PDL1 x IFNAR

摘要:佐剂性和递送性是mRNA疫苗设计的两个关键方面。在现代mRNA疫苗中，佐剂功能被整合到mRNA疫苗纳米颗粒中，允许抗原mRNA和佐剂以统一的、一体化的形式共递送。在这种配方中，许多mRNA疫苗利用mRNA的免疫刺激性特性以及疫苗载体组分（包括脂质和聚合物）作为佐剂。然而，需要谨慎设计，因为过度的佐剂性和不当的先天免疫信号激活反而会阻碍疫苗效果并引发不良反应。mRNA疫苗还需要递送系统来实现在淋巴器官内的抗原呈递细胞（APCs）中的抗原表达。一些疫苗直接针对淋巴器官中的APCs，而另一些则依赖于APCs在摄取mRNA疫苗后迁移到引流淋巴结。本综述探讨了这些过程的当前机制理解以及基于这种理解正在进行的提高疫苗安全性和有效性的尝试。 1.引言 mRNA为疫苗提供了一个强大的工具。在传染病的情况下，一旦建立了mRNA递送平台，只需改变mRNA序列，疫苗就可以针对各种病原体。这一特性使得两种mRNA疫苗BNT162b2和mRNA-1273在由严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）引起的2019冠状病毒病（COVID-19）爆发后的一年内迅速获得紧急批准。这些疫苗在各种疫苗形式中展示了高效果，对控制大流行起到了关键作用。mRNA疫苗有效诱导中和抗体，有助于其在预防SARS-CoV-2感染方面的高效性。此外，mRNA疫苗还激发细胞免疫反应，这些反应比体液免疫反应更持久，更能抵抗病毒突变。细胞免疫可能在预防COVID-19的严重疾病和死亡中发挥关键作用。mRNA疫苗的广泛免疫原性，包括细胞毒性T淋巴细胞（CTL）的诱导，也使其成为癌症疫苗的一个有吸引力的候选者。mRNA癌症疫苗通过针对共享的肿瘤相关抗原和来自每个患者基因突变的新抗原，在临床试验中显示出有希望的结果。新抗原疫苗的准备需要在识别癌症基因突变并预测合适的表位后迅速适应。在这方面，mRNA疫苗允许通过改变mRNA序列，简单地对应于每个患者中的突变蛋白，快速且方便地准备。从安全角度来看，mRNA在注射后一周内迅速降解，在体内持续存在的风险最小。最近的一项研究在人体样本中解决了这个问题，显示mRNA在接种后一个月内通过定量PCR（qPCR）检测不到。每年数十亿剂的可扩展性是另一个关键属性，特别是在大流行中。 早在1990年代中期就有关于针对传染病和癌症的mRNA疫苗的记录。然而，它们需要多年的研究和技术突破才能达到目前的临床成功，特别是在mRNA合成和递送系统领域。在前者中，mRNA的假尿苷修饰减轻了对mRNA的先天免疫反应，并提高了蛋白质翻译效率。其他关键技术包括添加5'帽和聚A尾，编码和非翻译区域的序列优化，以及去除体外转录mRNA的杂质。这些mRNA合成技术通过避免不良的炎症反应来提高mRNA疫苗的安全性，并通过增加抗原产生效率来增强疫苗效果。mRNA疫苗还需要递送系统来保护mRNA免受酶降解，将mRNA递送到APCs和淋巴组织，并促进mRNA在细胞内的运输到细胞质中的翻译位点。此外，最近的研究表明递送纳米颗粒作为免疫刺激性佐剂的作用。值得注意的是，在2010年代中期之前，大多数mRNA疫苗临床试验采用了体外mRNA递送后的APC移植。然而，体外策略需要在移植前进行临床级别的细胞培养的繁琐程序，限制了mRNA在癌症免疫疗法中的应用。最近的技术进步使得有效的体内mRNA递送成为可能，扩大了mRNA在传染病疫苗中的应用，并避免了癌症疫苗中繁琐的体外程序。在上述描述的mRNA疫苗的各种设计属性中，本综述关注两个问题：疫苗佐剂性和针对APCs和淋巴器官的递送系统，这在疫苗开发中尤为重要。同时，我们将读者重定向到其他综述中，以获得mRNA递送系统的一般描述，特定于COVID-19疫苗的主题，以及mRNA疫苗的临床概况。 2.佐剂性 2.1.佐剂性概述 免疫刺激性佐剂通过引发先天免疫反应，将抗原表达与适应性免疫诱导联系起来，从而提高疫苗效果的效率和持久性。在由重组蛋白或编码蛋白的核酸衍生的现代疫苗中，佐剂的作用变得越来越重要。值得注意的是，这些疫苗缺乏传统活减毒和灭活疫苗中存在的许多病原体相关分子模式（PAMPs），这些模式充当佐剂。在两种批准的mRNA COVID-19疫苗中，佐剂功能被整合到离子化脂质基脂质纳米颗粒（iLNPs）配方中，作为内置佐剂，而不是作为额外的佐剂补充。事实上，小鼠和人类对mRNA iLNPs的强烈先天免疫反应在疫苗功能中发挥着关键作用。iLNPs的脂质组分和mRNA分子都有助于mRNA疫苗中的佐剂性。内置佐剂方法允许mRNA疫苗的简单一体化配方，有助于平稳的临床转化。此外，一体化配方使得抗原mRNA和佐剂能够共递送到相同的APCs中，有效激活表达从递送的mRNA中得到的抗原蛋白的APCs。在这方面，重组蛋白疫苗的广泛研究表明共递送抗原和佐剂的好处。在一项开创性研究中，共包埋CpG DNA和卵清蛋白（OVA）的聚（D,L-乳酸-羟基乙酸共聚物）（PLGA）微球在诱导小鼠抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）活性方面优于分别包埋这两种组分的微球混合物。尽管佐剂在疫苗接种中起着关键作用，但佐剂性应该精确控制，以在最佳强度下激活适当的信号通路，因为过度和意外的佐剂性会带来安全问题，并对疫苗效果产生负面影响。本节提供了关于mRNA疫苗中佐剂性的机制理解和开发的观点。 2.2.当前mRNA疫苗的先天免疫反应 mRNA通过几种先天免疫受体触发先天免疫反应，包括内体内的Toll样受体（TLRs）和细胞质中的视黄酸诱导基因I（RIG-I）和黑素瘤分化相关蛋白5（MDA5）（图1(a)）。每个受体的首选配体分别是TLR3的>45碱基对（bp）双链RNA（dsRNA），TLR7,8的>20核苷酸（nt）单链RNA（ssRNA），MDA-5的几千bp dsRNA，以及RIG-I的>20 nt dsRNA，其在5'端有一个三磷酸基团。这些受体的主要适配分子分别是TLR3的Toll/白介素-1（IL-1）受体结构域包含的适配分子诱导干扰素-β（IFN-β）（TRIF），TLR7,8的髓样分化初级反应88（MyD88），以及MDA-5和RIG-I的线粒体抗病毒信号蛋白（MAVS）。这些分子最终触发I型IFN和其他促炎细胞因子的产生。此外，mRNA的5'帽结构对于区分自身和非自身mRNA至关重要。5'帽结构基于第一和第二核糖体的2'O-甲基化状态进行分类。在Cap0中，第一和第二核糖体中都没有2'O-甲基化，在Cap1中，只有第一核糖体有2'O-甲基化，而在Cap2中，第一和第二核糖体都有2'O-甲基化。在高等真核生物中，mRNA具有Cap1或Cap2结构，留下Cap0 mRNA主要被RIG-I识别为非自身。最近的一项研究表明，与Cap1结构相比，Cap2结构进一步降低了mRNA对RIG-I的亲和力。 图1. mRNA疫苗诱导的先天免疫。(a) 外源性RNA的受体及其信号通路。ppp-dsRNA：在5'端具有三磷酸基团的双链RNA。(b) 对iLNPs脂质成分的先天免疫反应的潜在机制。 体外转录mRNA中的杂质，包括未加帽和长dsRNA，引发强烈的先天免疫反应。体外转录制备的未加帽RNA在5'末端有一个三磷酸基团，刺激RIG-I。尽管包括CleanCap在内的最新技术已经提高了加帽效率，但在CleanCap mRNA制备过程中产生的少量未加帽RNA仍然显著激活先天免疫反应。事实上，CleanCap mRNA溶液的南极磷酸酶处理，去除未加帽mRNA杂质的5'三磷酸基团，显著降低了培养巨噬细胞中的细胞因子反应。这一结果突出了CleanCap mRNA中未加帽mRNA污染物的显著免疫刺激。长dsRNA是先天免疫的强烈诱导剂，是从体外转录过程中的RNA模板转录RNA制备的。在这个过程中，从DNA模板制备的预期mRNA链作为模板合成互补的非预期RNA链，导致长dsRNA的形成。如后文讨论的，这些杂质对先天免疫反应可能会极大地影响mRNA疫苗接种的结果，需要仔细讨论在免疫刺激杂质的背景下的疫苗接种效果。 尽管mRNA疫苗需要先天免疫反应作为佐剂，但过度的反应会带来安全问题，并负面影响疫苗效果，如后文所述。此外，对体外转录mRNA的细胞反应通过诱导全局mRNA降解和损害翻译启动，对mRNA的蛋白表达效率产生负面影响（图1(a)）。2'-5'-联腺苷酸合成酶（OAS）的mRNA识别和随后的RNase L激活导致大量细胞内ssRNA降解。此外，外源RNA通过激活RNA依赖性蛋白激酶（PKR）和磷酸化翻译启动因子2-α（eIF-2α）损害蛋白翻译的启动过程。因此，mRNA疫苗的开发需要控制细胞对体外转录mRNA的感知。为此，许多mRNA疫苗使用假尿苷（Ψ）或N1-甲基-假尿苷（1 mΨ）的核苷修饰，这减轻了对mRNA的先天免疫反应。此外，使用高效液相色谱（HPLC）消除长dsRNA，并通过南极磷酸酶去除未加帽mRNA的5'三磷酸也减少了mRNA杂质的免疫刺激。mRNA纯化的更近期技术包括具有光敏疏水标签的帽类似物，用于从未加帽mRNA中纯化加帽mRNA，以及为最小化dsRNA产生的工程化RNA聚合酶。这些方法可以通过增加抗原蛋白翻译和减轻促炎反应来提高mRNA疫苗的安全性和有效性。 在当前mRNA疫苗广泛使用的iLNP配方中，其脂质组分是先天免疫反应的主要诱导剂。事实上，不含mRNA封装的空iLNPs在小鼠局部注射后诱导了强烈的促炎反应。值得注意的是，在去除离子化脂质组分后，促炎反应几乎消失，表明离子化脂质在免疫刺激中的关键作用。离子化脂质在细胞外pH下呈中性电荷，在内/溶酶体pH下变为阳离子。因此，离子化脂质被认为比无pH响应的传统阳离子脂质的炎症性小，因为使用离子化脂质而不是阳离子脂质可能减少LNP与细胞膜的相互作用及其随后的膜损伤。相反，将iLNP中的离子化脂质替换为阳离子脂质减少了对纳米颗粒的先天免疫反应。几份报告提供了iLNP先天免疫激活的机制见解（图1(b)）。如后文所述，几种离子化脂质特别激活先天免疫受体，包括TLRs和细胞内干扰素基因刺激剂（STING）。此外，mRNA iLNPs和其他纳米颗粒的研究表明，溶酶体破裂，mRNA递送的一个重要细胞内过程，通过炎症体激活引发先天免疫反应。在注射部位受损细胞释放的损伤相关分子模式（DAMPs），包括DNA、RNA和蛋白质，也可能在iLNP递送后刺激先天免疫受体。事实上，最近的一项动物研究表明，在肌肉注射（i.m.）批准的COVID-19 mRNA疫苗BNT162b2后，包括双链DNA、高迁移率族蛋白盒（HMGB）1和尿酸在内的DAMPs血清水平急剧增加。在人类中，批准的COVID-19 mRNA疫苗诱导了强烈的局部反应，可能造成DAMPs的释放。 2.3.桥接佐剂性到疫苗效果 本节讨论先天免疫反应如何影响疫苗效果，重点关注iLNPs。最近的一项全面研究通过为各种受体准备基因敲除小鼠，调查了各种先天免疫受体在接种批准的COVID-19 mRNA疫苗BNT162b2后诱导体液和细胞免疫的参与情况。目标受体包括RNA感知途径中的TLR3、TLR7、RIG-I和MDA-5，炎症体中的NLR家族PYD结构域含有蛋白（NLRP）3和凋亡相关斑点蛋白含有C末端胱天蛋白酶募集结构域（ASC），以及TLR2、TLR4、TLR5、环状GMP-AMP合成酶（cGAS）和STING，其中一些是离子化脂质介导的免疫刺激的潜在靶分子。在这些基因中，只有MDA-5基因敲除显著降低了疫苗接种后刺突抗原特异性CD8+T细胞的频率。更准确地说，MDA-5基因敲除减少了IFN-α的分泌，这是MDA-5信号传导的下游分子，并阻止了树突细胞的激活。此外，IFN-α/β受体（IFNAR）1基因敲除也损害了刺突特异性CD8+T细胞的诱导。这些结果揭示了MDA-5和IFN-α在诱导CD8+T细胞反应中的关键作用。MDA-5可能识别mRNA疫苗配方中的dsRNA或作为DAMPs释放的受损细胞中的dsRNA。 然而，体液免疫诱导的途径更为复杂。上述任何先天免疫受体的基因敲除都没有降低刺突特异性抗体的效率。此外，只有在IFNAR1基因敲除后检测到刺突特异性抗体的最小减少。这一结果与人类研究的结果一致。该人类研究评估了COVID-19 mRNA疫苗在由于TLR7、IFNAR1或干扰素调节转录因子（IRF）7的固有缺陷或对I型IFNs的自身抗体而患有先天性和获得性I型干扰素信号传导缺陷的患者中的有效性。mRNA疫苗在这些患者中有效地诱导了中和抗体和记忆B细胞，水平与健康对照组相当。同时，几项动物研究提供了对体液免疫诱导至关重要的途径的见解。MyD88基因敲除，该基因编码许多TLRs的适配蛋白，显著抑制了使用mRNA iLNP疫苗接种后抗原特异性滤泡辅助T（Tfh）和生发中心（GC）B细胞的诱导。此外，编码Tfh细胞分化中关键细胞因子的白介素（IL）-6基因敲除也消除了疫苗效果。相比之下，RIG-I和MDA-5的适配蛋白MAVS基因敲除后，疫苗效果得以维持。另一项关于自扩增RNA（saRNA）的研究也证明了IL-6在小鼠疫苗接种中的作用，表明IL-6基因敲除损害了抗体反应和Tfh细胞及GC B细胞的诱导。与此同时，IL-6基因敲除后，saRNA疫苗对致命性流感病毒挑战的保护效果得以保留。这些研究表明，在诱导体液免疫反应的先天免疫信号传导途径中存在冗余，而TLRs和IL-6发挥主要作用。 在人类疫苗接种中，第二剂COVID-19 mRNA疫苗大幅增强了体液和细胞免疫，并同时引起了比第一剂更严重的全身反应原性。这一观察结果意味着，第二剂后负责反应原性的促炎分子可能也有助于增强适应性免疫。先前的一项研究评估了人类BNT162b2疫苗接种者血浆中67种细胞因子的概况。其中，IFN-γ显示出一个独特的概况，特别是在第二剂后急剧增加。小鼠模型也在第二次接种BNT162b2后复制了IFN-γ水平的急剧增加，伴随着巨噬细胞、单核细胞和树突细胞的激活。进一步分析揭示了CD4+和CD8+ T细胞在第二次接种后产生IFN-γ的显著贡献。有趣的是，IFN-γ受体中和抗体的给药减弱了巨噬细胞、单核细胞和树突细胞的激活，证明了IFN-γ在第二剂后的佐剂功能。然而，IFN-γ受体中和抗体对抗原特异性抗体产生和CD4+及CD8+ T细胞诱导的效率影响很小。因此，需要进一步的研究来解读COVID-19 mRNA疫苗的佐剂性机制。 2.4.脂质和mRNA的佐剂性 iLNP佐剂性的另一个关键问题是，脂质和mRNA组分中哪一个主要促进免疫刺激，以及每个组分激活的信号通路是什么。一项全面的机制研究通过比较空iLNP与封装修饰mRNA的iLNP来解决这个问题。有趣的是，两种配方在小鼠皮内（i.d.）注射后4和24小时引流淋巴结中产生的细胞因子和趋化因子水平相似，表明脂质组分在对iLNP的先天免疫反应中占主导地位。因此，两种iLNP都作为佐剂，并提高了重组蛋白疫苗的效率，使其比AddaVax（模仿临床上批准的MF59佐剂的角鲨烯佐剂）更有效地产生抗原特异性抗体。有趣的是，空iLNP的佐剂效应在MyD88和MAVS基因敲除后大多得以维持，但在IL-6基因敲除后减少。因此，空iLNP可能通过IL-6分泌发挥其佐剂性。然而，同一研究的详细分析揭示了mRNA对mRNA iLNPs的先天免疫反应的贡献，即使mRNA在化学上被修饰以最小化免疫刺激。当比较空iLNP和装载mRNA的iLNP对其作为佐剂以提高重组蛋白疫苗的效率时，MyD88基因敲除减少了装载mRNA的iLNP的体液免疫诱导，而不是空iLNP。这一结果表明，mRNA而不是脂质组分激活了MyD88。在另一项研究中，非人类灵长类动物（NHPs）肌肉注射和皮内注射后，只有装载修饰mRNA的iLNP，而不是空iLNP，在引流淋巴结中的树突细胞中诱导了I型IFN表达和树突细胞的成熟，揭示了mRNA在iLNP佐剂性中的关键作用。 随着未修饰mRNA的使用和较少免疫刺激性的mRNA递送载体，mRNA的佐剂性变得更加明显。在这方面，用于癌症疫苗临床试验的阴离子脂质体比iLNPs的免疫刺激性小。有趣的是，当装载未修饰的mRNA时，阴离子脂质体提供了强大的CTL活性，但相反，当装载1 mΨ mRNA时，诱导了抗原特异性免疫耐受。这些研究强调了未修饰mRNA的佐剂性，将免疫耐受疫苗转化为抗癌疫苗。在装载未修饰mRNA的阴离子脂质体中，TLR7和IFNAR1基因敲除，而不是TLR3、4和9，减少了疫苗接种后树突细胞、NK细胞、T细胞和B细胞的激活。这一结果表明，mRNA通过TLR7识别和随后激活I型IFN在未修饰mRNA的佐剂性中的贡献。 2.5.设计递送系统以改善佐剂性 迄今为止回顾的机制理解意味着改善mRNA疫苗的佐剂性的好处，促进了这一领域的积极研究（表1）。事实上，在某些情况下，佐剂性，而不是抗原表达效率，可能决定疫苗接种的效果，其中提供增强免疫刺激和较低抗原表达的疫苗比提供效率较低的免疫刺激和增强抗原表达的疫苗表现更好。在设计mRNA疫苗佐剂时，首选包含抗原mRNA和佐剂的一体化疫苗配方，允许抗原和佐剂的共递送。如上所述，重组蛋白疫苗的研究已经显示了共递送抗原和佐剂对强大疫苗接种的好处。此外，这种简单的疫苗配方在临床转化中是有利的。 一种策略是将佐剂和mRNA共封装到相同的纳米颗粒中。