SIGLEC14

-01-引言在过去十年中，以免疫检查点抑制剂和细胞疗法为形式的癌症免疫治疗改善了许多患者的治疗和预后。尽管如此，大多数癌症仍然对目前批准的癌症免疫疗法具有耐药性。需要新的方法和合理的组合来克服这些阻力。最新的研究表明，肿瘤微环境中含唾液酸聚糖的唾液酸与肿瘤浸润免疫细胞上唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素（Siglec）受体之间的相互作用可能代表一个新的免疫检查点和癌症免疫治疗的潜在新靶点。-02-一、Siglec受体及信号通路Siglecs是一类与含唾液酸的聚糖结合的受体家族。大多数Siglec受体是抑制性的，目前发现 15 种人源和 9 种鼠源的Siglec 分子。Siglec受体可进一步分为序列保守的受体和与CD33相关的快速进化受体。Siglec-1、Siglec-2（CD22）、Siglec-4和Siglec-15属于保守家族；Siglec-3（CD33）、Siglec-5、Siglec-6、Sigleg-7、Siglec8、Siglec-9、Sigle-c-11、Siglec-XII、Siglec-14和Siglec-16属于快速演化的CD33相关Siglecs受体。根据细胞内信号结构域的不同，Siglec受体也可分为抑制型、激活型和非信号型。Siglec-11、Siglec-14和Siglec-15属于激活型Siglec受体，而Siglec-1和Siglec-4没有直接的免疫调节细胞内结构域。所有其他人类Siglec受体在本质上都是抑制性的。Siglec 家族属于一次穿膜的Ⅰ型膜蛋白， 在结构上具有非常典型和保守的结构特征， 其穿膜区由 2 ～17 个胞外 Ig 结构域组成，N 端由一个结合唾液酸的V-set Ig 结构域和一定数目的 C2-set Ig 结构域组成。抑制性Siglec受体细胞内含有免疫受体酪氨酸抑制基序（ITIM）和免疫受体开关基序（ITSM）的结构域，可以通过SHP1和SHP2磷酸酶的参与调节细胞内信号。因此，抑制性Siglecs可以与PD-1/PD-L1类似的作用方式抑制免疫细胞激活。激活型Siglec受体具有带正电荷氨基酸的跨膜结构域，当CRD与唾液酸聚糖配体结合时，该跨膜结构区介导DAP12的招募，DAP12包含免疫受体酪氨酸基激活基序（ITAM），并可传递激活信号。-03- 二、癌症相关Siglec配体的表达许多研究报告了癌症和肿瘤微环境中唾液酸聚糖的表达变化，肿瘤细胞通常是高唾液酸化的，产生免疫细胞上抑制性Siglec受体的配体。例如，由于唾液酸转移酶ST3GAL1和ST3GAL4的过表达，胰腺导管腺癌（PDAC）肿瘤细胞显示出唾液酸化增加。PDAC细胞的唾液酸化被髓系细胞上的Siglec-7和Siglec-9识别，并使单核细胞向促瘤巨噬细胞极化。同样，Siglec-9配体的上调已在人类结直肠癌、前列腺癌、乳腺癌和非小细胞肺癌中得到证实。通过全基因组筛查，已确定唾液酸化CD43是Siglec-7的高度特异性配体，抑制NK细胞介导的K562白血病细胞杀伤。LGALS3BP已被证明是几种Siglecs（包括Siglec-9）的分泌型癌相关配体，可抑制中性粒细胞活化。CD24在许多癌症中过表达，并通过与Siglec-10在肿瘤相关巨噬细胞（TAM）上的相互作用，成为某些卵巢癌和乳腺癌中免疫逃避的主要机制。此外，可溶性CD52同样与T细胞上的Siglec-10结合，据报道在自身免疫性疾病中抑制T细胞。-04-三、Siglec受体对癌症免疫细胞的影响Siglec受体广泛表达于免疫系统的不同细胞上。已证明，不同免疫细胞上的唾液酸聚糖配体和Siglec受体之间的功能相关相互作用有助于在癌症背景下建立免疫抑制微环境。固有免疫细胞，特别是巨噬细胞，高表达几种不同的Siglec受体，包括Siglec-3、Siglec-5、Siglec-7、Siglec9、Siglec-10、Siglec/14和Siglec-15。最近证明，唾液酸聚糖对胰腺癌细胞的Siglec-7和Siglec-9结合可诱导促肿瘤巨噬细胞表型。。此外，已经表明，癌细胞上的唾液酸化CD24与TAM上的Siglec-10相互作用可以抑制吞噬作用。巨噬细胞上的Siglec-15也被证明可以抑制T细胞介导的抗肿瘤免疫。树突状细胞是抗肿瘤免疫反应的重要介质，与免疫治疗的成功密切相关。