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AAV免疫学的奇妙案例「BioMedDaily」研究概述2025年3月28日，马萨诸塞大学chan医学院Horae 基因治疗中心高光坪（Guangping Gao）教授团队在Molecular Therapy期刊发表标题为“The curious case of AAV immunology”的综述论文，该综述主要探讨了腺相关病毒（AAV）免疫学的复杂性，包括AAV与宿主免疫系统的相互作用、临床应用中的免疫挑战以及未来研究方向。导读「BioMedDaily」重组腺相关病毒（rAAV）具有许多独特的特性，使其能够用于在体内向细胞传递遗传物质，因此成为治疗众多遗传性疾病的首选基因传递载体。然而，免疫系统将这些AAV载体视为外来物和潜在的病原体。由此产生的免疫反应引发了重大的安全性问题，对治疗性基因转导的持久性产生了负面影响，并且在需要时可能会阻碍重新给药。在研究AAV免疫学时，作者观察到许多令人惊讶的发现。此外，AAV基因治疗与自然感染免疫学存在巨大差异，不仅因为rAAV缺乏复制能力，还因为rAAV通过多种途径直接给药用于基因治疗，这些途径在自然感染中是不可用的，且给药滴度极高。所传递的DNA总量通常在每千克10¹⁷到10¹⁸个碱基之间，加上衣壳是一种外来蛋白，应该会激活免疫系统，这在其他病毒载体系统中也有观察到。然而，在实验动物中，先天免疫激活极为温和，最初使研究人员认为它相对无关紧要。然而，在人类受试者中，rAAV基因治疗引发了罕见但严重的与免疫反应相关的不良事件，但这些事件的精确原因并未总是被识别，也未能很好地在动物模型中重现。此外，尽管先天免疫激活极小，但针对载体的适应性反应却很强烈，这挑战了适应性免疫需要强烈先天信号的传统观点。在本综述中，作者描述了AAV与免疫系统相互作用的已知和未知内容，讨论了临床应用中当前面临的挑战，并提出了针对这种奇特病毒的未来研究方向。正文「BioMedDaily」1. rAAV、宿主细胞与免疫系统的相互作用尽管大多数病毒是作为疾病病原体被发现的，但腺相关病毒（AAV）最初是作为腺病毒（Ad）培养物中的污染物被发现的，这也是其名称的由来。AAV是一种直径为26纳米的细小病毒，其基因组为单链DNA（ssDNA）。AAV具有稳定且无包膜的衣壳，从多种脊椎动物的感染中已鉴定出数百种自然衣壳变体。AAV自身无法复制，需要其他病毒（如腺病毒或疱疹病毒）的帮助才能繁殖，这一特性使其成为基因传递的理想载体。AAV编码一个4.7 kb的ssDNA基因组，表达四个已知的开放阅读框，分别编码Rep、Cap、装配激活蛋白和膜相关辅助蛋白，这些基因被非编码的发夹状结构——反向末端重复序列（ITR）所包围。为了生成重组AAV（rAAV），所有编码基因被移除并替换为治疗基因，唯一保留的病毒成分是非编码的ITR。为了理解对AAV基因治疗的免疫反应，了解对野生型AAV（wtAAV）的免疫反应至关重要。AAV单独并未被鉴定为致病因子，其在腺病毒培养中的发现最初被认为是一种污染，因为它具有非致病性。然而，在其被发现后不久的几项研究中，发现AAV常与腺病毒引起的疾病爆发共同分离，尤其是在儿童中。最近，AAV2还与儿童急性肝炎的爆发有关，这种爆发是在与其他病毒（如腺病毒和疱疹病毒）共感染后发生的。宿主遗传因素被认为赋予了受影响个体的疾病易感性，但wtAAV的致病性仍不清楚。AAV感染在人类中广泛存在，针对自然衣壳变体的中和抗体（Nabs）在各种人群中普遍存在。这种由自然感染产生的预先存在的免疫反应可能会抑制基因治疗的疗效，因为Nabs会结合并抑制载体。因此，基因治疗的临床试验排除了对载体具有高水平抗体的患者，这在该领域中为使治疗对所有患者都可及造成了重大障碍。此外，针对AAV衣壳变体的T细胞反应也在自然wtAAV感染的健康个体中被检测到。然而，一项研究表明，患者中抗体与T细胞反应之间几乎没有相关性，一些患者只有中和抗体阳性或T细胞反应阳性，有些患者两者都有，尤其是对于AAV9，这一发现随后得到了类似结果的支持。总体而言，人类对wtAAV的暴露是普遍的，但由此产生的免疫反应尚未被证实会导致任何疾病，但尚未完全被理解。1.1 AAV如何被免疫系统识别？先天免疫系统是人体抵御病毒感染的第一道防线，提供快速、非特异性的反应，这对于控制病毒复制和在感染初期遏制其传播至关重要。相比之下，适应性免疫系统能够以抗原特异性的方式识别病毒，同时引发免疫记忆，这需要时间来对病原体产生针对性的反应。先天免疫系统依赖于种系编码的受体和机制，能够检测和响应多种病原体。AAV载体具有低免疫原性和无致病性，然而，对AAV载体的先天免疫反应仍然可以影响其疗效和安全性。这与其他病毒载体（如腺病毒或单纯疱疹病毒）的免疫原性形成对比，后者的先天免疫反应强烈，导致转导细胞被清除。然而，随着临床试验中载体剂量的不断增加，观察到对AAV的不良免疫反应增加，这可能是由于触发了先天免疫途径，同时激发了适应性免疫系统产生强烈反应。