基于脂质的系统有两个选择：将水溶性佐剂封装在水相中，或将疏水性佐剂封装在脂质相中（图2(a)）。前者的方法是iLNP封装锰，这是STING途径的激活剂，在针对SARS-CoV-2的疫苗接种中显示出有希望的结果。在后一种方法中，R848，一个小分子TLR7/8激动剂，被结合到棕榈酸中以并入阳离子mRNA脂质复合物。该脂质复合物显示出强大的CTL诱导和抗癌效果。另一个例子是Pam2Cys，一个由半胱氨酸、硫甘油和两个棕榈酸链组成的TLR2/6佐剂，被并入iLNP，从而增强了细胞和体液免疫反应。其他系统使用了α-半乳糖神经酰胺，它在APCs上呈现后激活不变自然杀伤T（NKT）细胞，证明了它们在针对癌症和疟疾的疫苗中的效用。针对疟疾的疫苗靶向感染的肝细胞。 除了使用额外的佐剂外，将佐剂性纳入可离子化或阳离子脂质是脂质基疫苗的一个选项（图2(a)）。无需额外的佐剂，这种方法通过最小化成分来简化疫苗配方，可能有利于临床转化。佐剂脂质具有激活先天免疫反应和促进mRNA递送的双重功能。例如，具有环胺头基的可离子化脂质比具有线性胺头基的脂质更有效地诱导先天免疫反应和针对癌症的抗原特异性CTL活性。有趣的是，STING基因敲除消除了由环胺iLNP诱导的先天和适应性免疫反应，表明可离子化脂质中的环胺激活了STING。最近的一项研究在环胺和烷基链之间引入了可生物降解的酯类连接物，以促进佐剂环胺的清除，提高安全性。另一项研究开发了一种类似阳离子脂质的材料，激活TLR4。由此产生的基于脂质的疫苗在野生型小鼠中提高了细胞免疫，但在TLR4基因敲除小鼠中没有提高，证明了TLR4信号在疫苗中的参与。将现有的佐剂或其组分结合到可离子化脂质上是更直接的方法。最近的一项研究设计了一种与TLR7/8佐剂结合的佐剂可离子化脂质体，提高了细胞和体液免疫的诱导效率。另一项研究将维生素E（临床上批准的AS03佐剂的组分）引入可离子化脂质的疏水尾部。含有维生素E的可离子化脂质展现出增强的佐剂性，比含有肉豆蔻酸或油酸尾部的对照可离子化脂质更有效地诱导CTL反应。 在脂质基配方中使用无机系统是另一个具有递送和佐剂功能的双功能系统的例子。先前的一项研究设计了由mRNA负载的钙磷酸核心和脂质层涂层组成的纳米颗粒（图2(b)）。钙磷酸核心在细胞外环境中稳定纳米颗粒，但在细胞内释放Ca2+。由此产生的细胞内Ca2+浓度增加触发树突细胞成熟的信号。此外，钙磷酸核心可以与抗原mRNA共同封装PD-L1 siRNA，用于免疫检查点阻断，进一步增强癌症疫苗的效果。 聚合物基系统，作为一大类mRNA递送系统，与脂质基系统相比，在mRNA疫苗配方中的关注度较小。先前的一项研究比较了聚聚体和iLNP中saRNA的疫苗效果。有趣的是，装载saRNA的iLNP在肌肉注射后远远优于装载saRNA的聚聚体，在细胞和体液免疫诱导方面，尽管聚聚体比iLNP提供了更有效的抗原表达。一致地，iLNP在诱导IL-6（mRNA疫苗佐剂性的关键分子）的表达方面比聚聚体更强。因此，作者将其低疫苗效率归因于其低佐剂性，尽管其他因素，包括递送到淋巴组织的效率，也可能影响疫苗效果。 与此同时，一些聚聚体系统在疫苗接种中提供了有希望的结果（图2(c)）。在几项临床试验中使用的精蛋白/mRNA聚聚体利用未修饰mRNA的佐剂性刺激TLR7（图2(d)）。在这个系统中，与精蛋白的mRNA复合增加了先天免疫反应，但与裸mRNA相比，在小鼠皮内注射后降低了抗原表达效率。因此，控制mRNA和精蛋白的混合比例，以在注射溶液中包含游离mRNA和精蛋白/mRNA聚聚体，以同时获得抗原表达和佐剂性。在一项机制研究中，TLR7基因敲除几乎完全抑制了聚聚体给药后的IL-12分泌。此外，聚聚体通过TLR7基因敲除减少了其CTL诱导潜力，而不是TLR9基因敲除，突出了TLR7佐剂性在这种疫苗配方中的作用。在另一个例子中，硅纳米颗粒被聚(乙二醇)（PEI）涂层，随后PEI交联，mRNA装载和甘露糖涂层。然后，移除硅核心，提供中空核心糖胶囊（图2(e)）。甘露糖的功能是靶向树突细胞并激活树突细胞作为佐剂。结果，这个系统为癌症疫苗提供了强大的CD4+和CD8+免疫。最近的研究还展示了mRNA疫苗中佐剂性多阳离子的潜力（图2(c)）。例如，用于mRNA复合的200-kDa阳离子壳聚糖也作为佐剂，通过激活STING和炎症体，增强抗原特异性细胞和体液免疫。在另一项研究中，具有C18侧链的多阳离子由于其佐剂性激活树突细胞和有效的淋巴结迁移，展现了有效的癌症疫苗效果。一项关于亚单位疫苗的研究也揭示了多阳离子佐剂性。在这项研究中，PEI通过释放宿主细胞的DNA作为DAMPs，激活IFN调节因子-3信号，发挥其佐剂性。这些研究表明了聚合物基系统在疫苗接种中的潜力，这尚未被充分探索。如前所述，iLNP也产生DAMPs，这可能作为佐剂。同时，过量的DAMPs可能引发自身免疫性疾病。例如，通过自身DNA过度激活cGAS-STING途径可能会引起艾卡迪-古特雷斯综合症和共济失调毛细血管扩张症。疫苗开发需要考虑这些风险。 图2. 提高mRNA疫苗佐剂效应的策略。(a) iLNPs或其他脂质系统。(b) 含有磷酸钙核心的脂质载体。(c) 聚复合物。(d) 普罗胺/mRNA聚复合物。(e) 用甘露糖涂层的空心糖胶囊。(f) 设计用于提高佐剂效应的mRNA。用于增强佐剂效应的策略和组分用粗体标出。 2.6.设计mRNA以提高佐剂性 调节mRNA佐剂性提供了另一种改善疫苗效果的选项。这种mRNA佐剂方法包括添加编码免疫刺激性蛋白的mRNA，并利用RNA分子的内在免疫刺激性特性（图2(f)）。这些策略允许使用单一纳米颗粒配方共递送抗原mRNA和佐剂RNA。此外，佐剂RNA在注射后几天内经历酶促降解，避免长时间的免疫刺激。关于编码免疫刺激性蛋白的mRNA，一项开创性的研究将抗原mRNA与三种类型的免疫刺激性mRNA混合，编码CD40配体、TLR4的组成性活性形式和CD70。这种设计显著提高了与单独注射裸mRNA相比的抗原特异性CD4+和CD8+ T细胞诱导和抗癌效果，在淋巴结内注射后。最近的研究证明了免疫刺激性mRNA在iLNP配方中的好处。例如，先前的一项研究通过筛选编码参与先天免疫信号传导的各种蛋白的mRNA物种，确定组成性活性STING mRNA是最有效的mRNA，能在小鼠中诱导CTL活性。另一项研究使用了编码C3d的mRNA，C3d是哺乳动物补体成分，能激活滤泡树突细胞和B细胞。C3d mRNA封装到iLNP中提高了抗原特异性细胞和体液免疫。 RNA分子，特别是dsRNA的内在免疫刺激性特性可以作为佐剂使用。在这方面，dsRNA的免疫刺激性特性可能对saRNA疫苗的疫苗效果产生积极或消极的影响。saRNA具有单链RNA病毒的复制机制，可以在宿主细胞内自我放大，提供抗原蛋白的持续表达。此外，细胞内增殖过程中的dsRNA中间体也可能增强细胞dsRNA受体的激活，以诱导先天免疫反应。这些特性使得使用低剂量的saRNA在动物和人类中进行有效的疫苗接种。然而，dsRNA中间体的持久性可能导致长时间的免疫刺激和PKR激活，可能在某些情况下对疫苗效果产生负面影响。事实上，IFNAR1或MAVS基因敲除提高了saRNA疫苗接种后体液或细胞免疫诱导的效率。此外，saRNA通过共表达MERS-CoV-2 ORF4a提高了其疫苗效率，该蛋白通过结合dsRNA抑制MDA-5和RIG-I的激活[86]，或天花病毒免疫逃逸蛋白阻断PKR和IFN-β的活性。 相反，使用dsRNA对先天免疫反应进行短暂刺激有助于改善mRNA疫苗以提高CTL活性。在这个策略中，dsRNA结构是通过将互补RNA与mRNA杂交到非复制mRNA中准备的（图3）。以前的研究评估了互补RNA与mRNA杂交在蛋白翻译效率和先天免疫反应方面的影响。当互补RNA靶向蛋白编码区域时，在与17 nt互补RNA杂交后翻译效率保持稳定（图3(a)），但在与23 nt或更长的RNA杂交后下降（图3(b)）。与mRNA杂交的短RNA在细胞内环境中特别被从mRNA上脱落，可能是通过翻译过程中蛋白质翻译机制的内源性解旋酶活性。这个过程可能允许从与17 nt互补RNA链杂交的mRNA中有效表达蛋白。关于佐剂性，23 nt或更长的互补RNA杂交，而不是17 nt互补RNA，增加了mRNA的免疫刺激性特性。同时，当靶向mRNA的非编码区域时，RNA杂交的影响是不同的。在先前的研究中，通过体外转录准备的120 nt poly U RNA与mRNA的120 nt poly A杂交。有趣的是，poly U杂交极大地增强了mRNA诱导先天免疫反应的能力，对翻译效率的影响最小（图3(c)），提供了具有佐剂性的mRNA的优秀配方。机制分析揭示了RIG-I在先天免疫激活中的主要作用。事实上，120 nt poly U RNA在体外转录时没有5'帽类似物，在5'端有一个三磷酸基团，是RIG-I的配体。在小鼠疫苗接种中，这种配方在淋巴结内裸mRNA的形式下增强了模型抗原mRNA的疫苗效果。然而，这个系统中的免疫刺激强度是不可控的。因此，后来的研究重新设计了这个系统，以实现对免疫刺激强度的微调。为此，通过17 nt互补RNA与mRNA杂交，准备了梳状结构的mRNA，精确设计了dsRNA牙齿以诱导RIG-I刺激。更重要的是，通过改变免疫刺激性牙齿的数量，这个策略使佐剂性的微调成为可能，以最大限度地提高疫苗效率，同时最小化不良反应。最终，这个系统提高了三种不同mRNA配方的CTL活性：阴离子脂质体、iLNP和聚乙二醇化聚聚体。 图3. mRNA与dsRNA佐剂杂交。展示了RNA杂交后的翻译效率和免疫刺激性。(a-c) 互补RNA与mRNA的编码区(a, b)和聚A区(c)杂交。(d) 梳状结构的mRNA与设计用于靶向mRNA编码区RIG-I的dsRNA杂交。 2.7.杰基尔和海德的佐剂特性 上述描述集中在mRNA疫苗中先天免疫反应的积极方面。然而，许多研究揭示了佐剂特性更为复杂的方面。例如，mRNA修饰在疫苗接种中提供了复杂的结果。像Ψ和1 mΨ这样的mRNA修饰减轻了对mRNA的先天免疫反应，即佐剂效应。未修饰的mRNA的佐剂效应对CTL诱导和抗体产生产生相反的效果。几项iLNP研究表明，未修饰的mRNA在诱导抗原特异性CD8+ T细胞反应方面优于修饰的mRNA。根据最近的一项研究，不含核苷修饰的抗原mRNA包裹在iLNP中，比包裹1 mΨ修饰的抗原mRNA更有效地诱导抗原特异性CD8+ T细胞，包括那些对颗粒酶B呈阳性的细胞，并更有效地激活肿瘤浸润性树突状细胞。结果，未修饰的mRNA在小鼠模型的癌症疫苗中优于修饰的mRNA，显示出有效的肿瘤体积抑制和延长小鼠存活时间（图4（a））。引人注目的是，在一项使用编码荧光蛋白的mRNA的报告试验中，未修饰的mRNA在淋巴结和脾脏的树突状细胞和巨噬细胞中提供的报告蛋白表达效率远低于1 mΨ修饰的mRNA（图4（b））。这些结果证明了未修饰的mRNA在诱导CTL反应方面的潜力，即使以牺牲抗原表达效率为代价。在机制分析中，未修饰的mRNA比修饰的mRNA更有效地激活脾脏树突状细胞，并且使用抗IFNAR1抗体的给药减少了未修饰的mRNA在疫苗接种中的好处。因此，未修饰的mRNA可能通过I型IFN途径发挥其佐剂效应。 图4. 1 mΨ修饰对癌症疫苗接种的影响。(a) 装载卵清蛋白（OVA）mRNA的iLNP被肌肉内注射到皮下携带表达OVA的B16F0肿瘤的小鼠中。评估了肿瘤大小。(b) 使用iLNPs肌肉内注射0、40、70和100% 1 mΨ修饰的mCherry mRNA。量化了淋巴结和脾脏中常规类型1和2树突状细胞（cDC1和cDC2）中mCherry表达的效率。版权所有© 2022 sittplangkoon, Alameh, Weissman, Lin, Tam, Prompetchara和Palaga。 相反，与iLNP一起传递的1 mΨ mRNA在产生抗原特异性抗体方面比未修饰的mRNA更有效，这表明未修饰的mRNA中佐剂效应的负面影响。一项全面研究调查了1 mΨ修饰对基于iLNP的流感病毒疫苗在小鼠中结果的影响。在i.d.疫苗接种后，1 mΨ mRNA在诱导抗原特异性CD4+ T细胞和抗体方面优于未修饰的mRNA（图5（a）），伴随着脾脏中Tfh和GC B细胞的增强产生。这些结果可能反映了未修饰的mRNA佐剂效应的负面影响。同时，1 mΨ mRNA比未修饰的mRNA产生了更有效和持久的报告蛋白表达（图5（b））。值得注意的是，1 mΨ修饰对蛋白表达效率的好处在器官和细胞类型之间有所不同，在脾脏免疫细胞中尤为明显，包括单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞。因此，1 mΨ修饰的mRNA在免疫细胞中提供增强的抗原表达的能力也可能有助于其高疫苗潜力。最近的一项研究通过调查使用三种不同的iLNPs在小鼠和NHPs中1 mΨ修饰的效果，提供了关于先天免疫反应和抗体产生效率之间关系的机制见解。在研究中，1 mΨ修饰增加了抗体产生效率，并伴随着系统性趋化因子和细胞因子分泌的减少。更具体地说，在三种iLNPs中，两种在没有1 mΨ修饰的情况下诱导了大量I型IFN分泌的iLNPs，在1 mΨ修饰后获得了比其他iLNPs更大的疫苗效率好处，后者在没有修饰的情况下显示出最小的I型IFN反应。因此，I型干扰素反应可能是抑制疫苗结果的罪魁祸首。 图5. 1 mΨ修饰对传染病疫苗的影响。(a) 小鼠通过皮内注射使用iLNPs装载的未修饰或1 mΨ修饰的表达流感病毒血凝素（HA）的mRNA进行疫苗接种。评估了HA抑制滴度。(b) 在使用装载未修饰和1 mΨ修饰mRNA的iLNP皮内注射后评估荧光素酶表达效率。版权所有© 2018 Pardi等人。 mRNA杂质的免疫刺激也可能产生负面影响。在最近的一项iLNP mRNA疫苗研究中，C57BL6小鼠比BALB/c小鼠表现出更弱的体液免疫诱导。在这两种小鼠之间比较，C57BL6小鼠的树突状细胞产生的I型IFN比BALB/c小鼠多10倍以上。在使用HPLC从mRNA中去除dsRNA污染物后，C57BL6中的IFN产生被抑制，C57BL6小鼠中的抗体产生增加到与BALB/c小鼠观察到的水平相当。这些数据也表明了I型IFN对体液免疫诱导的抑制效应。在人类中，如上所述，I型IFN信号通路的缺陷并没有损害SARS-CoV-2 mRNA疫苗中的抗体产生。因此，人类的抗体产生可能不需要强烈的佐剂效应和I型IFN激活。从安全角度来看，1 mΨ修饰减轻了使用iLNP在NHPs中mRNA疫苗接种后系统性细胞因子和趋化因子的释放。因此，诱导最小I型IFN反应的mRNA疫苗配方可能在专注于体液免疫的疫苗中更实用。同时，也应注意到化学修饰的必要性仍然是有争议的。事实上，装载未修饰的mRNA的iLNP在NHPs中诱导了有效的体液免疫，其水平与临床批准的COVID-19疫苗装载1 mΨ mRNA的水平相当。 除了核苷修饰，I型IFN信号在CTL诱导中的作用提供了另一个复杂机制的例子，这些机制是佐剂效应的基础。值得注意的是，I型IFN信号根据疫苗接种途径对CTL诱导产生相反的效果。IFNAR1基因敲除或IFNAR1阻断抗体改善了局部给药后mRNA脂质复合物的CTL诱导效率，包括皮内(i.d.)、皮下(s.c.)和淋巴结内给药，显示出I型IFN信号对疫苗接种的负面影响。重要的是，即使没有从mRNA中大幅度提高蛋白表达效率，IFNAR1阻断也改善了疫苗接种效果。因此，除了抗原表达效率之外的机制，大概是I型IFN信号的过度佐剂效应，可能会损害疫苗接种效果。相反，IFNAR1基因敲除降低了系统性注射后CTL诱导的效率，显示出I型IFN佐剂效应的积极影响。根据对疫苗接种中I型IFN信号的后期机制研究，局部给药后的负面影响和系统性给药后的积极影响在条件性IFNAR1基因敲除的CD4+ T细胞中被消除，但在树突状细胞中没有。因此，I型IFN对CD4+ T细胞的作用可能解释了其在疫苗接种中相互矛盾的效果。 对于CD4+ T细胞的激活，I型IFN信号和抗原呈递的动力学在CD4+ T细胞的命运中起着关键作用。在抗原呈递给T细胞受体之前，I型IFN信号对T细胞具有抗增殖和促凋亡作用。另一方面，同时或延迟的I型IFN信号对T细胞具有增殖和抗凋亡作用。这种动力学上的差异可能解释了系统性给药和局部给药之间I型IFN的相互矛盾效果。系统性注射可能将mRNA直接送入脾脏树突状细胞，允许与I型IFN暴露相对快速和同时的抗原呈递，从而激活T细胞。另一方面，局部注射需要时间让组织残留的APCs迁移到淋巴器官。这可能会延迟抗原呈递，从而对T细胞功能产生负面影响。 最近的一项研究揭示了iLNP对先天和适应性免疫反应的长期影响，持续数周。有趣的是，预先注射装载非抗原mRNA的iLNP或空iLNP减少了2周后注射的后续iLNP疫苗产生抗体和GC B细胞的效果（图6(a,b)）。当预注射到疫苗接种的时间间隔从2周增加到8周时，抑制效果仍然存在，但程度较小。预注射降低了后续疫苗接种中mRNA iLNP的抗原表达效率，这可能有助于抑制效果。进一步的机制实验通过评估iLNP预注射对预防传染病的保护效果，调查了先天免疫在这种抑制效果中的作用。