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摘要：过继免疫治疗使用嵌合抗原受体（CAR）重定向的T细胞是一种新的治疗范式，它使用一类新的治疗“药物”在某些迄今为止难以治疗的B细胞恶性肿瘤患者中产生完全且持久的缓解。CAR T细胞源自患者自身的免疫细胞，这些细胞在体外通过基因工程改造，带有能够结合特定目标并在目标结合时传递激活信号的CAR。CAR激活细胞毒性T细胞以有效、重复和持久的方式破坏和消除识别的癌细胞。然而，各种障碍限制了CAR T细胞在其他类型的癌症或其他疾病中的广泛应用。目前的挑战包括设计最优的CAR、积极穿透肿瘤病变，并在不诱导对健康组织产生毒性的情况下维持T细胞的抗肿瘤激活。本章回顾了CAR的代际、增强CAR T细胞效力和选择性的策略，以及为日益增多的患者建立高效的制造流程。 1.原型嵌合抗原受体（CAR，T-Body，免疫受体） 在20世纪80年代中期，Steven A. Rosenberg（美国国立卫生研究院）将从黑色素瘤活检中分离并大量体外扩增的肿瘤浸润性淋巴细胞（TILs）重新注入黑色素瘤患者体内时，患者T细胞识别和有效摧毁癌细胞的能力变得显而易见。这些以及随后的发展促使了采用自体免疫细胞治疗肿瘤患者的概念，这些免疫细胞有能力在大量患者中诱导肿瘤退缩和长期缓解。这些扩增的TILs被认为对特定肿瘤抗原具有特异性，并具有迁移能力以进入肿瘤病变；然而，抗原特异性大多仍然未知。 接下来的几年中，为了给患者的T细胞提供明确的靶向特异性，人们付出了巨大的努力；与T细胞受体（TCR）链或重组嵌合抗原受体（CAR）的遗传工程化，证明是成功的策略之一。与TCR不同，CAR是一个复合的、单多肽链跨膜受体，它在目标识别时提供靶向特异性和T细胞激活能力。原型CAR由四个主要结构域模块化组成：在细胞外末端是用于目标识别的单链可变区（scFv）抗体，一个连接到跨膜结构域的间隔区，以及主要来自TCR/CD3ζ或Fcε受体I（FcεRI）的细胞内信号传导结构域，有或没有连接的共刺激结构域（图1）。目标细胞表面的同源抗原的参与启动了CAR工程化免疫细胞的激活，导致持久的T细胞反应。每个CAR结构域都有独特的功能，并对重定向的T细胞激活产生影响；对于每个特定应用，CAR设计需要进行一些调整，以提供优化的靶向和T细胞激活，如下文详细描述。 图1 嵌合抗原受体（CARs）的世界在不断增长。第一代CAR在细胞外域（外域）中拥有抗原结合和间隔基团，在跨膜域中，在细胞内域（内域）中拥有来自CD3ζ或FcεRI γ链的激活基团。第二代CAR除了拥有一个共刺激域之外，第三代CAR在内域中拥有两个共刺激域。第四代CAR（“TRUCK”，“T细胞重定向用于通用细胞因子介导的杀伤”）由第二代或第三代CAR组成，该CAR在CAR信号传导后诱导转基因蛋白的表达。虽然在规范设计中描绘，但已经工程化了大量CAR变体，每种变体都针对不同的应用进行了优化。 原型CAR的基本设计最初由Zelig Eshhar及其同事（魏茨曼科学研究所）提出，他们展示了一个模块化复合受体，最初命名为“T-Body”或“免疫受体”，具有用于结合的抗体衍生结合域和用于T细胞激活的TCR信号域，为工程化T细胞提供了特异性识别和激活。在随后的几年中，引入了许多修改，允许靶向广泛的抗原，并通过各种细胞内结构域发送信号，以启动和重定向定义的免疫细胞功能（表1）。 表 1 CAR构建模块及其替代模块。 EMA（欧洲药品管理局）批准。其他使用其他宿主细胞和不同CAR设计的应用程序也在早期临床试验中越来越多地被研究。 规范的CAR由抗体衍生的结合域、间隔区、跨膜域和细胞内主要及共刺激信号域模块化组成。每个结构域可以通过不同的模块构建，这些模块影响不同的变量，并最终影响T细胞的激活和性能。 CAR工程化的细胞毒性T细胞重定向至癌细胞是该技术研究最多的应用；自体抗CD19 CAR T细胞的过继转移成为美国食品药品监督管理局（FDA）批准的首个基因工程细胞疗法；随后，欧洲药品管理局（EMA）也批准了。使用其他宿主细胞和不同CAR设计的其他应用也越来越多地在早期临床试验中研究。 2.CAR的模块化组成：细胞外CAR结构域 2.1.结合域 抗原结合域传统上由来自小鼠或人类单克隆抗体的单链可变区（scFv）组成。通过短柔性连接子（通常是(Gly4Ser)3肽）将重链（H）和轻链（L）抗体链的可变（V）区域连接起来，形成VH-linker-VL或VL-linker-VH的顺序。甘氨酸残基提供了灵活性，以允许VH和VL正确折叠形成抗原结合口袋，而丝氨酸则为连接子提供了一些溶解性。VH和VL链的空间位置和相互作用可以显著影响亲和力、特异性和溶解性。足够高的结合亲和力对于诱导T细胞激活至关重要；然而，存在一个亲和力上限，超过该上限CAR介导的T细胞激活不会改善，但会导致激活诱导的细胞死亡（AICD）。在CAR的背景下，一些scFvs通过张力信号独立于抗原参与诱导AICD、耗竭和T细胞的终端分化。除了亲和力和细胞表面的抗原密度外，目标表位在抗原内的位置也很重要；通常，靶向膜近端表位比靶向膜远端表位诱导更强的T细胞激活。 通过使用抗体进行靶向，CAR介导的识别是MHC独立的。这在靶向MHC-肽处理和呈递机制有缺陷的肿瘤时是有益的。此外，通过抗体识别目标，还可以识别传统T细胞看不见的抗原，如碳水化合物、脂质或抗原的结构变体。规范的CAR识别目标细胞表面的抗原；也可以通过使用特异性针对定义的MHC-肽复合物的抗体，工程化MHC-肽识别CAR，使其能够感知由MHC呈递的细胞内抗原。例如，一个scFv识别HLA-A2背景下的NY-ESO-1肽的CAR提供了与相应TCR类似的TCR样识别目标。 2.CAR的模块化组成：细胞外CAR结构域 2.2.间隔区 原型CAR经常在抗原结合域和跨膜域之间包含一个“间隔区”，以便接近目标抗原；连接的铰链区提供了一定的灵活性。间隔区的类型和长度对于最佳目标结合和信号传递至关重要。间隔区并非必需，因为有些CAR在scFv直接融合到跨膜域时是活跃的，而其他CAR只有在具有一定长度的间隔区时才活跃。间隔区通常来源于IgG1或IgG4恒定域或来自细胞外CD28、CD4或CD8（图2）。一般的想法是，间隔区在工程化T细胞和相应目标细胞之间提供最佳距离，以允许与目标细胞形成有效的接触区。基于TCR-MHC相互作用的知识，人们普遍认为CAR-目标相互作用需要在T细胞和目标细胞之间创建约15纳米的距离，以最佳形成接触区。因此，针对膜近端表位需要较长的间隔区，而较小的间隔区对更远离膜的表位是最佳选择；通过使用不同长度的间隔区可以轻松调整距离。在这个背景下，IgG衍生的间隔区具有可以通过结合一个、两个或三个CH1-CH2-CH3部分来调整长度的优势。IgG1衍生的间隔区还有利于CAR分子的稳定；然而，它可能与髓系细胞上的Fcγ受体（FcγR）（CD64）结合，介导CAR T细胞和髓系细胞的“非肿瘤”激活。这可以通过删除间隔区内的IgG1 CH2域或通过删除IgG1 Fc受体结合部分内的Asn297糖基化位点来预防。类似的修改也可以引入到IgG4间隔区。 图 2 第二代CAR设计的变体。由于模块化组成，可以使用各种替代域来构建CAR，其中一些示例性地列出。各个组分的变化允许调节CAR的结合和信号传导，最终调节细胞功能、代谢和工程化T细胞的抗肿瘤活性。其他变体旨在提高结合亲和力、目标的可及性、信号强度和细胞膜上的持久性等。最后，安全预防措施导致CAR设计中进一步的修改。 2.3.跨膜区 典型CAR的跨膜区来源于如CD3ζ、CD4、CD8α、CD28或OX40等类型1跨膜蛋白，由20-23个疏水性氨基酸组成，富含亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸（图2）。带有CD3ζ跨膜域的CAR似乎比其他CAR更有效地整合到TCR/CD3复合体中，因此在表达和信号传导方面更为稳健；带有CD28跨膜区域的CAR似乎同样稳定。另一方面，带有CD8α铰链和跨膜域的CAR不易于AICD；然而，它们通过减少促炎细胞因子的释放来介导较少的T细胞激活。 2.4.细胞内信号传导域 “第一代”CAR完全通过主要信号传导域（信号-1）进行信号传导。TCR/CD3ζ细胞内链含有三个免疫受体酪氨酸激活基序（ITAMs），FcεRI γ链含有一个ITAM，这些在磷酸化后作为下游信号蛋白的特定适配器。因此，CAR利用内源性TCR信号机制来启动T细胞激活事件的级联。下游激酶如Lck或Fyn也可以作为CAR介导的T细胞激活的主要信号，等等（图2）。CAR信号传导域本身足以与下游激酶结合并启动有效的激活级联，因为CAR在TCR敲除细胞和非T细胞如NK细胞中也是功能性的。然而，仅有主要信号的CAR不足以激活以允许长期持久；这样的CAR T细胞迅速进入凋亡。根据“双信号假说”，静息T细胞还需要一个共刺激信号以持续激活。这就是将主要信号与共刺激信号（信号-2），如CD28或4-1BB（CD137），结合在“第二代”CAR中的理由。也在临床前和临床上探索带有替代共刺激域的CAR，如OX40、ICOS、CD27、CD40-MyD88、CD2和CD244。为了方便下游激酶的接近，CD28通常位于膜近端位置，随后是远端位置的CD3ζ；OX40和4-1BB在膜远端和近端位置都活跃。与第一代CAR相比，第二代CAR T细胞在细胞因子释放、扩增和抗肿瘤活性方面显示出稳健和持久的反应。 CAR介导的共刺激以不同的方式影响T细胞效应功能、存活、持久性和代谢。例如，4-1BB CAR T细胞在患者血液中的持久性超过6个月，而CD28 CAR T细胞在3个月之后大多无法检测到。经过重复刺激后，CD28 CAR T细胞重新编程为CD45RO+ CCR7−效应记忆细胞，这些细胞随后需要OX40来延长持久性并避免快速耗竭；4-1BB CAR T细胞主要转化为CD45RO+ CCR7+中央记忆细胞，并在外围血液中长期持久。CD28 CAR信号激活PI3K/Akt/mTOR途径，刺激有氧糖酵解，增加葡萄糖摄取和ATP生成，而4-1BB CAR信号激活Wnt/β-catenin途径和脂肪酸氧化，增加代谢和线粒体呼吸链能力。典型的Wnt/β-catenin有利于中央记忆细胞的形成和T细胞的长期存活，而CD28诱导的PI3K/Akt信号维持效应细胞的即时响应。在高剂量下，CD28和4-1BB CAR T细胞都能在临床前模型中根除大型已建立的肿瘤；在低剂量下，CD28 CAR T细胞比4-1BB CAR T细胞表现出更大的耗竭程度，结果是4-1BB CAR T细胞在长期内更有效地根除大型肿瘤负荷。另一方面，带有4-1BB CAR的T细胞仍然对肿瘤介导的通过TGF-β的抑制敏感，这对CD28 CAR T细胞来说较少见。因此，选择CAR设计的标准取决于多个参数，包括T细胞持久性、抗抑制能力、共刺激和共抑制配体的模式、肿瘤细胞上的抗原密度、T细胞上的CAR密度等。 “第三代”CAR结合两个共刺激域以及主要激活信号。联合共刺激的好处只在少数情况下得到证明，例如，通过CAR提供CD28-OX40共刺激对T细胞在终端成熟中的进展有益。 3.TRUCK：“第四代”CAR T细胞 CAR T细胞可以用来按需将转基因蛋白输送到预定的、靶向的组织。因此，CAR T细胞被设计成带有CAR诱导表达盒的额外“有效载荷”。所谓的“第四代”CAR T细胞，即TRUCKs（“T细胞重定向用于通用细胞因子介导的杀伤”），旨在在靶向组织中沉积分泌型转基因蛋白，以实现治疗有效浓度（图3）。“有效载荷”的表达受NFAT6-IL-2最小启动子的控制，该启动子在CAR信号传导时被激活；有效载荷可以是转基因编码的任何蛋白或肽。这种策略特别有趣，因为它结合了重定向CAR T细胞攻击和局部沉积的生物活性蛋白的作用，同时避免了系统毒性。只要CAR T细胞保持激活状态，TRUCKs就会沉积转基因产物，例如，IL-12或IL-18作为转基因免疫调节剂，以特定方式塑造靶向肿瘤环境，而不引起系统毒性。累积的TRUCK产生的IL-12在CAR靶向的肿瘤组织中招募天然免疫细胞，如NK细胞和巨噬细胞，在那里反过来启动二次抗肿瘤免疫反应。IL-12 TRUCKs抵抗Treg细胞的抑制，并显示出增加的细胞因子释放和扩增。当快速进展的肿瘤积累抗原丢失的癌细胞，导致对CAR T细胞不可见的肿瘤复发时，这种策略特别有趣。释放IL-18的TRUCKs将CAR T细胞转化为T-bet高FoxO1低效应细胞，抵抗耗竭并显示出对大型已建立肿瘤的优越细胞毒性。IL-18 CAR T细胞治疗改变了整个肿瘤免疫细胞景观，特别是通过增加CD206− M1型巨噬细胞和NKG2D+ NK细胞的数量，减少抑制细胞如Tregs、抑制性CD103+ DCs和M2型巨噬细胞。其他例子包括释放过氧化氢酶以保护T细胞免受过氧化压力介导的抑制和释放肝素酶以改善T细胞通过肿瘤基质的穿透。 图 3 第四代CAR T细胞（“TRUCKs”）。在抗原结合时，第二代或第三代CAR诱导表达一种转基因蛋白，该蛋白在细胞内作用、整合到膜中或由CAR T细胞释放。释放的转基因蛋白旨在改变肿瘤环境、重塑肿瘤组织或吸引二次免疫反应。CAR T细胞被诱导仅在CAR与其靶标结合时释放蛋白质，从而将“有效载荷”在预定义的交付点作为“TRUCK”进行交付。这种CAR T细胞被理解为“活体工厂”，用于精确和持续地交付治疗性细胞产品。 所谓的“装甲CAR”通过产生4-1BB配体提供增加的共刺激通过刺激4-1BB途径。工程化的T细胞被设计为分泌Toll样受体（TLR）配体，可以刺激T细胞和抗原呈递细胞上的TLR途径，然后可以激活一组T细胞进行广泛的抗肿瘤攻击。靶向Muc16ecto（即黏蛋白-16（CA-125）的膜保留残余物）并分泌IL-12的CAR T细胞正在临床试验中评估（NCT02498912）。IL-15 TRUCK细胞显示出改善的扩增和抗肿瘤活性，但在未受控制的扩增情况下需要自杀基因，由于其白血病潜力。“装甲”CAR通过与CAR共表达IL-7受体-α链来恢复对IL-7的反应性，并促进Th1反应。类似地，在IL-4水平增加的前列腺癌中，共表达IL-4结合/IL-7信号传导受体提高了抗PSCA CAR T细胞的抗肿瘤活性。