1.2 先天免疫反应病毒通过宿主的模式识别受体（PRRs）被识别，这些受体能够检测病原体相关分子模式（PAMPs）。这些PAMPs包括病毒核酸（如双链RNA、单链RNA、未甲基化的CpG DNA和双链DNA）以及病毒蛋白和其他结构成分。这些PAMPs被PRRs检测到，PRRs在抗原呈递细胞（APCs）上大量存在。许多研究表明，AAV能够被多种PRRs识别，包括Toll样受体（TLR）2、TLR9、cGas和RIG-I/MDA5（图1）。图1. AAV病毒颗粒中的免疫原性基序。TLR2通过识别衣壳蛋白来检测AAV，TLR9能够感知载体基因组中的未甲基化CpG基序，而cGAS-STING途径能够检测AAV基因组。TLR9、cGAS和RIG-I/MDA5激活宿主的干扰素（IFN）反应。TLRs通过接头蛋白（如MyD88和TRIF）发出信号，导致IRF3、IRF7和核因子（NF）-κB的激活，以及I型IFN和促炎细胞因子（如白细胞介素（IL）-6和肿瘤坏死因子（TNF））的产生。IFN反应能够激活自然杀伤（NK）细胞和其他先天免疫效应细胞，可能会降低转导效率。1.3 补体与AAV补体是AAV先天免疫反应的主要组成部分，可以通过三条主要途径激活：经典途径、替代途径和凝集素途径。经典途径和替代途径与基因治疗最为相关，因为它们在临床前和临床研究中均被证实与AAV诱导的补体激活有关。然而，凝集素途径也可能对AAV的宿主反应有所贡献，可能是因为AAV衣壳上丰富的甘露糖化N-糖链激活了凝集素途径，或者在内皮损伤后激活。经典途径、凝集素途径和替代途径均汇聚于C3转化酶，该酶能够裂解C3蛋白。经典途径通常由抗原-抗体复合物激活。此外，C1q与C反应蛋白（CRP）和五聚素-3（PTX-3）等多种靶标的结合也可以在抗体独立的方式下激活经典途径。替代途径可以通过C3的低水平自发水解，在没有识别分子（如抗体或凝集素）的情况下在异物表面沉积C3b。替代途径的一个显著特点是其正反馈环路：通过任何三条途径沉积的C3b可以与因子B结合；因子B随后被因子D裂解，形成替代途径C3转化酶（C3bBb）；替代途径信号的增加进一步放大了C3的裂解，增加了C3b的沉积。通过与B细胞上的补体受体2（CR2）结合并促进CR2与B细胞受体复合物的交联，C3的C3d片段作为一种分子佐剂，降低了B细胞激活的阈值，对于最佳的抗体反应至关重要。因此，在缺乏补体蛋白CR1/2或C3的小鼠中，对AAV的体液免疫反应受到抑制。C3在AAV衣壳上的沉积增强了巨噬细胞对病毒颗粒的摄取，导致细胞因子（如IL-8、IL-1β和MIP）的产生增加。此外，高滴度的AAV中和抗体（Nabs）可以在人血中激活补体和其他先天免疫系统成分。利用链球菌蛋白G（IdeS）的免疫球蛋白G（IgG）降解酶或通过亲和层析柱色谱法耗尽IgG，已在体外证实了抗体在触发补体激活中的作用。然而，体内研究表明，抗体独立的机制可能通过替代途径参与对高剂量AAV载体的反应。在非人灵长类动物（NHPs）和仔猪中最初观察到高剂量毒性，包括血小板丢失，随后在NHPs和小鼠中的研究表明，补体激活在输注后3-4天达到峰值，这发生在IgG或IgM反应以及血小板减少症之前。一些临床试验的患者出现了提示补体激活和血小板减少症的临床表现。补体激活可能导致罕见且危及生命的血栓性微血管病（TMA）以及呕吐、急性肝衰竭和心脏及肾脏组织损伤（非典型溶血性尿毒症综合征[aHUS]）。AAV诱导的补体激活已在其他地方进行了广泛综述，TMA/aHUS的临床结果将在下面的临床免疫毒性部分讨论。然而，总体而言，在临床试验中，即使在高剂量的AAV颗粒下，也并不常见到强烈的先天免疫反应。这与其他病毒载体形成对比，后者会强烈刺激先天免疫反应，这也是基于AAV的基因治疗在临床试验中取得成功的原因之一。1.4 适应性免疫反应尽管先天免疫反应水平较低，但针对野生型AAV（wtAAV）和重组AAV（rAAV）的强烈适应性免疫反应已被观察到。适应性免疫反应针对特定抗原产生免疫记忆，可通过AAV衣壳或rAAV的转基因诱导。AAV颗粒被细胞内化，并通过内吞作用运输到细胞核，在那里病毒被脱壳，其单链DNA（ssDNA）被转化为双链DNA（dsDNA）。然而，一些AAV衣壳在蛋白酶体中被消化，并被处理成主要组织相容性复合体（MHC）I类和II类抗原。适应性免疫反应大致可以分为两个分支：体液免疫，其中B细胞分泌抗体以中和病毒；细胞免疫，其中T细胞杀死病毒感染的细胞。AAV受体的HLA基因型可能在决定其适应性反应结果中起关键作用，这从COVID-19大流行期间发生AAV2相关非A-E型急性肝炎的儿童中HLA-DRB1*04:01等位基因的高富集度中得到证实。实验动物中存在多种MHC分子，但近交系可能具有更有限的单倍型库。人类和动物模型之间MHC组成的差异可能会影响适应性反应的有效建模。1.5 针对衣壳的抗体反应在AAV给药后，一些AAV会进入淋巴系统，作为抗原激活适应性免疫，如先前所示，AAV衣壳和DNA可在脾脏的生发中心中找到。在生发中心，具有识别AAV衣壳表位倾向的B细胞被激活，发生体细胞高频突变和增殖，借助CD4+滤泡辅助T细胞（图1）。