MRP1

抗体偶联药物（ADC）是一种极具潜力的癌症治疗方式，可以选择性地向肿瘤递送高细胞毒性有效载荷。但ADC正面临耐药性、肿瘤异质性和治疗相关不良反应等一系列挑战。如何解决这些挑战？一方面，ADC各组分（即抗体、连接子、有效载荷）的进步是提高药物疗效和安全性的关键；另一方面，目前几种新兴的ADC形式，如双特异性ADC、条件激活型抗体前药偶联物（也称为probody–drug conjugates, PDC）、免疫刺激ADC（immune-stimulating antibody conjugates, ISAC）、蛋白质降解ADC和双药ADC等都有各自的优势，能应对不同的挑战：1）双特异性ADC和双药ADC具有对抗耐药性和肿瘤异质性的双重潜力；2）将免疫刺激ADC和蛋白质降解ADC与当前的治疗方案相结合，可能通过几种不同的作用机制实现多模式治疗。近日，Nature Reviews Clinical Oncology发表了一篇综述文章，深入探讨了ADC分子的设计，以及每种组分如何影响药物的特性。此外，文章还重点介绍了处于临床前/临床早期阶段的上述ADC新兴形式（双特异性ADC、PDC、ISAC、蛋白质降解ADC和双药ADC）的代表药物。来源：Nature Reviews Clinical OncologyADC分子设计如图1a所示，ADC由单抗、有效载荷和连接子组成，这种设计结合了抗体的特异性和有效载荷的高细胞毒性。ADC设计的原理是通过优化每个结构组分（抗体、有效载荷和连接子）而发展起来的。图1. ADC的组分、分子特性和新设计抗体、靶点的选择ADC的抗体通常选用经人源化改造，或直接是人源的免疫球蛋白G（IgG）。ADC设计时会优先使用IgG1抗体，一方面，IgG1在体循环中总体稳定，并且能与先天免疫细胞产生协同作用（如NK细胞、巨噬细胞）；另一方面，使用人IgG1还有助于降低ADC的整体免疫原性，从而将超敏反应和抗药物抗体（ADAs）形成的风险降至最低。目前大多数ADC结构中会连接N-聚糖，以实现FcγR的结合。然而，聚糖可能会导致肝细胞非特异性摄取ADC，导致肝脏毒性，未来可能会使用非糖基化单抗。理想情况是，抗体能够识别在癌细胞表面特异性表达、在健康组织中完全不表达的抗原。但大多数ADC靶点（如HER2和TROP2）都在一定程度上在健康组织中表达。因此，靶标依赖性和靶标非依赖性毒性仍然可能发生。目前已经有研究在探索能够特异性识别肿瘤中的结构变异的抗原对应的抗体。此外，ADC内化和更新率对疗效也有重要影响。结合亲和力的优化也是ADC功效最大化的关键一步。但矛盾的是，过强的抗原结合会导致ADC分子滞留在肿瘤细胞表面，限制了组织渗透的程度。因此，ADC的抗体骨架要考虑到不同的参数，以确保最佳性能。有效载荷目前FDA批准的ADC的有效载荷包括抗有丝分裂剂（MMAE、MMAF、美坦素衍生物DM1和DM4）、DNA损伤剂（卡奇霉素和pyrolobenzodiazepine二聚体）、拓扑异构酶I抑制剂（CN-38、DXd）等。其他正在评估中的药物还包括微管蛋白抑制剂、DNA烷基化剂、拓扑异构酶II抑制剂、RNA聚合酶II抑制剂。此外，免疫调节剂、蛋白质降解招募分子也逐渐成为有希望的新型有效载荷。大多数有效载荷分子具有中等至高水平的疏水性。疏水有效载荷可以从靶表达的肿瘤细胞扩散到邻近的靶表达有限甚至没有靶表达的细胞，这种现象被称为旁观者效应。由于异质性肿瘤中表达抗原的细胞与未表达抗原的细胞共存，所以旁观者效应对于成功根除异质肿瘤至关重要。但疏水有效载荷也会对ADC的有效性产生负面影响：1）疏水有效载荷可以作为多药耐药蛋白（如MDR1、MRP1和BCRP）的良好底物，从而降低某些ADC对表达这些转运蛋白的肿瘤的效力；2）疏水ADC倾向于形成聚集体，可能会被迅速清除，且可能具有免疫原性；3）过度疏水性可促进肝脏摄取，并引起肝毒性。因此，在保证旁观者效应的前提下，需要调节ADC的疏水性。目前策略之一是降低DAR，但降低DAR会导致抗肿瘤活性的降低，所以需要对每个有效载荷类别的DAR进行微调，以平衡功效和毒性的重要性。另一种解决策略是插入如长聚乙二醇（PEG）等亲水性掩膜基团，这样可以构建高DAR的ADC，同时避免高疏水性的一些不必要的影响。连接子如图1b所示，连接子在使细胞毒性有效载荷保持附着在抗体上直到达到靶标方面起着关键作用。连接子分为两类：不可切割型和可切割型。不可切割的连接子由稳定的化学键组成，抵抗蛋白质水解降解，能在体循环中提供极好的稳定性，但这种ADC药物中，有效载荷的释放需要抗体的完全内吞和消化。相比之下，可切割连接子应用更广。可切割连接子能被肿瘤相关因子（如与大多数肿瘤或细胞内蛋白酶相关的酸性和/或还原条件）降解。这些连接子使有效载荷在内化到癌细胞后有效释放，从而产生细胞毒性，最大化ADC效力，并促进旁观者效应。但可切割的连接子存在有效载荷过早释放的风险，会导致系统毒性和有效载荷递送效率降低。因此，如何在稳定性和有效性之间取得平衡至关重要。同质性除了上面讨论的结构成分外，实现偶联的同质性也至关重要。如图1c所示，传统ADC多使用半胱氨酸-马来酰亚胺烷基化、赖氨酸-酰胺偶联来构建，但这些随机的偶联方法会得到有效载荷附着位点和DAR变化的ADC异质混合物。ADC的异质性通常导致有效载荷递送效率降低，因此需要严格控制生产，以尽量减少这种变化。目前已经有很多用于生成具有特定DAR的ADC的偶联技术，如链间二硫化合物的全烷基化（用于T-DXd和sacituzumab govitecan）、THIOMAB技术、非天然存在的活性氨基酸的结合、半胱氨酸再桥接、Fc亲和标签以及使用各种酶（如工程糖苷酶、谷氨酰胺转胺酶、甲酰基甘氨酸生成酶和分选酶）的位点特异性偶联。双特异性ADC如前所述，肿瘤异质性和耐药性会限制针对单靶点ADC的抗肿瘤活性。为了解决这一挑战，双特异性抗体作为一种能够同时结合两种不同的靶分子和/或细胞的方法出现了（图2）。图2. 代表性双特异性ADC双位ADC先前有研究表明，使用两种结合不同表位的抗HER2抗体可以导致内吞作用、溶酶体运输和靶受体的下调，所以研究人员假设，靶向HER2中两个不同表位的多价双异位ADC可能改善结合亲和力，提高有效载荷递送。为了验证这一假设，研究人员通过将曲珠单抗的单链可变片段与另一种抗HER2 IgG1抗体39S的N端融合，生成了四价HER2靶向ADC MEDI4276（图2a）。正如预期的那样，与曲妥珠单抗或亲本39S抗体相比，这种同质双异位ADC具有更快的内化动力学和溶酶体运输。尽管在临床前模型中具有高水平的活性，但在临床测试中MEDI4276并未表现出良好的疗效-安全性平衡。在乳腺癌患者中ORR较低（9.4%）。MEDI4276的最大耐受剂量（MTD）确定为每3周0.75mg/kg，但接受该剂量的12例患者中，有7例有一个或多个临床严重和/或3级以上不良事件。Zanidatamab zovodotin（也称为ZW49）是另一种双位HER2 ADC（图2a），与MEDI4276的四价结合不同，ZW49的不对称结构使HER2能够二价结合。尽管结合方式存在差异，但ZW49也能诱导HER2的受体聚集和快速内化。一项测试ZW49的I期剂量研究显示，ZW49具有可控的安全性，并且在大量预处理的患者中具有良好的抗肿瘤活性。靶向两种不同抗原的双特异性ADC双特异性ADC能同时靶向两种不同的抗原，具有多重优势：1）可以识别和杀死更广泛的肿瘤细胞，包括来自异质肿瘤的细胞；2）靶点合适的话，双特异性ADC具有更强的肿瘤特异性结合能力，可将健康组织中的毒性风险降至最低；3）多种抗原和/或细胞同时参与可能会产生协同效应。