CSF-2R x CD40 x GM-CSF

摘要：多发性骨髓瘤（MM）是一种以骨髓中浆细胞积累为特征的血液系统癌症。尽管治疗取得了进展，但大多数患者中的MM仍然无法治愈。与MM相关的免疫失调促进了疾病的进展，这促使研究者探索免疫疗法来对抗这种疾病。免疫疗法研究的一个领域是设计骨髓瘤疫苗疗法，以逆转与肿瘤相关的免疫抑制，并引发针对肿瘤的特异性免疫反应，有效地针对MM细胞。本文回顾了MM的疫苗免疫疗法，按抗原类型和递送方法对研究结果进行分类。抗原包括特异性抗原（Id）、肿瘤相关抗原（TAA）、肿瘤特异性抗原（TSA）和整个肿瘤裂解物。到目前为止，骨髓瘤疫苗在临床上显示出有限的疗效。然而，进一步的研究至关重要，以优化各个方面，包括抗原和患者选择、疫苗的时机和顺序，以及与新兴MM治疗的合理组合。 1.引言 多发性骨髓瘤（MM）是一种血液系统恶性肿瘤，其特征是克隆性浆细胞在骨髓（BM）中积累，并分泌单克隆免疫球蛋白，导致被称为CRAB（高钙血症、肾功能不全、贫血和骨病变）的特征性症状。尽管出现了许多新的治疗方法显著改善了治疗效果，但MM在很大程度上仍然无法治愈，对于大多数晚期患者来说，这种疾病仍然是致命的。越来越多的研究关注于利用宿主免疫系统针对MM细胞的免疫疗法。由于抗原呈递无效和效应细胞功能障碍，MM与免疫失调相关，创造了一个促进疾病进展的免疫抑制环境。研究的一个领域是设计骨髓瘤疫苗疗法。癌症疫苗接种是一种旨在激活免疫系统以识别和对抗癌细胞的治疗性方法。这些疫苗可以作为预防措施，称为预防性疫苗，或者作为已经诊断出癌症的个体的治疗选择，称为治疗性疫苗。任何癌症疫苗所针对的抗原的选择对其临床效果至关重要。肿瘤抗原被分为两大类：肿瘤相关抗原（TAAs）和肿瘤特异性抗原（TSAs）。TAAs是自身抗原，它们在肿瘤细胞中要么优先表达，要么异常表达，但也可能在正常细胞中以某种水平存在。TSAs，也称为新抗原，包括仅由癌细胞编码的抗原，并且是肿瘤特异性的，能引发高亲和力T细胞反应。疫苗被分为共享和个性化疫苗。共享抗原是公共抗原，可以由相对常见的人类白细胞抗原（HLA）等位基因在患者中呈递。这些疫苗是现成的免疫疗法的有希望的候选者。另一方面，个性化癌症疫苗由于高通量基因测序、质谱（MS）和生物信息学的进步而最近获得了更多的关注，这些技术使得能够识别HLA结合肽和预测独特的个性化新抗原。此外，癌症疫苗可以通过各种平台递送，如肽疫苗、RNA疫苗、DNA疫苗、病毒疫苗和抗原呈递细胞（APC）/树突细胞（DC）疫苗。如今，大多数正在临床研究中的疫苗涉及递送肿瘤抗原与佐剂或其他共刺激因子的组合。佐剂是癌症疫苗的重要组成部分，因为它们通过激活先天免疫途径来增强免疫反应。各种佐剂，如Toll样受体（TLR）激动剂和细胞因子被用来提高癌症疫苗的效果。有关癌症疫苗的更详细信息，请参考文献3-7。本文旨在回顾针对MM的疫苗免疫疗法的主要发现，根据抗原类型及其递送方式（无论是肽、蛋白质、DNA或DC基础疫苗）进行分类。讨论的肿瘤抗原包括特异性抗原（Id）、TAA、TSA和整个肿瘤裂解物。在MM中，恶性浆细胞分泌含有称为Id的肿瘤特异性抗原决定簇的单克隆免疫球蛋白（副蛋白）。Id是通过B细胞成熟和体细胞超突变期间的基因重排形成的。尽管Id抗原是TSA的一个子集，但由于研究针对骨髓瘤Id抗原的疫苗的历史意义，本综述中包括了对这些抗原的专门部分。 2.特异性疫苗 2.1.基于Id蛋白/肽或DNA的疫苗 Id疫苗的最初研究之一可以追溯到1995年Kwak等人的一项研究，他们用接受者血浆中的骨髓瘤免疫球蛋白免疫了一个健康的兄弟姐妹BM供体。检测到淋巴增殖反应，恢复了对骨髓瘤Id具有独特特异性的接受者CD4+ T细胞系，这证明了用Id免疫可能代表一种增强特异性抗肿瘤效应的新策略。后来，更多的研究调查了Id疫苗作为治疗策略的潜力。一组I-III期MM患者接受了用明矾作为佐剂的自体血清M组分的重复免疫。虽然在三名患者中成功，但引起的免疫反应幅度适中且短暂。随后的研究引入了免疫原性载体蛋白，如钥孔帽螺血蓝蛋白（KLH）或丝状噬菌体，单独或与粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）、白细胞介素（IL）-2、IL-12等佐剂一起使用，以增强Id蛋白的抗肿瘤免疫。尽管这些策略能够引起肿瘤特异性免疫反应，但临床反应适中。例如，在Osterborg等人的研究中，Id疫苗与GM-CSF一起用于五名II期MM患者。所有患者都发展了Id特异性T细胞免疫，但只有一名个体的M组分浓度显著降低。Massaia等人用KLH和低剂量的佐剂细胞因子GM-CSF或IL-2对接受高剂量化疗（HDT）后最小残留病（MRD）的患者进行了疫苗接种。在75%的患者中记录了特异性T细胞反应，但没有减少肿瘤负担。另一项研究探讨了在HDT和外周血祖细胞输注后的第一个缓解期使用与KLH结合的特异性蛋白和低剂量GM-CSF作为维持治疗。回顾性病例匹配分析显示，疫苗组和用干扰素（IFN）-α和/或地塞米松作为维持治疗的对照组之间的生存和无进展生存（PFS）持续时间相似。 在非随机的I期临床试验中，更多的努力被投入到研究基于Id DNA的疫苗，该疫苗编码患者特异性的单链可变片段，或将Id与破伤风毒素的片段C（FrC）链接。14名患者接受了至少在自体干细胞移植（ASCT）/高剂量治疗（HDT）后6个月开始的疫苗接种。在为期52周的研究期间，10名患者（71%）的血清副蛋白无法检测到、减少或保持稳定，而11名患者（79%）维持了持续的完全反应（CR）/部分反应（PR）。此外，对于13名患者，中位无进展生存期（TTP）为38.0个月。然而，由于之前的ASCT/HDT，很难区分疫苗效果和延迟治疗反应，因为在疫苗接种开始后，7名、6名和1名患者已经分别达到了CR、PR和稳定病状（SD）。在Qazilbash等人最近发表的一项研究中，采用了另一种Id疫苗接种策略。在这项随机的2期试验中，采用了初免和增强策略，通过收集已经用患者特异性Id-KLH在体内初免的T淋巴细胞，然后使用CD3/CD28磁珠在体外激活这些T细胞，并在HDT和自体造血干细胞移植（AHCT）后重新注入这些细胞，并随后增强剂量的指定疫苗。尽管疫苗引发了持续至+180天的强烈免疫反应，但与仅接种KLH的对照组相比，接种Id-KLH的组别在临床上没有益处。表1显示了使用Id蛋白/肽或基于DNA的Id疫苗的试验总结。 2.2.基于DC的Id疫苗 专业的APCs，DCs，在启动和调节先天和适应性免疫反应中发挥着关键作用。通过利用它们增强宿主效应器和记忆CD8 T细胞反应的能力，这些反应对于抗肿瘤免疫至关重要，DC疫苗已成为癌症免疫疗法的主要策略之一。DC疫苗首次在MM的Id抗原背景下进行了测试。历史上，基于Id的DC疫苗在MM试验中已经测试了十多年，但没有明确的临床益处。已经提出了几种优化方法，用于生成、给药途径和疫苗接种的时间。原始方法涉及从通过白细胞分离术收集的外周血液中分离DCs，随后进行密度梯度离心。随后，添加细胞因子，即GM-CSF和IL-4，成为培养要么粘附的单核外周血细胞，CD34+或CD14+细胞的标准实践。在Id脉冲后提出了各种成熟方案以增强有效性，包括单独暴露于肿瘤坏死因子α（TNF-α），TNF-α和IL1-B，CD40配体或TNF-α、IL-6、IL-1和前列腺素E2的组合。研究了不同的疫苗接种途径，包括皮下、皮内、静脉内和淋巴结内。在I/II期试验中，Curti等人比较了通过顺序皮下和静脉内途径的Id脉冲DCs。每位患者都作为自己的对照，接受顺序皮下和静脉内给药。结果表明，皮下给药诱导了更强的T细胞反应，表明其在引发免疫反应方面比静脉输注重建。此外，疫苗在不同的患者群体中进行了测试，包括晚期骨髓瘤患者，化疗后的患者，未经预处理的个体，在ASCT后肿瘤负担较低的患者和冒烟型骨髓瘤（SMM）。如上所述，尽管付出了巨大努力，基于Id的DC疫苗并未产生令人满意的临床结果。Wen等人在1998年进行的一项研究是对DC基础Id疫苗针对MM的首批试验之一，涉及一名43岁的晚期难治性骨髓瘤患者。通过一系列密度梯度离心从单核细胞中分离出DCs。尽管临床反应有限，但这项研究通过产生Id特异性免疫反应，证实了体外生成的骨髓瘤DCs的功能能力。后来，通过对DC生成的一些优化，通过培养粘附的单核细胞与GM-CSF和IL-4等细胞因子。在1999年，两名晚期难治性MM患者接受了用Id抗原和KLH装载的自体DC疫苗，并以GM-CSF作为佐剂。结果表明，两名患者都发展了Id特异性T细胞增殖反应，其特征是产生干扰素γ（IFN-g）。然而，在这两名病例中没有临床益处。尽管如此，考虑到这些患者患有晚期疾病，预计疫苗可能不会对这一特定群体产生最佳效果。因此，对免疫系统受损较小或肿瘤负担较低的患者群体进行了额外的试验，预期这可能会增强疫苗的效果。六名早期/早期复发的骨髓瘤患者接种了自体DCs（静脉内）准备如前述研究并装载Id抗原和KLH。然而，只有3名患者的Id血清水平稳定期，2名患者在疫苗接种后疾病进展。在另一项研究中，在26名预期肿瘤负担较低的患者中，在HDT和外周血祖细胞移植（PBPCT）后测试了基于DC的Id疫苗。值得注意的是，只有四名患者发展了Id特异性增殖性T细胞反应。这些免疫反应者中有三名在疫苗接种时处于CR状态。在移植后平均随访30个月，共有17名患者存活。这些发现表明，较低的肿瘤负担可能导致更好的免疫反应。然而，由于缺乏对照组进行比较，将这些结果完全归因于疫苗是具有挑战性的。还在未经治疗的I期患者中进行了基于DC的Id疫苗接种的调查。在这项试验中，九名患者接受了用Id和KLH脉冲的自体单核细胞衍生的DCs。疫苗在56%的患者中导致了T细胞增殖。与其他研究一样，临床反应适中，三名患者的M蛋白略有减少。 为了增强基于DC的Id疫苗的效力，对DC生成进行了优化。在早期的基于DC的疫苗接种研究中，未成熟的DCs被脉冲抗原。然而，未成熟的DCs激活T细胞的能力次优。因此，引入了在成熟诱导细胞因子存在下暴露于抗原的DCs。这首先在5名在HDT后稳定部分缓解的患者中进行了测试。此外，有人建议将给药途径从静脉内改为皮下，以克服与静脉内疫苗接种相关的潜在限制，例如DCs可能在肺、肝和脾等器官中的积累。即使对DC生成进行了修改，并将给药途径转移到皮下，临床效益仍然不明显。此外，将临床反应仅归因于DC疫苗仍然具有挑战性，特别是考虑到化疗/自体HCT后四个月开始的时机。 尽管探索了DC生成、给药途径、疫苗接种时机以及添加免疫原性载体蛋白/佐剂的优化，但未观察到显著结果。Bendandi等人假设缺乏临床意义可能是由于从MM患者获得的DC在数量和质量上的缺陷。因此，他们进行了一项试点研究，其中4名MM患者接受了异体树突细胞（alloDC）随后是Id-KLH。疫苗仅诱导了可检测的抗KLH效应T细胞和B细胞反应，而没有诱导针对肿瘤特异性Id的T细胞增殖。从临床角度来看，结果并不令人印象深刻，一名患者在停止疫苗接种后出现SD，而其中3名患者在研究随访期间进展。表2显示了在MM中使用基于DC的Id疫苗的试验总结。 3.肿瘤相关抗原 3.1.基于肽的TAA疫苗 尽管Id疫苗能诱导可检测的免疫反应，但未能显示出临床效力。这可能归因于高水平循环Id蛋白对T细胞的抑制作用，导致耐受性，以及Id蛋白本身是一个弱抗原的事实。作为Id疫苗的替代品，开发了具有TAA的疫苗。在临床、临床前和体外环境中研究了多种TAA在MM中的作用，如Mucin-1（MUC1）、透明质酸介导的运动受体（RHAMM）、B细胞淋巴瘤2（BCL-2）家族、Wilms肿瘤1（WT1）、X盒结合蛋白1（XBP1）、syndecan-1（CD138）、CS1（SLAM7）、癌症睾丸抗原（CTA）、Dickkopf-1（DKK1）、甲基丙二酸半醛脱氢酶（MMSA-1）、热休克蛋白（HSP）、端粒酶逆转录酶（hTERT）和Survivin。表3显示了在MM中使用TAA作为抗原的试验总结。 糖蛋白MUC1存在于包括MM在内的各种癌症中。ImMucin，一种21肽合成长肽疫苗，在15名骨髓瘤患者的I/II期研究中进行了测试。ImMucin诱导了显著的T细胞反应，并增加了针对MUC1的抗体滴度。然而，临床效力次优，中位PFS为17.5 ± 3.9个月。 RHAMM衍生的肽R3在I/II期研究中作为另一种潜在的血液学恶性肿瘤的免疫原性抗原进行了调查，包括MM。在10名HLA-A2阳性患者中进行的300 mg疫苗的初步研究，包括4名MM患者，显示出积极的临床和免疫学反应。在接受300 mg疫苗的MM患者中，3/4显示出特异性CD8+ T细胞增加，2/4显示出克隆标记减少。然而，有限的样本量需要谨慎得出明确结论。 BCL-2家族蛋白在1期试验中作为MM的另一个靶标抗原进行了研究。复发的MM患者接受了与montanide ISA-51作为佐剂混合的Bcl-2、Bcl-XL和Mcl-1肽的疫苗接种，以及bortezomib。由于肽HLA限制，患者根据他们的HLA-A阳性性接受肽，即HLA-A1、HLA-A2和/或HLA-A3。在7名患者中，3名显示出与基线（疫苗接种前）相比的疫苗诱导的肽抗原特异性T细胞反应。然而，小样本量阻碍了对临床效力的结论性评估。与儿童肾肿瘤Wilms肿瘤相关的WT1基因，作为癌基因和某些正常细胞过程的关键组成部分，发挥着双重作用。它在造血恶性肿瘤和实体癌中高度表达，包括骨髓瘤，其表达随着疾病进展而增加。研究已经鉴定了WT1中的各种表位，可以以人类HLA限制的方式引发WT1特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）反应。因此，基于WT1肽的免疫疗法可能是恶性疾病患者的一个选项。在Tsuboi等人的案例研究中，一名57岁的耐化疗MM患者每周接受HLA-A*2402限制的9肽WT1肽和montanide ISA51作为佐剂的皮内疫苗接种。疫苗接种后，骨髓癌细胞减少了60%，尿液M蛋白水平从3.6降至0.6 g/天。此外，C-X-C趋化因子受体类型（CXCR）4阳性细胞有显著变化，表明WT1特异性CTLs有效地迁移到肿瘤部位。 为了应对单一抗原肽疫苗的局限性，包括潜在的抗原逃逸和目标抗原的下调，还研究了多肽疫苗。PVX-410是一种基于肽的疫苗，由来自XBP1、CD138和CS1三个不同抗原的4个9肽组成。在一项研究中，22名中度至高风险HLA-A2阳性的SMM患者接受了PVX-410皮下注射和佐剂poly-ICLC，有或没有lenalidomide。PVX-410一致地产生了特定、持久的免疫反应，特别是与lenalidomide一起使用时。然而，总体临床反应仍然适中。单独使用时，所有患者的最佳反应为SD，其中5/12在12个月内进展。在联合治疗组中，一名患者实现了PR，四名患者有最小反应或SD。 DKK1、MMSA-1和HSP作为TAA被研究，它们有潜力作为针对MM的疫苗疗法。DKK1，一个Wingless相关整合位点（Wnt）/β-连环蛋白信号抑制剂，能诱导肽特异性CTLs，这些CTLs能识别并溶解表达HLA-A0201的骨髓瘤细胞。MMSA-1是一种在MM细胞中特异表达的膜蛋白。当与DKK1结合在疫苗中时，它以HLA-A0201限制性方式增强CTL反应，改善存活，并在临床前模型中减轻骨破坏。肿瘤细胞衍生的HSPs，如gp96，已被作为小鼠骨髓瘤的TAA进行研究。来自已建立的小鼠骨髓瘤细胞系的混合HSPs，显示出作为现成疫苗的潜力，有效治疗具有大骨髓瘤肿瘤负担的小鼠，HSP与抗B7H1或抗-IL-10单克隆抗体结合使用。然而，需要进一步的研究来确认它们在临床环境中的效力。 此外，最初在黑色素瘤患者中发现的CTA抗原，由于在正常组织上的有限表达，成为免疫疗法的靶点。Andrade等人的研究表明，骨髓瘤细胞上表达超过六个CTA抗原具有预后价值，与MM患者的较短总生存期（OS）相关。像NY-ESO-1、LAGE-1、MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3和MAGE-C1（CT-7）这样的突出CTA抗原已显示出刺激T细胞反应的潜力，使它们成为癌症免疫疗法的候选者。在CTA抗原中，MAGE-A3已在临床环境中进行了测试。在一个案例研究中，一个健康的捐赠者，即患者的同卵双胞胎，用MAGE-A3蛋白和AS02B作为佐剂进行免疫。在同种异体外周血干细胞移植后，将 primed捐赠细胞转移到患者体内。随后，患者接受了额外的MAGE-A3免疫接种，以及第二次外周骨髓单个核细胞输血。MAGE-A3免疫接种耐受性良好，并在两个双胞胎中产生了强大的MAGE-A3特异性抗体、CTLs和T辅助细胞反应。有趣的是，CTL反应针对一个以前未知的HLA-A*6801结合MAGE-A3肽，该肽在最后一次免疫接种后在患者体内保持可检测超过一年。检测到多个T辅助细胞反应，主要反应针对HLA-DR11限制的MAGE-A3表位。令人鼓舞的是，患者在第二次移植后2.5年仍处于缓解状态。这个案例研究表明，这种个性化的免疫治疗方法对MAGE-A3阳性MM患者具有潜在的疗效。在另一项II期研究中，评估了使用MAGE-A3多肽疫苗结合Poly-ICLC和GM-CSF在体内初次免疫，然后体外扩增的自体T细胞的安全性和效力，在27名骨髓瘤患者中。疫苗包括两个HLA-A2限制的类I表位和一个多类II表位。结果显示，在8名可评估的HLA-A2+患者中有7名检测到MAGE-A3特异性CD8 T细胞。此外，在25名患者中有19名产生了能产生细胞因子的疫苗特异性T细胞。2年OS为74%，2年无事件生存期（EFS）为56%。Cohen等人进行了类似的研究，其中13名MM受试者在接受ASCT前后以及早期SCT后疫苗初次自体淋巴细胞输注，接受了重组MAGE-A3和AS15免疫刺激剂。组合免疫疗法在所有受试者中产生了高滴度的体液免疫和持久且强大的抗原特异性CD4+ T细胞反应。然而，中位PFS为27个月，中位OS未达到，表明与标准护理没有差异。 在临床前环境中测试的其他CTA已被建议作为MM的可能免疫疗法靶点。自发的NY-ESO-1抗体和特异性CD8+ T细胞已在NY-ESO-1阳性MM病例中体内检测到。在临床前模型中，研究了一种名为NACH的复杂疫苗，该疫苗基于NY-ESO-1-alum-CpG ODN-HH2。NACH疫苗中使用的Alum-CpG ODN-HH2组合佐剂是一种新型免疫佐剂。疫苗在小鼠MM的预防和治疗模型中显示出有希望的抗肿瘤效果和免疫原性。NACH疫苗抑制了肿瘤生长，在小鼠中显著延长了存活时间。在治疗模型中，接受NACH疫苗的10只肿瘤小鼠中有7只存活至第90天，而对照组的所有小鼠在40天内死亡。LAG-1a是另一个在MM患者中经常表达的CTA抗原，与NY-ESO-1共享高mRNA序列相似性。In silico分析确定了在LAG-1a和NY-ESO-1中存在的七个肽段，这些肽段被不同肿瘤的T淋巴细胞识别。因此，假设针对NY-ESO-1的疫苗可能对表达LAG-1a但不表达NY-ESO-1的肿瘤的MM患者有益。MAGE-C1、SPAN-Xb和SP-17是其他能够引发CTL反应的CTA抗原，使它们成为基于疫苗的免疫疗法MM的靶点。 与Id疫苗类似，基于肽的肿瘤-TAA疫苗的实际应用到临床实践中尚未发生。Rapoport A.P等人的研究比较了54名MM患者中称为hTERT的端粒酶复合体的限速催化亚单位和抗凋亡蛋白Survivin作为目标抗原疫苗与肺炎球菌结合疫苗的免疫原性。HLA-A2阳性的患者（包括任何A2等位基因）被分配到A组，他们接受了hTERT/Survivin疫苗。