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说到减肥，大家肯定能想到层出不穷的减肥方法：生酮饮食法，8小时进食法，少吃多动等等。方法可行，但却总是坚持不了几天，归根究底就是管不住嘴，导致在减肥的道路上反反复复，美其名曰：减肥是一项终身的事业。话虽是玩笑，但是在科学界，减肥的确是一个不衰的课题。 最近，一项重磅“减肥神器”的研究，给管不住嘴的减肥人士带来了新的希望！该研究由麻省理工学院Giovanni Traverso 团队完成，成果发表在 Science Advances 期刊题为：A vibrating ingestible bioelectronic stimulator modulates gastric stretch receptors for illusory satiety。科学家设计了一种可食用的生物电子刺激器( VIBES )药丸，可以在胃里震动，刺激胃牵张感受器，导致虚拟的饱腹感，从而减少食物摄入，降低体重。  DOI: 10.1126/sciadv.adj3003 VIBES是一种带胶膜的胶囊，在胃液中4.3 ± 1.2 min内溶解，然后释放出一个弹簧针，完成激活振动电机的电路。该胶囊设计一个带有偏移轴的电机，位于外壳内，当使用1.55 V，80m.h的氧化银电池供电时，可以实现2 - 4mm的位移幅度，且平均震动时间为38.3 ± 1.83分钟，可以与食物进行混合。且经过验证，该胶囊在体内长时间停留也不会破坏肠胃功能。 图1. VIBES的概念和机制 研究者在动物体内对VIBES的性能进行了研究。选用了Yorkshire猪模型 (体重50-80kg, 年龄4-6个月) ，因为它的胃部解剖结构与人类相似。通过对猪的内窥镜观察，确定VIBES药丸的定位。发现在所有试验中，VIBES在给药后至少30分钟内都没有从胃中排出，这为餐前给药提供了可能性。 为了表征胃响应机械扩张和振动刺激的神经信号模式，在剖腹手术后，对腹腔迷走神经进行细导线电生理记录。通过向猪的胃里充气来模拟不同程度饱食的胃, 并通过内镜估计胃容积的变化, 同时记录相应的迷走神经电活动 (ENG)。再给予服用VIBES后, 通过内镜观察胶囊的定位, 同样记录ENG。 为了确定振动刺激是否可以激活神经反应，使用VIBES将频率在24至500 Hz之间的振动应用于胃腔，并对通道上的神经活动进行监测。结果发现，虽然这种药丸提供了大约298mm2的接触面，但振动刺激通过组织传播，刺激胃肌肉长达30厘米。并且在所有的试验中, 64-100Hz的震动频率下观察到的ENG最接近于机械扩张期间观察到的模式。然后切断双侧迷走神经后重复上述试验, 消除传出信号和负反馈环路之间显示出高度相似。 图2. 胃内机械感受器电生理 进一步研究了进食行为和饱腹感相关的激素分泌。受试动物分别摄入VIBES药丸和假药丸后，在0、15、30、45、60、90和150分钟时采集血液样本。结果显示，VIBES摄入导致生长激素释放肽 (即“饥饿激素”) 释放显著减少, 胰岛素水平显著增加, 其幅度和速度与正常膳食摄入相当。胰高血糖素（负责维持血糖水平）在对照组动物中有所增加，而在VIBES组中则保持在基线水平，说明VIBES可以诱导胃期代谢反应。 图3. VIBES调节产生虚拟的代谢饱腹感为了研究VIBES对饥饿和进食行为的影响，研究者进而对四只猪的食物摄入量进行了监测。结果发现，当胶囊在进食前大约 20 分钟被激活时，与未激活药丸时相比，动物的摄入量平均减少 40%，从而导致体重增加较慢。这表明VIBES药丸可显著减少受试动物的食物摄入量并减缓其体重增加速度。 图4. VIBES对喂养和体重增加的影响 最后，为评估运动性和安全性，研究人员给动物分别喂食假药丸或 VIBES 药丸以及一组小型放射性不透明钡颗粒。结果显示即使每天使用VIBES（每天两次）两周后，胃腔内窥镜检查也没有观察到磨损、刺激或炎症。此外，外植后组织固定切片上的苏木精和伊红染色显示没有异常的形态、刺激或炎症。此外，工作人员每天监测动物的活动情况、健康状况、粪便排出量、嗜睡、腹胀等不适或疾病的行为体征的变化。在治疗动物中也未观察到不良反应或不适。实验组和对照组动物均未见大便性状改变和腹泻。在所有试验中，该药丸均能顺利通过，无梗阻、穿孔，无任何不适症状，表明该药品具有很强的安全性。 总的来说，本研究研发了一种可食用的振动型胶囊，通过胃机械感受器作用，诱导产生饱腹感，从而减少食物摄入、限制体重增加，为无痛减肥提供了一条新思路。 参考文献：Srinivasan SS, Alshareef A, Hwang A, et al. A Vibrating Ingestible BioElectronic Stimulator Modulates Gastric Stretch Receptors for Illusory Satiety. Preprint. bioRxiv. 2023;2023.07.17.549257. Published 2023 Jul 19. doi:10.1101/2023.07.17.549257 撰文 | 娜娜山编辑 | lcc部分文字来源于网络，本文仅用于学术分享，转载请注明出处。若有侵权，请联系微信：bioonSir 删除或修改！精彩推荐：1、为什么她/他看上去更年轻？研究显示最佳水合作用可能会延缓人类衰老过程2、《盗梦空间》真实嘛？人为何能清醒地认识到自己在做梦？PNAS：神奇清醒梦（LD）背后的神经认知机制3、你经历过吗？“让人煎熬”的慢性疼痛会致抑郁！Science子刊：破解神经迷宫中慢性疼痛致郁的神经环路以及治疗最新靶点4、维C抗癌新发现！Nature子刊 ：中国科学家揭示大剂量维C促进肿瘤血管正常化，激活免疫系统5、头发重生计划启动！研究发现：皮肤内的这项秘密武器或许能拯救你的发际线！

摘要：免疫肿瘤学彻底改变了癌症治疗，为开发疫苗接种方法开辟了新的机会。基于 DNA 的癌症疫苗已经成为一种有希望的方法来激活身体免疫系统对抗癌症。质粒 DNA 免疫显示了良好的安全性特征，在临床前和早期临床实验中发生了诱导的普遍和定制的免疫应答。然而，这些疫苗在免疫原性和异质性方面存在显著局限性，需要改进。DNA 疫苗技术一直专注于提高疫苗效力和递送，以纳米颗粒为基础的递送系统和 CRISPR/Cas9 等基因编辑技术平行发展。这种方法在增强和调整疫苗接种的免疫应答方面显示了巨大的前景。增强DNA疫苗效力的策略包括选择合适的抗原，优化在质粒中的插入，研究疫苗与常规策略和靶向治疗的组合。联合治疗减弱了肿瘤微环境中的免疫抑制活性，并增强了免疫细胞的能力。这篇综述概述了DNA疫苗在肿瘤学中的当前框架，并重点介绍了新策略，包括已确立的联合疗法和仍在开发中的疗法。同时也强调了肿瘤学家、科学家和研究人员建立DNA疫苗作为战胜癌症的前卫方法所需要克服的挑战。免疫治疗方法的临床意义和预测性生物标志物的需要也进行了综述。我们也试图将中性粒细胞胞外陷阱 (NETs) 的作用扩展到 DNA 疫苗。免疫治疗方法的临床意义也进行了综述。最终，精炼和优化DNA疫苗将能够利用免疫系统识别和消除癌细胞的天然能力，引领世界走向癌症治愈的革命。关键词：基于DNA的疫苗；癌症疫苗；联合治疗；佐剂；免疫治疗；免疫反应；疫苗研制。缩略词1.简介癌症是整个医学辞典中最可怕的一个术语。由于治疗方案不同，准确和早期诊断癌症模式及其分期至关重要。癌症的理想药物治疗包括手术、放疗和全身治疗（单独或联合）。然而，细胞毒性癌症治疗被证明对患者来说是难以忍受的，也不能提供终生保护。我们已经进入了一个时代，这个六字母的词几乎造成了六分之一的死亡。2020年的全球流行病学事实表明，癌症死亡人数约为 990 万。其中男性发病 550万，超过女性 11%。癌症患病率呈上升趋势，2020 年达到高峰，约 193 万。有趣的是，自世纪之交以来，尽管癌症发病率、新发癌症病例和癌症死亡病例显著增加，但经年龄校正的死亡率仍显示癌症死亡率降低。为了使癌症死亡率的下降变得显著，我们需要一定的量子飞跃，DNA 疫苗可以是其中之一，经过正确的努力。