另一方面，CAR T细胞上共表达的显性负性TGF-β DNRII受体可以在TGF-β存在的情况下与TGF-β竞争，以改善T细胞的抗肿瘤活性。也可以设想提供细胞因子或细胞因子受体之外的应用，如输送可溶性HVEM外域，以靶向肿瘤血管，以维持肿瘤穿透。 4.具有双重特异性、组合抗原识别和条件性CAR的CAR T细胞 原型CAR通过一个scFv将特异性重定向到一个抗原；多种原因要求具有多重特异性的CAR：(1)肿瘤病变在可靶向抗原方面可能是异质的，或在肿瘤进展过程中丢失抗原；(2)靶向癌细胞和肿瘤基质或血管可能有益或需要增加治疗效果。将两种或更多CAR T细胞产品应用于癌症患者基本上是可行的，尽管需要在GMP条件下制造两种细胞产品。例如，通过顺序输注应用CD19和CD22 CAR T细胞目前正在评估治疗难治性B-ALL的试验中（NCT03620058）。或者，T细胞被设计为表达两个CAR，即所谓的双顺反子CAR，每个CAR针对不同的抗原（图4）。通过灵活的连接子将两个scFv相互连接，设计出具有双重特异性的CAR。这种串联排列的双特异性CAR（“串联CAR”，“Tan-CAR”）或环状结构，针对两种不同的抗原，并能够在结合任一抗原时提供T细胞激活（“或”门控）；具有其中一种相应抗原的目标细胞仍然被识别。除了两个连接的scFv外，双抗体、二合一抗体和双变量域抗体也可以用来设计具有两种特异性的CAR。三特异性CAR包含单价和/或多价CAR结构的组合，以针对三种抗原，进一步扩大靶向特异性。一个例子是设计了一种双特异性CAR，将针对CD20和CD19的scFv连接起来，旨在减轻在接受CD19 CAR T细胞治疗后经常发生的B细胞白血病/淋巴瘤的复发。CD19− CD20+白血病细胞的复发旨在通过CD20-CD19双特异性CAR T细胞得到控制。双特异性CAR中scFv的顺序取决于特定抗原中目标表位的空间可及性。CD20-CD19 CAR对CD19和CD20都具有相同的结合能力，并重定向T细胞激活，而CD19-CD20 CAR则效率要低得多。其他双特异性CAR的例子是针对CD19和CD123治疗B-ALL或CD19共靶向CD22、ROR1和免疫球蛋白κ轻链（Igκ）。多特异性CAR T细胞目前正在早期临床试验中评估。通过双顺反子表达盒设计了同时具有CD19和CD22 CAR的T细胞，正在进行治疗高风险B-ALL或干细胞移植后复发的试验（NCT03289455）。具有CD19和CD22特异性的双价CAR正在评估治疗B-ALL或B细胞淋巴瘤（NCT03241940, NCT03233854, NCT03330691, NCT03448393, NCT03019055）。目前正在进行的II期试验中评估了针对BCMA两个表位的双特异性CAR（NCT03758417）。 图4 基于逻辑门控的CAR介导的T细胞激活，以证明在肿瘤靶向中的选择性。共表达两种CAR，每种CAR在与相应的目标抗原结合时都能完全激活T细胞；双特异性CAR（串联CAR，Tan-CAR）也是如此。在这种情况下，通过表达抗原A或B或两者的细胞激活T细胞（"OR"门控）。为了仅通过同时表达A和B抗原的细胞激活CAR T细胞，识别A的CAR仅通过CD3ζ提供基本激活，这不足以实现完全和持续的激活，而识别B的CAR提供共刺激；通过两种CAR的同时信号传导诱导T细胞完全激活（"AND"门控）。识别抗原A的synNotch CAR驱动转录并表达第二种CAR，该CAR在识别抗原B时驱动T细胞完全激活。具有ITIM（免疫受体酪氨酸基抑制基序）的抑制性CAR在其识别的抗原B结合时阻止通过激活CAR的信号传导。当抗原B不存在时，CAR可以在结合抗原A时激活T细胞（"A-not-B"门控）。 当结合两种抗原时，双特异性CAR比单特异性CAR具有更高的亲和力，理论上稳定了突触并改善了T细胞对低抗原水平目标细胞的反应。这种情况可以用来只将CAR T细胞重定向到表达两种抗原而不是一种的细胞（图4）。这种“与”门控的抗原模式旨在提高对癌细胞的靶向选择性，同时保留健康细胞。两个共表达的抗原被两个共表达的CAR识别，每个CAR识别特定的抗原，并分别提供主要或共刺激信号。这样，只有同时结合两种抗原才提供完全T细胞激活所需的两个信号；结合一种抗原是不足够的。组合抗原识别的例子是，通过CD3ζ CAR靶向ErbB2和通过CD28 CAR靶向Muc1，或通过CD3ζ CAR靶向间皮素和通过CD28 CAR靶向叶酸受体-α。靶向CD13和TIM3的双特异性和分裂CAR T细胞在临床前模型中根除患者衍生的急性髓性白血病细胞，减少了对骨髓和外周髓性细胞的毒性。 通过异二聚体化两个多肽链，可以加强两个CAR上的初级和共刺激信号的组合；一个链由细胞外和跨膜以及初级信号传导部分组成，第二个链提供共刺激信号传导部分，并通过添加“二聚体化剂”与第一个链相连。CAR在二聚体化剂允许异二聚体化和功能性CAR形成之前保持沉默。通过滴定二聚体化剂剂量可以微调T细胞活性；撤除二聚体化剂终止CAR信号。只有当每个CAR信号单独不足以驱动T细胞激活时，才能通过组合抗原识别实现清晰的“开-关”T细胞激活。由于预先激活的T细胞中的CD3ζ信号可能重新诱导T细胞反应，因此需要调整信号或降低结合亲和力以实现平衡的激活阈值。 可调CAR的另一种策略基于合成Notch（synNotch）受体。Notch由一个细胞外受体、一个跨膜域和一个细胞内转录调节器组成，激活后介导内部域的蛋白水解，释放细胞内转录调节器。这些特性用于控制与Notch受体不同特异性的真正CAR的转录。优点在于Notch受体的抗原识别基于逻辑“与”门控，并以空间定义的方式控制CAR T细胞功能。在CD19结合后，CD19特异性synNotch受体释放转录效应域Gal4-VP64或TetR-VP64以诱导抗间皮素CAR的表达。只有当在靶向组织中同时识别synNotch配体和CAR配体时，T细胞才被激活。另一个例子是通过CAR靶向ROR1和通过Notch受体靶向EpCAM或B7-H3。虽然CAR的“开开关”决定了靶向癌细胞的选择性，但这种策略可能受到诱导足够水平的CAR表达和在没有Notch信号进一步发生时衰减CAR所需的时间的限制。 工程化T细胞的TCR特异性也可以用来提供更复杂的识别轮廓。带有γδ TCR的T细胞识别肿瘤细胞特有的磷酸化抗原；转基因表达GD2特异性CAR和共刺激域只会在γδ TCR和CAR同时结合它们相应的抗原时提供完全的T细胞激活；由于缺乏γδ TCR激活，不会攻击GD2+的健康细胞。 虽然许多可靶向的抗原既表达于健康细胞也表达于癌细胞，但有些抗原仅由健康细胞表达，而癌细胞缺乏表达。在这种情况下，结合共同抗原“A”但在结合健康细胞上的抗原“B”时阻断，将阻止CAR T细胞激活对抗健康细胞（图4）。带有ITIM（免疫受体酪氨酸基抑制基序）的抑制性CAR只要结合其相应的抗原“B”，就阻止通过激活性CAR的信号传导。结合缺乏抗原“B”的“A”癌细胞允许CAR T细胞激活，因为缺乏通过抑制性CAR的信号传导（“A非B”门控）。 5.具有植入多重抗原特异性的通用CAR 目前，原型CAR具有一个确定的抗原特异性；改变特异性需要用新的CAR工程化T细胞。在这种情况下，开发了一种“通用”CAR，它识别一种抗体，该抗体转而提供癌症特异性（图5）。例如，抗癌抗体的免疫球蛋白Fc区域被具有CD16作为结合域的CAR结合。CD16 CAR T细胞结合抗癌抗体，从而获得对癌细胞的特异性。或者，CAR结合至与抗癌靶向抗体相关联的蛋白质表位。具有荧光素异硫氰酸酯（FITC）特异性CAR的T细胞识别FITC标记的叶酸，该叶酸与叶酸受体阳性癌细胞结合。也可以设想将其他表位与桥接抗体相关联，如亲和素。同时添加不同特异性的抗体，允许将相同的CAR T细胞产品（“UniCAR”）重定向至多种抗原，无需重新制造CAR T细胞。该策略的优点是同时使用不同的抗体靶向广泛的抗原，同时只应用一种制造的CAR T细胞产品。实际的特异性由应用的抗体混合物在治疗足够浓度下定义。随着应用的抗体的短半衰期，此外，意外的不良事件在抗体撤除后很快就会有限。从机制上讲，有效的肿瘤控制需要CAR T细胞和连接抗体都渗透到肿瘤病变中；目前尚不清楚这是否适用于晚期实体瘤。也尚未解决“通用”CAR T细胞是否能够建立对癌症抗原的持久免疫记忆，这被认为是长期控制癌症所需的。 图 5 “通用”CAR的概念。T细胞表达一种特异性针对标签的CAR，该标签与连接分子相连，最好是天然抗体、单链抗体(scFv)或双特异性T细胞导向抗体(BiTE)，这些分子能够识别肿瘤细胞上的目标抗原。通过添加不同的连接分子，无需工程化新的CAR T细胞，就可以为T细胞配备不同的特异性。这被认为在将CAR T细胞应用于患者后也是可行的；注入针对不同肿瘤抗原的抗体，为CAR T细胞提供不同的特异性。 6.转换抑制信号为激活信号的Switch CAR 在肿瘤病变中，重定向的T细胞攻击通常以各种方式受到抑制；抑制性配体如程序性细胞死亡配体-1（PD-L1）和PD-L2与激活的T细胞表达的程序性细胞死亡-1（PD-1）结合。一种结合这种抑制性配体但向工程化T细胞传递激活信号的CAR，不仅可以与抑制性受体竞争结合，还可以通过提供激活信号克服抑制（图6a）。理想情况下，PD-L1:CD28 “开关”CAR在工程化T细胞中克服PD-1介导的抑制信号。特别是，一个具有PD-1细胞外域结合PD-L1和CD28细胞内信号传导域的CAR，将抑制信号转换为激活信号，导致ERK磷酸化增加，促炎细胞因子释放，T细胞扩增和目标细胞的细胞溶解。由TIGIT（具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体）的外域与CD28共刺激域融合而成的嵌合受体，在结合TIGIT配体CD155时增强T细胞功能。鉴于肿瘤组织提供的大量抑制信号，确定需要克服的“关键”抑制因素以维持有效的T细胞反应仍然是一个挑战。 图 6 开关CAR和抑制性CAR（iCAR）。(a) 开关CAR与生理性T细胞抑制性受体的配体结合，但为工程化T细胞提供激活信号。(b) 抑制性CAR在与抗原结合后，通过ITIM信号向工程化T细胞提供负信号。抑制信号压倒了通过TCR或共表达的激活CAR的激活。 7.抑制性CAR：iCARs 虽然原型CAR向工程化T细胞提供激活信号，但具有抑制信号的CAR旨在在结合健康细胞时抑制CAR T细胞激活。理想情况下，抑制性CAR通过在面对健康组织时覆盖激活CAR信号来减轻非肿瘤毒性。与激活性、肿瘤特异性CAR共表达的具有优势抑制信号的CAR，识别健康细胞；从而CAR T细胞只在结合癌细胞时激活，抑制性CAR不结合健康细胞（图6b）。这种抑制性CAR提供PD-1或CTLA-4信号，并覆盖癌症特异性CAR的激活信号。 8.异体CAR T细胞和CAR NK细胞 到目前为止，CAR T细胞治疗是一种通过体外制造患者自己的T细胞的个性化治疗。这不仅繁琐、成本密集和耗时，而且在患者晚期疾病无法提供足够或足够活跃的T细胞进行CAR工程化时通常也不适用。在这种情况下，异体“现成的”CAR T细胞将为广泛的患者群体带来好处。为了避免移植物抗宿主病（GvHD），需要删除内源性的αβ TCR和HLA分子，这可以通过锌指核酸酶或CRISPR/Cas技术实现。随后清除剩余的TCRαβ T细胞，通过污染的异体TCR+细胞降低GvHD风险。T细胞通过转录激活样效应核酸酶（TALENs）技术在TCRα和CD52位点进行基因编辑，用于治疗无法生产自体CAR T细胞的患者的儿童CD19+ ALL。CD52存在于患者的恶性B细胞上，需要从CAR T细胞中删除，以允许消除恶性淋巴细胞，同时保留注入的CD52阴性CAR T细胞。对于工程化异体CAR T细胞，CRISPR导向RNA和Cas9目前由病毒载体编码以实现组成性表达；当前的研究旨在短暂提供基因编辑工具，而不持久的载体，以最小化非目标编辑。 针对BCMA治疗多发性骨髓瘤的异体CAR T细胞，通过BCMA CAR和基因编辑技术进行了改造，以限制TCR介导的免疫反应。通过将CD20模拟表位整合到CAR的细胞外域，使CAR T细胞能够通过利妥昔单抗消除，从而提供了异体BCMA CAR T细胞的安全性。 关于使用异体效应细胞，NK细胞也可以用于诱导有效的抗肿瘤反应，因为它们具有细胞毒性潜力和分泌促炎细胞因子。除了使用异体细胞，使用NK细胞进行癌症的过继细胞治疗有很强的生物学理由；NK细胞表现出广泛的抑制性和激活性受体库，以识别外来、感染或恶性细胞。两种信号的平衡最终诱导或阻断细胞毒性CD56dim NK细胞释放细胞毒性颗粒以杀死目标细胞。虽然可能存在广泛的NK细胞亚群多样性，基于激活和抑制受体的库，但通过CAR工程化NK细胞将为特定癌细胞提供预定的特异性。原型CAR具有CD28-CD3ζ信号也在NK细胞中活跃；具有NK细胞2DS2和DAP12信号蛋白的CAR产生了更强的抗肿瘤活性。为NK细胞工程化的CAR通常包含DAP10或DAP12用于激活，单独或与CD3ζ一起。具有NKG2D作为结合物和DAP10-CD3ζ用于激活的CAR有效地激活了小鼠模型中针对骨肉瘤的原代NK细胞。CD3ζ在NK细胞中作为激活域优于DAP10，而DAP12优于CD3ζ。 9.制造CAR T细胞用于临床应用 对于临床应用，CAR T细胞产品是根据良好生产规范（GMP）规则，使用预期接受患者的自体T细胞制造的（图7）。在大多数情况下，通过白细胞分离术收集血液，分离T细胞，通过病毒感染或电穿孔进行基因工程改造，并扩增到临床相关的数量。大多数临床试验使用通过γ-逆转录病毒或慢病毒基因转移修饰的T细胞；基于转座子的载体，如Sleeping Beauty和PiggyBac，越来越多地应用于临床，其好处是避免了成本和时间密集型的病毒生产。病毒和转座子介导的基因转移程序旨在永久性地修改患者的T细胞以表达CAR；一些试验使用通过RNA电穿孔修饰的T细胞进行短暂的CAR表达。在永久性基因改造后，插入突变和随后成熟T细胞的致癌转化的风险似乎很低，到目前为止在这方面还没有报告致癌事件。一个需要注意的问题是，通过慢病毒转移，CAR基因插入到Tet2位点导致T细胞的克隆扩增，然而，它们自发地收缩了。