研究表明，尽管这种多肽肿瘤抗原疫苗的免疫反应频率高于报道的Id疫苗，但TAA仍未达到微生物疫苗所诱导的水平。这表明，为了获得显著的长期临床益处，可能需要对癌症疫苗产生更大规模的免疫反应。 3.2.基于DC的TAA疫苗 使用与肿瘤相关抗原(TAA)相关的基于树突状细胞(DC)的疫苗也被视为替代Id抗原的选择。对12名至少接受了诱导化疗和造血细胞移植/自体造血干细胞移植(HCT/ASCT)后获得最小部分缓解(PR)的II期或III期骨髓瘤患者进行了疫苗接种。通过电穿孔法用MAGE3、Survivin和BCMA装载粘附的CD14+细胞生成DCs，并与或不与KLH一起脉冲。值得注意的是，所有患者都产生了强烈的抗KLH T细胞反应，这表明在高剂量美法仑治疗后免疫恢复，并且在两名患者的迟发型超敏反应活检中检测到了疫苗特异性T细胞。在最后一次随访时，12名患者中有10名在第一次接种后平均25个月（范围9-53个月）仍然存活。在这些患者中，5名病情稳定(SD)，5名病情进展。在另一项研究中，进行了DC的mRNA电穿孔，使用装载有CT7、MAGE-A3和WT1的朗格汉斯DC。这些从CD34+造血前体细胞衍生的朗格汉斯型DC被认为是体外对肿瘤抗原的CTLs更具潜力的刺激因子，与单核细胞衍生的DC相比。患者被随机分配在ASCT后100天内接受疫苗或被放置在没有疫苗的对照组。虽然该研究没有足够的能力来评估临床疗效，但治疗反应倾向于接受疫苗的组。在最近发表的一项研究中，Locke及其同事设计了一种针对抗凋亡蛋白Survivin的基于DC的疫苗，在1期临床试验中。通过腺病毒载体工程化DCs以表达包含两个突变的全长Survivin版本(Ad-S)，这些突变中和了野生型Survivin的抗凋亡功能。13名新诊断的MM患者，他们没有通过诱导治疗获得CR，接种疫苗的时间是在干细胞收集前7到30天，以及在ASCT后20到34天。疫苗与ASCT联合使用耐受性良好，仅观察到轻微的不良反应。值得注意的是，85%的患者表现出针对Survivin的T细胞反应或抗体反应。7名患者在第+90天表现出增强的临床反应，所有这些都与Survivin特异性免疫反应相关。令人印象深刻的是，在平均4.2年的随访后，这7名患者中有6名保持无病状态。估计的四年无病生存(PFS)为71%，超过了IFM 2009试验的历史数据，该数据大约为4.1年时PFS为50%，针对这类患者群体。Survivin已成为MM中一个显著的TAA。在8项正在进行的MM试验中，有两项专注于开发针对Survivin的疫苗。其中一种疫苗名为TXSVN，它使用了一种减毒的活沙门氏菌株，经过遗传改良以产生Survivin。第二种疫苗是一种基于肽的配方，称为SVN53-67/M57-KLH，源自Survivin蛋白(表4)。 4.肿瘤特异性抗原 4.1.基于肽的TSA疫苗 尽管某些关于TAA的研究显示出希望，但由于每个临床试验中患者数量有限，总体评估具有挑战性。需要对更大的队列进行进一步研究，以得出关于基于TAA的免疫疗法疗效的确定性结论。此外，由于它们作为非突变的自身抗原的地位，一般来说TAA可能表现出低免疫原性，这归因于中枢T细胞耐受的影响。因此，TSA，也称为新抗原，似乎是疫苗免疫疗法的另一种靶标抗原。癌细胞中的体细胞突变可以产生新的蛋白质序列，这些序列可以被APCs作为新抗原呈现给宿主免疫系统。肿瘤新抗原是免疫疗法的极好靶标，因为它们在癌症组织中特异性表达。通过下一代测序，在184名MM患者中识别出的新抗原景观，揭示了在复发患者中的NRAS、KRAS和干扰素调节因子4(IRF4)基因中共享的新抗原，以及在新诊断患者中的KRAS，支持在具有此类突变的MM患者中使用基于新抗原的疫苗的可能性。在MAPK途径中的扰动，特别是KRAS、NRAS和BRAF中的突变，在相当一部分MM病例中观察到，RAS突变在多达70%的复发/难治性病例中被检测到。这些与MAPK激活相关的突变，可能会影响预后，有助于从前期状况向骨髓瘤的转变，以及从髓内到髓外疾病的转变，随着疾病的进展，其患病率越来越高。针对共享的新抗原，如与RAS突变相关的新抗原，正在临床试验中探索，例如我们小组正在进行的研究，使用TG01癌症疫苗在高风险SMM或MM患者中(表4)，在≥1线治疗后有可测量疾病。TG01由7种合成肽组成，模仿RAS蛋白的突变形式，在胰腺癌患者中显示出有希望的结果。TG01研究的主要终点是安全性，关键的次要终点包括对疫苗的免疫反应、总体反应率、OS和PFS。 另一种基于新抗原的疫苗是PGV-001。PGV-001是一种个性化的基因疫苗，针对基于患者HLA分型的多达10个预测的个人肿瘤新抗原。在辅助治疗环境中测试了PGV-001，包括3名接受了ASCT的MM患者在内的13名多种癌症类型的患者。疫苗肽在27周的过程中与聚肌胞（poly-ICLC）和破伤风辅助肽一起给药。一名患者失去了随访，但在剩下的12名患者中，平均随访了925天，其中四名没有疾病证据，四名接受了后续的治疗线，四名已经去世。值得注意的是，只有两名去世的患者有记录的恶性肿瘤复发。这篇摘要中没有描述患者的详细信息以及他们中哪些是MM患者。免疫监测免疫原性正在进行中。然而，初步分析表明诱导了针对新抗原的CD4和CD8 T细胞扩增。 如前所述，TSA由于缺乏胸腺选择和中枢耐受，可以激活高亲和力T细胞。尽管对Id有显著的关注，但由于其在骨髓瘤中的丰富性，显示出有限的临床疗效，对骨髓瘤中除了Id之外的其他新抗原的研究仍然有限。进一步的研究对于评估它们作为骨髓瘤疫苗治疗中的靶标抗原的潜力至关重要。 5.整个肿瘤抗原 5.1.基于DC的疫苗 单一抗原特异性疫苗容易受到因抗原表达下调而导致的免疫逃逸的影响。或者，也探索了整个细胞靶标作为一种策略，该策略寻求建立多克隆免疫反应。这样的疫苗可能包括广泛的抗原，包括新抗原。这在骨髓瘤中特别相关，因为存在大量的肿瘤突变负担。对664名新诊断的骨髓瘤患者的研究发现，每个患者的平均体细胞和错义突变负荷分别为405.84和63.90个突变。突变和新抗原负担之间存在正相关。此外，高剂量美法仑治疗，这是ASCT前的标准治疗，与高突变负担相关，并且可能在骨髓瘤患者的复发时有更多的新抗原。 Rosenblatt等人通过化学融合患者衍生的骨髓瘤细胞与自体DCs开发了一种肿瘤疫苗。这种疫苗的优势在于可能在DC介导的共刺激的背景下呈现多样化的骨髓瘤相关抗原。融合细胞是通过将DCs和骨髓瘤细胞与聚乙二醇共培养而创建的。在17名患者中测试了DC融合疫苗，其中大多数患有晚期疾病。疫苗接种耐受性良好，并在大多数评估的患者中导致与患者自己的骨髓瘤细胞反应的淋巴细胞扩增，以及记录的体液反应。晚期疾病的患者经历了疾病稳定，三名患者在12、25和41个月时分别显示持续的SD。在当前研究中，调节性T细胞水平在疫苗接种期间保持稳定。同一疫苗在ASCT后的患者中进一步测试，假设自体移植为融合疫苗提供了一个最佳环境，因为肿瘤细胞减少和调节性T细胞耗竭导致的免疫环境增强。该研究取得了有希望的结果，47%的患者实现了CR/近CR（nCR）作为最佳反应，78%的患者至少实现了VGPR。值得注意的是，近35%的CR发生在移植后超过100天，在接种疫苗后。尽管可能会观察到化疗的延迟效应，但在没有维持治疗的情况下，大量的晚期反应可能暗示了疫苗介导的效应。基于这些结果，该团队被鼓励检查融合疫苗与来那度胺作为自体HCT后维持治疗的联合疗效。然而，与来那度胺一起的DC/MM融合疫苗接种并没有在移植后1年显著增加CR率，但与循环MM反应性淋巴细胞的显著增加相关，这表明了肿瘤特异性免疫。该团队进行了另一项临床试验，涉及接受自体移植的MM患者，他们在接受DC/骨髓瘤融合细胞疫苗后接受了抗程序性细胞死亡蛋白1（PD-1）抗体（Pidilizumab）的联合治疗，目的是克服肿瘤细胞逃避宿主免疫的免疫抑制环境。这项试验涉及22名患者，并表明这种组合可以诱导抗肿瘤免疫反应，并且在一部分患者中，在移植后完全根除可测量的疾病。移植后，调节性T细胞水平显著下降，并在整个免疫治疗期间保持低水平。六名患者达到了VGPR的最佳反应，六名患者达到了nCR/CR。从移植起的中位PFS为19个月，随访正在进行中（表4）。其他整个细胞裂解物，如GVAX和DCOne疫苗，作为现货疫苗进行了测试，具有多样化的抗原库。MM-GVAX是一种疫苗，其中两个已建立的异质性骨髓瘤细胞系，H929和U266，与K562细胞系（GVAX®）一起给药，该细胞系被改造为过表达GM-CSF。H929表现出t(4;14)，并且NRAS突变，U266涉及BRAF和TP53途径的几个突变。注册的患者血清/尿液免疫固定阳性，并维持了至少4个月的nCR。在2021年的出版物中，15名患者中有8名（53.3%）加深了治疗反应并实现了真正的CR。中位OS为7.8年。MM-GVAX触发了克隆T细胞扩增和细胞因子反应，在所有患者中持续了长达7年。这项试验正在进行中（表4）。 DCOne是另一种现成的肿瘤疫苗，它源自人类急性髓系白血病（AML）细胞系，可以分化为完全功能的DCs的表型，并内源性地表达肿瘤相关抗原（TAA）。这些抗原与HLA分子以及对T细胞激活至关重要的各种共刺激分子一起呈现。尽管最初作为AML的癌症疫苗进行工程化，DCOne表达的肿瘤抗原也存在于包括MM在内的多种血液系统恶性肿瘤中。使用DCOne疫苗治疗MM导致激活的CD8+ T细胞扩增，这些细胞表达干扰素-γ和穿孔素。此外，将患者的肿瘤细胞与外周血单个核细胞和DCOne共培养，诱导了针对自体MM细胞的细胞毒性T淋巴细胞介导的杀伤，突出了DCOne在骨髓瘤治疗中的潜力。表5显示了使用整个肿瘤抗原治疗MM的试验总结。 6.结论和未来展望 尽管进行了广泛的研究，肿瘤疫苗尚未纳入骨髓瘤治疗。多年来，主要的研究重点是Id疫苗，这些疫苗偶尔产生免疫反应，但临床效果有限。随后的调查在临床试验中探索了不同的抗原靶标。然而，在早期试验中对各种抗原进行广泛测试，并限制了患者群体，这在建立明确结论方面带来了挑战。此外，即使在同一类型的抗原研究之间进行直接比较，也会因患者特征（如年龄、细胞遗传学/风险因素）的差异以及疫苗接种时的疾病阶段而受到阻碍。此外，许多疫苗研究是在化疗构成标准治疗的时期进行的，更多关注使用疫苗单独来根除肿瘤。然而，将疫苗接种与新建立的治疗方法（如IMiDs、蛋白酶体抑制剂和新一代免疫疗法，如嵌合抗原受体T（CAR-T）细胞和双特异性抗体）结合起来，尚未得到解决。 总的来说，疫苗的复杂性以及骨髓瘤作为疾病的复杂性，为将疫苗整合到骨髓瘤治疗策略中带来了挑战。疫苗治疗是复杂的，需要彻底的实验。这包括选择肿瘤抗原、制定疫苗、确定传递工具，决定给药途径和频率、确定疫苗接种的时间，以及考虑骨髓瘤肿瘤微环境的复杂性（图1）。优化所有这些因素可能是提高临床效果的必要条件。 图1：疫苗设计考虑因素。MM（多发性骨髓瘤）骨髓微环境由包括MDSCs（髓系来源的抑制细胞）、TAM（肿瘤相关巨噬细胞）和Tregs（调节性T细胞）在内的免疫抑制元素组成。MDSCs通过IL-10刺激TAM和Tregs。MDSCs还通过IL-10抑制CTLs（细胞毒性T淋巴细胞）。Tregs通过直接的细胞间相互作用以及通过分泌抑制性细胞因子，如TGF-b和IL-10，来抑制CTL和DC（树突状细胞）的功能。此外，MM细胞分泌包括IL-6、TGF-b和IL-10在内的多种细胞因子，这些因子抑制DCs、CTLs并刺激Tregs。多发性骨髓瘤患者表达多种免疫检查点受体，包括PD-1、CTLA-4、TIM-4、LAG-3、TIGIT。末端T细胞耗竭与CD4+和CD8+ T细胞亚群失去细胞毒性相关，这些细胞亚群产生IFN-g，这是肿瘤免疫的关键细胞因子。MM，多发性骨髓瘤；MGUS，未定意义的单克隆丙种球蛋白病；SMM，隐匿性MM；BM，骨髓；DC，树突状细胞；BMSC，骨髓基质细胞；CTL，细胞毒性T淋巴细胞；MDSCs，髓系来源的抑制细胞；TAM，肿瘤相关巨噬细胞；Treg，调节性T细胞；PD-1，程序性细胞死亡蛋白1；CTLA-4，细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4；TIM-3，T细胞免疫球蛋白黏蛋白-3；LAG-3，淋巴细胞激活基因3；TIGIT，T细胞免疫球蛋白和ITIM结构域；白细胞介素（IL）-10；TGF-b1，转化生长因子-b1；TAA，肿瘤相关抗原；TSA，肿瘤特异性抗原。部分图表使用了/改编自Servier Medical Art（Servier；https://smart.servier.com/）提供的图片，该图片在Creative Commons Attribution 4.0 Unported License（https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/）下授权使用。 6.1.抗原选择 理想情况下，靶标抗原必须具有免疫原性，在肿瘤中高度表达，在正常组织中低表达或不存在，并且具有肿瘤特异性，以避免脱靶效应。包括Id、TAA和TSA在内的几种抗原已在骨髓瘤研究中进行了探索。尽管努力增强它们的免疫原性，特别是通过将疫苗接种与免疫原和佐剂结合，但临床效果并不显著。对Id以外的TSA的研究仍然有限。预测TSA作为靶标既耗时又昂贵，需要先进的方法来预测能够引发新抗原特异性T细胞反应的新抗原。此外，准确的HLA分型对于可靠地预测免疫原性抗原和提高治疗效果至关重要，这为疫苗开发增加了另一层复杂性。这是由于人类HLA等位基因的多态性，涵盖了超过24,000个独特的基因复合体。尽管使用表达多种抗原的特定于患者的疫苗（如整个肿瘤裂解物）有很强的理论基础，但可能存在随着时间推移重新建立肿瘤耐受性，促进疾病进展的潜在担忧。这可能部分解释了整个肿瘤裂解物疫苗在骨髓瘤临床环境中采用的延迟。肠道微生物群抗原具有固有的强烈免疫原性属性，但在骨髓瘤研究中仍然是一个未被探索的领域。TAA和微生物抗原之间存在高度相似的抗原表位，表明可能存在强大的交叉反应性CD8+ T细胞反应。具体来说，由特定微生物抗原诱导的T细胞记忆可能转化为抗癌症T细胞记忆，对癌症生长进行长期控制。例如，在MAGE-A10和巨细胞病毒之间观察到的分子模拟。这一发现为探索骨髓瘤相关TAA和微生物抗原之间的交叉反应性开辟了途径，为提高骨髓瘤疫苗治疗的效果提供了新的见解。 6.2.疫苗传递平台 基于肽的疫苗接种已成为引发抗肿瘤T细胞反应的有希望的方法。然而，其有效性仍然有限，即使肽与强大的佐剂共传递时也是如此。这可能归因于DC的功能失调，DC在影响抗肿瘤免疫的质量和数量中起着重要作用。因此，通过基于DC的肽方法传递肿瘤抗原正被认识到作为一种潜在的癌症免疫治疗策略。 自从DC在骨髓瘤治疗中的使用开始以来，许多研究都集中在优化DC生成上，特别是使用 idiotype 作为抗原来源。一些研究表明，来源于CD34+造血前体细胞（HPC）的朗格汉斯型DCs在刺激CTL方面比单核细胞来源的DCs更为有效。然而，它们在骨髓瘤研究中的临床应用仍然有限。此外，对来源于骨髓瘤患者的DCs的体外生成也进行了巨大关注。Shinde等人从MM和健康供体样本中生成了DCs。尽管MM-DCs和健康供体衍生的DCs都显示出成熟的表型，但MM-DCs表现出较低的迁移能力和细胞因子分泌，使它们在诱导抗MM反应方面效果较差。此外，正在探索通过各种方法增强向DCs传递抗原的努力。这些包括用抗原肽库脉冲DCs，并采用基因编辑技术，如电穿孔、脂质纳米颗粒或病毒载体来改善抗原呈递。COVID-19大流行导致mRNA疫苗的显著进展，为它们在抗肿瘤治疗中的应用提供了机会。这些疫苗提供了强大的细胞和体液免疫，超越了传统的病原体或基于蛋白的疫苗。此外，mRNA疫苗提供了诸如快速开发、安全性、较少的副作用和灵活性等优势，从而促进了个性化疫苗策略的实施，特别是在TSA的背景下。mRNA疫苗用于抗原传递代表了一种新颖的方法，值得研究其在骨髓瘤治疗中的潜力。 6.3.给药途径和接种的最佳时间 给药途径和接种的最佳持续时间仍然是正在进行的辩论主题，临床试验中的比较不足。在骨髓瘤中被忽视的另一个因素是肿瘤疫苗接种的时机。在大量已发表的临床研究中，疫苗在系统性抗癌治疗后不久被给予。这个时机带来了挑战，因为自然免疫可能在疫苗接种时被化疗抑制。一个在许多试验中探索的建议方法是在ASCT后接种疫苗的潜在益处，特别是在达到深度反应状态时。在这个阶段的细胞免疫部分的植入提供了形成抗肿瘤免疫的机会。然而，这种方法的挑战包括延迟的免疫重建，T细胞数量至少需要3个月才能恢复正常，导致对疫苗治疗的反应次优。为了解决这个问题，一些研究已经研究了ASCT前疫苗接种，然后在淋巴耗尽环境中早期进行疫苗启动的T细胞转移。然后进行移植后增强疫苗接种以扩大疫苗特异性T细胞。尽管做出了这些努力，但这种策略并没有产生有利的临床结果。然而，这些研究是有限的，需要更多的调查才能得出任何结论性结果。另一种潜在的方法是针对疾病早期阶段的患者，特别是那些具有未定意义的单克隆丙种球蛋白病（MGUS）或SMM的患者。然而，实施这一策略将需要治疗大量患者并进行长期随访以建立临床效益。到目前为止，缺乏支持这一假设的结论性研究。目前有三项正在进行的试验正在研究SMM患者的疫苗，包括我们的针对RAS突变的TG-01研究、PVX-410（来自XBP1、CD138和CS1的多肽癌症疫苗）和由个人的血液和骨髓制成的个性化癌症疫苗（表4）。 6.4.疫苗外源性因素 疫苗外源性因素，包括肿瘤微环境和骨髓瘤中宿主免疫反应的功能障碍，强调了引发有效免疫反应的复杂性。骨髓瘤肿瘤微环境由免疫抑制细胞群组成，包括髓系来源的抑制细胞、调节性T细胞和肿瘤相关巨噬细胞。此外，不充分的抗原呈递、对自然杀伤（NK）细胞溶解的抵抗力、T细胞耗竭和/或衰老，与ASCT后较差的结果相关，并特征化为多次复发疾病。骨髓瘤衍生的细胞因子，如转化生长因子（TGF）-b、IL-6和IL-10，有助于免疫功能障碍。此外，由于与年龄相关的免疫系统变化导致的T细胞无反应性，疫苗的有效性随着年龄的增长而降低。这对于平均诊断年龄为70岁的骨髓瘤来说尤其重要。另一个在骨髓瘤患者中很少研究的外源性因素是肠道微生物群对肿瘤疫苗效力的潜在影响。Radojevic等人通过分析14名健康供体的粪便微生物群组成以及单核细胞衍生的DCs的表型和产生的细胞因子，报告了肠道微生物群组成与DCs的免疫原性之间的相关性。Calcinotto等人的另一项研究表明，Prevotella heparinolytica促进了定居在肠道并迁移到转基因Vk*MYC小鼠骨髓的Th17细胞的分化，在那里它们有利于MM的进展。这个主题是复杂的，因为许多因素可能影响肠道微生物群，包括通常给予骨髓瘤患者的抗生素治疗。 6.5.疫苗与新一代疗法的结合 需要注意的是，大多数肿瘤疫苗单独使用并不能直接消除肿瘤病灶，但肿瘤疫苗在消除微小残留病（MRD）方面具有潜在的前景。因此，需要进一步的试验来定义疫苗在新的药理疗法时代的角色，如免疫检查点抑制剂（ICI）、抗体药物偶联物、双特异性抗体和CAR-T细胞。这些治疗的持久反应不频繁，但与疫苗结合的策略可以增强反应或消除MRD。例如，疫苗与ICI的结合似乎是一种合理的途径，但在缺乏明确改善疗效信号的情况下，安全性问题已成为ICI在MM临床应用的主要障碍。在双特异性抗体构建之前进行疫苗接种，可以通过创建抗原经验丰富的T细胞池来增强治疗效力。疫苗还可以促进嵌合抗原受体T细胞的扩增和效力。此外，值得注意的是，尽管双特异性抗体和CAR-T目前在MM免疫疗法领域占据主导地位，但癌症疫苗提供了独特的优势。与主要针对细胞表面肿瘤特异性抗原的CAR-T细胞或双特异性抗体不同，癌症疫苗有潜力针对细胞内抗原。这种能力提供了解决更广泛肿瘤抗原的机会。 6.6.结论 总之，尽管迄今为止针对MM的疫苗接种尚未取得令人印象深刻的临床结果，但有必要进一步研究，重点关注选择合适的抗原、患者群体、优化疫苗的时机和序列，以及确定合理的组合。这些元素与其他针对肿瘤微环境免疫抑制活性的免疫干预措施相结合，可能会带来更大的益处，并实现改善和持久的临床反应。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