一些B细胞成为浆母细胞，向循环系统释放大量抗体。中和抗体（Nabs）可以进一步阻止AAV进入靶细胞，将其标记为吞噬作用，并激活经典补体途径。其他B细胞成为记忆细胞，保留对AAV的免疫记忆。自然暴露于野生型AAV会导致Nabs的产生，许多针对一种AAV血清型的Nabs与其他衣壳变体具有高度交叉反应性，这是由于AAV衣壳之间序列同源性高。如果患者预先存在对载体衣壳有反应的Nabs，可能会降低基因治疗的疗效。最近一项研究分析了六种衣壳变体的全球Nab血清流行率，发现AAV1在成人和儿童患者中的流行率最高。然而，其他研究对来自10个国家的样本进行筛查发现AAV2 Nabs最为普遍，其次是AAV1。这些研究发现AAV5的流行率最低，但另一项针对成年血友病患者的研究发现AAV5的血清流行率相对较高。总体而言，自然发生病毒的血清阳性率在不同人群中均有发现，许多针对AAV的Nabs在这些人群中普遍存在，但尚不清楚这些抗体如何影响基因治疗载体。一项研究评估了Nabs和结合抗体（Babs），发现它们之间存在正相关，但衣壳特异性Nabs的血清流行率高于Babs，这意味着大多数有Nabs的人也有Babs，但有些人可能只有一种。Nabs在阻断转基因表达中的作用已在动物研究中得到充分模拟，并在患者中观察到，而Babs的作用尚不清楚。一项研究在AAV给药前将AAV载体与Nabs或Babs共同孵育，或用Nabs或Babs免疫小鼠，发现载体在Nab或Bab挑战后都能进入细胞，但Nabs能够阻断转基因表达，而Babs则不能。细胞内IgG受体TRIM21可能在将抗体结合的病毒靶向蛋白酶体方面发挥作用，但在AAV背景下这一可能性尚待研究。这些抗体的存在是持久的，因为高滴度的Nabs在AAV基因治疗多年后仍可检测到，一项针对血友病B的研究发现，对输送的AAV2衣壳以及对AAV5和AAV8具有交叉反应性的高Nabs在治疗后15年仍然存在。血清阳性状态可能会排除患者参加临床试验，和/或使试验中的患者重新给药无效。针对AAV的Nabs的主要亚类是IgG1，其次是IgG2和IgM。IgM和IgG似乎都能阻止AAV进入细胞，这限制了重新给药策略。该领域的一个主要障碍是抗体检测方法缺乏标准化，因此在不同的试验中以不同的方式评估抗体，并使用不同的值来确定阳性结果。这使得比较反应变得困难，而且如果每个产品都需要自己的伴随诊断，这也是获得批准的一个障碍。用于确定患者临床环境中抗体滴度的检测方法分为两大类，即总抗体结合（TAb）检测法，用于检测Babs，以及转导抑制（TI）检测法，用于检测Nabs。然而，依赖活细胞培养、测试病毒的批间差异以及测试病毒转基因的差异使得TI检测法更难标准化，并且难以在不同的临床研究中进行比较。使用更敏感的转基因减少了TI和TAb检测法之间的差异。进一步的研究已开展，以利用冷冻电镜或肽段扫描来识别与抗体相互作用的AAV衣壳区域。在AAV衣壳上已鉴定出某些结构域区域或“抗原热点”，包括二十面体的3倍轴、5倍轴和2/5倍壁。最近一项研究显示，约76%的Zolgensma患者的抗体针对2倍对称轴，表明该区域对AAV9具有抗原优势。在本研究中测试的来自四名Zolgensma患者的21种抗体均为中和性抗体，其中大多数特异性针对AAV9，尽管有些与其他衣壳具有交叉反应性，并且更有可能结合5倍对称轴。减少AAV9衣壳上的抗原热点是开发免疫逃逸策略的一个潜在有影响的领域。值得注意的是，这些映射可能来自高亲和力抗体，而低亲和力抗体的抗原区域仍有待解决。1.6 针对衣壳的T细胞反应在首次临床表现之前，临床前动物模型中几乎没有针对AAV的T细胞特异性免疫反应的证据。这至少部分归因于AAV基因治疗诱导的先天反应缺乏。T细胞反应的产生是当抗原在MHC I类上呈递细胞内蛋白或在MHC II类上呈递细胞外蛋白时，分别导致CD8和CD4 T细胞反应的产生。然而，抗原的交叉呈递可以发生，细胞外抗原可以由MHC I类呈递，研究表明AAV递送会导致浆细胞样树突状细胞（DCs）、传统DCs和CD4+细胞的组合，这可以通过交叉呈递激活针对AAV衣壳的CD8+ T细胞。细胞介导的T细胞反应最初是在一项针对血友病的AAV2临床试验中观察到的，报告了转基因表达的丧失和肝转氨酶的升高。在随后使用AAV8的血友病临床试验中，接受2×10¹² vg/kg的患者观察到类似的结果，但使用类固醇治疗部分挽救了转基因表达，而接受6×10¹¹ vg/kg的患者通过ELISpot检测到针对衣壳的T细胞反应，但没有转基因表达的丧失或转氨酶升高。进一步的研究进一步支持了针对衣壳的T细胞反应呈剂量依赖性，但可以通过类固醇治疗进行控制。然而，并非所有的T细胞反应都阻碍了基因治疗的积极结果。在几项针对肌肉的临床试验中观察到诱导了称为调节性T细胞（Tregs）的特殊T细胞，这些细胞诱导了耐受性，并允许长期稳定的转基因表达。在针对α₁-抗胰蛋白酶（AAT）的临床试验中，在活检样本中观察到即使在注射后5年，患者的细胞浸润仍然持续存在，但这种细胞群含有针对衣壳的FoxP3 T细胞。在一项针对肌肉的非人灵长类动物研究中，也发现了类似的长期表达。