要理解DNA疫苗的作用机制，首先需要了解免疫系统与癌症的关系。免疫抑制性肿瘤微环境 (TME)和功能失调的抗肿瘤 T 细胞定义了这种关系。TME 构成细胞的复合网络，通常包括癌细胞、多种免疫细胞、基质细胞、血管、细胞外基质和调节蛋白。癌细胞通过逃避 TME 内的免疫攻击而存活，通过各种机制使环境免疫抑制。T 细胞介导的针对肿瘤细胞的反应涉及以下步骤：(a) 抗原呈递细胞 (APC) 阻止死亡肿瘤细胞释放的新抗原；(b) 将捕获的抗原呈递给 T 细胞；(c) 针对肿瘤抗原 (TA) 的 T 细胞反应；(d) 将效应 T 细胞向肿瘤位点推进；(e) T 细胞浸润肿瘤；(f) 识别效应 T 细胞并将其与 TA 结合；(g) 抗原特异性 T 细胞破坏癌细胞。正常情况下，针对肿瘤抗原的T细胞活化需要两个信号——识别抗原和来自 APC 的共刺激信号。CTLA-4 和 CD-28 是结构上同源的 T 细胞受体，它们共享共刺激因子 B7-1 和 B7-2。在它们与共享配体形成复合物时，CD-28 刺激免疫反应，而 CTLA-4 则抑制免疫反应。在健康宿主中，免疫应答的激活和抑制之间维持着错综复杂的平衡。然而，肿瘤通过促进 CTLA-4 和 PD-1，将平衡转向消灭免疫反应。由于 TME 的复杂性和肿瘤细胞逃避免疫的能力，身体保护机制下降，这是免疫治疗的表现。肿瘤间和肿瘤内异质性是细胞毒性化疗方案抗气候反应增加的主要缺点。2013 年，《科学》杂志，宣布治疗癌症的免疫疗法为“年度突破”。随后，免疫治疗重新振兴了肿瘤治疗领域。免疫治疗有多种分类，包括过继性细胞转移 (ACT)、免疫检查点抑制剂 (ICI)、癌症疫苗、抗体治疗和细胞因子治疗。ACT 涉及 T 细胞的输注，这些 T 细胞经过基因修饰以对肿瘤细胞作出反应。嵌合抗原受体 (CAR) T 细胞和 T 细胞受体修饰的 T 细胞是 ACT 的两种亚型。ICI 是最近纳入单克隆抗体的药物，靶向负性免疫调节剂。溶瘤病毒疫苗是癌症疫苗的亚型，病毒自然存在或通过基因操作靶向癌细胞，而不影响正常细胞。癌症疫苗靶向突变抗原和 TAA。它们可分为 (a) 基于细胞的疫苗；(b) 基于肽的疫苗；(c) 基于病毒和细菌的疫苗；(d) 基于基因的疫苗。白细胞介素-2 和 α-干扰素作为癌症治疗中的经典治疗细胞因子。新抗原是最近的一项突破是基于个体基因突变。作为这篇综述的中心，DNA 疫苗展示了基因疫苗惊人的技术进步。这些是一类核酸疫苗 (NAV)，最近成为一种方法。这些构成了针对肿瘤抗原的遗传信息，并将其传递给宿主，这有助于引起足够的免疫应答。DNA 疫苗可以通过各种途径接种，较好的途径是电穿孔、超声处理、DNA 纹身和基因枪。一旦所需的基因序列进入细胞核，它就会被主要组织相容性复合体-I (MHC-I) 和主要组织相容性复合体-II (MHC-II) 分子标记，从而激活分化簇 (CD) 细胞、CD4 和 CD8 以及 B 细胞。与其他非靶向治疗相比，DNA 疫苗提供了更好的抗原特异性和安全性，引起的副作用更少。然而，DNA 疫苗的免疫原性较差，这是其主要缺点。这篇综述的最终思想旨在探索和研究基于 DNA 的疫苗接种的每个方面，从而为更好地推进肿瘤治疗铺平道路。2.基于DNA的疫苗构建，增强免疫原性的策略嵌合DNA疫苗造成癌症 DNA 疫苗批准失败的几个原因是靶抗原的选择、疫苗的配制工艺以及超越耐受问题。为了克服这些限制，引入了嵌合 DNA 疫苗对抗癌症抗原的概念。利用异种元素，如从另一个物种中提取的蛋白质或肽，与自身直系同源物显著同源。由于这些序列相似且不相同，它们可以帮助规避免疫耐受并引起潜在的免疫原性反应。这种非自身抗原和固有蛋白之间的细微差异是刺激针对异种抗原的 T 细胞和 B 细胞应答的原因。这些反应可能与天然抗原或自身抗原发生交叉反应。ONCEPT 代表着第一个异种 DNA 疫苗被批准用于犬黑色素瘤，如前所述。嵌合疫苗的效力可以通过与免疫调节剂的联合使用来放大。间皮素 (MSLN) 已被确定为卵巢和胰腺肿瘤等多种恶性肿瘤的肿瘤抗原。内衬间皮素的抗原特异性结缔组织生长因子 (CTGF/MSLN) 与免疫调节剂表没食子儿茶素没食子酸酯 (EGCG) 联合使用。这种组合通过树突状细胞的成熟增强了疫苗的抗原特异性抗肿瘤作用。除了异种方法引起针对癌症抗原的反应外，还有一些其他策略。其中之一是同时将疫苗与诱导 CD4 T 细胞的肽类共同注射。这些肽的示例为使用长肽或泛 HLADR 表位 (PADRE) 肽，其刺激 CD4 细胞以及树突状细胞。尽管如此，很少有研究观察到与异种疫苗接种相比，自身抗体的应答在自体疫苗中是稳健的。显而易见的原因是对 DNA 疫苗触发的抗体同源抗原的特异性。因此，嵌合 DNA 疫苗存在低亲和力抗体反应的显著缺陷。为了超越低亲和力抗体反应的这一限制，在嵌合元件包括异种以及自体抗原结构域的地方，也可以制造杂交疫苗。其中一个例子是引入编码嵌合 neu-HER2 抗原的质粒，诱导与 ErbB2 + 肿瘤相反的免疫应答。基于MUC1的DNA疫苗黏蛋白 1 (MUC1) 在人体中以跨膜蛋白的形式存在，体现了三部分：(a) N 端胞外区由可变数量的 20 个氨基酸串联重复序列 (VNTR) 单位组成 (b) 跨膜区 (c) 细胞内 c 端区。该肽的基本部分在 MUC1 VNTR 的苏氨酸或丝氨酸残基上携带 5 个 O-连接糖基化位点。这种蛋白主要在乳房、卵巢、肺、肾、胰腺和结肠中表达。在具有正常生理功能的细胞中，这些蛋白高度糖基化。相反，在致瘤细胞中，其发生低糖基化或异常糖基化，这使其成为潜在的目标。在动物模型中，通过肌内途径引入 MUC-1 编码的重组真核载体表达，从而刺激 T 细胞和 b 细胞。这些疫苗发挥作用的三个值得注意的机制是：(a) MUC-1 肽释放到细胞外，并暴露于 APC。然后，这些 APC 帮助肽的内吞作用，并将 MUC-1 的片段呈递给 MHC-II 分子。这种递呈最终导致诱导 CD4 T 细胞分化为 Th1 和 Th2 细胞 (b) MUC-1 蛋白分泌到胞外区，直接与 b 细胞的受体结合诱导抗体的产生 (c) 粘蛋白肽降解为含有 8-12 个氨基酸 % 的肽__% 通过 MHC-I 途径诱导 CD8 T 细胞分化为细胞毒性 T 细胞。为了使抗肿瘤疫苗应答有效，接受疫苗的候选者应能够同时产生细胞免疫和体液免疫。仅含 MUC1 肽的疫苗未能证明足够的有效性，因此，使用了不同的 T 细胞和 B 细胞表位和佐剂。设计了一种编码粘蛋白基因的嵌合 MUC-1 DNA 疫苗，该基因具有跨膜和 C 末端的缺失，并与人热休克蛋白 (HSP70) 基因融合。该疫苗在小鼠模型中发挥抗肿瘤作用方面表现出必要的有效性。新抗原和个性化DNA疫苗尽管 TAA 是 DNA 疫苗的主要部分，但与标准方案相比，通过非突变抗原的免疫未能显示显著结果。这些不充分结果背后的原因是免疫耐受的概念，因为这些抗原通常存在于组织中，并阻止强烈的免疫应答。然而，新抗原的发展已经改变了表格，使我们有能力更具体地靶向肿瘤。新抗原是肿瘤特异性基因改变的结果，并产生新的表位。这种疗法靶向多种癌症抗原，这些抗原在每个患者中都是独一无二的。每个患者都体现了一组独特的肿瘤抗原，并受到克隆变异的影响。由于受试者间变异性，存在肿瘤内异质性，包括较多数量的分支突变。这些突变增加了肿瘤内亚克隆的数量，并导致 T 细胞对新抗原特异性的微弱报复。除了在肿瘤中定制靶向的益处，新抗原显示出极小的不良反应。冷肿瘤转化为热肿瘤，因为促炎性细胞因子倾向于蓄积，T 细胞暴露增加。这一过程还伴随着 TME 中 PD-L1 的调节增强。由于这些获益，肿瘤对免疫检查点阻滞剂 (ICBs) 更敏感。新抗原被宿主免疫系统识别为“非自身”抗原，这使其无法逃避免疫耐受。这些巧妙的新抗原的产生过程首先涉及从肿瘤活检中提取遗传信息，然后进行外显子测序。通过将肿瘤获得序列与正常基因图谱进行比较，鉴定导致致瘤序列发生的突变。根据某些抗原预测算法选择 MHC-I 或 MHC-II 同源的抗原。然而，并非通过该过程鉴定的所有抗原均具有免疫原性，因此需要确立最佳方案。