摘要：溶瘤病毒（OVs）正成为癌症治疗的潜在选择。自然和基因工程病毒表现出多种抗肿瘤机制。OVs通过直接细胞溶解、通过抗原释放增强免疫系统以及激活炎症反应来发挥作用，或者间接通过干扰肿瘤微环境中的不同类型元素、改变肿瘤细胞的能量代谢和抗血管生成作用。OVs的作用是多方面的，它们与宿主和肿瘤细胞有多种相互作用。在溶瘤病毒治疗中的一个重要障碍是病毒进入肿瘤细胞的途径以及它可能与不同的生物和非生物载体结合的可能性。在许多临床试验中，OVs已被证明能够消除对标准治疗有抵抗力的癌细胞（黑色素瘤、肺癌和肝癌）；然而，病毒本身的作用存在几种抗性元素。因此，有必要评估OVs与其他标准治疗方式（如化疗、免疫治疗、靶向治疗和细胞治疗）的结合，以提高反应率。本综述提供了OVs、它们在溶瘤病毒治疗中的使用以及这种疗法与目前用于癌症治疗的标准疗法的未来前景的全面更新。 1.引言 病毒通常被认为是导致人体致命感染的恶魔，但近几十年来，人们开始意识到可以将它们转变为保护天使，用作对抗恶性细胞的武器。使用病毒治疗癌症的想法源于一些病例报告中记录的肿瘤消退与病毒感染之间的关联。 近年来，溶瘤病毒（OVs）因其能够选择性地攻击和破坏肿瘤细胞，并可能刺激抗肿瘤免疫而受到特别关注。工程化肿瘤选择性靶向OVs具有可控的安全概况和对不同癌症的有效性，具有许多优势。被选为破坏肿瘤细胞的候选病毒必须具备某些特征：它必须是促炎性的，不应引起慢性传染病，对各种人群安全，应在肿瘤细胞中发挥溶解活性，并应具有整合到宿主基因组中的能力。促炎性的溶瘤病毒具有以下特征：存在可被免疫系统识别的抗原性，感染性，复制以触发强烈的免疫反应，以及有助于免疫识别和炎症反应的基因变异。 基因工程在开发具有可控安全概况和对广泛癌症高效性的OVs中发挥着重要作用。在这方面，OVs必须通过修改非编码突变并添加或删除某些功能、基因和非编码元素，专门为相应的肿瘤类型和肿瘤突变量身定制，以赋予它们额外的有益特性。癌症治疗使用OVs的三个研究方向是：病毒复制、肿瘤生长和免疫激活。因此，OVs的主要靶标是肿瘤细胞、宿主免疫和肿瘤微环境。大多数病毒载体通过释放肿瘤相关抗原引发免疫原性细胞死亡（ICD），随后引发抗肿瘤免疫反应。通过激活抗肿瘤免疫，OVs超越了ICIs和其他精确靶向药物的表现。OVs表现出广泛的抗肿瘤免疫增强特性。必须识别具有适当分子特征的患者，以从OV治疗中受益。因此，发现OV治疗的预测性生物标志物很重要。 2.溶瘤病毒治疗的有吸引力的病毒  病毒治疗是一种基于将OV感染的细胞引入被诊断出恶性肿瘤的宿主的治疗方法，可能是一种创新的未来癌症治疗方法。最近的研究揭示了使用OVs通过诱导系统性抗肿瘤免疫来特异性破坏肿瘤细胞。然而，这个过程并不像看起来那么简单，因为并非所有细胞类型和病毒都可用作此目的。了解不同类型病毒对选定肿瘤的肿瘤趋向性，以及它们可以包含的联合疗法，决定了选择适当和准确的病毒肿瘤治疗选项，以增加治疗的整体有效性。OVs可以是单链或双链RNA或DNA病毒，分为自然病毒株和基因修饰病毒。下面描述了合格的病毒肿瘤治疗候选病毒的主要类型，主要特征（表1）以及益处和问题（表2）： 单纯疱疹病毒（HSV），包括两个血清型（HSV-1和HSV-2），是一种带有核衣壳的包膜病毒，保护着双链DNA。HSV作为溶瘤病毒的优势如下：（i）大基因组和复杂结构，使得插入大片段和多个转基因成为可能，而不影响病毒效率；（ii）能够感染大多数类型的恶性细胞；（iii）插入多个转基因的灵活性；（iv）尽管在大部分人群中存在高频率的抗病毒抗体，但它们并不阻止病毒复制。HSV通过四种病毒糖蛋白，即gB、gD、gH和gL，与各种细胞受体结合。基于基因修饰HSV的Talimogene laherparepvec（T-VEC），编码人类粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF），是唯一获得FDA和EMA批准用于治疗IIIB/C–IVM1a黑色素瘤的七个溶瘤HSV之一。T-VEC刺激局部和系统性抗肿瘤免疫反应。T-VEC已在两项II期临床研究中进行了评估——一项是与放射疗法联合治疗局部晚期皮肤血管肉瘤（NCT02923778），另一项是软组织肉瘤。OH2是另一种基因工程2型溶瘤HSV，表达GM-CSF以促进抗肿瘤免疫反应。G207是一种基因工程单纯疱疹病毒，缺失ICP 34.5和ICP 6区域的基因，具有直接溶瘤效应，也可以刺激系统性抗肿瘤免疫反应。G207衍生的三种基因组修饰的工程病毒是G47∆，在肿瘤中高度复制，并具有更多的细胞病理效应。 腺病毒（Ad），具有双链DNA基因组和二十面体衣壳，其C末端负责识别细胞受体。腺病毒溶瘤疗法的优势如下：病毒还破坏了癌症干细胞，触发了各种细胞死亡信号，并释放了许多损伤相关分子模式分子（DAMPs），如高迁移率盒1（HMGB1）、热休克蛋白（HSPs）和核酸。腺病毒诱导局部炎症反应，产生大量病毒颗粒，并释放肿瘤抗原，具有直接和间接溶瘤效应。 大多数溶瘤腺病毒（oAds）与柯萨奇病毒和腺病毒受体（CAR）结合感染细胞。Ad是溶瘤病毒治疗的合适候选病毒，并且由于其高遗传稳定性和可用性，是该领域研究最多的病毒之一。遗传稳定性指的是病毒保持其遗传物质，特别是治疗或所需基因，而不会随着时间的推移发生显著突变或改变的能力。2005年，中国FDA批准了第一种oAd Oncorine与化疗联合用于治疗鼻咽癌。截至2021年，人类腺病毒工作组已识别出104种注册的腺病毒基因型，其中18种目前正在进行病毒肿瘤治疗测试，自2005年至2021年共进行了59项试验。为了使溶瘤治疗有效，病毒需要基因工程改造，非必需基因必须被其他增强治疗效果的基因所取代。 正在研究的三种基因工程腺病毒，也称为条件复制腺病毒（CRAd），如下所示。第一代CRAd由Onyx-015代表，它结合并灭活p53和Ixovex-1，阻止肿瘤生长，并参与不同的临床试验。第二代CRAd包含一个工程化腺病毒Delta-24-RGD（DNX-2401），针对视网膜母细胞瘤（Rb）的肿瘤抑制途径。第三代CRAd由一种与DNX-2401相似的病毒代表，E1A启动子发生变化，以提高肿瘤抑制性能。 Maraba，一种弹状病毒，最近被认为是溶瘤病毒治疗的合适候选病毒。使用这种病毒的想法源于在溶瘤病毒治疗试验中使用类似病毒——水泡性口炎病毒，这种病毒具有更强的溶瘤活性。体外实验中，Maraba病毒对正常细胞表现出非常广泛的肿瘤趋向性，良好的肿瘤选择性和低毒性。此外，在异种移植模型中进行的体内研究显示了强大的抗肿瘤活性和优越的治疗效力。 麻疹病毒（MeV）是一种RNA副黏液病毒，对包括卵巢癌和乳腺癌、多发性骨髓瘤、间皮瘤和胶质母细胞瘤在内的广泛癌症类型具有趋向性。MeV溶瘤治疗正在与其他疗法（如化疗）联合测试，用于腹膜或卵巢癌的治疗。MeV与宿主细胞的相互作用是通过三种受体介导的，即Nectin-4、CD46和SLAM/CD150。由于存在预先存在的抗麻疹抗体，系统性给药MeV可能很困难，因此开发了几种策略，如使用细胞载体运输病毒，编码抑制免疫系统的基因，用非反应性糖蛋白替换某些糖蛋白，或与免疫抑制药物联合给药。MeV具有有利的安全性概况和有限的毒性，MeV特异性T细胞反应可能增加溶瘤病毒治疗的有效性。 新城堡病病毒（NDV）是一种在鸟类中自然发现的1型禽类副黏液病毒。它已经被用于溶瘤治疗研究五十年了；因为它不通过重组进行基因交换的过程，所以它是高度安全的。 这一点从人类是非许可宿主这一事实上可以看出。NDV通过其RIG-I受体，可以减缓肿瘤活性，并且具有非常广泛的肿瘤趋向性，包括对乳腺癌、结直肠癌和头颈部癌的趋向性。 呼肠孤病毒在环境中很常见，通过根除病毒感染的肿瘤细胞，其抗癌活性可以得到增强。尽管呼肠孤病毒已被作为治疗黑色素瘤、骨髓瘤和胶质瘤的治疗选择进行研究，但也在进行其他恶性肿瘤的试验（表3），如胰腺癌、肺癌和结直肠癌（与pelareorep和atezolizumab联合进行的GOBLET研究）。 柯萨奇病毒对膀胱癌有肿瘤趋向性，特别是。一些研究人员已经研究了柯萨奇病毒B3对结直肠癌治疗的溶瘤活性，并显示出显著的肿瘤生长抑制作用，但也出现了一些严重的副作用，如心肌炎和胰腺炎。在一项II期临床试验中，对无法切除的黑色素瘤患者进行柯萨奇病毒A21（V937）瘤内注射，6个月无进展生存率为38.6%（95% CI，26.0至52.4）（表3）。 小病毒是临床上研究用于癌症病毒治疗的最小病毒。已经研究了三种重要的方法来提高这种病毒的溶瘤活性，即与其他各种抗癌剂结合，制备具有升级的溶瘤和免疫调节功能的新型小病毒，以及使用细胞复合物作为生物标志物来监测对小病毒治疗的反应（表3）。 3.溶瘤病毒治疗的抗癌机制  3.1.选择OV  理想的OV必须满足以下要求：（i）高度靶向肿瘤细胞；（ii）快速复制和扩展；（iii）低免疫原性，减弱抗病毒反应；（iv）强烈激活免疫反应。 病毒复制和扩展涉及一系列过程，病毒在宿主生物体内复制自身并增加数量。不同类型病毒的具体机制可能有所不同，但这里是一般概述： 1. 附着和进入，病毒首次使用表面蛋白附着在特定宿主细胞上，然后通过与细胞膜直接融合或通过内吞作用进入宿主细胞。2. 释放病毒基因组。一旦进入宿主细胞，病毒将其遗传物质（DNA或RNA）释放到细胞中。3. 复制和转录。病毒基因组控制宿主细胞的机制以复制和转录其遗传物质。DNA病毒通常在宿主细胞核中复制，而RNA病毒在细胞质中复制。4. 翻译和蛋白质合成：宿主细胞的核糖体被劫持以使用病毒RNA或DNA中的指令合成病毒蛋白。5. 组装。新合成的病毒组分（蛋白质和遗传物质）被组装形成完整的病毒颗粒。6. 成熟，组装好的病毒颗粒经历成熟并获得感染其他细胞的能力。7. 释放。成熟的病毒从宿主细胞中释放出来，要么通过细胞溶解（细胞破裂），要么通过从细胞膜出芽。8. 传播和扩展。释放的病毒可以感染邻近的细胞，重复复制周期，并导致宿主内病毒种群的扩展。 低免疫原性，减弱抗病毒反应，指的是免疫系统对病毒表现出减少或弱反应的情况，特别是当病毒已经被减弱或削弱用于各种目的时，如疫苗开发。减弱的抗病毒反应涉及使用弱化的病毒形式作为疫苗。病毒被修改以减少其毒力，使其更不有害，同时仍然保留刺激免疫反应的能力。这种方法旨在诱导提供针对自然更强病毒形式的保护的免疫反应。T-VEC就是一个减弱的溶瘤病毒的例子。 在确定破坏恶性细胞的OV时，首先要考虑的是病毒骨架。DNA病毒具有多重优势，因为它们具有更稳定的基因组，并且比RNA病毒更容易进行基因工程。DNA病毒的免疫原性低于RNA病毒，并且具有更多的修复机制，减少了复制过程中错误的可能性。一些DNA病毒，如逆转录病毒，具有将其遗传物质整合到宿主基因组中的能力。RNA病毒体积较小，可以穿过血脑屏障，并且比DNA病毒具有更恒定的复制能力；然而，它们的遗传不稳定性和突变率高于DNA病毒。最常用的平台是那些带有DNA病毒的平台，如HSV-1和Ad。基因工程是增强OVs某些特性的替代方法。据报道，临床试验中有三分之二的病毒已经被基因工程改造。1991年首次尝试使用HSVs对OVs进行基因工程改造。今天，第四代基因工程溶瘤病毒可用于肿瘤免疫治疗。基因工程OVs的研究重点是提高它们的效力和安全性，主要是促进选择性复制，减少免疫原性，促进肿瘤破坏，并减弱病毒致病性。迄今为止，已有20多个病毒家族经过基因工程改造；这些包括MeVs、NDVs、呼肠孤病毒、脊髓灰质炎病毒、牛痘病毒（VVs）、HSVs、Ad、痘病毒、粘液病毒和水泡性口炎病毒（VSVs）。这些转变的目的是针对病毒复制、免疫刺激的启动和肿瘤相关抗原的释放。一些临床前研究表明，工程化的OVs通过诱导所需的免疫反应发挥免疫调节作用。一个例子是通过添加GM-CSF或ICAM-1转基因来刺激宿主免疫反应。一个代表性的例子是VSV，其包膜中的糖蛋白已经被修改以减少病毒的神经毒性。已经为OVs的基因工程开发了各种策略。必须了解病毒的生物学和遗传学，以了解病毒与宿主之间的关系，并理解细胞如何防御病毒感染。基因工程使用具有不同机制的转基因来破坏肿瘤细胞。采用不同的策略替换病毒中的不同蛋白质以增加肿瘤靶向。许多病毒受体在癌细胞中高度表达，允许病毒在癌细胞中的摄取量高于正常细胞。一些受体，如层粘连蛋白、CAR、CD 46和CD155，在不同的癌细胞中表达过多，导致Ad、Sindbis病毒和Poliviruses的摄取量增加。一些病毒蛋白对肿瘤细胞有毒，并可以在病毒暴露时直接杀死细胞，而在病毒复制之前，如Ad编码的E3死亡蛋白和E4或f4蛋白。在一项研究中，VSV的糖蛋白G被一种脑膜炎病毒的变异蛋白替换，以增加VSV对恶性细胞的选择性。另一种策略是增加宿主对肿瘤的反应。T-VEC疫苗包含一个被基因改造以表达GM-CSF的Ad，增加了抗原呈递细胞（APCs）进入肿瘤免疫抑制微环境的招募，导致招募各种细胞因子，放大抗肿瘤活性。药物递送的效力与将药物递送到肿瘤床而不损害正常细胞有关，并将药物保持未降解直到它到达肿瘤。在一项研究中，用人血清白蛋白包裹的溶瘤Ad延长了病毒的存活率。在另一项研究中，人血清白蛋白涂层的腺病毒保护它免受中和抗体的侵害。 3.2.OVs的抗肿瘤机制 已经描述了OVs对肿瘤细胞作用的各种机制（图1）。 图1. 溶瘤病毒的作用机制。肿瘤细胞内病毒的复制引发免疫原性细胞死亡（ICD），随后释放肿瘤抗原激活免疫系统，重塑肿瘤微环境（TME），激活抗血管生成机制，增加肿瘤突变细胞中病毒复制，并传播病毒感染到其他肿瘤细胞。 OVs，无论是自然产生的还是由于基因工程修改，都表现出肿瘤选择性，通过靶向恶性细胞表面的受体，在癌细胞中优先复制，并引起癌细胞内途径和基因表达的细胞内异常，但不影响健康细胞。OVs可以感染健康细胞，但它们展现出抑制病毒传播的机制，这些机制在癌细胞中通常缺失。因此，在VSV感染中，正常细胞可以产生I型干扰素来阻止病毒复制，但大多数癌细胞I型干扰素信号传导有缺陷。研究表明，Semliki病毒感染在肿瘤细胞中诱导分泌WNT配体（WNT2B和WNT9B）和β-catenin（CTNNB1）的稳定，并以反馈机制减少IFNB1的表达，有利于减弱宿主的抗病毒反应。一些研究报告称，两个小鼠细胞系（NR6和B82），不表达表皮生长因子受体（EGFR），对呼肠孤病毒感染相对有抵抗力，但转染了编码EGFR基因的相同细胞系表现出显著更高的敏感性。这种感染效率的提高需要功能性EGFR，因为在表达突变EGFR的细胞中没有观察到，就像在肿瘤细胞中一样。诸如HPV、HCV和KSHV等致瘤病毒感染，已经发展出在感染期间减弱肿瘤抑制基因（如p53和RB）的机制，以促进病毒增殖，强调了这些守门人基因在控制病毒感染中的重要性。 OVs采用的主要抗肿瘤机制如下：(i) 直接肿瘤裂解；(ii) 通过激活抗肿瘤活性重塑TME；(iii) OVs的基因靶向；(iv) 破坏和重塑肿瘤部位的血管系统；(v) 肿瘤细胞的代谢重编程；以及(vi) OVs诱导的免疫原性细胞死亡（ICD）。3.2.1.直接肿瘤裂解 OVs采用的经典抗肿瘤机制是在癌细胞内复制，随后直接裂解这些细胞；这种机制被称为直接病毒诱导的溶瘤作用（图2）。因此，转基因表达并触发宿主免疫反应，从而激活抗肿瘤免疫。 图2. 溶瘤病毒（OVs）通过内吞作用或靶向一个或多个受体进入肿瘤细胞。OVs直接溶瘤作用的机制如下：(A) 大量OV复制，随后破坏溶酶体、自噬和细胞溶解；(B) OV改变通透性和线粒体代谢，随后发生细胞溶解；(C) OV决定肿瘤细胞应激反应，触发JNK途径和caspase级联反应，随后发生细胞溶解；(D) OV表面的蛋白质与TRAILR1和TRAILR2受体结合，激活TRAIL介导的凋亡（BioRender.com）。 有报道称，经过工程改造的新城堡病病毒导致肿瘤细胞线粒体膜通透性丧失，随后发生ICD。M1病毒诱导内质网应激介导的凋亡，随后肿瘤细胞溶解。携带TRAIL基因的工程病毒A4，可在病毒表面诱导TRAIL蛋白的表达，能够与肿瘤细胞上的TRAILR1或TRAILR2受体结合，并促进凋亡。这一机制通过直接肿瘤裂解在局部诱导肿瘤细胞死亡，但它也通过激活免疫系统（图2D）触发系统性反应，并激活参与肿瘤血管化的内皮细胞，减少肿瘤血管生成。3.2.2.通过激活抗肿瘤活性重塑TME OVs的抗肿瘤活性的一个复杂机制是TME重塑，激活抗肿瘤活性，局部OV诱导的炎症，以及对感染和未感染肿瘤细胞的间接介导凋亡。 肿瘤细胞的溶解释放肿瘤抗原，并在宿主中引发系统性抗肿瘤免疫反应。TME是一个由免疫细胞、血管和功能障碍的代谢途径组成的活跃的支持网络，这些途径刺激肿瘤细胞的增殖。一些环境由于肿瘤抗原水平降低和肿瘤抑制免疫细胞的浸润而被认为是免疫学上的“冷”。OVs是强大的免疫疗法剂，能够影响免疫抑制环境，创造一个有利于宿主免疫系统作用的免疫学上的“热”环境。OVs介导TME的重塑，创造一个有利于抗肿瘤免疫细胞的涌入和激活的环境，有利于肿瘤的消除（图3）。 图3. 冷TME包含基质和免疫抑制细胞。OVs引起细胞死亡。将抑制性免疫和代谢环境重塑为热TME。CAF，癌相关成纤维细胞；DC，树突细胞；IFN，干扰素；IL，白介素；MDSC，髓源性抑制细胞；NK，自然杀伤细胞；OV，溶瘤病毒；TME，肿瘤微环境；Treg，调节性T细胞（Biorender.com）。 OVs经历复制和扩增，这是肿瘤破坏的主要因素，导致新的肿瘤细胞被感染。这些复制和扩增过程是OVs特有的，并不在其他非生物癌症治疗中发现。 DC/T细胞激活 OVs通过包括先天免疫和适应性免疫以及诱导ICD在内的各种机制触发抗肿瘤免疫活性。 释放DAMPs。溶瘤病毒(OVs)导致内质网(ER)应激，随后是凋亡，病毒病原体相关分子模式(PAMPs)的释放，肿瘤相关抗原，损伤相关分子模式(DAMPs)的释放，以及先天免疫的激活。PAMPs与病毒元素一起结合到Toll样受体(TLRs)上，诱导树突状细胞(DCs)的成熟和细胞因子的释放。OVs激活的ICD可以随后释放其他DAMPs，如钙网蛋白(CRT)，ATP，热休克蛋白(HSPs)，尿酸，高迁移率族蛋白盒1(HMGB1)，以及细胞因子(IFN-α，IFN-γ，肿瘤坏死因子-α和白介素1,6,8和12)。DCs的激活。DAMPs也可以在DCs的TLR4配体(HMGB1和CRT)的支持下启动DCs的成熟。DCs在肿瘤中很少见，但代表与适应性和先天免疫系统相关的强大的专业抗原呈递细胞(APCs)。通过溶瘤效应调节肿瘤微环境中的DC群体提供了新的肿瘤抗原，并支持DCs的渗透和成熟。抗原呈递给CD4+和CD8+ T细胞后，激活效应T细胞反应，这些细胞记忆信息，在淋巴结中增殖，并迁移到肿瘤。遗传工程被用来通过删除或添加有效载荷(单克隆抗体，细胞因子和趋化因子)来修改溶瘤病毒，以增加肿瘤微环境中的免疫反应并限制不良反应。其中一个例子是添加GM-CSF，这是一种触发DCs转化为强大的APCs的细胞因子。临床前数据证明了GM-CSF武装HSVs的远隔效应。