在这个实验中，接受装载非抗原mRNA的iLNP的小鼠在2周后被流感病毒和白色念珠菌挑战，其中先天免疫决定了对感染的易感性（图6(c)）。有趣的是，预注射对流感病毒（图6(d)）提供了保护效果，但加剧了白色念珠菌的感染（图6(e)）。iLNP预注射后血液中中性粒细胞水平的降低可能解释了白色念珠菌的结果，而涉及流感病毒挑战实验的机制尚不清楚。重要的是，两个结果都表明iLNP注射对先天免疫反应的长期影响对抗随后的传染病。通过显示iLNP对后续疫苗接种的抑制效果，这项研究可能具有临床意义。通过延长初次和加强剂量之间的时间间隔，提高了COVID-19疫苗在人类中的效力。初次剂量对加强剂量的抑制效果可能解释了这一临床结果。 图6. iLNP预注射对后续先天和适应性免疫反应的影响。(A-B) 装载非抗原mRNA (eGFP)、空iLNP (eLNP) 或PBS被皮内注射。两周后，注射装载血凝素（HA）的iLNP，随后在疫苗接种后两周评估疫苗效果。(a) 实验方案。(b) HA特异性抗体产生。(c-e) 注射装载非抗原mRNA的iLNP两周后，小鼠被流感病毒或白色念珠菌挑战。(c) 实验方案。(d, e) 流感病毒挑战后的病毒载量(d)和白色念珠菌挑战后的病毒载量(e)。版权所有© 2021 Qin等人。 总的来说，这一节提供了过度佐剂效应阻碍疫苗效果的例子，而佐剂效应是mRNA疫苗的重要组成部分，如前几节所描述的。免疫刺激的强度、信号通路和动力学可能部分解释了佐剂效应的杰基尔和海德特性，尽管需要进一步的机制研究来理解和控制佐剂效应的结果。 3.传递 3.1.传递概述 有效的疫苗接种需要在淋巴器官中表达抗原的APCs（抗原呈递细胞），包括淋巴结和脾脏，与T细胞和B细胞合作以诱导适应性免疫。mRNA疫苗在淋巴器官中的APCs实现抗原表达主要有两条途径（图7）。在一条途径中，mRNA疫苗在非淋巴组织给药后，残留的APCs在注射部位摄取抗原mRNA，然后通过淋巴管迁移到淋巴组织。这些过程需要数小时到数天。在APCs较少的组织中，这一途径需要mRNA疫苗引发的先天免疫反应触发免疫细胞向注射部位的浸润。将mRNA疫苗传递到富含APCs的组织，如皮肤组织，是利用这一途径的另一种策略。在另一条途径中，疫苗纳米颗粒通过淋巴管传递，直接将mRNA传递到淋巴组织中的APCs，这一过程需要数分钟到数小时。值得注意的是，淋巴管有对流以促进这一过程。这一途径需要具有适合淋巴运输的尺寸和表面特性的纳米颗粒。此外，靶向配体可以帮助疫苗在淋巴组织中的积聚和保留，并将疫苗传递给特定类型的免疫细胞。从安全角度来看，疫苗在淋巴器官中的保留对于避免疫苗分布到非淋巴器官、异位抗原表达和先天免疫激活至关重要。以下各节将从传递的角度讨论mRNA疫苗接种，重点关注传递途径和纳米颗粒设计（表2）。每个部分首先一般性地描述每种疫苗传递途径，然后专注于mRNA疫苗接种。 图7. iLNP mRNA疫苗肌肉内注射后的可能机制。在一条途径中，iLNPs迁移到淋巴结以在淋巴结中的APCs中提供抗原蛋白表达。在另一条途径中，免疫细胞浸润到注射部位并在摄取抗原后迁移到淋巴结。 3.2.非淋巴组织的传递 大多数临床可用的疫苗都是注射到肌肉或皮下组织，尽管这些组织中APCs很少。因此，需要浸润注射部位的APCs摄取疫苗并迁移到近端引流淋巴结，以促进适应性免疫反应的协调激活。或者，疫苗可能直接通过淋巴管传递到这些淋巴结。与皮下途径相比，肌肉内注射通常在注射部位的不良事件风险较低，并诱导更强的免疫反应。肌肉组织通常血管和淋巴循环更丰富，允许疫苗有效运输到淋巴结。这可能解释了肌肉内注射途径相对于皮下途径在疫苗接种中的优势。相比之下，皮下给药的疫苗倾向于在注射部位停留较长时间，大概是因为皮下脂肪组织的血管化有限和物质交换能力低。因此，皮下途径在疫苗接种中依赖于APC迁移到淋巴结，而不是疫苗迁移。 在mRNA疫苗引起广泛关注之前，其他领域的广泛研究已经讨论了疫苗纳米颗粒的物理化学特性如何决定它们在细胞间质给药后的命运。特别是，它们的尺寸和表面特性，如电荷和亲水性，是它们淋巴结转移的决定因素。尺寸在10到100纳米之间，更具体地说是20-50纳米的纳米颗粒，适合穿越细胞间质并进入和通过淋巴管。然而，尺寸在100-200纳米的纳米颗粒表现出较差的淋巴结迁移能力，因为大约100纳米大小的水通道限制了它们通过细胞间质的扩散和对流。尺寸超过200纳米的纳米颗粒停留在注射部位，并完全依赖于APCs的摄取和APC迁移到淋巴结以提供疫苗效果。相反，小于10纳米的纳米颗粒更倾向于进入血管而不是淋巴管，因为尺寸允许穿透血毛细血管壁。此外，血毛细血管中的流动大约是淋巴流动的100-500倍，有助于清除纳米颗粒。 关于纳米颗粒的表面特性，带正电荷的纳米颗粒被注射部位的负电荷细胞膜和细胞外基质所困。相比之下，带负电荷或未带电荷的纳米颗粒缺乏这种局部相互作用，可以穿过淋巴管传递到淋巴结，显示出在疫苗接种中的适宜特性。用包括聚乙二醇（PEG）在内的亲水性隐形材料涂层纳米颗粒表面，可以进一步提高纳米颗粒向淋巴结的迁移效率，因为这种表面与细胞间质的相互作用最小。有趣的是，纳米颗粒的PEG化使超过100纳米尺寸的纳米颗粒转移成为可能，如120纳米尺寸的阴离子脂质体和250纳米尺寸的阳离子脂质体，大概是因为PEG化可能改善了纳米颗粒的胶体稳定性，并减少了它们在注射部位细胞间环境中的非特异性吸附。同时，纳米颗粒表面的PEG密度需要优化。例如，含有1摩尔% DSPE-PEG2000的阳离子脂质体在淋巴结中的保留时间延长，并且比含有5摩尔% DSPE-PEG2000的APCs摄取增强，而两种脂质体都有效地迁移到淋巴结。另一项研究也揭示了PEG密度优化对最大化疫苗效力的重要性。针对APCs的配体，如甘露糖衍生物和针对DC40、CD11c和DEC-205的抗体，也可以提高传递效率到APCs。然而，这些方法增加了制造的成本和复杂性。考虑到APCs的高吞噬活性以及它们在淋巴结中的丰富性，一旦纳米颗粒到达淋巴结中的APCs，调整纳米颗粒的物理化学特性可能就足够了。 这些关于纳米颗粒疫苗的研究为mRNA疫苗的开发提供了基础。根据之前的一项mRNA研究，直接将裸mRNA疫苗注射到淋巴结中可以产生强大的CTL反应，而裸mRNA疫苗在其他传递途径中，包括皮内、皮下和近淋巴结注射，未能诱导出可检测的疫苗效果。淋巴结内裸mRNA注射在针对新抗原的癌症疫苗的临床试验中也显示出有希望的结果。这些研究强调了在淋巴结中获得抗原表达的重要性。然而，淋巴结内注射需要在超声成像的指导下进行繁琐的操作，阻碍了广泛的临床应用。相比之下，在普通医疗护理中进行的局部注射，如皮下和肌肉内注射，针对的是非淋巴组织。因此，mRNA疫苗应该具有在传递到非淋巴组织后在淋巴组织中的APCs诱导抗原表达的功能。促进mRNA疫苗和APCs向淋巴结迁移是实现这一目的的两条主要途径（图7），而这两个途径通常无法区分。 有趣的是，mRNA iLNP在肌肉内注射后在引流淋巴结中有效地产生表达抗原的APCs，这可能有助于批准的COVID-19 mRNA疫苗的高效性。之前的一项研究通过正电子发射断层扫描-计算机断层摄影术跟踪了NHPs中放射性标记的iLNP。肌肉内注射后4小时内，iLNP在距离注射部位远达9.2厘米的淋巴结中提供了强烈的信号。其他研究通过观察小和大动物肌肉内注射iLNP后mRNA分布和报告蛋白表达，进一步深入了解了局部传递后mRNA iLNP在细胞水平上的过程。iLNP诱导免疫细胞浸润到注射部位，并在浸润的免疫细胞以及残留的成纤维细胞和脂肪细胞中提供报告蛋白表达。报告蛋白表达在注射后8小时在引流淋巴结中有效观察到，但在非引流淋巴结中未观察到。表达水平逐渐下降，但在注射后7天仍高于检测限。在淋巴结中的各种细胞类型中，位于被膜下和髓质窦的巨噬细胞表现出强大的报告表达，而树突状细胞和单核细胞的表达效率较低，T细胞和B细胞中几乎检测不到。巨噬细胞可能作为APCs通过与T细胞和B细胞的相互作用来触发强大的适应性免疫。值得注意的是，人类引流淋巴结在肌肉内疫苗接种后也显示出疫苗mRNA和抗原蛋白表达的有效积累。尽管上述研究没有精确区分在淋巴结中获得抗原表达的两条途径，即iLNP和APCs的迁移（图7），但iLNP在远处淋巴结的快速积累意味着iLNP迁移的贡献。此外，iLNP在全身器官中诱导了强大的蛋白表达，包括肝脏和脾脏，大概是通过iLNP迁移而不是APC迁移，突出了iLNP在注射部位以外传播的潜力。 几项研究试图进一步区分这两条途径的贡献。为了这个目的，最近的一项研究准备了一个在注射部位具有高效抗原蛋白表达效率而在引流淋巴结中效率低的系统。mRNA和空iLNP的混合物在肌肉内注射后在注射部位提供了可比较的蛋白表达水平，但与装载mRNA的iLNP相比，在引流淋巴结中的水平要低得多。值得注意的是，与装载mRNA的iLNP相比，mRNA和空iLNP的混合物在诱导体液和细胞免疫方面的效率要低得多。这些结果表明，淋巴结中抗原表达在疫苗接种中的重要贡献。尽管这项研究无法精确区分iLNPs和APCs的迁移，但可以合理假设装载mRNA的iLNP可能比mRNA和空iLNP的混合物更有效地将抗原mRNA传递到淋巴结。因此，结果表明iLNP迁移到引流淋巴结在疫苗接种中的重要角色。考虑到纳米颗粒的大小对其淋巴结迁移效率的影响，mRNA iLNPs的大小也可能影响其疫苗结果。在这种情况下，之前的一项研究使用小鼠中的135批iLNP进行回顾性研究，显示了抗体产生效率和iLNP大小之间的明确相关性。这一结果支持iLNP迁移到淋巴结在疫苗接种中的参与。同时，这种相关性在NHPs中变得不那么明显，这可能反映了小鼠和NHPs之间淋巴系统解剖学的差异。 另一项研究比较了iLNP、阳离子纳米乳和阳离子脂质体的疫苗效果，揭示了每种配方的目标细胞类型影响体液和细胞免疫的诱导效率（图8(a)）。肌肉内注射后，与其他配方相比，iLNP产生了更高水平的抗体产生，但细胞免疫水平较低（图8(b)）。在报告试验中，阳离子脂质体在小鼠的引流淋巴结中诱导蛋白表达的效率比其他配方更高。在培养细胞实验中，iLNP在蛋白表达方面对肌细胞的偏好超过了树突状细胞。相反，阳离子纳米乳和脂质体在树突状细胞中显示出高效的蛋白表达。基于这些结果，作者假设阳离子脂质体在淋巴结中的有效积累和有效的mRNA传递到树突状细胞有助于细胞免疫的强烈诱导。相比之下，iLNP可能主要在肌细胞中提供蛋白表达，然后APCs摄取肌细胞释放的抗原。这一过程可能更倾向于诱导体液免疫。重要的是，非APCs中的抗原蛋白表达以几种模式对疫苗结果做出贡献。当mRNA编码分泌性抗原时，APCs可以摄取非APCs分泌的抗原。在质粒DNA（pDNA）疫苗的研究中，编码分泌性OVA的pDNA在肌肉内和皮内裸注射后产生的抗OVA抗体水平比编码膜结合或细胞质OVA的更高，显示了抗原分泌的好处。同时，在mRNA iLNP疫苗中，编码细胞相关和分泌性血凝素（HA）的mRNA显示出可比的抗HA抗体产生，表明在这种情况下抗原分泌的作用边缘化。在另一种模式中，非APCs的细胞碎片也可以在疫苗接种后表达抗原的非APCs受损时向APCs提供抗原。 图8. 不同mRNA疫苗配方的接种效果。(a) mRNA疫苗配方。(b) 针对SARS-CoV-2尖峰蛋白的受体结合域（RBD）的每种疫苗配方诱导的体液和细胞免疫。版权所有© 2022 Shi等人。 一些研究表明mRNA疫苗不需要迁移到淋巴组织就能有效地进行疫苗接种。最近的一项研究对裸saRNA进行了皮内注射，该saRNA优选在皮肤温度范围（30-35°C）内复制，但在体温或超过37°C时变得失活。裸RNA分布在注射部位以外的其他器官是不可能的，因为在迁移到其他器官的过程中裸mRNA可能会被降解。此外，其他组织中非最佳温度限制了saRNA仅在皮肤中复制。即使仅在皮肤中表达抗原，这种疫苗配方也能诱导强大的细胞免疫。另一项研究表明，即使阳离子纳米乳基saRNA疫苗的分布最小化到淋巴结或其他器官，也能通过强烈的体液免疫诱导。在saRNA疫苗中，saRNA附着在纳米颗粒的表面，与脂质层内装载mRNA的iLNP相反。该研究比较了阳离子纳米乳和iLNP之间的生物分布和疫苗效果。在小鼠肌肉内注射后，纳米乳主要将蛋白表达限制在注射的肌肉中，而iLNP在引流淋巴结和肝脏中提供了强烈的蛋白表达。然而，纳米乳比iLNP诱导了更强烈的体液免疫反应，表明迁移到淋巴结在疫苗接种中并非不可或缺。值得注意的是，纳米乳的这种局部分布有助于避免全身炎症反应，而iLNP诱导了全身细胞因子释放和体重减轻。 值得注意的是，最近的一项研究揭示了NHPs中mRNA iLNP的大量系统分布，在肌肉内注射后在脾脏、肝脏和血浆中检测到注射的mRNA。这种系统分布可能在人类中引起安全问题，包括罕见的自身免疫性肝炎和心肌炎病例。自身免疫性肝炎的人类研究揭示了针对肝脏中尖峰蛋白的CD8+ T细胞的存在。这一结果表明，T细胞可能在mRNA疫苗接种后攻击表达尖峰蛋白的肝细胞。关于心肌炎，对mRNA疫苗接种后死亡的患者进行的mRNA分布调查揭示了在几位患者的心肌中存在疫苗衍生的mRNA。有趣的是，这些患者的心脏部分可视化显示心脏损伤的证据，有巨噬细胞浸润，而这种变化在心脏中未检测到疫苗mRNA的患者中要少得多。这些结果暗示了心肌炎和iLNP分布到心脏之间的因果关系。 尽管这些研究强调了mRNA疫苗系统分布的潜在安全风险，但mRNA疫苗更倾向于超越注射部位到淋巴器官。因此，研究人员试图开发能够迁移到引流淋巴结而不发生系统泄漏的mRNA疫苗配方。例如，之前的一项研究筛选了基于引流淋巴结中蛋白表达水平的iLNP配方，使用了一组可电离脂质和具有不同混合比例的四种脂质成分的iLNP。与BNT162b中使用的iLNP相比，最佳iLNP在淋巴结中提供了增强的蛋白表达，并最小化了肝脏或其他系统器官中的表达。另一项研究通过使用大约100 nm（小）、180 nm（中）和330 nm（大）大小的iLNP来调查iLNP大小的影响，从而提供了机制上的见解。肌肉内注射后，小型和中型iLNP从注射部位泄漏出来，在肝脏中积累并提供了强烈的蛋白表达，而大型iLNP显示出从注射部位的最小泄漏。 使用iLNP以外的传递系统也可能减少mRNA疫苗的系统泄漏，因为iLNP在肝脏积累中具有积极机制。血液中的载脂蛋白E（ApoE）与iLNP结合，通过肝脏中的低密度脂蛋白受体促进其被肝细胞吸收。没有这种积极机制，一些脂多聚复合物和多聚复合物避免了在肝脏中的积累，但允许有效地传递到淋巴器官，实现安全有效的疫苗接种。脂多聚复合物的研究比较了其分布与肌肉内注射后iLNP的分布（图9(a)）。脂多聚复合物在淋巴器官中，包括淋巴结和脾脏中，提供了有效的荧光素酶表达，而在肝脏中的表达最小，而肝脏是iLNP注射后表达荧光素酶的主要器官（图9(b)）。在脂多聚复合物注射后的定量PCR评估中，83%的mRNA停留在注射的肌肉中，其余的mRNA主要分布在血液中，只有0.06%分布在肝脏中（图9(c)）。这些结果表明了脂多聚复合物有利的分布概况。这种脂多聚复合物在小鼠和NHPs中诱导了针对SARS-CoV-2的强大疫苗接种，显示出对感染的保护效果。疫苗显示出可接受的安全性概况，全身细胞因子释放和白细胞的短暂增加。 图9. 脂多聚复合物的生物分布。(a) 脂多聚复合物的制备。(b) 脂多聚复合物和装载荧光素酶mRNA的iLNP肌肉注射后的荧光素酶表达分布。(c) 通过qPCR评估脂多聚复合物注射后的mRNA分布。饼图显示了每个器官中累积的mRNA拷贝数。版权所有© 2021 Yang等人。 3.3.皮内传递 与肌肉和皮下组织相比，皮肤是一个高度免疫原性的组织，为疫苗接种提供了一个有吸引力的场所。表皮中的免疫相关细胞包括角质形成细胞、APCs（如朗格汉斯细胞）、真皮树突状细胞和巨噬细胞，以及特定的T细胞亚群，它们共同作用于触发先天和适应性免疫。角质形成细胞占表皮细胞的80%，它们表达一系列模式识别受体，并通过分泌促炎细胞因子（IL-1α、IL-1β、IFN-α、IFN-β和G-CSF）以及促进朗格汉斯细胞迁移和分化的细胞因子（IL-6、IL-10、IL-18和TNF-α），为发展免疫原性环境做出贡献。朗格汉斯细胞和真皮树突状细胞擅长捕获抗原并迁移到引流淋巴结进行抗原呈递，从而激活适应性免疫反应。真皮环境富含血管和淋巴管，吸引免疫细胞并促进它们在对促炎刺激的反应中进入淋巴流动，允许疫苗有效地传递到淋巴结。 真皮组织作为免疫器官的这些有利特征促使多年来开发皮内mRNA疫苗。早期的动物研究已经证明了皮内普罗胺/mRNA疫苗针对传染病和癌症的潜力。皮内普罗胺/mRNA疫苗还在癌症疫苗的人类临床试验中提供了可检测的抗原特异性T细胞反应。此外，针对狂犬病病毒糖蛋白的皮内喷射普罗胺/mRNA疫苗在人类中诱导了强大的中和抗体和CD4+ T细胞反应，没有严重的安全问题。皮内给药途径即使在裸mRNA疫苗中也显示出其临床潜力。在一项临床试验中，使用粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）作为佐剂的裸mRNA疫苗针对几种肿瘤相关抗原，通过诱导对抗原有反应的CD4+和CD8+ T细胞，减缓了一些患者的肾癌进展。