有了这一点，新抗原的另一个缺点是它们的制造时间。开发所需的时间约为 5 个月，这在治疗癌症中似乎不方便，其中时间具有价值。与基于 RNA 和肽的疫苗相比，DNA 疫苗克服了这些限制，刺激了针对所需新抗原的显著强效 CD8 应答，因此更值得信赖。这些疫苗中的大多数正在进行试验，评价在实体瘤和联合治疗中的疗效。简而言之，新抗原提供了一个很好的个性化量子和量身定制的治疗让癌症患者获得更好的缓解。基于多表位的DNA疫苗体细胞 DNA 的改变形成肿瘤新抗原，使蛋白质序列发生变化，诱导适应性免疫反应。随着基因测序技术的发展，我们识别新抗原的能力不断提高。利用癌细胞测序结合表位预测算法识别和排序新抗原，将其整合到个性化癌症疫苗中。DNA 疫苗的首要地位与在单一结构中可以传递大量序列的事实有关。多表位 DNA 疫苗的基本概念从 CTL 开始。MHC-I 分子呈递抗原，被 CTL 识别为短肽（一般由 8-10 个氨基酸组成）。这些短肽或片段被命名为术语，T 细胞毒性细胞决定簇 (DTcs)。多表位 DNA 疫苗在微基因结构中用几种 DTcs 测序，以诱导针对广泛靶标库的 CTL 应答。换句话说，作为一种多表位 DNA 疫苗，同时递送非典型和免疫显性表位可以引起 CTL 的综合应答。据报道，单一表位疫苗可编码超过 20 种抗原。与合成长肽 (SLP)、DC 和 RNA 相比，以 DNA 质粒形式生产多表位疫苗观察到相对容易生产、理想的安全性特征和分子灵活性。其中一项研究报道，编码 20-25 个表位的多表位构建体，有或无间隔区，与泛素的突变形式融合，可以被有效处理。基于这种方法的模型 DNA 疫苗成功地在体内展示了显著的结果。评价基于 polyepitope-based DNA 疫苗的临床前试验证明诱导了抗肿瘤反应。而且，临床试验观察到新抗原特异性 T 细胞反应的刺激。尽管当培养基为疫苗接种时，CD8 + T 细胞是诱导抗肿瘤应答的主要元素，但已发现 CD4 + T 细胞可引起更广泛和更强的免疫应答。因此，辅助性 T 细胞 (Th) 肽与 DNA 疫苗联合给药，以增强对 Th-细胞的刺激，并最终增强 CTL 应答。Th 肽的一个例子是泛 DR 表位 (PADRE)，它确实增加了免疫系统的抗肿瘤作用。多项临床试验正在进行中，以评价多表位 DNA 疫苗对乳腺癌、宫颈癌、卵巢癌和胰腺癌的疗效。描绘 DNA 结构类型的插图已在 1.3.基于DNA的癌症疫苗批准遇到的障碍和需要完成的挑战基于DNA的癌症疫苗已经接近其目的。其设计可理解，并具有长期保护潜力。在生产方面具有成本效益，与减毒活疫苗相比更安全。此外，其在室温下保持稳定，并具有良好的溶解度特征。然而，这些资产已经被一些但相当大的缺点所超越，这些缺点阻碍了基于 DNA 的疫苗在人类中的批准，对抗癌症。DNA 疫苗的潜在缺点是不能诱导必要的免疫原性，主要因素是缺乏最佳的 DNA 转染和免疫刺激。由于每个个体中细胞和核膜的复杂性，这些疫苗的 DNA 转染能力产生了不一致的结果。质粒需要通过胞饮作用或内吞作用穿过富含磷脂的细胞膜。质粒也需要逃避溶酶体、内体和核酸酶进行的降解过程。通过物理和化学手段改善质粒的递送，可以抑制这些挑战。从物理方法开始，通过针头插入质粒，无论是皮内 (ID)、肌内 (IM)、经皮或粘膜，均显示出较差的转染。通过针头插入导致 DNA 集中在细胞内空间，而不是进入细胞本身，在那里它们可以转录为 mRNA。因此，使用 ID 或 IM 电穿孔已经取代了针头递送系统。电穿孔涉及通过针头施加电流，跟随并邻近 DNA 插入部位（通过针头和注射器插入）。除电穿孔外，还考虑了其他几种物理技术，如微粒介导表皮给药 (PMED) 和无针注射系统 (NFIS)。向化学方法发展，包括生物制药以增强转染能力。脂质体是一种生物药物，是将胆固醇和磷脂基团并入脂质双层以允许与脂质富集细胞膜融合的球形分子。这种融合使得 DNA 很容易插入细胞。脂质体通过有助于转染效率的增强以及作为佐剂发挥双重作用。通过灌输可生物降解的聚合物微颗粒和纳米颗粒的最新技术，可以临时制备给药系统。这些两亲性颗粒的尺寸应为 0.5-10 μm。伴随着物理和化学传递技术，另一种有助于增加免疫原性的策略是使用包含 DNA 的疫苗鸡尾酒以及编码佐剂免疫调节元件的质粒。细胞因子和二核苷酸基序是这些分子佐剂的范例。5’—C—phosphate—G—3’ (CpG) 基序是一种二核苷酸基序，与 DNA 疫苗理想匹配，整合到疫苗的骨架中。它有三种类型，即 A、B 和 C。A 型触发细胞免疫应答，而 B 型诱导体液免疫。CpG-C 具有刺激细胞和体液免疫应答的能力。白细胞介素 (IL)-2 是一种用作佐剂的主要细胞因子，可潜在诱导淋巴细胞。该佐剂已获批用于减轻转移性黑色素瘤和肾细胞癌。IL-15 与 IL-2 相似，可刺激 NK-和 T-细胞的增殖。粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 (GMCSF) 是另一种佐剂细胞因子，可将 APC 结合到接种部位并促进树突状细胞成熟。以聚乳酸 (PLA)、聚乳酸-羟基乙酸共聚物 (PLGA) 为例的聚合物载体的利用，和壳聚糖，作为纳米颗粒形式的佐剂和递送助剂表现出了有利的结果。Toll 样受体 (TLR) 配体也是最近关注的佐剂。这些佐剂编码质粒的益处是表达与抗原相同跨度的蛋白，并允许更长时间的免疫刺激。其次，考虑到安全性问题，这些疫苗倾向于通过促发过度的细胞因子释放诱导全身炎症反应，可导致持续发热。为了阐明这一点，我们需要证明受 DNA 疫苗引入影响的炎性免疫途径，并采用防止细胞因子风暴的方法（如佐剂编码质粒所示）。质粒 DNA 载体含有细菌区域元件，如复制起点和选择标记物。一旦细胞培养停止，这些功能元件是徒劳的，往往会对疫苗的有效性和稳定性造成负面影响。伴随这些不利影响，由于抗生素耐药标志物水平传播至宿主肠道细菌种群的可能性，安全性结果受到影响 。图1 建立了增强基于DNA的癌症疫苗免疫原性的结构。已经建立了 4 种类型的 DNA 结构来增加基于 DNA 的癌症疫苗的免疫原性潜力。包括嵌合 DNA 疫苗利用异种抗原 b MUC-1 为基础的 DNA 疫苗，由粘蛋白肽组成c编码新抗原的个性化 DNA 疫苗，对每名患者特异d多表位DNA疫苗，包含多个新抗原或表位的序列。针对耐药标志物的传播而设计的策略，是开发基于小细菌RNA的无抗生素选择标志物，也称为非编码标志物。而且，这些标记物的大小较小，小于200个碱基对，从而降低了载体大小，提高了转染效率（较小的载体能够抵抗递送过程中遇到的剪切力）。进一步解决安全性问题时，可能会发生疫苗散毒至环境中，并通过捕食性动物传播。DNA 疫苗还存在整合到宿主基因组中的风险，最终破坏宿主基因组的表达。因此，为了监测这些问题，制定了准则和管理框架，这些框架因国家而异。法规要求基于受试种属。DNA 接种动物需要标记转基因生物 (GMO)，以帮助阻碍 DNA 疫苗的广泛使用。必须彻底检查 DNA 结构是否整合到宿主染色体中，并应保持与健康风险评估和环境危害相关的透明度。此外，将癌细胞的细胞学和生物分子机制平行化是很麻烦的，这最终使肿瘤抗原的识别和抑制变得复杂。此外，肿瘤新抗原具有突变趋势，导致抗原靶向疫苗无效。同时，肿瘤细胞的复合免疫抑制环境延缓了这些疫苗的效力。我们需要超越癌症抗原的这些免疫逃避能力，并增强 APC 对其的递呈，以越来越多地部署抗原特异性 T 细胞。无法开发针对癌症的疫苗最明显的原因是在动物模型和人类的解剖结构中遇到的差异。从更光明的方面来说，2021 年 8 月，ZyCoV-D，世界上首个基于 DNA 的预防性疫苗获得了印度药物控制总干事 (DCGI) 的批准，fo rCovid-19 感染病毒严重急性呼吸综合征冠状病毒 2 (SARS-CoV-2)。基于 DNA 的免疫已被批准用于动物以减轻几种兽医疾病，其中之一是 Oncept。它是美国食品药品监督管理局 (USFDA) 批准的异种人酪氨酸酶质粒 DNA 疫苗，用于减轻犬的恶性黑色素瘤。它靶向一种称为酪氨酸酶的自身抗原，该抗原在犬和人的几种恶性黑色素瘤中上调。