IL12也参与了DCs，T细胞和自然杀伤(NK)淋巴细胞在肿瘤微环境中的成熟，抑制调节性T细胞(Tregs)和MDSC活性，并诱导M1型巨噬细胞的极化。关于IL12的一个主要问题是其与致命炎症综合征的关联，这是由于IL12在全身的积累。为了避免这些毒性，工程化了一种表达IL12突变形式的oAd，以安全给药。 巨噬细胞的参与 TME中M2型巨噬细胞的存在是大多数癌症低总生存率的强大预后因素。在TME水平上，OVs作用于M2型巨噬细胞，这些细胞被重极化为M1表型，并表达各种促炎细胞因子和趋化因子(IFN-γ，CXCL10，各种白介素)，等等，这些因子加强了抗肿瘤免疫环境；这种效应已在一些OVs的研究中显示，包括VSVs，HSVs，呼肠孤病毒(RV)，副黏病毒(MeV和MuV)，GLV-1h68和Ad5 D24-RGD。 NK细胞的参与 NK细胞是溶瘤病毒疗法的重要介导者。此外，NK细胞参与对抗病毒感染，因此，它们可能对OVs的效力产生不利影响。OVs对NK细胞的影响包括促进NK细胞从循环中招募到肿瘤，增强NK细胞激活，并防止和逆转NK细胞的无反应性。OVs有能力裂解肿瘤细胞并触发免疫原性细胞死亡，随后释放DAMPs，被DCs检测到，促进炎症。此外，OVs感染DCs，作为对感染，肿瘤和髓样细胞的反应，产生趋化因子，招募NK细胞进入肿瘤。此外，DCs和其他髓样细胞产生各种细胞因子，增强NK细胞存活，并防止和逆转NK细胞的无反应性。当NK细胞被激活时，它们产生大量的IFN-γ并杀死肿瘤细胞。NK细胞配体在癌细胞表面的配体也由OVs调节。此外，OVs感染的细胞释放病毒蛋白，被NK细胞识别，增加激活受体的表达，并增强杀死肿瘤细胞。一些OVs介导增加细胞因子和趋化因子的产生，随后表达NK细胞抑制配体，如肿瘤细胞中的MHC-I。 已经证明，IL2武装的仙台病毒在血管肉瘤小鼠模型中增加了NK细胞的招募。在另一项研究中，表达IL-2的细小病毒(H-1PV)在胰腺导管腺癌模型中增加了NK细胞的激活。工程化的天花病毒(VV)，VV∆TK∆N1L，武装有IL12，并删除了胸苷激酶和N1L基因，作为新辅助治疗在各种小鼠和仓鼠手术癌症模型中使用时延长了存活时间。 中性粒细胞的参与 已经证明了基于VV和VSV的病毒促进肿瘤细胞凋亡的抗肿瘤效应。在临床前实验中，发现TGF-β极化的N2中性粒细胞具有促肿瘤效应，而1型IFN极化的N1中性粒细胞具有促免疫和抗肿瘤结果。N1促进CD8+ T细胞的招募和激活以及细胞因子的产生，如VGF，TNF-α，GM-CSF和IL12。一种名为PVSIPO的重组脊髓灰质炎病毒疫苗株，包括一个异源内部核糖体进入位点，被证明可以促进前列腺和乳腺癌中中性粒细胞的积累，并与改善存活相关。 Tregs的参与 Tregs也通过高表达转录因子Foxp3诱导强烈的免疫抑制活性。已经证明，感染AdCMV∆24可以降低TME中的Treg水平。最近的研究报告说，溶瘤VV可以直接感染并减少小鼠癌症模型中的Treg数量，随后产生抗肿瘤效应。 基质修饰 一些OVs针对肿瘤基质并重塑细胞外基质(ECM)以改善其抗肿瘤效应。一种表达松弛素的oAd与各种调节剂结合形成平台oAd/IL-12/GM-RLX，导致ECM降解，增强治疗性单克隆抗体的渗透，并在胰腺癌模型中促进抗肿瘤效应。此外，一种表达PH20透明质酸酶的oAd导致ECM中透明质酸的降解，从而改善了其传播。癌症相关成纤维细胞(CAFs)在许多癌症中上调，并通过成纤维细胞激活蛋白(FAP)激活基质中的成纤维细胞。肿瘤相关周细胞是胶质母细胞瘤模型中的主要基质细胞亚群。一种oAd，ICOVIR15，减少了FAP+周细胞，胶质母细胞瘤细胞和GMP相关基质FAP+小鼠细胞的数量。另一种溶瘤VV，Western reserve double-deletion (WRDD)，已被证明针对CAFs并在黑色素瘤中具有抗肿瘤效应。 3.2.3.OVs的基因靶向 基因靶向是OVs的主要抗肿瘤机制。例如，呼肠孤病毒利用通常在癌细胞中改变的特定细胞特征。在肿瘤细胞中，癌基因被激活，肿瘤抑制基因被灭活，导致特定蛋白的信号传导调节，如TP53，PTEN，RB1和RAS，并激活肿瘤形成，血管生成，抑制凋亡，侵袭和转移。这些信号级联被OVs靶向，调节肿瘤细胞中的各种信号通路。已经研究了呼肠孤病毒对肿瘤细胞培养的作用，并确定了病毒在肿瘤细胞内的有选择性复制步骤—Ras突变可以促进呼肠孤病毒进入和肿瘤转化，增强OVs的产生，诱导凋亡，并在呼肠孤病毒感染后防止干扰素产生，允许病毒由于有缺陷的抗病毒反应而扩散。呼肠孤病毒通过与特定细胞表面受体相互作用进入细胞。癌细胞上这些受体的表达或可及性的变化可能增强病毒进入和感染它们的能力。溶瘤VVs和VSVs只能感染肿瘤细胞并促进由于ras/丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)的高表达而破坏内皮细胞。有些病毒，如呼肠孤病毒，对肿瘤细胞有天然的偏好，而其他病毒，如Ads，VSVs和HSVs，必须适应这种对肿瘤细胞的选择性。 被OVs感染的健康细胞通过不同的机制抑制病毒的传播，这些机制在肿瘤细胞中通常不足。细胞的I型IFN相关抗病毒潜能与其对VSV对癌细胞的选择性相关。正常细胞产生I型IFN以防止病毒复制；然而，大多数肿瘤细胞的I型IFN产生有缺陷，因此，它们被提议用于VSV感染。3.2.4.破坏和重塑肿瘤部位的血管系统 影响肿瘤血管生成的因素由癌基因介导的蛋白的表达和诱导细胞条件的因素组成，如低pH值、缺氧、营养缺乏或诱导活性氧(ROS)。OVs的抗血管生成方式如下：(i) 直接感染肿瘤细胞，随后裂解新形成的血管的血管内皮细胞；(ii) OVs触发的免疫反应，导致细胞聚集和血流减慢；(iii) 表达病毒蛋白，阻断肿瘤诱导的促进血管生成的因子的合成（图4）。 图4. 溶瘤病毒(OVs)诱导的抗血管生成机制。(A) OVs促使中性粒细胞的招募，发展为微血栓和缺血，随后发生凋亡。(B) 工程化病毒可以诱导内皮细胞的直接裂解。(C) OVs可以调节转录因子，减少IL8的产生，从而刺激凋亡。(D) OVs与血管生成蛋白相互作用，下调VEGF的表达。(BioRender.com)。 许多OVs具有直接的抗血管特性。一种含有人类端粒酶逆转录酶元素的腺病毒，OBP-301，被设计用来调节E1基因的表达，产生具有抗血管生成效应的IFN-gamma，选择性地破坏小鼠结肠肿瘤中的癌细胞。在血管内，VSVs刺激血栓形成和炎症。 最重要的因素包括CRT、ATP、HMGB1、热休克蛋白（HSPs）和annexins[135]。增强树突细胞吞噬抗原的DAMPs之一是CRT。ATP从凋亡细胞释放并结合到巨噬细胞和单核细胞上的P2Y2受体，加速凋亡细胞的清除。HMGB1激活未成熟树突细胞中的TLR4，导致树突细胞成熟并加速树突细胞对肿瘤抗原的摄取。热休克蛋白（HSPs）能够结合到树突细胞受体上，刺激抗原肽；它们也刺激内在的促炎级联反应。Annexin A1（ANXA1）在解决炎症过程中和协助树突细胞活动方面发挥着重要作用。参与ICD发展的其他因素包括细胞因子、趋化因子、核酸和转录因子。一些溶瘤病毒（OVs）对肿瘤组织有天然的趋向性，而另一些则经过基因改造在肿瘤细胞中复制以检测特定目标并传递某些基因（图5）。 图5. 由天然溶瘤病毒（OVs）诱导的免疫原性细胞死亡途径。一些天然OVs，包括新城疫病毒（NDVs）、柯萨奇病毒（CVs）、麻疹病毒（MVs）、单纯疱疹病毒（HSVs）、牛痘病毒（VVs）、腺病毒（Ads）、森林塞姆利基病毒（SFVs）和绵羊痘病毒（ORFVs）可以诱导特定模式的免疫原性细胞死亡。NDV、HSV和Ad可以诱导多模式细胞死亡，调节濒死恶性细胞中损伤相关分子模式的暴露，随后招募先天免疫应答者并触发强烈的免疫反应。VV诱导坏死性凋亡，而CV、MV、SFV和ORFV诱导免疫原性凋亡（BioRender.com）。 免疫原性凋亡是OV诱导的细胞死亡的最常见类型。受体，如TRAIL-R、TNF-R和Fas，形成死亡诱导信号复合体（DISC），被病毒感染调节，并调节激活caspase-8，诱导凋亡。这些受体过度表达并触发caspase级联反应，启动外源性凋亡。腺病毒在肿瘤细胞中诱导凋亡，这是其自然特征。表达三聚体肿瘤坏死因子的H5CmTERT-Ad株（H5CmTERT-Ad/TRAIL）在对照组中比天然腺病毒具有更强的肿瘤杀伤效果。HSV也参与凋亡。一种工程化的oHSV-2配备了凋亡激活因子Her2-COL-sFasL，以增强感染细胞中caspase的激活并放大凋亡。坏死代表细胞通过自溶的过早死亡，包括细胞膜完整性的丧失、细胞器的肿胀和细胞死亡产物不受控制地释放到细胞外空间。坏死性凋亡是一种程序性坏死细胞死亡过程，可以诱导或增强抗肿瘤免疫。它经常与由于DNA、ATP、尿酸、核蛋白和HSPs的释放而激活的级联炎症体激活相关，这些物质激活类激酶蛋白（MLKL），随后膜通透性增加并释放DAMPs。OVs还触发目标肿瘤细胞中的多种细胞死亡过程。例如，野生型Ad血清型5诱导自噬、焦亡和坏死性凋亡细胞死亡途径。NDV触发凋亡并被发现激活内在和外在凋亡途径。溶瘤NDV株FMW（NDV/FMW）是肺、黑色素瘤和前列腺癌细胞中的ICD诱导剂，显示HSP70/90和ATP分泌，并在黑色素瘤细胞中触发凋亡、自噬和坏死性凋亡。NDV/Hitchner B1促进胶质瘤细胞中的凋亡和坏死性凋亡。 4.OVs的递送系统  4.1.溶瘤病毒的直接递送  4.1.1.瘤内递送  瘤内给药是临床试验中用于递送OVs的最常用途径。各种试验已经建立了瘤内给药的有效性，并研究了其通过避免循环洪流来保持OVs足够生物利用度的能力。瘤内局部给药方法通过减少病毒失活来利于这一过程。有限的病毒与先天免疫系统的相互作用降低了系统毒性的可能性，并通过对独特给药途径的期望病毒载量进行转移。限制因素包括由于密集的ECM而在肿瘤中达到的非治疗水平，以及由于新生血管生成而导致的瘤内灌注不足。瘤内给药的OVs可以诱导全身反应。肿瘤抗原的产生是对OVs和肿瘤细胞之间相互作用的反应。对T-VEC给药的研究显示，研究的黑色素瘤病变大小都有所减小，无论是注射的还是未注射的。 4.1.2.静脉内递送 静脉给药对于转移性癌症有益，当需要感染不同大小和位置的多种肿瘤时，以及由于肿瘤位置原因无法进行瘤内给药时。这种类型的给药可以确保OVs在肿瘤质量中更好地分布；然而，最佳OV剂量尚不确定。一些OVs在静脉给药时可以刺激更明显的免疫反应。免疫系统可以使用不同策略阻止OVs成功传播到目标组织。OVs可以非特异性地连接到血清蛋白或循环流中的循环细胞，随后被破坏。由于这些机制是先天免疫系统的一部分，它们在未暴露于特定病毒的患者中也有效，暴露史可以通过存在精确而有力的免疫反应通过抗体的存在显著破坏病毒。通过与病毒颗粒结合，抗体可以通过补体作用或被位于不同器官的巨噬细胞破坏而消除。肝脏、脾脏和肺是中和OVs的主要器官。另一个有效静脉给药OVs的障碍是肿瘤ECM和间质流体压力。高间质流体压力限制了进入肿瘤中心的通道，其中由于其周边的流体流动而具有最高值，但它也减少了大分子的通过。 4.2.通过OVs的货物系统递送 在OVs货物递送到肿瘤的领域已经进行了众多且多样的研究，可以分为生物和非生物递送系统。生物载体包括细胞、细胞膜介导的和血清白蛋白介导的OVs载体。非生物载体的OVs包括矿化纳米结构、磁性纳米结构和基于聚合物的纳米载体。 4.2.1.OVs的有机载体 细胞载体 间充质干细胞（MSCs）因其独特的生物学特性、广泛的治疗应用以及对组织工程的影响而在科学研究中受到越来越多的关注。MSCs通过分化成成骨细胞、脂肪细胞或软骨细胞来展示这种能力，并且具有广泛的分泌网络，包括多种介质、细胞因子和信号分子，除了它们显著的自我更新和多能性特征。这种分泌塑造了炎症反应，并控制了组织再生和修复所需的关键渗透过程。MSCs的调节行为是由MSC分子-靶细胞轴内的反馈驱动的。MSCs无法显示共刺激粒子，因此与较低的免疫活性有关，有机会用于肿瘤的基于细胞的免疫疗法。MSCs可能促进体外oAds的病毒复制，通过防止大鼠模型中的病毒特异性免疫反应，使运输和提高病毒的长期存活率成为可能。此外，与体内单独病毒接种相比，CR-MSCs可能减少刺激T细胞合成的IFN的数量，并导致oAds在扩散和存活方面的增加更大。全身给药的MSCs感染了肝细胞癌异种移植标本中的oAds，增强了病毒粒子的积累，并显著抑制了肿瘤增殖。另一项涉及由人类MSCs携带的复制Ad的研究，其中包括由甲胎蛋白启动子调节的E1A基因，显示在正位和皮下肝异种移植癌小鼠模型中显著限制了生长。经过全身给药后，MSCs被oAd污染，在肺和乳腺恶性肿瘤的正位小鼠模型中显示出治疗特性，提高了存活率。在转移性乳腺癌的实验模型中，全身注射工程化的人类MSCs，携带可复制病毒的副本，如Ad5/3.CXCR4和Ad5R6D.CXCR4 Ads，增加了动物的存活率。全身输注感染了HER2重定向溶瘤HSV的MSCs，在实验室模型中将感染传播到乳腺和卵巢癌细胞，随后减少了肺部和大脑的转移。对SKOV3ip.一个卵巢肿瘤异种移植的研究显示，腹腔内给药的MSCs装载了溶瘤MeVs在SKOV3ip.一个卵巢肿瘤异种移植可以进入肿瘤病变，并最终在小鼠中传播病毒感染，增加了平均寿命。针对MSCs的CRAd5/F11嵌合oAds显著抑制了结直肠癌细胞的生长。 神经干细胞（NSCs） 一些研究表明，NSCs具有迁移到脑肿瘤细胞的能力，并可能为各种抗癌剂提供运输平台。Ad（CRAd-Survivin (S)-pk7病毒）可以针对NSCs上的CD46受体。感染的NSCs迁移到胶质瘤细胞，从而减少肿瘤生长。NSCs和MSCs被用作载体在胶质瘤模型中运输oAd，观察到NSCs和MSCs都允许病毒复制并减少神经炎症。然而，NSCs释放的Ads数量多于MSCs，并且使用病毒载NSCs在肿瘤携带动物中注射瘤内，存活时间延长，这表明NSC细胞系中CXCR4的高表达是原因。Kim等人报告说，CRAd-S-pk7和NACA的组合提高了NSCs中oAds的复制，从而提高了OV的效率。 细胞膜介导的OVs系统递送 作为载体的某些实体在来自几种细胞类型的细胞外载体的多样化保护伞下共同可用。使用这些载体的好处，由生物模拟技术作为PEG化替代品，包括在环境中的安全性和耐用性，从而克服了药物递送系统的局限性。 整合来自细胞膜的运输者的主要优势在很大程度上是由于保留了它们来源的细胞内的固有功能和信号传导途径。结合这些纳米载体只包含来自单一来源的膜部分，如红细胞、血小板、癌细胞和负责免疫防御的细胞的膜，或者是从几种不同的细胞类型生成的，结果是有价值的载体选择，它们具有靶向肿瘤细胞的能力，是细胞膜的生物工程过程的结果，并且可以携带小分子，如遗传物质、特定药物和疫苗抗原。这些由细胞的基本组成部分生成的囊泡在肿瘤学试验中使用，主要是通过在它们内部运输实体或通过包裹纳米粒子-药物复合物。在所有细胞来源替代品中，红细胞为所讨论的目标提供了一些最有用的特征。可以相当容易地获得这些细胞，它们在血管系统中的平均存活时间很长，并且由于这些细胞缺乏天然细胞器，因此还有潜力封装额外数量的产品。依赖于具有混合涂层的囊泡的新模型，称为红细胞脂质体，由人工成分与红细胞膜的组合生成，对分布有益。随后，在体外和体内检查了肿瘤细胞膜，以评估病毒感染的程度及其破坏性影响。因此产生的颗粒，称为ExtraCRAd，被瘤内给药，并显示出通过clathrin介导的内吞作用的适当吸收，考虑到oAds感染需要表达CAR的需求，这是一个重要的好处。此外，这种设置对于体内抗体识别和灭活是一个重要的限制。 血清白蛋白介导的OVs系统递送 用不同材料包裹OV颗粒是一种保护它们免受免疫系统作用的策略。Ads和血清白蛋白之间的关联阻止了针对OVs的抗体的作用。抗体识别病毒的衣壳蛋白，并通过吞噬作用对它们进行涂层。因此，它们使OVs成为免疫效应细胞的目标；然而，它们也可以在细胞水平上阻止转导。白蛋白是血浆中浓度最高的蛋白质，并且具有长的半衰期。 经过基因工程改造后，白蛋白自然地结合到Ad的表面。形成病毒衣壳的最常见蛋白质具有高变区域，可以促进白蛋白和病毒之间的相互作用，但也是抗OV抗体的主要目标。使用降解ECM的蛋白酶可以增加肿瘤床中的病毒载量。透明质酸是ECM的组成元素之一。它是一种复杂的多糖，在某些癌症中以高浓度存在。透明质酸的积累可能发生在消化道癌症的上皮中，如结肠和胃。在卵巢、乳腺和前列腺癌症的肿瘤基质中，聚集是明显的。有些器官具有富含透明质酸的多层上皮和基质。在这些情况下，变化是可见的，并且与癌症进展相关。在头部、颈部和皮肤的鳞状细胞癌中，透明质酸水平降低，与肿瘤阶段有关。增加的浓度与侵袭性肿瘤和预后不良有关。透明质酸酶降解ECM并降低间质流体压力。因此，抗肿瘤剂对靶细胞的作用增加。透明质酸酶的表达增加了OVs的有效性。Hexon是Ad包膜中发现的一种重要蛋白质。衣壳蛋白与白蛋白的结合域结合。透明质酸酶的蛋白水解作用和基于白蛋白与病毒表面结合的递送机制决定了OVs的溶瘤效力。VCN-11是一种修饰的腺病毒，表达透明质酸酶和白蛋白结合域。目前正在研究其细胞毒性和逃避免疫系统的能力。这些OVs对肿瘤细胞的作用最强，并且细胞毒性是450倍。在体内，含有白蛋白结合域的OVs组中存在高滴度的中和抗体，表明它们没有作用。VCN-01是一种oAd，其透明质酸酶作用于胰腺间质基质。它可以增强化疗药物的效果。HAdV5是最好表征的Ad类型之一，靶向呼吸道上皮细胞。在具有健全免疫系统的个体中，可以轻松控制这种病毒的感染。这种病毒是溶瘤治疗的良好候选者，考虑到其个体性。这种病毒确保有效地转导到感染的细胞中。因此，在感染靶细胞后，遗传物质被转移到细胞核中。在将核酸释放到细胞核后，细胞使用病毒提供的遗传物质产生所需的蛋白质。此外，这种方法用于分裂细胞系和难以接近的细胞，如原代细胞。另一个优点是大规模生产的可能。适应悬浮培养的细胞确保了细胞培养的简便程序，从而提高了安全性并降低了生产成本。通过将白蛋白层适应病毒，可以减少OVs在肝脏中的清除。通过将适配蛋白附加到这个复合物上，可以将遗传物质传递给表达HER2或EGFRs的肿瘤细胞。此外，这种适应减少了免疫介导的清除。免疫中和可以通过阻断特定受体或将其暴露于蛋白酶体降解的抗体发生；这被称为抗体依赖性细胞内中和。先天免疫系统通过IgM抗体和补体系统与OVs相互作用。 细胞外囊泡（EVs） 细胞外囊泡是各种类型细胞释放的膜囊泡，通过携带脂质、蛋白质、RNA、DNA和碳水化合物参与细胞间信号传导，并根据其大小被分类为外泌体、微囊泡、凋亡小体和肿瘤小体。它们通常用于携带抗癌药物，如OVs。Garofalo等人报告说，Ad5D24-CpG和PTX封装在EVs中在体外和体内诱导了肺癌模型中的肿瘤周围炎症，提高了疗效和细胞毒性。来自肿瘤细胞的外泌体通常具有免疫抑制功能；然而，感染OVs的肿瘤细胞的外泌体可能具有免疫刺激功能。Labani-Motlagh等人表明，感染OVs的黑色素瘤细胞，装备有CD40（CD40L）和4-1BB（4-1BBL）配体，增强了树突细胞的激活和TME中的响应。OVs可以包含选择性在肿瘤中积累的外泌体，局部或在远处肿瘤中表达抗肿瘤效应。它们被设计成带有免疫刺激转基因的LOAd溶瘤腺病毒。LOAd感染的肿瘤细胞表达转基因包装到内体区室并作为外泌体释放。此外，mRNA在外泌体中的表达在LOAd700和LOAd703感染的细胞中显著增加。观察到任何感染的细胞都可以表达转基因，即使病毒只在肿瘤细胞中复制。