然而，白细胞分离产品中污染的恶性细胞也可能意外地被CAR改造，存在重新输注给患者后通过CAR介导的肿瘤促进的风险。 图7 CAR T细胞制造和患者治疗时间表。(a) 通过白细胞分离术从患者体内收集T细胞，并在体外处理以获得最终的CAR T细胞产品，包括T细胞工程化以携带CAR、扩增至临床相关数量，以及最终的质量控制程序（QC）。在输注CAR T细胞产品之前，患者需接受非清髓性淋巴细胞减少（“预处理”），以促进CAR T细胞的植入和体内扩增。随后需要院内护理以管理潜在的副作用，如CRS或神经毒性。(b) 体外CAR T细胞制造过程通常从白细胞分离产品开始，并涉及多个后续生产步骤，包括T细胞分离和激活、基因工程、CAR T细胞扩增、制剂、CAR T细胞产品的冷冻保存，以及最终的质量控制以供释放。整个过程可以手动运行，或在监督下（半）自动化进行。 经过基因改造后，CAR T细胞在细胞因子存在的情况下在体外广泛扩增到临床相关的细胞数量；目前使用手动处理的摇动反应器或袋子以及完全自动化和监督处理设备。自动化的目标是允许以高再现性和质量进行生产，并从越来越多的患者中并行生产细胞，并缩短静脉到静脉的时间。 最适合CAR治疗的T细胞群体被认为是具有急性炎症特征的原始或年轻中央记忆细胞。在IL-2存在下扩增CAR T细胞优先触发效应T细胞，而IL-7或IL-2加IL-15扩增具有持续细胞因子释放和抗肿瘤活性能力的中央记忆T细胞。添加IL-21使CAR T细胞保持较少分化状态。刺激方式不仅决定了扩增CAR T细胞的产量，还决定了代谢依赖性；IL-15增加氧化代谢以及肉碱棕榈酰转移酶，这是脂肪酸氧化的限速步骤。IL-7通过STAT5和Akt激活增加Glut1，并诱导甘油运输和甘油三酯合成，从而改善T细胞持久性和存活。在体外扩增期间抑制Akt触发具有高水平脂肪酸氧化的中央记忆表型，最终改善CAR T细胞的抗肿瘤活性。CD45RO+ CD62L+记忆CAR T细胞比更高级分化阶段的效应T细胞提供更持久的抗肿瘤反应，使富含CD62L的CAR T细胞成为进一步探索的有吸引力的选择。 因此，中央记忆CAR T细胞在临床应用中似乎更优越，因为响应的患者没有累积具有早期记忆和耗竭特征的T细胞，而非响应的患者则累积了。最终产品中工程化细胞的活性可能影响治疗效果。然而，基于制造的细胞产品的活性对CAR T细胞治疗结果的首次回顾性分析表明，当患者接受70-80%活性的产品与至少80%活性的产品相比，CD19 CAR T细胞扩增或患者存活没有差异的证据。 制造T细胞产品是一种个性化方法，当前程序有一些显著的限制： 一些癌症患者淋巴细胞减少或具有低数量的原始T细胞，导致生产延迟或失败，如在为儿科患者生产时所经历的。 生产过程耗时，这对急性或晚期疾病的患者不利。 由于疾病，患者的T细胞可能功能失调，如CLL和一些实体瘤所报告的，导致产品反应率低。 在某些情况下，工程化异体T细胞可能是另一种策略。在接受造血干细胞移植的患者中，使用移植的异体T细胞制造CAR T细胞产品。这样的异体CD19特异性CAR T细胞诱导了部分和完全缓解；然而，一些患者遭受了GvHD。病毒抗原特异性、部分HLA匹配的供体T细胞缺乏异体反应性，并且通过CAR工程化，显示出抗淋巴瘤活性。NK细胞以其MHC独立活性也是第三方供体细胞CAR工程化的来源；然而，它们在患者中表现出较差的持久性。 10.通过CAR T细胞的过继治疗在血液学恶性肿瘤中诱导持久缓解 过继转移CAR T细胞的治疗效果取决于多个参数，包括CAR设计、CAR信号传导、结合亲和力、目标细胞上的抗原数量、目标抗原表位的空间可及性、T细胞的成熟阶段、CAR T细胞的持久性和扩增、患者免疫系统的预处理等。目前的努力旨在优化特定疾病的状况；一些治疗方案已在CAR T细胞治疗恶性疾病的方面证明成功，特别是B细胞白血病/淋巴瘤；少数试验旨在治疗实体癌。 在迄今为止难以治疗的B细胞白血病和淋巴瘤的治疗中，使用“第二代”抗CD19 CAR T细胞的早期临床试验实现了完全且持久的缓解；使用“第一代”CAR T细胞的治疗大多失败，因为CAR T细胞从循环中迅速清除。目前，近600项早期阶段的CAR T细胞试验正在进行临床探索，主要由学术中心进行（截至2020年初，中国有268项，美国有227项，欧洲有67项）。用于治疗儿童B-ALL（Kymriah™，tisagenlecleucel，诺华）和成人大B细胞淋巴瘤（Yescarta™，axicabtagene ciloleucel，Kite-Gilead）的抗CD19 CAR T细胞已获得FDA和EMA的批准；其他将很快跟进。 CAR T细胞治疗的标准程序从患者的白细胞分离开始，分离T细胞，体外基因工程改造相应的CAR，CAR T细胞扩增，以及在非清髓性淋巴细胞减少和IL-2支持后，通过静脉输注将最终的细胞产品重新给患者（图7）。由于CAR T细胞的持久性对临床效果至关重要，目前在试验中使用的CAR具有一个或两个共刺激内域，其中大多数提供CD28或4-1BB共刺激。在持久性方面，4-1BB共刺激的CAR T细胞似乎优于CD28 CAR T细胞，在循环中持续4年以上，而CD28 CAR T细胞持续30天。由于CD19 CAR T细胞不区分健康和恶性B细胞，只要CD19 CAR T细胞持续存在，患者就会经历持久的B细胞耗竭。尽管B细胞耗竭在临床上是可管理的，但这种情况要求在靶向恶性B细胞时更具选择性。最近，Fcμ（IgM）受体被确定为治疗慢性淋巴细胞白血病（CLL）时可能更具肿瘤选择性的目标，由于目标表达水平较低，因此大多数健康B细胞免于被淘汰。目前也在探索其他替代靶标。 在缓解期间，大多数接受4-1BB CAR T细胞治疗的白血病/淋巴瘤患者没有接受进一步的癌症特异性治疗；接受CD28 CAR治疗的患者经常接受异体干细胞移植，这似乎是有益的，因为CD28 CAR T细胞的持久性不如4-1BB CAR T细胞。需要进一步探索以确定长期内更成功的策略。 迄今为止，患有DLBCL、CLL、B细胞急性淋巴细胞性白血病（B-ALL）和滤泡性淋巴瘤的患者已通过CD19 CAR T细胞成功治疗。值得注意的是，接受CD19 CAR T细胞治疗的多发性骨髓瘤患者也经历了缓解，尽管通过流式细胞术评估，骨髓瘤细胞是CD19low或CD19阴性。目前也在探索用于治疗B细胞恶性肿瘤的其他替代靶标，包括CD20、CD22、Igκ轻链、ROR-1和CD30。 由于缺乏标准化的试验设计、CAR组成、靶向抗原、预处理等方面，很难比较各种试验中CAR T细胞治疗的成功。然而，越来越明显的是，CAR T细胞剂量和淋巴细胞减少的程度或淋巴细胞减少方案对于允许广泛的T细胞扩增、持久性和最终治疗效果至关重要。应用后对CAR T细胞的重复再刺激可能改善它们在长期内的持久性和抗肿瘤效果。这是使用病毒特异性T细胞进行CAR植入的合理性，它们在接触病毒抗原时通过TCR重复再刺激；例如，Epstein-Barr病毒（EBV）特异性T细胞通过CAR工程化，并被EBV感染的细胞触发扩增。事实上，EBV特异性CAR T细胞的表现优于没有病毒特异性的CAR T细胞。 11.治疗实体癌的CAR T细胞面临的挑战 虽然血液学恶性肿瘤的治疗越来越成功，但实体癌的治疗仍然具有挑战性（表2）。作为“活药”的CAR T细胞基本上非常适合治疗实体癌，特别是由于T细胞固有的迁移和组织穿透能力，穿透血脑屏障，并在几乎所有组织中积累，包括睾丸和眼睛等特权组织，因此特别适合消除（微）转移。然而，大多数实体肿瘤具有大量策略，以非常有效的方式对抗CAR T细胞的迁移、渗透和激活。其中，改变的趋化因子环境损害了CAR T细胞向肿瘤的迁移；肿瘤内皮细胞上丢失了一些粘附因子，妨碍了T细胞的渗透。通过局部沉积TNF-α可以对抗后者，它增加了血管粘附分子，如血管细胞粘附蛋白-1和内皮细胞上的细胞间粘附分子-2。靶向血管内皮生长因子（VEGF）受体-2或阻断迁移抑制因子如内皮素B受体也改善了内皮细胞粘附和/或T细胞的跨内皮迁移。在T细胞上下调的趋化因子受体被重新表达，如CXCR2（CXCL1受体），以便于靶向黑色素瘤或CCR2b用于靶向神经母细胞瘤。 表 2 CAR T细胞疗法面临众多挑战。 为了绕过迁移障碍，CAR T细胞被瘤内植入或分别注入胸膜或腹膜以治疗间皮瘤和卵巢癌。通过内窥镜将抗CEA CAR T细胞应用于肝转移；抗c-Met CAR T细胞被注入乳腺癌转移。一旦进入肿瘤病变，CAR T细胞需要突破基质细胞和细胞外基质的障碍，才能接近癌细胞以执行它们的细胞毒性攻击。通过基因工程释放的肝素酶在基质中降解肝素硫酸蛋白多糖，改善T细胞的渗透；需要高水平的IFN-γ来消除基质细胞并根除大型已建立的肿瘤病变。通过直接针对基质细胞的CAR T细胞特异性针对成纤维细胞激活蛋白（FAP），一种参与细胞外基质重塑的丝氨酸蛋白酶，整体抗肿瘤活性得到改善。 许多过程使肿瘤病变对重定向的CAR T细胞产生敌意，使它们变成耗竭状态或进入凋亡。调节性T（Treg）细胞、髓源性抑制细胞（MDSCs）和肿瘤相关M2型巨噬细胞释放抑制性细胞因子，如IL-4、IL-10、白血病抑制因子（LIF）和TGF-β。MDSCs和巨噬细胞降低肿瘤内色氨酸水平；基质细胞释放吲哚胺2,3-双加氧酶（IDO）和犬尿氨酸，抑制T细胞效应功能并剥夺组织中的葡萄糖和其他营养物质。严重的酸中毒也对抗肿瘤活性的CAR T细胞产生反作用。由于MDSCs释放的精氨酸酶，低精氨酸水平抑制CD3ζ表达和TCR信号传导。 12.CAR T细胞治疗与毒性相关 作为“活药”的CAR T细胞治疗在一些试验中取得了显著的治疗效果；然而，CAR T细胞在初始应用后的几天甚至几周内可能导致严重的副作用，需要重症监护干预，甚至可能致命。大多数毒性是由于CAR T细胞的特殊生物学特性，其他与CAR T细胞相关的毒性目前尚未完全理解。从机制上讲，主要毒性是(1)由于大量T细胞激活、细胞因子释放和肿瘤溶解引起的全身毒性，以及(2)由于CAR T细胞与健康组织相互作用引起的特异性毒性（“靶上非肿瘤”毒性）。 12.1.系统性毒性 细胞因子释放综合征（CRS）：大量CAR T细胞与目标细胞的结合导致大量细胞因子释放，血清中促炎细胞因子（包括IFN-γ和TNF-α、IL-10和IL-6）的水平异常高，这本身会导致其他免疫细胞的交叉激活，以及进一步的细胞因子释放，直至达到有毒水平。这些毒性被称为细胞因子释放综合征（CRS），临床上伴有高烧、不适、疲劳、肌肉痛、恶心、厌食、心动过速、低血压、毛细血管渗漏、心脏功能障碍、肾功能损害、肝功能衰竭和弥散性血管内凝血。CRS常与血管渗漏综合征（VLS）一起出现，与巨噬细胞激活综合征（MAS）和巨噬细胞激活密切相关，临床上类似于噬血细胞性淋巴组织细胞增多症（HLH）。CRS的风险与T细胞激活和扩增有关，这可能与总体肿瘤负荷相关，但并非绝对。为了避免CRS，需要在肿瘤负荷高的患者中使用较低剂量的CAR T细胞，这是一个需要通过精确定义治疗窗口来解决的悖论，通过调整T细胞激活、细胞因子释放和抗肿瘤活性。 CRS的早期诊断和临床管理通过新建立的评分系统和治疗指南得到便利。C反应蛋白，即由肝细胞在IL-6水平增加时释放的蛋白质，目前作为CRS发作和严重程度的实验室标志物；成人的预测标志物还包括可溶性gp130（sgp130）、IFN-γ和IL-1Rα的增加，在儿科患者中，IFN-γ、IL-13和MIP1α的增加。目前CRS的治疗基于阻断IL-6/IL-6受体信号轴，通过阻断抗体如抗IL-6受体抗体tocilizumab或抗IL-6抗体siltuximab，这似乎不会干扰CAR T细胞的疗效。短期系统性皮质类固醇治疗也能迅速逆转CRS，且不影响最初的抗肿瘤反应；然而，它可能在长期内损害CAR T细胞反应。在CRS期间中和促炎细胞因子有助于减轻CRS的严重程度。在CRS期间，活化的单核细胞和/或巨噬细胞释放高水平的IL-1；通过IL-1受体拮抗剂中和可以改善临床模型中的CRS和神经毒性。通过给予lenzilumab抗体中和巨噬细胞-单核细胞激活细胞因子GM-CSF，降低了CRS的风险。通过阻断酪氨酸羟化酶减少儿茶酚胺，降低了小鼠模型中的细胞因子水平，暗示了临床干预的途径。 与CAR T细胞相关的HLH/MAS通常与CRS症状一起出现，伴有铁蛋白和肝酶血清水平升高、噬血细胞现象、细胞减少、肺水肿、脾肿大、肾功能衰竭和NK细胞丢失。治疗包括使用依托泊苷或阿糖胞苷进行系统性化疗，如果与神经毒性相关，也可以鞘内应用；在这种情况下，IL-6/IL-6R阻断大多无效。 神经毒性（ICANS）：CAR T细胞治疗相关的神经毒性现在被称为免疫效应细胞相关神经毒性综合征（ICANS）。神经系统效应包括失语症、幻觉、混乱、谵妄、表达性失语症、肌阵挛、谵妄、癫痫发作和脑水肿。这种神经毒性发生在大约40%的患者中，是可逆的，并且在CD19 CAR T细胞治疗期间频繁发生；其他CAR T细胞也可以引起神经毒性，指向由于活化CAR T细胞的浸润导致的弥漫性但暂时性脑病。神经毒性的机制尚不清楚，但与破坏血脑屏障和脑脊液中细胞因子水平增加有关。如果与CRS一起治疗，用IL-6阻断和类固醇治疗可以成功。 12.2.“靶上非肿瘤”毒性 由于大多数靶向抗原也由健康细胞表达，CAR T细胞治疗与攻击健康组织的风险相关，导致巨大的“靶上非肿瘤”毒性。治疗B细胞白血病的CD19靶向CAR T细胞也消除了健康的B细胞；持久的B细胞耗竭需要免疫球蛋白替代和抗生素及抗真菌保护，这在临床上是可管理的。当目标抗原由重要组织表达时，毒性更严重。在一项针对肾癌患者的碳酸酐酶IX特异性CAR T细胞治疗试验中，患者由于胆管上皮细胞上碳酸酐酶IX水平较低而出现肝毒性；通过预先给予阻断抗体，可以减少“非肿瘤”毒性的严重程度。避免“靶上非肿瘤”毒性的策略目前旨在增加肿瘤选择性，并以空间和时间的方式限制CAR活性。T细胞给药的替代途径可能是避免通过血液系统分布大量CAR T细胞的选项。通过内窥镜或胸膜内或腹膜内应用局部CAR T细胞给药，在肿瘤部位提供高剂量的CAR T细胞，并在一定程度上避免了非肿瘤毒性。然而，这种应用是有限的，因为在大多数情况下，肿瘤病变无法接触或肿瘤广泛扩散。 12.3.