尽管最初观察到了针对转基因的免疫反应，但这种反应只是短暂的，转基因的再表达虽然在较低水平，但在注射后5年内被观察到，这被认为是由Tregs介导的。1.7 针对转基因的抗体和T细胞反应与慢病毒或腺病毒等其他载体相比，AAV诱导的转基因免疫反应要低得多，这可能是因为AAV对APCs的转导效率低，无法激活先天免疫反应。然而，与针对衣壳的免疫反应类似，针对AAV递送的转基因的免疫反应也可以产生。针对转基因产生的抗体通常被称为抗药物抗体（ADAs）。在患有遗传性疾病的患者中，这些抗体更有可能产生，这些患者的受影响基因存在无效突变，导致没有内源性蛋白表达，或者如果递送的转基因不是内源性蛋白序列，例如“迷你”或“微型”序列，其中部分转基因被移除以产生新的表位。在两种情况下，都没有建立免疫耐受。错义突变通常更容易被耐受，但仍然可能发生免疫反应。在具有不太常见的HLA单倍型的患者中，发现一种常见的非致病性AAT多态性会导致针对突变AAT蛋白的免疫反应。值得注意的是，自互补AAV（scAAV）载体比单链AAV（ssAAV）诱导了更强的针对转基因的抗体反应和CD8+ T细胞反应，这可能是由于scAAV比ssAAV更强地表达了转基因产物，以及诱导了先天免疫。在庞贝病中，该病是由编码α-葡萄糖苷酶（GAA）的基因发生突变引起的，缺乏任何残留GAA的患者被称为交叉反应免疫物质（CRIM）阴性。这些患者通常会在酶替代疗法和AAV基因治疗中产生高滴度的抗GAA抗体或ADAs，因为存在一种没有耐受性的治疗蛋白。在血友病、肾上腺脑白质营养不良和肌肉营养不良等其他疾病中也观察到了类似的免疫反应，这些疾病的患者在致病基因中存在大片段缺失或无效突变。针对转基因的T细胞反应在几项针对杜氏肌营养不良症（DMD）的AAV临床试验中被观察到。由于肌营养不良蛋白基因包含79个外显子，其cDNA超过11 kb，因此它太大，无法装入单个AAV衣壳中。因此，研究人员设计了一种缩短版的基因，称为“微型肌营养不良蛋白”，该基因具有功能性，但省略了许多外显子，以适应AAV的包装能力。虽然大多数患者在没有强烈针对转基因的T细胞免疫的情况下表达微型肌营养不良蛋白，但一些患者可能会出现T细胞介导的针对转基因的免疫介导肌炎（IMM），特别是在那些在微型肌营养不良蛋白cDNA中存在的肌营养不良蛋白基因大片段缺失的患者中，这些患者还具有特定的HLAs。DMD患者肌肉组织中的促炎环境也可能有助于免疫系统对AAV衣壳的反应。因此，在评估基因治疗的免疫反应时，应考虑疾病对生理的影响，特别是对于促炎性疾病。2. rAAV引发的免疫反应带来的临床挑战针对衣壳和转基因的免疫反应限制了重新给药的能力，而重新给药是维持治疗基因表达的一种策略。然而，情况并非总是如此简单，即更强的免疫反应会导致转基因表达减少。特别是T细胞反应的双重性令人困惑，因为T细胞反应既可以清除转基因表达，也可以促进其持续存在。这种双重性在同一个研究小组最近的两份报告中得到了很好的体现，这些报告评估了许多影响免疫系统对AAV基因治疗反应的因素。其中一些因素，如给药途径和AAV衣壳的选择/设计，可以在临床前模型中轻松模拟。然而，其他因素，如疾病表型、HLA状态、免疫抑制方案以及共感染等混杂因素，在临床前模型中很难考虑。此外，年龄和性别也被发现在眼部治疗的小鼠模型中调节对基因治疗的免疫反应。更好地理解T细胞反应对于实现耐受性将有助于持续的临床成功。2.1 降低AAV免疫原性的策略为了降低AAV的免疫原性，可以采用多种策略，包括对AAV衣壳或其基因货物进行工程改造，以减少与先天和适应性免疫反应的相互作用。2.2 基因货物提高转基因表达可以减少需要输送的载体剂量，从而降低免疫反应。研究人员还研究了使用高活性的AAV转基因变体来减少载体剂量，但这些变体也可能产生新的B细胞和T细胞识别的表位。通过机制如aptazyme核糖开关或药物诱导的剪接来控制基因表达，也可能减少毒性。许多策略被用来提高转基因表达，包括密码子优化。然而，如上所述，密码子优化可能会增加免疫反应，因为它通常会增加CpG基序，从而增强TLR9的激活。然而，从AAV构建物中去除CpG二核苷酸已被证明可以促进稳定的转基因表达，并减少细胞浸润。但很难完全去除所有CpG，尤其是考虑到AAV包装所需的ITR通常含有高CpG含量。然而，一项研究生成了功能性无CpG的ITR，尽管使用它们时载体产量有所下降。另一种减轻TLR9信号的方法是在AAV基因组中加入TLR9抑制序列，这可以阻断宿主DNA传感器。这种策略已在小鼠和猪中被证明可以减少免疫反应，并允许成功重新给药。进一步的修饰可以通过阻断3′-ITR的转录来减少免疫反应，这会产生ssRNA和dsRNA，作为细胞内RIG-I和MDA5的识别基序。使用微RNA靶向技术阻断APCs中的转基因表达已被成功证明可以限制适应性免疫反应。2.3 衣壳衣壳工程被提出作为一种替代方法，以克服免疫系统的挑战。对常见Nab识别位点的衣壳表面进行改造，可以提高转导效率。大多数在基因治疗后被鉴定出来的人类抗体都显示出AAV9沿2倍对称轴的抗原区域，这与小鼠抗体所显示的不同。