FGF8

在一项新的研究中，奥地利科学院分子生物技术研究所（IMBA）的Jürgen Knoblich及其团队开发出一种新方法，使科学家们能够培养出具有独特皮层区域和前后模式的大脑类器官。这项技术让科学家们能够更深入地研究人类特有的大脑发育和疾病。 相关研究结果于2024年9月18日在线发表在Nature Methods期刊上，论文标题为“A polarized FGF8 source specifies frontotemporal signatures in spatially oriented cell populations of cortical assembloids”。 大脑类器官是一种三维模型，源自人类多能干细胞。这种模型让科学家们可以研究人类大脑的独特属性，回答一些基本问题，比如人脑如何长到这么大，或者人脑的长距离连接是如何形成的。然而，传统的皮层类器官通常是均匀的球形结构，就像微型足球，与长方形的人类大脑皮层相差甚远。人类大脑皮层从后向前分为不同的区域，每个区域都有独特的功能。 生成模式化大脑类器官 在这项新的研究中，研究团队开发了一种新方法，生成沿纵轴组装成不同区域的大脑类器官。他们首先制作了长线性的大脑类器官，然后通过与产生一种名为FGF8的因子的细胞团融合，使其模式化。这种单一的不对称FGF8源可以沿着大脑类器官的纵轴建立基因表达和细胞分离，类似于在人类大脑皮层中观察到的模式。 研究团队展示了如何利用模式化皮层类器官研究大脑疾病。例如，软骨发育不全症患者的颞叶（皮层的一个区域）形态不正确，这与FGFR3的突变有关，而FGFR3是FGF8信号的受体。在模式化皮层类器官中，FGFR3的这种突变也会导致沿纵轴的模式化和细胞增殖发生变化。 Knoblich教授说：“模式化皮层类器官是研究导致发育障碍的模式化缺陷的模型。这种皮层类器官甚至可以作为一个实验平台来检验一个假设，即早期模式化缺陷是自闭症患者大脑转录变化的原因。皮层类器官提供了一种方法，将与神经精神疾病相关的遗传和环境改变与特定的早期皮层模式化事件联系起来。” 图片来自Nature Methods, 2024, doi:10.1038/s41592-024-02412-5 深入了解大脑发育 利用模式化皮层类器官，研究团队还深入了解了人类的发育过程。在人类大脑发育过程中，多种形态发生因子和信号通路相互作用，因此很难弄清每种成分是如何单独促进发育的。相比之下，在模式化的皮层类器官中，FGF8是指定不同结构域的唯一信号。 论文共同第一作者Camilla Bosone说：“通过将产生不同形态发生因子的大脑类器官融合在一起，并精确控制这些融合体中形态发生因子产生细胞的时间和数量，极性皮层类组装体（PolCA）可作为一种最佳体外模型，用于单独引入和研究单个信号通路。” Knoblich教授补充说：“模式化的大脑类器官将是进一步研究神经元如何在发育过程中获得其特征的有用模型。” 参考资料： Camilla Bosone al. A polarized FGF8 source specifies frontotemporal signatures in spatially oriented cell populations of cortical assembloids. Nature Methods, 2024, doi:10.1038/s41592-024-02412-5. 本文仅用于学术分享，转载请注明出处。若有侵权，请联系微信：bioonSir 删除或修改！ 点击下方「阅读原文」，前往生物谷官网查询更多生物相关资讯~

耳蜗是听觉系统的第一级声音感受器，其内部的柯蒂氏器官有序排列着三排外毛细胞、一排内毛细胞及不同类型的支持细胞。内毛细胞负责将声波转换为电信号，并传递给螺旋神经节（听神经）。 《Development》杂志在线发表了题为《In situ  regeneration of inner hair cells in the damaged cochlea by temporally regulated coexpression of Atoh1 and Tbx2》的研究论文。该研究由中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心（神经科学研究所）、上海脑科学与类脑研究中心（上海脑中心）刘志勇研究组完成。研究团队构建了耳蜗内毛细胞特异性损伤的小鼠模型，并在该模型的基础上把幼年耳蜗支持细胞转分化为新的内毛细胞，从而实现了损伤耳蜗内源性内毛细胞后的原位再生，并对新的内毛细胞进行了全面详细的转录组学，形态学和电生理特性等分析。 耳蜗是听觉系统的第一级声音感受器，其内部的柯蒂氏器官有序排列着三排外毛细胞、一排内毛细胞及不同类型的支持细胞。内毛细胞负责将声波转换为电信号，并传递给螺旋神经节（听神经）。与非哺乳类动物（如鱼类和鸟类）不同，哺乳类动物丧失了再生毛细胞的能力，因此毛细胞一旦损坏将导致不可逆的永久性耳聋。IBCs/IPhs是耳蜗支持细胞的两种亚型，它们与内毛细胞在空间位置上彼此相邻，并且在发育过程中具有相似的细胞起源。因此，IBCs/IPhs是内毛细胞再生的潜在细胞来源和基因操纵靶点(图1A)。本实验室前期通过在新生小鼠耳蜗IBCs/IPhs中条件性地异位过表达Atoh1和Tbx2，在正常（没有损伤）耳蜗内成功地将IBCs/IPhs转分化为vGlut3 新生内毛细胞。但仍有几个关键问题亟待解决：1）在内毛细胞损伤的耳蜗内，能否再生出新的内毛细胞？2）新的内毛细胞与野生型内毛细胞在转录组水平和电生理特性方面的相似度如何？3）新的内毛细胞能否实现听力的恢复或者部分恢复？ 为解决以上科学问题，研究人员首先构建了内毛细胞特异性损伤的小鼠模型Fgf8-DTR/ 小鼠模型。当Fgf8-DTR/ 被注射白喉毒素（DT）后，可以导致97.8%的内毛细胞死亡。为了探究损伤野生型内毛细胞能否增加支持细胞转分化为内毛细胞的效率，研究人员构建了一个能够进行精细调控基因表达的小鼠模型，Plp1-CreER ;Rosa26-Loxp-stop-Loxp-Tbx2-P2A-DHFR*Atoh1*DHFR-T2A-tdTomato/ ;Fgf8-DTR/ (简称Plp1-TAT-DTR)，并分为两组: 1)第一组作为对照组，仅在P2注射DT (图1B-B”和图2A-A’); 2)第二组在P0和P1注射他莫西芬(TMX)﹑P2注射DT，P3和P4注射甲氧苄啶(TMP,用于结合DHFR，从而瞬时稳定Atoh1的表达)，被定义为TMX/DT/TMP实验组(图1C-C”和图2B-B’)。实验结果显示，实验组有477.0±48.0个内毛细胞，远远高于对照组（17.3±4.0）。并且损伤情况下的新生内毛细胞的再生效率（73.5%±2.3%）显著高于未损伤的再生效率（29.5%±1.2%，图1D）。更为重要的是，单细胞转录组分析（图1E）和膜片钳电生理分析（图1F-G）表明新的内毛细胞和野生型的内毛图2.A-B.扫描电镜可观察到在内源内毛细胞损伤的情况下，新生内毛细胞可再生出新的纤毛结构；C-D.透射电镜可观察到新生内毛细胞有囊泡结构的产生；E.但小鼠听力未能得到有效的改善；F-H.电生理技术发现新的内毛细胞不具备机械敏感的MET通道电流。细胞具有高度的相似度（达60%以上），透射电镜可观察到新的内毛细胞囊泡结构的产生（图2C-D’）。本研究首次证明了当内源性内毛细胞受损时，新生IBCs/IPhs中异位表达Atoh1和Tbx2，可以再生出新的内毛细胞，它们在转录组和电生理水平上，与内源性内毛细胞有60%以上的相似度，并且再生效率比没有内源性内毛细胞损伤时有显著提高。 图1：A.内毛细胞损伤再生的示意图；B.内毛细胞损伤小鼠模型可以高效特异的损伤内毛细胞；C.在内毛细胞损伤的情况下，异位表达Atoh1与Tbx2可再生出vGlut3 的新生内毛细胞；D.损伤情况下的再生毛细胞效率显著提高；E.转录组水平上，新生毛细胞与野生型P30内毛细胞聚为一群；F-G.新生内毛细胞的电压依赖的Ca电流与野生型内毛细胞相似。 