“靶外非肿瘤”毒性 大多数过去工程化的CAR在细胞外部分包含IgG1 CH2CH3结构域作为间隔区，这可能会与Fcγ受体（FcγR）（CD64）结合，从而激活NK细胞和巨噬细胞等先天细胞。尽管到目前为止在临床上并不突出，但理论上可以通过删除IgG1 CH2结构域或突变FcγR结合位点内的Asn297来减少风险。替代间隔区包括IgG4 Fc结构域或细胞外CD8结构域。 第三代曲妥珠单抗衍生的CAR T细胞靶向ErB2导致可能由于急性呼吸窘迫综合征和CRS导致的致命的心肺衰竭。同样，在用EGFR变体3特异性CAR T细胞和CEA特异性CAR T细胞治疗时记录了肺水肿，而没有直接证据表明CAR T细胞攻击肺上皮。由于使用针对同一目标的不同表位或传递不同信号的CAR可能产生显著不同的毒性，因此毒性概况更加复杂，例如，使用来自FRP5抗体的第二代ErB2 CAR的T细胞在肉瘤患者中并未诱导靶外非肿瘤毒性。 12.4.改善CRS的策略 基本上，当CRS在临床上显著时，需要对CAR T细胞进行下调或去激活；瞬时CAR表达、“关闭开关”和“自杀开关”是常用工具。 当存在严重CAR T细胞相关毒性的重大风险时，瞬时CAR表达可能有益。RNA转移产生瞬时表达的CAR。CAR在T细胞表面存在数天，并在目标细胞结合时介导有效的T细胞激活，然而，随着RNA降解和T细胞扩增时RNA稀释，CAR表达会下降。这种RNA修饰的T细胞在试验中显示出一些虽短暂但有效的效果。然而，由于CAR T细胞迅速清除，其缺点是短期效果。 然而，永久性修改的CAR T细胞需要在毒性不受控制的情况下主动消除这些细胞的策略。大剂量脉冲治疗类固醇在应用碳酸酐酶IX特异性CAR T细胞后停止了自身免疫。虽然这是非选择性地清除激活的T细胞，但可以通过特定靶向更有选择性地消除CAR T细胞。CAR结合域基本上也可以通过抗独特型抗体进行靶向，以诱导CAR T细胞的溶解性消除。通过给予识别细胞外CAR结构域中整合的表位的消耗性、FDA批准的抗体，也可以实现CAR T细胞的消耗。例子包括使用利妥昔单抗来消耗具有CD20表位或模拟表位的CAR T细胞，或使用西妥昔单抗来消耗具有EGFR表位的CAR T细胞。是否能够迅速实现足够的CAR T细胞清除以逆转正在进行的CRS，还有待在临床情况下证明。 诱导凋亡的CAR T细胞消除似乎是这种情况下更快速的解决方案。转基因脲酶-9（Cas9）与FKBP1A相连，在系统应用原本惰性的小分子AP1903后，会在工程化CAR T细胞中诱导凋亡，该分子促进二聚体化和激活诱导性Cas9（iCas9）。这种策略是有效的，因为供体T细胞介导的GvHD可以在实验系统中通过iCas9介导的T细胞凋亡在一小时内停止。 与其消除CAR T细胞，不如通过整合模块控制细胞表面的CAR。CAR被设计为融合蛋白，整合了一个自切割降解结构域，该结构域被可以被特定蛋白酶抑制剂特异性阻断的蛋白酶反向调节。在蛋白酶存在的情况下，产生的CAR融合蛋白从连接的降解结构域分离并表达在细胞表面；抑制蛋白酶导致CAR降解和缺乏表面表达。 CAR也可以通过添加酪氨酸激酶抑制剂dasatinib来降低其表达或调节其信号强度，该抑制剂可以迅速且可逆地阻断Lck激活；从而在小鼠模型中减少CRS的严重程度。该策略的好处是，只要存在dasatinib，CAR T细胞的信号强度就会减弱，但不会被清除；然而，该策略仍需临床验证。 需要进一步开发以降低细胞因子介导毒性风险的CAR。调节信号强度的一个关键是CAR共刺激。CD28-ζ CAR更快地诱导T细胞激活，并诱导更高的细胞因子释放、扩增和随后的耗竭，而4-1BB-ζ CAR则驱动较少的急性扩增，但具有较低的细胞因子水平，因此与严重CRS的风险较低。因此，4-1BB-ζ CAR可能更适用于肿瘤负荷和抗原密度高的患者，而CD28-ζ CAR可能需要用于肿瘤负荷低的情况。 降低CAR介导的T细胞激活的其他策略，例如，修改CD8跨膜和铰链区域，从而降低ICANS或高于1级CRS的风险。作为一种替代策略，“通用”CAR允许通过调整将CAR T细胞与目标细胞链接的适配器分子来动态控制T细胞激活。 13.CAR T细胞治疗的挑战 在过去的几年里，临床试验正致力于将CAR T细胞治疗确立为治疗几种类型的B细胞白血病和淋巴瘤；然而，在治疗其他恶性疾病的方面，仍然存在重大障碍。 13.1.如何选择最佳的肿瘤选择性抗原作为靶标？ 在CAR T细胞治疗中，肿瘤靶向的选择性对于长期兼容性至关重要。大多数可靶向的肿瘤相关抗原并不具有肿瘤选择性，这增加了CAR T细胞疗法中诱导靶上非肿瘤毒性的风险。肿瘤特异性的表面蛋白突变或肿瘤相关糖基化变体如Muc1或Muc16是罕见的。然而，有些抗原虽然由健康组织表达，但似乎是安全的靶标。例如，癌胚抗原（CEA，CD66e）严格表达在胃肠道和肺部健康上皮的腔面，而在癌细胞上以去极化方式表达。系统性应用CEA特异性CAR T细胞（NCT01212887, NCT02349724）和通过肝动脉输注局部给药的抗CEA CAR T细胞（NCT01373047）在减缓肿瘤进展的同时，并未诱发治疗相关结肠炎。其他如ErB2等抗原可能在高表达ErB2的肿瘤细胞被选择性靶向时是合适的靶标，同时保留中低表达的健康细胞。 为了增加肿瘤选择性，优先考虑靶向一组抗原模式而不是单一特定抗原。技术上，在同一T细胞中共表达两种具有不同特异性的CAR，以在两种CAR同时结合它们相应的抗原时仅诱导完全的T细胞激活；一种CAR提供主要信号，另一种CAR提供共刺激信号，从而仅在存在两种抗原的情况下补充完全T细胞激活所需的信号。该策略需要一个弱的主要信号，以避免在存在一种抗原的情况下进行一些基本的CAR T细胞激活，以及一个强的共刺激信号以驱动完全的T细胞激活。 为了在结合健康细胞时阻断CAR T细胞激活，与激活性CAR共表达具有细胞内PD-1或CTLA-4信号传导的抑制性CAR（iCAR）。iCAR识别健康细胞上存在但在癌细胞上不存在的抗原。因此，仅在结合缺乏iCAR识别的抗原的目标细胞时才发生CAR T细胞激活。 有些抗原在癌细胞上的表达水平高于健康细胞；“亲和力调节”CAR结合域可能有助于区分这两种组织。虽然在临床前模型中证明了可行性，但癌细胞可能通过下调相应抗原来逃避监视。亲和力调节的治疗窗口狭窄，因为增加亲和力可能导致识别健康细胞，如GD2特异性CAR在实验模型中诱发致命性脑炎。 13.2.如何优化CAR结构？ 目前临床评估中的大多数CAR基于近二十年前设计的原型CAR结构。临床前研究表明，对于每种抗原，特定CAR需要针对目标抗原表位、结合亲和力、间隔区长度以及信号传导和跨膜结构域等进行优化。由于各组分之间复杂的依赖性，目前无法预测特定抗原的最佳CAR组成。例如，结合亲和力和目标表位的位置为靶向高抗原负载的癌细胞同时保留低抗原负载的健康细胞提供了狭窄的亲和力窗口。 13.3.如何在CAR T细胞治疗后建立长期癌症控制？ 尽管在儿童B-ALL中可以高频率诱导完全缓解，但约40%的白血病患者在持续存在CAR T细胞的情况下仍然复发。多种原因导致复发频率高，包括整个CD19分子的丢失或表达缺乏目标外显子2的CD19异构体，从而使其对CAR T细胞不可见。在CD19 CAR治疗后，B-ALL的两个案例中通过转换为CD19阴性的髓系谱系丢失CD19。在这种情况下，靶向对癌细胞存活至关重要的抗原将是一个理想的策略。由于这样的抗原通常不可用，通过双特异性CAR共靶向第二种抗原（例如CD20或CD22）可能会增加对白血病细胞的治疗压力。在实体瘤中这种情况更为重要，因为它们在抗原表达上通常表现出深刻的异质性；在初始肿瘤消退后的早期肿瘤复发可能是由于选择抗原丢失的癌细胞。这些癌细胞可能以抗原非依赖性方式被先天免疫细胞反应识别和消除。为了吸引和激活先天细胞并启动更广泛的免疫反应，CAR T细胞在实验模型中被赋予了诱导释放转基因IL-12的能力，使抗肿瘤攻击更有效。有一些迹象表明，结合抗原依赖性和非依赖性免疫反应可能在长期内控制肿瘤。 13.4.哪种T细胞亚群提供长期肿瘤控制？ 临床前模型表明，具有增强扩增能力和长期持久性的原始或早期中央记忆T细胞是过继治疗最合适的细胞。沿着这条线，CD62L+记忆T细胞似乎表现出优越的性能。发现中央记忆干细胞（TSCMs），这是CD62L+中央记忆T细胞库的一部分，具有非凡的扩增潜力，激发了对这些细胞进行过继细胞治疗的探索。人们对识别和调节干细胞样T细胞形成和维持的因素和调控网络越来越感兴趣，因为这些细胞在过继转移到患者后似乎对长期治疗效果至关重要。另一种策略是基于预测性地诱导T细胞成熟。例如，4-1BB共刺激在年轻T细胞中启动中央记忆T细胞反应，这与CD28 CAR T细胞表现出更短暂的效应细胞反应形成对比。另一方面，更成熟的阶段的细胞在大多数肿瘤所在的外围显示出优先积累。然而，这些细胞需要不同的共刺激信号，即优先迁移到外围的CCR7− T细胞从联合CD28-OX40共刺激中受益。特定T细胞亚群的功能能力也可以通过与激酶抑制剂的联合治疗来调节；ibrutinib，一种布鲁顿酪氨酸激酶（BTK）抑制剂，降低了PD-1和CAR T细胞的耗竭，从而增加了持久性和抗肿瘤活性。 13.5.如何使CAR T细胞制造适应日益增长的患者数量？ 目前，大多数CAR T细胞由专门的GMP设施生产，冷冻并运送到患者的医院。生产越来越多的细胞产品将使当前程序达到极限，特别是当及时需要数千个自体细胞产品时。在医院内（半）自动化、完全控制和完全封闭系统的分散制造是解决这种情况的首选概念之一。这也将需要在制造过程中高度标准化，并避免血液和细胞产品运输中的复杂物流。作为另一种概念，一个高度专业化的、集中的生产设施，具有多个并行的自动化制造过程，可能作为患者细胞产品的区域供应商。 另一个限制是由患者自体T细胞治疗的需要设定的；对于每位患者来说，“通用”供体将使治疗在多个方面更容易。一个包含不同工程化CAR的“通用”供体T细胞产品库将在临床应用中提供更大的灵活性，根据患者的具体情况。此外，扩大生产规模将使更多的患者能够使用CAR T细胞产品。正在努力生成可以应用于众多患者的这种“通用”T细胞。这需要使CAR T细胞对宿主免疫细胞“隐形”，缺乏对患者健康组织的异体反应性，同时保留CAR介导的抗肿瘤活性。在这种情况下，通过基因组编辑技术获得的MHC缺陷、CAR修饰的病毒特异性T细胞和TCRα敲除T细胞，目前正在开发作为“现成的”或“第三方”细胞产品，GvHD风险低。CAR基因插入TCRα位点一步实现CAR的遗传工程和TCR表达的废除。编辑MHC I类以防止宿主识别和排斥供体T细胞可能通过NK细胞诱导消除，并不防止MHC II类介导的排斥。然而，目前探索的所有基因编辑程序在某种程度上都容易受到非目标修饰的影响，因此与意外的突变风险相关。该领域发展迅速，首次使用异体CAR T细胞治疗B细胞恶性肿瘤和实体瘤的试验已经启动。 13.6.如何平衡CAR T细胞的疗效和副作用？ 目前，一些CAR T细胞治疗与高风险的严重副作用相关，可能需要重症监护住院治疗。尽管各种CAR T细胞协议和治疗程序不同，并且没有在比较性的临床环境中进行评估，但一些临床管理规则变得明显。例如，CRS的早期诊断、分级和临床管理将标准化，建立共识的治疗方案。在毒性不受控制的情况下，可以通过各种手段选择性地和迅速地消除CAR T细胞。通过添加二聚体化剂AP1903二聚体化转基因诱导的脲酶-9（iCasp9），在30分钟内消除超过90%的T细胞。或者，通过给予针对CAR结构域或共表达表位的抗体，诱导抗体依赖性细胞毒性（ADCC）清除循环中的CAR T细胞。免疫介导的CAR T细胞消除的缺陷仍然是，癌症患者的潜在功能障碍免疫系统可能通过ADCC消除CAR T细胞的能力有限。 13.7.我们是否需要针对每种癌症类型的特定预处理？ 在大多数试验中，患者在过继T细胞治疗前接受非清髓性淋巴细胞减少，使用氟达拉滨和环磷酰胺；这种预处理的理由是暂时提供“空间”和细胞因子，以实现转移的CAR T细胞在体内的充分扩增。淋巴细胞减少还通过免疫调节提供抗肿瘤效果，因为它耗尽抑制细胞，并在肿瘤破坏时释放肿瘤相关抗原到免疫系统。尽管目前的预处理方案基本上是有效的，但基本方案可能需要针对每种癌症实体进行调整。例如，用于治疗Her2+肿瘤的调节方案通过应用nab-紫杉醇来耗尽间质性基质，并促进Her2呈递，并通过应用环磷酰胺耗尽Treg和MDSC，用于胆道和胰腺癌的修改。另一方面，预处理在CAR T细胞治疗的背景下可能具有高度毒性，通过诱导脑水肿和神经系统毒性，特别是在最近的一项试验（NCT02535364）中观察到的氟达拉滨治疗后。 13.8.如何激活免疫网络以诱导广泛的炎症性抗肿瘤反应？ CAR T细胞作为“活药”，越来越成为在目标器官产生和释放生物活性化合物的“活工厂”。使用CAR T细胞作为工厂的合理性基于实验肿瘤模型的证据，即宿主免疫系统在肿瘤排斥中起着重要且必要的作用，这使得在目标肿瘤组织内产生免疫刺激性条件成为必要。释放IL-12的CAR T细胞（IL-12 TRUCKs）可以通过吸引和激活M1型巨噬细胞来在肿瘤组织中诱发免疫反应，这些巨噬细胞可以消除CAR T细胞未能识别的癌细胞。其他具有特定影响局部免疫环境的细胞因子也可以使用；释放IL-18的CAR T细胞增加了肿瘤相关CD206+ M1型巨噬细胞和NKG2D+ NK细胞的数量，并减少了如Treg细胞、CD103+树突细胞和M2型巨噬细胞等抑制细胞。目前正在试验中探索使用靶向PD-1的检查点阻断，以激活CAR T细胞和浸润性淋巴细胞（NCT02650999）；其他检查点的阻断或组合，以重新激活肿瘤内源性免疫细胞，同样值得进行临床探索。 14.CAR T细胞用于其他疾病的治疗 将T细胞激活重定向的CAR不仅限于靶向癌细胞，还可以用于靶向任何由目标抗原定义的细胞。通过抗Dsg3 CAR靶向记忆B细胞的CAR T细胞被设计用来消除导致天疱疮病理的细胞。通过识别MHC呈递的自身抗原的CAR T细胞靶向自反应性T细胞。CAR被工程化以靶向病毒感染的细胞，如乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、巨细胞病毒和HIV感染的细胞。源自Dectin-1的CAR T细胞被用于破坏真菌Aspergillus的发芽。