再者，一种新技术利用基于 CRISPR/Cas9 的基因编辑技术，在疫苗开发中。该技术由一系列短重复组成，与大肠杆菌基因组中的短序列间隔。它展示了有希望的效率、简单性、特异性、成本效益和灵活性，这使我们朝着基因乐观的未来前进工程疫苗。随着这一进步的步伐，很可能所有这些障碍都将得到解决，DNA 疫苗将很快完成治疗癌症。上述讨论的障碍如图 2 所示。4.基于DNA的癌症疫苗的免疫机制和特征如前所述，免疫抑制性TME和T细胞功能障碍是肿瘤细胞逃避机体免疫系统的主要原因。TME 连同基质细胞、血管、细胞外基质和调节蛋白，也体现了免疫细胞。在这些免疫细胞中，髓源性干细胞 (MDSCs) 和调节性 T 细胞 (Tregs) 是突出的。MDSCs 是肿瘤浸润巨噬细胞，具有免疫抑制表型，参与抗炎过程。Tregs 与转录因子叉头框蛋白 3 基因 (FoxP3) 一起表达 CD4 和 CD25，均为获得性免疫的调节因子。Tregs 通过释放抑制性细胞因子如 IL-35 和转化生长因子-β (TGF-β)，能够抑制抗肿瘤免疫反应。此外，癌细胞下调 MHC 分子（通过促进非经典 MHC-I 分子，如 HLA-E 和 HLA-G）和靶抗原的表达能力。肿瘤扩大了其对引流淋巴结的耐受性，并增强了 Tregs 的活性。肿瘤通过释放可溶性因子如血管内皮生长因子 (VEGF)、TGF-β 和 IL-10，对 APC 的成熟和分化产生负面影响。简言之，免疫抑制性 MDSCs、Tregs、VEGF、IL-10，加上免疫刺激 T 细胞的功能障碍，负责肿瘤逃逸免疫力并最终破坏造血的能力。因此癌症免疫疗法背后的概念化是诱导对癌细胞免疫的充分报复。对于特定的癌症抗原，需要各自和持续的免疫应答，这是基于核酸的疫苗开发的假设。基于 DNA 或信使 RNA (mRNA) 的核酸疫苗首先需要体现在细胞质中，随后体现在细胞核中，以最终实现基因表达 [17]。质粒 DNA 的构成和免疫的及时性，是 DNA 疫苗的两个主要特征。首先，插入 DNA 的载体可以是病毒载体、脂质体、裸质粒 DNA 和基因或粒子枪介导的直接 DNA 传递。所有这些方法都携带肿瘤表达抗原的遗传特性，并指导免疫引起针对该特异性抗原的反应。TA 是在肿瘤组织中过表达的抗原蛋白，它们可以作为肿瘤标志物。随着基因测序和分析的进步，TA 被确定并作为癌症疫苗中的关键元素。TA 的分类分为两类，肿瘤特异性抗原 (TSA) 和肿瘤相关抗原 (TAA)。TSAs 又称突变抗原或新抗原是自身抗原突变的结果。这些细胞严格局限于肿瘤，在正常细胞中不表达。P53、Ras 和 Bcr-Abl 是常见的 TSA。相反，TAA 不会发生突变。它们是自身抗原与正常细胞相比，肿瘤细胞中上调。TAA 中包括沉默基因产物，如癌症/睾丸抗原、前列腺特异性抗原 (PSA)、前列腺酸性磷酸酶 (PAP)、酪氨酸酶和人表皮生长因子受体 2 (HER2)/neu。随着质粒 DNA 的引入，抗原被确定，免疫可以区分它应该对哪种物质作出反应。借助于诱导的免疫机制，表达后的抗原与APC结合，然后呈递给T细胞。图2 DNA疫苗审批所遇到的障碍和挑战以及所需的进展。DNA疫苗的批准面临几个障碍和挑战，包括稳定性、低免疫原性和整合到宿主基因组的潜力等问题。此外，DNA 疫苗的递送需要先进的技术来有效地将质粒 DNA 递送到靶细胞。尽管存在这些挑战，但近年来取得了重大进展，包括开发新的递送系统、佐剂和增强DNA疫苗免疫原性的策略。需要进一步的研究来应对这些挑战，推进DNA疫苗的开发和批准。如图3所示，疫苗DNA质粒编码的遗传信息通过固有佐剂特性或通过TA表达进行处理。这些疫苗的益处是通过内源性和外源性途径分别使用人白细胞抗原 (HLA)、HLA-1 和 HLA-2 作为 APC。这显示了 CD4 + 和 CD8 + T 细胞的令人垂涎的抗原，受益者是诱导细胞和体液免疫应答。在癌细胞抗原被识别之前，借助 1 型传统 CD103 + 迁移 DC（APC 的一种类型）阐明 CTL（CD8 + T 细胞），通过：(a) 共刺激分子（如 CD80/86 和 CD28/152）(b) 癌症抗原与 MHC-I 的粘附 (c) 促炎细胞因子（如肿瘤抗原定制 CTL）识别肿瘤抗原的表位，与 T 细胞受体 (TCR) 形成复合物后。TCR 信号通过三个主要途径使肿瘤细胞死亡：(a) TNF 相关凋亡诱导配体 (TRAIL) (b) 穿孔素和丝氨酸蛋白酶的释放通过脱颗粒 (c) 增强了分化配体簇 (CD95L) 的调节。已观察到活化的 CD8 + T 细胞释放 IFN-γ 和 TNF-α，并显示肿瘤细胞减少。另一方面，IFN-γ、TNF-α 和 IL-2 由 CD4 + T 细胞产生，并显示患者耐力改善。固有免疫应答暴露于固有佐剂特性（如疫苗的双链 DNA (dsDNA) 和鸟嘌呤残基 (CpG)）后被激活。图3 图示证明了基于DNA的癌症疫苗在刺激针对癌细胞的适应性和先天性免疫中的作用机制。该疫苗编码肿瘤特异性抗原，这些抗原被树突状细胞摄取并呈递给 T 细胞。这导致了针对癌细胞的先天和适应性免疫反应的激活。先天免疫细胞，如作为自然杀伤细胞，释放细胞因子和趋化因子，招募额外的免疫细胞到肿瘤部位。然后活化的 T 细胞迁移到肿瘤部位，释放杀死癌细胞的细胞毒性分子。这一机制导致了全身抗肿瘤免疫反应，降低了癌症复发的风险。先天性免疫反应由NK细胞、中性粒细胞和巨噬细胞组成，通过肿瘤结合抗体（识别肿瘤细胞表面表位的抗体）的 Fc 受体识别癌症抗原并吞噬癌细胞。这些疫苗可全身或局部接种。全身途径包括口服、肺部和静脉给药，而局部途径包括肌内、皮下、经皮和皮内给药。据报道，作用机制随给药途径不同而不同。与局部途径相比，全身途径倾向于激活更多的次级淋巴器官 APC。在肌内给药途径中，肌细胞被转染。肌细胞不是专职 APC，与 MHC-I 形成复合物刺激 CD8 + 淋巴细胞，但不能诱导调节性 T 细胞。然而，由于炎症和疫苗接种引起的细胞因子释放，像树突状细胞这样的专业 APC 被招募。然后，这些细胞吞噬转染的体细胞，然后通过与 MHC I 类和 II 类复合物处理和递呈外源性抗原。另一方面，基因枪辅助皮内给予质粒 DNA 转染未成熟的朗格汉斯细胞，然后通过 MHC-I 分子将内源性抗原递呈至 CD8 + T 细胞。APC 也可以直接转染，通过 MHC-I 呈递触发 CD8 + T 细胞。所有这些发现都阐述了 DNA 免疫在消除恶性肿瘤中所产生的深刻机制。5.优缺点关于良好的科学和社会决策，基于dna的癌症疫苗更多的是一个警示故事。考虑到个体患者，权衡这些疫苗的所有利弊非常重要。首先，DNA 疫苗在所有免疫技术中扩展了大量的益处。这些疫苗不含任何类型的感染因子，如由死细菌或其减毒活形式组成的疫苗所示，因此是无害的。考虑到批量生产和储存成本，这些疫苗定价敏锐。其在环境温度下稳定，降低了运输值。它们证实了所需基因靶标的适当处理和递呈，促成因素是在自然感染中观察到的抗原体内递呈和抗原内部翻译后修饰。重组 DNA 技术可缓解抗原的快速修饰。如前所述，它们激活适应性免疫和体液免疫。它们可安全对抗由于先天免疫刺激引起的各种载体相关问题。跳过这些优势，DNA 疫苗有一些限制，阻碍了他们批准治疗人类癌症。DNA疫苗的主要缺点之一是免疫原性不合格。对于免疫系统的中度激发，需要更大量的约 5-10 mg。这些疫苗刺激的免疫反应仅限于基于蛋白质的抗原，对糖衣细菌没有用处。机体可能对通过这些疫苗引入的抗原产生耐受性。最后，自身免疫和质粒 DNA 整合到宿主基因组中始终存在威胁。6.正在开发或试验的疫苗描述人们一直在探索免疫疗法来战胜癌症，改善肿瘤治疗的前景。很少有研究正在进行临床试验来评估基于 DNA 的癌症疫苗减轻乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、肺癌、脑癌和宫颈癌的有效性，同样的研究也被列入表 1。这些疫苗正在乳腺癌和前列腺癌领域得到最大程度的评价。2020 年乳腺癌病例超过 200 万例，不断将其定位为女性最常发生的癌症。