为了探讨再生出的新生内毛细胞是否具有生物学功能，研究人员通过听觉脑干反应检测并比较了Plp1-Ai9（TMX/TMP，阳性对照组）、Plp1-TAT-DTR（DT，阴性对照组）和Plp1-TAT-DTR（TMX/DT/TMP，实验组）三者之间的听力，结果显示实验组小鼠的听力未能得到恢复（图2E）。为了进一步寻找听力不能恢复的主要原因，研究人员利用电生理技术，发现新的内毛细胞不具备机械敏感电转导通道电流（图2F-H）。该发现解释了新的内毛细胞无法感知外界声音信号，无法恢复听力的原因，从而为未来如何再生出有功能的毛细胞提供了方向。 图2.A-B.扫描电镜可观察到在内源内毛细胞损伤的情况下，新生内毛细胞可再生出新的纤毛结构；C-D.透射电镜可观察到新生内毛细胞有囊泡结构的产生；E.但小鼠听力未能得到有效的改善；F-H.电生理技术发现新的内毛细胞不具备机械敏感的MET通道电流。 中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心刘志勇研究员与毕政鸿副研究员为本论文的通讯作者，刘志勇组副研究员李响为本论文的第一作者，博士研究生任旻蕙在生物信息学分析上做了大量工作，博士研究生顾云鹏和研究助理朱彤为本项目做了重要贡献，上海交通大学第九人民医院张宇博士和脑智卓越中心李杰博士共同完成电生理研究内容，脑智卓越中心副研究员李超和王广琴博士也对本项目提供了帮助，上海交通大学第九人民医院宋雷教授对本课题电生理内容给予了重要的指导。中国科学院脑智卓越中心光学平台、电镜平台、分子细胞技术平台和啮齿类实验动物平台提供了重要技术支持。该研究获得了国家自然科学基金委员会、科技部、上海市科委和中国科学院的资助。

摘要中国仓鼠卵巢（CHO）细胞的培养应用于现代工业，如重组蛋白的表达，需要支持其生长和表达产物的培养基。这种培养基必须支持高密度细胞存活，同时刺激生物产品的合成和细胞外运输。这一领域的早期培养基开发工作产生了维持生长、活力和细胞功能的基本配方，包括动物源成分和在批量培养模式中使用的复杂成分。随后的改进包括无血清培养基的开发和化学限定性(CD)培养基，鉴定关键营养素、生长因子、潜在抑制性或有毒细胞代谢物，以及使用分批补料和灌注培养技术优化营养物输送，同时尽量减少不需要的代谢废物的累积。本综述包括哺乳动物细胞培养基发展的里程碑、营养成分和配方要求、优化策略、工业用粉末和液体培养基制备的一致性和可扩展性，以及推动CHO细胞培养基设计和开发的关键新进展。哺乳动物细胞培养用培养基配方的历史演变最早成功开发并用于动物细胞培养的培养基通常由血浆、血清或组织提取物组成。这些生物成分的复杂、未确定的性质导致可变性，增加污染风险，且细胞生产所需的最小、特定营养成分无法确定。由于这些原因，许多研究小组试图通过分析细胞和血清成分，确定支持细胞生长所需的关键成分，开发无血清、化学限定性的细胞培养基。HarryEagle实验室的开创性工作产生了一种基本的配方，可以支持两种不同细胞系的生长，即小鼠成纤维细胞和Hela细胞（人类子宫癌）。其最初的培养基含有“任意混合的氨基酸、维生素、辅酶因子、碳水化合物和盐”。通过对细胞蛋白质组成和氨基酸代谢的分析，Eagle进一步研究了透析后的血清，把这种培养基发展成“最低必需培养基”（EMEM）。EMEM由28种必需代谢物组成。当补充血清时，它可以支持多种细胞系的繁殖，倍增时间为18至24小时。虽然这种培养基含有血清，但它的配方仍然是当今许多广泛使用的细胞培养基的基础。例如，Dulbecco和Freeman的DMEM6是一种该培养基的改良版，含有与EMEM相关的四倍浓度的氨基酸和维生素。这一配方被证明支持增强生长和更高的细胞密度，并最终被用作许多后续无血清培养基配方的基础。血清是一种高度复杂的生物成分，含有大量营养素、激素、生长因子、载体蛋白和代谢物，支持细胞生长。无血清细胞培养基的发展有以下驱动因素，包括血清的不良特征，如可变性、外源性物质污染的风险包括牛和传染性海绵状脑病，有限的可用性和成本。血清现在通常被认为不适用于工业化的细胞培养基，从工艺和监管的角度来看。HAM营养混合物F12是一个早期完全合成、化学限定性和无血清培养基的成功典型。支持中国仓鼠卵巢细胞(CHO)克隆生长的培养基。这种培养基是专为单一细胞培养和扩展而设计的，但不太适合支持高密度（大于105个/ml）细胞生长。佐藤和他的同事后来确定这种缺陷可以用HAM的F12和Dulbecco培养基混合来补救，创造出一种名为DMEM/ F12的新配方。在这项工作的基础上，HirokiMurakami和同事们确定了在化学成分确定的培养基中替换血清所需的四种关键添加剂：胰岛素，转铁蛋白，乙醇胺和硒。这四种添加剂结合在一起形成了一种补充剂（ITES），用于代替早期无血清培养基中的血清。此外，村上的团队通过混合现有配方，如DMEM/ F12和其他如RPMI1640（一种早期细胞培养基，在RoswellPark Memorial institute (Buffalo, NY)开发，用于人类淋巴细胞的成功培养），进一步改进现有培养基。这两种制剂的混合物，以及用于去除血清的ITES补充剂，产生了非常有效和广泛有用的基础培养基RDF，随后，富集为RDF（eRDF）。Yap及其同事进一步评估了痕量金属在早期无血清细胞培养基中的作用，鉴定了锌的胰岛素模拟活性，并展示了它在化学成分确定的无蛋白质培养基中用作胰岛素替代品。表1显示了本综述中描述的几种关键历史培养基配方的组成。由于这些早期成就，无血清细胞培养基继续演变，通过开发和优化努力，旨在支持更高的细胞密度，活力和重组蛋白含量。麻省理工学院和明尼苏达大学的研究小组率先使用细胞生长和营养利用的化学计量分析来设计基础和补料培养基配方，以根据营养需求来进行补料，从而防止关键营养素的消耗，同时最大限度地减少有毒代谢废物的积累。生物制药行业的领先团队进一步优化CHO细胞培养基和工艺参数，专门针对mAb和其他重组蛋白的商业化生产，细胞密度和蛋白质表达显著增加，蛋白含量在某些情况下达到10克/升以上。此外，一些专门从事细胞培养基的公司(ThermoFisher, Waltham, MA, USA,GE Healthcare,Waukesha, WI, USA, MilliporeSigma, St.Louis, MO, USA, Lonza, Basel,Switzerland, Irvine Scientific,Santa Ana, CA,USA)已经开发并优化了基础和补料培养基组合，专门用于重组CHO生产工艺。这些商业上可获得的培养基的配方通常是有专利的，尽管有关细胞生长，蛋白质表达，代谢物特征，营养成分和这些培养基的利用的数据非常有限，但一些研究人员对这些产品进行了比较和基准测试。这些供应商还提供培养基开发和优化服务。此外，SAFC（现为MilliporeSigma）在其网站上提供了非常广泛和可搜索的知识库（“培养基专家”），其中包含所有细胞培养基有关成分的详细信息。哺乳动物细胞培养基的关键组分所有细胞培养基都需要类似的基本营养物，它们对于支持生命和细胞生长至关重要。水，碳源，氮和磷酸盐，某些氨基酸，脂肪酸，维生素，微量元素和无机盐，所有这些都以浓度来供应，基于细胞的化学组成，达到期望细胞密度所需计算量和营养物消耗速率率的知识，以便可以补充关键组分以维持和延长细胞活力。已开发出许多培养基针对不同的细胞类型，包括微生物，植物，昆虫和哺乳动物，并且考虑到许多不同的目标。虽然这些不同的培养基在基本营养成分方面可能大致相似，但本节主要关注专门为CHO细胞工业培养开发的无血清化学成分确定的培养基，并针对重组蛋白的表达进行了优化。水哺乳动物细胞对水中的杂质非常敏感，其中可能包括微量元素，细菌，内毒素（来自细菌细胞膜），微量有机物和微粒。为了防止由于培养基中不受控制的离子和微量元素造成细胞污染，推荐使用高纯水用于配制培养基。典型的用于产生无污染物水的净水系统，包括蒸馏水/去离子水，微孔过滤和反渗透。通常以电导率或电阻（>18MΩcm）以及低有机碳含量（≤15ppb）来衡量水的纯度，并且应该没有内毒素。在许多情况下使用注射用水（WFI），因为它易于获得，高度纯化，不含内毒素。许多商业上可获得的专门用于细胞培养的瓶装水产品符合这些规格，并且保证不含支原体，支原体可污染哺乳动物细胞培养物。