实验模型暗示，CAR重定向的Treg细胞可用于促进自身免疫疾病如结肠炎、过敏性哮喘和移植物抗宿主病的免疫耐受治疗，通过靶向HLA。最近，通过识别心脏成纤维细胞激活蛋白（FAP）的CAR T细胞靶向心脏纤维化，该蛋白在心肌损伤重塑时由心脏成纤维细胞高度表达。采用FAP特异性CAR的T细胞过继转移减少了心脏纤维化并恢复了小鼠的损伤后功能。该报告暗示CAR T细胞作为“活药”，在治疗目前疗法非常有限的心脏病中消除激活的心脏成纤维细胞。CAR T细胞用于治疗非恶性疾病其他应用的临床前开发正在进行中。 要点 采用嵌合抗原受体（CAR）重定向的T细胞的过继细胞治疗在某些血液学恶性肿瘤中取得了显著的治疗效果；然而，在其他疾病中的治疗效力仍然有限。 CAR是由结合域、跨膜域和细胞内信号传导域组成的模块化、重组的跨膜分子，用以激活工程化细胞。最佳分子设计需要通过变化组成域在每种情况下探索。 原型CAR设计可以通过使用各种靶向和信号传导元件进行修改，使CAR更加通用。此外，各种免疫细胞可以通过CAR重定向，提供方便的治疗细胞。 CAR T细胞治疗经常与毒性相关，这些毒性可以通过同时进行的治疗、改变CAR设计和靶向替代抗原来减少靶上非肿瘤毒性来减轻。 通过共同激活广泛的免疫反应、共同靶向肿瘤基质、癌症干细胞和其他与肿瘤相关的结构，可以提高CAR工程化免疫细胞的抗肿瘤效力。 生产CAR T细胞产品仍然具有挑战性，为所有患者提供个性化治疗；正在努力为广泛的患者群体制造异体细胞产品“现成”。 下章预告：抗体关键特性的改进 往期内容： 第二章：抗体：发现及特性的历史 第三章：单克隆抗体和杂交瘤细胞 第四章：抗体展示系统 第五章：转基因动物用于产生人类抗体 第六章：抗体在治疗、诊断和科学中的应用 第七章：双特异性抗体 第八章：抗体偶联药物 第九章：替代性结合框架：用于基础研究和治疗应用的多功能结合剂 为促进抗体行业的交流与创新，2024年10月16-17日第七届金秋十月抗体产业发展大会如约而至。会议旨在为研究人员提供一个互动交流的平台，有助于推动抗体产业的进一步发展。 会议内容 时间：2024年10月16-17日 地点：上海张江（酒店定向通知） 规模：600-800人 主办单位：生物制品圈、抗体圈 演讲支持：Entegris、瑞孚迪、AS ONE CORPORATION 会议费用：免费FREE!（仅收取100元报名定金，含参会学习、茶歇、会议手册，定金概不退还），先到先得，报完即止！ 报名方式：扫描下方二维码或点击文章最底部“阅读原文”→ 填写表格 → 报名成功（报名志愿者，承担一定工作，请慎重考虑，免交定金）！ 组委会获得报名信息后，根据报名信息进行初筛，并进一步与报名者沟通确认，实现精准邀请。最终有机会进入大会微信群（严格审核通过）。 日程安排 更多嘉宾正在邀请中 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

CD137，又名4-1BB，是一类T细胞共刺激受体，属于肿瘤坏死因子受体超家族（Tumor Necrosis Factor Receptor Superfamily，TNFRSF）。CD137激动性抗体已被证实可以通过激活T细胞来达到抗肿瘤的作用。目前尚无CD137小分子/抗体激动剂药物被批准上市。2024年8月23日，中国科学院上海有机化学研究所丁克研究员和暨南大学陈良教授联合在Science子刊Science Advances杂志在线发表题为“Human/mouse CD137 agonist, JNU-0921, effectively shrinks tumors through enhancing the cytotoxicity of CD8+ T cells in cis and in trans”的研究性文章，共同报道了首个CD137小分子激动剂JNU-0921的开发及其在肿瘤免疫治疗中的机制研究。 CD137 免疫检查点疗法在肿瘤免疫治疗领域中使很多癌症患者大大受益，显著缓解患者病症、延长患者生存期。该法的原理是相当于“刹车”的作用，消除癌细胞对T细胞的抑制作用，激活T细胞的效应能力。根据免疫检查点的作用机制可以分为抑制性免疫检查点和共刺激性免疫检查点：前者包括PD-1、CTLA-4、LAG3、TIGIT、BTLA、TIM-3和CEACAM1等，后者包括CD137（4-1BB）、OX40、CD27、CD28、CD40L、ICOS、GITR和LIGHT等。 图1  T细胞表达的共刺激/抑制受体及其配体相互作用的示意图（图源自Immune Network, 2020） 目前，共刺激受体的激动性药物研究正成为炙手可热的研发方向之一。其中，明星分子4-1BB作为一种强大的T细胞共刺激受体备受瞩目：4-1BB信号的激活能增强NK细胞抗体依赖性的细胞毒性功能；增强效应T细胞的细胞毒性功能，促进其分化和记忆能力，上调细胞炎症因子的分泌，保护其不被凋亡，将Treg重编程为具有抗肿瘤活性的细胞毒性CD4+ T细胞并提高机体的抗肿瘤能力。因此对4-1BB这一重要靶标的生理功能以及激动剂药物进行探究是非常有必要的。4-1BB根据白细胞分化抗原簇的命名又被称之为CD137。 CD137的天然结合配体是4-1BBL，又称作CD137L，在人体中位于19p13.3染色体，是一个II型跨膜蛋白，主要表达在DC细胞、B细胞和巨噬细胞等抗原呈递细胞上，并随着这些细胞的激活而进一步上调。与CD137一样，CD137L可以在非造血细胞中表达，例如内皮细胞、平滑肌细胞和心肌细胞。CD137L也可在造血干细胞、中性粒细胞和成纤维细胞上被检测到。 多款CD137单克隆抗体已进入临床研究。其中，Bristol-Myers Squibb公司的Urelumab（BMS-663513, IgG4）和Pfizer公司的Utomilumab（PF-05082566, IgG2）进展最快，均处于临床II期。临床结果发现，Urelumab具有剂量依赖的肝毒性和引起疲劳等副作用，而Utomilumab虽安全性提高，但疗效有限。 研究成果 1.     CD137小分子激动剂的先导化合物筛选和分子优化 NFAT作为免疫应答中诱导基因转录的一类重要的转录因子参与细胞功能调节，并作为关键调节点参与细胞中多条信号传导通路的调节。为了进行小分子化合物的筛选，作者首先建立了一个稳定的Jurkat克隆（人T细胞系）细胞Jurkat-CD137-NFAT-luciferase（即JC-luc），包含过表达的hCD137以及一个由NFAT结合元件控制的荧光素酶基因组成的转基因，从而刺激hCD137导致荧光素酶表达 (图2A)。并通过CRISPR/Cas9敲除Jurkat-NFAT-luciferase中的hCD137基因获得J-luc-sgCD137。用激动性抗CD137抗体 (aCD137) 处理JC-luc细胞可以诱导强大的荧光素酶活性，但在J-luc-sgCD137细胞中没有出现。因此，JC-luc细胞是评估潜在CD137小分子激动剂的理想选择。 图2小分子化合物筛选系统原理图及筛选结果 随后，作者对已上市小分子药物库进行了筛选。结果发现，Ataluren (AT，图2B) 在JC-luc细胞中以剂量和时间依赖的方式诱导了强大的荧光素酶活性。然而，在功能验证性实验中，与DMSO相比，aCD137能够显著提高WT小鼠CD4+、CD8+ T的分裂增殖能力（图3A-C）、促进原代T细胞的激活（图3D-G）以及上调IL-2、IFNG和Perforin的产生和分泌（图3H-M），而AT对CD4+和CD8+ T细胞均没有活化作用。 图3 AT未能活化小鼠脾脏原代T细胞 综上所述，AT是一种弱效、低特异性的CD137激动剂：尽管它能够激发CD137信号，但只能在JC-luc细胞中CD137高表达的情况下才会发生。因此，为了筛选出高效且特异性更高的CD137小分子激动剂，作者对AT的化学结构进行了系统的结构优化。 AT的化学结构由三个芳环串联而成，作者采用生物电子等排及骨架跃迁等经典药物设计策略，分别对三个环的类型及其取代基进行了系统的结构优化，设计并合成一系列小分子化合物，并通过JC-luc细胞实验验证改构后的化合物对细胞中luciferase活力的影响（图4C-4F）。结果表明，当1,2,4-噁二唑3-位为间位羧基取代的苯基时，活性最佳；当5-位为萘基时，化合物2-25处理后的luciferase活力值最高，相对荧光值达2.23，EC50值最低（64 nM）；噁二唑的改造对活性不利。因此，后续对2-25（即JNU-0921）的生物学功能进行了探索。 特异性实验：与DMSO相比，anti-huCD137和JNU-0921均能显著促进JC-luc细胞中luciferase活力，而在J-luc、J-luc-sgCD137细胞中均没有促进作用（图4G）。这提示我们，JNU-0921靶向CD137的特异性高，没有脱靶活性。同时，通过RT-qPCR实验发现JNU-0921能够显著促进JC-luc细胞中IFNG和GZMB的转录水平（图4H）。 小鼠原代细胞增殖、激活和细胞因子分泌实验：与DMSO相比，JNU-0921和aCD137均能够显著提高WT小鼠CD4+、CD8+ T的分裂增殖能力（图4I-J）、促进原代T细胞的激活（图4K-N）以及上调IL-2、IFNγ的产生和分泌（图4O-R）。而相比之下，在KO小鼠中并没有观察到这些实验现象。这说明，JNU-0921是以CD137依赖的方式促进T细胞的活化。 以上结果表明，JNU-0921是一种有效的特异性激动剂，能够激活人和小鼠CD137。 图4 2.     JNU-0921通过直接与CD137的胞外结构域结合激活CD137信号 确认了JNU-0921对CD137的特异性激活作用后，作者进一步探究了JNU-0921具体是如何激活CD137信号通路的。 三聚体CD137Ls结合并引起CD137的三聚化，然后招募TNFR相关因子(TRAF) 并引发下游NF-κB和MAPK信号传导。为了确定JNU-0921具体是影响了CD137信号通路中的哪个环节，作者首先考察JNU-0921是否影响CD137的寡聚化。根据荧光素酶互补实验原理构建了两个质粒，分别是pCDH-CD137-Nluc和pCDH-CD137-Cluc，当两个质粒在细胞中共表达后，如果CD137分子之间发生多聚化，则Nluc和Cluc相互靠近并正确配位，从而产生荧光素酶活性。实验发现，在Jurkat细胞中JNU-0921能够以时间和剂量依赖的方式显著增强荧光素酶活力（图5A-B）。根据激光共聚焦实验原理，进一步构建了pCDH-CD137-GFP和pCDH-CD137-mCherry两个质粒，当两个质粒在293T细胞中共表达后，如果CD137分子之间发生多聚化，则GFP和mCherry靠近或重叠，并显示出强烈的共定位信号。实验发现，JNU-0921能够显著增强CD137-GFP和CD137-mCherry的共定位（图5C-D）。同时，根据CO-IP实验原理，进一步构建了pCDH-CD137-Nluc-3xFlag和pCDH-CD137-Cluc-Myc两个质粒，当两个质粒在293T细胞中共表达后，如果CD137分子之间发生多聚化，那么通过IP拉下来的蛋白会增多（Flag拉Myc显）。实验发现，JNU-0921能够增强CD137-Flag共免疫沉淀CD137-Myc的能力（图5E）。这些结果说明，JNU-0921能够结合并促进CD137寡聚化。 那么，JNU-0921是如何直接与CD137发生相互作用的呢？作者分别构建了hCD137胞内段/胞外段的293T-Luc细胞（CD137-IN、CD137-EXtra），在过表达胞外段蛋白的293T细胞中的荧光素酶互补实验结果显示，JNU-0921能够以剂量依赖的方式显著增强荧光素酶活力（图5F）。而相比之下，JNU-0921对过表达胞内段蛋白的293T细胞中荧光素酶活力的增强程度要小的多。同时，激光共聚焦实验结果显示，JNU-0921能够显著促进CD137-Extra-TM-GFP和CD137-Extra-TM-mCherry的共定位（图5G-H）。另外，免疫共沉淀实验结果显示，JNU-0921能够明显促进CD137-Extra-TM-Nluc-Flag免疫共沉淀CD137-Extra-TM-mCherry-Myc的能力（图5I）。而相比之下，CD137-Intra-TM-GFP-Flag却未能免疫沉淀CD137-Intra-TM-mCherry-Myc。热漂移实验发现，与对照相比，在50℃-72℃范围内JNU-0921能够结合并稳定CD137胞外蛋白，使其相对不容易因高温而变性析出（图5J-K）。以上结果说明，JNU-0921通过结合CD137蛋白的胞外段从而促进CD137寡聚化。 接下来，作者将JNU-0921与CD137全长分子进行了分子模拟对接研究。对接结果显示，JNU-0921嵌合在CD137胞外段形成的一个凹槽中。JNU-0921的羧基与K69侧链、C68位主链之间形成氢键相互作用（图5L）。进一步地，作者通过定点突变的方式对关键氨基酸进行单点突变，将69位赖氨酸突变成精氨酸（Arg，R），将68位半胱氨酸突变成丝氨酸（Ser，S）。热漂移实验显示，JNU-0921并不能结合和稳定CD137-K69R蛋白，而仍然能够结合和稳定CD137-C68S蛋白（图5M-O）。同时，荧光素酶互补实验分析显示，JNU-0921对CD137-WT蛋白和CD137-C68S蛋白多聚化的影响程度相当，而对CD137-K69R的多聚化作用显著减弱。这些数据表明，在JNU-0921与CD137胞外段发生相互作用的过程中，K69与JNU-0921之间的氢键相互作用发挥了主要作用。 综上所述，JNU-0921通过与CD137胞外段的K69侧链基团发生氢键相互作用而促进CD137多聚化，而与C68位点主链之间的相互作用的存在与否对JNU-0921结合CD137胞外段的影响并不显著。 图5 3.     JNU-0921有效激活CD137的信号传导 CD137三聚化后招募下游TRAFs多聚体，包括TRAF1：(TRAF2)2、(TRAF2)3和TRAF3：(TRAF2)2，并激活ERK、MAPK和NF-κB信号通路。