然后未成熟的树突细胞被LOAd病毒感染，并在体外被外泌体激活。OVs用其免疫刺激转基因武装肿瘤衍生的外泌体，这可能部分解释了为什么局部治疗可以导致全身免疫。还证明了感染细胞中外泌体中微小RNA（miRNA）的转运发生了变化。 微粒子（MPs） 另一种用于OVs系统运输的车辆是微粒子（MPs），它们是通过外泌作用从细胞释放的直径最大为1微米的囊泡。微粒子提供免疫保护并延长oAds的释放。封装在微粒子或PLGA中的Ads为oAds提供了免疫保护。使用MPs的总循环系统对oAds的高保护增加了oAds的释放。肿瘤细胞衍生的MPs被用作oAds的货物，被运送到肿瘤细胞的细胞核，并保护Ads免受抗体的影响；由MPs携带的oAds比用游离oAds治疗肿瘤更有效。 4.2.2.无机载体介导的OVs系统递送 包括脂质体、树状分子、金纳米粒子、二氧化硅纳米粒子和氧化铁纳米粒子在内的各种类型的纳米粒子（NPs）可以与OVs链接。使用NPs递送OVs有两种策略。第一种是屏蔽和表面修饰，第二种是OV-NPs的联合疗法。将NPs递送到肿瘤部位有两种机制，即主动和被动。在被动机制中，EPR效应增加了肿瘤血管的通透性，NPs在肿瘤区域集中。主动递送涉及NPs对目标细胞的选择性结合，目的是在减少副作用的情况下增加治疗剂在肿瘤中的浓度。各种生物配体，如肽、蛋白质、核酸适体和多糖，对肿瘤细胞中的分子或受体表现出亲和力和特异性。 药物递送中的屏蔽 聚乙二醇（PEG）最常用于屏蔽NPs的表面，因为它在极端pH溶液中的生物相容性、稳定性和亲水性。PEG成功地与Ad载体结合，延长了循环时间并减少了肝脏毒性。精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）是另一种通过内吞作用进入细胞的配体。阳离子脂质体（DOTAP/DOPE）被报道可以增强病毒基因组在肿瘤细胞中的转移，并增加肿瘤的通透性和优先靶向。 OV-NP联合疗法 金纳米粒子（AuNPs）在溶瘤病毒疗法中广泛使用，有助于DNA进入肿瘤，尽管存在抗体。设计了一种含有Ad的微胶粒包被的粒子，并与紫杉醇结合，显示出对肿瘤的高效性。我们测试了聚乙二醇-聚乳酸（PEG-PLA）与聚合物微胶粒的结合，携带紫杉醇到特定目标，比紫杉醇诱导了更高的抗肿瘤效应。另一种聚合物，聚半乳糖基-b-agmatyl二嵌段共聚物（Gal32-b-Agm29），涂覆了oAd，对肝肿瘤细胞表面表达的糖蛋白受体表现出非常强的亲和力。oAds也可以与水凝胶系统结合，提供决定恶性细胞细胞毒性影响的保护环境。oAds可以装载在海藻酸盐凝胶中并瘤内给药，与裸oAds相比，在肿瘤异种移植模型中显示出oAds的长效性。Almstätter等人将磁技术与OV递送结合起来，以改善OVs的递送。设计了四种磁性病毒复合模型，被证明可以提高OVs的疗效并减少系统毒性。 5.当前溶瘤病毒治疗策略  5.1.对溶瘤病毒治疗的耐药性  并非所有患者和癌症类型对病毒治疗都有相同的反应。这种治疗方法的局限性和挑战，以及治疗耐药性的存在，已经被描述。宿主对病毒的免疫反应是病毒治疗中的关键挑战。在几项临床前研究中，宿主免疫反应被证明在减少OVs的复制和更快的清除中发挥重要作用，并对降低抗肿瘤效力负责。在这种情况下，涉及OVs的新的治疗策略集中在调节宿主免疫系统以最大化抗病毒反应，从而改善肿瘤破坏[9]。已经描述了不同的耐药机制；这些包括抗病毒免疫、肿瘤细胞介导的、基质细胞和系统反应。对病毒感染的抵抗力可以在四个阶段完成：（i）病毒的进入和结合；（ii）病毒转录和翻译；（iii）细胞存活；（iv）细胞信号传导。包括中和抗体、正常细胞受体和ECM中的蛋白酶在内的多种因素影响病毒的结合和进入。在上皮-间质和间质-上皮转换期间，据报道细胞间连接得到加强，这使得OVs的渗透变得困难。 为了执行其自身基因组的转录和翻译，病毒的下一个关键步骤是适当调节宿主转录和负责将mRNA翻译成蛋白质的机制。例如，肿瘤细胞可以通过表观遗传修饰和表达几种蛋白质（如载脂蛋白B mRNA编辑酶）来影响病毒转录。几种存活蛋白保护肿瘤细胞免受病毒感染。除了表观遗传修饰外，对OVs的耐药性被发现与调节自噬、肿瘤细胞中的凋亡和促进细胞存活有关。Li等人证明了病毒治疗溶瘤活性的增加，其中Ads中的beclin-1活性促进了肿瘤细胞的凋亡。此外，对病毒感染和肿瘤细胞中的增殖的抵抗力与几个细胞存活调节因子（MEK、MAPK、MYCN、MDR1和SMAC）有关。感染的细胞释放可溶性信号，保护周围细胞免受各种病毒感染。此外，通过分泌干扰素在OVs感染的背景下触发肿瘤细胞中的干扰素受体（IFNR）基于Janus激酶（JAK-STAT）途径在抗病毒耐药性中发挥重要作用。基质细胞的抗病毒活性比肿瘤细胞更强，这影响了对OVs的治疗反应。Arwert等人表明CAFs通过干扰素调节转录因子3（IRF3）和干扰素基因刺激因子（STING）阻止病毒感染。类似地，在卵巢和乳腺癌中，肿瘤相关巨噬细胞通过分泌IFN促进对OVs的耐药性，从而创造了保护性的抗病毒状态。OVs也可以诱导局部免疫反应，随后将免疫学上“冷”的TME转化为“热”的，被免疫细胞浸润，其中干扰素信号通路发挥重要作用。干扰病毒治疗效力的机制存在于不同的水平，并涉及TME中不同细胞的相互作用。因此，上皮细胞代表了控制肿瘤中病毒传播的物理屏障。此外，肿瘤血管生成是病毒传播和感染的调节组成部分。对oncoviral治疗产生耐药性的另一个因素是肿瘤中存在缺氧区域。缺氧可以减少OVs在肿瘤细胞中的增殖并干扰肿瘤细胞的裂解机制。缺氧诱导因子1（HIF-1α）是缺氧中的主要因素，促进肿瘤细胞的血管生成和转移。除了物理限制外，前列腺素和VEGF与TME中的耐药性有关。使用病毒载体开发新疗法的困难与无效分布、肿瘤中的缺氧、血管屏障、亚优免疫反应和在细胞间水平发生的抗病毒分子机制有关。总而言之，某些机制对病毒治疗施加了一定程度的耐药性，并负责随后杀死肿瘤细胞。尽管如此，这种机制在赋予OVs耐药性方面的作用仍然不清楚。 这些数据表明需要鉴定新的因素，如肿瘤缺氧和表观遗传修饰，这些因素被认为是对溶瘤病毒治疗产生耐药性的组成部分。关于这一机制的额外数据将为研究人员和临床医生提供完美的工具，以合理设计OVs并制定适当的治疗策略。 5.2.当前将溶瘤病毒治疗与其他协同疗法结合在癌症治疗中的现状 如前所述，已经描述了在单药治疗中对OVs产生耐药性的几种因素。已经考虑了联合疗法来克服这个问题。这种方法在临床前和临床环境中的各种类型的肿瘤中证明了其有效性。 5.2.1.与化疗的结合 化疗仍然是传统的抗癌疗法。OVs与化疗在多个层面上协同作用，包括抑制免疫介导的病毒降解和中和。化疗通过多种机制补充病毒治疗，如通过增强肿瘤细胞的免疫原性、直接杀死癌细胞和阻断抗病毒免疫反应（NCT00006106、NCT00634595、NCT01584284）。环磷酰胺是一种烷化剂，可以提高使用不同病毒的病毒治疗的疗效。这种化疗药物触发的免疫调节被认为可以改善病毒的复制、传播和溶解活性。在临床前和I/II期研究（NCT00006106）中取得了有希望的结果，一种工程化的Ad载体，ONYX-015，与5-氟尿嘧啶和顺铂联合用于治疗头颈部或食管鳞状细胞癌的III期试验。联合治疗的患者反应率为79%，而单独接受化疗的患者为40%。此外，当Ad与不同的药物如阿霉素、吉西他滨、紫杉醇、伊立替康和环磷酰胺联合给药时，抗肿瘤效应得到加强。此外，在临床前研究中，对胶质瘤患者测试了替莫唑胺与OV的联合使用，并显示出良好的毒性剖面和提高的存活率。然而，OVs与化疗的结合效果仍然存在争议，需要进一步研究。尽管一些临床试验显示出有希望的结果，但其他涉及大样本的研究报告了这种联合方案的无效性。例如，Eigl等人在用多西他赛和pelarorep联合治疗的转移性去势抵抗性前列腺癌患者中，中位生存时间为19.1个月，而接受多西他赛治疗的患者为21.1个月（NCT01619813）。 5.2.2.OVs与放疗的结合 一些研究表明，病毒治疗和放疗的结合导致了有希望的治疗结果。尽管存在强有力的临床前数据，但由于缺乏一个完善的机制，这种效应是由于这两种疗法之间的协同活动。这种结合导致了改善的抗癌活性。放疗诱导的细胞修饰可以增加病毒在肿瘤中复制和传播的能力。Pokrovska等人证明，当OV与放疗结合时，通过增加病毒产生诱导了肿瘤特异性细胞毒性。在一项I期试验中，一种突变的HSV（G207）与复发性恶性胶质瘤的放疗结合，显示出临床反应的潜力。在这项研究中，9名患者中有6名显示出部分反应或稳定疾病，这被证明具有协同效应。另一种方法是，病毒治疗可以增加肿瘤对放疗的敏感性。表达p53的Ad诱导感染的p53缺陷肿瘤细胞对辐射诱导的凋亡更敏感，随后比未从放疗中受益的肿瘤细胞的凋亡减少，导致更大的肿瘤抑制。 5.2.3.OVs与免疫治疗的结合 尽管文献中关于免疫治疗和病毒治疗的结合的报告很少，但将针对PD-1和/或细胞毒性T淋巴细胞抗原-4（CTLA-4）的免疫检查点抑制剂与OV结合在癌症治疗中提供了新的视角，特别是在具有免疫抑制微环境的癌症中，其中PD-1/PD-L1抑制剂的单一疗法可能变得无效。这种疗法的溶瘤活性决定了细胞因子和其他分子的释放，这些分子具有将“冷”肿瘤转变为“热”肿瘤的效果，这种修改可以改善免疫治疗对易感目标的效果。除了PD-1，一些也表达在TIL上的免疫检查点分子也被证明可以诱导免疫抑制微环境并减少活化的CD8+细胞。这一类包括CTLA-4、TIGIT、TIM-3和LAG-3。OVH-aMPD-1与抗TIGIT协同作用，并在MC38和Hepa 1-6肿瘤模型中显著改善免疫反应。然而，在难治性肺癌中，vvDD单一疗法与抗PD-1和抗TIM-3 mAbs的结合未能显示出治疗优势。重要的是，将超过两种ICIs作为治疗策略结合使用可以产生更好的抗肿瘤结果。T-VEC是一种瘤内疗法，是免疫疗法的领先组合。GM-CSF在这种结合中的作用是增强细胞免疫。T-VEC的作用来自于病毒载体的直接溶瘤效应和免疫反应触发的结合。在将T-VEC与抗CTLA4，ipilimumab联合用于治疗IIIB-IV期黑色素瘤的I期试验中，观察到了客观和持久的反应率的有希望的结果。此外，在一项开放标签的II期试验中，无论是原发性还是转移性肿瘤，与ipilimumab单一疗法相比，T-VEC与ipilimumab联合使用的目标反应率显著增加。在T-VEC与ipilimumab与ipilimumab单独用于晚期黑色素瘤的II期试验中，在5年分析中，联合治疗的中位PFS为13.5个月，ipilimumab为6.4个月，估计的5年OS在联合治疗组为54.7%，ipilimumab组为48.4%（NCT01740297）。Pexastimogene Devacirepvec（Pexa-VEC）是一种溶瘤牛痘病毒，与抗PD-1抑制剂，cepilimumab联合在肾肿瘤患者中在Ib期试验中显示出令人鼓舞的结果。这种联合疗法报告了37.5%的总体反应。腺病毒DNX-2401是一种OV，在接受恶性胶质瘤诊断的患者中进行了剂量递增研究。在那项研究中，单剂量的DNX-2401，瘤内给药，获得了不同的肿瘤反应。目前，这种OV正在与pembrolizumab联合用于胶质母细胞瘤患者的II期试验中进行研究。中期分析显示，48名接受联合治疗的患者中位总生存期为12个月，反应率为47%。将抗PD1/PD-L1与抗CTLA4和OV结合使用的三重疗法的想法最近变得非常吸引人，在其中一项研究中，Ad与抗PD-L1和抗CTLA4的结合在TNBC正位小鼠模型中显著抑制了肿瘤生长并延长了存活。通过增加CD8+ T和T记忆细胞的比例以及耗尽Tregs和极化为M1表型的肿瘤相关巨噬细胞，增强了抗肿瘤效应的协同增加，调节了TME。这种联合疗法具有很大的潜力，代表了一种有前景的治疗策略，用于改善癌症细胞治疗，应该很快就会可用。考虑到安全性、毒性剖面和有希望的结果，越来越多的ICIs和OVs正在进入临床试验。 5.2.4.激酶抑制剂的作用 药物病毒方法是用来克服对OVs的耐药性的策略之一，它将病毒治疗与针对激酶的分子治疗相结合。在临床前模型中，已经获得了重要的协同结果，明显的表现是在肿瘤组织中OVs的复制和传播显著增加。受体酪氨酸激酶（RTKs），位于细胞表面，控制大多数情况下介导细胞生长和存活的细胞内反应。一些途径，如MAPK级联或PI3K/Akt/mTOR途径，通过受体特异性配体结合在下游激活。RTKs的超激活导致细胞生长不受控制，是一个重要的药物靶标。最近，病毒治疗与RTK抑制剂的结合已经取得了一些有吸引力的效果。肿瘤间质液压力（IFP）高是有效药物递送的障碍，被认为通过阻碍病毒在整个肿瘤微环境中的接触和侵入，限制了OVs的临床效益。肿瘤组织中IFP增加的原因尚有争议。一个被认为对此有贡献的机制是异常的VEGF介导的血管化增强。Kottke等人指出，当将VEGF配体VEGF165与oReoV结合时，OV给药前给予VEGF165可以改变肿瘤血管并改善OV递送到肿瘤组织。两种酪氨酸激酶抑制剂，厄洛替尼和阿西替尼，与oHSV1结合，通过抑制oHSV1血管生成刺激病毒递送，并被报告影响小鼠胰腺肿瘤的肿瘤生长和血管生成。总的来说，这些观察结果证实了与不同的激酶抑制剂结合治疗的合理性，在临床前研究中取得了有希望的结果。此外，临床前研究的结果与药物病毒结合使用OVs与这些分子可以刺激病毒治疗在癌细胞中溶瘤效力的观点一致。 5.2.5.与细胞治疗的结合 嵌合抗原受体（CAR）-T疗法是治疗癌症的一种新颖且有前景的治疗方法，产生了有效和持久的临床反应。合成受体主要重新定向T细胞，消除表达特定靶标抗原的细胞。2017年，FDA批准了针对B细胞恶性肿瘤的抗CD19 CAR-T细胞疗法。CAR-T细胞疗法存在一些限制，包括主要毒性，限制了其对实体瘤的疗效，抗原逃逸，持久性有限，以及肿瘤渗透性差。这些都导致了新的方法，在这些方法中，CAR-T疗法与其他抗癌治疗相结合，以提高抗肿瘤效力并减少毒性。抗CD19 CAR-T细胞疗法彻底改变了B细胞恶性肿瘤的治疗。一些研究表明，CD-19在多种OV感染的肿瘤细胞类型表面表达，携带CD19-T编码基因（OV19T）。因此，CD-19刺激CAR-T细胞并触发肿瘤溶解，刺激来自死亡肿瘤细胞的OV19T的释放，可以激活内源性抗肿瘤免疫。此外，病毒治疗可以与免疫治疗和CAR-T细胞同时结合，增加TME中的免疫细胞数量并改善抗肿瘤反应。例如，可以同时给予表达IL12的Ad和全身HER-2和PD-L1阻断抗体。在临床前肿瘤模型中，这种结合显示出增强或协同效应。此外，抗CTLA4、病毒治疗、抗PD-(L)1抗体和新兴ICI抗体给药的时间是另一个需要进一步观察的重要领域。为了提高疗效并改善肿瘤反应性，需要系统探索免疫治疗在OVs和CAR-T细胞之前、之后和同时给药的效果。 6.结论及展望  溶瘤病毒在破坏肿瘤细胞方面的优势源于其本身的品质，包括直接细胞溶解、针对免疫系统、调节TME和直接特性，如调节肿瘤细胞中的特定途径、抗血管生成作用和调节肿瘤细胞代谢。基因工程在增强细胞溶解作用和肿瘤细胞攻击的多样性方面提供了巨大的优势。将病毒运送到肿瘤细胞的方法仍然是一个挑战，有多种可能性获得表现出更有效作用的OVs。在过去的几年中，许多研究已经使用非生物或生物纳米载体将OVs运送到肿瘤细胞中，并显示出有希望的结果。OVs作为单一药物疗法或与其他治疗策略结合在临床前和临床研究中都已得到证明。OVs具有抗肿瘤潜力；然而，作为一类新的抗癌治疗，它们的发展仍然存在一些特定的障碍。导致溶瘤病毒治疗失败的障碍包括OVs渗透和扩散不足、宿主抗病毒免疫、患者之间的个体差异、溶瘤病毒与病毒耐药或病毒敏感肿瘤细胞的相互作用，以及作为单一药物使用时的低或中等效力。单一OV给药的效力低是因为宿主免疫系统可能将其从血流中清除，病毒可能只在短时间内表达转基因，或者病毒传播可能受到限制。已经在用oHSV或oAds治疗的小鼠中进行了研究，在这些小鼠中，病毒颗粒被迅速清除。此外，oAds在目标组织中的效力有限且持久性低。为了克服这些限制，溶瘤病毒治疗可以与其他抗癌治疗结合使用，如化疗、放疗、靶向治疗或免疫治疗。治疗效果与宿主的抗病毒反应和OV诱导的抗肿瘤免疫之间的平衡有关；然而，影响这种平衡的生物学机制仍然不清楚。各种类型的肿瘤和癌症的不同阶段在选择OVs、运输方式及其与各种系统治疗的结合方面仍然具有挑战性。

摘要：佐剂是疫苗不可或缺的组成部分。尽管在疫苗中广泛使用，但其作用机制尚未完全清楚。随着对先天免疫反应如何控制抗原特异性反应机制的更深入了解，佐剂的作用机制开始被阐明。佐剂可分为免疫刺激剂和递送系统。免疫刺激剂是危险信号分子，通过靶向Toll样受体（TLRs）和其他模式识别受体（PRRs），促进抗原信号和共刺激信号的产生，从而增强适应性免疫反应，导致抗原呈递细胞（APCs）的成熟和激活。另一方面，递送系统是载体材料，通过延长装载抗原的生物可用性，以及将抗原靶向淋巴结或APCs，促进抗原呈递。本文综述的开头系统总结了佐剂的作用机制。随后介绍了经典疫苗佐剂的机制、特性和进展。此外，由于一些正在研究的佐剂显示出比经典佐剂更大的免疫激活潜力，这可能弥补经典佐剂的不足，因此随后总结了正在研究的佐剂平台。值得注意的是，我们强调了这些佐剂平台的不同作用机制和免疫学特性，这将为不同疫苗的合理设计提供广泛的选择。在此基础上，本综述指出了疫苗佐剂的发展前景和未来应注意的问题。 1.引言 佐剂被定义为与疫苗抗原联合使用时增强疫苗免疫原性的各种成分（图1）。佐剂可以是合成的小分子化合物，也可以是复杂的天然提取物和颗粒材料。佐剂的第一个证据出现在1926年，当时亚历山大·格伦尼发现将铝盐与抗原混合并注射到豚鼠体内比单独给予抗原诱导出更多的抗体（图2）。随后，在20世纪40年代，弗伦德及其同事开发了水包油乳液，导致了弗伦德佐剂的创建。然而，由于对人类有毒，弗伦德佐剂并未获准用于人类疫苗。与弗伦德佐剂类似，由于局部和系统性副作用，细菌脂多糖（LPS）佐剂在人类疫苗中的使用受到限制。实际上，从20世纪20年代到90年代，尽管努力开发新的人类疫苗佐剂，但只有铝佐剂获得了许可。直到1997年，水包油乳液MF59才作为流感疫苗的佐剂在欧洲获得许可。在接下来的20年里，另外四种佐剂（AS04、AS03、AS01和CpG ODN 1018）获准用于疫苗，改变了人类疫苗佐剂的单调性。此外，在此期间，许多其他不同类别的化合物作为佐剂进行了评估，包括矿物盐、微生物产品、乳液、皂苷、合成小分子激动剂、聚合物、纳米颗粒和脂质体。它们在临床前和临床研究中显示出增强免疫反应的强度、广度和持久性。 图1 佐剂增强疫苗的免疫原性。a 无佐剂的疫苗诱导产生适度的T辅助细胞极化细胞因子、抗体和活化T细胞。b 相比之下，含佐剂的疫苗促进更多APCs（抗原呈递细胞）的成熟，增加APCs与T细胞之间的相互作用，促进产生更多数量和更多类型的T辅助细胞极化细胞因子、多功能T细胞和抗体，从而导致广泛和持久的免疫力，以及剂量和抗原的节省。这张图是用BioRender（https://biorender.com/）创建的。 图2 疫苗佐剂研究历史中主要事件的时间线。这张图是用BioRender（https://biorender.com/）创建的。 尽管佐剂在疫苗中已广泛使用很长时间，但它们增强免疫反应的机制尚未得到很好的表征。直到揭示了先天免疫反应如何控制适应性免疫反应的机制，科学家们才开始理解佐剂的作用机制。佐剂通过靶向先天免疫细胞并激活模式识别受体（PRRs）信号通路，引导和增强特定的适应性免疫反应。