最近，BNT162b2和mRNA-1273，这两种基于iLNP的COVID-19疫苗在临床上被批准用于肌肉内给药，它们在临床试验中被测试了皮内注射的潜力。皮内注射10μg或20μg的mRNA-1273产生了几乎与肌肉内注射100μg mRNA相当的尖峰特异性抗体，表明皮内给药在剂量节省方面的潜力。BNT162b2的临床研究评估了作为灭活疫苗接种者的增强剂量的疫苗接种结果。在这些研究中，皮内注射五分之一剂量和肌肉内注射全剂量诱导了几乎相当的针对尖峰蛋白的体液和细胞免疫反应。值得注意的是，与全剂量注射BNT162b2相比，五分之一剂量的皮内疫苗接种减轻了系统性反应原性。 一项机制研究使用NHPs对皮内和肌肉内mRNA疫苗接种进行了详细比较。在针对流感病毒的基于iLNP的mRNA疫苗中，皮内途径在产生抗原特异性抗体和CD4+记忆T细胞方面优于肌肉内途径。皮内和肌肉内iLNP给药都导致循环中性粒细胞、单核细胞和树突状细胞浸润到注射部位。值得注意的是，皮内给药刺激了CD209+残留真皮APCs的增殖。有趣的是，在皮内传递荧光标记的装载报告蛋白mRNA的iLNP后，CD1a+和CD209+真皮APCs有效地摄取了iLNP，提供了长达9天的报告蛋白表达，激活表达CD80，并迁移到引流淋巴结。这些真皮APCs可能增强了皮内传递后的疫苗效果。最近的一项研究评估了使用敲除这些细胞类型的小鼠在接种装载saRNA的iLNP后朗格汉斯细胞和常规类型1树突状细胞（cDC1）的贡献。缺乏这两种细胞类型的小鼠表现出血清中疫苗特异性抗体诱导和引流淋巴结中Tfh和GC B细胞反应受损（图10(a)）。有趣的是，那些只缺乏一种细胞类型的小鼠没有表现出疫苗效果受损，表明朗格汉斯细胞和cDC1s在mRNA疫苗接种中的冗余作用。同一研究还通过评估有无中性粒细胞耗竭的疫苗效果，探索了中性粒细胞在疫苗接种中的作用。中性粒细胞耗竭并没有显著减少Tfh和GC B细胞反应和抗体产生（图10(b)），表明在皮内mRNA疫苗接种中浸润中性粒细胞的较小贡献。如图7所示，mRNA疫苗有两种机制来获得APCs在淋巴结中的抗原表达：组织残留APCs迁移到淋巴结和mRNA疫苗纳米颗粒的迁移。在这种情况下，本节中的皮内疫苗接种研究表明，通过展示真皮组织残留APCs的关键作用，前一种机制做出了巨大贡献。同时，并非所有mRNA疫苗都受益于皮内给药途径。例如，以前的saRNA疫苗报告显示，皮内途径提供了与肌肉内途径相当或效率较低的疫苗效果。其他因素，包括抗原蛋白表达的效率、saRNA生物分布和佐剂效应，可能是这些设置中疫苗接种结果的决定因素。 图10. 朗格汉斯细胞（LCs）和常规树突状细胞1（cDC1）在皮内mRNA疫苗接种中的作用。使用iLNPs皮内注射表达HA的mRNA。(A) 在野生型（WT）小鼠或缺乏一个或两个LCs和cDC1的敲除小鼠中的抑制滴度。(B) 在疫苗接种前用中性粒细胞耗竭抗体（1A8）注射的WT小鼠中的抗体水平。版权所有© 2022 Ndeupen等人。 皮内疫苗接种途径在临床设置中面临技术困难和注射不准确的问题。这一问题促使了新的注射方法和设备的开发。其中，喷射注射器在狂犬病毒的临床试验中被使用。有趣的是，普罗胺/mRNA多聚体的喷射注射，而不是多聚体的针头注射，在人类中诱导了可检测的抗体产生。这一结果揭示了喷射注射改善疫苗效果的额外好处，大概是通过提高多聚体的传递效率。 微针提供了另一个有希望的皮内疫苗接种选择。例如，裸mRNA和脂质mRNA载体在用空心微针注射后在猪皮中提供了有效的报告蛋白表达，这种微针允许从每个针尖的孔中注入液体。最近的一项研究开发了由可溶解聚合物基质组成的微针，其中包含mRNA iLNP。微针在插入皮肤后30分钟内溶解以释放iLNP。这一系统在水平上显示出与相同iLNP的肌肉内注射相当的强大疫苗效果对抗SARS-CoV-2。此外，该系统可以在室温下耐受6个月的储存，储存后蛋白表达效率没有显著下降。 3.4.系统性传递 通过静脉注射进行的系统性给药提供了一条有效的途径，可以达到全身的器官或组织。与其它注射途径相比，其低侵入性、技术简单性和普遍适用性也具有吸引力。值得注意的是，通过系统性给药的重组蛋白癌症疫苗在治疗黑素瘤和结直肠癌方面显示出高疗效。在目标器官中，脾脏和淋巴结作为富含免疫细胞（包括T细胞、B细胞和树突状细胞）的二级淋巴器官，在疫苗接种中发挥关键作用。特别是，疫苗的主要靶器官是静脉注射的脾脏和局部给药的淋巴结。 多年来，除了mRNA疫苗领域外的研究已经解决了控制系统给药纳米颗粒生物分布的一个艰巨挑战。纳米颗粒的物理化学属性决定了它们在系统给药后的生物分布。例如，纳米颗粒应具有直径大于6纳米或分子量大于50 kDa，以避免通过肾脏肾小球滤过快速清除。尺寸在10到200纳米之间的纳米颗粒优先在肝脏中积累，肝脏是一个主要的清除器官。这一尺寸范围与肝脏窦状内皮细胞中的孔径（50-200纳米）和Kupfer细胞的大小依赖性吞噬活性一致。此外，肝脏窦状内的慢血流促进了纳米颗粒对窦状壁的捕获，肝脏的重量也是一个导致纳米颗粒在肝脏中积累的原因。疫苗纳米颗粒应避免这些清除和清除机制，以改善脾脏靶向。用生物相容性亲水性聚合物，如PEG或两性离子聚合物，涂层纳米颗粒表面，可以有效地减少纳米颗粒的肝脏摄取。PEG化肝脏窦状内皮壁，而不是纳米颗粒，也可以抑制纳米颗粒在肝脏中的积累。脾脏通过脾脏窦隙的内皮缝隙物理捕获大于200纳米的纳米颗粒，这些缝隙过滤血液成分，而微米级聚集体则受到肺微血管的捕获。此外，将纳米颗粒的表面电荷从正变为负或用亲水性聚合物修饰它们可以显著改善它们对脾脏的选择性。总的来说，略大于200纳米的大小、阴离子表面和亲水性隐形涂层可能是适合脾脏靶向的属性，而脾脏APCs的靶向配体可以进一步增强纳米颗粒在脾脏中的积累。 在mRNA疫苗领域，一项开创性研究已经证明了系统性mRNA疫苗在动物实验和人类临床试验中对抗癌症的效用。在该研究中，具有不同表面电荷的脂质体，通过改变mRNA和阳离子脂质体的混合比例制备，基于它们在系统注射到小鼠后在脾脏中的mRNA传递效率进行筛选。在报告试验中，用mRNA对阳离子脂质体的过量电荷比制备的阴离子脂质体，有效地将mRNA传递到脾脏、淋巴结和骨髓中的CD11c+树突状细胞，提供蛋白表达。这一系统在几种小鼠癌症模型中展示了有效的治疗效果，并在人类中诱导了可检测的抗原特异性T细胞。随后的临床试验通过靶向肿瘤相关抗原和新抗原展示了这一系统的强大的抗肿瘤效果。人类中的荧光-2-脱氧-2-D-葡萄糖正电子发射断层扫描（FDG-PET）显示，在这一阴离子脂质体传递后，脾脏中葡萄糖摄取选择性增加（图11），表明这一系统在人类中也成功地靶向脾脏。 图11. 通过系统给药使用脂质体靶向人类脾脏。在使用阴离子脂质体进行静脉疫苗接种后的人体中进行18F-2-脱氧-2-D-葡萄糖正电子发射断层扫描。脾脏被圈出。版权所有© 2018 Pektor等人。 这一临床成功正在促进针对脾脏的mRNA传递系统的开发。例如，向mRNA iLNP中添加阴离子脂质将iLNP从肝脏重新定向到脾脏，而iLNP具有肝脏的内在亲和性。随后的机制研究表明，添加阴离子脂质改变了血液循环中附着在iLNP上的蛋白质冠的组成，这可能决定了iLNPs的组织亲和性。同样，来自报告mRNA和聚阳离子的聚复合物在小鼠静脉注射后选择性地在脾脏和淋巴结中提供报告蛋白表达（图12(a)）。聚阳离子具有两性离子结构，向阳离子侧链添加了带负电荷的磷酸基团。在淋巴结中，CD4+ T细胞和巨噬细胞有效地表达了报告蛋白（图12(b)）。尽管阴离子纳米颗粒经常用于mRNA疫苗中靶向脾脏，但一种称为两亲性碳点的阳离子纳米颗粒也展示了选择性mRNA传递到脾脏。 图12. 使用聚复合物在小鼠中靶向淋巴组织。系统性注射编码荧光素酶（a）和tdTomato（b）的报告mRNA。（a）荧光素酶表达的分布。（b）淋巴结中表达tdTomato的细胞类型。版权所有© 2021美国化学会。 碳点是通过将疏水烷基链结合到基于多胺的纳米颗粒上制备的。通过体外筛选选出的两种碳点配方在系统注射后评估了其体内功能。其中一种实现了对脾脏的选择性mRNA传递，在癌症疫苗中诱导了有效的抗肿瘤活性。总的来说，这些系统利用纳米颗粒的物理化学属性进行脾脏靶向。然而，在大多数系统中，靶向的确切机制仍然不清楚，阐明这些机制将有助于未来合理设计脾脏靶向系统。 除了依赖于物理化学属性的策略外，配体基础系统也被追求作为一种实现细胞水平精确靶向的策略。一项开创性的研究将甘露糖配体附着在脂多聚复合物上，这增加了mRNA传递到脾脏树突状细胞的效率4倍。在应用于靶向肿瘤相关抗原的癌症疫苗时，脂多聚复合物显示出有效的抗肿瘤效果。然而，脂多聚复合物在脾脏以外的器官中诱导了蛋白表达，包括肝脏。为了提高对脾脏树突状细胞的选择性，随后的研究使用三甘露糖而不是单甘露糖作为配体。结果，三甘露糖脂多聚复合物将mRNA专门传递到脾脏，并在其他器官中最小化了传递mRNA的蛋白表达。此外，在小鼠中耗尽CD11c+ APCs后脾脏中的蛋白表达显著减少，显示出该系统在脾脏APCs中的高特异性。有趣的是，该系统诱导的CTL反应独立于I型IFN，因此即使带有1 mΨ修饰也保留了CTL活性。因此，装载1 mΨ修饰的mRNA的脂多聚复合物提供了有效的癌症疫苗，并最小化了系统性细胞因子释放的诱导。另一组使用唾液酸作为配体，靶向树突状细胞表面表达的唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素-1 (Siglec-1) 作为iLNP的配体。有趣的是，将唾液酸引入iLNP显著增加了内体逃逸效率。结果，iLNP在系统给药后允许有效的mRNA传递到脾脏树突状细胞，从而增强了抗癌症疫苗。 3.5.粘膜传递 粘膜疫苗接种可以避免侵入性注射程序，并在粘膜相关淋巴组织（MALT）中触发强大的局部和系统免疫反应。特别是，包括肺在内的上呼吸道和下呼吸道的粘膜，是针对传染病的疫苗的一个有吸引力的场所。针对COVID-19的鼻内（i.n.）给药或吸入活减毒和腺病毒载体粘膜疫苗在临床试验中显示出有希望的结果。在粘膜免疫中，分泌到粘液中的IgA在中和和消除最初进入点的外来病原体中发挥重要作用，有效预防感染。此外，鼻内疫苗接种有效地诱导交叉反应性抗体，赋予广泛的交叉保护性免疫。这一特性对于预防具有高突变率的病毒（如RNA病毒）的感染是吸引人的。有效地诱导IgA分泌需要将抗原传递到位于粘液覆盖的上皮屏障下的淋巴组织中的APCs。粘膜上皮中的M细胞介导抗原从粘膜表面到固有层的采样。因此，以前的鼻内疫苗接种研究已经尝试促进疫苗穿透粘液以被M细胞吸收，证明了这一策略的可行性。在这种给药途径中，靶向APCs也是至关重要的，其中被APCs激活的B细胞在激活的CD4+ T细胞的协助下大量分泌IgA。值得注意的是，不同部位的粘膜具有交叉对话。因此，在粘膜部位的疫苗接种可以在远处的粘膜部位诱导抗原特异性免疫，促进整个粘膜系统对病原体感染的加强。除了粘膜IgA分泌外，激活的B细胞还为全身免疫提供系统性IgG分泌。此外，粘膜疫苗接种可以诱导细胞毒性CD8+ T细胞直接杀死感染细胞或表达抗原的细胞，激励其应用于癌症疫苗。 尽管粘膜疫苗接种具有这些优点，但mRNA疫苗的应用仍然具有挑战性，很少有报告涉及这一主题。在一项针对流感病毒和SARS-CoV-2的疫苗研究中，saRNA iLNP的鼻内（i.n.）给药产生的抗体滴度比其肌肉内（i.m.）注射低10倍以上，并且细胞免疫效率较低。机制分析显示肌肉内注射后的血清细胞因子水平高于鼻内给药。因此，作者通过鼻内途径的低佐剂效应来解释i.n.路线的疫苗效率降低。随后的一项研究在i.n.、i.m.和皮内（i.d.）saRNA疫苗接种中进行了更全面的比较，使用了4种不同的疫苗配方：固体LNP、聚合物纳米颗粒、阳离子LNP和iLNP。在每种配方中，i.n.疫苗接种一致地产生了比其他疫苗途径效率低的体液和细胞免疫，即使i.n.疫苗接种使用的mRNA剂量比其他两条途径高10倍。荧光素酶mRNA报告试验显示，荧光素酶表达在i.n.给药后仅持续几天，而肌肉内和皮内注射提供了超过10天的表达。因此，通过i.n.给药引入的saRNA细胞的快速清除可能解释了i.n. saRNA疫苗接种的低免疫原性。 与此同时，几份报告在利用基于脂质和聚合物系统的i.n. mRNA疫苗接种中展示了有希望的结果。在脂质系统方面，一项开创性的研究使用了一种商业脂质试剂进行i.n. mRNA疫苗接种，在小鼠模型中预防性和治疗性给药后诱导了抗癌症活性。在另一项研究中，mRNA被装载到使用普罗胺缩合的聚乙二醇化阳离子脂质体中。这一系统在培养细胞中展示了有效的抗原表达和免疫刺激，以及在小鼠中伴随CD4+和CD8+ T细胞有效诱导的抗肿瘤活性。在最近的一项研究中，通过用阳离子脂质替代两性离子辅助脂质来增强mRNA传递效率到粘膜组织，iLNP被用于i.n.疫苗接种。结果iLNP实现了有效的mRNA传递到粘膜APCs。最终，iLNP展示了与相同系统在装载编码SARS-CoV-2尖峰蛋白的受体结合域和补体C3蛋白的融合蛋白的mRNA后肌肉内疫苗接种观察到的水平相当的强系统IgG诱导。 在聚合物系统的领域，一系列研究试图克服阻碍mRNA疫苗到达APCs的鼻上皮屏障。虽然多聚阳离子通过打开上皮细胞之间的紧密连接有效地破坏屏障，但它们可能引起组织损伤。因此，这些研究通过将聚乙烯亚胺与环糊精结合来减轻细胞毒性，从而减少电荷密度。在i.n.疫苗接种后，得到的聚复合物成功地在鼻腔和阴道腔中产生了IgA，以及IgG和抗原特异性CD8+和CD4+ T细胞。根据随后的机制研究，聚复合物在浅表颈、深颈和腋窝淋巴结中有效地提供了蛋白表达，并激活了淋巴结中的树突状细胞，从而增强了疫苗效率。在安全分析中，聚复合物没有引起血液中毒性标记物或细胞因子的增加，并且在鼻上皮和肝脏的组织切片中没有观察到异常。在最近的一项研究中，通过聚乙二醇化mRNA聚复合物传递到肺部尝试了粘膜疫苗接种。对于聚复合物的肺部传递，需要优化表面PEG密度。PEG减轻了由阳离子聚复合物引起的组织损伤，并促进了它们对粘膜的穿透，尽管它们表面密集的PEG层阻碍了进入目标细胞。疫苗研究首先通过基于传递效率到肺部的筛选优化了PEG密度和多阳离子结构。最优聚复合物在肺部APCs和上皮细胞中有效地提供了蛋白表达。在SARS-CoV-2疫苗方面，聚复合物在引流淋巴结中诱导了抗原特异性T细胞和B细胞，包括表达IgA的B细胞。此外，观察到抗原特异性组织驻留CD8+ T细胞和强粘膜IgG分泌，证明了成功诱导粘膜免疫。最终，该系统有效地保护了小鼠免受病毒挑战。然而，该系统未能诱导可检测的IgA分泌，需要进一步改进疫苗设计。 4.未来展望 mRNA疫苗需要多种功能，包括保护mRNA免受RNase攻击、以最小化非靶向分布为目标APCs和淋巴组织，以及时空控制先天免疫激活。虽然先天免疫的刺激对于有效的疫苗接种至关重要，但过度的佐剂效应可能导致不良反应并阻碍疫苗结果。在mRNA传递系统方面，mRNA纳米颗粒迁移到淋巴器官有利于疫苗效果。然而，它们广泛分布到非靶向组织，如肝脏和心脏，可能导致罕见但严重的不良反应。在mRNA疫苗中微调这些各种因素仍然具有挑战性，需要大规模筛选以确定最优的mRNA疫苗设计。例如，SM-102是一种用于批准的COVID-19疫苗mRNA-1273的可电离脂质，它是基于小鼠和NHPs中抗原产生能力从30种LNPs配方中筛选出来的。值得注意的是，可电离脂质结构的微小变化可能导致体液免疫诱导的显著差异，而pKa在6.6和6.9之间的可电离脂质往往表现出有效的疫苗效果。有趣的是，虽然五种领先的LNPs在小鼠中展示了可比的抗体产生效率，但它们在NHPs中导致了抗体诱导的大差异，强调了疫苗效力的物种特异性变化。更详细地解密结构-功能关系可能有利于未来疫苗开发，为此，正如本评论所讨论的，正在进行有力的机制分析。 前述的物种差异是纳米医学领域的一个重要问题。例如，临床前动物模型和人类之间在纳米药物生物分布上存在显著差异。吸附到纳米药物上的蛋白质冠在不同物种中的特异性变化可以通过影响克服多种生物学屏障的过程（如有限的组织扩散和不良的清除机制）来影响它们在各个物种中的分布。此外，对mRNA疫苗构成额外障碍的炎症反应在不同物种之间也有所不同。例如，小鼠对阴离子mRNA脂质体的耐受性比人类高，系统给药时炎症反应最小。小鼠在对炎症刺激的反应中更有效地产生抗炎IL-1ra，与人类相比，减轻了mRNA疫苗的系统反应原性。解决物种差异对未来疫苗开发至关重要。 尽管mRNA疫苗在对抗COVID-19方面取得了成功，但当前的mRNA疫苗仍需改进，特别是在减少反应原性方面。虽然在大流行期间，反应原性可能被认为是可以接受的，但人们需要反应原性更温和的mRNA疫苗配方，以用于反复增强针对COVID-19的免疫力，以及更广泛地应用于其他传染病。此外，强烈的反应原性也是疫苗犹豫的原因之一。关于反应原性和免疫原性（疫苗效果）是否可以分离的辩论仍在继续。在人类中，疫苗的系统反应原性在第二次剂量后比第一次剂量更常见，这表明适应性免疫在反应原性中的参与。此外，增强的反应原性与第二次剂量后系统IFN-γ分泌水平的升高相吻合，这在人类和小鼠中都有观察到。在小鼠研究中，CD4+和CD8+ T细胞是第二次剂量中IFN-γ的主要产生者，给予IFN-γ受体中和抗体减弱了巨噬细胞、单核细胞和树突状细胞的激活。这些发现表明反应原性和免疫原性之间存在密切关系。然而，IFN-γ受体中和抗体对小鼠体液和细胞免疫诱导的效率影响很小。此外，系统反应原性的强度与人类体液和细胞免疫诱导的效果之间的相关性有限。这些结果表明反应原性和免疫原性有潜力被分离。关于佐剂效应，阐明负责反应原性和免疫原性的先天免疫信号通路可能有助于开发具有降低反应原性的高效疫苗。在淋巴结中有效积累且系统泄漏最小的mRNA传递系统可能在减轻系统不良反应的同时保持效果。 虽然这篇综述主要关注佐剂效应和mRNA传递系统，但与其他策略的结合对未来mRNA疫苗的设计至关重要。旨在延长抗原表达持续时间的RNA设计，包括saRNA和环状RNA，也可以增强mRNA疫苗的效力。saRNA疫苗ARCT-154在3期临床试验中作为加强疫苗接种，比BNT162b2或mRNA-1273的两剂接种后显示出更强的免疫原性。编码SARS-CoV-2尖峰蛋白受体结合域的环状RNA在小鼠和NHPs中诱导了强大的免疫反应，尽管环状RNA和线性mRNA之间的疫苗效果几乎相当。在重组蛋白疫苗的研究中，抗原和佐剂的暴露动力学对疫苗接种结果有很大影响，持续暴露导致增强的抗体产生。因此，在mRNA疫苗中调节动力学可以提高其效力。为了实现这一点，一些报告尝试通过水凝胶控制mRNA纳米颗粒的释放。例如，与基于脂质的商业试剂复合的mRNA被装载到基于聚(2-羟乙基甲基丙烯酸酯)(pHEMA)的多孔支架上。在皮下注射后，这种支架保留mRNA超过3天，并提高了与mRNA注射相比的蛋白表达效率。最近的研究开发了一种由氧化石墨烯(GO)和线性聚乙烯亚胺(LPEI)组成的水凝胶，装载抗原mRNA和TLR7激动剂。这种水凝胶在小鼠注射后逐渐释放装载mRNA和激动剂的GO-LPEI纳米颗粒，超过一个月，同时在此期间保护mRNA免受降解。结果，水凝胶注射比纳米颗粒的注射提高了抗肿瘤效果。由mRNA编码的蛋白质的工程也大大影响疫苗接种效果。有趣的是，在mRNA疫苗中将SARS-CoV-2的尖峰蛋白工程化形成类病毒颗粒，提高了中和滴度10倍以上。在癌症疫苗中，准确的表位预测和与其他免疫疗法的结合是关键。优化佐剂效应和传递系统，结合上述其他策略，将大幅扩展mRNA疫苗在未来的潜力。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