能源（碳水化合物，谷氨酰胺，谷氨酸）在大多数培养基配方中，特别是用于CHO细胞培养的化学成分确定的培养基中，葡萄糖是主要的碳源。CHO细胞通过糖酵解将葡萄糖转化为丙酮酸，并在Krebs循环中进一步氧化丙酮酸，产生相当于每摩尔葡萄糖高达36mol ATP的能量。由于葡萄糖代谢通量中涉及的酶的活性和效率相对较高，特别是在无血清培养基中，CHO细胞可以在葡萄糖浓度低于3mM（0.540 g /L）的葡萄糖限制培养基中维持高活力。已经证明细胞只要葡萄糖浓度维持在1.22mM（0.220 g /L）以上，细胞特异性生长速率，ATP浓度和氨基酸代谢率在统计学上并不会随着培养基中葡萄糖浓度的降低而显著降低，表明葡萄糖只要在1.22mM（0.220 g /L）以上，就不是速率限制因素。然而，由于mAb生产中CHO细胞的快速生长和营养消耗速率，培养基和工艺参数的葡萄糖水平通常被控制在更高的水平，甚至在一些限制葡萄糖的培养策略中也是如此。虽然葡萄糖是典型CHO细胞培养基中的主要碳源，但葡萄糖的消耗通常导致丙酮酸积累和乳酸浓度增加。高浓度的乳酸可以抑制哺乳动物细胞培养中的细胞生长。在细胞培养的早期阶段，乳酸生成速率不受培养基中葡萄糖浓度的显著影响，在后期阶段，高葡萄糖浓度可导致乳酸积累增加。代谢流分析表明，在指数生长期，CHO细胞通过有氧糖酵解大量产生能量，并产生乳酸，无论氧浓度如何，而稳定期主要进行氧化磷酸化并消耗乳酸。这些观察结果导致了在培养基中利用低或有限葡萄糖浓度的开发策略。同时，为了进一步降低葡萄糖水解产生的代谢物的影响，考虑使用许多其他能源取代培养基中的葡萄糖。半乳糖是一种重要的替代碳源，可用于CHO细胞培养基。与葡萄糖一样，半乳糖在糖酵解中转化为丙酮酸。对半乳糖代谢流的分析表明，在含有葡萄糖和半乳糖的培养基中，CHO细胞倾向于首先使用葡萄糖，然后转向半乳糖消耗。这种代谢转变可导致乳酸产量降低和乳酸消耗量增加，从而延缓细胞活力的下降。然而，在培养基中用半乳糖完全取代葡萄糖导致细胞生长减少和活力早期下降，尽管控制乳酸和铵离子浓度。这可能是由于己糖激酶对半乳糖的活性低。培养基中存在半乳糖也可以影响与糖基化相关的基因的表达。据报道，通过调节这三种成分的浓度，可以使用流加半乳糖以及尿苷和氯化锰来控制CHO细胞培养过程中的抗体半乳糖基化水平。半乳糖添加也可能通过两种不同的机制影响抗体唾液酸化。由于半乳糖残基是抗体N-葡聚糖中唾液酸化的靶标，因此增加的半乳糖苷化通过提供额外的唾液酸化位点来增加潜在的唾液酸化水平。然而，唾液酸酶基因表达谱和细胞内酶活性研究表明，半乳糖添加可能会增加去唾液酸化。其他己糖也被在CHO细胞培养基中用作葡萄糖的替代品，包括果糖，甘露糖等。向含葡萄糖的培养基中添加甘露糖显示无效或N-糖基化中的位点占有率轻微降低。培养基中甘露糖替代葡萄糖可以通过加速细胞生长和减少乳酸积累而不改变产品质量来提高体积生产力。然而，含有高浓度甘露糖的培养基可以也抑制细胞内α-甘露糖苷酶，从而增加产品中甘露糖糖基化的百分比，这可以增加抗体依赖细胞介导的细胞毒性（ADCC）和人体内抗体的清除率。像半乳糖和甘露糖一样，果糖也可用于控制乳酸积累并延缓活力下降。然而，已经表明葡萄糖被果糖完全取代的培养基导致细胞生长和蛋白含量降低。除了葡萄糖和其他己糖之外，谷氨酰胺还被用作CHO细胞培养物中的主要能量来源。谷氨酰胺通过谷氨酰胺酶代谢并以α-酮戊二酸的形式进入三羧酸循环。谷氨酰胺是CHO细胞培养中必需的营养素，其缺失往往会延迟指数生长期的开始。对于源自谷氨酰胺合成酶基因敲除的宿主（CHO-GS）CHO细胞系，使用不含谷氨酰胺的培养基用于选择转染的细胞。然而，据报道，在基础培养基中补充谷氨酰胺可改善细胞活力，减少乳酸生成并提高抗体生产率，即使在转染后产生大量谷氨酰胺合成酶的CHO-GS细胞的情况下也是如此。然而，在谷氨酰胺分解过程中，谷氨酰胺通常转化为谷氨酸，从而在培养基中也产生游离的铵。培养基中的高浓度铵可能通过潜在地降低细胞生长速率对细胞培养产生显著影响，增加糖型异质性，影响其他氨基酸的消耗率。因此，设计了一些培养基优化的方法。要么取代谷氨酰胺，要么降低谷氨酰胺浓度。其中一种这样的方法用谷氨酰胺基二肽（包括丙氨酰谷氨酰胺和甘氨酰谷氨酰胺）替代培养基中的谷氨酰胺，以降低谷氨酰胺代谢速率和控制铵释放。目前，该技术已商业上用于Glutamax（ThermoFisher），常用于CHO细胞培养。为了减少由谷氨酰胺代谢产生的铵的积累，谷氨酸作为谷氨酰胺分解的主要中间体，可以用作CHO细胞培养基中的替代能源。据报道，在CHO细胞培养基中用相同浓度的谷氨酸替代谷氨酰胺可以降低生产阶段的铵和乳酸生成速率，从而增加细胞生长和蛋白含量。此外，优化以谷氨酸为基础的限定性培养基中葡萄糖浓度，被证明可以提高葡萄糖和氮源的利用效率，同时降低丙氨酸和乳酸的产生率。丙酮酸钠是另一种能源，可用于代替CHO细胞培养基中的谷氨酰胺以减少铵积累。研究表明，在CHO细胞培养基中用丙酮酸替代谷氨酰胺对细胞生长至少19代没有显着影响，并且不需要任何适应步骤来维持细胞生长速率。丙酮酸是乳酸生成中间体，也是丙氨酸脱氢产物，添加丙酮酸添加可以限制CHO细胞培养过程中乳酸消耗时丙氨酸的消耗，从而减少丙氨酸代谢产生的铵。氨基酸氨基酸是CHO细胞培养基中的关键组分，特别是在化学成分确定的培养基中。研究表明，细胞培养基中氨基酸组成的微小变化可以改变生长曲线和蛋白含量，并且还可以显著影响产物糖基化模式。使用代谢流分析以优化培养基中的氨基酸浓度，在融合蛋白生产过程中，显示细胞密度最高值增加大于50％，蛋白含量大于25％。在更全面的研究中，利用几个Plackett-Burman实验开发了一个工作流程，通过识别影响细胞生长和蛋白含量的关键氨基酸来优化细胞培养基中的氨基酸浓度，并通过响应面方法分析这些氨基酸的二元效应。使用这种方法，蛋白含量增加了70％而不改变产品质量。除了提高蛋白含量和峰值细胞密度外，某些选定氨基酸在特定浓度可能对生物反应器中生长的细胞具有保护作用。某些氨基酸已经被证明可以消除或减轻铵和pCO2 积累以及高渗透压浓度的一些负面影响。一些早期的报道表明，一些氨基酸也可以作为信号分子，降低哺乳动物细胞中细胞凋亡速率。因此，在培养基设计中应仔细确定氨基酸浓度。通常，氨基酸可以分类为非必需氨基酸（NEAA），可由哺乳动物细胞合成，和必需氨基酸（EAA），这些细胞不能合成必须由细胞培养基的组分提供。多种浓度下氨基酸的响应面分析，NEAA和EAA均对CHO细胞生长具有统计学显着影响。此外，已显示优化培养基中NEAA和EAA的相对浓度可提高重组单克隆抗体的生产力。必需氨基酸包括组氨酸，异亮氨酸，亮氨酸，赖氨酸，蛋氨酸，苯丙氨酸，苏氨酸，色氨酸和缬氨酸。在大多数情况下，细胞培养基中都需要所有必需氨基酸，其中许多已被证明在CHO细胞培养过程中以相对较高的速率消耗。因此，CHO细胞培养基中的必需氨基酸通常浓度较高。缺乏亮氨酸，异亮氨酸，缬氨酸或苯丙氨酸可使L-转运系统的活性增加1-4倍，并增加L-转运系统相关氨基酸的摄取率，随后以更快的速度消耗这些氨基酸。因此，亮氨酸，异亮氨酸，缬氨酸和苯丙氨酸的浓度应高于通过代谢通量或“组学”分析计算的浓度，并应在细胞培养过程中仔细监测。一些培养基研究中发现色氨酸是一种限制因素。色氨酸补充剂已被证明可以提高蛋白含量和峰值细胞密度。然而，在培养液中，色氨酸可被氧化并通过荧光转化为tetrahydropentoxyline，5-羟色氨酸，N-formylkynurenine或其他氧化物，这些氧化产物可能会导致细胞生长减少。某些培养基配方的变化，包括色氨酸，铜和锰浓度的增加以及半胱氨酸浓度的降低，可以减少色氨酸的光诱导氧化。尽管如此，在培养基储存和处理过程中避免强光照射仍然是防止色氨酸降解和氧化的最佳方法。含苏氨酸的培养基可以保护细胞免受细胞培养中的各种压力。苏氨酸是多种氨基酸中的一种，已被证明可在高铵，溶解二氧化碳或渗透压的环境中改善细胞生长和生产率。通过这种机制，苏氨酸和其他氨基酸可间接影响重组产物的唾液酸化模式。培养基中高浓度的赖氨酸和组氨酸可以有效地减少最终产品的酸性物质而不影响生产率。