因此，基于小鼠抗体结合区域设计AAV衣壳可能无法转化为人类。许多组织特异性的AAV衣壳被提出用于更有效的组织靶向和细胞进入，以提高转基因的表达。AAV衣壳表面的酪氨酸残基突变已被测试，以减少磷酸化和泛素化，这会导致衣壳降解和表位作为抗原的呈递。这些酪氨酸残基的突变增强了转基因表达，同时减少了抗原呈递和T细胞毒性。通过点击化学将N-乙酰半乳糖胺配体结合到AAV衣壳的酪氨酸上，可以在不改变衣壳的情况下减少与Nabs的相互作用，同时增强肝脏和视网膜的靶向性。此外，PEG化和聚合物包被也被提出用于避免抗体中和。外泌体包裹的AAV的创造允许改变AAV衣壳的趋向性，使其能够在Nabs存在的情况下转导细胞，并诱导耐受性。外泌体-AAV递送载体甚至可能允许在体内对淋巴细胞进行工程改造。3. 给药途径在免疫反应中的作用AAV载体的不同给药途径会导致不同的免疫反应，原因多种多样（图2）。直接注射到某些特定组织隔室，如眼睛或中枢神经系统（CNS），会因缺乏血清成分、存在屏障组织以及独特的免疫环境而产生不同的免疫反应。而其他途径，如系统性给药，则面临额外的障碍。一项体内研究使用RNA原位杂交发现，在静脉注射后2-24小时内，AAV DNA被限制在间质空间，表明细胞外基质可能是系统性给药的屏障。然而，在注射后5天，AAV DNA已进入大多数组织的细胞核，且在脾脏和淋巴结中观察到的AAV DNA大多位于B细胞丰富的区域。所有这些因素都在AAV的免疫反应中发挥作用。图2. AAV载体基因治疗的免疫反应因给药途径而异。3.1 眼部在美国，首个获批的基因疗法Luxturna是针对RPE65基因突变相关的视网膜营养不良设计的。眼睛是基因治疗的理想靶点，因为它只需要相对较少的载体，并且是一个受保护的免疫环境。在初次视网膜下注射后产生的针对AAV的抗体，并未阻止对侧眼的重新给药。然而，在视网膜下注射后，局部眼部炎症对AAV的反应已被观察到，但并未诱导全身耐受性。尽管一些眼部基因治疗试验报告称免疫反应较少，缺乏T细胞反应，但其他试验报告了局部和全身免疫反应，这被称为基因治疗相关性葡萄膜炎（GTAU）。玻璃体腔注射被认为比视网膜下途径更具免疫原性，因为载体可能进入血液并接触到淋巴组织。眼睛中有几种免疫细胞作为APCs，包括驻留的类似巨噬细胞的小胶质细胞和周血管巨噬细胞。眼睛表达许多PRR基因，包括各种TLRs和cGAS。然而，几个独特的免疫学因素影响眼部免疫反应，包括免疫抑制微环境和物理的血-组织屏障。眼部对AAV基因治疗的免疫反应已在其他地方进行了广泛综述。3.2 中枢神经系统针对中枢神经系统（CNS）的给药途径可以是直接的，例如将载体注射到CNS隔室中，也可以是更广泛的，例如系统性给药，使用经过改造能够转导CNS组织的载体。后一种方法被用于Zolgensma，用于治疗脊髓性肌肉萎缩症（SMA）的神经元。AAV9能够穿过血脑屏障（BBB）的发现是CNS基因递送的一个重要突破。CNS独特的免疫环境使其成为早期基因治疗的一个有吸引力的目标。尽管CNS最初被认为具有“免疫特权”，但最近的研究表明，CNS和免疫系统之间存在着独特的关系。BBB阻止抗体进入CNS，这使得即使在循环系统中存在针对它们的中和抗体（Nabs），也可以直接将病毒载体注射到CNS中。然而，AAV给药到CNS会导致血清和CNS中的抗体滴度增加，以及CNS中的细胞浸润。3.3 肌肉内注射在CNS和眼睛中，预先存在的Nabs对基因治疗载体的影响最小。然而，Nabs对肌肉直接给药的基因治疗载体的影响则更难以捉摸。几项试验表明，预先存在的Nabs的存在并不是直接肌肉内注射的重大障碍。在AAV2血友病B试验、AAV1治疗脂蛋白脂肪酶缺乏症（LPLD）的试验以及AAV1肢带型肌营养不良（LGMD）试验中，尽管一些患者存在阳性Nab滴度，但仍有成功的转基因表达。此外，尽管一些患者对AAV有交叉反应性的Nab滴度，但仍有四名曾在AAV2试验中接受治疗的患者在随后的试验中接受了AAV1的直接肌肉内注射。然而，对于肌肉适应症的静脉给药，由于预先存在的Nabs的限制，患者被排除在临床试验之外。在肌肉靶向基因治疗后的几项临床试验中观察到了额外的T细胞反应。在一项直接肌肉内注射试验中，检测到了针对衣壳的调节性T细胞（Tregs）反应，并认为这些反应有助于长期稳定的转基因表达。然而，在采用系统性给药治疗杜氏肌营养不良症（DMD）的临床试验中，观察到了强烈的针对转基因的T细胞反应。3.4 系统性/肝脏在动物模型中，AAV对肝脏的靶向已被证明在小鼠、狗和非人灵长类动物（NHPs）模型中具有耐受性，并且已被用于在更多免疫组织中诱导耐受性。此外，在肝脏移植领域，肝脏异体移植已被耐受，这可能为基因治疗领域的免疫耐受性提供一些启示。肝脏的特定环境中，许多因素共同作用，包括库普弗细胞（肝脏中较不成熟的驻留巨噬细胞）、IL-10的分泌以及肝脏窦状内皮细胞诱导调节性T细胞（Tregs）的生成。大约30%的严重血友病A患者会产生针对凝血因子VIII（FVIII）的抗体，这些抗体可能通过定期给予治疗性FVIII来耐受。