摘要：疫苗是改善健康影响最大的药物。尽管对病原体非常有效，但癌症疫苗仍然是一个未兑现的承诺。然而，RNA技术的最新进展，加上科学和临床上的突破，加速了肿瘤抗原的发现和有效递送，使癌症疫苗成为一个诱人的前景。尽管我们正处于一个关键的转折点，未来几年将有多项随机临床试验成熟，但仍有几个关键问题：哪些抗原、肿瘤、平台和宿主能触发具有临床影响的强大免疫反应？在这里，我们用一个从抗原检测到递送的癌症疫苗原则框架来解决这些问题。通过这个框架，我们概述了使RNA技术能够快速、强大、实时地进行体细胞突变衍生的新抗原疫苗接种的特点——这是一种新兴的“理想”抗原类别——并强调了激发了人们对RNA能够实现对抗癌症疫苗持久愿景的信念的潜在特点。 1.引言 癌症免疫疗法的成功证明了免疫系统的力量可以被释放来对抗癌症。这些包括免疫检查点抑制剂（ICIs）和经过改造的T细胞在内的巨大进步，都建立在数十年关于T细胞如何识别同源抗原的发现之上，并将免疫疗法确立为肿瘤学的支柱。然而，该领域仍面临重大挑战——只有约20%的癌症对现有方法有反应，迫切需要为对当前药物不敏感的80%的癌症识别新的、有效的免疫疗法。尽管基础免疫学稳步揭示了启动、增强和维持T细胞识别癌症抗原的新策略，但值得注意的是，最成功的癌症免疫疗法都围绕着T细胞受体（TCR）与其同源抗原之间的基本相互作用。这照亮了一条道路，将最具影响力的药物应用于利用T细胞-抗原识别——疫苗——对抗癌症。 2.疫苗原则：从病原体到癌症 针对病原体的疫苗可以说是预防疾病最成功的药物。疫苗——递送抗原以诱导特定抗原免疫的药物——的成功根植于治疗性地利用免疫记忆的内在电路。也就是说，外来抗原激活免疫细胞清除威胁，并赋予一部分激活的细胞长期存在并在抗原再次暴露时重新扩张的能力。因此，预防性抗原保护未来遭遇，这是一个优雅且高效的解决方案，以保护宿主免受病原体侵害。 然而，尽管数十年来一直尝试，利用这一免疫框架对抗癌症却取得了令人失望的临床结果。然而，最近的证据表明人类T细胞能够识别转化细胞，并可以治疗性地利用，这激发了将以往癌症疫苗失败与成功病原体疫苗原则进行更密切比较的动力。作为一种有效的疫苗——无论是针对病原体还是癌症——必须从根本上向理想的宿主递送最佳抗原以激活免疫记忆，癌症疫苗的关键要素将进一步讨论（图1）。 图1. 有效的癌症疫苗需要四个关键要素 有效的癌症疫苗必须利用抗原（特异性、免疫原性、最小性、价性）、传递系统（模块化、佐剂性、速度、规模、安全性）和宿主（健康状况）的最佳特征，以持久激活目标免疫细胞（CD8+和/或CD4+ T细胞）。缩写如下：APC，抗原呈递细胞。© 2024 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center, Memorial Hospital for Cancer and Allied Diseases, and Sloan-Kettering Institute for Cancer Research, each in New York, NY. 版权所有，经许可转载。 2.1.目标抗原 疫苗最关键的组成部分是抗原（框1）。对于病原体，疫苗可以被广泛分类为抗原不可知和抗原特异性。 2.1.1.抗原不可知疫苗 抗原不可知的减毒活疫苗递送抗原和佐剂（框1），使用失去致病性但保留抗原性和佐剂性的灭活微生物。这些疫苗，如针对天花、黄热病、麻疹、腮腺炎、风疹和水痘等不变病原体的疫苗，不需要事先选择抗原，并能引发强烈的细胞和体液反应，模仿自然感染的保护性免疫。甚至单次免疫接种也能提供长达数十年的免疫。在癌症中，类似的概念是使用辐照肿瘤细胞、用自体肿瘤细胞裂解物脉冲的树突状细胞（DCs）或异质肿瘤细胞系产生的全细胞疫苗。由于这种方法同样是抗原不可知的，理论上它广泛捕获了多种癌症克隆的癌症抗原，并规避了对个别癌症或患者进行抗原选择。为了诱导抗原摄取和启动，全肿瘤细胞和DC疫苗通常与“功能性佐剂”（如刺激DCs、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞和T细胞的细胞因子、趋化因子或共刺激分子，例如GM-CSF、IL-2、IL-4、IL-6、TNF-a或IFN-g）结合使用。尽管全肿瘤细胞疫苗在临床前模型中可能有效，但临床效果大多有限，这表明抗原不可知疫苗与全细胞的概念——尽管在缺乏致病性微生物的情况下是可行的——不能线性应用于癌症。与递送基因组简单、克隆群体的减毒病原体疫苗不同，全肿瘤细胞具有更复杂的基因组，这可能会用非免疫原性的自身抗原稀释相关的免疫原性抗原。尽管尚不清楚临床效果不佳是否是由于不精确的抗原选择和递送，但鉴于最近技术进步使能够快速实时识别和递送肿瘤特异性抗原，当前疫苗大多是抗原特异性的。 2.1.2.抗原特异性疫苗 与抗原不可知的减毒活疫苗不同，抗原特异性疫苗（也称为亚单位疫苗）选择并递送免疫原性抗原（例如乙型肝炎病毒中的重组蛋白、白喉和破伤风中的灭活毒素、肺炎球菌中的细菌多糖，以及与更免疫原性载体结合的流感B型和脑膜炎球菌中的弱抗原），与佐剂复合。 目前，大多数癌症疫苗类似于病原体亚单位疫苗。这种方法需要事先为特定癌症或个体肿瘤选择抗原，这带来了根本性的挑战。与病原体不同，癌细胞是宿主衍生的，具有大量的“自我”抗原，受到中枢和外周耐受的限制（框1），因此缺乏宿主外周T细胞库中的同源抗原特异性T细胞。单个癌细胞也可能包含一系列具有不同免疫原性的“非自我”抗原。因此，最佳癌症疫苗抗原必须足够（1）癌症特异性，以限制对健康组织的非目标免疫，（2）“非自我”以在外周库中有功能性抗原特异性T细胞，这些细胞可以在抗原递送后扩展，以及（3）免疫优势以最大化对个体癌细胞的免疫反应。快速且大规模地识别最佳癌症抗原的能力一直是限制癌症疫苗发展的一个关键瓶颈。 为疫苗选择最佳癌症抗原可能具有挑战性，不仅在单个癌细胞内，而且在癌细胞集合中也是如此。由于肿瘤是遗传异质性的转化细胞集合，不同的克隆群体可能具有不同的抗原库，类似于病原体血清型。此外，这些抗原可能在内源性或治疗诱导的免疫选择压力下随时间演变，从而改变抗原层次。因此，癌症疫苗接种类似于针对快速演变的群体进行疫苗接种，类似于季节性病毒疫苗。这种假设强调了需要平衡疫苗的“最小性”、“价性”和“持久性”（框1）——即用最少的主要和次要抗原对单个克隆进行疫苗接种，广泛疫苗接种以覆盖所有癌症克隆和亚克隆，以及频繁重新采样抗原和重新疫苗接种以维持随着克隆组成演变的保护。 总之，我们认为必须选择癌症抗原以优化五个疫苗特征（图1）——特异性、免疫原性、最小性、价性和持久性。 2.2.目标递送 最佳疫苗平台必须安全地以速度、规模和强度递送抗原，同时保留上述五个关键特征。疫苗平台包括基于细胞的、基于蛋白质/肽的和基于核酸的。在这里，我们专注于RNA，它已成为创建满足前述要求的癌症疫苗的有吸引力的平台（图2）。 典型的RNA疫苗是通过体外转录（IVT）在无细胞系统中将线性化的质粒DNA模板转录成RNA，以产生模仿内源RNA结构的RNA，包括50帽、50和30非翻译区（UTRs）、开放阅读框（ORF）和聚（A）尾。通过IVT生成的RNA与传递载体复合，通常为脂质，它封装并保护RNA免于降解，并通过巨胞饮、内溶体合并和内体逃逸将RNA有效载荷传递到目标细胞的细胞质中。在细胞质中，RNA作为翻译模板产生蛋白质。翻译的蛋白质被蛋白酶降解成短肽，并用于在主要组织相容性复合体（MHC；框1）分子上呈现。RNA对癌症疫苗的关键优势包括以下几点。 图2. RNA实现快速、强效、模块化和安全的疫苗接种 RNA能够实现可行的抗原传递、内在的佐剂性以及多功能的模块化，通过多种平台和途径安全地传递任何抗原。缩写如下：UTR，非翻译区；ORF，开放阅读框。© 2024 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center, Memorial Hospital for Cancer and Allied Diseases, and Sloan-Kettering Institute for Cancer Research, each in New York, NY. 版权所有，经许可转载。 2.2.1.抗原递送和模块性 RNA可以同时编码多种蛋白质，无需体外细胞培养或蛋白质工程。由于RNA制造是序列独立的，它可以生成细胞或基于蛋白质技术无法制造的蛋白质，这是基于肽疫苗的优势。序列修改可以进一步优化RNA半衰期、反应原性、免疫原性、稳定性和翻译。这种模块性使得可以快速更新几乎任何目标抗原的制造，具有高度特异性和价性，以确保持久免疫。 2.2.2.佐剂性 RNA分子结合内体（Toll样受体[TLRs] 3、7、8）和细胞质（RIG-I、MDA5、OAS、PKR）RNA传感器，在靶细胞中产生I型干扰素（IFNs），提供强大的内在佐剂性。这一特性省去了外源性佐剂，并理论上将抗原和佐剂递送到同一抗原呈递细胞（APC）以最大化免疫原性。 2.2.3.速度、可扩展性和递送 由于RNA疫苗是直接从DNA模板通过重组酶和核苷酸三磷酸体外转录而成，它们可以快速生成（数小时）并产量高。所有反应组分理论上都可以从商业供应商处获得，作为良好生产规范等级的无细胞产品，使RNA疫苗平台高度可扩展。RNA平台还可以通过简单地更换编码序列来适应生产各种疫苗，提供了巨大的灵活性。RNA可以使用各种传递载体传递到目标细胞，包括体外和体内。RNA支持快速、高度可扩展疫苗制造的能力在COVID-19 RNA疫苗开发的速度和规模上得到了壮观的展示。 2.2.4.安全性 RNA是一种非传染性、非整合性分子（即没有插入突变或永久改变宿主基因组的风险），它通过正常的细胞过程降解，这限制了分子半衰期并防止了免疫过度刺激。此外，由于癌症疫苗可能需要针对不断演变的肿瘤进行重复剂量，RNA是合适的，因为它是一个最小的基因载体，没有抗载体免疫的风险。最近针对COVID-19的RNA疫苗的广泛应用进一步证实了RNA疫苗的高度有利的安全剖面。一致地，对于癌症疫苗，到目前为止只观察到轻微到中度的不良事件，包括全身反应如头痛、疲劳和发热。 2.3.目标宿主 从概念上讲，理想的宿主是那些在最小抗原暴露下触发最大长期免疫记忆的宿主。为了实现对传染病的这种记忆，病原体疫苗用于初级预防（即预防性疫苗）。 癌症疫苗，像病原体疫苗一样，旨在传递抗原以激活保护性免疫记忆，类似的宿主健康特征可能增强免疫力。因此，就像对抗传染病一样，这需要接种“免疫最健康”的宿主——在癌症中，这可能等同于“疾病最轻微”的宿主，以在疾病发作或复发前产生免疫力。在癌症中，宿主特征可以为预防性疫苗（即，预防癌症发作）优化的概念现在已经在病毒驱动的癌症中被证明是可行的，早期研究表明，这在二级预防（即，预防癌症复发）中也可能是可行的。然而，大多数先前的临床癌症疫苗都是在晚期癌症宿主中部署的，因此可能存在广泛的免疫学损害，例如抗原呈递的缺陷、T细胞激活的抑制以及肿瘤内交通的损害等。这些多因素宿主免疫失调可能损害疫苗诱导的抗原特异性免疫，并可能解释了早期癌症疫苗临床效果信号较弱的原因。 在晚期癌症患者中测试疫苗和其他免疫疗法药物的范式也反映了一种历史药物开发方法，这种方法针对直接针对癌细胞的细胞毒素，如化疗和靶向疗法。然而，疫苗作为前药，必须激活宿主免疫细胞，而这些细胞又必须保持长期功能。因此，我们认为疫苗单药疗法应该在能够产生和维持长期记忆和功能的宿主中部署——这在最小疾病宿主中可能是最大的，疫苗旨在用于癌症的一级或二级预防。支持这一点的是，几项针对晚期疾病患者的癌症疫苗临床试验显示了有限的临床效果，而最近在最小残留疾病患者中进行的疫苗试验显示了更强大的疫苗诱导免疫。 2.4.目标细胞 大多数病原体疫苗刺激B细胞产生中和抗体，这些抗体主要识别细胞外蛋白。这些抗体通过结合同源表位来中和病原体毒素、抑制病原体进入或通过吞噬作用、补体固定、抗体依赖性细胞毒性或其他机制杀死病原体，以保护宿主。 尽管体液反应可能在免疫肿瘤学中发挥作用，但大多数癌症免疫疗法针对的是细胞免疫，因为T细胞具有内在的细胞毒性能力，并且能够识别由MHC分子在转化细胞中呈递的细胞内抗原。因此，当前的疫苗优先考虑CD8+ T细胞，它们能够识别人类癌症抗原并通过多种机制溶解目标细胞。此外，由于持久的免疫力是疫苗的一个关键特征，因此最大化长寿命记忆CD8+ T细胞的策略也是可取的。然而，越来越多的证据表明，除了CD8+ T细胞外，CD4+ T细胞在自发性和治疗性免疫中，包括疫苗中，也起着关键作用。因此，癌症疫苗的最佳目标细胞和细胞亚群仍在不断发展。 3.新抗原作为最佳靶标抗原 作为疫苗最关键的组成部分，抗原有三个特征定义了一个能够激发特定、强大、持久且最小自身反应的强效癌症疫苗抗原：肿瘤特异性、免疫原性和克隆性。尽管癌症抗原可以来自几个类别，例如在癌细胞中选择性或过度表达的蛋白质，包括来自病毒的蛋白质，但最近从癌症特异性遗传变异中产生的新抗原（Box 1）已经成为一个理想的疫苗抗原类别。 3.1.特异性 随着癌细胞的分裂，它们累积了各种遗传变异，最常见的是非同义突变，以及插入/缺失（indels）、新融合基因产物和选择性剪接RNA转录本。 这些遗传变异的一部分产生了正常组织中不存在的新蛋白质，称为“新抗原”。最近的研究表明，新抗原在人类癌症中刺激内源性T细胞，并且它们的存在与多种癌症中的T细胞活性相关。此外，癌症新抗原是生存的预后因素，受到自发编辑的影响，并且诱导临床免疫疗法的成功。因此，新抗原是肿瘤特异性的、由肿瘤发生产生的基本副产品，使免疫系统能够识别癌细胞，因此是理想的癌症疫苗抗原类别。 目前，由于新抗原必须在实时中快速识别以产生临床疫苗，计算技术仍然是识别新抗原的主要方式。在这里，下一代测序（NGS；全外显子或全基因组与RNA测序和患者特异性人类白细胞抗原[HLA]分型）识别在正常组织中不存在的肿瘤中表达的突变作为新抗原。新抗原是否可以通过较少侵入性的肿瘤细胞采样方法（例如，循环肿瘤DNA或其他检测液体活检中的肿瘤DNA的策略）被检测到，仍然是一个正在进行的研究领域。 3.2.免疫原性 尽管NGS识别了癌症特异性新抗原，但新抗原的免疫原性各不相同。因此，使用专门的下游计算策略进一步选择和排名免疫原性部分。尽管目前可用的计算工具准确性有限，但它们仍然是当今临床预测策略的主流。 目前，一个免疫原性新抗原必须满足两个要求：新抗原必须产生一个结合MHC-I或MHC-II分子的新表位（Box 1），并且呈现的新表位必须逃避宿主耐受性，以在库中繁殖并激活同源TCR（识别）。计算工具分别估计每个要求。 3.2.1.估计呈递 翻译。在通过NGS识别突变后，通常通过RNA测序获得的RNA表达可以估计一个突变是否被翻译成蛋白质以及翻译蛋白质的丰度。