考虑到这一点，DNA 疫苗正在被仔细检查大约 18 类组织学不同的乳腺癌，常见的有 HER2 阳性、HER2 阴性和三阴性乳腺癌 (TNBC)。首先，HER2 阳性乳腺癌体现了人类表皮生长因子受体 2（一种增殖基因）检测阳性的肿瘤细胞。pNGVL3‑hICD和沙格司亭治疗晚期HER2阳性乳腺癌和卵巢癌该疫苗编码 HER-2/neu 原癌基因的胞内结构域，并引起针对 HER2 上调肿瘤细胞的细胞和体液免疫应答。一项入组 66 例 HER2 阳性 BC 或卵巢生殖细胞和上皮癌研究 pNGVL3-hICD（一种基于 DNA 质粒的疫苗）联合 Sargramostim-a 重组粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 (rGM-CSF) 的疗效。这是一项开放标签研究，患者接受 pNGVL3-hICD 联合沙格司亭作为辅助治疗，在无疾病进展或不可接受毒性的情况下，每月皮内注射一次，持续3个月。根据剂量分为三组，即10μg、100μg和 500μg 血浆。患者已完成针对其原发疾病的适当治疗，并在入组前停用细胞毒化疗和皮质类固醇至少1个月。本研究的主要目的是确定3剂pNGVL3-hICD 与固定剂量沙格司亭混合皮内给药的安全性。试验概要旨在研究pNGVL3-hICD的副作用并确定最佳剂量。迄今为止获得的结果描述了中等剂量100μg具有免疫原性，其中免疫原性持续 60 周。本试验的估计完成日期为2024年12月1日。STEMVAC联合GM‑CSF治疗HER2阴性晚期乳腺癌STEMVAC是一种多抗原疫苗，利用基因工程来操纵 DNA，指导细胞产生靶抗原。这项 I 期非随机临床试验旨在研究 CD105/Yb-1/SOX2/CDH3/MDM2 多表位质粒 DNA 疫苗的副作用和最有效剂量，该疫苗使用 100 μg 重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子作为佐剂 (NCT02157051)。42 例成人患者被分为 3 个 150 μg、300 μg 剂量组，和 600 μg STEMVAC。已完成标准治疗并从近期治疗中恢复（轻度至无残留毒性）的患者已入组并分配至三个组之一。在没有不可接受的毒性或疾病进展的情况下，患者还在第 3 次疫苗接种后 3 个月和 6 个月接受了 2 次额外的 STEMVAC 疫苗加强剂量。主要终点研究安全性和免疫原性，次要结局为疫苗接种后免疫应答的持续性，以及 MDSC 和 Tregs 的诱导。迄今为止获得的结果描述了 300 μg 的剂量具有高度持续性。研究治疗完成后，将每年对患者进行两次随访，最长持续 5 年。完成日期估计为 2027 年 2 月 10 日。表1 正在进行的临床试验，重点是针对癌症的DNA疫苗的开发WOKVAC联合沙格司亭治疗非转移性、淋巴结阳性和HER2阴性乳腺癌WOKVAC 是基于DNA质粒的疫苗，编码三种蛋白即胰岛素样生长因子结合蛋白 2 (IGFBP2)、HER2 和胰岛素样生长因子受体-1 (IGF-1R)。这些蛋白在浸润前和高危乳腺病变中过表达，并与进展为浸润性乳腺癌有关。一项在非转移性、淋巴结阳性、人表皮生长因子受体 2 阴性乳腺癌患者中评价 pUMVC3-IGFBP2-HER2-IGF1R 联合沙格司亭预防癌症复发的副作用和适当剂量的 I 期试验 (NCT02780401)。共入组了 24 例缓解且无疾病证据的成人患者。这是一项单组开放标签研究，首次包括在第 1 天接受 WOKVAC 联合沙格司亭 ID 的患者，在无疾病进展或不可接受毒性的情况下，每 28 天重复疗程，最多 3 个疗程。腋窝淋巴结清扫 (ALND) 患者将在对侧手臂接种疫苗，双侧 ALND 患者将在大腿接种疫苗。研究治疗完成后，将在 1 个月、6 个月和每年对患者进行随访，直至 5 年。试验完成日期估计为 2025 年 3 月 31 日。WOKVAC联合化疗和HER‑2靶向免疫治疗药物治疗乳腺癌一项单组、开放标签、II 期研究调查了 WOKVAC 联合紫杉醇、帕妥珠单抗和曲妥珠单抗的疗效 (NCT04329065)。患者将在第1天接受曲妥珠单抗和帕妥珠单抗，并在第1、8和15天接受紫杉醇输注。WOKVAC 将在 21 天周期的第13天给药。免疫化疗联合疫苗将主要基于肿瘤浸润淋巴细胞 (TIL) 的数量进行评估。试验结果将使我们对化疗、单克隆抗体和 DNA 疫苗的组合有一个认识。本试验的完成日期预计为 2027 年 6 月 30 日。STEMVAC联合沙格司他丁治疗三阴性乳腺癌一项2期试验仔细检查了与沙格司亭混合的 STEMVAC 辅助性 T 细胞 (Th1) 多表位质粒疫苗治疗 IB-III 期三阴性乳腺癌患者的能力 (NCT05455658)。共有 33 例成人患者，在无疾病进展或不可接受毒性的情况下，每月皮内给予 STEMVAC 疫苗与 GM-CSF，持续 3 个月。第 3 次接种后 3 个月和第 1 次强化接种后 6 个月，患者将接受 STEMVAC 疫苗联合沙格司他丁 ID 强化注射。待评价的主要结局包括刺激特异性 Th1 免疫应答和次要点研究安全性参数。研究治疗完成后，将在第 28 天对患者进行随访，然后每年一次，持续 5 年。估计完成日期为 2024 年 4 月 30 日。pTVG‑HP联合pTVG‑AR与pembrolizumab治疗前列腺癌—联合两种DNA疫苗的试验这些疫苗是质粒 DNA，其中 pTVG-HP 编码人前列腺酸性磷酸酶，pTVG-AR 编码雄激素受体的配体结合域。一项随机、开放标签和多中心研究的两个实验组之一描述了两种 DNA 疫苗的接种，在周期 1、2、5 和 6 的第 1 天和第 8 天给予 pTVG-HP (NCT04090528)。另外，pTVG-AR 将在第 3、4、7 和 8 周期的第 1 天和第 8 天给药。疫苗将在第 1 天与单克隆抗体 Pembrolizumab 联合给药。本试验旨在评价无进展生存期 (PFS) 作为主要结局和几个次要结局。预计完成日期为 2025 年 12 月。Mammoglobin‑A DNA疫苗联合内分泌治疗的新辅助化疗治疗乳腺癌Mammoglobin-A 是乳腺肿瘤的特殊靶点，属于分泌球蛋白超家族成员，涉及主要在粘膜组织中表达的二聚体蛋白。它具有接近普遍的高表达加上良好的特异性，这使其成为乳腺癌预防或治疗的非凡靶点。已经建立了一项非随机、开放标签研究，评估乳腺球蛋白 A DNA 疫苗在 ER +、HER2-乳腺癌患者中的疗效 (NCT02204098)。其中一组涉及该疫苗接种联合新辅助化疗，另一组设定为疫苗接种联合内分泌治疗。需要测量的结局包括安全性参数、免疫应答、客观缓解率 (ORR)、PFS 和总生存期 (OS)。试验的估计完成日期为 2028 年 8 月 31 日。简而言之，DNA疫苗目前正在进行广泛的癌症类型的测试，包括常见的乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌和宫颈癌，再加上确定其在相对罕见的肺、脑和肛门肿瘤中的疗效。这些试验正在进行中，以评价 DNA 疫苗作为预防和治疗方法的有效性。这些试验的广度表明，DNA 疫苗有可能在未来成为肿瘤治疗的一种突出形式，为癌症治疗提供了一种有前景的新方法。7.已完成的证明DNA疫苗有效性的临床试验大量试验已经完成了他们在包括黑色素瘤、多发性骨髓瘤、宫颈癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、膀胱癌和肺癌在内的各种类型癌症中评估 DNA 疫苗的目标。其中一些关键因素已在表 2 中介绍，其中很少有描述。一项开放标签、非随机、2 期研究评价了 DNA 疫苗 INO-3112 在宫颈癌女性中的安全性、耐受性和免疫原性。此处，VGX-3100 体现了 HPV-16 和 HPV-18 质粒，INO-9012 由编码白细胞介素-12 (IL-12) 的 DNA 组成。