随后，发现一些递送材料也可以通过模仿自然病原体的大小或空间结构，通过促进抗原呈递细胞（APCs）摄取和呈递抗原，作为佐剂通过增强适应性免疫反应发挥作用。尽管在佐剂开发方面取得了上述进展，但由于它们的定义广泛和机制复杂，对佐剂的作用机制缺乏系统的概括和总结。此外，由于缺乏对当前佐剂平台的机制、特性、免疫效果和应用场景的系统深入理解，很难为特定疫苗匹配和设计合适的佐剂。这导致当前疫苗在使用中逐渐显示出不足，例如无法提供长期保护性免疫、老年人群的免疫弱和无法提供有效的细胞免疫。因此，为了解决这些问题，本综述尝试首先总结佐剂的机制。然后，总结了具有潜在发展价值的经典佐剂平台和正在研究的佐剂平台的机制、特性和应用进展。在本文的最后一部分，讨论了佐剂可能的未来发展方向。本综述希望能为佐剂机制的进一步研究、现有佐剂的合理使用以及新佐剂的设计和开发提供有效的参考。 2.佐剂的作用机制 佐剂已广泛用于疫苗中，以促进疫苗接种的成功。佐剂通过激活先天免疫细胞增强疫苗的适应性免疫。核心概念是佐剂通过激活APCs促进抗原呈递信号（信号1）和共刺激信号（信号2）的产生（图3）。抗原呈递信号是抗原肽-主要组织相容性复合体（MHC），在抗原被摄取和处理后呈现在APCs表面。共刺激信号包括APCs表面表达的共刺激分子（例如CD40、CD80、CD86）和分泌的炎症细胞因子（例如IL-6、IL-10、IL-12和TNF-α）。这两种信号的产生可以强烈诱导初始T细胞的激活，导致增强的适应性免疫反应。免疫刺激剂，如病原体相关分子模式（PAMPs）、损伤相关分子模式（DAMPs）和化学合成的TLRs小分子激动剂，可以通过APCs产生信号1和信号2。递送系统，如脂质纳米颗粒（LNPs）、聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）和笼状蛋白纳米颗粒，通过促进MHC分子上的抗原呈递（信号1）发挥作用。值得注意的是，一些研究表明，许多纳米颗粒递送系统可以直接靶向B细胞以诱导最佳有效的抗体反应。接下来，我们详细描述免疫刺激剂和递送系统发挥佐剂效力的具体机制。 图3 佐剂作用机制的核心。佐剂被分类为免疫刺激剂和递送系统。像PAMPs（病原体相关分子模式）、DAMPs（损伤相关分子模式）和化学合成的小分子激动剂这样的免疫刺激剂，提供危险信号（信号0），激活APCs（抗原呈递细胞）上的PRRs（模式识别受体），从而增强MHC分子上的抗原呈递（信号1）。此外，PRRs的激活导致细胞因子和共刺激分子表达上调，这导致共刺激信号增强（信号2）。像LNPs（脂质纳米颗粒）、PLGA（聚乳酸-羟基乙酸共聚物）和自组装蛋白纳米颗粒这样的递送系统，通过促进MHC分子上抗原的呈递（信号1）发挥作用。这张图是用BioRender（https://biorender.com/）创建的。 2.1.免疫刺激剂的作用机制 根据作用机制，佐剂可分为免疫刺激剂和递送系统。免疫刺激剂是危险信号分子，通过靶向APCs细胞上特定受体导致APCs的成熟和激活。具体来说，免疫刺激剂作为PAMPs、DAMPs或其模拟物，可以与APCs上的PRRs相互作用，触发先天免疫反应，导致APCs的激活和成熟。成熟的APCs终止其吞噬抗原活性，并增强其呈递抗原和表达高水平共刺激信号和细胞因子的能力。这导致适应性免疫反应的启动和增强。此外，值得注意的是，不同类型的免疫刺激剂将通过不同的PRRs发出信号，并导致不同的细胞因子分泌，这是适应性免疫反应的主要决定因素（图4）。 图4 免疫刺激剂通过激活模式识别受体(PRRs)调节适应性免疫反应的简化图。不同类型的免疫刺激剂通过不同的PRRs发送信号，导致不同细胞因子的分泌，从而诱导不同的适应性免疫反应。免疫刺激剂通过靶向和激活a TLRs；b cGAS-STING；c CLRs；d 其他PRRs来诱导和调节适应性免疫反应。这张图是用BioRender（https://biorender.com/）创建的。 靶向TLRs途径。最初发现，免疫刺激剂通过与APCs上的TLRs相互作用来发挥其作用（图4）。作为佐剂的TLRs激动剂通过激活TLRs，增强抗原呈递、上调共刺激信号和细胞因子表达，最终增强适应性免疫反应，显示出有希望的结果。值得注意的是，不同类型的免疫刺激剂通过与不同的TLRs信号传导，介导不同的适应性免疫反应。总体而言，由于TLR1、TLR2、TLR4、TLR5和TLR6表达在细胞表面，它们主要识别微生物膜成分，如脂质、脂蛋白和蛋白质。因此，相应的免疫刺激剂激活APCs表面的TLRs通常会导致产生促炎细胞因子，如IL-1β、TNF-α和IL-6，并最终导致产生Th1或Th2型免疫反应。TLR3、TLR7、TLR8和TLR9是细胞内TLRs，它们在细胞内囊泡中表达并与核酸反应。这些细胞内TLRs被相应的免疫刺激剂激活通常会导致产生I型干扰素。I型干扰素可以促进Th1细胞的分化并调节其功能。此外，I型干扰素通过常规树突状细胞（DCs）促进抗原交叉呈递给CD8+ T细胞，并可能直接刺激CD8+ T细胞的增殖。免疫刺激剂通过TLRs发挥作用的具体机制如下：(1)与TLR2异源二聚体（TLR2/1或TLR2/6）结合的免疫刺激剂通过髓样分化初级反应88（MyD88）途径启动信号传导并激活NF-κB，从而诱导产生促炎细胞因子如IL12。IL-12参与将初始T细胞分化为Th1细胞。此外，靶向TLR2的免疫刺激剂还导致增强的细胞外信号调节激酶1/2（ERK1/2）信号传导，结果增强c-Fos蛋白的表达，这将抑制IL-12表达并增强IL-10表达。这推动初始T细胞极化为Th2型细胞。因此，靶向TLR2的免疫刺激剂主要诱导Th2型适应性免疫反应。(2)与TLR3结合的免疫刺激剂通过toll/白介素-1受体结构域包含的适配体诱导干扰素-β（TRIF）途径启动信号传导，激活干扰素调节因子3（IRF3）并刺激APCs产生I型干扰素。这最终导致Th1型反应和细胞毒性T淋巴细胞（CTLs）的产生。(3)与TLR4和TLR5结合的免疫刺激剂通过MyD88途径启动信号传导以激活NF-κB，这诱导促炎细胞因子分泌并推动初始T细胞向Th1型细胞极化。此外，值得注意的是，通过TLR4触发适应性免疫的免疫刺激剂也可以通过TRIF信号传导，导致IRF3的激活，从而产生少量I型干扰素。(4)靶向位于内质体的TLR7/8/9的免疫刺激剂通过MyD88途径激活NF-κB和干扰素调节因子7（IRF7），触发APCs产生促炎细胞因子和I型干扰素，并诱导强烈的Th1和CTLs反应。 靶向cGAS-STING途径。随着环鸟苷酸-腺苷酸合成酶-干扰素基因刺激因子（cGAS-STING）途径在协调先天和适应性免疫中独特作用的揭示，科学家们越来越有兴趣尝试将cGAS-STING途径的激动剂作为疫苗佐剂。cGAS是一种胞质DNA受体，可被双链DNA激活。cGAS激活后，将胞质腺苷酸和鸟苷酸环化成环鸟苷酸-腺苷酸（cGAMP）。随后，cGAMP锁定到STING二聚体的V形结合口袋中，引起构象变化、聚集和STING的激活。之后，NF-κB和IRF3将被激活，这反过来促进促炎细胞因子和I型干扰素的产生。I型干扰素如IFN-α/β可以诱导APCs的成熟，上调共刺激信号并增强其呈递或交叉呈递抗原的能力。因此，靶向cGAS-STING途径的免疫刺激剂不仅将初始T细胞极化为Th1型细胞，还促进CTLs的产生。靶向cGAS-STING的免疫刺激剂包括核苷酸小分子激动剂和非核苷酸小分子激动剂。其中，核苷酸小分子激动剂通常是基于环二核苷酸（CDNs）的天然配体分子，如环二鸟苷酸（c-di-GMP）、环二腺苷酸（c-di-AMP）、2’,3’-cGAMP和3’,3’-cGAMP。非核苷酸小分子激动剂的例子是DMXAA和CF501。此外，值得注意的是，胞质中的线粒体DNA（mtDNA）也可以被cGAS感知，从而激活STING途径。 靶向CLRs途径。C型凝集素受体（CLRs）是一个包括Dectin-1、Dectin-2、MINCLE、DC-SIGN、CD206、CD205等的超家族。CLRs主要定位在细胞膜上，作为抗原受体参与捕获和呈递抗原。具有碳水化合物结构的免疫刺激剂通常激活CLRs，随后诱导APCs启动内吞、处理和呈递抗原，以增强适应性免疫反应的发展。此外，一些免疫刺激剂可以激活CLRs，触发不同的信号传导途径，诱导特定细胞因子的表达，从而控制初始T细胞的极化方向。例如，β-葡聚糖通过Dectin-1的激活导致Syk激酶的磷酸化，进而激活NF-κB，导致制造促炎细胞因子IL12、IL-1β、IL6和IL23，从而诱导初始T细胞分化为Th1和Th17细胞。Th1型细胞诱导强烈的CTLs反应以及驱动B细胞中的免疫球蛋白转换为IgG2a。Th17效应细胞以产生IL-17、IL-17F和IL-22为特征，并通过招募中性粒细胞触发大规模炎症反应。免疫刺激剂激活Dectin-2和MINCLE以及DC-SIGN也可以导致NF-κB激活和促炎细胞因子的产生。然而，由于Dectin-2和MINCLE不具有免疫受体酪氨酸基激活基序（ITAMs），它们需要与携带ITAM的FcRγ结合，才能发生信号传导。值得注意的是，多糖配体对DEC-205和CD206的刺激通常偏向于诱导增强的吞噬作用和抗原呈递，而不是细胞内信号传导。 靶向其他PRRs。在后续研究中，科学家发现免疫刺激剂也可以激活许多其他PRRs，如核苷酸结合寡聚化结构域1（NOD1）、核苷酸结合寡聚化结构域2（NOD2）、NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3（NLRP3）、视黄酸诱导基因I（RIG-I）和黑素瘤分化相关基因5（MDA5）。NOD1、NOD2和NLRP3是核苷酸结合寡聚化结构域样受体（NLRs）家族的成员。佐剂通过激活它们将导致APCs上调MHC II并有助于增强抗原呈递。此外，这些NLRs的激活将导致产生促炎细胞因子，如IL-1β和IL-18，驱动初始T细胞偏向极化为Th2型细胞。 Muramyl dipeptide (MDP) 或完全弗伦德佐剂 (CFA) 可以激活NOD1和NOD2，随后刺激NF-κB的转录激活，产生IL1、IL18和IL33的前体。随后，在激活的NLRP3炎症体复合体存在下，caspase1将这些因子切割成其活性形式。NLRP3炎症体复合体由NLRP3蛋白、凋亡相关斑点蛋白（ASC）、cardinal和caspase1蛋白组成。总的来说，NOD1、NOD2和NLRP3的激活将导致主要产生Th2型的免疫反应。RIG-I和MDA5是视黄酸诱导基因I样受体（RLRs）家族的成员，主要识别RNA。大多数TLR3激动剂，如polyI:C，也会在APCs中激活MDA5。RIG-I和MDA5的激活导致IRF3和IRF7的激活，进而诱导I型干扰素的表达。因此，靶向这两个受体的免疫刺激剂最终偏向于导致Th1细胞和CTLs的产生。 2.2.递送系统的作用机制 递送系统被定义为装载抗原的载体材料，并增加APCs对抗原的摄取和呈递。换句话说，递送系统的主要功能是促进抗原呈递。抗原呈递过程涉及APCs对抗原的识别、摄取和内吞，然后由MHC在APCs表面装载和呈递。递送系统可以通过一种或多种方式增加APCs表面呈递的抗原信号。 延长抗原的生物可用性。递送系统通过(1)允许抗原持续释放，(2)形成免疫微环境，和(3)为抗原提供货物保护来实现延长抗原的生物可用性。延长的抗原生物可用性将确保有足够的抗原可供APCs使用。因此，这将导致更多的MHC-抗原肽信号产生。 递送系统可以通过持续释放抗原来延长免疫系统中抗原的生物可用性。例如，纳米乳液递送系统（例如，MF59、AS03）的作用机制之一被认为是持续的抗原释放。最近，一些正在研究的递送系统也被发现具有缓慢释放抗原的能力，如可注射水凝胶。可注射水凝胶允许APCs通过缓慢释放持续呈递抗原，这有助于生发中心B细胞经历多轮亲和力选择，最终导致产生更大量和高亲和力的抗体。值得注意的是，通过调整水凝胶网格的大小，可以控制疫苗成分在水凝胶中持续释放的时间，从而调节释放时间窗口。此外，由生物可降解的PLGA或聚醚酸聚合物制成的固体聚合物颗粒可以包裹抗原，并在几天到几个月的时间内缓慢释放亚单位抗原。我们也注意到，具有大孔结构的自组装支架也具有缓慢释放抗原的能力。不仅如此，自组装支架除了抗原外，还可以通过装载免疫刺激剂来释放炎症信号，并增强血清抗体水平和CTLs水平。总之，使用持续释放技术来延长抗原和佐剂在免疫系统中的暴露时间和生物可用性，可以提高适应性免疫反应的效力、持久性和质量。 此外，一些递送系统可以通过在注射部位形成抗原库/免疫微环境来实现更高的免疫激活。以这种方式工作的递送系统不仅延长了抗原在免疫系统中的保留时间，还招募了更多的免疫细胞渗透到注射部位，这将增加抗原的摄取并提供局部炎症线索以激活随后的适应性免疫反应。已证明能够产生炎症免疫微环境的递送系统显著延长了抗原的生物可用性，增加了抗原的摄取，招募了免疫细胞，并增强了抗体滴度和细胞免疫反应。渗透到注射部位的先天免疫细胞的浸润使得形成微环境的递送材料比单独使用持续释放技术制备的递送材料具有更大的免疫激活能力。为了使免疫细胞渗透到递送系统中，可以将一些细胞因子并入递送系统并缓慢释放，从而增加细胞迁移。最常用的细胞因子是粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）。最近，Sun等人开发了一种可注射的聚（己内酯）-聚（乙二醇）-聚（己内酯）热敏水凝胶，包裹GM-CSF和卵清蛋白，增加了注射部位DCs的招募并提高了抗原的摄取效率。 此外，封装一些免疫刺激剂如TLR激动剂也可以促进先天免疫细胞的招募和渗透。研究发现，一些自佐剂递送材料也可以促进免疫细胞的渗透。例如，介孔硅棒是一种自佐剂递送材料，可以激活NLRP3先天免疫途径。当注射到小鼠体内时，它增加了先天免疫细胞对注射部位的渗透并增强了免疫反应。 此外，递送系统还可以通过保护抗原（特别是DNA和mRNA）免受体内酶的分解，从而维持其生物活性来延长抗原的生物可用性。例如，mRNA抗原容易受到细胞外血清中RNA酶的降解。因此，它们需要被包裹在密封的载体中以避免酶促水解，并确保mRNA顺利递送到目标细胞。LNPs是一种被证明有效的mRNA递送系统，其基本功能之一是包裹mRNA并保护其免受降解RNA酶的侵害。 值得注意的是，由于佐剂具有多种机制，延长抗原的生物可用性只是佐剂作用机制之一，它占所有作用机制的比例需要仔细研究。例如，通过形成“抗原库”来延长抗原的保留和生物可用性被认为是铝佐剂的关键作用机制。然而，随着研究的深入，一些研究人员发现，在铝佐剂给药后移除“抗原库”并没有显著减少抗原特异性T和B细胞反应的产生。这意味着形成抗原库以保留抗原的机制可能不是铝佐剂的关键作用机制，应该全面准确地理解佐剂的作用机制，以更合理地使用佐剂和开发新型佐剂。 APCs靶向。递送系统可以通过以下两种方法靶向APCs，并使APCs有效摄取抗原（图5）。增加抗原摄取量，反过来又增加了APCs表面呈递的MHC-抗原肽的数量，从而导致更强的适应性免疫反应。 图5 递送系统的的作用机制图。递送系统通过以下方式促进增强的抗原呈递或抗原交叉呈递，以增强适应性免疫反应：a 延长抗原的生物利用度；b 将抗原靶向到抗原呈递细胞(APCs)；c 直接将抗原运送到淋巴结；d 促进内质网逃逸。这张图是用BioRender（https://biorender.com/）创建的。 递送系统的第一种方法是通过模仿病原体的尺寸和空间结构来促进APCs对抗原的摄取。由于病毒和细菌是纳米到微米大小的颗粒，免疫系统已经演化出识别和响应颗粒性抗原的能力。微米或纳米材料已被用于递送抗原，增加了抗原的大小，从而在一定程度上改善了APCs的摄取。例如，与可溶性抗原相比，用脂质纳米颗粒封装抗原可以提高APCs对抗原的识别和内吞作用，从而增加抗原呈递并诱导产生更高幅度和更高亲和力的抗体。另一个例子是，装载H5N1流感抗原的新型水凝胶微粒递送系统可以改善体液反应并增强T细胞激活。这一现象的原因之一是水凝胶微粒增加了抗原的大小，进而提高了APCs对抗原的识别和摄取。此外，高度有序和重复的空间结构是病原体的固有特征，免疫系统已经演化出对这类结构高度敏感的识别和响应能力。自组装蛋白纳米颗粒和其他多价颗粒递送系统通过模仿病原体的高度有序和重复的空间结构，向APCs展示多价抗原，增加了APCs摄取抗原的概率。研究发现，即使在没有其他免疫刺激剂补充的情况下，这些递送系统也能引发强烈的体液和细胞免疫反应。值得注意的是，递送系统的有序和重复的空间结构非常有利于B细胞受体（BCRs）的共聚集，这可以导致B细胞的强烈激活，最终产生高亲和力抗体和记忆B细胞。 此外，递送系统通过直接靶向APCs上特定的受体（例如，Fc受体、CLRs）来促进更有效的抗原摄取。许多研究表明，靶向APCs上Fc受体的递送系统可以选择性地增强体外和体内的抗原摄取和细胞免疫。此外，CLRs是一类特定于DCs亚群的PRRs。这个家族的成员包括DEC-205、DC-SIGN和甘露糖受体等。使用CLRs配体（通常是碳水化合物）来修饰递送系统将导致抗原更直接地靶向特定的DCs，从而增强抗原摄取。例如，甘露糖修饰的聚合物用于递送黑色素瘤抗原肽，在黑色素瘤模型中强烈诱导预防性和治疗性抗肿瘤免疫反应。另一个例子是CDX-1401，它是一种疫苗，由特异性结合DEC-205的单克隆抗体与全长肿瘤抗原NY-ESO-1融合而成。研究表明，这种疫苗通过特异性靶向DEC-205受体的DCs，增加了抗原的摄取和呈递，从而增强了抗肿瘤效果。它在与其他药物联合使用时也显示出了有希望的临床价值。 考虑到与淋巴结相关的不同亚群的DCs可能在诱导不同类型的T细胞反应中具有不同的功能，递送系统的靶向免疫细胞群体（尤其是纳米颗粒）是疫苗递送系统开发中的关键考虑因素。从上述对APCs靶向的描述中可以看出，纳米颗粒递送系统的表面可以被特异性修饰以主动靶向特定的细胞群体。首先，纳米颗粒可以通过与功能化配体的耦合来靶向特定的细胞群体。例如，通过将针对CD169的抗体耦合到纳米颗粒的表面，纳米颗粒可以靶向至被膜下窦巨噬细胞。其次，调整纳米颗粒的大小也是靶向特定细胞群体的策略。当纳米颗粒被设计为保持在50-100纳米时，它们将优先靶向滤泡树突状细胞（FDCs）并被保留在FDCs中。这对于产生高亲和力和持久的抗体免疫反应很重要。此外，增加纳米颗粒的抗原价和纳米颗粒的糖基化修饰也将使纳米颗粒优先靶向FDCs。纳米颗粒还可以被设计为展示多价抗原蛋白以靶向和激活B细胞。总之，这些方法允许纳米颗粒主动靶向不同的细胞群体。 淋巴结迁移。大量的先天免疫细胞和淋巴细胞在淋巴结中积累，淋巴结是初始免疫反应的场所。因此，淋巴结是递送系统的关键靶标。一些递送系统可以直接促进抗原迁移到淋巴结，从而增加抗原在淋巴结中遇到APCs的机会，导致APCs摄取和呈递更多的抗原，增加抗原呈递信号。递送系统以两种方式直接将抗原运输到淋巴结。第一种方法是，递送系统通过被动扩散直接运输到淋巴结。具有适当尺寸和表面特性（如电荷和疏水性）的递送系统可以通过被动扩散进入传入淋巴管，随后进入淋巴结。研究表明，最佳尺寸在5到100纳米之间。如果递送系统的尺寸太小，它倾向于进入毛细血管。然而，如果递送载体佐剂的尺寸太大，它可能无法通过传入淋巴管内皮细胞之间的间隙，因此无法进入传入淋巴管。此外，在这种方法中，递送系统最好带净负电荷，而不是净正电荷，因为传入淋巴管的间质基质主要由胶原纤维和带负电荷的糖胺聚糖组成。此外，递送系统的亲水性影响其在传入淋巴管之间运输疫苗的效率。