如图2b所示，研究人员创建了双特异性ADC AZD9592，可以靶向EGFR和MET（一种在肿瘤细胞表面优先与EGFR共表达的分子）。该药物在EGFR突变型和野生型NSCLC以及头颈部鳞状细胞癌的PDX模型中显示出良好的单药治疗，及与奥西替尼联合治疗的活性。而且AZD9592在猴子中耐受性良好。这些积极的临床前结果推动了其I期试验（NCT05647122）。M1231是另一种双特异性ADC，可靶向MUC1和EGFR，有效载荷是SC209。临床前数据表明，与单特异性二价ADC相比，PDX模型在非小细胞肺癌和食管鳞状细胞癌（ESCC）中的内化、溶酶体运输和治疗活性更强。此外，BL-B01D1是一款可靶向EGFR和HER3的四价双特异性ADC，有效载荷是喜树碱衍生物ED04，通过全半胱氨酸偶联连接，DAR为8，临床前评估证实了该化合物在胰腺或结直肠癌小鼠异种移植模型中的抗肿瘤活性，目前已进入III期临床。但是，双特异性ADC的应用也存在潜在的挑战。例如，两种靶抗原在不同肿瘤和患者中的表达比例可能有所不同，这可能增加了识别和选择潜在治疗响应者的复杂性。因此，对靶点的表位、结合方式及其潜在生物学特性的仔细评估对于双特异性ADC的有效治疗至关重要。这要求研究人员在开发双特异性ADC时综合考虑各种生物学和临床因素，以优化治疗策略。条件激活型抗体前药偶联物（PDC）传统ADC不仅靶向肿瘤细胞上表达的受体，也靶向某些健康组织的受体，导致了不可避免的靶外肿瘤毒性。PDC可以解决这个问题（图3），这一概念的灵感来自于与小分子药物的前药。PDC的前体抗体分子是IgG，它们要么在N端通过可裂解的间隔子与自我掩蔽（self-masking）基团融合，要么被设计为pH依赖性构象变化的抗原结合位点，从而降低了IgG的靶点结合亲和力。当到达肿瘤微环境时，这些抗体或通过移除自我掩蔽基团，或通过响应特定肿瘤相关因素（如蛋白酶丰度和酸性条件）而改变抗原结合位点的构象，从而在局部恢复其原始的靶点结合亲和力及有效载荷的释放。这种创新方法有望提高ADC的治疗指数。图3. 条件激活型抗体前药偶联物具有蛋白酶敏感自掩蔽基团的PDC一项研究显示，抗CD71-PDC CX-2029及其ADC等价物（都含了MMAE有效载荷，DAR~2）在各种实体瘤的小鼠异种移植模型中具有相当水平的抗肿瘤活性。PDC和其等效ADC在非人灵长类动物中的临床前MTDs分别为6和0.6mg/kg，说明掩蔽片段的引入使治疗指数提高了约10倍。基于这一理念，研究人员开发了几款first-in-class PDCs，包括CX-2051（I期临床）、praluzatamab ravtansine（II期临床）和CX-2029（I/II期临床）等。Praluzatamab ravtansine含有微管抑制剂DM4和抗CD166抗体。CD166在许多非恶性组织中广泛表达，因此为PDC提供了理想的靶点。临床I期研究中，由乳腺癌（46%）、上皮性卵巢癌（22%）和非小细胞肺癌（13%）组成的99例转移性实体肿瘤患者接受了praluzatamab ravtansine治疗，剂量≥4mg/kg时观察到肿瘤消退。CX-2029是一种具有MMAE有效载荷的抗CD71 PDC，目前正在进行I期临床试验，涉及各种晚期实体肿瘤患者，如NSCLC（20%）、HNSCC（18%）和结直肠癌（16%）。具有pH反应性抗原结合位点的PDC肿瘤组织（pH=6.0-6.8）通常比大多数健康组织（pH=7.3-7.4）略偏酸性。由于抗原结合位点的可逆构象变化，pH值的差异可用于使ADC有条件激活（图3b）。将弱碱性组氨酸残基结合到抗体的结合区域中是一种常见的赋予这种pH依赖性激活的方法。基于MMAE的EGFR靶向PDC HTI-1511是一个典型案例。HTI-1511亲本抗体在pH=6.0-6.5时对EGFR的结合亲和力比pH=7.4时高10倍以上。HTI-1511在食蟹猴中显示出高达8mg/kg剂量的良好耐受性，表明了潜在的临床安全性。总之，PDC平台在靶向抗原方面具有很大的前景，但使用PDC有效靶向的特定癌症亚型的种类仍需确定。免疫刺激ADC（ISAC）ISAC通过激活免疫系统来增强针对肿瘤的免疫反应。与携带细胞毒性有效载荷的传统ADC相比，ISAC具有以下潜在优势：1）ISAC介导的抗肿瘤反应能够针对多种与肿瘤相关的损伤相关分子模式（DAMPs）；2）ISAC介导的免疫刺激不仅能激活抗原呈递细胞，还可能激活其他肿瘤浸润免疫细胞，如T细胞；3）ISAC能够诱发贯穿整个细胞免疫反应的免疫记忆效应，从而提供持久的抗肿瘤效果，并减少复发风险。图4. 免疫刺激ADC具有TLR7/TLR8/TLR9激动剂有效载荷的ISAC在迄今为止确定的所有TLR中，TLR7、TLR8和TLR9是大多数ISAC的主要靶点，这些内体TLR的激活促进了APC对肿瘤相关DAMPs的呈现，通过激活先天和适应性免疫反应产生强大的抗肿瘤作用。2015年，研究人员公布了通过将TLR7激动剂与利妥昔单抗结合而开发的抗CD20 ISAC的活性，体外测试表明，结合不会损害利妥昔单抗的抗原结合能力或特异性，也不会损害激动剂的TLR刺激活性。这项早期研究为开发各种激活TLR7/8的ISAC铺平了道路。但HER2 TLR8 ISAC SBT6050的I期研究（NCT04460456）和I/II期研究（NCT05091528）中，细胞因子相关的不良事件最终导致了研究的终止。另一种靶向HER22的ISAC NJH395包含一种TLR7激动剂，通过不可切割的连接子与抗HER2抗体结合，已在I期试验中进行评估（NCT03696771）。但由于疗效不足等原因，该研究也在完成单次上升剂量部分后停止。另一款靶向HER2的ISAC BDC-1001是一种基于曲妥珠单抗的ISAC，通过不可切割的连接剂配备了TLR7/8激动剂（图4b）。BDC-1001目前正在I/II期试验中进行测试。与SBT6050和NJH395不同，BDC-1001显示出了有希望的初步结果。具有STING激动剂有效载荷的ISAC暴露于来自微生物病原体和/或垂死肿瘤细胞的外源DNA时，cGAS-cGAMP-STING通路会被激活，导致I型干扰素的产生和先天免疫的激活。研究表明，STING信号传导对于诱导T细胞介导的抗肿瘤免疫反应，以及T细胞浸润到TME至关重要。靶向EGFR的ISAC将cGAMP类似物IMSA172偶联到抗EGFR抗体上，这些ISAC在EGFR表达的小鼠异种移植模型中具有良好的耐受性，每隔3天给药3次，剂量为200μg（约8-10mg/kg），抗肿瘤活性较好。这些ISAC的抗肿瘤活性通过与抗PD-L1抗体联合进一步增强。总之，ISAC所提供的多模式抗肿瘤免疫作用展现了减少获得性抗药性风险和/或推迟其发生的潜力。基于其独特的作用方式，ISAC有望成为在癌症治疗中应对复杂免疫环境的有力工具。蛋白质降解ADC（DAC）DAC利用细胞内的蛋白降解机制来靶向特定蛋白质，为癌症治疗提供了一种创新的提效方法，其设计理念源自于PROTAC技术。PROTACs是由两种配体通过连接子相连的异双功能分子，其中一个配体靶向特定的目标蛋白，另一个配体则结合E3泛素连接酶。与传统的抑制剂不同，这些配体与目标蛋白的结合不需要具有拮抗活性。这样的设计使得一些之前被认为是“不可成药”的蛋白质成为可能的治疗靶点。图5. 蛋白质降解ADCGNE-987是一款BET-PROTAC，由BRD4配体和VHL配体组成，在EOL-1细胞中表现出对BRD4的有效降解（DC50=0.03nM），在两个细胞系中表现出优异的体外效力（EOL-1中IC50=0.02nM，HL-60中IC50=0.03nM），但药物代谢和药代动力学导致其在体内模型中无效。