高浓度的赖氨酸和组氨酸也显示出在指数期略微降低细胞生长速率，同时在生产过程的后期提高细胞活力。然而，高浓度的赖氨酸可能对碱性羧肽酶具有抑制作用，导致C-末端赖氨酸变体增加。因此，赖氨酸和组氨酸的浓度可根据具体的产品要求而改变。非必需氨基酸包括丙氨酸，精氨酸，天冬酰胺，天冬氨酸，半胱氨酸，谷氨酸，谷氨酰胺，甘氨酸，脯氨酸，丝氨酸和酪氨酸。尽管非必需氨基酸可以由哺乳动物细胞合成，但大多数细胞培养基仍然含有大部分或全部这些氨基酸以支持细胞生长和蛋白质产生。事实上，大多数非必需氨基酸对细胞培养过程具有显着影响。在大多数培养基中，丙氨酸的初始浓度相对较低。培养基研究表明细胞倾向于以非常慢的速率消耗丙氨酸或在细胞培养过程中从其他氨基酸产生丙氨酸。培养基中存在足够的乳酸时，丙氨酸产生率与氨基酸浓度正相关。丙氨酸的积累对细胞生长几乎没有直接抑制作用，除非丙氨酸浓度超过3mM。然而，在乳酸和丙酮酸饥饿的条件下，丙氨酸倾向于转化为丙酮酸并释放游离铵通过谷氨酸降解进入培养基，从而增加培养物中铵的浓度。抗体生产过程中CHO细胞以相对较高的速率消耗精氨酸。精氨酸饥饿可导致指数期的CHO细胞在G0或G1期被捕获。培养基中过量的精氨酸可有效减少产品的酸性物质的比例。然而，与赖氨酸不同，高精氨酸浓度可以抑制细胞生长并降低活力。此外，精氨酸浓度的升高已经显示出C末端赖氨酸变体的量增加一倍，从而增加了抗体产物的异质性。天冬酰胺和天冬氨酸是细胞培养基中重要的非必需氨基酸，在关键代谢途径中起着重要作用。与其他氨基酸相比，CHO细胞倾向于以相对较高的速率消耗天冬酰胺和天冬氨酸，特别是在指数生长期。与葡萄糖，谷氨酰胺和谷氨酸一样，这两种氨基酸对于补充TCA循环和能量代谢是很重要的。天冬氨酸和天冬酰胺通过转氨酶反应在谷氨酰胺和谷氨酸之间的转换中充当铵供体和受体，可以产生谷氨酸和草酰乙酸。在没有天冬酰胺的情况下，CHO细胞以更高的天冬氨酸，谷氨酸，丝氨酸，谷氨酰胺和精氨酸转化率来补偿，甚至以更高的速率消耗整个细胞内氨基酸;因此，氨基酸利用率的降低可能会对蛋白质合成或整体基因表达产生负面影响。事实上，已经证明天冬酰胺和天冬氨酸在培养基中的限制对基于CHO的单克隆抗体的产生是有害的。例如，生长期的天冬酰胺饥饿是抗体产物肽序列中丝氨酸随机错误掺入天冬酰胺位点的主要原因。此外，天冬酰胺在抑制DNA损伤和凋亡中起重要作用。培养基中的天冬酰胺浓度也可用于控制产物的半乳糖基化糖形式的分布。低天冬酰胺浓度可以减少铵的产生和细胞内的pH值，从而增强β-1,4半乳糖转移酶的活性和表达，最终导致从G0F向G1F/G2F的转变。此外，补料培养基中天冬酰胺浓度的增加能以高乳酸和铵为代价来提高最终的蛋白含量。但是，通过增加补料培养基中天冬酰胺与谷氨酰胺的比例可以降低铵浓度。半胱氨酸是唯一含有巯基的氨基酸，是单克隆抗体生产中的一种特殊的非必需氨基酸。在半胱氨酸残基上的巯基之间形成二硫键支持CHO细胞结构蛋白和重组抗体产物的三级和四级结构的折叠。半胱氨酸限制对于CHO细胞生长可能是致命的和不可逆的，并且可能导致细胞活力在3天内降至40％以下。生产培养基中半胱氨酸浓度降至0.1mM以下可导致单克隆抗体生产中蛋白含量40％的损失。同时，半胱氨酸浓度>1mM对哺乳动物细胞可能有毒，可能是由于脂质过氧化和羟基自由基的形成，并且会因铜的存在而进一步加速。在哺乳动物中，半胱氨酸库是受肝脏调节。在CHO细胞中没有这种调节机制，应仔细设计和控制培养基中的半胱氨酸浓度以进行细胞培养过程。甘氨酸被CHO细胞以相对慢的速率消耗，并且在大多数培养基中研究中不是主要的成分优化工作。在CHO细胞中，甘氨酸是胸苷酸从头生物合成的副产物。然而，对于缺乏二氢叶酸还原酶（DHFR）的CHODG44细胞系，胸苷酸的从头生物合成阻断可导致甘氨酸饥饿。因此，基于DG44的CHO细胞系，其培养基中甘氨酸的浓度需要仔细设计，特别是在包括甲氨蝶呤（MTX）的扩大培养基中，甲氨蝶呤是一种阻止叶酸减少的叶酸类似物。丝氨酸是消耗量第二高的氨基酸，是CHO细胞中单碳（1C）单位代谢的主要供体。培养基中CHO细胞消耗的丝氨酸超过70％转化为甘氨酸，最终用于胸苷酸合成。尽管丝氨酸具有重要作用，但培养基中的低丝氨酸浓度（1mM）似乎对细胞生长几乎没有影响，除了在指数期减少甲酸和减少甘氨酸的产生。然而，培养基中的丝氨酸耗竭会产生负面影响，包括天冬酰胺消耗增加，丙氨酸产生，乳酸生成和铵生成，这最终会抑制细胞生长。考虑到高消耗率和耗尽的不利影响，丝氨酸是通常在培养基中以相对高的浓度提供。事实上，一些研究表明，培养基中额外的丝氨酸可以提高蛋白含量并增加特定的峰值细胞密度。酪氨酸是影响CHO细胞培养中mAb产生的关键氨基酸。低酪氨酸浓度可以干扰蛋白质翻译并将比生产率降低到接近零。酪氨酸残基上苯丙氨酸错误掺入的程度与酪氨酸饥饿正相关，从而导致产物序列变体的产生。在培养基中维持浓度高于1mM的酪氨酸可以有效地消除酪氨酸位点的错误掺入。然而，酪氨酸是一种溶解性差的氨基酸，这使得在细胞培养基中使用高酪氨酸浓度变得复杂。总之，在培养基中维持大多数氨基酸在特定浓度范围对CHO细胞培养非常重要。因此，补料培养基通常设计为含有高浓度氨基酸。然而，与其他培养基组分相比，一些氨基酸具有相对低的溶解度和稳定性。为了提高氨基酸溶解度，许多进料培养基设计在相对高的pH下。为了氨基酸的稳定性，培养基可以避光储存。最近，已经描述了一些具有改善的溶解度和稳定性的氨基酸取代物。例如，酪氨酸，最不可溶的氨基酸，可以用磷酸酪氨酸二钠盐或含酪氨酸的二肽代替，以提高溶解度。半胱氨酸是最不稳定的氨基酸之一，可以在中性pH下被氧化成胱氨酸。胱氨酸的低溶解度降低了半胱氨酸在培养基中的表观溶解度。最近，一种高度可溶且稳定的半胱氨酸衍生物S-磺基半胱氨酸已被报道为CHO细胞培养基中半胱氨酸的替代来源和抗氧化剂。此外，小肽已被评估为某些氨基酸的替代物以提供改善的稳定性和培养条件。脂类脂质是生物膜的主要成分，也可以作为哺乳动物细胞的能量来源和信号分子。它们是内质网状和高尔基体的关键组成部分，内质网状和高尔基体是负责蛋白质合成，折叠，翻译后修饰和分泌的细胞器。通常，CHO细胞能够自己合成脂质。重组CHO细胞能够在无脂质培养基中适应和生长，而细胞增殖率和产物活性没有显著下降。然而，无血清培养基中的脂质补充已证明有益于细胞活力和产物糖基化。事实上，脂质和脂质前体对CHO细胞生长的影响可以根据所提供的脂质或前体的类型而显着变化。因此，培养基中使用的脂质补充剂的选择可对细胞生长产生显着影响。磷脂是大多数哺乳动物细胞膜的主要成分。无论在无血清培养基中是否存在生长因子，外源性补充磷脂如磷脂酸和溶血磷脂酸已被证明可刺激CHO细胞生长。作为磷脂的主要成分，胆碱和乙醇胺表现出的对细胞生长的增强影响与混合脂质相当。因此，在许多众所周知的商业培养基中都使用了胆碱补充剂，包括DMEM和RPMI-1640。脂肪酸和胆固醇在培养基中不是高度可溶或稳定的。作为替代品，脂肪酸和胆固醇的不同前体和类似物更稳定且可溶于培养基，已被证明可用于促进细胞生长和健康。同时，在同一研究中，培养基中含有少量酒精可增加脂溶性而不影响细胞生长。尽管脂肪是很重要的培养基成分，但脂肪酸的浓度应该保持在相对较低的水平，因为高浓度的脂肪酸可能会导致CHO细胞产生脂毒性。维生素维生素在信号级联以及酶抑制和激活中用作辅酶，辅基或辅因子。维生素的高还原能力可以保护细胞免受氧化自由基的侵害。尽管需要微量，但维生素是细胞培养基的必需成分，特别是在化学成分确定的培养基中。许多商业培养基含有B族维生素及其衍生物，包括生物素，叶酸，肌醇，烟酰胺，胆碱，4-氨基苯甲酸，泛酸，吡哆醇，核黄素，硫胺素和钴胺素。在CHO细胞培养中，添加维生素已被证明可使mAb体积产量增加3倍。然而，并非所有通常包含在培养基补充剂中的维生素对细胞生长都很重要。例如，补充叶酸，钴蓝蛋白，生物素和4-氨基苯甲酸在增加细胞生长和生产力方面与增加培养基中所有维生素的浓度一样有效。许多维生素易受热，强光和长期空气暴露的影响。特别是，在CHO细胞培养基中常用的维生素中，抗坏血酸和生育酚对空气氧化敏感。维生素B1，核黄素，钴胺素和抗坏血酸对光敏感; 维生素B1和泛酸对热敏感。因此，在培养基储存期间，保护培养基免受光和热的影响至关重要。