将RNA转录本丰度纳入新抗原识别的理由是观察到较高的RNA转录本丰度可以抵消较低的肽-MHC结合亲和力。一致地，转录本表达幅度与肽-MHC复合物密度相关，具有较高转录本的新抗原是T细胞的靶标，并且转录本下调被认为是一种补偿性免疫逃逸机制。对于疫苗来说，转录本表达已被用于优先选择疫苗的新抗原。MHC结合。一个翻译后的新抗原被呈递给T细胞，如果它产生一个结合MHC I或MHC II分子的新表位（Box 1）。 为了识别结合在宿主MHC分子上的表位，理想情况下，需要分离肿瘤细胞，并通过液相色谱与串联质谱法鉴定结合到患者特异性HLA等位基因上的肽段。这种方法理论上可以捕获最广泛的MHC呈递肽段，并且可以包括翻译后修饰和非典型抗原（即来自编码区序列之外的抗原，以及非典型抗原处理机制）。 尽管这种方法可以鉴定肿瘤抗原，但它需要实时的体外抗原纯化，这限制了快速和大规模检测抗原的能力。这一挑战，加上获取足够新鲜实体瘤样本的技术障碍，以及低灵敏度和样本重现性，限制了免疫肽组学在临床新抗原检测中的当前应用。 为了匹配临床检测新抗原所需的速度和规模，各种计算工具被用来估计新抗原是否能产生结合患者特异性HLA分子的新表位。这些计算工具是基于神经网络构建的，它们在体外实验测量的MHC-新表位结合亲和力和人类及小鼠的质谱免疫肽组上进行训练。这些工具倾向于更常见的HLA等位基因，尽管已有努力利用MHC序列同源性来估计与罕见HLA等位基因的表位结合亲和力，这些罕见等位基因的实验数据很少。其他工具模拟了MHC结合之前的分子途径，例如蛋白酶体切割和内质网转运，以及其他结合特征，例如MHC-新表位稳定性，但这些额外参数是否提供额外的准确性仍然不清楚，因为当前的结合工具是在包括这些早期步骤的MHC洗脱配体上训练的。绝对结合亲和力的不准确性可以通过测量相对或与野生型（WT）表位的差异结合亲和力来抵消。然而，预测体内免疫原性的最优结合阈值仍然不清楚，因为具有低预测结合亲和力的新抗原在体内可能是免疫原性的。 3.2.2.估计T细胞识别 并非所有MHC结合的新表位都会被T细胞识别。相反，由于中心和外周耐受性会删除和失活与高亲和力的生殖系编码MHC结合自身肽段的TCR，因此，幼稚的外周库缺乏识别自身表位并与抗原性相似的新表位交叉反应的TCR。因此，只有与WT表位足够“抗原性距离”的新表位才可能逃避中心和外周耐受性，并在库中具有同源TCR。与呈递不同，呈递在当前新抗原选择流程中研究得更好并被纳入，而识别则较少，目前通过以下策略进行估计。 自身相似性和不相似性。与WT肽段的差异性可以识别足够抗原性距离以使其具有免疫原性的新抗原。差异性通过与人类蛋白质组、WT表位的差异性，或者与病原体表位的相似性来估计。确切的生物学原理，即为什么新表位序列与病原体序列的相似性能够改善免疫原性新抗原的预测，尚不清楚——即，是否存在“理想”的表位特征，可被人类TCR库识别，或者它是否代表通过预先存在的T细胞对新抗原交叉反应的异源免疫。由于特定TCR的产生是通过生殖系编码序列的重组而发生的，这被认为是随机的，可能重组倾向于产生更频繁和强烈识别某些抗原的TCR。虽然缺乏直接证据，但这种可能的库对偏好识别具有“外来性”特征的肽段的固有倾斜可能解释了为什么自身不相似性的代理增强了免疫原性新抗原预测。 类似于不相似性，自身相似性可以识别与WT表位过于抗原性相似的新抗原，因此受到宿主耐受性的影响。最近的努力已经确定，对于由单个氨基酸替换产生的表位，替换大小、疏水性、生化家族和位置（即，TCR-肽-MHC接触区之外的替换）可以广泛估计表位之间的抗原相似性。总体而言，估计自身相似性和不相似性的稳健框架依赖于实验验证，这是完善和测试的活跃领域。 TCR结合。与自身相似性/不相似性不同，它通过比较新肽段与其他肽序列来预测免疫原性新抗原，新肽段-MHC复合物是否直接结合TCR也已被研究，但这是预测免疫原性新抗原最不发达的特征。一些当前策略包括估计氨基酸组成是否有利于与TCRs的相互作用，纳入对配对α和β TCR链的训练数据，以及基于迁移学习的模型来预测TCR-新抗原结合特异性。 黑箱方法。尽管当前的工具，如神经网络，可以熟练地提供现成的模型结构来分类新抗原识别的各个方面，但机器学习的最新进展可能允许自然改进现有方法来预测免疫原性新抗原。由于这些方法需要更大的实验数据集，它们可能随着这些数据的可用性而变得更加可行。 3.3.克隆性 由于癌症是由具有不同突变集合的不同肿瘤克隆组成的异质混合物，因此疫苗需要完全针对这种异质群体，以避免未靶向克隆的无限制生长。因此，新抗原靶标选择应最大化肿瘤克隆覆盖。为此，采用两种策略：针对（1）来自（如驱动突变）的截断突变的新抗原，以及（2）完全涵盖所有肿瘤克隆的乘客突变集合。特定策略是否诱导更持久的T细胞反应仍然未知。 3.3.1.截断新抗原 针对截断突变有几个吸引人的优势——由于它们在定义上存在于绝大多数肿瘤克隆中，它们满足了最大化肿瘤克隆覆盖的要求。此外，如果截断突变是驱动因素，诱导的免疫可能针对癌细胞的致癌功能。尽管在治疗上理想，但大多数驱动内源性免疫的免疫原性新抗原似乎不是截断的，因为免疫原性新抗原将受到T细胞选择压力，使免疫原性新抗原在癌细胞进化过程中变为亚克隆。此外，有证据表明，由于MHC-I呈递不佳和可能选择具有较弱免疫原性的驱动突变的进化压力，驱动突变可能是较弱的抗原。一致地，尽管已有报道称肿瘤突变的体外免疫原性，但免疫原性驱动新抗原很少见，并且似乎不是主要的内源性免疫靶标。尽管克隆新抗原的存在与增强对ICIs的免疫反应相关，这些ICIs放大了新抗原特异性T细胞，并且早期工作表明克隆肿瘤的存在可能与增强的疫苗免疫相关，但如果这种相关性意味着肿瘤、新抗原或两者的致敏特征仍然不清楚。尽管如此，针对在各种癌症类型和患者中常见的驱动新抗原，如在突变的KRAS或TP53中产生的新抗原，仍然是许多正在进行的努力开发高度可扩展的现成疫苗的重点，最近的KRAS肽疫苗试验显示在一部分患者中可测量的免疫反应。 3.3.2.乘客新抗原 针对乘客突变的策略有一个缺点，它们发生在肿瘤发生的后期，并且通常是亚克隆的。它们也可以驱动内源性免疫，受到编辑，因此会不断进化。然而，由于它们构成了一个更大的多样化的癌细胞特异性抗原库，它们允许选择最有力而不是最普遍的抗原。此外，由于乘客突变在功能上可能与致癌性相比更脱钩，它们可能会在长期内最小化疫苗抗性。事实上，目前大多数团队选择具有保守免疫原性特征的乘客新抗原，而不是最普遍的新抗原，用于疫苗（表1）。 为了选择覆盖所有肿瘤克隆的疫苗乘客新抗原，必须确定肿瘤克隆结构，将新抗原映射到克隆上。目前，这是通过从大量DNA测序（全外显子或全基因组）中计算每个突变的变异等位基因频率（VAFs），将VAFs聚类到克隆中，然后构建系统发育树来实现的。此外，选择不同克隆中不同的新抗原疫苗靶标，以最大化疫苗价力，既可以提高免疫反应的概率，最大化诱导疫苗免疫的克隆覆盖，理论上也可以最小化克隆生长。直接使用单细胞技术（如单细胞DNA测序）实验测量肿瘤克隆结构和异质性，目前尚未在临床上适用。 3.4.疫苗新抗原选择的其他考虑因素 3.4.1.热肿瘤和冷肿瘤 新抗原选择原则可能在具有更强（热）和较弱/缺失（冷）内源性免疫针对新抗原的肿瘤中有所不同。 免疫学上的“热”肿瘤显示出针对新抗原的更强内源性T细胞免疫。这些肿瘤通常突变程度较高（例如，黑色素瘤、非小细胞肺癌、错配修复缺陷癌症），具有足够的内源性新抗原特异性T细胞免疫，使肿瘤对ICIs的免疫增强敏感。因此，疫苗新抗原必须从抑制宿主抑制途径的主导内源性靶标中选择，从不驱动内源性免疫的亚主导新抗原中选择，或两者的组合。针对主导内源性靶标可以使与ICIs的合理组合进一步放大新抗原特异性T细胞；然而，疫苗单药疗法可以重新放大ICI增强的新抗原特异性T细胞以驱动临床效益的程度仍然不清楚。一种可能性是，对于热肿瘤，ICIs增强的主导新抗原特异性免疫，针对亚主导新抗原的疫苗将扩大和堆叠免疫反应，以赋予持久性。 免疫学上的冷肿瘤表现出针对新抗原的较弱内源性T细胞免疫。这些肿瘤通常突变程度低/中等，只有少数患者表现出针对肿瘤新抗原的自发性T细胞免疫，这间接支持了缺乏预先存在的、被抑制的新抗原特异性T细胞，这些T细胞会使肿瘤对ICIs敏感。历史上，这些肿瘤被认为是不适合疫苗的，因为它们的突变数量少，因此产生适合疫苗的新抗原的可能性低。几个团队挑战了这一概念，证明突变程度低的癌症，如结肠癌、胰腺癌和胶质母细胞瘤，确实含有新抗原，这些新抗原可以预测临床结果，驱动选择患者的内源性T细胞，并且可以通过疫苗增强治疗效果。在这里，大多数患者将通过疫苗对新抗原进行新的T细胞启动。此外，由于激活的T细胞在初次启动后上调免疫检查点，疫苗可以与ICIs协同作用。观察到疫苗可以在冷肿瘤中诱导强大的免疫反应，这包括目前对ICIs不敏感的80%的癌症，可能特别重要，鉴于它们巨大的未满足需求，总体预后差，重大的全球医疗负担，以及继续依赖上一代细胞毒素药物，如化疗，作为当前的临床标准。 3.4.2.新抗原的数量、类型、位置和演变 疫苗的最佳新抗原数量仍然不清楚。当前的个性化疫苗接种策略包括多个新抗原，最近的试验中从20到34不等（表1），主要是为了最大化价力。虽然理论上可以将整个突变组纳入疫苗，但疫苗中的更多新抗原可能导致免疫优势，减弱对亚主导和可能更具临床相关性靶标的免疫。理论上，理想的疫苗新抗原数量不应是一个预定的数量，而是最大化最小性和价力所需的最小新抗原数量。此外，尽管MHC-I限制的新抗原驱动CD8+ T细胞被认为是有效癌症疫苗的主要靶标，但MHC-II新抗原在小鼠模型中实现了最佳的抗肿瘤免疫，并且也应该纳入疫苗中。 如果新抗原是内源性T细胞靶标，它们可能会受到免疫选择压力，并随着肿瘤的进展而演变。因此，新抗原的组成和层次可能在原发和复发/转移部位之间有所不同，需要对多个肿瘤的患者进行多点采样。类似地，由于这也可能影响疫苗接种后演变的肿瘤，可能需要重新采样新出现的肿瘤，并用新的新抗原靶标重新接种疫苗，以实现持久的反应。 4.RNA作为最佳疫苗平台 RNA最初被认为是一种不稳定的分子，容易被细胞外的RNA酶降解，因此不适合作为治疗剂。然而，通过坚持不懈的科学努力，对RNA细胞摄取、分子稳定性和蛋白质翻译进行工程化和修饰，导致了1990年首个基于RNA的疫苗的出现。这些进步，以及Kariko和Weissmann获得诺贝尔奖的发现，即mRNA基础修饰可以避免被先天免疫受体不必要的免疫识别，共同改变了我们对如何在体内工程化和传递mRNA给细胞的理解，为有效的mRNA疗法奠定了基础。 4.1.优化稳定性和翻译 为了增强RNA稳定性、优化翻译并增加抗原传递，通常使用一系列药理学RNA修饰。治疗性RNA编码序列可以被50和30 UTR元素所包围，通常来自自然表达的α和β球蛋白RNA，具有可以增加RNA半衰期和蛋白质翻译的50帽状结构。新型合成50序列也可以增强RNA的可用性并增强抗原呈递。合成帽状类似物和加帽酶进一步增加蛋白质翻译。最佳的聚(A)尾巴（带有自由30端的120个核苷酸）可以防止RNA被外切酶降解并增强RNA翻译和稳定性。密码子优化和G-C含量富集可以进一步改善蛋白质翻译，并通过算法获得。在ORF中的序列修饰，如MHC-I转运域和与溶酶体相关的膜蛋白，可以将有效载荷定向到溶酶体隔室，并在MHC-I和MHC-II上提高抗原呈递效率。ORF可以通过连接序列连接，最近的一项研究表明，基于丙氨酸的连接序列可能比基于甘氨酸的连接序列更增加抗原处理和呈递。最后，修饰的核苷类似物可以增加翻译。尽管最近的一项研究表明某些核苷修饰可能导致移码，但这一点的重要性仍然不清楚。 RNA的固有佐剂性可以触发强大的I型IFN产生，但也可能抑制蛋白质翻译。因此，限制RNA佐剂性的策略已经被纳入RNA药物产品设计和制造中。一个不希望的先天刺激是IVT反应中产生的双链(ds) RNA污染物。由于dsRNA触发病原体关联分子模式，包括TLR3、RIG-I、MDA-5和NLRP3，以产生I型IFNs，因此，通过反向相快速蛋白液相色谱和高性能液相色谱从酶制备的RNA中消除dsRNA的策略已经被Kariko、Weissman和同事开创。这种纯化进一步在原代人类DCs中将蛋白质翻译提高多达1000倍。为了限制来自单链RNA的先天刺激，用天然发生的化学修饰核苷类似物修饰的RNA，如假尿苷或N1-甲基假尿苷，进一步限制了TLR3、TLR7和其他先天感应器产生的I型IFN，同时抑制了dsRNA识别，从而也在体外和小鼠体内提高了蛋白质产量。这种修饰的RNA疫苗在预防COVID-19方面引起了高度有效的保护性免疫，并且已经获得食品和药物管理局的批准，有几种其他核苷修饰的RNA病原体疫苗正在进行临床开发。 由于抗癌免疫的主要免疫臂是直接和间接使用I型IFNs的CD8+ T细胞，I型IFNs在癌症疫苗佐剂性中可能发挥更关键的作用。事实上，I型IFN受体缺陷（Ifnar1或Ifnar2）增加了小鼠化学致癌诱导的肉瘤发病率，Ifnar1-/- DCs显示出向CD8+ T细胞交叉呈递肿瘤抗原的受损，并未能拒绝免疫原性肿瘤。I型IFNs还诱导DC成熟和淋巴结迁移，增加细胞毒性T细胞中的穿孔素I和颗粒酶B表达，并促进记忆T细胞的存活，突出了I型IFNs在宿主对转化细胞反应中的重要性。一致地，在使用未修饰RNA疫苗的临床癌症模型中，Sahin和同事报告说，IFNAR缺陷（Ifnar1-/-小鼠）和抗IFNAR1阻断损害了DC激活，CD8+ T细胞获得颗粒酶B、IFN-g、TNF-α和脱颗粒功能，并减弱了体内抗肿瘤疫苗效力。此外，Seder和同事使用一种激活TLR7/8的自组装纳米颗粒疫苗的小鼠结肠癌模型，显示I型IFN消除了抑制性肿瘤内单核细胞，以增强系统性疫苗抗肿瘤效力。未修饰的RNA确实在人类单核细胞中诱导了更高水平的I型IFN反应，迄今为止，大多数RNA癌症疫苗使用未修饰的核苷类似物。 4.2.RNA传递策略 裸露（未配方）RNA可以局部给药，但会被细胞外的RNA酶迅速降解。RNA还具有负电荷的磷酸二酯骨架，体积大（104-106 Da），亲水性，这阻止了它进入阴离子脂质双层和细胞质，在那里它可以被翻译成蛋白质。尽管有几种技术允许RNA在体外培养皿中和在小鼠体内使用物理方法传递，如电穿孔和基因枪穿透细胞膜，但在体内疫苗接种需要将RNA传递给免疫细胞。已经使用了两种方法：体外RNA DC加载与细胞重新输注，以及RNA复合或不复合载体的全身注射。 4.2.1.DC RNA加载 DCs是主要的专业APC，能够激发细胞介导的抗肿瘤免疫，并且对RNA转染非常敏感。这些特性，以及能够直接和特异性地将免疫原传递给APC，使得体外RNA加载具有吸引力。通常通过电穿孔将RNA加载到从患者体内收集的DC上，电穿孔使用高压脉冲创建膜孔，允许RNA进入细胞质。缺点包括需要实时操作自体细胞产品以生成疫苗。这种缺点，以及直接将免疫原传递给体内目标APC的更大简单性，激发了直接RNA传递系统的发展。 4.2.2.RNA的系统给药 最常见的RNA传递系统使用脂质/基于脂质的材料。脂质通过静电相互作用包裹RNA，保持RNA稳定性，防止细胞外RNA酶降解，并使细胞内体摄取，随后通过膜破坏逃脱，允许RNA胞质释放。其他传递系统包括聚合物和基于肽的车辆，如精氨酸。 第一代RNA疫苗使用了阳离子脂质，如1,2-二-O-十八烯-3-三甲基铵丙烷及其合成类似物二油酰-3-三甲基铵丙烷。然而，由于它们的正电荷触发炎症反应，并且为了将这些RNA-脂质复合物(RNA-LPX)从肝脏/肺部重定向到二级淋巴器官和骨髓中的DCs，引入了电荷修饰。使用这种封装策略的RNA疫苗的静脉给药在临床肿瘤模型中产生了强大的抗原特异性CD8+ T细胞，具有效力。 目前，基于脂质的纳米颗粒(LNPs)是疫苗中最常用的RNA传递平台(RNA-LNP)，包括所有SARS-CoV-2 RNA疫苗。LNPs包括四个组成部分——一种阳离子脂质、胆固醇、一种辅助磷脂和一种聚乙二醇化脂质——共同包裹和保护RNA有效载荷。阳离子脂质是LNPs最重要的组成部分——它们促进自组装成病毒大小的颗粒，并且在血清中的生理pH下保持中性电荷，这两者都延长了半衰期并促进了内体摄取（酸性内体环境调节正电荷并介导膜融合和胞质RNA释放）。LNPs的其他组成部分包括胆固醇，它填补脂质间隙以增强纳米颗粒稳定性；辅助脂质，它有助于纳米颗粒流动性并促进脂质相变以协助内体膜融合；以及聚乙二醇化脂质（聚乙二醇与脂质锚结合），它稳定LNP大小，减少RNA聚集和吞噬作用，限制肾脏清除，并增加半衰期。脂质传递车辆不仅可以传递RNA（从而传递抗原），还可以提供内在的佐剂信号。最近的工作表明，脂质可以增强NLRP3炎症体激活，以增强RNA诱导的IL-1b产生，并且激活STING途径以诱导APCs的成熟。 由于传递途径可以影响传递的免疫原的大小和持续时间，从而影响随后免疫的效力，因此正在测试各种传递封装RNA的途径，包括局部（肌肉内、皮内、淋巴结内、鼻内、皮下和肿瘤内）和全身（静脉内、腹腔内、鞘内和气管内）。鉴于直接将有效载荷传递给APCs的明显优势，Sahin和同事的早期研究直接将裸露的RNA注射到二级淋巴器官（腹股沟淋巴结）中，通过巨噬细胞吞噬作用将模型抗原传递给DCs，刺激抗肿瘤免疫，并延长了淋巴瘤和黑色素瘤模型中小鼠的存活时间。