为了解决这一问题，研究人员将GNE-987的羟基与6个半胱氨酸连接到抗CLL1抗体中，使用不稳定的碳酸盐连接，将GNE-987转化为均质DAC（图5b）。数据显示，在皮下移植的HL-60和EOL-1 AML小鼠模型中，单次静脉给药10mg/kg的DAC能够持续在体内暴露，并显著抑制肿瘤生长。除BRD4外，雌激素受体-α（ERα）、TGFβ受体2和染色质调节蛋白SMARCA2（也称为BRM）也被广泛应用为DAC的靶点。然而，DAC面临的挑战在于其有效载荷通常具有较高的疏水性，导致整体结构过度疏水。为了确保足够的细胞毒性，可能需要较高的药物抗体比（DAR），这会进一步加剧其疏水性，从而对这些药物的药代动力学和毒性特性产生不良影响。因此，开发新型连接子设计和改良降解剂分子以解决这些问题，可能会大大改善DAC在癌症治疗中的应用潜力。双药ADC双药ADC通过整合两种不同的有效载荷，联合多种细胞毒性药物的作用机制，来应对肿瘤的耐药性和异质性问题。这种策略可能对异质性肿瘤细胞群和耐药性克隆表现出增强的活性。双药ADC作为一种单一疗法，有可能产生协同效应，同时通过简化的给药方案，克服对治疗不敏感的肿瘤患者的抗药性。图6. 双药ADC研究人员首先假设使用两种有效载荷（MMAE和MMAF）同时递送会增强和协同活性，实验表明，这种双药ADC在表达CD30耐多药的间变性大细胞淋巴瘤（ALCL）的小鼠异种移植模型中显示出强大的活性，导致5只小鼠中的3只完全根除癌细胞。相比之下，DAR为8的、仅MMAF的ADC活性较低，仅在5只小鼠中有1只小鼠中根除了所有癌细胞，而等效的仅MMAE的ADC完全没有抗肿瘤活性。在具有异质CD30表达的小鼠霍奇金淋巴瘤异种移植模型中，双药ADC和仅MMAE的ADC都能完全抑制肿瘤生长，这可能是由于MMAE介导的旁观者细胞杀伤。相反，仅MMAF的等效ADC仅赋予肿瘤生长适度延迟。虽然双药ADC在克服肿瘤的异质性和抗药性方面显示出潜在的优势，但也必须警惕其可能引发的协同毒性。为此，研究人员已开发出多种正交偶联策略，以制造出具有高均一性和明确药物抗体比的双药ADC。这些策略不仅确保了两种有效载荷的有效整合，而且优化了它们的共同作用，以最大化治疗效果并减少不良反应。参考资料：Kyoji Tsuchikama et al. Exploring the next generation of antibody–drug conjugates. Nature Reviews Clinical Oncology（2024）ADC是2023年中国创新药最炙手可热的赛道，license out交易频出并不断刷新记录，为时下略显低迷的创新药行业注入了资金和信心。这种热度能够持续多久？ADC企业的竞争力在哪？医药魔方3月28日举办的2024医药投融资交易大会暨第二届医药魔方TOP15榜单发布大会将会有ADC投资交易相关话题讨论，敬请关注！Copyright © 2024 PHARMCUBE. All Rights Reserved.欢迎转发分享及合理引用，引用时请在显要位置标明文章来源；如需转载，请给微信公众号后台留言或发送消息，并注明公众号名称及ID。免责申明：本微信文章中的信息仅供一般参考之用，不可直接作为决策内容，医药魔方不对任何主体因使用本文内容而导致的任何损失承担责任。

为打造全球ADC/RDC未来产业高地，成都医学城拟于2024年4月18日-19日举办首届未来XDC新药大会！大会以“共创偶联药物产业未来”为主题，由同写意策划，安排一场主论坛和九场主题论坛，邀请“政、产、学、研、金、媒”各领域专家，通过“成果发布、主题演讲、热点对话、表彰颁奖、展览展示”五位一体的多元化的组织形式，迸发更多XDC产业新科技、新业态、新模式，构建XDC产业全新生态，触摸医药产业未来脉动。在这个资源稀缺的世界，身处一场激烈的竞争，那些充满实力与野心的角逐者，他们无所不用其极，争夺着有限的资源。他们不断加码，以惊人的代价去追逐那些不变的资源，这场残酷的战斗，我们称之为“内卷”。然而，破解这个困局的关键并不在于我们如何更拼命地去争夺，而是在于如何创造新的增量资源。过去一年，ADC领域就如同一幅繁华似锦的画卷，为我们展示了无限的可能性和希望。这不仅是一个创新的突破，更是我们走出“内卷”的一个契机。ADC的下一波机会在哪里？下一波增量在哪里？接下来会通过几篇文章来简单分析，希望对大家有帮助！1ADC的挑战是什么？机遇是什么？ADC药物通过选择性地将高毒性药物输送到肿瘤部位，理论上可实现高效、低毒性的对肿瘤细胞的杀伤。然而，ADC药物的发展仍需要药物设计研究来解决诸如耐药、肿瘤异质性和不良反应等挑战。几种新兴的ADC结构包括双特异性ADCs、条件活性ADCs（也称为前体-药物ADC）、免疫刺激ADCs、蛋白降解ADCs和双药ADCs等为解决ADC药物的挑战提供了新的视角。如，前体-药物ADC可以增强肿瘤特异性，而双特异性ADCs和双药ADCs可以通过增强活性来应对肿瘤耐药和异质性。图注：ADC药物结构示意图。ADC的结构包括单克隆抗体和通过化学linker连接的细胞毒药物（毒素），这种设计把抗体的靶向性和长半衰期与抗细胞毒药物的高细胞毒性相结合。ADC荷载的细胞毒药物比传统的化疗药物毒性要强，因此，具有增强的抗肿瘤效力，从而改善临床获益。目前，FDA已经批准了11种ADC药物，涵盖了至少20种特定适应症，最近3年内FDA批准了四种新的ADCs，并且目前有100多种不同的ADCs正处于临床试验中。图注：FDA批准的ADC药物鉴于ADC的优良基因，市场对其的兴趣水平在呈指数级增长，market.us数据显示ADCs全球市场规模正在迅速增长，2022年达到72亿美元，预计2023年至2032年的复合年增长率为17.5%。图注：ADC的全球市场规模（数据：market.us）肿瘤异质性引起的ADC耐药是限制ADC疗效的主要因素。肿瘤的异质性指肿瘤内或不同患者存在的肿瘤间的遗传和表型特征的可变性，这两者都可能导致ADC耐药肿瘤的出现。ADC治疗也可能会产生耐药克隆的选择性压力，这些克隆具有特定的特征，包括药物代谢的改变，靶蛋白或其下游信号通路的突变，替代信号通路的激活以及癌症干细胞的形成等。图注：肿瘤异质性以及药物对肿瘤异质性的选择压力示意图除肿瘤异质性外，ADC的另一个重要限制因素是临床的药物耐受性，许多ADC药物在初步批准后因不可接受的毒性和/或过窄的治疗窗口而被撤回，包括2010年FDA批准的CD33+急性髓样白血病（AML）ADC gemtuzumab ozogamicin，不过该药物在2017年以较低剂量重新获批。即使已被证明对大多数患者具有明显临床益处的成功ADC，也可能伴随着某些毒性风险，如接受三杂环霉素二甲胺（T-DXd）的患者出现的间质性肺疾病和肺炎。图注：gemtuzumab ozogamicin的审批时间表2抗体和靶点选择人源化和全人源IgG最常被用作ADC的抗体。某些ADC涉及IgG4亚类的抗体（如吉罗单抗和依诺单抗），不过IgG1抗体现在更受青睐，其在系统循环中更稳定性（14-21天的半衰期）及通过与Fcγ受体（FcγRs）作用而引起先天免疫细胞（如NK细胞和巨噬细胞）的免疫作用。使用人源IgG1还有助于减少ADC的免疫原性，从而降低抗药抗体（ADAs）的形成。图注：不同分型的IgG特点以及在ADC中的应用。IgG1和IgG4是两个被使用的抗体分型，其中IgG1使用的频率更高。仅在肿瘤表达而在正常组织中不表达的靶点，可以实现药物的肿瘤特异输送。