微量元素细胞培养基中微量元素的有效浓度通常很低，在许多情况下，它们可能低于标准分析的检测仪器仪表阈值。然而，相对于少量添加，它们的重要性不成比例。许多痕量金属元素对代谢途径的调节，对某些酶和信号分子的活性起关键作用。在CHO细胞培养中，缺铜会导致乳酸脱氢酶和其他线粒体氧化酶的下调，从而导致组织毒性缺氧，无论溶解氧浓度如何。因此，相对高铜浓度可以改变CHO细胞的乳酸代谢，从净乳酸产量到净乳酸消耗，并随后增强细胞生长和蛋白含量。然而，高铜浓度也可以增加抗体产物的基本变体的相对量。因此，CHO细胞中的铜浓度培养基应在培养性能和产品质量方面进行仔细优化。铁被广泛认为是化学成分确定的培养基中必不可少的成分。铁在通过血红素，线粒体氧化途径和其他重要酶转移氧的过程中中起着关键作用。然而，游离铁，尤其是游离铁离子，即使是微量的，也会导致高氧化应力。铁载体或螯合剂可以包含在培养基中以使毒性最小化并改善细胞对铁的摄取。转铁蛋白是一种非常有效的铁载体，可显著影响铁的摄取。在血清补充培养基中，转铁蛋白通常作为血清成分存在，而在无血清培养基中，可加入重组转铁蛋白以改善铁的稳定性和摄取。作为转铁蛋白的较便宜的替代品，也使用小分子螯合剂，如Tropolone，柠檬酸盐和亚硒酸盐。由于IP限制，Tropolone尚未在基于CHO的生产中得到广泛应用或评估。亚硒酸盐与铁和柠檬酸盐的最佳比例已被证明可以通过改善铁吸收来增强铁载体缺乏培养基中的CHO细胞生长，并且可以提供与Tropolone相当的效果，而单独使用没有亚硒酸盐的柠檬酸盐离子没有被证明有同样的效果。然而，后来的研究表明，硫酸亚铁和柠檬酸钠的组合可以提高转化效率和蛋白含量。据报道锌是最有影响力的的微量元素之一，在化学成分确定的和无蛋白质的产生mAb的CHO细胞培养基中。化学成分确定的商业培养基中，锌补充剂已经显示出mAb产生增加1.2倍。此外，CHO细胞的锌暴露可以导致应激蛋白功能的诱导，并随后减少细胞凋亡。除了上面讨论的主要微量元素外，其他元素也可以影响细胞生长，生产力和产品质量。大多数这些微量元素仅在细胞培养基中浓度低于5μM时才需要。已知锰，钼，硒，钒是细胞培养所必需的，因此包含在大多数培养基中。某些哺乳动物细胞可能需要其他微量元素，包括锗，铷，锆，钴，镍，锡和铬，或具有某些功能，因此也包含在某些培养基中。表2提供了所选微量元素在CHO细胞培养基中的主要功能。尽管在CHO细胞培养基中提供微量元素至关重要，但大多数微量元素对相对较高浓度的CHO细胞都有毒性。培养基粉末、其他原材料或细胞培养容器由于带有某些微量元素，杂质或不当制造的存在而受到污染。如果这些微量元素的浓度在培养基中处于不明确状态，可能导致表现差异或对细胞的毒性。无机盐盐在CHO细胞培养基中起着重要的化学和生物作用，包括维持细胞膜电位，重量摩尔渗透压浓度和缓冲作用。通常，大量添加到CHO培养基中的离子包括钠，钾，镁，钙，氯化物，磷酸盐，碳酸盐，硫酸盐和硝酸盐。所有哺乳动物细胞都使用钠和钾离子梯度来产生跨膜电位，支持信号传递以及营养和离子富集。在许多常用的CHO细胞培养基中，钠离子与钾离子的比例约为20-40：1同时，据报道钠钾比例较低（6-8：1）或钾浓度较高的培养基，有利于CHO细胞提高活力和提高生产力。培养基中钙和镁离子的浓度通常分别设计为约1-3mM和0.2-1mM。已证实缺乏钙和镁通过CHO细胞中的清道夫受体BI引发细胞凋亡，而细胞内钙过载也可导致细胞凋亡。磷酸盐是信号级联，能量转移和许多细胞组分（例如核酸）形成中的关键阴离子。在补料培养基中添加磷酸盐已被证明有利于细胞活力和活细胞密度。在接种扩增培养基期间适应长期磷酸盐缺乏已被证明导致能量产生的替代途径。除了它们的生理学效用外，无机盐还控制培养基重量摩尔渗透压浓度。据报道，将渗透压从290增加到435mOsm可以减少杂交瘤细胞系的细胞生长，但是将生产率提高了两倍以上，从而产生了类似的最终抗体浓度。对于CHO细胞，据报道，特定的细胞生长率，随着扩增培养基渗透压在316-450mOsm / kg之间的增加而线性下降。然而，渗透压逐渐增加至~450mOsm/ kg也显示出显着提高CHO细胞生产率和mAb产量。因此，在设计细胞培养基时，综合的无机盐和大量离子供应须考虑最终重量摩尔渗透压浓度。生长因子生长因子通常是肽，小分子蛋白质和激素，充当影响细胞生长，增殖，恢复和分化的信号分子。早期研究表明，生长因子是细胞培养基中不可或缺的一部分，没有生产因子，细胞生长可能会被显著抑制甚至停止。在许多早期培养基中，生长因子以血清形式提供。然而，在无血清培养基中，不是提供通常在血清中发现的广谱生长因子，而是仅提供少量特定生长因子，从而最小化培养基配方的总体复杂性。胰岛素及其类似物是无血清培养基中最广泛使用的生长因子。研究表明，与缺乏生长因子的培养基相比，微量低至50ng /ml的胰岛素可将蛋白含量提高3-4倍。已证明1毫克每毫升的胰岛素可改善批次培养中CHO细胞的健康状况，抑制细胞凋亡标志物如ICE，Bcl-2和Bax的表达。胰岛素的类似物，包括胰岛素生长因子1（IGF-1）和LONGR3（Repligen，SAFC），已证明在无血清培养基中对CHO细胞的活力有相似或更好的改善，且培养基中所需使用浓度低于胰岛素。除了外源性胰岛素和胰岛素类似物外，还在转录组学和免疫化学水平上鉴定了8种CHO细胞的自分泌生长因子。包括脑源性神经营养因子（BDNF），成纤维细胞生长因子8（FGF8），生长调节α蛋白（CXCL1），肝细胞生长因子（HGF），肝细胞来源生长因子（HDGF），白血病抑制因子（LIF），巨噬细胞集落刺激因子1（CSF1）和血管内皮生长因子C（VEGFC）。研究表明，添加一种或多种生长因子FGF8，HGF和VEGFC可促进无血清培养基中的细胞增殖。然而，为了尽量减少培养基的复杂性，可变性和成本，应排除生长因子过量供应对细胞生长和生产力的影响。使用生长因子的一种可能的替代方法是小分子抗氧化螯合剂金精三羧酸（ATA），已显示通过以类似于胰岛素的方式作用于IGF-1受体（与溶血磷脂酸组合）来促进CHO细胞生长。因此，ATA可以在某些培养基中，证明是一种更稳定，更便宜的胰岛素或胰岛素类似物替代品。多胺多胺是哺乳动物细胞中普遍存在的分子，在多种代谢过程中起着关键作用，包括DNA合成和转录，核糖体功能，离子通道调节和细胞信号传导。在哺乳动物细胞中，几种多胺是由鸟氨酸合成的，鸟氨酸是尿素循环中的代谢中间体。无论如何，用多胺补充培养基对于支持和加速CHO细胞生长至关重要。通常在CHO细胞培养基中补充的外源多胺包括腐胺，亚精胺和精胺。腐胺是合成精胺和亚精胺的前体，而精胺和亚精胺在细胞中是可相互转化的。以前的研究表明，这些多胺中的每一种都可以单独提高细胞生长速度和活力，并且精胺可能是三者中间最有效的。许多CHO细胞培养基含有几种不同的多胺。同时，多胺分解代谢可通过多种途径产生氧化物质，醛类，丙烯醛和氨，从而抑制细胞生长，最终影响细胞活力。因此，细胞培养基中的多胺补充应控制在细胞毒性极限以下。非营养成分在CHO细胞培养基中，包括一些非营养成分，为细胞提供更稳定的物理或化学环境。这些组分可包括缓冲剂，表面活性剂和消泡剂，可对细胞生长和生产率产生显著影响。缓冲剂是细胞培养基的重要组成部分。尽管氨基酸和多价离子可以提供一些缓冲能力，但细胞培养基仍然需要强缓冲试剂以满足在CHO细胞培养物中维持pH的挑战。许多传统的细胞培养基，如DMEM和RPMI-1640，应用碳酸氢盐缓冲系统（CO2 / NaHCO 3）作为主要的缓冲源。为了提高pH稳定性，有机两性离子缓冲剂HEPES也包含在细胞培养基中，在7.2-7.4的pH范围内提供强大的缓冲能力。此外，培养基中包含的磷酸根离子也可以提供缓冲能力的主要来源。PluronicF-68是一种通常包含在培养基中的表面活性剂，通过降低泡沫层中细胞的浓度，可以保护细胞免受气泡破裂引起的机械应力。研究表明，在培养基中加入0.03g/ L Pluronic F-68可将发泡层中细胞的浓度降低至整体培养物中细胞浓度的30％。PluronicF-68可通过以下一种或多种机制保护细胞。