在基因治疗前没有FVIII抑制剂的患者被选入试验，但来自狗的证据表明，肝脏靶向的AAV-FVIII能够诱导对FVIII的耐受性。目前正在评估诱导耐受性的可能性，其中一名接受治疗的血友病A患者取得了成功。然而，耐受性并不总是能在人类临床试验中转化为更好的结果，系统性给药的载体通常会导致短暂的转基因表达，与肝酶升高和通过ELISpots检测到的阳性衣壳特异性T细胞反应相关，这需要使用皮质类固醇进行免疫抑制。但免疫抑制使得血友病试验中的转基因表达在数年内保持稳定，并导致美国食品药品监督管理局（FDA）批准了三种基因疗法：Roctavian、Hemgenix和BEQVEZ。3.5 耳部内耳基因递送最近取得了巨大成功，开辟了一个令人兴奋的治疗新领域。内耳是一个独特的环境，它是一个解剖学上孤立的部位，并且有一个紧密调节的血-迷路屏障，形成了一个与循环系统分离的内耳微环境。然而，内耳中存在白细胞，特别是巨噬细胞，表明有一个活跃的免疫系统。尽管如此，对内耳AAV基因治疗的免疫反应的研究还相对较少，但一些研究提供了见解。在新生小鼠内耳的圆窗注射AAV载体产生了低水平的中和抗体（Nabs），表明这种途径可能防止适应性免疫反应。然而，在后半规管给药后，也有报道在小鼠中观察到细胞浸润和巨噬细胞积聚，以及在非人灵长类动物（NHPs）的圆窗膜给药后也观察到了类似现象。需要更多的研究来充分理解内耳基因治疗后对AAV的免疫反应。4. rAAV引发的免疫反应导致的免疫毒性免疫毒性在注射后数天内以及给药后1年均有观察到，早期反应在基因治疗后数天到数周内更多地与先天免疫系统相关，而治疗后数周到数月内发生的事件更多地与适应性免疫系统相关（图3）。图3. AAV治疗后免疫反应和免疫毒性的时间轴。4.1 先天免疫反应导致的免疫毒性AAV给药后不久出现的免疫毒性包括补体激活、血小板丢失和细胞因子升高，这些可能导致补体介导的血栓性微血管病（TMA）和一种非典型溶血性尿毒症综合征（aHUS）。TMA的特征是血小板减少、微血管病性溶血性贫血以及不同程度的终末器官损伤，但凝血酶原和活化部分凝血活酶时间正常。TMA可能是原发性的（遗传性或获得性），也可能是继发于其他疾病过程，如感染（包括Shiga毒素相关HUS）、恶性高血压、自身免疫性疾病、恶性肿瘤和药物。原发性遗传性TMA包括由ADAMTS13（一种含有血栓性血小板减少性紫癜的13号成员）缺乏引起的血栓性血小板减少性紫癜（TTP），以及由补体抑制剂的功能丧失突变或补体激活剂的功能获得突变引起的过度或不受抑制的补体激活导致的aHUS，以及其他罕见疾病，如钴胺素C（cblC）缺乏和DGKE（二酰基甘油ε）或INF2（倒置formin 2）基因的突变。针对ADAMTS13或补体抑制因子H的抗体可能导致获得性TTP或aHUS，分别是原发性TMA的获得性原因。TMA的一个标志是内皮细胞损伤，由补体C5b-9的膜攻击复合体引起。最近的一项研究表明，在携带补体C3功能获得突变的小鼠中阻断C7可以防止动物死于疾病，这再次强调了C5b-9在触发内皮细胞损伤中的关键作用，这对于该疾病的发病机制至关重要。因此，预防过度的补体激活和C5b-9的生成可能会缓解这种不良反应。尽管TMA/aHUS最初仅在用于治疗杜氏肌营养不良症（DMD）的AAV9试验中被观察到，但此后在涉及不同AAV衣壳和不同疾病的儿童和成人患者的试验中均有报告，但所有这些不良事件的报告都与通过静脉给药的相对高剂量载体有关。然而，与AAV8或AAVrh74相比，AAV9试验中报告的TMA病例要多得多，即使在相同的DMD疾病背景和相似剂量下也是如此。TMA病例现在被认为与六种不同的临床产品有关，这些产品用于治疗五种不同的疾病。除了高剂量外，反复感染或近期接种疫苗的报告在已知病例中也很常见。最近的一项研究评估了使用利妥昔单抗和西罗莫司进行免疫调节以减少抗抗体产生的效果，报告了成功的免疫预防，以防止不希望的免疫反应。然而，需要注意的是，不同AAV剂量组中纳入的患者数量不同，这可能会对观察到的结果产生重大影响。此外，还有几种抗补体疗法正在评估中，包括阻断C5激活的单克隆抗体eculizumab及其长效衍生物ravulizumab、C1抑制剂疗法以及抑制C3和C3b的肽。接受基因治疗的患者还接受了多种辅助治疗，包括血浆置换、糖皮质激素、eculizumab、抗高血压药、利尿剂、血小板和红细胞输注。大多数患者的TMA病例已得到解决，但至少有一例死亡报告。该患者作为补体因子I（CFI）基因（补体的抑制剂）的一个未知意义的变异携带者，可能具有潜在的易感性，再次强调了患者的遗传背景如何可能影响免疫反应和结果。基因治疗试验中的TMA病例已在其他地方进行了广泛综述。此外，还有在AAV给药后不久报告的其他死亡病例，包括一名DMD患者因内皮细胞损伤导致严重的弥漫性肺泡损伤和急性呼吸窘迫综合征，以及在一项针对Rett综合征的临床试验中，一名患者在接受3×10¹⁵ vg AAV载体通过鞘内途径给药后2周死亡，这是该给药途径的首例死亡病例。该患者出现了全身性高炎症综合征，其特征是异常的细胞因子释放、噬血细胞性淋巴组织细胞增多症和多系统炎症综合征。