然而，大多数ADC靶点，包括已成功的靶点（如HER2和TROP2），在某种程度上也会在正常组织表达，因此，仍然可能出现靶点依赖和非靶点依赖的毒性反应，这可能导致临床暂停甚至早期测试的中止。为了进一步增强ADC的肿瘤特异性，可以对抗体结构进行修饰，例如截短、剪切（由肿瘤相关蛋白酶引起的肽键切割）和其他独特的翻译后修饰（例如EGFR变体III、剪切的TROP2和糖基化的PD-L1）。除了抗原表达谱外，ADC的内化和turnover rate对疗效也具有重要意义。优化亲和力也是优化ADC疗效的关键步骤。矛盾的是，过强的抗原结合可能导致ADC分子滞留在肿瘤组织表层，限制其组织渗透（这种现象被称为结合位点屏障效应）。因此，ADC的抗体骨架必须经过慎重选择，考虑这些各种参数，以确保最佳性能。图注：结合位点屏障效应示意图。结合力强的ADC（上图绿色抗体），其组织的渗透深度受限，结合力适中的ADC（下），具备合理的组织渗透能力。3毒素的选择（荷载或细胞毒药物）ADCs的荷载通常比常规化疗药物毒性更大，活性通常为nM甚至pM级别，而常见化疗药物的活性水平通常为uM级别。FDA批准的ADCs的荷载包括抗有丝分裂剂，如单甲基金星素E（MMAE）、单甲基金星素F（MMAF）和马丹霉素衍生物DM1和DM4，DNA损伤剂，如卡利基霉素和吡咯苯并二氮杂二环己烷二聚体（PBDs），以及拓扑异构酶I抑制剂，如SN-38和DXd。图注：常见ADC荷载及作用机制处于临床前和临床研究中的ADCs还包括其他荷载，管花碱素（抗有丝分裂剂）、二聚氨基甲酸酰胺（DNA烷化剂）、PNU-159682（拓扑异构酶II抑制剂）和鹿曼西汀（RNA聚合酶II抑制剂）。除了这些细胞毒性荷载外，免疫调节剂和蛋白降解招募分子也作为有前途的新型荷载出现。图注：ADC毒素的发展历程大多数ADC毒素具有一定的疏水性，可以从表达靶细胞扩散到靶点表达少甚至不表达靶蛋白的相邻细胞，这对根除异质性肿瘤至关重要，这种现象被称为旁观者效应。图注：ADC的“旁观者效应”示意图。靶细胞附近的细胞，看热闹的时候被“躺枪”消灭，这些靶细胞附近的细胞通常是肿瘤异质性细胞的窝点，ADC通过这种效应起到了斩草除根的效果。但毒素的疏水性也可能对ADC产生负面影响。首先，疏水性毒素是多药耐药蛋白（如MDR1、MRP1和BCRP）的良好底物，降低对表达这些转运蛋白的肿瘤的某些ADC的效力。第二，疏水性毒素容易形成聚集，聚集体导致被迅速从体内清除，并可能具有免疫原性。第三，过度的疏水性已被证明有助于肝脏摄取并引起肝毒性。ADC的疏水性也是促进非特异性摄取通过巨噬细胞吞噬作用的因素，这可能导致眼部毒性和血小板减少症。因此，微调荷载物和ADC的疏水性对于克服这些问题至关重要，同时确保旁观者杀伤的潜力得以保留。解决这个问题的一种方法是降低毒素的数量（抗体-药物比(DAR)）。然而，降低DAR意味着抗肿瘤活性的降低。安装疏水性掩蔽基团，如长链聚乙二醇（PEG）或聚糜氨酸，也是一种解决方法，避免高疏水性不良影响的同时构建高DAR的ADC。图注：ADC的DAR设计4新型的LinkerLinker是链接毒素和抗体的结构，常用的类型有两种：不可切割型和可切割型。不可切割Linker由稳定化学键组成，能抵抗蛋白水解，从而在体内具有良好的稳定性。不可切割Linker结合的毒素的释放需要内吞作用和抗体氨基酸残基的酶切，这一过程通过细胞溶质体和溶酶体蛋白酶来实现。目前ADCs中首选的可切割Linker，主要由二硫键连接和半胱氨酸酶敏感的缬氨酰-精氨酰二肽链接，可以被肿瘤相关因子降解，在内吞进入细胞时释放活性荷载物，从而最大限度地提高ADC的效力和旁观者效应。然而，可切割Linker存在过早释放毒素的风险，导致全身毒性和药物递效率降低。图注：不可切割和可切割Linker的化学结构示意图。不可切割Linker在细胞内释放后仍保持和毒素的链接，可切割Linker能在酸性pH、还原环境、肿瘤细胞或肿瘤微环境中存在的酶介导下有效释放连接的毒素。因此，科学的设计Linker，以稳定性和效力间取得平衡至关重要。过去十年的研究工作集中于开发更稳定的可切割Linker，如T-DXd中使用的GGFG四肽连接剂，半胱氨酸响应性三肽连接剂，以及β-葡萄糖苷酶、硫酸酶、磷酸酶和豆腐蛋白酶降解的连接剂。5如何搞定链接位点的均一性（CMC的均一）？ADC常采用半胱氨酸-马来酰亚胺烷基化或少见的赖氨酸-酰胺偶联来构建，这些随机共轭会导致ADC具有不同的毒素附着位点和DAR，导致CMC不均一。进而导致毒素递送效率低，疏水性和高DAR的成分会迅速被清除异。为克服这些限制，药物科学家开发了许多方法如：全烷基化的亚链间二硫键（用于T-DXd和sacituzumab govitecan）、THIOMAB80（一种涉及基因组中的半胱氨酸残基的共轭方法）、非自然出现的反应性氨基酸的合并、半胱氨酸重桥、Fc亲和标签及使用各种酶的定位共轭（如工程的糖苷酶、转麦角胺酶、甲酰甘氨酸生成酶和分泌酶）等。图注：链接位点异质（左侧）和均质的ADC（右侧）示意图。通过赖氨酸偶联或部分半胱氨酸烷基化的随机结合，导致具有可变药物结合位点与抗体比率（DAR）的异质ADC。通过完全烷基化亚链二硫键（在特拉斯珠单抗德鲁西汀和萨曲珠单抗生产中使用）或通过半胱氨酸工程技术进行特异性结合的均质ADC具有确定的DAR。6双特异性抗体ADC（Bispecific ADCs），是未来？单靶点ADC受肿瘤异质性和耐药的限制，双特异抗体是解决问题的方法之一。双特异性ADC常用的是基于人IgG1的骨架，主要分两类：一是针对同一抗原不同表位的双特异性ADC；另一种是针对不同抗原的双特异性ADCs。研究表明，结合到同一抗原的不同抗原表位的两种抗HER2抗体可以诱导在细胞表面形成大量受体-抗体簇，导致内吞作用、溶酶体转运并降低靶点表达。基于这一假设，如果ADC能够在HER2内部靶向两个不同的表位，可能提高ADC的结合亲和力，引起更有效的药物递送，特别是对于HER2低表达的癌细胞群体。图注：Zanidatamab结合HER2的两个位点，细胞表面抗体饱和度增加约1.5倍，并导致受体交联。由Zanidatamab介导的大型细胞表面HER2簇促进C1q结合，可能通过促进六聚体化，在HER2高表达的细胞系中引发强效CDC。在所有表达HER2的细胞中，包括低表达的肿瘤中，也观察到ADCC和ADCP活性。此外，大型受体簇导致受体内化和降解增加。总体，这些机制有助于Zanidatamab在体外和体内对肿瘤细胞的杀伤。为了验证这一假设，研究人员通过将Trastuzumab的scFv与另一种抗HER2 IgG1抗体的N-末端融合，生成了一个四价的靶向HER2的ADC，命名为MEDI4276。随后，用稳定连接方法，DAR为4，位点特异性的结合方法，将一个抗有低皮摩尔级别活性的抗有丝分裂作用的图布林类衍生物（AZ13599185）与这个结构进行偶联，药物代号MEDI4276。MEDI4276在小鼠异种移植模型中表现出显著活性，但在临床测试中，并未表现出良好的疗效-安全性平衡。乳腺癌患者中，总体反应率（ORR）较低（9.4％，32名患者中的3名），与T-DXd（在另一项研究中，HER2低表达晚期乳腺癌患者的ORR为37％）相比并不理想。MEDI4276的最大耐受剂量（MTD）确定为每3周0.75 mg/kg。图注：MED14276和ZW49结构示意图另一种双特异性结合HER2的ADC药物为zanidatamab zovodotin（也称ZW49）。ZW49由异源二聚化的Fc区域与靶向HER2 ECD4的scFv以及靶向同一蛋白质的ECD2的Fab组成，与平均DAR为2的auristatin载体结合。