包括在细胞膜上形成保护层，降低其疏水性，稳定生物反应器中细胞培养物顶部的泡沫层，或通过结合细胞膜并加强细胞膜。总而言之，人们普遍认为PluronicF-68可以显着增强细胞生长，细胞活力，生产率和糖基化。然而，CHO细胞可以内化PluronicF-68并在溶酶体中降解它。因此，除了在基础培养基中包含PluronicF-68外，作为补料培养基组分连续补充该表面活性剂来维持细胞培养物中所需的浓度。此外，PluronicF-68批次之间的差异已被证明会影响细胞生长和生产力，特别是在大规模生产活动中。据报道，基于摇瓶的强大缩放模型为PluronicF-68的质量控制和验证提了高效解决方案。消泡剂是具有低表面粘度的强疏水性表面活性剂，通常添加到细胞培养基中以控制和最小化发泡。这对于保护细胞免受由发泡引起的机械剪切以及防止生物反应器潜在的“发泡”和排气过滤器堵塞是必要的。排气过滤器堵塞可能导致过压。消泡剂可以直接添加到生产培养基中或在生产过程中根据需要添加。消泡剂可以是基于油的（有机的）或基于硅氧烷的，并且可以基于消泡机理分为快速和慢速消泡剂。速效消泡剂通常是水性悬浮液或乳液，其中乳液中的颗粒或液滴进入泡沫气泡膜以破坏气泡。油基消泡剂的作用更慢，以防止和消除泡沫。在CHO细胞培养中，硅基消泡剂如消泡剂C（SigmaAldrich），通常作为硅聚合物的水性悬浮液提供，因其有效性，消泡效率高，毒性低而广泛使用。应该注意的是，一般添加表面活性剂，包括PluronicF-68和消泡剂，倾向于减少生物反应器环境中的氧转移，导致较低的kLa值，消泡剂已被证明会降低生物反应器中的流体动力学和传质特性，特别是在氧转移方面。此外，相对高浓度的消泡剂可能对细胞有毒，可能加速细胞死亡。因此，应小心控制消泡剂添加并保持在细胞培养中的最低必需浓度。用于重组蛋白表达的生长培养基的优化生物分子细胞培养强劲生产工艺的开发需要一种细胞培养基，它不仅含有生长和蛋白质表达所需的所有营养素，而且还是一种优化的配方，综合考虑到细胞健康和活力，代谢作用，产品质量，工艺性，监管因素，供应链和知识产权（IP）。用于给定过程或产品的理想细胞培养基将最佳地解决这些方面，同时还支持高蛋白含量和特定生产力。由于这些原因，对哺乳动物细胞培养基进行彻底优化是一个极其复杂和资源密集的过程，因为需要大量实验来优化多种培养基组分的浓度，以满足最终许多所需属性和培养基表现。用于工业应用的培养基优化设计元素工业细胞培养工艺需要能够进行一致的大规模生产和配制的培养基。因此，干粉和液体培养基配方应针对影响可制造性的属性进行优化，例如组分溶解度，培养基过滤，灭菌，储存稳定性，培养基配制可扩展性和原料一致性，批次间差异最小。补料-分批培养工艺的培养基优化工作通常侧重于营养补料开发，以提高细胞生长和生产力。然而，对于工业应用，可制造性属性和工程问题，例如制备时间，剪切保护和泡沫减少，同样重要。与“批量”过程相反，细胞在单一培养基中生长直至营养物耗尽，“分批补料”过程包括至少两种培养基：支持初始生长的基础培养基和一种或多种补料培养基。补料培养基可以以单次量和指定的间隔添加，或者在该过程的后期连续添加，以补充耗尽的营养物，支持稳定期生长和蛋白质表达。在其最简单的形式中，补料培养基可以仅供应葡萄糖，葡萄糖是为细胞生长提供能量所需的主要碳源。更常见的是，补料培养基类似于基础培养基的浓缩形式，相对于基础的某些组分，浓度高达15倍。补料培养基可以基于分批培养实验的数据而设计，这些实验确定营养物消耗和耗尽率。将营养素分离成基础培养基和饲料培养基，以便以最佳水平向细胞提供营养，而不达到溶解度极限或抑制浓度。某些营养素，如葡萄糖，可以单独补料，以更精确地控制培养基中的浓度，并防止不需要的代谢物如乳酸盐的积累。在工业环境中，可能不希望使用细胞系发育早期阶段的不同培养基，如转染和单细胞克隆时期对比后来用于接种培养基和基础生产培养的基础培养基。尽管预先使用不同的培养基可以允许使用已经针对敏感步骤（例如转染或克隆）优化的市售培养基，但是仍然需要较长时间来适应营养更丰富的基础和补料分批培养基配方。适应步骤可以延长项目时间表并使细胞暴露于额外的压力，可能导致不稳定的亚群的选择。理想的细胞培养工艺从转染和克隆到生产基础培养基使用同一种培养基，只需要短暂适应期或几乎不需要适应，并且克隆和基础培养基之间仅有微小差异（补充生长因子等）。如前所述，大多数现代细胞培养物制造方法使用化学成分确定的，无血清和无动物成分的培养基。这解决了由血清或动物成分引起的外来微生物或病毒潜在污染问题，以及未定义的培养基组分如水解产物的一致性和再现性问题。尽管化学成分确定的培养基已经使用了一段时间，并且许多有效的成分容易获得，但通常需要进一步优化培养基以开发针对特定克隆的稳健的高蛋白含量的工艺方法。单个转染和克隆之间的生长，代谢物和营养物耗尽曲线可能不同。因此，优化工作的目标是提高蛋白含量，同时保持所需的营养水平，优化微量元素，盐和重量摩尔渗透压浓度，最大限度地减少废物代谢物的积累，防止细胞凋亡和活力崩溃，并避免细胞聚集或结团。可制造性是优化培养基用于工业细胞培养工艺的一个至关重要的特征，哺乳动物细胞培养基非常复杂，通常包括超过50种成分。在工业环境中，这种复杂性使得确保可扩展和可重复的培养基制备具有挑战性，从小规模工艺开发到大规模临床和商业制造都需要提供一致的性能。因此，现在通常的做法是制备含有全部或大部分组分的经研磨和混合的“预混”干粉配方。使用不同类型的研磨设备进行研磨，例如球磨机针磨机或FitzMill（TheFitzpatrickCompany，Elmhurst，IL），取决于制造商。预混合粉末可以小规模和大规模可重复制造，易于运输，具有可接受的保质期，并且通常仅需要用水重新溶解，然后在使用前进行pH调节和过滤除菌。液体培养基或浓缩物也可以由培养基制造商提供，但是这些可能是大批量运输昂贵并且具有较短的保质期。对于干粉配方，由于某些组分的溶解度限制，可能需要将整个配方分成多个预混粉末。通常，由1-2种预混合粉末组成的培养基对于最小化培养基制备的复杂性是理想的。额外的的组分可以单独添加或以补充剂的形式添加，这取决于组分在溶解度，稳定性和灭菌要求方面的属性。培养基配方的优化应考虑原料可用性（双重或多源），溶解度，重量摩尔渗透压浓度，可扩展性，室温下的稳定性，干粉组分的润湿性，以及最终研磨和混合的干粉或重新溶解液体培养基的稠度。存在某些粉末制造工艺，例如GibcoAdvanced Granulation Technology（ThermoFisher），它通过使用已经调节pH和渗透压的完全培养基粉末来保证简单且可重复的培养基制备，并且仅需要用水重新配制和使用前除菌过滤。另外，MilliporeSigma开发了一种培养基粉末压实技术，可用于优化颗粒尺寸，改善培养基处理和溶解，最大限度地减少粉尘形成。然而，在制造环境中，为所有培养基粉末和成分提供多个供应商至关重要，以减少潜在的供应链问题。使用专有的粉末配方可能会造成单一供应商采购限制。某些培养基组分有众所周知的稳定性和溶解度问题。营养物可用性和氧化还原平衡的变化可能是由于培养基组分的降解或沉淀造成的。液体培养基通常保持冷却并且在储存期间避光，以防止光敏或热不稳定成分的降解。几种氨基酸，包括谷氨酰胺，酪氨酸和半胱氨酸具有稳定性和/或溶解度问题，限制了在培养基中提供必要浓度的这些组分的能力。此外，某些生长因子，包括胰岛素和IGF，以及许多维生素，在液体培养基中可能不稳定。培养基可以通过设计来克服这些限制，包括不稳定的成分，如谷氨酰胺和生长因子，以单独的补充剂的形式在使用前添加，并持续作为补料培养基的一部分提供，以避免耗尽。氨基酸也可以以小肽或二肽的形式提供，以在培养基中提供更高的浓度，同时提高稳定性和溶解度。渗透压是培养基设计中的主要问题。所有离子，包括盐，氨基酸，缓冲剂和脂肪酸，都可以与渗透压相关。高渗透压（>450 mOsm / kg）可导致细胞生长，蛋白含量和细胞活力降低，以及细胞大小和倍增时间增加。低于450 mOsm /kg，渗透压增加对细胞生长的直接影响很有限。事实上，在生产阶段，较高的重量摩尔渗透压浓度（高达约400mOsm / kg）已被证明可以提高蛋白含量20％。