最近的研究进一步表明Siglec受体在经典树突状细胞（cDC）上的作用。已证明DC上的小鼠Siglec-G可以调节抗原处理；此外，小鼠体内的Siglec-E被证明参与了抗原摄取和向CD4+T细胞的递呈。在小鼠模型系统中，抗原的唾液酸化可通过Siglec-E诱导耐受性调节性T细胞。人单核细胞衍生树突状细胞上的唾液酸聚糖通过Siglec-7和Siglec-9抑制免疫细胞激活。唾液酸聚糖还可诱导DC和CD8+T细胞之间的高亲和力相互作用。NK细胞是重要的先天性淋巴细胞。几组研究表明，NK细胞上的Siglec-7和Siglec-9可与癌症相关唾液酸聚糖作用，参与抑制抗肿瘤免疫激活。将合成唾液酸聚糖插入肿瘤细胞的细胞膜能够剂量依赖性地抑制NK细胞介导的杀伤和脱颗粒。最近的工作进一步证明Siglec-7与多发性骨髓瘤细胞上的唾液酸化PSGL-1相互作用，能够抑制NK细胞介导的骨髓瘤细胞杀伤。此外，在肾癌细胞中，神经节苷脂Siglec-7配体的过表达抑制NK细胞活化；唾液酸化MUC16结合人Siglec-9并抑制卵巢癌中的NK细胞。除了影响髓系细胞和其他先天免疫细胞外，唾液酸聚糖-Siglec相互作用也影响癌症的适应性免疫系统。研究发现，Siglec-9在癌症患者血液和肿瘤浸润性T细胞中上调，其在肿瘤特异性耗竭的PD-1+T细胞上表达。肿瘤细胞上Siglec-9配体的减少显著诱导T细胞介导的效应器功能和肿瘤细胞杀伤。在T细胞急性激活后，Siglec-5和Siglec-10也被发现上调，并可能影响抗肿瘤免疫。总之，唾液酸聚糖与Siglec受体的相互作用已被证明通过诱导肿瘤相关巨噬细胞的促癌表型、抑制NK细胞和中性粒细胞活化、减少DC成熟和抗原提呈以及抑制T细胞反应，有助于免疫抑制肿瘤微环境。-05-四、针对唾液酸聚糖-Siglec的药物开发近几年以来，作为肿瘤抗原的Siglec受体一直是治疗癌症的重要靶点。Siglec-2（CD22）在许多B细胞恶性肿瘤中表达，抗体偶联药物（ADCs）已成功用于靶向肿瘤细胞，如inotuzumab ozogamicin治疗复发性急性淋巴细胞白血病。靶向Siglec-2和CD19的CAR-T细胞也被开发用来治疗复发性弥漫性大细胞B细胞淋巴瘤或急性淋巴细胞白血病患者。此外，靶向Siglec-3的ADC也在开发和测试当中。除了作为一种直接的肿瘤相关性抗原，Siglec受体及其唾液酸聚糖配体也可以作为靶向激活免疫细胞对抗肿瘤。Siglec受体可以被高亲和力抗体阻断，类似于PD-1/PD-L1和CTLA-4的免疫检查点抑制剂。阻断性抗体NC318以Siglec-15为靶点，目前正在进行一项对晚期非小细胞肺癌患者联合使用pembrolizumab的临床研究（NCT04699123）。Siglec-7和Siglec-9是提高NK细胞抗肿瘤活性的潜在靶点，一项使用Siglec-7和-9阻断性抗体的临床前研究证明了在小鼠模型中的抗肿瘤功效，阻断抑制性Siglec受体可支持免疫抑制微环境中TAM的复极，增加抗肿瘤巨噬细胞的吞噬作用。此外，肿瘤细胞上CD24与肿瘤相关巨噬细胞上Siglec-10之间的相互作用被认为是增强巨噬细胞吞噬作用的新治疗靶点。另一种方法是使用针对特定糖类的阻断性抗体。最近的一项研究表明，抗神经节苷脂GD2的抗体可以通过抑制巨噬细胞上GD2与Siglec-7的结合来提高抗肿瘤免疫，从而通过进一步增加吞噬作用来增强CD47阻断的效果。此外，降低肿瘤细胞和肿瘤微环境中的唾液聚糖密度是一种替代策略。可以开发新的唾液酸生物合成抑制剂，以改善癌症免疫治疗。在小鼠模型中，使用2-脱氧-D-葡萄糖抑制肿瘤细胞的N-糖基化可增加CAR-T细胞介导的杀伤作用和疗效。使用酶降低肿瘤中唾液酸聚糖的密度也被证明可以增强抗肿瘤免疫治疗，与抗HER2抗体trastuzumab偶联的细菌唾液酸酶，目前正在首次人体临床试验。-06-结语癌症免疫治疗的改进需要开发新的方法。Siglec受体及其与唾液酸聚糖配体的相互作用是改善癌症免疫治疗的一个潜在的新型免疫检查点。在过去的几年里，已经进行了一些临床前和临床研究，支持了针对Siglec受体的药物开发。以唾液酸聚糖-Siglec轴为靶点的癌症免疫治疗显示出良好的潜力。参考资料：1.Siglec receptors as new immune checkpoints in cancer. Mol Aspects Med.2022 Aug 7;101112.公众号内回复“ADC”或扫描下方图片中的二维码免费下载《抗体偶联药物：从基础到临床》的PDF格式电子书！公众号已建立“小药说药专业交流群”微信行业交流群以及读者交流群，扫描下方小编二维码加入，入行业群请主动告知姓名、工作单位和职务。