类似的结果随后在临床前模型中发现，使用裸露的RNA将肿瘤相关和病毒抗原传递到黑色素瘤、淋巴瘤、肥大细胞瘤、白血病和HPV驱动的癌症的淋巴器官。直接注射到另一个淋巴结（脾脏）也刺激了抗肿瘤免疫并在黑色素瘤小鼠模型中有效。此外，还测试了皮内和皮下疫苗传递，以优化有效载荷转移到皮肤中的APCs，许多APCs位于皮肤中。皮内RNA注射在早期研究中被证明可以延迟免疫原性致癌物质诱导的纤维肉瘤。类似地，皮内疫苗接种被证明可以在自发性前列腺癌模型中触发细胞毒性T细胞。还测试了其他传递途径，包括鼻内、肌肉内和肿瘤内注射RNA，传递固有的RNA佐剂信号或编码的共刺激。 4.3.其他疫苗平台 上述特点突出了RNA作为癌症疫苗有吸引力的传递平台。除了RNA，临床上用于传递新抗原和其他肿瘤抗原的其他传递平台包括合成肽和DNA质粒。肽疫苗已用于预防HPV和乙型肝炎的疫苗，以及作为黑色素瘤和胶质母细胞瘤的新抗原疫苗。尽管肽疫苗具有有利的安全性概况，但基于肽的个性化新抗原疫苗的一个主要缺点是无法制造针对相当一部分序列的临床级新肽，这阻止了对任何已识别的新抗原的无偏疫苗接种。此外，肽疫苗主要产生了CD4+ T细胞，与最近RNA-LPX疫苗可以强烈诱导细胞毒性效应CD8+ T细胞的证据形成对比，尽管这是否是疫苗平台、新抗原选择或肿瘤类型的结果尚不清楚。尽管基于DNA的新抗原疫苗也在临床上使用，并且显示出与RNA类似的理想特征，具有TLR9依赖的内在佐剂性，并且能够编码任何新抗原，但插入突变的可能性仍然是一个潜在的安全缺点。 5.RNA癌症疫苗在临床上 随着检测突变衍生新抗原的工具在临床兼容的时间框架内发展，早期针对实体癌症的RNA癌症疫苗的临床试验集中在共享的肿瘤相关抗原(TAAs)作为“现成”目标。对于有多个可靶向TAAs的前列腺癌，针对晚期患者的四个TAAs的皮内精氨酸配方RNA疫苗的1期和1/2a期临床试验发现，58%的接种患者对多个抗原有反应，但免疫反应在时间上不一致。同样，在Lipo-MERIT试验中，静脉注射RNA-LPX编码TAAs诱导了部分反应，在抗PD-1治疗的晚期/转移性黑色素瘤患者中，50%的目标病变退缩，具有显著强烈的抗原特异性CD4+和CD8+ T细胞反应，包括在选定患者中大约1.2年后可检测到的抗原特异性CD8+ T细胞。 与此同时，NGS和计算生物学的技术进步使得实时、个性化的新抗原预测与临床疫苗接种相兼容。在这种方法中，通过活检或手术切除对肿瘤进行采样、测序、识别新抗原、优先排序、实时制造疫苗，并在大约14周内交付给患者，最近在仅9周内。 6.个性化RNA癌症疫苗的人体首项研究 在13名患有III/IV期黑色素瘤且复发风险高的患者的腹股沟淋巴结中，通过直接注射未修饰的RNA，编码多达10种个性化新抗原。疫苗在所有患者中诱导了针对多种（平均三种）新抗原的特异性免疫反应，其中三分之一的新抗原扩大了预先存在的T细胞，三分之二的新抗原扩大了新的T细胞（57% CD4+，17% CD8+，26%两者都有），这些T细胞展示了多功能细胞因子的产生和溶解能力。总体而言，60%的预测新表位具有免疫原性。新表位特异性T细胞表达了PD-1，PD-1阻断进一步增强了疫苗反应，并且接种疫苗与减少转移相关。这项研究为免疫学上的“热”肿瘤中的个性化新抗原疫苗提供了第一个原理证明，并为随后在热、晚期癌症中的研究奠定了基础。 与上述原则一致，即疫苗可能在疾病最轻微的宿主中诱导最大的免疫活性，我们的团队完成了首个针对胰腺癌的个性化RNA新抗原疫苗的试验——这是一种免疫学上的“冷”癌症，被认为含有很少的新抗原，因此被认为不适合疫苗接种。在这项试验中，手术可切除的胰腺癌患者的肿瘤被切除，然后接受顺序的PD-L1阻断、静脉注射未修饰的RNA-LPXs（编码多达20种个性化新抗原）和化疗。在16名可评估的患者中，疫苗在50%的患者中诱导了高幅度的多功能CD8+ T细胞，包括针对单一（50%）和多种（50%）新抗原的T细胞。与接种疫苗的黑色素瘤患者的发现相反，我们发现PD-L1阻断和疫苗接种扩大了不重叠的T细胞克隆，这可能是因为在胰腺癌中，大多数患者的内源性新抗原特异性免疫反应低/低于阈值，无法用PD-L1阻断来增强，但可以用疫苗来诱导新的反应。一致地，疫苗诱导的T细胞在接种疫苗后长达1.9年的时间内在血液中持续存在。此外，尽管只有24%的预测新抗原具有免疫原性，但有疫苗诱导T细胞的患者表现出延迟复发，这一结果促使全球多中心2期随机试验测试疫苗在胰腺癌中的效力。 7.测量疫苗免疫反应 为了确定新抗原疫苗是否刺激了免疫反应，需要适当的生物标志物。在病原体疫苗中，通过针对病毒组分的血浆抗体滴度来测量B细胞反应，或针对共享病原体表位的肽-MHC四聚体来测量T细胞反应，相对来说比较简单。然而，由于新抗原疫苗诱导对患者特异性抗原的免疫反应，这需要一种策略来追踪可以广泛扩展的个性化抗原特异性反应。新的测序技术显示出解决这一挑战的希望。 在疫苗研究中，最常用的测量抗原特异性T细胞的方法是使用抗原特异性体外T细胞敏感性试验（例如，酶联免疫吸附试验[ELISpot]）或荧光标记的肽-MHC多聚体。这两种试验在速度和规模上都有使用上的挑战——两者都是劳动密集型的，需要体外湿实验室实验/校准，难以标准化，并且依赖于定制试剂的可制造性。更常见的免疫学技术，如通过流式细胞仪进行的表型分析，不足以从背景噪声中区分出新抗原特异性T细胞。 通过测序TCR CDR3域（TCR Vb测序）来识别T细胞克隆的最新进展，提供了更大的灵敏度，以高通量方式准确追踪个体T细胞克隆。TCR Vb测序可以逐个克隆解析，并已用于在针对病原体和癌症的RNA疫苗试验中追踪疫苗诱导的T细胞克隆。这种方法还可以与额外的依赖TCR序列的工具配对，如单细胞RNA/TCR a/b测序，以测量疫苗扩大的T细胞克隆的表型和功能。 动态追踪疫苗诱导的T细胞最重要的理由是实时监测疫苗反应，并根据需要重新干预，类似于当前用病原体疫苗的抗体滴度下降来增强免疫的做法。如果疫苗诱导的T细胞克隆下降到保护阈值以下，或者变得耗竭，可以根据需要重新接种疫苗（或重新激活）。识别适合响应或注定会丧失功能的T细胞的表达标志物，可以进一步发现推动T细胞长期持久或耗竭的疫苗特征。鉴于这些测序工具比目前的方法更适合扩展，因为它们在患者间的校准更简单，且不依赖于定制试剂。 一个并行的考虑，特别是考虑到当前计算新抗原预测工具的不准确性，是检查疫苗诱导的T细胞是否正确识别了在自体肿瘤细胞上处理和呈现的抗原。这种验证需要将疫苗诱导的T细胞与自体患者衍生的肿瘤材料进行体外共培养。然而，这些研究目前在后勤上存在挑战，因为对于某些肿瘤小和/或基质含量高的癌症，大部分肿瘤材料将需要分配给疫苗制造。此外，患者肿瘤衍生的细胞系可能无法捕捉所有异质的肿瘤克隆进行体外筛选，因此，缺乏反应性可能错误地意味着缺乏肿瘤特异性T细胞活性。是否可以用肿瘤衍生的类器官克服这一限制，仍然是一个未解决的问题。 8.疫苗抗性的成因 尽管由于大规模辅助癌症疫苗临床试验的数量有限，目前对癌症疫苗抗性机制的全面理解还不是很深入，但从治疗性疫苗和其他T细胞疗法的临床试验中了解到的抗性机制可以提供合理的见解。 疫苗失败主要有两种情况：（1）疫苗未能产生免疫反应；（2）随着时间的推移，疫苗诱导的免疫反应逐渐失效。 8.1.疫苗因素 未能优化疫苗的基本要素（特异性、免疫原性、最小性、价性和持久性）、疫苗传递或疫苗时机可能导致失败。抗原特异性和免疫原性不足可能导致初次失败，因为缺乏肿瘤特异性的自身抗原和与佐剂不足（因此免疫原性弱）的抗原可能诱导耐受性。价性不足的疫苗，因此无法充分覆盖克隆，可能导致逃逸克隆的出现。未能优化抗原层次结构的疫苗可能导致优势反应，饱和且可能偏斜的反应。同样，传递效果不佳的疫苗可能无法将T细胞激活到足够高的水平或长期持久，从而导致初次或二次疫苗失败。最后，由于在疾病最轻微的宿主中癌症复发是随时间不对称的，大多数复发发生在早期，随后逐渐减少，因此在癌症易感窗口期间最大化疫苗免疫可能对预防二次失败至关重要。 8.2.肿瘤因素 从T细胞选择压力下出现的耐药克隆可能适应限制新抗原呈递或T细胞杀伤的观察中，可以了解到导致疫苗失败的肿瘤内在因素。限制新抗原呈递的适应包括肿瘤抗原的下调，以及MHC表达的下调或失活，导致失去肿瘤特异性疫苗诱导的反应。肿瘤细胞还可以通过获得性遗传改变来抵抗T细胞的细胞毒性，这些改变限制了肿瘤细胞对细胞因子的敏感性，包括IFN-g和TNF-a，或通过表达抑制CD8+ T细胞的配体。肿瘤细胞也可能利用策略将T细胞排除在肿瘤微环境之外，例如通过激活β-catenin信号或PTEN的丢失。这些策略在治疗性疫苗的抗性中可能起主要作用，而不是针对初级或二级癌症预防的疫苗接种。 8.3.宿主因素 由于有效的疫苗需要能够产生并持久维持疫苗诱导细胞的宿主，癌症发展和治疗过程中获得的宿主损害可能会改变疫苗诱导细胞的动态和功能，并导致疫苗失败。考虑到最佳疫苗接种应该在最适合的宿主中进行——例如在疾病最轻微的宿主中进行辅助疫苗接种——任何和所有接种前的治疗，包括化疗（新辅助或辅助）、手术和其他治疗，可能会影响宿主的健康状况、疫苗接种潜力以及疫苗诱导的免疫细胞的动态和功能。事实上，接种前的治疗可能会影响B细胞和对SARS-CoV-2 RNA疫苗的抗体反应，类似的接种前治疗可能会影响T细胞。一致地，接种前使用类固醇可能会影响疫苗诱导的T细胞，但某些化疗似乎不会，这表明特定治疗可能会不同地影响疫苗诱导的免疫。由于淋巴区域对于产生强烈的疫苗诱导免疫至关重要，完整、功能性的淋巴结区域的存在可能会影响宿主产生高强度免疫的能力，因为有观察表明，如果脾切除术先于静脉注射RNA-LPX新抗原疫苗，反应会减弱。疫苗诱导的T细胞也可能随着时间的推移通过频率或功能的丧失而失去功能。 9.展望 尽管在对抗传染病方面取得了巨大成功，但针对癌症的疫苗尚未成为现实。然而，RNA技术的进步，加上在抗原发现和临床传递方面的科学突破，极大地增强了人们对癌症疫苗的兴趣，临床试验现在涵盖了各种癌症。随着这些试验似乎准备实现教会宿主免疫系统识别改变的自我这一持久的追求，新型RNA传递平台（如环状RNA和自扩增RNA）的技术加速将开辟新的疫苗接种途径。然而，由于任何成功疫苗的基本组成部分是最佳抗原，迭代改进新抗原选择策略对于成功推进临床疫苗接种至关重要。尽管目前源自体细胞突变的新抗原疫苗仍然是“个性化”的——因为大多数新抗原出现在有限的基因组范围内——迭代映射癌症突变组可能会开辟新的可能性，例如用于预防性疫苗的新抗原库和多价疫苗以防止克隆逃逸。

背景当前市售的44种抗体相关产品在2013年全球的销售额约为750亿美金。治疗性抗体已经成为多种癌症、自身免疫、炎症和其他疾病患者的主要治疗选择。但是，抗体治疗本身也有局限性，比如接受抗体治疗的患者可能产生抗药性或对治疗没有反应。癌或和其他疾病往往是多方面原因引起的，并由多个信号通路参与病理的发生。仅采用单靶向的抗体治疗似乎不足以破坏癌症细胞。双特异性抗体（BsAbs）在过去的几十年中已经被认为是有潜力的癌症治疗药，但是直到最近才开始出现好的成果。BsAbs具有以下几个优势：能够使特异免疫细胞重定向到肿瘤细胞从而促进对肿瘤的杀伤作用可以同时阻断两个导致病理发生的不同通路可以与两个不同细胞表面抗原相互作用增强结合特异性但是产品不稳定、低表达、免疫原性等生产相关问题一直阻碍着BsAbs的发展。新型的BsAbs比较稳定、易生产和低免疫原性。目前，有三十多个BsAbs在临床报批阶段，其中有两种药已经被批准上市。目前主要通过三种方法生产BsAbs：（1）细胞杂交瘤技术（2）化学偶联方法（3）重组DNA方法这些方法改变了BsAbs的发展，设计出很多不同的新型BsAbs去满足不同应用（图1）。图1 形成双特异性抗体的不同方法BsAbs类型BsAbs可以分为两类: IgG样分子和非IgG样分子（图2）。IgG样BsAbs保留着Fc结构域介导的效应功能如ADCC、CDC、ADCP。Fc结构域的保留还有易于纯化并提高抗体的溶解性和稳定性。由于分子结构较大和FcRn介导的再循环使IgG样BsAbs具有较长的半衰期。同样由于分子结构小，使得非IgG样BsAbs组织穿透力增强。图2 双特异性抗体的分子类型抗体样BsAbs1. 杂交瘤细胞融合型BsAbs杂交瘤融合技术基于不同杂交瘤的融合。抗体的重链和轻链的随机配对产生了BsAbs，但是也会产生没有功能的BsAbs（图3）。卡妥索单抗（Catumaxomab）是第一个被批准的大鼠/小鼠杂交瘤细胞表达的BsAbs（图4）。图3 杂交瘤细胞融合技术生长双特异性抗体图4 第一个上市的双特异性抗体-卡妥索单抗作用机制示意图2. Knobs-into-holes具有Fc结构域的BsAbs可能会形成同源二聚体和其他错配的杂质。纽扣型BsAbs的方法通过在一种抗体的CH3结构域设计一个较大的氨基酸作为“knob”和在另一种抗体的CH3结构域设计一个“hole”来解决错配问题。为了解决轻链错配问题，有以下几种方案：（a）设计含有普通轻链的BsAb，但是结合特异性受限，并不适用所有BsAb。（b）在不同的细菌中分别表达含有“knob”和“hole”的抗体，但是在细菌中表达会缺少关键的糖基化修饰，会影响抗体的效应功能（图5）。图5 在细菌中通过knobs-into-holes方法生成双特异性抗体（c）结合CrossMab和Knobs-into-holes方法能够减少错配。在CrossMab中，重链CH1结构域与轻链CL结构域互换引起轻链的正确配对。结合CrossMab和Knobs-into-holes方法，罗氏开发特异靶向Ang-2和VEGFA的交叉BsAbs A2V。（d）VH-VL和CH1-CL接触域引入一些突变。这些突变可以使重链优先与轻链配对。缺点是需要在抗体的保守区进行大范围的突变。3. 双可变结构域Ig（ Dual-Variable Domain Immunoglobulin, DVD-Ig）将两个抗体的可变结构域串联在一起形成双特异IgG样分子。DVD-Ig的每个Fab结合两个靶标。这个技术可以避免不同的重链或轻链的错配，同时提高生产的重复性、产量和稳定性，而且含有Fc结构域便于纯化。但是，可变区内部的亲和结合力有降低的潜在风险。4. IgG-scFvIgG-scFV是将scFv或单链可变区连接到轻链或重链的末端，这类抗体也属于DVD-Igs。5. 二合一或双功能Fab（Dual Action Fab, DAF）抗体DAF抗体有双抗原结合位点。抗体本身能够结合的靶抗原为第一个抗原，在抗原结合区引入突变可以识别第二个抗原。对抗原结合位点进行编辑促进高双亲合力（图6）。但是，二合一抗体不能同时结合两个不同的抗原。图6 二合一抗体通过引入突变能够识别不同类型的抗原6. 半分子交换抗体在血清中，人源IgG4能够交换半个分子，产生IgG4 bsAbs，这种途径称为“半分子交换”。IgG1的CH3结构域引入点突变后，在特定的条件下IgG1通过半分子交换形成BsAbs（图7），这项技术也应用于人IgG2和IgG3。这是方法能够在短期内产生很多种BsAbs，并且通过半分子交换产生的BsAbs是天然的形式，具有较低的免疫源性。图7 IgG1的CH3结构域引入突变后通过半分子交换形成BsAbs7. κλ抗体在一个细胞中能够同时表达一个重链和两个不同的结合特异性的轻链（κ和λ），能够产生具有与同一种重链配对的κ和λ轻链的BsAbs（图8），然后用高选择性的亲合树脂进行纯化（图9）。κλ抗体有很多优势：第一，BsAbs保留完整人IgG形式，没有任何修饰；第二，方便从抗体混合物中纯化BsAbs，第三，能够生产工业级的BsAbs；第四，纯化平台可以适用于任何κλ抗体，可以同时开发不同的BsAbs。图8 形成κλ抗体的流程示意图步骤1通过噬菌体文库筛出相应的κ和λ轻链，步骤3在同一个细胞中表达κ轻链、λ轻链和重链。图9 亲和层析快速从抗体混合物中纯化纯化出BsAbs非抗体样BsAbs1. ScFv型BsAbsScFv由VL结构域和VH结构域构成，VL结构域和VH结构域是抗原结合的基本结构。根据连接肽长度、抗体长度和外部因素可以产生二聚、三聚或四聚ScFvs（图10）。与常规IgG分子相比，ScFvs具有高肿瘤特异性格组织渗透性。图10 不同长度的连接肽产生不同类型的BsAbs（a）串联scFvs两个ScFvs通过易弯曲的连接肽（如Gly-Ser重复序列）以串联的方式连接在一起。短连接肽可以防止链内VH结构域和VL结构域配对。易弯曲的长连接肽允许抗原结合位点自由旋转，受欢迎的双特异的T细胞衔接抗体（BiTE）技术以此结构基础设计的。（b）双价特异抗体双价双特异抗体的不同抗体的可变区结构域通过两条连接肽连接。第一个抗体的VH结构域连接第二个抗体的VL结构域，两个连接肽可以提高双价抗体的稳定性，但是两个连接肽会限制抗原结合位点的移动，从而限制抗原识别。（c）单链双价特异抗体在链间加一个连接肽可以将双价特异抗体转换成单链双价特异抗体。（d）串联双价特异抗体两对VL结构域和VH结构域通过一个多肽链连接形成四价TandAb。（e）双亲合重靶向抗体（DARTs）DARTs的结构为VLA-VHB+VLB-VLA：VH结构域的第一个可变区与第二条链的VL连接，VH结构域的第二个可变区与第一条链的VL连接。