18 例经活检证实的 IB-IVB 期浸润性宫颈癌（无法手术且与人乳头状瘤病毒 (HPV) 16 或 18 相关）女性受试者和已接受两种类型治疗的女性受试者入组研究。这两种治疗将患者分为两个队列。队列 I 包括接受过以治愈为目的的标准化疗的患者，而队列 II 包括挽救治疗后 HPV 相关宫颈癌复发的患者。该研究强调，疫苗通过刺激具有细胞毒性 T 细胞 (CTL) 表型的 CD8 + T 细胞诱导了强烈的抗体应答。同时，产生抗原特异性 CTL。不良事件为轻度至中度。报告的 3 级不良事件为病毒性胃肠炎、紧张性头痛和手腕头痛。然而，这些 3 级不良事件与治疗无关。根据实验室参数，仅 2 例患者发生中度低血糖，无需任何治疗。该数据描述了该疫苗驱动对接种抗原的强应答的能力，可推断出该疫苗具有接近治愈的未来。NCT01341652 ii期研究评估了 pTVG-HP 联合 rhGM-CSF 的有效性。入组了 99 例非转移性、去势敏感性前列腺癌患者。患者随机接受 pTVG-HP 皮内给药，联合 200 μg GM-CSF 或 200 μg 单药。2 年无转移间期是待评价的主要终点。待研究的次要结局包括前列腺特异性抗原倍增时间、至放射学疾病进展的中位时间、PSA、PFS 和观察到的毒性的调节。pTVG-HP 治疗未显示 2 年无转移生存期 (MFS) 显著延长。然而，预先设定的 18F-NaF PET/CT 成像显示对微转移性骨病有显著影响。简言之，本研究未显示令人满意的结果，需要进一步分析。正在进行的试验正在研究 pTVG-HP 与 PD-1 抑制剂的联合用药。一项关于ImmunoPulse IL-12 治疗 Merkel 细胞癌有效性的开放标签、非随机、ii 期研究正在进行一项有趣的研究。该疫苗是 tavokinogene telseplasmid（编码 IL-12 的质粒）和体内电穿孔介导质粒 DNA 疫苗的组合。本研究入组了 15 例受试者，以评价主要和次要终点。其中 12 名参与者的肿瘤组织中 IL-12 的表达增加了两倍。与单周期疫苗接种相比，4 个周期接种的不良反应更多，观察到的唯一显著不良反应是注射部位炎症。简而言之，已完成的临床试验相对较少，未能描绘令人满意的结果。然而，pTVG-HP 显然显示了令人鼓舞的结果，并可能在不久的将来成为先驱。此外，大量试验正在进行中，它们可能很快导致治疗方向。8.DNA疫苗与其他疗法的结合DNA 疫苗单独无法克服肿瘤的免疫逃逸策略，包括选择有效缺乏免疫原性抗原的肿瘤细胞以及在 TME 中充分招募免疫抑制细胞。然而，将它们与沉默免疫抑制细胞募集的策略结合，并充分诱导 TME 中抗 TA 的免疫应答，可以增强它们。关于 DNA 疫苗与包含化疗、放疗和手术干预的常规方法联合使用的文献证据可以很好地证明。图 4 说明了基于 DNA 的癌症疫苗的各种组合策略，以及组合如何影响肿瘤细胞。描述 DNA 疫苗与其他疗法联合使用的一些临床前试验列于表 3，已完成的临床试验列于表4。DNA疫苗联合化疗近年来，化疗如何在缓解肿瘤中发挥双向作用已被阐明。在几种化疗药物（如紫杉醇、环磷酰胺和吉西他滨）中观察到 TA 释放诱导以及 TME 中 T 细胞活性增加和免疫抑制细胞清除。在几项临床前研究中，其中一项研究评价了 DNA 疫苗与环磷酰胺联合给药，结果显示 VEGF 和 IL-10 降低，小鼠的生存率增加。如代表正在进行的临床试验的表中所示，涉及 DNA 疫苗和相关化疗药物的联合策略可能在随后几年中至关重要地参与肿瘤治疗。Toll 样受体 4 (TLR4) 模拟介导的检查点阻断敏感性的重建在化疗治疗中已经遇到。将DNA疫苗与靶向治疗相结合扩增 T 细胞启动并刺激 TA 释放的靶向治疗可与 DNA 疫苗联合使用。尽管未与 DNA 疫苗联合检测，但当舒尼替尼（一种酪氨酸激酶抑制剂 (TKI)）与癌胚抗原 (CEA) 编码的病毒疫苗联合使用时，观察到肿瘤体积减小。然而，未来的研究可能会评估 fda 批准的 TKI，如阿昔替尼、卡博替尼和帕唑帕尼联合 DNA 疫苗。DNA疫苗与免疫检查点抑制剂的结合介导抗原呈递信号机制的共刺激分子是 T 细胞调节的关键要素。肿瘤能够模拟这种共刺激分子，抑制抗 TA 免疫细胞的活化，从而逃避免疫。具有特异性的是，肿瘤细胞表达与抑制性受体连接的配体，如 PD-1、CTLA-4、T 细胞免疫球蛋白和粘蛋白结构域包含-3 (TIM-3) 以及存在于 T 细胞上的淋巴细胞活化基因-3 (LAG-3)。克服肿瘤细胞逃逸的一种方法是阻断 T 细胞上的这些抑制性受体，并阻止其与肿瘤释放配体的相互作用。在临床前模型中评估的 CTLA-4 抑制显示了肿瘤生长的延迟。在黑色素瘤患者中研究相同的 CTLA-4 阻断时，观察到肿瘤排斥。T 细胞活化增强，同时抑制 IL-10 和 TGF-β，可能是这些抗肿瘤作用的原因。除了这一益处，据报道 CTLA-4 抑制剂对免疫记忆有利。此外，抗 PD-1 抗体已获得 FDA 批准用于多种癌症，因为这些抗体表现出显著有效的结果。肿瘤负荷增加的肿瘤具有增加的新抗原。这些大量的新抗原可被抗肿瘤机制很好地识别，并最终使此类癌症对涉及 ICI 的治疗敏感 [。因此，疫苗与 ICI 的组合在未来可能被证明是有益的。表2 评估DNA疫苗特征的已完成临床试验将DNA疫苗与细胞因子结合通过免疫刺激细胞因子的辅助，可提高疫苗对T细胞的效率。它们可以以蛋白质的形式注射，也可以通过靶编码疫苗进行编码。GM-CSF、IL-12 和 IL-2 是临床研究中最常涉及的药物。FDA 已批准 IL-2，因为其通过分化未成熟 T 细胞形成更多的效应 T 细胞和调节 T 细胞。此外，还显示了缓解转移性肾细胞癌和转移性黑色素瘤的有效结果。GM-CSFs，如已经在正在进行的临床试验中引入的沙格司亭，刺激树突状细胞的成熟，并诱导 T 细胞的活化和增殖。IL-12（另一种强效细胞因子）的组合增强了疫苗的有效性，因为其涉及 T 细胞的活化和募集。DNA 疫苗与编码 IL-12 的质粒的融合已在临床前小鼠模型中进行了抗宫颈癌的试验，结果显示 MDSC 减少，这传达了该组合的治疗前景。在一项针对晚期肝细胞癌 (HCC) 的临床试验中，还评估了 IL-12 与新抗原 DNA 疫苗和帕博利珠单抗联合使用的情况。与这三种细胞因子一起，其他细胞因子如 IL-7、IL-15 和干扰素-γ (INF-γ) 以及其他佐剂如 TLR 激活剂也可用于与 DNA 疫苗结合。可与DNA疫苗联合使用的其他方法包括内分泌和放疗。当在临床前研究中评估与疫苗联合使用时，放射治疗的效应包括肿瘤体积减小、癌细胞损伤增加和 TA 释放增加。在激素相关癌症中，如前列腺癌和乳腺癌，内分泌治疗是主要策略，来曲唑显示调节性 T 细胞减少。此外，在前列腺癌中实施雄激素阻断治疗时，观察到 T 细胞数量增加和胸腺细胞再生。其中一项正在进行的试验正在评估 Mammoglobin-A DNA 疫苗联合来曲唑、依西美坦、戈舍瑞林和他莫昔芬的能力。该疫苗针对的是特定的肿瘤抗原，而常规疗法，如化疗、放射治疗和手术，会消灭散装的肿瘤细胞。靶向治疗，如单克隆抗体和小分子肿瘤生长和进展。免疫检查点抑制剂释放免疫系统的刹车，允许更大的 T 细胞激活对抗癌细胞。最后，细胞因子，如干扰素和白细胞介素，刺激免疫细胞，增加其对肿瘤细胞的细胞毒性。这些策略的结合有可能增强癌症治疗的疗效，改善患者预后。图4 图示展示了基于 DNA 的癌症疫苗与常规疗法、靶向疗法、免疫疗法和细胞因子在对抗肿瘤细胞能力方面的组合策略。该疫苗针对的是特定的肿瘤抗原，而常规疗法，如化疗、放射治疗和手术，会消灭散装的肿瘤细胞。靶向治疗，如单克隆抗体和小分子抑制剂，干扰参与肿瘤生长和进展的特定分子。免疫检查点抑制剂释放免疫系统的刹车，允许针对癌细胞的更大 T 细胞激活。最后，细胞因子，如干扰素和白细胞介素，刺激免疫细胞，增加其对肿瘤细胞的细胞毒性。这些策略的结合有可能增强癌症治疗的疗效，改善患者预后。表3 基于DNA的癌症疫苗在小鼠模型中的临床前研究作为新疫苗发现和开发的一部分表4 已完成的DNA疫苗与其他疗法相结合的临床试验9.肿瘤免疫治疗的临床意义针对癌症的免疫治疗策略几乎获得了肿瘤领域常规疗法的地位。