-26具有良好的口服给药PK特性。 化合物6-26抑制TNF-α和IL-6诱导的NF-κB和STAT3核转位 研究了化合物6-26的细胞水平作用机制。由于化合物6-26抑制TNF-α和IL-6诱导的细胞反应，继续研究6-26的抑制作用是否与核NF-κB和p-STAT3水平的改变相关，它们是TNFR1信号通路的下游靶点和IL-6受体。虽然已知TNF-α和 IL-6可以增加核NF-κB和p-STAT3，但每种刺激激活这些转录因子的时间顺序仍然未知。本研究首先比较了TNF-α和IL-6在HT-29细胞中诱导NF-κB和p-STAT3核转位的程度。在治疗后TNF-α分别在5min NF-κB和在1h后诱导p-STAT3核转位，而IL-6在5min诱导p-STAT3和30min诱导NF-κB核转位。治疗后1小时，TNF-α和IL-6使核NF-κB增加的倍数分别为7倍和4倍，而TNF-α和IL-6使核p-STAT3增加的倍数几乎相似，均为5倍。这些结果通过免疫染色得到进一步证实。用6-26预处理HT-29细胞显着抑制TNF-α和IL-6诱导的NF-κB和p-STAT3核转位（图7A，B）。在TNF-α和IL-6处理的HT-29细胞中，6-26（1.5μM）对NF-κB和pSTAT3核转位的抑制作用大于美沙拉嗪（20mM）和托法替布（5μM）（图7C，D）。此外，化合物6-26的这种抑制作用超过了先前报道的化合物6-29（图7C、D）。 化合物6-26的靶标识别 目前已经使用相似性分析、机器学习和对接等多种方法来预测小分子的大分子靶点。这些方法是药物发现（包括药物重新定位）的宝贵工具。Kirchmair小组根据3D分子形状与非复杂分子的相似性，应用基于比对的方法来识别结构复杂小分子的靶标。他们证明了这种基于形状的靶标预测方法非常稳健且成功。受这项工作的启发，作者采用ROCS，一种领先的基于形状的分子比对软件查询分子与生物活性化合物进行匹配。IUPHAR/BPS药理学指南提供了专家驱动的药物靶点及其配体知识库，而ChEMBL提供了具有药物样特性的生物活性分子数据库。因此，作者从IUPHAR/BPS中检索了一系列药物靶点，并从ChEMBL中提取了每个靶点的生物活性分子的数据记录。活性和非活性之间的阈值pChEMBL值设置为5.0，对应10μM的IC50，EC50以及其他相关测量指标。通过去除盐和电荷中和来标准化化合物，然后滤除分子量小于250或大于600的分子。如果分子不具有明确的立体化学，则列举立体异构体。最后，使用 OMEGA.62为每个分子生成了多达50个构象异构体，总共活性化合物生成了大约2600万个构象异构体。 随后，使用OMEGA生成了化合物6-26的单一3D构象。然后将化合物6-26的形状和颜色特性与先前生成的活性化合物的构象异构体进行比对。这些命中化合物的靶标包括caspase-3、NPC1、Sentrin特异性蛋白酶、MAOB和COX-1、碳酸酐酶、menin、CCR6、PDE7A、HSP90a、S1PR4、GPER1和S6K-alpha-2。在这些靶标中，与观察到的表型结果最相关的是caspase-3、MAOB、COX-1和GPER1（表4）。随后进行了实验来评估6-26是否抑制MAOB和COX-1，但它们没有表现出抑制作用。命中化合物CHEMBL3233622得分最高，为1.575，具有caspase-3抑制活性，IC50为38.15nM。CHEMBL3233622属于1,2-苯并异噻唑-3-酮衍生物类，其中酮基的存在对于caspase-3的结合至关重要。6-26苯并噻吩环中缺乏酮基；因此，预计caspase-3活性不会很强。最后，6-26还具有与GPER激动剂CHEMBL4204670的高比对得分（Tanimoto组合得分＝1.411），其具有480nM的EC50值。使用ROCS计算的6-26和CHEMBL4204670的3D比对如图8A所示，显示了6-26的苯并噻吩环和CHEMBL4204670的吲哚环之间的大致对应关系。这些化合物之间的重叠可以进一步区分为形状和颜色成分（图8B），表明形状成分的贡献大于颜色的贡献。 化合物6-26与GPER对接实验 研究了6-26是否可以通过蛋白质-配体对接与GPER结合。从 AlphaFold蛋白质结构数据库中获得了由AlphaFold（AF-Q99527-F1-model_v4）生成的人类GPER 3D模型。利用CAVIAR来识别结合位点，并设置结合盒来包围该空腔。使用Flare6.0将6-26对接到该结合腔中。最佳结合姿势的ΔG为-9.9kcal/mol，表明6-26与GPER具有很强的结合相互作用。在图9所示的结合姿势中，主要相互作用似乎是Phe208和苯并噻吩之间的π−π相互作用。这种结合姿势与Arnatt小组提出的结合姿势一致。 化合物6-26直接结合在GPER 针对6-26的分子靶标，利用SPR研究了6-26与人GPER蛋白的直接结合。描述结合动力学的传感图如图10所示。数据分析显示6-26对GPER具有结合亲和力，KD值为2.37×10−8M。SPR数据的可靠性经过Chi2和U值。在实验中，获得了令人满意的Chi2（