需要进一步调查以充分了解影响基因治疗的安全性、耐受性和持久性的因素。4.2 适应性免疫反应导致的免疫毒性在AAV给药后数周至数年，还观察到了其他免疫毒性。如上所述，针对衣壳的T细胞反应或针对转基因的免疫反应导致了临床毒性。这些通常与针对衣壳或转基因的T细胞反应相关，并与肝转氨酶（丙氨酸转氨酶[ALT]和天门冬氨酸转氨酶[AST]）升高或其他组织炎症有关。在最初的血友病试验之后，肝毒性还在几种临床试验中被观察到，包括脊髓性肌肉萎缩症（SMA）和X连锁肌管性肌病（XLMTM）的治疗中。对接受Zolgensma治疗的SMA患者的上市后监测揭示了肝毒性以及心脏事件和神经节病变。诺华公司报告了两例儿科患者因开始减少泼尼松龙剂量后发生急性肝衰竭而死亡。然而，迄今为止已有超过3700名患者接受了Zolgensma治疗，美国食品药品监督管理局（FDA）报告称肝毒性很常见，大约发生在三分之一的患者中，但通过泼尼松龙治疗可以解决。使用表达SMN1转基因的更接近生理水平的启动子在小鼠模型中显示出比Zolgensma更好的安全性和有效性。肝毒性还与XLMTM临床试验中患者的死亡有关。然而，对那些经历严重治疗相关肝胆不良事件的患者进行评估并未表明这些事件是由免疫反应引起的，而且似乎免疫调节治疗没有任何益处，这导致了对XLMTM和肝胆疾病的自然史的重新审视。4.3 心肌炎心肌炎在两项针对杜氏肌营养不良症（DMD）治疗的临床试验中被观察到。患者通常在AAV给药后1个月内出现肌钙蛋白增加、心室壁增厚和更多的炎症细胞浸润。在辉瑞公司的AAV9试验中有两名患者和在Sarepta公司的AAVrh74试验中有一名患者在给药后3-6周出现心肌炎，导致辉瑞试验中一名患者死亡。这些患者还出现了严重的肌炎，导致肢体以及球部和呼吸肌无力，所有三名患者都需要呼吸支持，尽管在恢复的两名患者中是短暂的。在DMD临床试验中还观察到了其他与抗转基因免疫反应相关的免疫介导肌炎（IMM）病例。DMD患者的炎症表型可能会进一步加剧对AAV载体的免疫反应。两名XLMTM患者出现了可能的心肌炎，并接受了类固醇和西罗莫司治疗，同时还接受了麦考酚酸酯和静脉注射免疫球蛋白治疗。在这两名患者中，心肌炎在4个月和10个月后分别得到解决。心肌炎还在针对庞贝病和TNFRII-Fc治疗的非人灵长类动物模型中被观察到。4.4 背根神经节毒性在一项使用AAV9通过鞘内注射递送针对SOD1的微RNA的肌萎缩侧索硬化症（ALS）临床试验中，观察到一名患者出现了背根神经节（DRG）毒性。在该患者中，神经系统症状和疼痛综合征以及磁共振成像扫描表明DRG毒性与基因治疗后4周出现的针对衣壳的T细胞相似。在增加免疫抑制后症状得到缓解，研究中的第二名患者接受了更积极的免疫抑制，并未出现DRG毒性的迹象。在非人灵长类动物研究中，DRG毒性被注意到与B细胞和T细胞浸润相关的神经元损伤，但毒性并未被免疫抑制所抑制。进一步在非人灵长类动物中利用微RNA靶点降低神经元中转基因表达的研究表明，DRG毒性是由转基因的直接毒性引起的，而不是免疫反应。其他研究表明，非蛋白质编码的RNAi构建物可能导致DRG毒性。因此，免疫反应在DRG毒性中的作用存在争议，仍有待澄清。5. 缓解免疫毒性相关不良反应的管理方案为了调节对AAV基因治疗的免疫反应，临床和临床前都采取了多种策略。目前还没有针对AAV基因治疗的标准免疫抑制方案，但在设计适当的免疫抑制策略时会考虑多个因素，例如给药途径和载体剂量。5.1 当前策略目前在临床上用于AAV基因治疗的最常见免疫调节药物是皮质类固醇，如甲泼尼龙、泼尼松和泼尼松龙。在皮质类固醇治疗后观察到促炎细胞因子和趋化因子的减少以及肝毒性降低。皮质类固醇治疗可以解决基因治疗后出现的肝转氨酶水平升高。皮质类固醇的剂量和给药时间可以有所不同，但通常以1-2 mg/kg的剂量给药4-133天，然后逐渐减量以使患者逐渐停止治疗。然而，一些患者在治疗初期或因出现临床症状而被给予高剂量的皮质类固醇。皮质类固醇可以单独使用，也可以与其他免疫抑制剂如雷帕霉素（mTOR抑制剂）或钙调磷酸酶抑制剂（如他克莫司）联合使用。他克莫司已被证明可以抑制调节性T细胞（Tregs）的增殖或功能，而雷帕霉素已被证明有助于诱导耐受性。一种三联免疫抑制方案已使用皮质类固醇、雷帕霉素和利妥昔单抗的组合来抑制B细胞和T细胞反应，已被证明可以有效调节对载体的免疫反应。麦考酚酸酯，它抑制B细胞和T细胞的增殖，以及环孢素，它抑制T细胞的增殖和激活，也已在AAV临床试验中使用。此外，还测试了限制补体激活的药物。Eculizumab用于通过阻断C5激活和MAC形成来对抗补体过度激活，并已在多项临床试验中进行测试。Ravulizumab是一种长效的下一代单克隆抗体C5抑制剂，用于治疗aHUS。一种C3抑制肽APL-9已被证明可以减少补体激活。Pegcetacoplan（APL-2或Empaveli）是另一种C3抑制剂，它靶向并阻断C3激活，这是所有三条补体途径的汇聚点。