因此，作者首先探究CD137在对JNU-0921刺激的反应中招募了哪些TRAFs复合体。借助CRISPR/Cas9技术，构建了同时敲除了TRAF1、TRAF2和TARF3的293T细胞系。荧光素酶互补实验分析显示，JNU-0921能够以剂量依赖的方式显著促进TRAF3-Nluc和TRAF2-Cluc的多聚化，相比之下对TRAF1-Nluc和TRAF2-Cluc、TRAF2-Nluc和TRAF2-Cluc多聚化的影响程度要小的多（图6A）。激光共聚焦实验显示，JNU-0921能够显著增强TRAF3-GFP和TRAF2-mCherry的共定位信号（图6B-C）。免疫共沉淀实验分析显示，JNU-0921能够增强TRAF2-Flag免疫共沉淀TRAF3-Myc的能力。而相比之下，JNU-0921均不能增强TRAF1与TRAF2或TRAF2与TRAF2的相互作用（图6D）。这些实验结果说明，JNU-0921促进CD137寡聚化之后招募了下游的TRAF3：(TRAF2)2复合体。 P65和IκB是NF-κB信号通路中的成员，二者磷酸化增强程度能够反应出该信号通路的激活程度。WB实验显示，JNU-0921能够以剂量依赖的方式明显增强Jurkat细胞中P65和IκB的磷酸化水平（图6E）。同样，在WT小鼠激活的脾脏原代细胞中也发现，JNU-0921和aCD137均能够明显促进IκB的磷酸化水平，且是剂量依赖的。而相比之下，在CD137KO小鼠的原代细胞中并没有观察到这一趋势（图6F）。此外，RT-qPCR实验分析显示，JNU-0921和aCD137均能显著提高WT小鼠中NF-κB信号通路下游靶基因如BCL-XL、BCL-2、BFL-1和Survivin等抗凋亡因子的转录水平，而在CD137KO小鼠中则没有发现促进作用（图6G-J）。小鼠原代细胞中的实验数据进一步证明，JNU-0921是特异性靶向CD137而发挥作用的。因此，JNU-0921能够通过CD137激活NF-κB信号通路。 图6 综上表明，JNU-0921结合CD137后招募TRAF3：（TRAF2）2复合体，进而激活NF-κB信号通路并上调抗凋亡因子的表达。 4.     JNU-0921通过激活T细胞免疫从而抑制肿瘤生长 MC38是一种源于小鼠结肠癌的非免疫原性肿瘤，因其具有独特的生物学特征如免疫逃避、生长速度快、易于操控等特点而被广泛应用于肿瘤免疫治疗、药物筛选等各个方面。Rag1（Recombination activating gene 1）是参与免疫球蛋白VDJ重组的RAG复合物成分。Rag1纯合敲除（Rag1-/-）小鼠体内缺乏成熟的T细胞和B细胞，NK细胞比例略有增加。作者通过在WT和Rag1-/-小鼠皮下种植MC38移植瘤模型来探究JNU-0921在体内治疗肿瘤的能力。结果显示，JNU-0921在WT小鼠中显著抑制了MC38肿瘤的生长，而在Rag1-/-免疫缺陷小鼠中则没有抑制作用（图7A-C）。流式细胞术检测分析发现，JNU-0921治疗之后WT小鼠肿瘤中浸润的CD8+ T细胞比例显著增加（图7D）。因此，JNU-0921可能是通过激活CD8+ T细胞免疫功能而促进抗肿瘤作用。 随后，作者利用WT小鼠EG7移植瘤模型进行实验验证。将EG7种植至小鼠皮下，3天后待肿瘤成型再回输OT1 CTLs，再用JNU-0921治疗两周。实验结果显示，JNU-0921能够显著促进CTLs去杀伤EG7，抑制肿瘤生长，显示出显著的抗肿瘤作用（图7E-H）。为了探究JNU-0921治疗对肿瘤微环境中T淋巴细胞免疫功能的影响，流式检测和分析发现JNU-0921的治疗能够显著上调肿瘤浸润CD8+ T细胞中IL-2、IFNγ和GZMB的表达，提高CD8+中央记忆T细胞的比例，并且抑制TIM-3、PD-1和CTLA-4等耗竭marker的表达（图7I-O）。这提示JNU-0921能够在体内激活CD8+ T细胞、促进其记忆形成并抑制其耗竭。同时，流式分析还发现，JNU-0921的处理能促进肿瘤浸润CD4+ T细胞中IL-2和GZMB的表达，提高CD4+中央记忆T细胞的比例，并且抑制TIM-3和PD-1的表达（图7P-R）。此外，JNU-0921治疗还降低了肿瘤结节中Treg细胞的绝对数量。 综上所述，JNU-0921通过激活T细胞免疫而有效缩小肿瘤。 图7 5.     JNU-0921增强CTL的效应和记忆功能 进一步探究JNU-0921在抗肿瘤过程中对免疫系统产生的具体影响，首先，作者在小鼠原代细胞实验上探究JNU-0921对CD8+ T细胞效应功能的影响。将WT B6小鼠和CD137KO小鼠脱颈处死，取脾研磨获得原代细胞，用Recombinant Human IL-2、2-ME、anti-moCD3、anti-moCD28刺激后，加入药物处理。实验发现，JNU-0921能够显著增强WT小鼠CD8+ T细胞的分裂增殖能力（图8A-B）并促进T细胞激活，上调CD25和CD69的表达（图8C-D），而在CD137KO小鼠中则没有增强作用。 在免疫系统抗肿瘤的过程中发挥杀伤作用的主要是肿瘤浸润细胞毒性T淋巴细胞（CTLs）。因此，作者进行细胞杀伤实验以验证JNU-0921能否促进杀伤作用。首先构建P815-aCD3模型：向小鼠肥大细胞瘤细胞P815上过表达anti-mouse CD3 scFv，那么T细胞可以不依赖MHC呈递抗原的方式识别靶细胞P815-aCD3。杀伤实验结果显示，JNU-0921和aCD137均能显著促进WT小鼠CD8+ T细胞的杀伤作用（图8E-F），而在CD137KO小鼠中则没有增强作用。CD8+ T细胞在杀伤肿瘤细胞时会产生和分泌细胞效应因子，而细胞因子分泌实验也显示出JNU-0921处理以后能够显著促进WT小鼠CD8+ T细胞IFNγ、Perforin的表达（图8G-H）。 综上所述，JNU-0921增强CD8+T细胞的效应功能。 图8 OT1小鼠被广泛应用于多肽在CD8+ T细胞对抗原的阳性选择和应答中的作用，是用于体内研究CD8+ T细胞生物学的理想材料。OT1小鼠的脾脏原代细胞在体外用OVA257-264抗原肽进行刺激2-3天后，流式检测会发现CD8+ T细胞比例占95%及以上。因此，作者采用OT1小鼠去更有针对性地探究JNU-0921对CD8+ T细胞效应功能的影响。 细胞分裂和激活实验分析显示，与上述WT小鼠中观察到的结果一致，JNU-0921显著增强了OT1 CD8+ T细胞的分裂能力（图9I-J）并促进T细胞的激活（图9K-L），而在OT1/CD137KO小鼠中则没有增强作用。杀伤实验结果表明，JNU-0921显著增强了OT1 CD8+ T细胞的杀伤能力（图9M-N）。与杀伤作用增强对应的，JNU-0921显著提高了CD8+ T细胞IFNγ、Perforin的表达水平（图9O-P），而在OT1/CD137KO小鼠中则没有增强作用。 图9 随后，作者考察了JNU-0921对记忆性CD8+ T细胞分化的影响。采用EG7反复刺激OT1 CTL生成CD8+记忆T细胞 (图10A)。FACS数据显示，JNU-0921可诱导OT1初始CD8+ T细胞分化成CD44+CD62L+细胞 (图10B-C)，同时下调包括PD-1、CTLA-4和TIM-3在内的耗竭标志物的表达 (图10D-F)。RT-qPCR分析显示，JNU-0921处理增加了抗凋亡因子的转录水平，包括BCL-XL、BCL-2、BFL-1和Survivin (图10G-J)。 图10 此外，为了明确阐明JNU-0921对体内记忆细胞分化的影响，作者采用表达卵白蛋白 (LM-OVA) 的单核细胞增生李斯特菌 (Listeria monocytogenes) 感染CD45.1 C57BL/6J小鼠，然后在第二天通过尾静脉注射转移CD45.2 OT1 CTL。按照早期方案，在JNU-0921治疗45天后，分析脾脏和血液中中央记忆T细胞的比例 (图11A)。FACS分析显示，JNU-0921处理增加了脾脏和血液中中央记忆细胞的比例(图11B-D)。 综上所述，JNU-0921能够促进初始CD8+ T细胞向中央记忆T细胞分化并增强其效应功能。 图11 6.     JNU-0921通过增强Th1的辅助功能和抑制Treg活性来增强CTL在trans中的功能 图7数据可知，在JNU-0921治疗的小鼠中，肿瘤浸润的CD4+ T细胞表现出更高的效应和记忆功能，这表明CD4+ T细胞可能参与了JNU-0921的肿瘤缩小作用。事实上，作者也验证了CD4+ T细胞的耗竭会降低JNU-0921的治疗效果，正如CD8+ T细胞的耗竭一样 (图12A-C)。为了研究JNU-0921对CD4+ T细胞极化的影响，作者将JNU-0921作用于Th1和Th2极化条件下培养的CD4+ T细胞。有趣的是，JNU-0921促进Th1极化，抑制Th2分化 (图12D-G)，与前期报道一致。此外，JNU-0921可促进CD4+ T细胞的增殖和活化 (图12H-J)；而在CD137KO小鼠中则没有观察到这些实验现象。这表明，JNU-0921能够促进初始CD4+ T细胞向有利于细胞免疫的方向极化。 为了探索JNU-0921通过增强Th1功能促进CTLs功能的可能性，作者分离CD4+细胞并使其在体外向Th1极化。然后将这些Th1细胞分别以1:1的比例与CFSE标记的WT或CD137KO背景的OT-1 CTL混合。FACS分析显示，Th1能有效促进CTL增殖 (图12K-L)。在此基础上，JNU-0921和aCD137的处理能够进一步显著促进OT1小鼠CD8+ T细胞的增殖，而在OT1/CD137KO小鼠中则没有促进作用 (图12K-L)，无可置疑地表明JNU-0921通过促进Th1的辅助功能来增强CTL的功能。 图12 随后的Treg极化实验发现，JNU-0921和aCD137能够显著下调Treg（CD4+CD25+FOXP3+）的比例及其典型生物标志物CTLA-4和ICOS的表达，说明初始CD4+ T细胞向Treg方向的极化被抑制（图13M-R）。为验证JNU-0921在减弱Treg抑制功能的作用，作者根据Miltenyi Biotec的CD4+CD25+ Regulatory T Cell Isolation Kit分选了CD4+CD25-效应性T细胞和CD4+CD25+调节性T细胞，分别与OT1或OT1/CD137KO脾脏原代细胞以1:1比例进行共孵育，并加入JNU-0921进行处理后流式检测CD8+ T细胞的分裂情况。流式分析显示，CD4+CD25+细胞能够显著抑制T细胞的增殖，这证明了实验体系的有效性。在此基础上，JNU-0921和aCD137的加入能够显著促进OT1 CD8+ T的分裂，而在OT1/CD137KO小鼠中没有促进作用（图13S-T）。实验结果说明，JNU-0921能够逆转Treg对效应CD8+ T细胞增殖的抑制作用。 综上所述，JNU-0921能够诱导初始CD4+ T细胞向有利于抗肿瘤免疫的方向极化，增强Th1促进CD8+ T细胞功能的能力，并逆转Treg对CD8+ T细胞的抑制作用。 图13 小结 激动型CD137抗体的应用受限于严重的肝毒性（Urelumab）和弱效性（Utomilumab）。与抗体相比，小分子激动剂具有更好的药代动力学特性和组织渗透性，且对人类的抗原性较低，更适用于临床治疗，并可能降低治疗成本和不良反应的发生率。鉴于CD137共刺激信号在免疫系统中的重要作用及其抗肿瘤活性，本文开展了CD137的小分子激动剂的开发工作。首先，通过构建针对CD137信号轴的高通量小分子药物筛选系统，成功筛选到小分子先导化合物AT，并通过结构优化获得了一个没有脱靶活性且依赖CD137共刺激信号激活T细胞的化合物JNU-0921。JNU-0921通过CD137激活NF-κB信号通路，有效增强CD4+和CD8+ T细胞的效应和记忆功能，增强Th1辅助功能，削弱Tregs的抑制作用，从而发挥显著的抗肿瘤作用。根据目前文献报道，JNU-0921是首个CD137小分子激动剂，具有显著抗肿瘤活性及低毒性。 本文的通讯作者分别为暨南大学陈良教授、中国科学院上海有机化学研究所丁克研究员和暨南大学周倩副研究员，共同第一作者分别为刘鹭（PhD，暨南大学）、陈峰华（MD，暨南大学）、李姗（PhD，中国科学院杭州医学研究所）和杨童（PhD candidate，暨南大学）。 原文链接：https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.adp8647 撰稿：李姗陈峰华 核对：刘鹭 声明：发表/转载本文仅仅是出于传播信息的需要，并不意味着代表本公众号观点或证实其内容的真实性。据此内容作出的任何判断，后果自负。若有侵权，告知必删！ 长按关注本公众号  粉丝群/投稿/授权/广告等 请联系公众号助手 觉得本文好看，请点这里↓