然而，增加重量摩尔渗透压浓度高达450mOsm/kg也可以提高铵和乳酸的产量，从而间接影响培养性能。因此，用于在CHO细胞表达重组蛋白的生产和扩增培养基通常设计为保持相对低的重量摩尔渗透压浓度（250-350mOsm/kg），而补料培养基在生产过程的后期阶段增加重量摩尔渗透压浓度。工程问题也是培养基设计的一个关键方面。通过机械搅拌，喷射和发泡引入的剪切应力破坏了细胞。这在化学成分确定的无血清培养基中尤其明显，可能是由于它们的总蛋白含量低。因此，发泡在生物反应器中有多种原因是一个重要问题。除了对细胞活力和生产力的负面影响之外，在严重的情况下，通过导致排气过滤器堵塞，过度加压和污染，发泡对于工艺可能是灾难性的。如本综述（聚胺部分）中所述，保护性聚合物和表面活性剂，如PluronicF-68和消泡剂，通常包含在化学成分确定的培养基中，以减少剪切相关的损伤和控制发泡。在培养基中优化Pluronic和消泡剂水平有助于最大限度地提高剪切和泡沫保护，同时最大限度地减少生物反应器环境中对氧转移和kLa值的负面影响。在培养基准备时的病毒控制是另一个重要的可制造性问题。灭活方法采用紫外（UV）照射，γ辐射，加热，极端pH或溶剂/洗涤剂暴露。对于化学成分确定的培养基，已经使用超滤和高温短时间（HTST）处理来降低病毒引入的风险。HTST虽然有效，但可导致细胞培养基沉淀或形成不溶性颗粒。已经表明，调节基础培养基配方中的钙盐和无机磷酸盐浓度导致由于热处理导致的沉淀显着减少。另一种方法是使用病毒保留过滤，这种过滤广泛适用并且可能对于化学成分确定培养基需要考虑的特殊因素最少。培养基优化的实验方法一旦确定了细胞培养基所需的关键设计元素，就可以采用几种不同的，可能互补的方法进行培养基优化。基本上，培养基中每种成分的特定浓度应该得到优化。考虑细胞系的利用率及其对蛋白含量，生长和产品质量的影响。还必须考虑多个培养基组分之间的相互作用，可使用简单的，以实验为依据的的one-factor-at-a-time(OFAT)方法解决复杂的优化工作。以前描述的许多基本培养基成分，包括葡萄糖，氨基酸，维生素，脂质和脂肪酸，在细胞生长过程中以化学计量方式消耗，因为它们要么转化为生物质和重组产物，要么被用作能量来源。因此这些营养素可以用化学计量学加以优化，通过分析细胞培养基用量和计算每种成分的特定利用率。可以使用各种分析方法监测氨基酸，微量元素和维生素的消耗，以优化培养基中这些营养素的浓度，促进增长，延长细胞活力。已经开发出用于哺乳动物细胞生长和单克隆抗体表达的化学计量模型，并且成功地用于优化细胞培养基和补充物中的葡萄糖，谷氨酰胺和氨基酸浓度，带来细胞密度和产物蛋白含量的显著改善。虽然最初开发用于杂交瘤培养物，但该化学计量模型也已应用于CHO细胞工艺以进行重组γ-干扰素表达，从而改善细胞生长和最终产物的产生和糖基化，同时减少培养基中代谢副产物的积累。这些研究证明了化学计量模型对培养基优化的普遍适用性。基于消耗量和消耗率的化学计量比营养平衡是培养基优化的有效方法，但不能通过复杂的细胞代谢途径深入观察和理解营养物质的流动。另一方面，代谢流分析（MFA）旨在通过在细胞培养的生长和生产阶段通过测量营养物和代谢中间体的流动率来解释组成细胞代谢的主要途径和生化反应。物质平衡反应应用于复杂的是具有挑战性的，细胞代谢系统发生大量反应，包括一些具有非常低流量且难以测量的反应。在这种情况下，整体分析可以缩小至仅包含最重要和特征良好的途径，有可测量的流量可以解释大部分葡萄糖和氨基酸代谢以及转化为生物量和产物。前面提到的化学计量分析定义了动物细胞生长和蛋白质表达中涉及的关键代谢和营养需求，以及最终将化学计量模型应用于CHO细胞培养工艺，为MFA的未来发展和应用于CHO细胞奠定了基础。MFA已被用于模拟CHO细胞中的主要代谢并已应用于CHO细胞培养工艺，以深入了解葡萄糖和氮的利用，和乳酸消耗。最近的研究已建立了非常完整的CHO细胞代谢模型，使用计算机模型预测在改良营养条件下的细胞反应，为更容易的培养基和工艺开发铺平了道路。高通量技术在培养基优化中的实验设计与应用由于细胞培养基非常复杂，在许多情况下含有超过50种成分因此优化培养基配方可能非常具有挑战性。传统的one-factor-at-a-time（OFAT）培养基优化方法对于这种复杂的情况，需要大量劳动力和密集资源。由于这种方法一次只改变一种成分的浓度，同时保持所有其他成分不变，这样的努力需要大量的培养容器和大量的人员工作时间。此外，这种方法无法识别组分之间的相互作用，因此培养基优化的可能性有限。通过一次评估多个组分及其相互作用，减少必要的实验规模和数量，并允许观察培养基组分之间复杂的相互作用，使用统计设计实验（DoE）已经证明可以简化和改进这项工作。存在许多不同的统计设计，每个设计都有其独特的优点。设计范围从大型全因子设计，其中几个因素在两个或更多个级别（在所有可能的组合中）被评估，到部分因子设计（其中仅评估组合的子集），到更复杂的模型，例如Plackett-Burman，CentralComposite和Box-Behnken，可以识别主要效应和一些相互作用，同时减少所需的实验总数。Plackett-Burman设计（图1），特别是对于筛选大量因子非常有效，最大限度地减少实验次数。然而，结果可能会被双因素相互作用混淆，因此一旦确定了关键因素和主要影响，就需要使用不同的设计进一步优化。使用统计DoE进行CHO细胞培养基开发的早期实例利用了Plackett-Burman样式筛选设计，以开发无血清培养基配方，用于改善细胞生长和重组蛋白表达。自从这些早期努力以来，统计设计的使用已成为细胞培养基优化的常规方法，许多团体组合了Plackett-Burman用于初步筛选主要效应和组分相互作用的类型设计，采用最主要的混合或定制设计，在随后的实验中将最佳配方归零（图2）。培养基混合（或掺和）是用于简化复杂细胞培养基组分优化的另一种方法，同时还能评估单个组分及其相互作用。通过这种方法，将全面成分或特定组分（或其组合）的相对浓度不同的多种培养基以不同的比例混合以产生更多数量的培养基“混合物”，然后可以筛选它们对细胞生长和重组蛋白表达的影响。如前所述，这种方法用于开发哺乳动物细胞培养基的一些最早的努力，并创建了重要的突破性配方，如DMEM/ F12和RDF。培养基混合仍然用于优化研究中,介质混合在优化研究中仍在使用，为了最大限度地减少因使用组分原液筛选实验培养基而产生的溶解度，重量摩尔渗透压浓度和pH值问题。可以对混合培养基进行评估和直接比较，以确定混合配方，从而改善任何亲本配方培养基或特定组分，其在不同混合物中的相对浓度显示出对培养性能的显著影响。此外，统计实验设计和分析也可以应用于培养基混合实验，以预测未在所测试的培养基混合物组中具体表示的最佳配方。这些方法已成功用于优化CHO细胞培养基中的氨基酸，己糖和其他成分浓度，以及用于培养基优化的市售试剂盒的开发。即使使用刚刚讨论过的简化和高效的实验设计，哺乳动物细胞培养基的成功优化仍然需要同时运行和评估大量培养容器的能力。这对于研究足量的实验重复评估多个组分范围以确保稳健性是必要的。摇瓶可以用较小规模的摇动容器替换，例如50ml锥形管或深孔板（DWP），以最大限度地减少所需的混合器空间，这也可以与自动液体处理配对，以最大限度地减少与采样和补料相关的人力劳动。由BioProcessorsInc.开发的SimCell微生物反应器系统包含一系列600μl生物反应器，可以大量运行，多达1000个反应器并行运行，可进行大规模细胞培养实验，来优化培养基和参数。该系统通过与Amgen合作进行评估，显示了5L系统的可比性和可扩展性，该平台最终由NovoNordisk购买。最近，全自动小型生物反应器如Ambr系统（Sartorius）的出现，在真正的生物反应器环境中实现了细胞培养过程的高通量优化，包括内部叶轮，气体供应，pH和溶解氧控制以及在线细胞计数。这些类型的技术是非常有用和有价值的工具，这大大提高了研究人员正确彻底地评估和优化复杂培养基配方的能力。培养基开发的最新进展CHO细胞培养基开发的现代方法，利用新技术或现有技术来推动性能表现，通过直接解决细胞代谢，基因组成和信号通路的问题，这些问题可以抑制生长和生产力，甚至通过细胞凋亡等机制导致细胞过早死亡。