胃癌是我国最常见的肿瘤之一，发病率和死亡率均排名第三，且近年来发病率日益增加，造成的疾病负荷也越来越重[1]。因此，寻找治疗胃癌的新靶点和新方法尤为重要。 胃癌是我国最常见的肿瘤之一，发病率和死亡率均排名第三，且近年来发病率日益增加，造成的疾病负荷也越来越重[1]。因此，寻找治疗胃癌的新靶点和新方法尤为重要。 正所谓“对症下药”，在寻找胃癌治疗新靶点及新药物前，首先需要明确它的特征。20年前，人类参考基因组图谱（GRC38）发布，大幅度加深了科学家对疾病尤其是肿瘤的认识，并极大地促进了肿瘤领域研究的进步。 然而，由于样本选择不充足等原因，这个数据库无法全面反应不同种族、地区人群的基因多样性[2]。此外，这种人类参考基因组也不完整，来自大型队列研究的长片段序列与目前的人类参考基因组无法完全匹配[3]。 针对以上问题，近年来，科学家研究出一种新的检测方法-泛基因组学法，用于研究单个样本中的基因缺失[4]。泛基因组是群体中所有个体基因组的总和，其中存在两种类型的基因，一种是所有个体共享的核心基因，另一种是部分个体共享的非必须基因（也被称为基因的存在-缺失变异，PAV）[5]。针对PAV，研究人员在2019年开发出了一款名为“HUman泛基因组自动化分析工具”（HUPAN）用于构建人类泛基因组，并表征出基因组中的PAV[6]。 那HUPAN这个锋利的“矛”是否可以刺破守护胃癌基因组PAV这个“盾”，从而揭示胃癌基因组特征，为胃癌分子靶向治疗提供出一份完整的“地图”呢？ 近日，上海交通大学医学院附属瑞金医院朱正纲和于颖彦，及上海交通大学陈红专和韦朝春领衔的研究团队，在《自然·通讯》上发表了一项重要研究成果。 这项研究通过HUPAN工具分析了185对中国人胃癌及正常组织的泛基因组特征，表征了胃癌基因组中的PAV景观，确定了在中国汉族人胃癌患者中高频缺失的抑癌基因[7]。总之，这项研究揭示了中国人胃癌基因组学特征，提供了重要的分子遗传学参考。 图1. 文章封面截图 研究人员通过HUPAN工具，分析了185对胃癌和正常组织的全基因组序列（WGS），构建出了包含以往的人类参考基因组（GRC38）和80.88Mbp新序列的胃癌泛基因组（GCPAN）。 这80.88Mbp新序列中包含53.78Mbp完全未对齐序列和27.10Mbp部分未对齐序列（图2），并预测出新序列上的含82个基因，与GRC38相比，有14个基因的重复序列不到50%，意味着这段新序列上可能存在至少14个新基因。 图2. 胃癌泛基因组的构建 随后，研究人员将GCPAN作为参照，进行胃癌患者的PAV图谱分析，共计发现了261个PAV。 其中，195个PAV在肿瘤组织和正常组织中都存在，而缺失变异相对特异，有36个PAV只在正常组织中缺失，30个PAV只在肿瘤组织中缺失（图3）。 图3. 胃癌泛基因组的PAV景观 为找出癌症易感基因，研究人员将这些PAV与两个其他的基因组测序数据（数据1：SGDP项目，西蒙斯基因组，263人；数据2：中国汉族基因组，90人）进行了比较，并发现GCPAN与中国汉族基因组的PAV景观无显著差别，但有78个PAV的缺失频率与SGDP显著不同。 对缺失频率具体分析后，研究人员发现4个PAV（GSTM1、UGT2B17、ACOT1和SIGLEC14）在胃癌中高度缺失，其中，UGT2B17在亚洲胃癌患者中高频缺失，GSTM1和SIGLEC14在东亚胃癌患者中高频缺失，而ACOT1在中国汉族人群胃癌患者中的缺失频率较高（图4）。 图4. 在不同地区患者中高频缺失的PAV 研究人员用HUPAN这把锋利的“矛”打开了围绕在胃癌PAV面前的“盾”，并发现至少有14个新基因。 本着“一网打尽”的原则，研究人员对这14个新基因是否为PAV进行了分析，并发现这14个新基因中，有9个属于PAV（图5），并且在肿瘤组织和正常组织中都存在。 随后，研究人员对这9个PAV进行了染色体位点鉴定，并在这9个PAV中发现一个可鉴定出染色体位点的新基因-GC0643（图5）。 图5. 