▲ 详细日程见文末 ▲摘要：猪流行性腹泻(PED)是由流行性腹泻病毒(PEDV)引起的一种高度传染性肠道疾病，新生仔猪死亡率高达100%。2010年出现了高致病性基因群2 (G2) PEDV，其给全球猪肉产业造成了巨大的经济损失。2013年首次在美国报道并在全国暴发疫情，2013 - 2014年PED给许多猪肉生产商带来了巨大的灾难。怀孕母猪/后备母猪接种减毒活疫苗(LAV)是诱导乳原免疫的最有效策略，并通过初乳和乳汁为哺乳仔猪提供抗PED的被动保护。然而，经过大约十年的努力，仍然没有安全有效的疫苗。最大的困扰之一是LAV在野外的潜在毒力恢复。本文依据PEDV - LAV的发展现状及主要困难进行综述。我们还讨论了转录调控序列在PEDV转录中的功能，有助于重组以及防止LAV逆转的可能策略。关键词：猪流行性腹泻病毒；减毒活疫苗；重组；安全问题1概述猪流行性腹泻病毒(PEDV)是一种主要的猪肠道病原体，可引起新生仔猪严重的肠道感染，导致急性腹泻、呕吐、脱水和死亡。1971年在英国首次发现猪流行性腹泻(PED)的疾病，然后传播到欧洲多个猪肉生产国，当时其背后的病原体仍未被发现。1978年，比利时的研究人员首次确定PEDV为该病的病原体。它在欧洲农场引起了广泛的感染，导致20世纪70年代和80年代乳猪的损失严重。然后，它在20世纪90年代在欧洲变得罕见，在成年猪中零星爆发或在乳猪中出现轻微症状。1982年在亚洲报告了首例PED病例，疫情一直持续到20世纪90年代。然后，它成为地方性流行病，直到2010年，高毒性PEDV毒株在中国出现。2013年PEDV传入美国，并迅速在全国蔓延。在2013-2014年疫情期间，在养猪健康监测项目跟踪的猪场中，超过50%的猪场发生了新的疫情，估计造成9亿-18亿美元的经济损失。PEDV是尼多病毒目冠状病毒科甲型冠状病毒属的一员。它是最大的RNA病毒之一，核苷酸长大约28000个，正义单链RNA基因组，5＇帽和3＇聚腺苷化尾部。因为RNA基因组很大，包括PEDV在内的冠状病毒已适应了具有校对酶，可以平衡复制保真度和遗传多样性之间的冲突。PEDV通过积累突变和重组事件经历了一条进化路径，从而提高了病毒的适应性。两个大的ORF, ORF1a和ORF1b，编码在PEDV基因组的5＇2 / 3处，其次是四个结构蛋白和一个辅助蛋白的ORF:刺突(S)，ORF3，包膜(E)，膜(M)和核衣壳(N)蛋白。在病毒复制过程中，ORF1a和ORF1b被翻译成两种多蛋白前体，这些前体在翻译后被病毒蛋白酶进一步加工成16种非结构蛋白(nsp1-nsp16)。在PEDV编码的所有蛋白中，S糖蛋白在病毒粒子表面形成三聚体突起，负责附着于宿主受体，并通过膜融合介导病毒进入细胞，启动感染过程。此外，S基因在PEDV株中是一个高变区域。因此，它可以作为确定PEDV遗传多样性的系统发育标记。根据S蛋白的遗传多样性，PEDV可分为两个基因组:基因组1 (G1)和基因组2 (G2)，基因组2又可分为G1a、G1b和G2a、G2b、G2c亚群。PEDV G1a包括在比利时发现的原型毒株CV777，所有毒株都与CV777具有较高的遗传同源性。新出现的高毒力毒株被归类为G2。由于冠状病毒在复制过程中会合成一组共用相同5＇端的亚基因组RNA (sgRNAs)，因此在包括PEDV在内的冠状病毒中，不同毒株之间的同源重组率相对较高。因此，G1a和G2毒株之间潜在的重组事件导致了S-INDEL毒株、G1b和新近定义的G2c毒株的出现，这表明PEDV的进化复杂而快速。尽管群体免疫和生物安全仍然是预防PEDV最有效的方法，但新变种的不断出现，包括来自重组事件的毒株，其已经导致疫苗失败，并阻碍了PEDV的预防和控制。本文综述了PEDV病毒转录的分子基础，以及安全有效的PEDV减毒活疫苗的合理设计。2PEDV复制和转录中的功能元件PEDV感染的第一步是通过S蛋白识别并结合宿主受体。研究人员已经确定了几种冠状病毒的宿主受体用法。中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)识别二肽基肽酶4 (DPP4)受体结合。严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV)和SARS-CoV-2结合血管紧张素转换酶2 (ACE2)引发感染。而一些冠状病毒，包括传染性胃肠炎病毒(TGEV)及其变体、猪呼吸道冠状病毒(PRCV)、猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)、人冠状病毒(HCoV)-229E和猫冠状病毒II型，利用氨基肽酶N (APN)作为受体。APN是一种150kDa的跨膜蛋白水解酶，可从肽中切割中性或碱性NH2末端残基。它是一种在上皮细胞、巨噬细胞和粒细胞中普遍表达的蛋白。APN参与了广泛的生物过程，包括细胞增殖、运动、粘附和内吞作用。以往的研究表明APN是PEDV感染的共受体。PEDV的S蛋白能有效结合人和猪的APN。然后，一种外源表达人或猪APN (pAPN)的非受纳犬肾细胞系MDCK可以支持PEDV感染和连续病毒传代。相反，用抗pAPN抗体预处理易感细胞和允许细胞可阻断PEDV的生产性感染。与此同时，PEDV在表达pAPN的转基因小鼠模型中复制。然而，由于APN缺陷细胞系Vero和pAPN敲除猪支持PEDV复制，因此PEDV一定存在未知受体。在进入宿主细胞后，PEDV基因组被释放到细胞质中，并进入细胞器进行病毒复制。PEDV有一个正链RNA基因组，作为初始病毒蛋白翻译的mRNA。ORF1a和ORF1b编码pp1a和pp1ab两种多蛋白，它们是多蛋白前体，并分别被在nsp3和nsp5中存在的木瓜蛋白酶(PLpro)和3c样蛋白酶(3CLpro)两种病毒蛋白酶自加工成16种非结构蛋白(nsps)(图1)。图1.PEDV基因组结构和它的结构蛋白（S,E,M,和N），非结构（nsp1-16）和辅助（ORF3）蛋白。位于5＇UTR或每个ORF上游的绿色和红色条代表领导TRS和TRS主体区域。缩略词：pp1a和pp1ab的数字表示非结构蛋白1-16。PLpro：木瓜蛋白酶样的蛋白酶；3CLpro：糜蛋白酶样蛋白酶；RdRp:RNA依赖的RNA聚合酶；ExoN:核糖核酸外切酶;N7-MTase:N7-甲基转移酶;EndoU:内切核糖核酸酶;2＇-O-MTase:2＇-O甲基转移酶；S:刺突蛋白；E：包膜蛋白；M：膜蛋白；N：核蛋白。在病毒复制过程中，nsp1在翻译后迅速从多蛋白中产生和释放。它以宿主翻译机制和干扰素(IFN)应答系统为靶点，诱导宿主mRNA降解并拮抗IFN应答。复制-转录复合体(RTC)负责病毒RNA合成，由多种病毒非结构蛋白组成。在参与RTC的蛋白质中，nsp3-nsp6负责调节胞内膜和组装双膜囊泡(DMV)，而DMV是病毒RNA合成的地方。此外，剩余的nsps含有RNA合成中涉及的核心酶功能。例如，nsp7和nsp8的异源二聚体启动新生RNA合成并产生用于复制的短RNA引物，与nsp12形成冠状病毒复制复合体的最小核心。Nsp12是一种RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp)，用于复合体内的RNA合成。在新生RNA的延长过程中，RNA结合蛋白nsp9和解旋酶nsp13也参与其中。此外，双功能蛋白nsp14具有3＇-5＇外切酶(ExoN)和N7 -甲基转移酶(MTase)活性。外切酶结构域通过在RNA延伸期间去除错误结合的核苷酸来负责校对活动，以保持高复制保真度。而且，N7-MTase结构域与2＇-O-MTase nsp16一起介导病毒RNA的加帽过程，nsp10作为辅助因子参与其中。此外，nsp15是一种在冠状病毒中保守的尿嘧啶特异性核糖核酸内切酶(EndoU)，它处理病毒的dsRNA以逃避宿主防御系统的检测，从而导致免疫逃避。RTC初始翻译和组装后的病毒RNA合成包括病毒基因组复制和转录。在病毒基因组复制中，RTC可以识别PEDV正链RNA基因组并持续复制，产生互补的负链基因组。然后，负链基因组拷贝作为模板，更多新生的正链基因组RNA被合成并最终整合到子代病毒粒子中。与连续的基因组复制不同，PEDV利用非连续的转录策略。在负链RNA合成过程中，有一组5＇和3＇共末端亚基因组RNA (sgRNAs)通过中断机制产生，负链sgRNAs随后作为模板产生正链亚基因组信使RNA (sgmRNA)。所有sgmRNAs共享相同的5＇区，称为先导序列，位于冠状病毒基因组的开头，而在sgmRNAs的合成过程中，需要一组顺式作用元件，称为转录调控序列(TRS)。TRS是位于每个体ORF上游的同源性较高的短序列(称为“主体TRS”)和5＇前导序列下游（称为“前导TRS”）(图1）。在负链RNA合成过程中，当RTC在3＇1/3的病毒基因组中遇到N、M、E、ORF3和S基因的主体TRSs时，新生链的延伸被中断。在这种情况下，主体TRS作为RTC的“减速”或“停止”信号，RTC要么通读转录下一个ORF，要么将模板切换到先导TRS，产生sgRNA，携带5＇先导序列的反向互补序列（图2）。图2.PEDV的中断复制模型。当RTC遇到TRS区域时，要么“通读”，要么“模板切换”，生成中断的sgRNA。修改自Baker, s.c.，2008。主体TRS的模板切换事件涉及新生负链的RNA反向互补TRS(负义体TRS或新生抗体TRS)与基因组RNA的5 ' UTR(正链先导TRS)之间的相互作用。在TRS区域内，存在一个由6 ~ 8个核苷酸组成的保守核心序列(CS)并在其第5＇和3＇端两侧有可变序列。基于系统分析，Yang等发现前导TRS-CS在一个属内保守，但在属间不同，但β冠状病毒属的厄贝孔冠状病毒的TRS-L CS与α冠状病毒相似，而与β冠状病毒属不同。例如，α冠状病毒包括TGEV, SADS-CoV和PEDV共享TRS-CS(5＇-CUAAAC-3＇)。对于TRS-CS体，即使是同一属的病毒也表现出多样性。TGEV具有9个高度保守的TRS-CSs体，序列为5＇-CUAAAC-3＇，包括每个ORF的5＇端各1个 (1a, S, 3a, 3b, E, M, N和7)，以及S基因的内部CS。对于PEDV，CV777株的TRS-CS体的E,M和N基因经实验分别确定为5＇-CUAGAC-3＇，5＇-AUAAAC-3＇和5＇-CUAAAC-3＇。推断S和ORF3的TRS-CSs分别是5＇-GUAAAC-3＇和5＇-CCUUAC-3＇。PEDV的主体TRS-CS与先导TRS-CS最多可相差3个核苷酸。先前的研究报道了CS在指导碱基配对和新生负链与基因组5＇末端的先导TRS位点之间的二链体形成方面的关键作用。控制不同ORF表达的TRS-CSs体与PEDV中的先导TRS-CS表现出多种相似性，这可能是控制不同sgmRNAs丰度以及病毒蛋白的另一种策略。除了序列相似性，RNA二级结构也被认为是RNA合成所需的顺式作用元件。5＇UTR在病毒基因组复制中的结构功能首次在基于缺陷干扰RNA (DI RNA)的BCoV系统中得到验证。在BCoV 5＇UTR中预测了四个茎环(SLs)， SL I, II, III和IV，突变分析表明这些结构对病毒复制至关重要。随后，从甲型冠状病毒(HCoV-NL63、HCoV-229E和TGEV)、乙型冠状病毒(HCoV-OC43、HCoV-HKU1、SARS-CoV和MHV)和γ冠状病毒IBV中鉴定出3个保守的SLs (SL1、SL2和SL4)。MHV作为一个模型，证明了这些保守结构对病毒复制至关重要。SL1与部分展开的构象处于平衡状态。SL1因碱基配对减少而导致的结构不稳定被证明是致命的或导致病毒复制减少，而重新建立SL1碱基配对的补偿性突变使病毒复制恢复到与野生型病毒相似的水平。在保守的SLs中，SL2在所有属间的一致性最高。它有一个U-turn基序，这可能是RNA-RNA相互作用的原因。突变分析报告，突变破坏SL2茎的稳定性，显著削弱MHV的复制，导致感染滴度峰值降低，与野生型MHV相比，斑块更小。此外，具有不稳定SL2的突变体合成的RNA量显著低于野生型病毒。相反，恢复碱基配对的补偿性突变可以将这些不稳定突变体的病毒复制恢复到与野生型病毒相当的水平。另外，携带颠覆性突变的突变体破坏了茎，无法存活。这表明SL2通过调节RNA合成对病毒复制至关重要。SL4是一个位于先导TRS下游的长发夹结构。有人提出，SL4的基底部分处于一种柔性状态，这可能是导致sgRNA合成过程中模板切换的瞬时远程RNA-RNA相互作用的原因。根据Mfold [http://www.unafold.org/mfold/applications/ rna-folding-form.php(于2022年5月26日访问)]的分析，在PEDV CV777毒株的5＇UTR范围内预测了SL1、SL2、SL4和SL5四个二级结构(图3)。除了保守的SLs外，在核苷酸(nt)残基123和305之间还发现了一个SL5。它是一个包含三个发夹环的大型结构，延伸到ORF1a。迄今为止，在5＇UTR中，这些与先导TRS相邻的二级结构的功能仍然不清楚，需要进一步的实验来证实它们在PEDV RNA复制中的作用。图3.PEDV CV777典型毒株5 ' UTR的二级结构。4个保守茎环（SLs）用Mfold http://www.unafold.org/ mfold/ applications/rnafolding-form.php（2022.05.26），计算了每个SL的吉布斯自由能，并以kcal/mol表示。3PEDV疫苗研制现状产生的感染将基于基因组内各种病毒蛋白和功能元件的协同作用而启动，感染触发宿主对病毒感染的全身和局部粘膜免疫反应。早期的一项研究表明，先前接触引起的免疫反应可以防止断奶仔猪再次感染。此外，PED暴露的后备母猪可以通过肠道-乳腺-分泌IgA轴被动地转移母体免疫，并在攻击后为仔猪提供高达100%的PED保护。这提示病毒复制诱导的宿主免疫，特别是乳原免疫是预防PED的有效途径。Won等和Lv等评论了PEDV疫苗，包括LAV疫苗、灭活疫苗、病媒疫苗和亚单位PEDV疫苗。2010年之前，G1a型PEDV疫苗包括灭活疫苗和减毒活疫苗，其有效地控制了PEDV在亚洲国家的爆发。Ma等人于1994年制备了一种基于细胞适应CV777毒株的灭活疫苗，母猪接种后，3日龄猪的保护率为85.19%，仔猪的被动免疫保护率为85.0%。随后，该团队又于1995年成功研制出TGEV和PEDV二价灭活疫苗，并在中国实现商业化。除了灭活疫苗，Tong等人报道了一种体外连续传代CV777生产的LAV。对3 - 6日龄仔猪的保护率为95.52%，被动免疫保护率为96.2%。1999年成功开发了PEDV和TGEV的二价LAV，对PEDV的主动和被动保护率分别高达97.7和98%。这两种二价疫苗在2010年PEDV高毒变株突发事件之前，在中国广泛使用，有效控制了PEDV和TGEV的传播。日本和韩国也开发了疫苗。一种日本毒株PEDV 83P-5在Vero细胞中连续传代后被减毒，并作为LAV在市售。重要的是，母猪接种83P-5被动保护了80%的仔猪免受G2 PEDV攻击的死亡。两株韩国毒力毒株SM98-1和DR-13也进行了体外传代和减毒。SM98-1毒株已被用作肌肉注射LAV或灭活疫苗，DR-13毒株可作为口服LAV。Song等人的研究表明，晚期妊娠母猪口服DR-13后，87%的哺乳仔猪能抵抗同源病毒的攻击。从2010年底开始，由于出现了G2分支的高毒力PEDV变体，中国经历了严重的PED疫情，对养猪业造成了毁灭性的破坏，并传播到其他亚洲和北美国家以及欧洲(乌克兰)。2015年，两种多价疫苗在中国正式获批上市。