新技术可以支持生物反应器的自动和无菌采样，以及通过过程分析技术（PAT）方法（如电容和拉曼光谱）进行实时分析和诊断，这些方法允许反馈回路调整以开发培养基组分。“多组学”技术的进步，结合了基因组学，表观基因组学，转录组学，蛋白质组学，代谢组学和其他分析的数据，实现了代谢机制的综合和完整图像和控制。培养基设计最新进展的其他驱动因素包括使用高通量细胞培养设备和方法来破译和控制产品质量，特别是在匹配生物仿制药产品质量的背景下，以及长时间维持高细胞密度连续处理的需要。直接解决这些问题可以导致高度定制培养基的开发，针对特定的细胞系和工艺进行优化，以最大化细胞生产力。近年来，灌流技术越来越多应用于种子培养（N- 1）和/或生产阶段生物反应器，以提高细胞生长和生产力，提高生物反应器的使用效率，并降低制造成本。通过不断去除含有有毒代谢副产物的培养基，同时也以合理的速度不断灌流新鲜培养基，设计合理的灌流工艺可以消除营养物质耗竭和生长抑制问题（图3）。与常规批次或分批补料过程不同，灌流工艺中的活细胞密度可以高达20-35百万细胞/ml，细胞有产出，2亿细胞/ml，无产出。因此，灌流培养基需要专门设计，以支持非常高的细胞密度和生长速度。尽管在CHO细胞培养中用于重组蛋白表达的各种灌流操作之间存在差异，包括N-1灌流，浓缩分批补料和连续灌流生产，灌流培养基开发的起点通常是用于进行补料分批培养的基础培养基和补料培养基。灌注培养基开发的一个成功案例，其结果是每天的蛋白含量1.2g/ L 通过优化现有基础培养基和补料培养基之间的比例，去除不必要的成分，增加培养基深度，优化渗透压，重新平衡氨基酸和维生素来实现。然而，比起分批补料培养基，灌流培养基的开发中必须更多地考虑后勤问题，诸如操作简单和与制造设施的兼容性等。特别是，灌流工艺中中非常需要较低的灌流速率，因为它们需要较小体积的灌流培养基。因此，这应该在灌流培养基开发中优先考虑。配制用于精确输送营养的浓缩培养基可以使生产工艺更便利并降低成本。尽管灌流实验和过程通常在实验室规模的生物反应器中进行，但已经开发出便宜且方便的用于灌注的缩小模型，如深孔板，自旋管和自动生物反应器，可以实现优化灌流培养基所需的大型DoE统计筛选。基因组和转录分析方法也已用于评估CHO细胞培养工艺并鉴定用于培养基改善的区域。比较相同的mAb生产细胞系分批补料工艺的高蛋白含量和低蛋白含量，并鉴定了由于培养基配方的差异导致的基因表达的显著差异，以及培养基配方差异对细胞生长和活力的代谢途径的特异性影响。此外，鉴定两种培养基之间与脂质代谢相关基因的差异表达，允许基于转录组数据对现有培养基配方进行靶向优化，导致该培养基中蛋白含量提高20％。代谢组学方法也可用于优化培养基配方。MirandaYap及其同事利用HPLC-MS（高效液相色谱-质谱法）表征细胞内和细胞外代谢物，这些代谢物来自氨基酸，培养基成分和各种代谢途径，这些代谢物可在细胞培养过程中积累在培养基中，抑制生长或引发细胞凋亡。此外，Mulukutla及其同事使用质谱和核磁共振来鉴定和定量代谢副产物，尽管在此过程中对乳酸，氨和渗透压有良好的控制。这些生长抑制分子是被鉴定为某些氨基酸代谢的分流（或死端）副产物，包括苯丙氨酸，酪氨酸，色氨酸，蛋氨酸，亮氨酸，丝氨酸，苏氨酸和甘氨酸。作者证明，通过以与特定消耗速率相匹配的速率补料，仔细控制细胞培养物中的氨基酸水平可以控制抑制剂积累，并改善生长和生产力。虽然已经证实可以利用基因组学和代谢组学方法改进CHO细胞培养工艺，通过整合这些技术以及其他“组学”分析，包括蛋白质组学，糖组学，表观遗传学，通量组学，脂质组学和转录组学，以建立更完整的机制模型，实现更好的进展。来自多个国家的学术和工业贡献者的一项大型研究开发了CHO细胞的基因组规模代谢模型，并证明了其在优化生长和生产力以及用于确定基因工程的有用靶标以改善重组蛋白表达和分泌方面的价值。此外，作者通过结合每种细胞系的转录组学，代谢组学和蛋白质组学数据与基因组规模代谢模型，开发了CHO-K1，CHO-S和CHO-DG44谱系的细胞系特异性模型。随着分子组学和分析技术的不断发展，这些模型可能会被进一步优化，通过结合糖组学，蛋白质组学和表观基因组学数据来模拟产品质量和细胞系稳定性以及代谢“杠杆”，通过对给定的CHO细胞系进行培养基开发来控制生长和生产力。应用这些类型的高级分析开发CHO细胞工艺可以潜在地实现高度专业化的培养基开发，基于其自身独特的“多组学”特征定制特定的细胞系。某些靶向细胞通路和机制的分子，与细胞健康或蛋白质表达有关，可以添加到细胞培养基中。细胞凋亡和自噬是程序性细胞死亡过程，其可以由营养物耗竭或环境压力引发，可能降低整体细胞健康和细胞培养性能。经评估发现，补充凋亡抑制剂和自噬抑制剂，在一些情况下可改善重组蛋白表达。由于生产规模的成本，大多数这些补充剂没有被广泛使用。然而，广泛使用的一些生长因子，如胰岛素，IGF-1和LongR3，已被证明可通过抑制细胞凋亡来改善生长和生产力。某些小分子，包括丁酸钠和丙戊酸，作为已被熟知的组蛋白去乙酰化酶抑制剂，可通过改善基因的可及性来增强转录，并且还捕获进入G1期的细胞，增加培养物中生产细胞的数量，评估其对CHO细胞重组蛋白表达的影响，也包括其他哺乳动物细胞系。虽然这些分子已被证明可以提高比生产力，但它们可以抑制生长并诱导细胞凋亡从而降低整体生产力。这可以通过添加的时间和浓度来调控以及控制细胞凋亡的策略，例如降低温度。除了培养基配方外，补料策略在改善细胞生长和生产力方面发挥关键作用，通过优化养分吸收速率和减少抑制性废物代谢物的积累。辉瑞公司的GregHiller及其同事已经实施了由细胞培养物由pH引发的葡萄糖补料策略（名为HIPDOG），这可以最大限度地减少培养物中乳酸的积累，并显著提高细胞生长，蛋白含量和比生产率。此方法基于当葡萄糖被消耗到非常低的水平时，由于乳酸消耗导致pH升高。pH值上升触发葡萄糖进料，由于葡萄糖消耗和乳酸产生导致pH值下降。本质上，通过葡萄糖进料将pH控制在范围的高端，因此称为Hi-EndpH-Controlled Delivery ofGlucose（HIPDOG）高ph控制的葡萄糖输送。这种巧妙的策略也被改进用于混合灌流和分批补料工艺，其中灌流进料的速率同样由pH（HIPCOP）控制。同时，在Genentech，Lu及其同事已经证明了动态补料策略的好处，其中高度优化的补料培养基以在线细胞密度测量或自动葡萄糖监测确定的速率补料，也实现了某些细胞系蛋白含量的显著改善。Genentech的其他研究已经证明使用乳酸和丙酮酸补料，以最大限度地减少细胞培养中潜在的抑制性CO2 和氨积累。这些补料策略，加上完全优化的培养基配方，可以真正最大化CHO细胞培养工艺中细胞的生长潜力和生产力。结论细胞培养基已经从含有血清的早期配方，升级到含有复合水解产物的培养基，到化学成分完全确定的和无蛋白质配方（在某些情况下）无蛋白质配方。基础和补料培养基的再平衡组合配方以优化营养物递送，同时控制最终重量摩尔渗透压浓度，以及化学计量方式进料，细胞培养工艺和培养基设计的概念相结合以最大化性能和一致性。现代“组学”方法有助于更好地认识机制，以进一步开发和优化培养基，确保生物生产细胞培养工艺高产，一致。更好的机制理解还应有助于开发能够在多个细胞系中提供类似的高性能和产品质量的培养基，并有助于实现更大的飞跃以实现最佳性能。原文来源：Ritacco FV, Wu Y, Khetan A.Cell culture media for recombinant protein expression in Chinese hamster ovary (CHO) cells: History, key components, and optimization strategies.Biotechnol Prog. 2018 Nov;34(6):1407-1426. 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入生物制品微信群！请注明：姓名+研究方向！版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。