新PAV的鉴定 随后，研究人员对新基因GC0643进行了“摸底排查”，分析了GC0643染色体位点上的结构变异，匹配了GC0643编码蛋白的序列。 为了明确GC0643在胃癌中的作用，研究人员分析了65例胃癌RNA-Seq数据（GC0643缺失组 vs GC0643表达组，18 vs 47），发现GC0643缺失会引起与胃消化功能、上皮分化、抗肿瘤活性、化学代谢及先天免疫防御等15个途径有关的138个基因显著下调。 此外，研究人员对GC0643的肿瘤生物学功能进行了进一步研究。他们使用亚洲胃癌患者细胞系HGC-27过表达GC0643，发现GC0643表现出抑癌基因的特性：过表达GC0643抑制了胃癌细胞的增殖、克隆形成能力，并促进了胃癌细胞凋亡，诱导了G2/M期阻滞，抑制了肿瘤迁徙能力。 而随后的GC0643多重基因编辑实验更是证明了这个观点，过表达GC0643显著抑制了肿瘤细胞的侵袭能力，但在此基础上敲减GC0643后这种抑制效果就会消失（图7）。因此，这个新基因GC0643也被鉴定为胃癌的抑癌基因，收录于NCBI数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/MW194843.1）。 总之，这项研究利用新兴的技术方法构建了中国胃癌患者泛基因组图谱，并通过HUPAN工具揭示了胃癌中非必须基因（PAV）景观，识别出汉族胃癌患者中高频缺失的基因ACOT1，同时鉴定出一种新的中国人胃癌的抑癌基因GC0643，为中国人胃癌分子遗传信息提供了重要补充。 参考文献 [1] Xia C, Dong X, Li H, et al. Cancer statistics in China and United States, 2022: profiles, trends, and determinants. Chin Med J (Engl). 2022 Feb 9;135(5):584-590. doi: 10.1097/CM9.0000000000002108. [2] Rood JE, Regev A. The legacy of the Human Genome Project. Science. 2021 Sep 24;373(6562):1442-1443. doi: 10.1126/science.abl5403. [3] Yang X, Lee WP, Ye K, et al. One reference genome is not enough. Genome Biol. 2019 May 24;20(1):104. doi: 10.1186/s13059-019-1717-0. [4] Tettelin H, Masignani V, Cieslewicz MJ, et al. Genome analysis of multiple pathogenic isolates of Streptococcus agalactiae: implications for the microbial "pan-genome". Proc Natl Acad Sci U S A. 2005 Sep 27;102(39):13950-5. doi: 10.1073/pnas.0506758102. [5] Yu Y, Wei C. A powerful HUPAN on a pan-genome study: significance and perspectives. Cancer Biol Med. 2020 Feb 15;17(1):1-5. doi: 10.20892/j.issn.2095-3941.2019.0317. [6] Duan Z, Qiao Y, Lu J, et al. HUPAN: a pan-genome analysis pipeline for human genomes. Genome Biol. 2019 Jul 31;20(1):149. doi: 10.1186/s13059-019-1751-y. [7] Yu Y, Zhang Z, Dong X, et al. Pangenomic analysis of Chinese gastric cancer. Nat Commun. 2022 Sep 15;13(1):5412. doi: 10.1038/s41467-022-33073-7.