一种是由TEGV、PEDV (CV777株)和猪轮状病毒减毒研制的三价疫苗，另一种是含有TGEV和PEDV的二价减毒疫苗(ZJ08株，G1b)，但由于G1和G2株之间的交叉保护较差，其有效性值得怀疑。一项比较研究评估了G1b和基于G2b的疫苗对2周龄断奶仔猪G2b毒株攻击的效果。这表明，基于G1b毒株的灭活疫苗对G2b的攻击提供了足够的保护，证明了粪便中PEDV RNA在高峰脱落期间减少了3-4个logs，病毒脱落持续时间更短，但G1b毒株衍生的疫苗失败了。在韩国和泰国也观察到类似的现象，在这两个国家，市售的G1毒株衍生的疫苗未能对目前流行的G2毒株提供完全的保护。迄今为止，高毒力PEDV是中国主要的猪病毒病原体之一(占世界生猪存栏量> 50%)。因此，迫切需要针对G2株的有效疫苗来预防和控制仔猪的这种致命病毒感染。大多数许可的PEDV疫苗是灭活疫苗或由已被杀死或完全减毒的整个病原体组成的LAV。这种全病原体疫苗可以引起强烈的保护性免疫反应。Collin等人研制了一种G2b型灭活疫苗，基于分离的美国变异NPL-PEDV 2013 P10.1株。根据基于细胞的病毒中和试验，该疫苗通过肌肉注射引起了相当水平的针对PEDV的体液免疫。然而，灭活疫苗不能复制，只能诱导较小范围的免疫反应。此外，由灭活疫苗诱导的免疫不像LAV那样持久，导致需要多次剂量才能增强。此外，由LAV触发的强被动乳原免疫是保护新生哺乳仔猪免受包括PEDV在内的肠道疾病侵害的最有希望和最有效的方法。在非自然寄主组织培养中进行连续传代导致病毒致弱是培养LAV的常规方法。迄今为止，已经报道了几种细胞减毒的G2毒株，包括美国分离株PC22A，亚洲株YN, Pingtung-52和KNU-141112。Hou等人对四种减毒毒株的突变模式和分子机制进行了全面的评论。一般来说，细胞适应毒株在仔猪中是减毒的，并且通过激发高水平的中和抗体而具有高度的免疫原性。然而，对于这些报道的G2 PEDV为基础的LAV候选物的保护功效存在一些担忧。首先，由于最脆弱的种群是乳猪，在它们遇到病毒之前没有足够的时间诱导主动免疫，因此PEDV疫苗接种的理想策略是在母猪/后备母猪中诱导保护性乳原免疫反应。由于在母猪/后备母猪中进行PEDV攻击研究是昂贵且劳动密集型的，科学家们利用基于细胞的病毒中和试验来测试疫苗接种诱导的保护性免疫反应，这可能作为保护的指标。此外，新生儿猪模型用于测试病毒致弱，保育猪(或断奶猪)用于评估病毒的免疫原性和筛选有希望的候选病毒。例如，在细胞培养适应的PC22A株的研究中，100代(P100)和P120在断奶仔猪中完全减毒，但在新生仔猪中部分减毒。然而，与P120病毒相比，PC22A的P100在毒力毒株攻击后诱导了更高的血清PEDV IgA、IgG和病毒中和(VN)抗体滴度和更多的PEDV IgA抗体分泌细胞。这些结果表明PEDV的致弱是一把双刃剑。在仔猪中完全减毒的LAV候选物不能在母猪中诱导足够的乳原免疫。年龄较大的猪比仔猪更能抵抗PEDV感染和疾病。因此，仔猪中PEDV的完全衰减通常会导致减毒病毒的低效复制和老龄猪中病毒免疫原性的降低，从而导致保护性免疫的低效。其次，G1组和G2组之间的交叉保护程度较低，G2a组和G2b组之间的交叉保护效率也是疫苗开发中需要关注的问题。Liu等证实CH/HBXT/2018 (G2a)和CH/HNPJ/2017 (G2b)灭活疫苗对异源株的VN抗体滴度均显著低于同源株。因此，在进一步的疫苗研究中，异种毒株的攻击对阐明交叉保护具有重要意义。4PEDV减毒活疫苗毒力逆转的风险与预防除了保护效率之外，阻碍PEDV LAVs应用的最大问题之一是安全问题。减毒毒株携带突变，通过系列传代或分子工程引入，使其没有致病性。然而，一些疫苗毒株通过(1)病毒基因组内突变的积累和(2)重组在初级疫苗受体传代过程中表现出毒力的逆转。在本节中，我们将回顾抵制PEDV - LAV发展的逆转事件的策略。有两种方法可以产生有希望的减毒候选疫苗:(1)经典方法是通过在非自然宿主或环境中连续传代病毒，使其适应新条件并减少在自然宿主中的复制，或者(2)通过对多种基因进行遗传修饰的反向遗传学方法，这些基因对于降低病毒的致病性是必不可少的。然而，由于宿主的免疫功能低下或弱病毒的遗传不稳定，衰减突变的逆转和基因组中其他地方的补偿性突变都可能导致毒力的逆转。nsp16的2＇-O-MTase在冠状病毒中高度保守，在复制和转录过程中介导病毒基因组RNA和sgmRNAs的加帽过程。在老龄小鼠模型中，一种SARS-CoV nsp16突变体(dNSP16)在异源攻击后显示出作为候选疫苗的有效性。然而，在缺乏功能性B细胞和T细胞(RAG - / -)的小鼠模型中，接种dNSP16突变体后，62.5%(5/8)的免疫受损小鼠表现出体重减轻和死亡，而这在老年小鼠模型中是不存在的，表明毒力的逆转。同时，虽然引入的靶向nsp16的突变在逆转录物中被保留，但在nsp3、nsp12和nsp15中发现了6个突变，这些突变可能具有代偿性突变的作用。先前的一项研究表明，PEDV nsp14-ExoN突变体E191A显著减弱，但具有高度的遗传不稳定性，并且在体外和体内均观察到反向突变。重组MHV和SARS-CoV携带断裂的nsp14外显子结构域也有类似的报道。在体外连续传代(250次)后，尽管在外显子(-)活性位点未发现反向突变，但具有工程外显子的MHV突变体(MHV-ExoN(-)- p250)积累的突变比野生型MHV多8倍，并且显示出更高的复制保真度，这表明在病毒复制过程中出现了外显子功能的代偿突变。为了减轻这种突变驱动的逆转，可以将针对不同基因的多个突变结合到病毒基因组中，并通过不同的机制减弱病毒。例如，我们形成了重组PEDV icPC22A-KDKE4A-SYA，携带失活的nsp16 2＇ -O-MTase和S蛋白的内吞信号。如上所述，nsp16 2＇-O-MTase功能障碍在小鼠中减弱了SARS-CoV、MHV和MERS-CoV。S蛋白胞质尾部的保守基序YxxΦ调节被感染细胞表面S蛋白的水平，并作为毒力因子发挥作用。重组突变体icPC22A-KDKE4A-SYA在猪体内传代三次后保留了引入的突变，表明其体内遗传稳定性。在SARS-CoV LAV发展过程中也采用了类似的方法，通过将失活的nsp14-ExoN和nsp16-2＇-O MTase结合产生dNSP16/ExoN。与dNSP16突变体不同，dNSP16/外显子不会引起重大疾病，并且在接种后30天免疫功能低下小鼠模型中被清除，而不会恢复到毒力形成。总的来说，多种突变的组合通过各种途径减弱病毒，为对抗突变驱动的冠状病毒LAV的逆转提供了答案。此外，重组是许多RNA病毒的重要进化因素，特别是冠状病毒，在密切相关毒株的混合感染中，其重组率高达20%。重组驱动的逆转，即当一种疫苗毒株与产生新变体的野毒毒株重组时，对LAV的应用构成了障碍。几种动物病毒的LAV包括犬细小病毒、传染性法氏囊病病毒、牛疱疹病毒1，以及冠状病毒、IBV和PEDV的成员，他们都发生了由重组驱动的逆转引起的疫苗失败。在中国几个养猪业大省发现了PEDV重组变异体。一种在田间表现出高致病性的变异源于低致病性疫苗与强毒田间菌株之间的重组事件。病毒基因组重组的一般机制有三种:(i) DNA基因组中的断裂和修复，(ii) RNA基因组中的聚合酶模板切换，以及(iii)分段RNA基因组中的片段重组。作为一种非分段RNA病毒，冠状病毒可以在两个不同分子之间进行分子间重组，也可以通过模板切换在同一分子内进行分子内重组。分子内重组是指复制酶在先导区和主体TRS区之间切换，产生一组sgmRNAs，而分子间重组是指复制酶从不同亲本毒株的供体模板跳到受体模板，在RNA合成过程中共享同源序列，偶尔会产生重组病毒子代。对冠状病毒TRS位点和重组事件的系统分析表明，近10%的主体TRS区域参与断点热点，重组热点经常与主体TRS相关。因此，TRS线路成为阻止冠状病毒复制过程中分子间重组的主要靶点。通过将3-nt引入与野生型TRS序列有三个核苷酸差异的重组TRS中，设计了一种抗重组SARS- CoV。重装TRS线路与野生型线路不相容，它是导致携带混合野生型和重装的TRS的拯救嵌合病毒失败的原因。随后，同一组的研究人员进一步优化了调控回路，设计了一个7-nt重组的TRS，该TRS具有增强的遗传稳定性，基因组可作为SARS - CoV减毒疫苗开发的有效抗重组平台。对于PEDV来说，重装TRS线路有两个困难:(1)与在大多数冠状病毒中观察到的TRS-CSs的高度一致性不同，PEDV的TRS-CSs表现出令人难以置信的多样性，其中，TRS-CS主体与先导TRS-CS可以有三个核苷酸的差异(见第2节);(2)在PEDV基因组中，所有的体TRS-CSs都与上游ORF重叠。因此，将突变引入TRS区域可能会改变上游ORF的氨基酸序列，导致不利突变。需要新的方法而不是直接重新编码TRS-CSs来防止TRS相关的重组驱动的逆转。第一种可能的方法是通过引入沉默突变来重新设计与上游ORF重叠的TRS-CSs，以保留原始氨基酸序列。除了沉默突变外，保守氨基酸替代策略也可用于设计TRS-CSs，该策略将蛋白质中的一个氨基酸替换为具有相似生化特性的另一个氨基酸。除了序列相似性方面，TRS区域的RNA二级结构被认为是顺式作用元件，也调节RNA转录。正如我们在第2节中所讨论的，PEDV基因组5＇UTR的二级结构在病毒复制中起着重要作用。然而，对于二级结构的准确预测信息有限，尤其是对主体TRS的预测。研究人员根据SARS-CoV-2报道了冠状病毒基因组在其生命周期中的二级结构动态。例如，与感染细胞中的病毒RNA相比，病毒粒子内的RNA基因组经历了主要的构象改变，并表现出过渡的密封。虽然预测了PEDV CV777毒株5＇UTR的二级结构(图3)，通过靶向主体TRS区域内的关键结构元件来重新编码PEDV TRS系统的更多方法将受益于PEDV基因组结构在病毒复制过程中的动态说明。这些区域的结构变化也可能调节RTC的模板开关事件，导致转录回路的改变。使用这些方法，重新编码的主体TRS-CSs将与野生型不兼容，但保留上游ORF的保守置换。最后，我们可以通过人为引入间隙，将PEDV的TRS区域与上游ORF区分离，从而破坏原有的TRS位点，重组PEDV的基因组。因此，引入的间隙有望作为调节PEDV转录的功能元件，我们可以像之前在SARS-CoV中描述的那样重新连接转录回路。目前，我们正在设计一个改造的TRS，几乎没有改变原来5＇的二级结构UTR。一个重塑的PEDV突变体RMT已经被拯救，在体外和体内有效地复制。RMT在新生仔猪中显示出部分减毒表型和诱导的部分保护作用(未发表的数据)。它也显示出与野生型S-INDEL PEDV菌株的重组减少。因此，它可以作为未来开发抗重组PEDV LAV的平台。5结论新出现的高毒力PEDV在哺乳仔猪中引起了大规模暴发，死亡率很高，给猪肉工业造成了重大损失，但很少有疫苗能有效预防这种疾病。由于新生仔猪的脆弱性，最有效的疫苗接种策略是在妊娠母猪体内诱导强乳原免疫，通过初乳和乳汁将保护性中和抗体被动传递给哺乳仔猪。同时，保护母猪肠道的主动粘膜免疫在这一过程中起着至关重要的作用。先前对另一种猪肠道冠状病毒TGEV的研究表明，只有用活病毒免疫，而不是灭活疫苗或亚单位疫苗免疫，才能触发足够的乳原免疫。因此，在母猪体内使用易于触发乳原免疫的LAV是预防和控制PED的一种很有前途的方法。未来需要同源和异源挑战来证明疫苗对野外流行毒株的交叉保护作用。此外，弱毒株的毒力回复的安全性问题仍未得到解决，这阻碍了LAV的应用。利用反向遗传学和新开发的方法，结合几种不降低病毒免疫原性的致弱突变(例如，nsp1突变)和重新连接的TRSs，可以帮助提高候选疫苗的遗传稳定性，从而可能对突变和重组驱动的逆转更具抵抗力。参考资料：Niu X, Wang Q. Prevention and Control of Porcine Epidemic Diarrhea: The Development of Recombination-Resistant Live Attenuated Vaccines. Viruses. 2022 Jun 16;14(6):1317. doi: 10.3390/v14061317. PMID: 35746788; PMCID: PMC9227446.为了推动兽用生物制品行业交流，共同探讨该领域的最新研发进展、产业化现状及未来发展趋势，生物制品圈联合四叶草会展、乘风济海将于2024年4月17日-18日在南京共同举办“兽用生物制品研发和产业化大会”，系中国医药全产业链新资源大会（CBC大会）中的一个分领域专业会议。诚邀全国相关领域研究者共享学术盛会。名称：兽用生物制品研发和产业化大会时间：2024年4月17日-18日（周三-周四）地点：南京国际展览中心主办单位：生物制品圈、抗体圈、四叶草会展，乘风济海媒体支持：药时空、细胞基因研究圈报名方式：扫描下方二维码→ 填写表格 → 报名成功组委会获得报名信息后，根据报名信息进行初筛，并进一步与报名者沟通确认，实现精准邀请（严格审核通过）。注：大会日程以会议现场为准。中国医药全产业链新资源大会（CBC大会）是一场将“政、产、学、研、用、管、投”各方精英围绕全产业链新资源展开的合作大会，将于2024年4月16日-18日在南京国际展览中心举办。大会将主打“全产业链新资源对接”，围绕投资、立项、临床前研发、临床研究、生产、供应链国产化、销售、MAH合作、国际品种合作、公司股权合作与并购全产业链，为中国医药同仁带来全新的资源与商机。大会下设的同期会议包括：宠物药品、食品、保健品新资源大会兽用生物制品研发和产业化大会透皮技术研发生产与注册开年分享会吸入制剂研发、生产与注册新机遇新进展分享会中国改良新药与缓控释制剂全产业链合作大会多肽产业创新与发展大会新药典新型辅料与包材产品与技术交流会新药典新型实验室仪器与耗材实操演示交流会陆续更新中......识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入生物制品微信群！请注明：姓名+研究方向！版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。