例如，与非PEG修饰颗粒相比，PEG修饰的50纳米聚合物在大鼠皮下注射后在大鼠淋巴结中的颗粒积累更多。 第二种方法是所谓的白蛋白搭车。由于内源性白蛋白在淋巴系统中循环，如果抗原能够与内源性白蛋白结合，它们就可以通过搭乘白蛋白列车被运输到淋巴结。目前，我们知道白蛋白是脂肪酸分子的转运蛋白，可以捕获并结合一些脂质分子。利用这一机制，研究人员设计了一种带有亲脂尾部的肿瘤肽疫苗。实验结果表明，疫苗与白蛋白结合，并在淋巴结中大量积累，导致T细胞产生增加30倍，并在小鼠注射后显著增强抗肿瘤效果。另一个例子是1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺（DSPE），它已被证明可以与内源性白蛋白高效结合，具有高亲和力。秦等人构建了一个基于DSPE的递送系统，装载OVA抗原肽和聚I:C，使疫苗成分能够直接靶向淋巴结，并在淋巴结中大量积累，导致体内产生强烈的CD8+ T细胞反应，从而在小鼠中实现更有效的治疗和延长中位生存时间。此外，内源性白蛋白还可以与一些染料结合，如Evans蓝染料。利用这一特性，朱等人使用临床安全的Evans蓝衍生物与抗原耦合，发现疫苗有效地与白蛋白结合，并随白蛋白的回流被输送到淋巴结。通过体内实验发现，疫苗显著抑制了小鼠原发性或转移性肿瘤的生长。 促进抗原交叉呈递。抗原交叉呈递是外源性抗原通过MHC I分子呈递给CD8+ T细胞的过程。这对于针对病毒感染疫苗和癌症疫苗的接种至关重要。然而，在正常情况下，外源性抗原通常只被APCs内吞并由MHC II分子呈递给CD4+ T细胞，而不会发生任何交叉呈递。已经开发了几种递送系统，通过促进抗原从内体或溶酶体逃逸，然后由MHC I分子装载，从而实现抗原交叉呈递。这些递送系统主要通过三种方式实现这一目标。 第一种是质子海绵效应。当一些带有可质子化的胺基的阳离子聚合物或脂质递送系统被APCs内吞时，它们会吸收大量质子以缓冲APCs内体或溶酶体的酸性环境。这导致大量氯离子和水分从细胞质流入内体或溶酶体，引起内体膨胀和破裂。这一过程导致抗原释放到细胞质中，促进了MHC I分子的抗原交叉呈递。例如，在内体酸性条件下，聚乙烯亚胺（PEI）通过其可质子化的氨基吸收质子，导致内体膨胀和破裂。有研究报告称，用PEI修饰的氢氧化铝纳米颗粒显著增加了抗原交叉呈递。今天，其他阳离子聚合物和阳离子脂质体也被发现可以通过质子海绵效应增加抗原交叉呈递。 第二种，一些递送系统通过与内体/溶酶体膜融合或结合来破坏膜的稳定性，从而将抗原释放到细胞质中。通过Pickering乳液（PAPE）颗粒的阳离子颗粒铝佐剂在传递SARS-CoV-2 RBD疫苗抗原时，与铝佐剂组相比，诱导了3倍多的IFN-γ+ T细胞。这表明这种颗粒具有强大的激活细胞免疫反应的能力。这部分是因为它能够与内体/溶酶体膜结合，破坏内体/溶酶体膜的稳定性，导致抗原释放到细胞质中，并呈递给CD8+ T细胞。 第三种方法是光化学内化释放技术。这种技术提供了一种新兴的技术，通过使用光敏剂基于光诱导破坏内体膜，将内吞物质路由到细胞质中。具体来说，光敏剂被纳入递送系统中与抗原一起递送，随后光敏剂在暴露于特定光源后被激发形成单线态氧，这导致脂质过氧化和内体膜的破坏，从而将抗原释放到细胞质中。在一项研究中，Ji等人使用基于精氨酸和苯丙氨酸的聚酯酰胺作为原料制备阳离子纳米颗粒，这些纳米颗粒随后被进一步用于与光敏剂AlPcS2a形成静电复合物并递送抗原。当在660纳米光源下应用时，它显著促进了抗原从内体/溶酶体逃逸到细胞质，并增强了CD8+ T细胞介导的免疫反应。 3.经典佐剂平台 氢氧化铝佐剂、MF59、AS01、AS03、AS04和CpG ODN 1018是人类疫苗的经典佐剂。它们已被广泛批准用于多种疫苗，并用于增加疫苗抗体滴度和增强细胞免疫反应。 3.1.氢氧化铝佐剂 氢氧化铝佐剂是第一个被批准用于人类疫苗的佐剂。在许可疫苗中常用的两种基于铝的佐剂是氢氧化铝和磷酸铝。氢氧化铝佐剂通过促进Th2细胞反应增强IgG1和IgE抗体的产生。然而，氢氧化铝佐剂的作用机制复杂，学术界仍存在持续的争论。目前有两个方面得到了广泛认可。首先，氢氧化铝佐剂作为递送系统与抗原紧密结合并持续释放抗原，从而延长抗原的生物可用性并增加抗原呈递。其次，氢氧化铝佐剂也可以作为免疫刺激剂，诱导DAMPs的产生，从而激活先天免疫途径的PRRs，导致产生IL-1β等细胞因子和Th2型免疫反应。近年来，一些研究表明，由注射部位的氢氧化铝佐剂诱导的宿主细胞死亡释放的宿主DNA或尿酸可作为内源性危险信号。这些内源性危险信号可以作为DAMPs诱导先天免疫途径的激活。关于氢氧化铝佐剂靶向的PRR，一些科学家认为是NLRP3，而一些人持怀疑态度。然而，这并不妨碍氢氧化铝佐剂成为疫苗行业的佐剂首选，因为其公认的安全性和可靠性。含铝佐剂广泛用于预防和治疗各种疾病，包括白喉、破伤风、脑膜炎和乙型肝炎病毒（HBV）疫苗，已获食品药品监督管理局（FDA）批准。此外，铝也是新临床开发疫苗的候选佐剂，如SARS-CoV-2疫苗。然而，氢氧化铝佐剂也有一些缺点，包括难以诱导强烈的细胞免疫反应和可能的不良反应（红斑、过敏反应）。出于这些原因，通过改进配方或将其制备为纳米铝佐剂，可以使氢氧化铝佐剂更有效。 3.2.乳液佐剂 MF59和AS03都是经典的水包油乳液佐剂。MF59由角鲨烯、Tween 80和Span 85组成。MF59作为流感疫苗的佐剂于1997年获得许可，成为第一个被批准用于人类疫苗的非铝佐剂。MF59乳液具有抗原递送和免疫刺激的双重功能。MF59可以作为乳液递送系统，与抗原共递送时，它可以延长抗原与免疫系统的相互作用时间，并通过在淋巴结中缓慢释放抗原来增加抗原呈递。这导致APCs表面呈递更多的抗原信号，因此，身体对抗原产生更强的特异性免疫反应。此外，MF59还作为免疫刺激剂。MF59可以靶向特定的PRRs并通过诱导产生内源性危险信号来激活先天免疫细胞。MF59在肌肉中的给药激活了巨噬细胞和DCs等先天免疫细胞，并促进了CCL2、CCL4、CCL5和CXCL8等趋化因子的产生。这些趋化因子反过来招募更多的先天免疫细胞到注射部位以进一步放大免疫反应，并促进这些招募的先天免疫细胞迁移到引流淋巴结以激活B细胞和T细胞。然而，值得注意的是，MF59的确切靶向PRR仍然不清楚，除了MF59可能通过NLRP3独立的ASC激活途径和TLR独立的MyD88激活途径发挥作用。（图6） 图6 经典佐剂主要信号通路的简化图。这张图是用BioRender（https://biorender.com/）创建的。 总之，使用MF59佐剂的疫苗接种会导致体内偏向于Th2的免疫反应，并弱化Th1反应的诱导。目前，MF59已被广泛用于多种人类疫苗，并显示出良好的安全性和有效性。AS03是另一种水包油乳液佐剂，由α-生育酚、角鲨烯和Tween 80组成。AS03和MF59的佐剂效果相似。首先，它作为抗原递送系统，通过缓慢释放来增强APCs表面的抗原信号呈递。其次，AS03也具有免疫刺激作用，因为它也含有角鲨烯。和MF59一样，AS03通过NLRP3非依赖性ASC激活途径和TLR非依赖性MyD88激活途径发挥免疫刺激作用。此外，AS03还包含α-生育酚作为额外的免疫刺激成分。研究表明，α-生育酚参与调节某些趋化因子和细胞因子的表达，如CCL2、CCL3、白细胞介素6和CXCL1，这些因子增强APCs对抗原的摄取，并增加引流淋巴结处募集的先天免疫细胞数量。像MF59一样，AS03通常主要诱导偏向于Th2的免疫反应，对Th1反应的诱导较弱。AS03在2009年H1N1大流行期间被欧盟许可用于流感疫苗（Pandemrix, TM,GSK）。随后，在2013年，AS03被美国FDA许可用于H5N1禽流感疫苗，并显示出令人满意的安全性、反应原性和免疫原性。AS03主要用于各种流感疫苗，以增加抗体的滴度和持久性。最近，AS03在COVID-19疫苗（NCT04450004, NCT04405908）的开发中也显示出良好的临床效益。 3.3.基于TLR激动剂分子的佐剂 AS04和CpG ODN 1018都是经典的基于TLR激动剂分子的佐剂。AS04是通过氢氧化铝吸附TLR4激动剂分子制备的。由于AS04包含氢氧化铝佐剂，它也具有免疫刺激和递送抗原的功能。然而，AS04的免疫刺激功能比氢氧化铝佐剂更强。这是因为AS04包含一种更强效的免疫刺激分子，称为单磷酸脂质A（MPLA）。MPLA是从LPS中分离出的低毒性衍生物，可以特异性激活APCs上的TLR4，导致NK-κB激活和促炎细胞因子的表达，从而产生更强的Th1细胞反应。此外，当比较补充AS04的疫苗与仅补充氢氧化铝佐剂的疫苗时，发现补充AS04的疫苗诱导了更高水平的抗体。这证明TLR4激动剂MPLA在AS04中发挥重要作用。总的来说，AS04比氢氧化铝佐剂产生更强的抗体反应和Th1细胞反应，并诱导更平衡的Th1/Th2免疫反应。AS04目前主要用于人类乳头瘤病毒（HPV）疫苗（Cervarix）和乙型肝炎病毒（HBV）疫苗（Fendrix），以增加抗体产生和激活抗原特异性T细胞。 CpG ODN 1018是一种合成的单链DNA分子，已被广泛研究作为TLR激动剂。CpG ODN 1018特异性激活TLR9，导致TRF7激活，进而导致促炎细胞因子和I型干扰素的产生，最终导致强烈的Th1型细胞反应和细胞毒性T细胞的产生。这使得它比氢氧化铝佐剂产生更好的细胞免疫反应。CpG ODN 1018最初被批准用于乙型肝炎病毒（HBV）疫苗。CpG ODN 1018目前正在临床试验中作为COVID-19疫苗的潜在佐剂进行评估。最近，一种用CpG ODN 1018佐剂的COVID-19疫苗（SCB-2019）已被评估用于紧急使用。 3.4.颗粒佐剂系统 AS01是一种经典的颗粒佐剂系统，是一种含有免疫刺激剂MPLA和从Quillaja Saponaria树皮中提取的活性成分QS-21的脂质体佐剂。AS01具有抗原呈递和免疫刺激的双重功能。AS01的抗原呈递功能由脂质体执行。脂质体是一种中空的磷脂双层人工膜，可用于封装和递送抗原。脂质体可以保护抗原免受降解并延长其生物可用性，从而使APCs能够捕获更多的抗原信号。AS01的免疫刺激功能由MPLA和QS-21贡献。MPLA通过TLR4激活先天免疫系统，导致Th1型反应增加。QS-21激活APCs中的NLRP3，随后激活caspase 1以促进细胞因子IL1β、IL18和IL33的活性形式的产生。此外，QS-21还被发现可以促进内体逃逸并促进交叉呈递。总的来说，这两种免疫刺激成分协同作用，使AS01诱导以Th1为主的免疫反应，并促进CTLs的产生。AS01是已许可的疟疾和带状疱疹疫苗的一部分，促进抗原特异性抗体产生并增强细胞免疫反应。最近，AS01也已应用于新型结核肽疫苗（M72/AS01E）的开发，并已显示出对健康成年人的安全性、有效性和预防结核病的前景。 总之，佐剂是疫苗的重要组成部分。经典佐剂为其他新疫苗的开发提供了相对可翻译的平台。这些佐剂可以优先选择用于新疫苗的临床试验，以便快速获得市场批准。然而，这些佐剂也揭示了一些问题。例如，它们增强疫苗免疫的能力较弱，不提供长期保护性免疫，并且在老年人群中效果较差。此外，大多数这些批准的佐剂只能诱导抗体反应，并且诱导CD8+ T细胞介导的细胞免疫的能力较弱，这对于针对病毒感染性疾病和癌症疫苗至关重要。最后，大多数许可的佐剂的作用机制仍然不清楚，这可能导致这些佐剂的不当使用和不可控制的副作用。因此，需要新型佐剂来解决这些问题。 4.正在研究的佐剂平台 由于佐剂在疫苗中的突出作用，近年来佐剂科学经历了快速发展。一些正在研究的免疫刺激剂和递送系统显示出良好的佐剂效果。接下来，我们将总结和描述它们。 4.1.正在研究的免疫刺激剂平台 近年来，随着对佐剂的深入研究，一些正在研究的免疫刺激剂显示出良好的佐剂效果。在本节中，我们将总结和描述这些正在研究的免疫刺激剂的作用机制、特性和应用进展。 合成双链RNA（dsRNAs）。合成双链RNA（dsRNAs）能够靶向并激活APCs上的TLR3和MDA5，导致产生IL-12等促炎细胞因子和I型干扰素，促进产生强烈的偏向Th1的免疫反应和CTLs。Poly-I:C及其改良变体Poly-ICLC是最研究的合成dsRNA免疫刺激剂。体外研究表明，poly-I:C和poly-ICLC诱导人外周血单核细胞衍生的DCs成熟，导致分泌IFN-β和促炎细胞因子IL-6和IL-12，从而促进外源性抗原与CD8+ T细胞的交叉呈递，并触发偏向Th1的免疫反应。临床前和临床研究均表明，poly-I:C和poly-ICLC是增强抗体产生和CD8+ T细胞免疫反应的有前景的佐剂。在人类的一项测试显示，将poly-ICLC与靶向DC的疫苗结合使用，诱导了与活病毒疫苗相似的先天免疫反应，进一步强调了poly-I:C/poly-ICLC作为疫苗佐剂的有效性。此外，我们注意到poly-I:C和poly-ICLC在临床上用于肽疫苗、DC疫苗和全细胞疫苗，主要用于各种癌症疫苗。将poly-I:C或poly-ICLC添加到癌症疫苗中，增强了疫苗诱导的抗肿瘤T细胞和NK细胞反应，从而有助于肿瘤的消退或根除。然而，值得注意的是，poly-I:C/poly-ICLC可能会有剂量依赖性全身发热和凝血异常等副作用，除了其触发强大免疫反应的功能外。因此，应考虑合理的递送系统来保护它免受降解，并将更多的poly-I:C/poly-ICLC靶向到APCs，以确保尽可能低的剂量激活APCs并减少副作用。 GLA及其衍生物。葡萄糖基脂质A（GLA）是一种合成的LPS模拟物，是MPLA的替代品。GLA可以通过激活APCs上的TLR4在体内诱导Th1型免疫反应。为了增强GLA的免疫效果，通常将其制备成制剂使用。GLA通常被制备成葡萄糖基脂质A-水性纳米悬浮液（GLA-AF）、葡萄糖基脂质A-稳定乳液（GLA-SE）、葡萄糖基脂质A-脂质体（GLA-LS）和葡萄糖基脂质A-氢氧化铝（GLA-alum）。其中，GLA-SE在临床前和临床研究中研究最多。当Clegg等人使用GLA-SE作为H5N1亚单位疫苗的佐剂时，他们发现它诱导产生了抗原特异性Th1型CD4+ T细胞和更高滴度的Th1型抗体，并保护小鼠和雪貂免受H5N1病毒挑战。在非人灵长类动物中，GLA-SE作为流感疫苗佐剂使用时诱导产生更多的Th1型细胞因子，并诱导产生针对多种流感病毒变种的中和抗体，大大提高了疫苗的保护性免疫效果。除了改善疫苗的体液免疫反应外，在一项II期临床试验中，当使用GLA-SE作为H5N1流感疫苗的佐剂时，显示出剂量节省效应，这在大流行性流感情况下特别有益。在几项临床试验中，当GLA-SE作为TB疫苗的佐剂并针对ID93重组蛋白进行测试时，疫苗被发现诱导产生高滴度的抗原特异性抗体产生和CD4+ T细胞反应，在接种人群中展现出良好的安全性和免疫原性。此外，GLA-SE已在临床上作为疟疾疫苗、肿瘤疫苗、HIV疫苗、内脏利什曼病疫苗和血吸虫病疫苗的疫苗佐剂进行评估。这些临床试验似乎表明，GLA-SE是一种有效且安全的疫苗佐剂，有潜力成为下一代疫苗佐剂。GLA-AF是GLA家族中另一个研究得很好的产品。GLA-AF也已在临床前和临床测试中作为几种疫苗的佐剂候选进行了评估。 咪唑喹啉类。咪唑喹啉类能够激活TLR 7/8，导致NF-κB和IRF7激活，促进产生促炎细胞因子和I型干扰素，这将导致强烈的Th1细胞和CTLs产生。伊马克莫德（R837）、雷西莫德（R848）和3M-052（也称为特拉托利莫德）是作为佐剂在临床前和临床环境中研究最多的咪唑喹啉类。大量证据表明，R837在黑色素瘤、HPV、乳腺癌和T细胞淋巴瘤疫苗中表现出强大的佐剂作用。与R848结合的病毒疫苗和肿瘤疫苗显示出更强的体液反应和CD8+ T细胞免疫反应。 3M-052是一种结构类似于R848的咪唑喹啉化合物。3M-052的18-C脂肪酸链赋予了化合物增强的疏水性，从而提高了免疫部位的生物利用度并降低了系统传播的可能性。此外，这种脂化使3M-052更容易纳入基于脂质的制剂中，如乳液或脂质体。用PLGA纳米颗粒或氢氧化铝包裹的3M-052配制的HIV疫苗已被证明能诱导高水平和持续的抗体反应和T细胞反应。基于氢氧化铝-3M-052佐剂的HIV疫苗已在人类I期临床试验中进行了研究。此外，3M-052也用于灭活SARS-CoV-2疫苗。印度III期临床试验的中期结果显示，该疫苗总体估计有效率为77.8%，表明该疫苗耐受性良好。COVAXIN目前已被世界卫生组织（WHO）批准紧急使用。 这些咪唑喹啉类作为疫苗佐剂的使用增强了免疫效果，但也存在一些不足。具体来说，它们经常从注射部位系统扩散，从而远离抗原，降低效果，并诱导系统性副作用。因此，这些咪唑喹啉需要与合成聚合物支架、纳米凝胶、基于脂质的纳米颗粒或其他递送材料结合，以增强其免疫效果并减少副作用。 CpG ODNs。CpG ODNs是合成的单链DNA分子，作为TLR9激动剂已得到广泛研究。其中，最常用作疫苗佐剂的是CpG ODN 1018、CpG ODN 7909和IC31。它们可以导致TRF7的转录激活，进而导致细胞因子IL-12和I型干扰素的产生，最终诱导强烈的Th1型细胞反应和CTLs产生。CpG ODN 1018是在临床前和临床试验中研究最多的CpG ODN，并在前一节中有所描述。除了CpG ODN 1018，CpG ODN 7909是研究最多的CpG ODN。当CpG ODN 7909添加到HBV疫苗中时，CpG ODN 7909在健康人群中诱导出更显著和快速的HBsAg特异性体液反应。CpG ODN 7909还可以改善HIV阳性患者对疫苗的反应率，展示了与CpG ODN 7909配制的疫苗在提高免疫受损个体疫苗反应率方面的潜力。一项随机、双盲对照试验测试了CpG ODN 7909作为HBV疫苗（Engerix-B）佐剂的免疫刺激效果。试验结果表明，添加CpG ODN 7909实现了快速、更高和持续的血清保护，并增加了与单独Engerix-B相比的HBV特异性Th反应。除了与HBV的使用外，CpG ODN 7909(表1, NCT00889616)还用于疟疾疫苗。一项基于蛋白质的疟疾疫苗BSAM2的I期临床试验显示，添加CpG ODN 7909的剂量节省效应。这一特性在资源匮乏的环境中特别有价值。 IC31是TLR9的另一种激动剂，它包含CpG ODN和带正电的抗菌肽成分。它通过TLR9/MyD88依赖途径信号细胞和体液免疫反应。此外，IC31的两个组分之间通过离子和疏水相互作用形成的稳定复合物可以在注射部位形成抗原库，提供抗原的缓慢释放并延长抗原的生物可用性。IC31可以增加APCs的抗原呈递，并显著提高CpG ODN的免疫效果。基于小鼠的研究表明，IC31有助于诱导强大的抗原特异性CTLs和强烈的抗原特异性体液反应。IC31已作为各种亚单位疫苗的候选佐剂在临床前和临床试验中得到广泛评估。结果表明，IC31是一种有效的疫苗佐剂，具有临床转化的潜力。 环二核苷酸（CDNs）。CDNs能够靶向并激活cGAS-STING途径，导致IRF3和NF-κB的激活，诱导产生I型干扰素和促炎细胞因子。I型干扰素选择性刺激抗原交叉呈递并动员CD8+ T细胞。因此，CDNs产生强烈的Th1型细胞反应和CTLs反应。CDNs包括天然CDNs和合成CDNs。天然CDNs包括2',3'-cGAMP、3',3'-cGAMP、c-di-GMP和c-di-AMP，它们是细菌和哺乳动物的第二信使，具有强大的免疫调节功能。基于天然CDNs的佐剂已在多种疫苗中得到评估，并显示出有希望的结果。