细胞系体外过表达GC0643基因显著抑制了肿瘤细胞的生长、迁移侵袭、细胞周期进展并促进细胞的凋亡，并且此种肿瘤抑制效应可以通过基因再敲低而逆转。 近日，上海交通大学生命科学技术学院韦朝春教授课题组、上海交通大学医学院附属瑞金医院于颖彦教授课题组、朱正纲教授课题组上海中医药大学交叉科学研究院陈红专教授课题组和复旦大学附属肿瘤医院章真教授课题组等多家单位联合完成了汉族人胃肿瘤泛基因组研究，相关成果论文“Pangenomic analysis of Chinese gastric cancer”于2022年9月15日在线发表在国际著名学术期刊《Nature Communications》。该研究将全新的泛基因组研究方法引入人类肿瘤基因组研究。通过构建胃癌人群泛基因组，再以泛基因组作为参照分析胃癌全基因组测序数据，发现胃癌个体基因组中的一些存在-缺失变异（Presence-absence variation，PAV）和胃癌表型存在显著关联。该研究成果为解析中国人胃癌高发的分子遗传学背景提供了重要参考。 上海交通大学医学院附属瑞金医院于颖彦教授、上海交通大学生命科学技术学院韦朝春教授、上海中医药大学交叉科学研究院陈红专教授以及瑞金医院朱正纲教授为文章共同通讯作者。瑞金医院于颖彦教授、复旦大学附属肿瘤医院章真教授、上海交通大学生命科学技术学院博士生董晓瑞、段忠取、医学院博士生杨蕊馨为共同第一作者。 2001年发布的人类参考基因组草图由于其DNA样本取自少量捐献者个体，存在样本选择不足，难以充分反映不同地区、不同种族人群的基因组多样性。泛基因组是指某个群体中所有个体基因组的总和，相较于单个人类参考基因组更能反映遗传多样性。在人类疾病基因组学研究中，以泛基因组作为参照可能更为合适。本研究联合团队借助交大高性能计算中心的超级算力，展开了基于泛基因组学的胃癌基因组的跨学科合作研究。历经五年多时间的探索，先后完成了人类泛基因组构建及分析系统HUPAN自主研发（Genome Biology，2019， 20:149）及本项泛基因组学在胃癌基因组中的应用研究（Nature Communications, 2022, 13:5412）。 该研究使用HUPAN分析了185对胃癌及癌旁组织（共370个样本）的全基因组深度测序数据，构建了包含人类参考基因组（GRCh38）和80.88 Mbp新序列的胃癌泛基因组。其中，新序列包含至少14个新基因。再将个体基因组以泛基因组为参照进行比对，识别胃癌患病个体基因组中的PAV。在胃癌人群中总计发现261个非必需基因（在一个或多个个体中缺失或部分缺失的基因），其中195个非必需基因属于癌旁和癌组织共有的基因（186个位于人类参考基因组上，9个新序列基因）。再将这些非必需基因与公共数据库中不同种族健康人群的基因组测序数据集对比发现，有些非必需基因的存在或缺失可以增加胃癌易感性。例如，非必需基因ACOT1、GSTM1、SIGLEC14和UGT2B17在胃癌人群中缺失率显著高于其他人群。 对于非参考基因组的新序列，课题组通过基因结构预测、利用长读长测序数据进行染色体定位等，成功发现了可以定位到染色体9q34.2位点的GC0643基因。 细胞系体外过表达GC0643基因显著抑制了肿瘤细胞的生长、迁移侵袭、细胞周期进展并促进细胞的凋亡，并且此种肿瘤抑制效应可以通过基因再敲低而逆转。这表明人类参考基因组中所缺失的序列可能在疾病发生发展中发挥作用。