考虑到获得更长缓解期和改善患者依从性的机会更高，将标准常规化疗与免疫治疗合并使用可减轻高级别肿瘤。它通过利用和加强机体对抗肿瘤的免疫系统来消除肿瘤细胞的生长。目前的临床情况包括免疫治疗，如单克隆抗体 (mAb)（治疗性、双特异性、免疫检查点）、过继性细胞治疗 (CART、TCR-T、TIL、CAR-NK)、小分子药物（PD-1/PD-L1 抑制剂、IDO1 抑制剂）、溶瘤病毒，最后是该文献的精髓，即疫苗。事件已证明 mAb 治疗是临床病例中一种有前景的方法。然而，由于其免疫原性特征，mAb 可引起严重不良反应，因此需要严格监测，最近开发的 mAb 与 Fc 工程抗体的偶联疗法可用于挽救。小分子抑制剂的特征相对优于 mAb，是实体瘤更好的免疫治疗替代药物。以嵌合体为靶点的蛋白水解 (PROTAC) 是一种新型的小分子抑制剂，目前正在临床试验中进行测试。随着过继细胞治疗的进展，由于安全性问题和脱靶结局，CAR-T/TCR-T 的使用较少。然而，这些药物已成功用于治疗血液肿瘤，并与实体瘤的小分子抑制剂联合使用。随着溶瘤病毒的出现，出现了靶向递送病毒的对抗，因为病毒需要通过身体的全身免疫力量。目前正在开发纳米颗粒辅助递送病毒以克服该问题。最后，正在开发针对癌症的预防和治疗疫苗，其中 Gardasil 和 Cervarix 的制造是一项重大成就。然而，疫苗，特别是 DNA 疫苗需要投入，无论是金钱还是智力。与单药治疗相比，免疫治疗的联合方法在临床上更有前景，FDA 批准了其中的少数。随着肿瘤学、免疫学、生物技术和生物信息学的进步，免疫治疗领域将不断扩展和发展。10.前进的道路随着fda批准，许多病毒样颗粒 (VLP) 和基于细胞的疫苗已经被制造用于对抗癌症，其中 DNA 疫苗面临着相当大的障碍，这是我们在本文的前面部分中引入的。然而，这些新时代在将疫苗接种策略与传统策略相结合方面取得了进展，这导致评价肿瘤疫苗的临床试验死灰复燃。这种合并在很大程度上减少了细胞毒性化疗药物无法控制的毒性事件。它抵消了免疫抑制性 TME，并表现出更大的协同抗肿瘤作用。即便如此，我们仍需要建立未来的研究，以表征联合化学免疫治疗的作用，并通过谨慎选择药物（包括新型免疫佐剂）和重振给药时间，在更大程度上最大化治疗活性。此外，除了晚期癌症外，还需要评估早期癌症的联合治疗。虽然 DNA 疫苗可以皮内或肌内接种，但设备辅助接种——电穿孔法经常被使用。此外，表达单一肿瘤抗原的疫苗，在外延时显示出增加的有效性和免疫原性。Ergo 临床试验越来越多地纳入了外置技术，以达到最佳疗效结局。此外，由 DNA 和载体组成的骨架，可以利用微环 DNA (mcDNA) 进行升级。mcDNA 是一种仅体现所需真核表达的产物，可消除不必要的原核序列，从而防止炎症反应。免疫治疗的可变反应需要建立预测性生物标志物，这也将有助于监测相关的副作用。为了建立这些生物标志物，我们需要在基因组和蛋白质组工具方面取得进展，同时在生物信息学方面取得进展。最后，中性粒细胞胞外陷阱 (NETs) 在以 DC 为基础的癌症疫苗中的作用正在被探索。这些疫苗最初倾向于诱导中性粒细胞募集对抗肿瘤，然而长期暴露于中性粒细胞产生的 NETs 证明 T 细胞免疫反应耗竭，DC 细胞死亡并最终发挥肿瘤保护作用。由于基于 DNA 的癌症疫苗通过分子模式识别受体的复杂参与刺激树突状细胞 (APC)，NETs 的相同作用可应用于基于 DNA 的癌症疫苗。总之，我们需要对免疫调节途径进行更多的探索，这些进展将为潜在的组合癌症疫苗的制备铺平道路，并加强广泛的治疗方式。未来，DNA 疫苗有望通过对中性粒细胞胞外陷阱 (NETs) 形成的影响，有效减少血栓-炎症，在卒中和心肌梗死 (MI) 的管理中发挥举足轻重的作用。血栓炎症是指炎症与血凝块形成之间错综复杂的相互作用，可导致脑卒中和 MI 的发生和发展。NETs 是由染色质（DNA 和组蛋白）组成的网状结构，表面装饰有抗菌肽和酶。尽管 NETs 主要用于捕获和杀灭病原体，但过多的 NET 形成可导致有害作用，包括促进卒中和 MI 的血栓形成和炎症。DNA 疫苗可被设计用于靶向导致卒中和 MI 发生的病原体相关分子模式 (PAMP)。通过诱导针对这些 PAMP 的免疫反应，DNA 疫苗可能潜在缓解由活化的中性粒细胞触发的过度 NET 形成。这种可能的机制有可能减少血栓事件和抑制受影响组织中的炎症反应。因此，重要的是要认识到，DNA 疫苗在管理血栓-炎症中的作用，特别是在卒中和 MI 中，将是一个正在进行的研究和开发领域。然而，为了证明这些可能的机制，临床前研究是必要的，以证明有希望的可能的效果 DNA 疫苗在此背景。11.结论基因，作为人体的基础，制造以基因为基础的疫苗来抵御癌症的想法，无疑是肿瘤学最大的先驱之一。DNA 疫苗已被设计为新一代生物技术之一，正在逐步改良并用于癌症治疗。与传统疫苗相比，这些基因疫苗已被证明是安全的，因为它们携带抗原的遗传信息。此外，它们相对稳定，生产经济。这些疫苗的设计和递送的最新进展，结合最佳肿瘤抗原的鉴定和与其他免疫治疗的联合，在临床前和临床研究中显示出巨大的潜力。尽管存在这些挑战，基于 DNA 的癌症疫苗在广泛的癌症类型中的持续开发和测试突显了它们在癌症治疗的未来发挥重要作用的潜力。随着不断的研究和进步，DNA 疫苗可能为对抗这种毁灭性疾病提供新的有效方法。参考资料：Pandya A, Shah Y, Kothari N, Postwala H, Shah A, Parekh P, Chorawala MR. The future of cancer immunotherapy: DNA vaccines leading the way. Med Oncol. 2023 Jun 9;40(7):200. doi: 10.1007/s12032-023-02060-3. PMID: 37294501; PMCID: PMC10251337.识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入生物制品微信群！请注明：姓名+研究方向！版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

在上一期内容中，我们提到，Moderna 团队发现通过改变 mRNA 二级结构可增加 mRNA 功能半衰期，从而提升 mRNA 蛋白表达水平。可以看出，mRNA 半衰期与蛋白质表达水平之间存在密切关系。最近，Alicia Bicknell 在第11界International mRNA Health Conference 会议上分享了设计高蛋白产出 mRNA 的一种策略：避免缓慢解码，减少翻译起始。她分析认为拥有高核糖体载量的编码序列展现出更高的翻译依赖的 mRNA 降解速率，在特定时间内，产生更少的蛋白。快速的翻译起始或者缓慢的翻译延伸导致高核糖体载量，最终导致 mRNA 半衰期变短。我们本期内容，主要来看看如何理解 Alicia Bicknell 的观点。2015 年，有学者发现密码子适应性（Codon Optimality）是芽殖酵母中 mRNA 稳定性的主要决定因素。首先，生物信息学分析表明最佳密码子的百分比与 mRNA 半衰期之间存在很强的相关性。例如，最佳密码子少于 40% 的 mRNA 的中位半衰期为 5.3 分钟，而最佳密码子超过 70% 的 mRNA 的中位半衰期为 20.1 分钟。如果将最佳密码子更改为非最佳密码子会使原本稳定的 mRNA 不稳定，而将非最佳密码子更改为最佳稳定的否则不稳定的 mRNA。值得注意的是，尽管密码子含量显然是 mRNA 稳定性的主要决定因素，但它并不能预测所有 mRNA 的半衰期。例如，几种组蛋白成分（例如 HHF2 和 HHT1）的 mRNA 含有 85% 的最佳密码子，但非常不稳定，半衰期分别为 2.4 分钟和 3.5 分钟。此类 mRNA 的半衰期可能由它们有效（或低效）启动翻译的能力或者 5'/3'UTR 元件决定。其次，他们发现核糖体在含有非最佳密码子的 mRNA 上要比含有最佳密码子的 mRNA 易位更缓慢，从而导致翻译延伸减慢。