例如，当2',3'-cGAMP被包裹在肺表面活性剂模拟脂质体中时，它增强了H1N1流感疫苗诱导的体液和CD8+ T细胞反应，并在小鼠和雪貂中诱导了对异型病毒的长期交叉保护免疫反应。Junkins等人将3'3'-cGAMP包裹在酸敏感的乙醛缩聚右旋糖（Ace-DEX）聚合物颗粒中，并与流感疫苗一起给小鼠注射。测试结果表明，与常规氢氧化铝疫苗组相比，抗体滴度高出60至600倍，并且未观察到明显的毒性效应。Lin等人将c-di-GMP包裹在PLGA中，并将MERS疫苗抗原外部耦合形成纳米疫苗。这种疫苗不仅触发了有效的中和抗体和抗原特异性T细胞反应，而且还优先靶向引流淋巴结，产生局部免疫并减少系统反应。当Ebensen将c-di-AMP作为H5N1流感疫苗的粘膜佐剂时，发现它能有效诱导小鼠对H5N1流感的保护性免疫。c-di-AMP作为HPV疫苗佐剂的I期临床试验目前正在进行中。 由于天然CDNs的半衰期短和APCs的摄取效率低，一些具有化学修饰的合成CDNs应运而生，以增强其免疫效果，如ADU S100、MK-1454、BMS-986301、SB-11285、IMSA-101。然而，这些合成CDNs作为疫苗佐剂的具体应用实例尚无。值得注意的是，由于这些合成CDNs在临床前和临床试验中显示出显著增强机体免疫反应的能力，我们相信使用这些合成CDNs作为疫苗佐剂的愿望很快就会实现。 此外，值得注意的是，随着纳米技术的出现，基于纳米颗粒的递送系统，如脂质体、乳液、类病毒颗粒（VLPs）和可生物降解聚合物，已受到显著关注。它们可以持续释放货物并改善货物的生物可用性。因此，使用纳米颗粒包裹CDNs被视为提高体内CDNs利用效率的策略。 代谢佐剂。近年来，一些靶向代谢途径的小分子调节剂被发现是新型疫苗佐剂。甲羟戊酸途径是各种细胞过程的核心代谢途径，包括胆固醇生物合成和蛋白质翻译后香叶基化。研究人员发现，亲脂性他汀类药物和合理设计的双膦酸盐可以通过靶向甲羟戊酸途径中的酶抑制下游代谢产物香叶基焦磷酸（GGPP）的形成。这一结果导致APCs中小型GTPases（例如Rab5）的香叶基化受阻，减缓了抗原从内体到溶酶体的运输并防止了抗原的快速降解。这延长了抗原保留时间，从而增强了抗原呈递。这些靶向甲羟戊酸途径的小分子抑制剂在增加抗体滴度和增强小鼠和猕猴的细胞免疫反应中显示出佐剂效果。 此外，最近的研究发现，雷帕霉素（mTOR）复合体，作为中心代谢调节因子，在调节免疫细胞中起着重要作用。首先，mTOR复合体可以调节浆细胞样DCs中I型干扰素的分泌。抑制mTOR复合体会严重减少产生的干扰素α。此外，mTOR复合体是效应T细胞扩增和生发中心B细胞反应产生的必需调节因子。除了mTOR，氨基酸传感器一般控制非压抑性2（GCN2）也在调节DCs等免疫细胞中发挥作用。研究表明，GCN2的激活导致DCs的自噬增强，从而增强了抗原呈递。这些结果表明，细胞代谢途径的酶或调节剂可能是设计和开发新型佐剂的潜在靶标。 锰佐剂及其衍生物。最近，锰（Mn）及其衍生物被发现具有潜在的佐剂活性。它们作为cGAS的激活剂，直接激活cGAS并诱导非规范的催化合成2'3'-cGAMP。通过这种方式，锰激活cGAS-STING先天免疫途径，诱导产生I型干扰素，增强抗原呈递和交叉呈递，促进抗体产生并增加CD8+ T细胞免疫反应的产生。据报道，Mn2+诱导的小鼠骨髓来源的DCs产生大量IFNβ和IFNα，并在体外实验中导致共刺激分子（例如CD80和CD86）和趋化因子（例如CCL2和CCL3）的显著上调。这表明Mn2+具有诱导DCs成熟和增强抗原呈递的佐剂活性。为了进一步验证其佐剂活性，研究人员将含有Mn2+的溶液与抗原一起注射到小鼠体内，发现它导致抗体滴度增加。为了防止Mn2+在溶液中聚集并失去佐剂活性，研究人员开发了一系列基于Mn2+的纳米佐剂来稳定Mn2+的佐剂活性。 例如，纳米级锰果冻（MnJ），它不仅具有作为免疫刺激剂激活cGAS-STING途径并诱导产生I型干扰素的能力，而且还作为递送系统携带抗原，从而产生强烈的体液和细胞反应。当通过鼻腔给药时，MnJ还作为粘膜佐剂诱导高水平的IgA抗体。王等人开发了另一种名为MnARK的锰佐剂。他们发现，即使在抗原剂量低5倍且注射次数减少的情况下，用含有MnARK佐剂的RBD疫苗接种的小鼠与用含有氢氧化铝佐剂的RBD疫苗接种的小鼠相比，显示出更大的中和假病毒（约270倍）和活冠状病毒（8倍）的感染能力。孙等人使用化学工程策略制造了一种基于Mn2+的纳米锰佐剂，称为nanoMn。以nanoMn为佐剂的冠状病毒疫苗在体内诱导了强烈的CD8+ T细胞免疫反应，并显示出良好的安全性。此外，一些其他基于Mn2+的纳米佐剂也显示出激活cGAS-STING途径和改善疫苗免疫反应的效果。这些结果表明，锰作为新型疫苗佐剂的开发具有巨大潜力。 许多具有不同特性的免疫刺激剂已在临床前和临床试验中得到评估。总体而言，靶向TLRs的免疫刺激剂在临床前和临床研究中仍然是最受欢迎的。另一方面，将多种PRRs激动剂结合起来，并将其配制成水包油乳液或使用其他递送系统进行装载，以增强其靶向APCs(NCT02126579, NCT01585350, NCT01008527, NCT02126579)的趋势日益增加。 4.2.正在调查的交付系统平台 近年来，随着工程材料科学的发展，基于工程材料的多种疫苗递送系统已经被开发出来。新型水包油纳米乳液、脂质纳米颗粒(LNPs)、聚合物纳米颗粒、类病毒颗粒(VLPs)、笼状蛋白纳米颗粒和无机纳米载体是一些重要的递送系统平台。不同类型的递送系统具有不同的机制和物理化学特性，相应地影响疫苗接种的效果。在这里，我们总结并描述了这些递送系统平台的机制、特性和应用。 新型水包油纳米乳液。Montanide ISA 51和Montanide ISA 720是两种在临床试验中测试的新型水包油乳液递送系统。Montanide ISA 51是用矿物油和甘露单油酸酯乳化的，而Montanide ISA 720是用非矿物油和甘露单油酸酯乳化的。此外，它们具有不同的油水比。这两种佐剂的作用机制是形成抗原库和缓慢释放抗原，以延长抗原的生物利用度。临床前和临床测试结果表明，Montanide ISA 51和Montanide ISA 720佐剂增强了血清抗体的产生和细胞毒性T细胞(CTLs)的产生。目前，Montanide ISA 51和Montanide ISA 720正在作为流感、疟疾、黑色素瘤和其他癌症疫苗的佐剂在临床试验中进行评估。此外，Montanide ISA 51在古巴获得了治疗性肺癌疫苗的许可。我们注意到，Montanide ISA 51和Montanide ISA 720通常用作乳化免疫刺激佐剂，以增强免疫刺激剂的效力。 脂质纳米颗粒(LNPs)。LNPs是一种多功能、非病毒性的纳米级脂质囊泡递送系统，由离子化脂质、磷脂、胆固醇和聚乙二醇修饰的脂质组成。离子化脂质是LNPs的主要成分。磷脂和胆固醇有助于LNPs的结构完整性，而聚乙二醇修饰有助于维持LNPs的稳定性。LNPs的作用机制主要包括(1)为抗原提供有效的货物保护并延长其生物利用度；(2)增加抗原的粒径以针对抗原呈递细胞(APCs)并促进其被APCs摄取；(3)通过膜融合促进抗原从内质网逃逸，从而引发CD8+ T细胞免疫反应。经过多年的研究，LNPs已被用于各种疫苗的递送，并显示出强烈增强体液和细胞免疫反应的能力。Alameh及其同事发现，LNPs通过诱导强大的T滤泡辅助细胞、生发中心B细胞、长寿命浆细胞和记忆B细胞的增殖，增强了对mRNA和蛋白质亚单位疫苗的体液免疫反应。Oberli及其同事在使用LNPs递送mRNA疫苗治疗B16F10黑色素瘤时，激活了CD8+ T细胞，导致肿瘤缩小并延长了小鼠的总体存活率。近年来，LNPs作为有前景的mRNA疫苗递送系统，在COVID-19疫苗、肿瘤疫苗、流感疫苗等的临床试验中得到了广泛测试。2020年，辉瑞的BNT162b2疫苗(商品名为Comirnaty)和Moderna的mRNA-1273疫苗(商品名为Spikevax)，这两种使用LNPs递送mRNA抗原的疫苗，获得了紧急上市许可。这两种mRNA疫苗在抗击COVID-19方面做出了重要贡献。 聚合物颗粒。聚合物颗粒通常分为天然聚合物和合成聚合物颗粒。它们通常通过缓慢释放抗原来发挥作用。疫苗递送中最常用的天然聚合物是壳聚糖。壳聚糖具有高阳离子电荷和生物粘附特性。因此，壳聚糖可以通过静电相互作用与阴离子核酸形成紧密复合物。此外，壳聚糖的生物粘附特性使其能够长时间保持与粘膜表面的接触，促使抗原持续刺激免疫细胞。这表明壳聚糖可能是核酸疫苗和粘膜疫苗的一个有前景的递送系统。Sawaengsak等人通过将壳聚糖与三聚磷酸钠交联来封装灭活的流感病毒抗原，制备了一种纳米颗粒疫苗，并发现通过鼻内接种两剂这种疫苗的小鼠能够产生更多的抗原特异性抗体和IFNγ+ T细胞。这导致接种疫苗的小鼠100%抵御流感病毒攻击。最近，壳聚糖也被测试为Neocrown DNA疫苗的递送系统。鼻内免疫后，在小鼠体内检测到高水平的中和抗体，并且各种冠状病毒及其突变假病毒被有效中和。此外，壳聚糖最近还被发现通过激活DNA感受器cGAS-STING途径诱导I型干扰素的产生，以促进CD8+ T细胞免疫。 合成聚合物颗粒通常具有比天然聚合物更高的可重复性和更可控的缓慢释放速率。PLGA，一种合成聚合物颗粒材料，现在被广泛用作疫苗递送的载体。在临床前研究中，Kim等人将疫苗成分(包括抗原和免疫刺激剂)封装在PLGA中，以增加DCs对抗原的摄取和呈递，这使得免疫刺激剂能够针对淋巴结中的DCs，而不是系统性传播。Koerner等人设计了一种封装抗原和dsRNA佐剂的PLGA颗粒。这种颗粒疫苗被发现显示出理想的释放曲线，增加了目标淋巴结的数量，并被DCs有效吞噬和呈递。最终产生了有效且持久的抗癌免疫反应。PLGA也被用来递送其他癌症疫苗和HBV疫苗，并增强它们的免疫治疗效果。目前，PLGA颗粒已作为癌症疫苗的递送系统在临床上进行了测试。值得注意的是，PLGA已被FDA批准用于药物递送。因此，我们相信基于PLGA的疫苗递送系统将在未来不久被批准用于人类。 类病毒颗粒(VLPs)。VLPs是由病毒衣壳蛋白的外套蛋白通过蛋白单体的自组装形成的具有固定形状的聚合物颗粒。VLPs的优异粒径和几何形状使其成为递送疫苗抗原的有效平台。VLPs通常直径在20到100纳米之间，因此容易进入淋巴管并靶向淋巴结，由专门的APCs摄取。此外，由于它们高度重复和刚性的结构，VLPs可以在其表面展示多价抗原表位，因此可以广泛交联BCRs，从而刺激B细胞并诱导强烈且持久的抗体反应。目前，基于VLPs的疫苗已经成功并已经广泛上市，如用于HPV的Cervarix®和Gardasil®，用于肝炎病毒的Sci-B-Vac™，以及RTS, S VLP疫苗。VLPs不仅可以递送内源性病毒抗原，还可以递送通过化学偶联或基因融合修饰在VLPs上的异源抗原。例如，一种将HER2抗原表位附着在30纳米二十面体豇豆花叶病毒(CPMV)上的乳腺癌VLP疫苗，能够有效诱导抗原特异性反应和肿瘤保护。此外，肿瘤相关糖抗原MUC1可以共价连接到Qβ，这是一种自组装的二十面体壳VLP，直径为25纳米。这种MUC1 VLP疫苗诱导产生更高水平的特异性抗体，并延长了荷瘤小鼠的存活时间。几种基于VLPs的疫苗已成功进入临床试验，包括基孔肯雅疫苗、流感疫苗、Neocon疫苗、癌症、脑炎等疫苗。值得注意的是，由于VLPs的高度有序和重复的空间结构，非常有利于交联BCRs，即使在没有T辅助(Th)细胞的情况下，VLPs疫苗也能强烈激活B细胞。(表2) 笼状蛋白纳米颗粒。笼状蛋白纳米颗粒通常由一系列重复的图案组成，这些图案允许将抗原表位或抗原并入它们的亚单位结构中，使得这些并入的抗原表位或抗原在组装好的颗粒表面展示出来。与类病毒颗粒类似，笼状蛋白纳米颗粒具有高度有序和重复的空间结构以及适合淋巴结转运的最优尺寸。然而，与类病毒颗粒不同，笼状蛋白纳米颗粒是非病毒来源的。如热休克蛋白、蛋白金库和铁蛋白等笼状蛋白纳米颗粒已被广泛研究作为疫苗的递送平台。在上述蛋白纳米颗粒中，铁蛋白是最常应用的。铁蛋白是由24个亚单位自组装形成的具有八面体对称结构的蛋白，每个亚单位由四个α螺旋束组成。Kanekiyo等人通过将H1N1流感病毒的血凝素抗原与幽门螺杆菌来源的铁蛋白进行遗传融合，并将血凝素抗原插入铁蛋白亚单位并在其表面展示，构建了一种抗体滴度超过许可灭活疫苗10倍以上的纳米流感疫苗。这一设计的有希望的结果帮助开发了三种针对其他流感亚型的疫苗，这些疫苗现在正处于1期临床试验中。在上述三个1期临床试验中，NCT03186781试验已完成。结果显示，无论作为单独还是加强方案，流感疫苗H2HA-铁蛋白都是安全且耐受性良好的，并且可以产生广泛的中和抗体反应。最近，张和他的同事开发了一种基于铁蛋白的SARS-CoV-2纳米颗粒疫苗，该疫苗引发了有效的保护性免疫反应。此外，基于铁蛋白纳米颗粒的乙型肝炎疫苗可以递送乙型肝炎病毒抗原preS1到特定的抗原呈递细胞，激活强烈的免疫反应，并诱导高水平的持续抗体反应。此外，铁蛋白纳米颗粒可以有效递送肿瘤特异性抗原到淋巴结，导致特定的细胞毒性CD8+ T细胞反应和显著抑制肿瘤生长。值得注意的是，一种基于计算机设计的新型笼状蛋白纳米颗粒I53-50最近作为展示多价抗原的强大且多功能平台显示出令人兴奋的结果。基于I53-50的SARS-CoV-2疫苗展示了60个SARS-CoV-2刺突受体结合域在高度免疫原性图案中，产生了比对照疫苗高10倍的中和抗体滴度。同样，一种基于I53-50的纳米颗粒疫苗可以展示20个呼吸道合胞病毒DS-Cav1三聚体抗原，诱导的中和抗体反应比单独的DS-Cav1三聚体抗原高出约10倍。 无机纳米材料。金纳米颗粒是常用的无机纳米材料递送系统之一。由于金纳米颗粒的组成、尺寸、形态、疏水性、表面电荷、均质性和分布等物理化学特性可以通过材料合成和表面化学修饰精确调节以形成特定的免疫类型，因此近年来金纳米颗粒作为有前景的抗原递送系统被研究。金纳米颗粒通过(1)保护抗原免于降解和(2)形成合理粒径的纳米疫苗以促进直接将抗原运送到淋巴结来促进抗原呈递并增强适应性免疫反应。此外，Zhu等人报告称，金纳米颗粒可以通过激活NLRP3炎症体并促进Th2型细胞因子的产生来增强抗原特异性抗体的产生。当金纳米颗粒用作SARS-CoV-2蛋白疫苗的佐剂时，也发现它们可以促进抗原特异性IgG的产生，但未能诱导足够的细胞免疫反应来对抗病毒感染。因此，为了扩大金纳米颗粒的使用，它们通常与其他免疫刺激剂联合使用或表面修饰，以增强它们的T细胞免疫反应。Xu等人制备了修饰有PEI的金纳米颗粒，发现这些纳米颗粒通过激活抗原呈递细胞显著促进了T细胞的增殖。Wang等人将重组流感病毒血凝素与金纳米颗粒偶联，然后将其与TLR5激动剂鞭毛蛋白偶联作为颗粒佐剂系统。用这种疫苗通过鼻内接种小鼠，发现它增加了抗原特异性IgA和IgG水平，并增加了细胞因子IFN-γ的分泌和CD8+ T细胞的激活。在临床上，使用金纳米颗粒作为佐剂的登革热和SARS-CoV-2疫苗正在测试中。 与金纳米颗粒类似，介孔二氧化硅纳米颗粒(MSNs)也具有强大的装载能力和易于表面修饰的特点。修饰后的MSNs已被研究作为有效的疫苗递送系统。Lee等人通过将MSNs与氧化铁纳米颗粒组装，形成了具有超大介孔的空心MSNs。然后使用PEI进行表面修饰，使得修饰后的MSNs内部的空隙允许有效装载不同大小的各种模型蛋白，并能增强抗原呈递和交叉呈递。当用作癌症疫苗递送系统时，它增加了抗原特异性CTLs的产生，抑制了小鼠的肿瘤生长，并提高了荷瘤小鼠的存活率。Li等人报告了一种以结核菌素纯化蛋白衍生物为佐剂的介孔二氧化硅/钙磷酸盐复合纳米颗粒的例子。结果表明，复合颗粒能够显著抑制肿瘤的生长。MSNs基材料也已在其他抗原的递送系统中进行了测试。值得注意的是，MSNs作为其他药物的载体已慢慢开始临床试验。由于MSNs在临床前研究中已显示出作为疫苗递送系统的效力，我们相信基于MSNs作为递送系统的疫苗也将在未来不久获得临床试验许可。 随着材料科学的发展，基于材料的递送系统迅速发展。现在可以通过递送系统保护疫苗成分并将其靶向到抗原呈递细胞或特定淋巴组织来增强疫苗接种的适应性免疫反应。然而，与免疫刺激剂相比，相对较少的递送系统进入了临床测试。这可能部分是由于递送系统的安全性问题尚未解决。因此，递送系统与宿主免疫细胞或器官之间的具体相互作用机制仍需要进一步研究以阐明其有效性和副作用，以便更好地平衡和控制两者之间的关系。 5.结论与展望 近年来，新型冠状病毒的出现和传播给全球公共卫生在疾病预防控制方面带来了巨大挑战，这再次凸显了疫苗开发的重要性。疫苗开发中不可忽视的一个话题是佐剂，因为它们能显著增强疫苗的适应性免疫反应。在综述的开头，我们总结了佐剂的作用机制，并对其进行了描述。根据作用机制，佐剂可分为免疫刺激剂和递送系统。免疫刺激剂通过靶向特定的模式识别受体(PRRs)激活抗原呈递细胞(APCs)，从而增强抗原呈递和共刺激信号，导致适应性免疫增强。递送系统通过延长抗原的生物利用度，将抗原靶向到APCs或淋巴结，增强APCs对抗原的摄取和呈递，从而增强适应性免疫反应。随后，本综述详细阐述了经典佐剂平台以及正在研究中的佐剂平台，希望为开发特定疫苗时合理选择佐剂提供信息。为了促进佐剂领域的更好发展，我们认为以下几点可能需要关注。 首先，选择正确的佐剂以协助抗原并改善免疫反应是新疫苗开发中的一个重要问题。然而，这个问题复杂且具有挑战性。这是因为免疫系统对给定疫苗和佐剂的反应高度依赖于具体情况，没有任何一种佐剂适用于所有情况下的抗原。结合本综述中对佐剂的描述，我们在此提出，在为新疫苗开发选择佐剂时，需要考虑以下因素。例如，给药途径（如肌肉内、粘膜、腹膜内）、所需免疫反应的类型（抗体偏向或CD8+ T细胞偏向，或两者兼有）、病原体类型、抗原类型（亚单位抗原或mRNA抗原）以及疾病阶段。此外，疫苗接种者的生物学特征也可能很重要，包括物种、种族、年龄、医疗史和遗传组成等。此外，佐剂的安全性和经济性也需要考虑。所有这些因素都可能影响疫苗佐剂的有效性。 此外，考虑到目前免疫刺激剂（主要是PRRs激动剂）和递送系统（尤其是纳米颗粒递送系统）的结合用于佐剂开发，以实现更高的免疫激活。在这里，需要仔细考虑一些问题。首先，通过我们对黄热病病毒疫苗的了解，我们知道同时激活多个先天受体比激活单个受体更有效。因此，非常需要阐明不同PRRs之间的信号交互作用，以更好地筛选更有效的PRRs组合。此外，鉴于抗原和PRR激动剂之间以及不同PRR激动剂之间的物理化学特性差异，递送系统需要更合理地设计，以足够灵活和兼容，同时递送多种疫苗成分。 最后，我们也想提及一点关于经典佐剂的问题。经典佐剂在历史使用中已显示出良好的生物安全性。此外，成熟的研发技术和完善的制造条件和设备为新疫苗的开发转化提供了相对容易的平台。然而，经典佐剂的缺点是它们的免疫刺激能力有限。鉴于此，迫切需要新佐剂来弥补经典佐剂的不足。然而，临床前开发和临床试验的成本和时间限制了新佐剂的转化。因此，我们认为，在促进新佐剂的开发和转化的同时，对经典佐剂进行一些性能优化和配方改进，如表面修饰、颗粒化，以及与其他提高其免疫效力的佐剂结合，可能是具有临床价值的研究课题。 在本综述中，我们系统总结了佐剂的作用机制，并根据其机制介绍和讨论了不同类型佐剂的特点和应用场景。我们期望这篇综述能为佐剂作用机制的进一步研究、现有佐剂的合理使用以及新佐剂的设计与开发提供参考价值。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。