链间的二硫键可以使DARTs稳定。DARTs结构小，半衰期短，可以增加Fc延长半衰期。2. 纳米抗体纳米抗体是天然纯在的最小抗体，仅含有重链的可变区(15kDa)（图11）。在缺少轻链的情况下，纳米抗体能够与相应的抗原结合。来源于骆驼的不同结合特异性的纳米抗体通过短连接肽连接形成BsAb。 图11 纳米抗体的示意图3. Dock-and-lock（DNL）抗体通过DNL方法，抗体片段形成类似PKA和AKAP结合的异源二聚体(图12)。图12 通过DNL方法形成双特异性抗体的示意图4. 其他双特异性/多特异性分子ScFvs也能与其他分子如TNF-α(以三聚体形式存在)、胶原蛋白XV或者XVII的三聚结构域、Fos或Jun的拉链型二聚结构域连接形成多价分子。延长半衰期的策略以ScFv为基础的BsAbs具有很多优势如易生产和具有较高的组织渗透性。它能够结合到抗原表位，但是空间效应上很难与完整抗体比较。同时由于缺少Fc结构域，免疫源性较低，可以避免与FcR结合。但是半衰期短，需要增加注射次数和剂量。延长半衰期从经济和治疗方面都有很大的意义。1. PEG化连接高灵活性和亲水性分子如PEG会增加动态水体积，提高半衰期。连接PEG的数量和大小会导致部分活力降低和降低抗体的亲和力（图13）。图13 PEG化避免BsAbs被降解和导致亲和力部分降低的示意图2. 与HSA融合ScFv-HSA能够延长半衰期，HSA能够与FcRn结合而不改变抗原结合力。ScFv-HSA不仅增加分子的大小，促进BsAbs的再循环，延长半衰期。被细胞吸收的HSA首先结合早期溶酶体的FcRn，避免降解，然后HSA重新定位在质膜上，重新释放到血清中。理论上，分子越小，越容易被肾消化。如ATN-103通过连接HSA增加分子的大小，而且也保留与TNF-α结合的特异性。3. 与Fc片段融合将ScFv-BsAbs与Fc融合，不仅增加分子大小，促进FcRn引起的再循环。通过这个方法设计的抗体DART MGD007用于治疗直肠癌。4. 多聚化多聚化通过调节大小和结合力来延长半衰期。BsAbs的临床应用BsAbs重定向免疫细胞靠近肿瘤细胞细胞毒性T淋巴细胞在癌症治疗的免疫应答过程中起着关键的作用。由于肿瘤细胞在免疫编辑过程中利用免疫逃逸机制使肿瘤特异T细胞应答受限。控制免疫细胞的一个策略就是利用BsAbs使T重定向接近肿瘤细胞，这个过程伴随着T细胞和靶肿瘤细胞之间形成瞬时的溶细胞突触，随后T细胞的增殖和激活导致肿瘤细胞裂解。除了T细胞，其他免疫细胞如巨噬细胞、单核细胞、粒细胞和自然杀伤细胞（NK）也会发挥杀死肿瘤细胞的效应。1. Triomab抗体使T细胞重定向到肿瘤细胞通过鼠-大鼠杂交瘤细胞高表达Triomab，BsAbs与单特异性抗体、轻链错配等副产物混合在一起，增加纯化难度；分别来自老鼠和小鼠的轻重链优先配对，使轻重链错配比例降至4%-10%，便于ProteinA纯化（图14）。图14 杂交瘤细胞表达的Triomab的ProteinA的纯化流程Trimab有三个功能，一个臂结合肿瘤相关抗原，第二臂结合T细胞的CD3，Fc结构域优先识别辅助细胞如巨噬细胞、树突细胞和NK细胞的受体Ⅰ(CD64)，Ⅱα（CD32α），ⅢFcγ（CD16）。T细胞激活，伴随着释放T细胞因子如TNF-α和IFNγ，接着辅助细胞重新定位到肿瘤细胞，并释放高水平的前炎症因子如IL-6，IL-2，GM-CSF和DC-CK1。肿瘤细胞被T细胞介导的裂解、激活的辅助细胞如巨噬细胞的ADCC作用所杀死（图15）。图15 Triomab®抗体将T细胞和其他辅助细胞重定向至肿瘤细胞卡妥索单抗属于Trimab，是第一个被用于癌症治疗的BsAbs。用同一种宿主细胞表达大鼠IgG2b和鼠IgG2a。相比于BiTE，IgG样BsAb具有较长的半衰期。在9到13天期间内，病人需要接受向腹膜内注射四到五次10-150ug。潜在的副反应是短暂的发烧、恶心、呕吐。卡妥索单抗被欧盟批准用于治疗EpCAM阳性的恶性上皮瘤。卡妥索单抗目前在进行治疗卵巢癌、胃肠癌、非小细胞肺癌、乳腺癌、腹膜转移癌的临床试验。2. BiTEs重定向T细胞到肿瘤细胞BiTEs平台运用的是串联ScFv BsAbs。博纳吐（Blinatumomab，Blincyto）结合T细胞的CD3和表达CD19的恶性肿瘤B细胞。是第一被US FDA批准的BsAbs用于治疗急性B细胞淋巴性白血病，大小为55kDa。另外，用于治疗临床2期和3期的ALL(急性淋巴性白血病)、临床3期的 DLBCL（弥漫性大B细胞淋巴瘤）、临床1期的NHL(非霍奇金淋巴瘤)。博纳吐通过重定向T细胞到肿瘤细胞，并且具有杀死肿瘤细胞的强大能力（图16）。不同的颗粒蛋白酶是形成T细胞和靶细胞之间溶细胞突触的必须组成。以此同时，T细胞开始增殖，并释放蛋白因子如TNF-a，IFN-r，IL-6，IL-2，IL-4和IL-10。BiTE分子非常有效，在非常低的浓度范围（10~100pg/mL）能够使T细胞重新定靶到CD19阳性淋巴瘤细胞上。剂量大于15ug/m2/day会导致体内肿瘤细胞消除。博纳吐在血清的半衰期低于2h，病人通过一个注射输入系统注入BiTE，并观察3-7天。博纳吐有一些缺陷，一些患者会忍受神经毒性和显示细胞激素释放症候（CRS）的症状。因为体积小，很容易被肾消除，病人每48小时需要更换注射包。有些患者会形成药物抗性，原因可能是CD19缺失、髓外复发和肿瘤细胞的PDL1上调。图16 BiTE®抗体重定向T细胞至肿瘤细胞3. DARTs重定靶T细胞到肿瘤细胞DARTs技术通过减小连接肽使BsAbs的稳定性提高、免疫源性降低。不像BiTEs，DARTs两个链的连接使抗原结合位点移动受限。因为DARTs结构的影响，在靶细胞和效应细胞之间形成稳定的接触。Moore et al.提到在使杀伤细胞重定向到B细胞淋巴瘤过程中CD19XCD3 DART比BiTEs分子更有效，可能因为DART与CD3的亲和力较高，与CD19的解离常数低。哺乳和真核表达系统可以用于抗体的表达，迄今为止，已经生成70多种DART。DART的功能主要有：激活杀伤细胞、定靶到受体上、结合到病原表位。目前有两个产品在临床试验中。MGD006通过重定向T细胞到白血病细胞治疗急性髓细胞样白血病（AML），具有两个特异的功能臂：一个靶作用白血病干细胞的CD123，另一个靶作用T细胞的CD3。目前MGD006应用于临床1期患有AML的病人。MGD007属于Fc-DARTs，具有较长的半衰期，通过重定向T细胞到gpA33阳性的结肠癌细胞从而裂解gaA33阳性细胞。目前应用于临床1期患有直肠结肠癌的病人。4. TandAbs重定向免疫细胞杀死肿瘤细胞TandAbs含有四个亲和位点，比BiTEs大，约为114kDa。半衰期比BiTE和双价特异性抗体长。TandAbs可以在细菌和哺乳细胞中表达。与BiTEs不同，TandAbs具有二价结合活力，提高了与靶细胞的结合能力。AFM13是鼠源的抗CD30结构域的四价BsAbs，它特异靶作用NK细胞和巨噬细胞的CD16A（图17），霍奇金和里德-斯泰伯格氏细胞高表达CD30。AFM13募集和激活NK细胞诱导CD3阳性的肿瘤细胞裂解。某些注射AFM13的病人可能出现剂量限制毒性症状如溶血性贫血。AFM13目前应用于临床2期患有霍奇金的病人。图17 AFM13重定向NK细胞杀死肿瘤细胞示意图BsAbs阻断信号通路细胞表面生长因子受体、酪氨酸激酶受体(RTK)主要参与癌症的形成。几种特异靶作用RTK的抗体如赫赛汀（转移性乳腺癌）、伊马替尼（CML和GIST）、吉非替尼（NSCLC）、西妥昔单抗（结肠直肠癌）用于癌症治疗。然而疾病的发生是由多个信号通路引起的，BsAbs可以同时靶作用两种细胞，比mAbs更有效。1. HSA-BsAbsMM-111是一种将两个scFvs与修饰HSA融合的bsAb。它可以同时靶作用HER2/HER3信号通路。对很多种癌症，HER2是一个有效的靶位点。HER3信号通路对于HER2抑制剂的抗药性有很重要的作用。双靶向HER2/HER3更有效。单独使用MM-111或与西妥昔单抗一起治疗患有HER2阳性的实体瘤的患者处于临床试验中。2. ScFv-IgGsMM-141是同时靶作用胰岛素样生长因子I受体（IGF-IR）和HER3（图18）。与MM-111不同，MM-141是一个IgG恒定区与两个ScFvs融合的IgG样BsAbs。IGF-IR和HER3可以激活PI3K/AKT/mTOR通路，MM-141结合IGF-IR和HER3阻断下游通路。MM-141目前应用于临床1期的肝细胞癌患者。图18 MM-141同时靶作用IGF-IR和HER3示意图3. 二合一抗体Duligotuzumab是一个噬菌体来源的DAF人源化抗体。它同时结合EGFR和HER3，导致HER家族下游信号通路受到抑制，下调引起癌症（如头颈癌和结肠直肠癌）病原发生的依赖于EGFR和HER3信号通路。患者接受EGFR抑制剂西妥昔单抗治疗经常会产生抗EGFR抗性。当结合放疗后，Duligotuzumab能够克服药抗，增强放疗的效果。Duligotuzumab目前应用于临床期患有上皮肿瘤和颈部鳞状细胞癌的患者。接受Duligotuzumab治疗患者极易产生副作用如粒细胞减少性发热、血钾过少、恶心和脱水。靶作用肿瘤血管生成的BsAbs肿瘤血管生成是肿瘤生长和转移的关键过程。很多肿瘤血管生成因子包括内皮生长因子受体2（VEGFR2）、VEGFR3、VEGFA、血管生成素、血小板源生长因子（PDGFs）参与了肿瘤血管的生成。很多癌症治疗通过消耗这些蛋白来破坏肿瘤血管生成。双重靶向这些肿瘤血管生成因子会获得更好的效果。RG7221是靶作用肿瘤血管生成因子（VEGFA）和血管生成素（Ang-2）的人IgG样CrossMab。。在临床前模型中，与单信号通路抑制剂相比，RG7221对肿瘤血管生成和肿瘤的生长有明显的抑制。RG7221目前应用于患有结肠直肠癌的患者的临床II研究。根据临床I的研究数据，接受RG7221治疗的病人可能容易产生高血压、无力、头疼和疲劳等反应。RG7716是一个与RG7221相似的CrossMab，也能够同时阻断VEGFA和Ang2，目前应用于患有湿型年龄相关性黄斑变性（wet AMD）的研究。阻断细胞因子的BsAbs一些细胞因子被认为是引起炎症发生和自体免疫疾病的关键因子。因此阻断这些因子是有治疗潜力的。例如，抑制TNF-a对于牛皮癣、银屑病关节炎、克罗恩病、溃疡性结肠炎、少年关节炎和许多其他疾病有很好的治疗效果。其他有效的因子包括IL-6，IL-7，IL-1，IL-12，TGF-β，IL-4和IL-13。纳米抗体Ozoralizumab（ATN-103）是由Ablynx研发的小的三价双特异性纳米抗体，与TNF-a和HSA具有较高的亲和力。与白蛋白结合可以提高血清中的亲和力。Ozoralizumab完成了治疗患有RA的患者临床II试验，对RA有明显的改进。Ozoralizumab展示了特异的分子特性如体积小、低免疫源性、长半衰期，让人们更加期待它在临床的应用。Ablynx也研发了其他类似的纳米抗体包括治疗RA抗IL-6R/HSA的ALX-0061和治疗炎症疾病抗IL-17A/F的ALX-0761。SAR156S97SAR156597是一个四价双特异串联IgG，可以同时结合IL-13和IL-4。从结构上看，是一个N端与抗IL13的抗体可变区融合的IgG分子（抗IL4抗体）。它已经完成特发性肺纤维变性疾病的临床I/II研究。作为运载工具的BsAbsBsAbs的一个有趣的应用就是运输如药物、放射性同位素标记和纳米颗粒。这些运输物一旦释放出来，空载的BsAbs分子在血清中被清除。BsAbs也被用于在肿瘤位点富集运输物，这种策略明显的延长血清中的半衰期。DNL利用DNL方法生产双特异性TF2，用于肿瘤显影和放射免疫疗法，能够与CEA和99mT标记的组胺-琥珀酰-甘氨酰(HSG)半抗原特异结合。在临床试验中，先注射TF2，然后99mT标记的HSG被释放，最后血清中BsAbs被清除。肿瘤对99mT吸收提高，伴随着肿瘤/血液比例的提高。TF2目前应用于患有结肠直肠癌的患者临床I期的研究。BsAbs临床前研发1. 应用于穿越血脑屏障（BBB）的BsAbsBsAbs一个最有前途的应用就是穿越BBB从而靶作用神经性疾病的病原发生中介。BBB形成单特异性抗体治疗的禁区。Couch et al.设计了一个能够结合转铁蛋白受体 (TfR)和β位淀粉样前体蛋白裂解酶1 (BACE1)的BsAbs去克服这个障碍。大脑内皮细胞表面高表达TfR。BACE1是导致阿尔茨海默病发生的天门冬氨酰蛋白酶，靶作用BACE1是长期寻找治疗阿尔茨海默病的策略。与TfR结合后，经受体介导的胞吞作用运输到大脑。BsAb与TfR的亲和力低，bsAb可以从内皮释放进入大脑靶作用BACE1。一个临床前研究显示这种BsAb能够减轻疾病的症状。2. 用于诊断试验的BsAbsBsAb可被用于诊断试验。一个bsAb被设计成结合特异抗原和检测结构域如辣根过氧化物酶。BsAbs可以作为交联剂，同时结合抗原和报告分子。在免疫试验中，单特异性捕获抗体被固定在固体表面，结合血清中相应的抗原。加入BsAbs，结合抗原和报告分子。基于BsAb的免疫试验应用于感染了肺结核、乙型肝炎、大肠杆菌、百日咳博德特氏菌、非典型肺炎和其他传染性疾病的检测分析。另外，BsAbs也被用于其它诊断应用如免疫组织化学和放射免疫诊断。与单特异性抗体相比，BsAbs可以简化诊断试验，减少假阳性反应。基于BsAb的诊断可以特异检测细菌或病毒抗原，便于早期检测。3. 应用于病原体治疗的BsAbs由于过度使用广谱抗生素，许多致病菌产生了抗生素耐药性，有些甚至能够抵抗多种抗生素和化学剂。多重抗药物性的产生为研发新的抗生素构成巨大的威胁。一个新的有效的BsAbs（BiS4αPa）用于治疗铜绿假单胞菌感染。铜绿假单胞菌是医院内肺炎和囊性纤维化患者死亡的重要因素。由于抗药性，抗铜绿假单胞菌的单一表位的抗生素是无效的。双特异性BiS4αPa能与对免疫逃逸和生物膜形成具有重要作用的细胞外多糖Psl结合，同时能与参与毒性因子分泌的PcrV结合。在动物实验研究中证明BiS4αPa具有优越的保护活性。BiS4αPa目前应用于治疗铜绿假单胞菌患者的临床研究。除了BiS4αPa之外，开发了很多BsAbs用于重定向细胞毒性T淋巴细胞杀死HIV、防止HBV感染或促进噬菌体清除。讨论BsAbs不仅将治疗（如T细胞、药物）和靶细胞（如肿瘤）联系起来，而且同时阻断两个不同的病原发生中介。在不久的将来，BsAbs可能会改进治疗癌症、自体免疫疾病、炎症疾病的方向。两个被批准的BsAbs具有令人印象深刻的治疗效果。BsAbs的成功引起制药公司的关注，同时不同的公司将设计新的形式。除了成功，一些关键的障碍依然存在，仅有少数的形式进入临床试验。大规模的生产和纯化是一个长期的所要追逐的目标。理想的平台应该围绕整个开发过程，从研发和临床前研究到临床材料生产，到快速研发有潜力的BsAbs和在短时间内纯化得到临床级别的BsAbs。当设计BsAbs形式时，简化结构和生长过程、运用有效的生产平台是关键。配套靶位点的确定和靶位点之间潜在的协同效应也给BsAb带来了极大的挑战，必须具备高通量筛选的平台。免疫源性对药物设计和开发也是一个复杂的难题，很多临床副作用阻碍了BsAbs的成功。随着科技的发现，希望可以开发出更多被批准上市的BsAbs。参考文献1. Gaowei Fan, et al. Journal of Hematology & Oncology (2015) 8:1302. Tarcsa E, et al. Bispecific Antibodies. Berlin, Heidelberg: Springer Berlin Heidelberg; 2011. p. 171–85.3. Eigenbrot C, et al. Curr Opin Chem Biol. 2013;17(3):400–5.4. Labrijn AF, et al. Nat Protoc. 2014;9(10):2450–63.5. Fischer N, et al. Nat Commun. 2015;6:6113.6. Goldenberg DM, et al. J Nucl Med. 2008;49(1):158–63.7. Fishburn CS. J Pharm Sci. 2008;97(10):4167–83.8. Lindhofer H, et al. J Immunol. 1995;155(1):219–25.9. Ecker DM, et al. The therapeutic monoclonal antibody market. mAbs. 2015;7(1):9–14.近期直播推荐识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入生物制品微信群！请注明：姓名+研究方向！版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。