这项研究利用密码子适应性将 mRNA 衰变过程和翻译过程连接起来，最适密码子含量越高，mRNA 半衰期越长，翻译延伸越快，蛋白产出越高。图片来自：Codon Optimality Is a Major Determinant of mRNA Stability对于每个 mRNA 分子来说，有 3 个必须经历的过程：转录、翻译及降解。在细胞质中，mRNA 水平动态变化由转录速率和降解速率决定。有意思的是，细胞受到外界刺激时，RNA 水平的动态变化仅仅与降解速率（稳定性）相关。mRNA 稳定性会受到顺式作用元件和反式作用因子的双重影响。顺式作用元件主要包括密码子最适性、化学修饰、3'UTR 序列中富含 AU 的元件或者 miRNA 结合位点、GC 组成及 5'UTR 序列。在反式作用因子对 mRNA 稳定性的影响中，核糖体扮演着至关重要的作用，也就是 mRNA 翻译过程与其稳定性之间存在一定的关联。早在三十年前，人们发现 c-Myc mRNA PolyA 尾巴的缩短是依赖翻译过程的。至于，翻译到达会增强还是减弱 mRNA 稳定性存在着一定的争议。有研究借助全基因组研究发现，在酵母和哺乳动物细胞中，活跃翻译的 mRNA 同时也在发生降解。随着发现越来越多的与核糖体直接相互作用的降解因子，这种 mRNA 共翻译降解理论得到进一步支持。反面的例子当然也有，有些研究发现翻译可以保护 mRNA 不被降解，mRNA 翻译和降解是相互排斥的过程。因此，mRNA 的翻译和衰变之间的关系并不是十分清楚，现有的结论也是相互矛盾的：翻译可以促进 mRNA 衰变或者稳定 mRNA。有研究人员发现在起始（eIF2α磷酸化）、延伸（放线菌酮和三尖杉酯碱）阶段抑制翻译或导致提前终止（嘌呤霉素）反应会导致 mRNA 变得更加稳定。虽然这些结果表明翻译促进了 mRNA 衰减，但无法排除这种现象是由整体性的翻译抑制通过改变其他途径引起的。2023 年，瑞士巴塞尔 FMI 研究所 Jeffrey A. Chao 等人在 Molecular Cell 发表文章：Single-molecule imaging reveals translation-dependent destabilization of mRNAs。他们开发出一种控制特定转录本翻译的方法，将铁蛋白重链 mRNA 的 5' UTR（包含 IRE 铁响应元件）整合到 mRNA 中来实现。当细胞内铁离子浓度较低时，IRE 会招募铁调节蛋白 (IRP1/2)，通过阻止预起始复合物的招募来抑制翻译起始 。当胞内铁离子水平增加时，IRP1/2 蛋白与 IRE 分离，从而启动翻译。为了可视化活细胞中单个 mRNA 分子的翻译，将 SunTag 盒作为海肾荧光素酶 N 端融合蛋白整合进 CDS 区，并将 MS2 茎环整合到 3' UTR 中。SunTag 盒编码一系列抗原肽，可通过检测表达 GFP 融合同源单链抗体 (scFV-GFP)细胞中的新生多肽实现翻译可视化。24 个 MS2 茎环与 MS2 外壳蛋白 (MCP)-Halo 融合蛋白结合，可实现单个 mRNA 的可视化。为了限制可增加背景信号的成熟 SunTag 肽在细胞质中的积累，将不稳定的 FKBP 结构域融合到 SunTag-Renilla 编码序列的 C 末端。此外，研究人员将 IRE 整合到先前建立的 TREAT mRNA 的 5' UTR 中，由于存在耐受 Xrn1 降解的假结 (PK)，这样便可用单分子荧光原位杂交 (smFISH) 来区分完整的 mRNA 和稳定的 3' 降解中间体。研究员利用上述系统研究翻译过程对 mRNA 稳定性的影响，发现一个非常有意思的现象：与未处理的细胞（翻译抑制）相比，经铁处理的细胞（翻译活跃）中完整 mRNA 比例减少得更快。这表明，与未发生翻译的 mRNA 相比，正在进行翻译的 mRNA 降解会更快。接着，研究人员在铁存在的情况下诱导 IRE-TREAT mRNA，但与铁再孵育 1 小时后，洗涤细胞并保存在含有铁螯合剂的 DMEM 中，与铁处理的细胞相比，铁螯合剂处理的细胞中完整 mRNA 比例有所增加，但低于从未用铁孵育的细胞中的比例。这说明，一旦终止翻译过程，mRNA 衰变便会减慢。此外，他们还发现这种依赖于翻译的 mRNA 衰变与密码子适应性无关。相比不存在铁的情况下，密码子去优化的 Renilla 转录本被发现在铁存在的情况下降解同样会更快。但是，与原始的 Renilla mRNA（密码子优化） 相比，密码子去优化的 Renilla 转录本降解更迅速，也就是半衰期会更短，这与前面提到的酵母中密码子适应性对 mRNA 半衰期的影响也相一致。翻译依赖的 mRNA 衰变与密码子适应性无关，但是，密码子适应性会影响 mRNA 衰变速率。为了搞清楚翻译依赖的 mRNA 不稳定性是由于正在延伸的核糖体数量（核糖体占有率，ribosome occupancy）造成的还是每单位时间启动翻译的核糖体数量（核糖体通量，ribosome flux）造成的，研究人员设计了两种具有不同长度开放阅读框（ORF）但具有相同的 5' UTR 和 3' UTR 的 mRNA（96nt 和 1884nt）。他们推断 ORF 的长度与延伸核糖体的数量相关，但由于 5' UTR 相同，核糖体通量应该保持不变。短 ORF 很可能一次只能容纳一个核糖体，而多个核糖体可以同时占据长 ORF。在铁存在的情况下，这两种 mRNA 都会以翻译依赖性方式降解。有趣的是，尽管 ORF 的长度相差约 20 倍，但两种 mRNA 的降解速度相似。这些结果表明，翻译依赖性的 RNA 衰减并不依赖于转录物上延伸核糖体的数量，而是取决于核糖体通量。核糖体通量而不是核糖体占有率影响翻译依赖的 mRNA 衰变研究人员还提出了一种渐进衰减数学模型，认为随着每轮翻译的推进，mRNA 降解率逐渐增加，也就是说，mRNA 降解概率随着每一轮翻译而增加。近端帽茎环已被证明可以降低翻译起始率，研究人员将具有 (SL) 和不具有 (ΔSL) 茎环的 5' UTR 整合到 SunTag mRNA 中，与 ΔSL-SunTag mRNA 相比，SL-SunTag 转录本上的核糖体平均数量减少，SL-TREAT mRNA 的降解速度比 ΔSL-TREAT mRNA 慢。有趣的是，mRNA 预期寿命和翻译起始频率之间的关系是非线性的，并且在更快速的翻译起始频率下，mRNA 半衰期会达到一个平台，而不是持续下降，这表明核糖体通量对mRNA 稳定性的影响存在上限。降低翻译起始频率（核糖体通量），会使得 mRNA 变得更加稳定。   小结一方面，与非翻译状态相比，处于翻译活跃状态的 mRNA 存在衰变过程，称为翻译依赖的 mRNA 衰变（translation-dependent mRNA decay）。不管 mRNA 密码子适应性程度如何，只要发生翻译，均会触发 mRNA 衰变。翻译依赖的 mRNA 衰变速率与 ORF 长度无关，由核糖体通量（受5'UTR序列影响）来决定。降低翻译起始频率，会增加 mRNA 稳定性。既然翻译会促进 mRNA 降解，那么重新审视为什么高度翻译的高丰度转录本（例如，管家基因）也是一些最稳定的转录本是很有意义的，这表明存在某些机制（例如，某些反式作用因子）能够抵消掉翻译过程带来的降解效应。另外一方面，密码子适应性又会影响翻译中的 mRNA 稳定性。mRNA 上拥有的最适密码子含量越多，半衰期越长，核糖体易位更快速，翻译延伸更快，蛋白产出会更高。从上述两个方面来看翻译对 mRNA 稳定的影响，便能理解 Alicia Bicknell 提出的 mRNA 设计优化策略：降低翻译起始频率，避免缓慢解码。总的来说，翻译对 mRNA 稳定性的影响是非常复杂的，具有多种效应的叠加。识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入生物制品微信群！请注明：姓名+研究方向！版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。