ZW49也能诱导受体聚集和快速内化HER2。在一项测试ZW49的I期剂量确定研究中，建立了每3周2.5mg/kg的推荐II期剂量（RP2D），这与其他基于auristatin的ADCs的RP2D相当。在接受该剂量方案下ZW49的29名可评估疗效的患者中，多种HER2+晚期癌症类型的确证ORR为28%，疾病控制率为72%。只有9%的患者出现了≥3级的与治疗相关的不良事件（TRAEs），另有三名患者出现临床严重事件。这些结果表明ZW49在经过重度治疗的患者中具有可控的安全性和有前景的抗肿瘤活性。图注：三种不同的双靶点ADC双特异性ADC同时靶向两种不同抗原具有多重优势。首先，可以识别并杀死更广表型的肿瘤细胞，包括异质性肿瘤细胞。其次，由于正常细胞仅有限同时表达两种靶抗原，从而最小化脱靶的毒性风险。此外，同时作用于多种抗原和/或细胞可引发一种协同效应。AZD9592，是一种配备拓扑异构酶I抑制剂荷载的EGFR-MET双特异ADC。该药物在EGFR突变型和野生型非小细胞肺癌（NSCLC）以及头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）的PDX模型中作为单药或与奥西美替尼联合应用显示出有前途的活性。重要的是，AZD9592在猴子身上耐受良好。目前该药物正处于I期临床试验(NCT05647122)。M1231是一种MUC1-EGFR靶向的双特异性ADC，由一种具有抗-MUC1单链抗体和抗-EGFR Fab结构域的异源二聚体抗体构建而成。偶联毒素为SC209，是一种具有抗微管活性的半阿斯特林衍生物，通过可切割的缬氨酸-精氨酸连接物偶联。在非小细胞肺癌和食管鳞状细胞癌（ESCC）的PDX模型中，与单特异性二价ADC相比，M1231表现出更好的内化、溶酶体转运和改善的治疗活性。一项用于评估M1231的安全性、药代动力学和初步疗效的I期递增剂量研究（NCT04695847）据称已于2023年6月完成，但详细结果目前尚未公开披露。另一个例子是BL-B01D1，这是一种靶向EGFR和HER3的四价双特异性ADC。该结构特点是一种名为ED04的紫杉醇衍生物药物载体，通过全半胱氨酸偶联，并且其DAR为8。临床前评估证实了该化合物在胰腺癌或结肠癌的小鼠移植瘤模型中的抗肿瘤活性。目前，I期临床试验已经启动，旨在测试该药物对于不能手术切除的局部晚期或转移性实体肿瘤患者的疗效，包括胃肠道和乳腺癌（NCT05262491）。总之，双特异性ADC能够靶向更广泛的抗原，具有更高的活性和安全性。然而，也存在潜在的风险，例如意外受体激活和激动的风险。7前药ADC（Probody-drug conjugate，PDC）ADC的靶点不仅在肿瘤细胞上表达，而且在正常组织上表达，这会导致ADCs不可避免的脱靶毒性，导致临床减少剂量或中断治疗。为了解决这个问题，开发了具有条件活性的抗体（通常称为Probodies）的新型ADC设计。这种概念受到小分子的前药的启发，其中毒素以非活性形式递送体内，然后在循环或某些器官中代谢为其活性形式，从而提高体内稳定性和/或特异性。Probodies是IgG分子，其N端通过可切割的Spacer与自掩蔽基团融合，或者设计在pH依赖的构象变化下，降低了IgG的靶标结合亲和力。当到达肿瘤微环境（TME）时，掩蔽基团被去除或者抗原结合位点因蛋白酶的丰度和酸性条件的影响而发生构象变化，导致抗体的亲和力和荷载释放的局部恢复。8PDC：蛋白酶敏感的自遮蔽基团在一项早期研究中，研究人员确定了一个可被多种蛋白酶敏感的可裂解肽序列（LSGRSDNH），这些蛋白酶在非恶性组织中活性较低，但在各种人类癌症的肿瘤微环境中表达上调。通过利用该序列作为掩蔽，动物实验结果表明，引入遮蔽基团增加了约十倍的治疗指数。利用这一创新，这些研究人员已经开发出多个首创的PDC，目前处于临床前阶段（CX-2051）和praluzatamab ravtansine（前称为CX-2009）NCT03149549和NCT04596150以及CX-2029（NCT03543813）。图注：Praluzatamab ravtansine的结构和机制图示Praluzatamab ravtansine是一种携带微管抑制剂DM4的抗CD166 PDC。CD166在许多非恶性组织中广泛表达，因此为PDC方法提供了理想的靶点。在一项I期研究中，99名转移性实体瘤患者，包括乳腺癌（46%）、上皮性卵巢癌（22%）和非小细胞肺癌（13%），接受了praluzatamab ravtansine。在每剂≥4 mg/kg的剂量下观察到肿瘤缩小。在HR+、HER2-非扩增型乳腺癌患者中，观察到两例部分缓解（占9%的队列），另有十名患者（45%）出现稳定病情。三名三阴性乳腺癌患者报告了未经证实的部分缓解（30%）。在每3周8 mg/kg和每2周6 mg/kg的剂量下观察到限制剂毒性，如角膜炎（9%的患者）、血清天冬氨酸氨基转移酶升高（8%）和丙氨酸氨基转移酶升高（5%），以及贫血（5%），因此选择了每3周7 mg/kg的RP2D。图注：CX-2029结构示意图CX-2029是一种携带MMAE药物的抗CD71 PDC，目前正在进行I期试验，涉及各种晚期实体瘤患者，如非小细胞肺癌（20%）、头颈部鳞状细胞癌（18%）和结肠直肠癌（16%）。在接受CX-2029治疗的45名患者中，有16名患者观察到相关的抗肿瘤活性（3名部分反应和13名患者病情稳定）；每3周3毫克/千克被选为RP2D。这种PDC设计的临床效用将完全由正在进行的临床试验中入组患者的结果阐明。图注：人亮氨酸拉链异二聚螺旋卷曲作为空间遮挡基团，作用示意图。此类PDC开发面临的主要挑战之一是对自掩蔽肽序列进行广泛筛选和优化。目前有研究人员报道了一种更通用的结构，该结构使用人亮氨酸拉链异源二聚螺旋卷曲结构域作为空间遮挡基团。这种刚性肽结构与抗体的轻链和重链的N末端通过基质金属蛋白酶（MMP）可切割肽序列融合在一起，从而在空间上抑制抗体与靶标的结合。研究人员证明了这项技术对肿瘤特异性激活的普遍适用性。经过相同阻断单元工程化的hBu12（抗CD19）、利妥昔单抗（抗CD20）、曲妥珠单抗（抗HER2）、h15H3（抗整合素αVβ6）和145-2C11（抗小鼠CD3）抗体在体外表现出对其靶抗原的最小结合（浓度高达2μM），但在MMP的引入和随后的遮挡结构域裂解后重新获得80-至1000倍的更大结合亲和力。在同一研究中，有条件遮挡的hBU12、h15H3和145-2C11 PDC在异种移植模型中表现出改善的循环半衰期和更强的抗肿瘤活性，与其未遮挡的等效物相比。9PDC：pH敏感的抗原结合位点肿瘤微环境(TME)(pH 6.0-6.8)通常比正常组织(pH 7.3-7.4)偏酸性，这种pH差异可用于ADC的有条件激活，将弱碱性组氨酸组合到抗体的结合区域是这种pH依赖性激活的常见方法。图注：对pH或负电离浓度变化做出反应的PDCs。对于依赖于pH的PDCs，失活的Fab区域内的组氨酸残基在温和酸性的肿瘤微环境中变为质子化状态，但在生理条件下保持未质子化状态，从而通过构象改变促使抗原结合。对于使用蛋白质相关化学开关（PaCS）的PDCs，Fab区域和抗原表位被氯化物、碳酸氢根和硫化物等负电离阻断（阻塞）在与生理pH相关的浓度下。由于这些离子中的一些被中和，这些基团在肿瘤微环境中暴露出来，从而重新激活靶向结合。已开发的各种pH依赖性ADC中(包括靶向EGFR、HER2、AXL175和ROR2)。其中，基于MMAE的EGFR靶向PDC HTI-1511表现出了积极的临床前数据。HTI-1511的母抗体在pH 6.0-6.5时与EGFR的结合亲和力比在pH 7.4时高出十倍以上，在EGFR表达的A431异种移植瘤中保持了与cetuximab172相当的结合亲和力。还在cetuximab耐药的PDX模型和携带KRAS或BRAF突变的模型中显著抑制甚至逆转了肿瘤生长。在恒河猴体内，HTI-1511在最高8mg/kg的剂量下显示出良好的耐受性，表明具有良好的临床安全性。不过自2018年以来，HTI-1511的临床开发似乎没有取得进展。这可能归因于一系列因素，包括EGFR ADC领域的潜在竞争、在生产和规模化过程中出现的意想不到的技术挑战，或者是公司在新兴数据或市场考虑下发展重点的战略转变。作为PDC能够响应TME的另一个例子，研究人员基于一种称为蛋白质相关化学开关pac的机制开发了pH依赖的PDC。基于pac的PDC中的互补性决定区域被设计为能够与丰富的离子相互作用，包括氯化钠、碳酸氢盐和硫化氢。在pH值~7.4时，这些分子的负电荷形式以足够的浓度存在，通过与带正电荷的互补决定区域相互作用来抑制抗原结合。然而，在酸性越强的TME中，这些离子的浓度越低，从而使靶结合的离子浓度依赖性激活成为可能。10ADC偶联TLR激动剂肿瘤细胞通过释放损伤相关分子模式（DAMPs），DAMPs与模式识别受体（PRRs）相互作用，激活先天免疫并引发抗肿瘤炎症反应。Toll样受体（TLRs）和干扰素基因激活剂（STING），这些先天免疫激活剂，可以促进先天免疫激活及抗肿瘤免疫应答。但这类药物作用的靶点非常广泛，如果全身给药可能会引起免疫系统过度活化而导致严重不良反应，因此常通过瘤内注射给药。目前，TLR和STING激动剂都尚未获批，临床试验疗效也不尽如人意。不过，这却成了ADC药物的用武之地，通过偶联这些激动剂，ADC可以靶向的递送到肿瘤细胞。图注：ADC偶联先天免疫激动剂示意图TLR7、TLR8和TLR9是这类ADC开发的的主要靶点，这些TLR都是抗原递呈细胞胞内的PRR，肿瘤激活这些内体TLR，促进APC呈递肿瘤相关DAMPs，从而通过激活先天和适应性免疫应答产生强大的抗肿瘤效应。图注：曲妥珠-T785 ADC结构示意图研究人员把T785（TLR7-TLR8双激动剂），CL264（TLR7特异性激动剂）与抗HER2抗体曲妥珠单抗通过不可切割Linker结合，得到平均DAR约为2的HER2靶向ADC。在5mg/kg的单剂或多剂下，对HER2+乳腺癌小鼠移植模型具有中等至高的抗肿瘤活性，同时伴有髓样细胞激活和细胞因子释放。使用抗大鼠HER2抗体构建的ADC在每5天以5-10mg/kg的剂量给药后，几乎完全抑制了同种小鼠模型中肿瘤生长。此外，接受治疗的小鼠在再次挑战具有HER2-形式的母源肿瘤细胞系后，能够免受肿瘤再生的影响。这一结果表明，不仅对HER2存在强大的免疫记忆，而且对其他DAMPs也存在免疫记忆。图注：曲妥珠-T785 ADC动物实验结果SBT6050通过可切割Linker把抗HER2帕妥珠单抗和TLR8激动剂偶联。该药I期研究（NCT04460456）作为单药疗法及与抗PD-1帕博利珠单抗或塞米利珠单抗联合使用，并在I/II期研究（NCT05091528）中与其他HER2靶向疗法联合使用。然而，该试验中出现的细胞因子相关的不良事件限制了能够与帕博利珠单抗联合使用的剂量范围。图注：SBT6050作用机制另一种靶向HER2的ADC，NJH395，通过不可切割Linker把TLR7激动剂与抗HER2抗体结合。在I期试验（NCT03696771）中，由于疗效不足及TRAEs的普遍发生和所有患者产生ADA形成，研究中止。BDC-1001是一种基于曲妥珠单抗，通过不可切割Linker与TLR7/8激动剂结合的药物。BDC-1001正在晚期HER2+实体瘤患者进行I/II期试验，单药或与抗PD-1抗体nivolumab联合使用。BDC-1001与pertuzumab联合的II期试验也正在进行中（NCT05954143）。与SBT6050和NJH395不同，BDC-1001的结果较理想：所有测试的剂量水平（0.15-20 mg/kg），临床上严重的毒副作用很少，且没有ADA形成。图注：BDC-1001结构示意图其他研究使用THIOMAB技术将双功能免疫调节剂D18与抗PD-L1抗体结合，这种ADC通过TLR7/8激活诱导了强有力的抗肿瘤免疫反应，在小鼠同种移植模型中显著抑制了肿瘤生长。TLR7激动剂结合的抗HER2的ADC在小鼠异种移植模型中杀灭了肿瘤。图注：TAC-001结构示意图TAC-001是一种抗CD22抗体，携带合成的CpG寡核苷酸荷载物（一种强效的TLR9激动剂，DAR为1），通过静脉注射给药。TAC-001将荷载物输送至CD22+的B细胞，从而启动TLR9信号、B细胞激活和一系列免疫反应。还会激活其他表达TLR9的免疫细胞，包括树突状细胞和单核细胞。临床前研究数据表明，间隔3天给予两次10mg/kg的剂量可显著抑制肿瘤生长，并在多个同种移植肿瘤模型中产生记忆反应，该药物目前正在进行II期试验，涉及各种晚期实体瘤患者（NCT05399654）。11ADC偶联STING 激动剂cGAS-cGAMP-STING通路可识别外源DNA（微生物病原体或死亡肿瘤细胞）激活，导致I型干扰素的分泌和先天免疫的激活。STING信号对于诱导T细胞介导的抗肿瘤免疫至关重要，也对T细胞浸润肿瘤微环境产生影响。图注：STING信号通路XMT-2056是一种携带非cGAMP类STING激动剂的ADC，在HER2+小鼠异种移植瘤模型及大鼠HER2表达亚系建立的小鼠同基因模型中，均表现出持久和完全的肿瘤杀伤效果。当与曲妥珠单抗、帕妥珠单抗、T-DXd或抗PD-1抗体联合给药时，XMT-2056显示出进一步增强的疗效。XMT-2056目前正在进行I期研究，入组晚期或复发的HER2表达实体瘤患者（NCT05514717）。不幸的是，在剂量递增研究中一名患者在注射X后发生了致命的（5级）与药物相关的不良事件，导致2023年3月临床暂停。研究人员降低起始剂量后，FDA在2023年10月解除了这一暂停。图注：XMT-2056结构及体内数据12ADC偶练PROTACPROTAC由两个配体连接而成。一个配体靶向靶蛋白，另一个配体与E3泛素连接酶结合，这种分子设计使得PROTAC能够同时结合靶蛋白和E3连接酶，触发有针对性的泛素化，随后通过蛋白酶体降解。ADC和PROTAC的偶联，基于抗体的靶向性，进一步推动PROTAC药物的临床应用。图注：ADC偶联PROTAC示意图BET蛋白，特别是含有溴结构域的蛋白4（BRD4），在不同肿瘤乙酰化组蛋白的表观遗传调控中起着至关重要的作用。GNE-987由BRD4的配体和一种VHL诱导分子组成，在EOL-1细胞中表现出对BRD4的有效降解（DC50为0.03 nM），然而由于药代动力学特性不佳，在体内模型中表现不佳。为解决这一问题，研究人员将GNE-987的羟基通过不稳定碳酸酯键连结到抗CLL1抗体中的六个半胱氨酸基因上，转化成ADC。以10 mg/kg的剂量进行单次静脉注射后，实现了持续的体内暴露，并显著抑制了小鼠皮下移植模型中的肿瘤生长。图注：抗CLL1抗体-GNE987 ADC结构图研究人员将CC-885衍生物与抗HER2抗体帕珥珠单抗结合，使用缬氨酸-精氨酸连接剂，结果得到一个DAR为4的产物。这种靶向HER2点的ADC被命名为ORM-5029，其体外细胞毒性比其他GSPT1降解物和传统的ADC（包括T-DM1和T-DXd）高出100到1,000倍。在MDA-MB-453小鼠异种移植瘤模型中，ORM-5029的单次10mg/kg剂量的抑肿瘤效果，与等效剂量的T-DXd相当。正在进行一项测试ORM-5029用于晚期HER2+实体瘤患者的I期临床试验（NCT05511844）。这项研究的结果将对评估这一新型ADC类别的临床潜力至关重要。图注：ORM-5029结构示意图同一家公司开发了一种针对AML患者的CD33靶向ADC，名为ORM-6151。在AML的MV4-11皮下小鼠异种移植模型中，单剂3mg/kg可完全清除所有肿瘤细胞。值得注意的是，即使是0.1 mg/kg的单剂量也显示出对MV4-11异种移植模型的广泛版本具有有效的疾病控制作用。图注：ORM-6151作用机制除了用于降解特定细胞质蛋白外，还有研究者开发了定向细胞表面蛋白降解剂，包括基于抗体的PROTACs（AbTACs）、蛋白降解靶向抗体（PROTABs）和溶酶体靶向嵌合体（LYTACs）。AbTACs和PROTABs是异源二特异抗体，包括一个细胞表面POI识别区（识别PD-L1）、IGF1R245和HER2等靶标）和一个识别跨膜E3泛素连接酶蛋白的区域，如RNF43或ZNRF3。LYTACs包括一个识别细胞表面POI的抗体，与溶酶体相关膜蛋白（如寡聚甘露醛6-磷酸或三聚N-乙酰半乳糖）相互作用，结合到能促进溶酶体降解抗体-靶蛋白复合物的配体。总之，抗体导向的蛋白质降解剂是具有开创性技术的，有潜力为癌症患者提供独特的治疗干预手段。然而，大多数这些实体仍处于早期临床前阶段的开发中，需要进一步进行药物化学研究和其他临床前评估，以确定安全且有效的结合物进入临床测试阶段。13ADC偶连多种毒素大多实体瘤由不同基因表达谱、药物敏感水平不一的癌细胞亚群组成。因此，依赖单药进行化疗可能会有选择压力，使不敏感的癌细胞亚群被筛选，导致复发和耐药。因此，临床常采用多药组合的化疗方案。对ADC药物来说，同一抗体欧联多种不同毒素，是一种行之有效的，在克服肿瘤异质性和抗药性方面具有优势的设计。图注：偶联多种毒素的ADC设计通过顺序耦合毒素，研究人员将MMAE和MMAF共轭到抗CD30抗体上，DAR为16（每个抗体8个MMAE和8个MMAF）。MMAE作为多药耐药（MDR）转运蛋白的底物，对MDR+肿瘤细胞的活性减弱，但这种毒素的疏水性质使其具有高水平的细胞膜渗透能力，通过旁观者效应导致邻近细胞的根除。MMAF对MDR+细胞具有很高的活性，但由于其有限的细胞渗透性，这种毒素不太可能产生旁观者效应。基于这些不同特性，MMAE和MMAF的同时递送具有增强的协同活性。这种双药物ADC在表达MDR的CD30+间变性大细胞淋巴瘤（ALCL）小鼠异种移植模型中展示出强大的活性，五只小鼠中有三只完全根除了癌细胞。相比之下，仅含MMAF的ADC（DAR为8）只有一只小鼠完全根除了所有癌细胞，而相同的仅含MMAE的ADC没有观察到抗肿瘤活性。图注：CD30抗体上偶联MMAE和MMAF的药效结果（cAC10-(1+3)组）除MMAE和MMAF组合荷载的ADCs之外，双药ADC也对其它两种不同荷载类别的ADCs进行了探索。如，结合抗微管剂hemiasterlin和TLR激动剂的ADC，它与抗FolRα抗体偶联，在小鼠模型中显示出协同的抗肿瘤活性和免疫记忆。然而，并非所有双药ADCs的研究都是有意义的协同效应，如装备有MMAE和SG3457（一种超强PBD二聚体，能通过交联损伤DNA）的抗HER2 ADC，DAR为2+2。同样，也开发了一种以MMAF和高效的拓扑异构酶II抑制剂PNU-15968为荷载的HER2靶向ADC，其DAR也为2+2。尽管这两种ADCs都能够施加双重作用机制，但与相应的单药ADCs相比，它们在体外功效上均未显示出改善。选择具有适当作用机制的不同荷载非常重要，确保在选定的两种荷载之间维持平衡的效力，并优化DAR以实现最佳的治疗效果。全面理解和最大化双药ADCs潜力的努力仍处于探索的早期阶段。— 总结 —  ADC治疗潜力巨大，但要实现这一潜力，必须克服若干关键挑战，如药物耐药性、肿瘤异质性及治疗相关不良事件（TRAEs）的风险。新的ADC模式，包括双特异性和双药ADCs，有潜力解决耐药性和肿瘤异质性问题。将ADC平台与免疫调节、降解传统难以靶向的药物等其他干预策略相结合，为实施多模式癌症治疗提供了机会，这些策略可以与化疗、放疗、免疫疗法及其他靶向疗法一起使用。ADC的发展正处于变革性增长的边缘，将大幅改变癌症治疗格局。随着对肿瘤生物学的深入理解及改进的ADC设计，研究人员将接近实现真正有效、安全和个性化的癌症治疗目标，这最终将为难治癌症患者带来新的希望。更多优质内容，欢迎关注↓↓↓

吸入式核酸纳米递送系统在呼吸系统疾病治疗中显示出良好的临床应用前景,但也因肺部的特殊结构等原因面临种种挑战。呼吸系统疾病如肺炎、呼吸合胞病毒(RSV)感染、肺纤维化、哮喘、过敏性鼻炎、慢性阻塞性肺病(COPD)等已成为中国第三大疾病死因，仅次于心脑血管疾病和恶性肿瘤。呼吸系统疾病病程长、用药技术壁垒高、可供选择的有效治疗药品有限，未满足巨大的临床需求。mRNA 技术凭借其研发周期短、预防效果好、安全性好、理论上可表达任意抗原等优势在新冠疫苗开发中得到迅速应用，显示了核酸药物在呼吸系统疾病预防和治疗领域中的巨大应用潜力。与传统药物（小分子、多肽、蛋白等）相比，核酸药物在高特异性和高效性方面表现出独特优势， 且有望攻克“不可成药”靶点的局限性，具有广泛的临床应用前景。吸入递送为呼吸系统疾病治疗的最佳给药方式，具有无创性、可直接将治疗剂递送到肺部、 增加药物局部浓度和减少全身系统毒性等优势。此外，肺泡巨大的表面积有利于药物快速吸收、避免直接代谢。然而，裸露的核酸具有电负性大分子的固有属性，易降解、细胞摄取和转染效率低，因此亟待开发安全有效的核酸递送载体，不仅能够保护核酸药物不被降解和促进细胞摄取，而且能够承受雾化过程中产生的剪切力，经吸入给药后能够克服多重生理屏障将核酸治疗分子递送至肺组织疾病部位。吸入式核酸递送面临的挑战抗雾化剪切力雾化过程会产生一定的剪切力，剪切力可以通过设计优化递送载体、粒径及分布、分散体系以及雾化装置等参数降低，保护药物结构不被破坏。近期，上海交通大学章雪晴团队利用类脂质G0-C14构建吸入式核酸纳米药物。该纳米颗粒可有效包载小干扰核糖核酸(siRNA)， 具有良好的雾化稳定性，并保持雾化前后纳米颗粒的粒径、形貌、包封率及转染效率不变，在肺纤维化小鼠模型上显著改善了肺组织损伤和功能损伤。另有研究表明，振动网筛雾化器在雾化过程中产生的剪切力较低，可以实现温和的气溶胶产生过程。此外，有文献报道粒径较小的单层脂质体（通常小于 200 nm）在雾化过程中不易受到剪切力的影响。克服黏液屏障呼吸道中高度分支的支气管结构对药物在肺部特定位置的富集形成障碍，这要求吸入式气溶胶制剂具有高分散性和气动性能。核酸纳米药物雾化形成的雾滴直径需控制在1～ 5μm，才可通过重力沉降机制沉积在肺组织深处的呼吸区域。气道内壁黏液 - 纤毛清除是气道的主要防御机制，也是吸入式核酸纳米药物面临的主要生理屏障之一。研究表明，黏蛋白是黏液主要成分，呈负电性，分子骨架中周期性的疏水裸蛋白球状结构域可以结合并束缚外来疏水分子。聚乙二醇(PEG)因其亲水性和屏蔽纳米颗粒表面电荷的性质，能增强纳米颗粒在黏液层的渗透能力，在纳米颗粒表面修饰PEG可避免其被黏液纤毛清除。采用多粒子跟踪(MPT)技术对表面分别修饰有可控密度的胺、羧基和PEG的二氧化硅纳米颗粒(SNP)库进行研究，结果显示，SNP表面高密度修饰的聚乙二醇形成 一种刷状构象，可以屏蔽纳米颗粒 - 黏蛋白的相互作用，表现出更强的黏液渗透能力。逃避巨噬细胞清除肺泡巨噬细胞吞噬介导的免疫清除是吸入式核酸纳米药物面临的另一个主要生理屏障。纳米颗粒在呼吸道中沉积后首先与肺表面活性剂(PS)层接触，随后肺泡巨噬细胞内化外来颗粒并在充满溶菌酶的囊泡中将其消化、运送至黏膜纤毛或淋巴系统进行清除。PS 影响纳米颗粒的保留时间并决定药物的肺部生物利用度。PS 由 II 型肺泡细胞产生，主要由90%脂质（如磷脂酰胆碱、磷脂酰甘油和胆固醇）以及 10% 表面活性蛋白（如亲水蛋白SP-A和SP-D及疏水蛋白SP-B和SP-C）组成。研究表明，吸入制剂的表面和理化性质（如尺寸）会影响纳米颗粒与PS之间的相互作用，对其被肺泡巨噬细胞吞噬的过程有较大影响。经PS组分修饰的纳米颗粒可在其表面形成生物分子冕，进而调节其与肺泡巨噬细胞之间的相互作用。研究者利用二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二棕榈酰磷脂胺(DPPE)、二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)以及二棕榈酰磷脂酰丝氨酸(DPPS)分别修饰负载紫杉醇(PTX)的聚乳酸 - 羟基乙酸共聚物(PLGA)纳米颗粒，结果显示不同的磷脂修饰可以赋予纳米颗粒不同的黏液渗透和细胞摄取性质。吸入式核酸递送载体分类目前，吸入式核酸递送载体包括病毒载体、脂质纳米颗粒、脂质-聚合物杂化纳米颗粒、纳米结构脂质载体、阳离子聚合物、外泌体纳米囊泡，以及蛋白载体等。病毒载体病毒载体在疫苗领域已经得到了广泛研究。2022年5月19日，全球首款吸入用重组新型冠状疫苗（5 型腺病毒载体）克威莎® 雾优® 被正式列入世界卫生组织紧急使用清单。2022年12月5日，北京万泰生物与厦门大学、香港大学合作研发的鼻喷流感病毒载体新冠疫苗也获批紧急使用。相较于肌肉注射疫苗主要产生IgG抗体来保护下呼吸道和肺，吸入疫苗可以利用黏膜免疫产生更多的IgA抗体，从而保护上呼吸道免受病毒入侵。需要注意的是，病毒作为核酸递送载体具有转染效率高且基因表达持续时间较长等优点，但也存在尺寸限制、整合宿 主基因组所带来的潜在风险等问题。除此以外，有文献报道腺相关病毒(AAV)衣壳的免疫原性触发中和抗体和T细胞反应，限制了基于AAV治疗的重复给药。关于优化病毒载体的安全性研究仍在持续进行中。基于脂质的吸入式核酸纳米载体（1）脂质纳米颗粒(LNP)新兴的非病毒载体因其免疫反应低、载体容量大、化学结构可控、无整合宿主基因组风险等优势被认为是病毒载体的更安全的替代品。LNP 是目前临床使用的核酸纳米载体，由可电离脂质、胆固醇、辅助型脂质和PEG-脂质自组装形成。使用LNP的上市核酸药物包括首款上市的siRNA药物ONPATTRO®(Patisiran) 和 5 款新冠病毒mRNA疫苗制剂。近年来，吸入式mRNA递送系统的研究也不断取得进展。例如，美国化学和生物工程师詹姆斯·达尔曼(James  Dahlman)等通过对大量 LNP 制剂处方的评价和筛选，对LNP组分及组分比例进行迭代优化，获得经雾化吸入递送mRNA的最优 LNP。该LNP以吸入式气溶胶的方式递送编码治疗性抗体FI6的mRNA，可以有效结合血凝素，中和流感病毒亚型。全球现已有至少4个吸入式 mRNA 纳米载体应用到人体临床试验。美国mRNA 疗法研发公司Translate Bio 研发的MRT5005于2018年获批进入临床试验治疗囊性纤维化，是全球首个以可雾化气溶胶制剂进入临床试验的LNP-mRNA纳米药物。出自美国RNA 制药公司 Arcturus、生物制药公司Vertex Pharmaceuticals和基因疗法公司ReCode Therapeutics的吸入式 LNP-mRNA 药物（ARCT-032、VX-522 和 RCT1100）于2023 年先后获批进入临床试验，分别用于治疗囊性纤维化肺病和原发性纤毛运动障碍(PCD)。遗憾的是，目前尚无吸入式 LNP-mRNA 候选药物成功完成临床试验。（2）脂质 - 聚合物杂化纳米颗粒(LPN)脂质-聚合物杂化纳米颗粒由脂质和聚合物组成，在体内外显示出良好的核酸递送潜能。LPN中的可离子化脂质与核酸通过静电相互作用结合，促进细胞摄取、内体逃逸和胞质递送。可生物降解的聚合物如PLGA构成LPN基质骨架， 实现负载核酸的持续释放。丹麦和瑞典的研究团队利用PLGA和L5N12制备负载肿瘤坏死因子(TNF)-α siRNA的LPN干粉吸入制剂，并通过亮氨酸等辅料的引入提高该干粉吸入制剂耐受喷雾干燥过程的热稳定性和气溶胶性能。上海交通大学章雪晴研究团队基于类脂质G0-C14构建吸入式LPN，通过雾化吸入给药方式将靶向IL-11的siRNA有效递送至小鼠肺部，在肺纤维化小鼠模型中展示出良好的抗纤维化治疗效果。（3）纳米结构脂质载体(NLC)纳米结构脂质载体是另一类由固体脂质和液体脂质的混合物组成的脂质纳米载体，具有避免药物在储存过程中析出的优势。美国新泽西州立罗格斯大学药剂学系教授塔玛拉·明科(Tamara Minko)等以Precirol® ATO 5作为固体脂质，角鲨烯作为液体脂质制备 NLC，单次吸入及静脉注射非靶向 NLC 24 小时后的器官分布结果显示，吸入方式递送的非靶向 NLC 在肺 部富集的总量为83%，比静脉注射(23%)高出 3.5 倍以上。进一步对NLC进行靶向修饰，实验结果证明，表面修饰LHRH肽的NLC经吸入方式递送后主要富集在肺部肿瘤中，而未在健康肺组织中检出，该NLC共递送化疗药物以及靶向MRP1和Bcl2 mRNA的siRNA可以显著增强纳米颗粒的抗肿瘤细胞作用。阳离子聚合物阳离子聚合物是另一类得到关注的吸入式核酸载体。美国麻省理工学院教授丹尼尔·安德森(Daniel Anderson)等使用超支化聚β氨基酯(hPBAEs)hDD90-118 包载编码荧光素酶的mRNA，经吸入给药后可以实现荧光素酶在5个肺叶中的均匀分布，且未在其他组织中观察到荧光素酶表达，重复给药hPBAE-mRNA未产生局部或全身毒性。此外，美国佐治亚理工学院和埃默里大学的研究团队报道了一种基于聚 β- 氨基硫代酯的聚合物纳米载体，该载体对于所负载核酸的大小和复杂性没有限制，可经吸入给药方式将不同类型的核酸分子输送到多个动 物种属的肺部。所获最优聚合物载体经吸入递送编码Cas13a蛋白的mRNA，在极低的剂量下产生的疗效与高于其20倍剂量的中和抗体相似。外泌体纳米囊泡外泌体是由体内细胞主动分泌的纳米级(30 ～ 150 nm)细胞外囊泡，通常由双层脂质膜形成，富含多种生物成分，包括来自其亲本细胞的蛋白质、核酸和脂质。因其表达来自亲本细胞的表面蛋白和受体，在靶向相同的组织受体细胞方面具有独特优势，是一类新兴的靶向药物递送载体。美国北卡罗来纳州立大学程柯团队报道的人肺球细胞来源的外泌体经雾化吸入给药后能将mRNA递送至细支气管和肺泡中， 提高mRNA在肺组织中的分布、保留及蛋白表达。然而，外泌体载体在临床转化上存在工艺复杂、 可放大性差的技术挑战。蛋白载体近年来，蛋白载体也被探索用作吸入式核酸纳米递送载体。山东大学研究团队采用内源性核糖体蛋白包载基质金属蛋白酶 13的mRNA， 并在该核糖体蛋白纳米结构表面修饰RGD肽和 角化细胞生长因子(KGF)，经雾化吸入给药方式将纳米药物靶向递送至特发性肺纤维化小鼠肺部富含整合素的肌成纤维细胞和受损的上皮细胞，从而加速细胞外基质的降解和促进肺泡上皮再生。 3结语吸入式核酸药物在呼吸系统疾病的预防和治疗领域具有广阔的临床应用前景。合理设计和开发吸入式核酸纳米递送系统，使其具备良好的生物安全性和耐受雾化剪切的性能，并能穿透黏液屏障和减少肺泡巨噬细胞吞噬清除，继而促进靶细胞摄取和实现溶酶体逃逸，是提高mRNA纳米药物肺部递送效率及其靶向转染特定细胞效率的关键。