5.2 实验性药物/临床前发现由于高剂量基因治疗可能会引发更多的免疫和炎症反应，因此在提高AAV效率方面取得了重大创新，以减少需要输送以实现转基因治疗表达的剂量。在视网膜下空间与AAV共注射时，使用羟氯喹啉已被证明可以提高病毒效率，从而提高转基因表达。AAV衣壳在MHC中的呈递依赖于内体逃逸，因此抑制转导细胞中的蛋白酶体处理是一种被考虑的策略。然而，需要考虑安全性和有效性，因为蛋白酶体抑制剂可能对不同靶组织或与某些衣壳变体一起使用时产生不同的结果。这可能会给患者带来并发症，因为已报告临床批准的蛋白酶体抑制剂硼替佐米有严重的副作用。为了克服预先存在的免疫反应和重新给药，已经确定了许多其他靶点以靶向抗体形成。一种被提出的策略是使用空载体作为诱饵以阻断抗体反应。然而，空载体仍然可以触发CD8 T细胞反应并清除转导的细胞。血浆置换可用于从血液中清除抗体，但需要多轮才能清除针对AAV的高滴度中和抗体。其他方法可以清除AAV特异性抗体或特定的同种型。使用血浆置换与针对AAV2和AAV5的AAV抗体的免疫吸附相结合的策略，能够在数次治疗后将中和抗体滴度降低到1:5以下。进一步的生理盐水冲洗与直接注入非人灵长类动物门静脉的直接注射或一种不太侵入性的球囊导管引导注射也被发现可以最小化AAV中和抗体的影响。还可以利用细菌衍生的酶来清除抗体。由化脓性链球菌产生的Imlifidase（IdeS）和由马链球菌亚种 zooepidemicus产生的IdeZ可以裂解IgG，并已在AAV研究中用于降解中和抗体。此外，IgM裂解酶（IceM）的发现导致了一种融合酶的工程化，该酶对IgM和IgG都具有双重功能（IceMG），已被证明可以减轻抗体中和和补体激活。此外，由于新生儿Fc受体（FcRn）在IgG的半衰期中起着重要作用，使用FcRn抑制剂能够减少小鼠和非人灵长类动物中预先存在的中和抗体。重新给药可能在某些患者群体中是必要的，特别是在新生儿和儿童中，随着个体的成长，载体稀释或丢失更有可能发生。尽管上述策略可能有助于重新给药，但接受基因治疗的患者具有高滴度的中和抗体，可能难以克服，因此可能需要在首次给药后阻断AAV衣壳抗体的形成策略。使用利妥昔单抗（一种抗CD20抗体）进行B细胞耗竭已在多项临床试验中用于减少AAV抗体形成。在经过标准利妥昔单抗治疗的类风湿关节炎患者中也实现了中和抗体滴度的降低，但在1-2剂后，少于一半的受试者抗体滴度降至1:5以下。还提出了其他双重靶向方法，包括联合单克隆疗法靶向CD20和B细胞激活因子（BAFF），以允许在小鼠中重新给药。利妥昔单抗和环孢素A（一种钙调磷酸酶抑制剂）的进一步联合使用允许在非人灵长类动物模型中成功重新给药。雷帕霉素和伊布替尼（Bruton酪氨酸激酶抑制剂）的联合使用也已进行测试，这抑制了回忆反应并减少了循环浆细胞的数量，但未能降低记忆形成并允许成功重新给药。还进行了其他B细胞靶向策略，包括阻断CD28/B7和CD40/CD40L。在一种表面活性蛋白-B（SP-B）缺乏的小鼠模型中成功实现了重新给药，其中AAV6.2FF衣壳被输送到肺部多达五次，与未经治疗的动物仅存活5天或在单剂量后存活134天相比，中位生存期增加到296天。只有接受含有TLR9抑制性寡核苷酸序列的载体的动物才受益于重新给药，这表明这种益处依赖于抑制先天免疫反应。MyD88信号已被确定在B细胞反应和抗体产生中发挥重要作用，并且使用CRISPR-CAS9抑制其表达暂时导致血清中抗体减少并能够成功重新给药。通过使用ImmTOR（一种含有雷帕霉素的纳米颗粒）诱导调节性T细胞（Tregs）已被证明可以在与AAV共同给药时成功重新给药，已在多种动物疾病模型中证明，如肝内胆汁淤积症3型、甲基丙二酸血症和Crigler-Najjar综合征1型。ImmTOR进一步与B细胞靶向剂结合，如针对BAFF的抗体和伊布替尼，对减少抗AAV IgM和IgG抗体具有协同作用，并允许四次连续AAV给药。ImmTOR还在一项健康志愿者接受空载体衣壳的人类临床试验中进行了进一步评估。在接受ImmTOR治疗的患者中观察到针对衣壳的T细胞反应减少和延迟。5.3 通过调节性T细胞诱导耐受性在临床试验中，诱导耐受性也与稳定的转基因表达相关。几种基因治疗策略已被尝试诱导Tregs，包括在AAV衣壳上添加Treg诱导表位，称为Tregitopes，这能够扩大Treg群体同时抑制CD8 T细胞。Tregitopes还被探索作为AAV货物，用于诱导针对溃疡性结肠炎的耐受性疗法。此外，而不是诱导Tregs，一个小组输送了多克隆扩增的Treg群体或针对AAV衣壳的工程化嵌合抗原T细胞受体（CAR）Tregs，并表明AAV CAR Tregs可以在AAV基因治疗后抑制针对衣壳和转基因的免疫反应。其他研究利用针对转基因免疫反应的CAR Tregs用于血友病A或重新编程的抗原特异性细胞。在血友病A小鼠模型中测试了T细胞受体（TCR）融合构建物（TRuC）Tregs，并发现其比CAR Tregs更有效地抑制ADA形成。通过将B细胞抗体受体（BARs）转导到Tregs中，也在Tregs的背景下评估了BARs，这在耐受化血友病A ADA发育方面取得了成功。结论AAV有时被称为“几乎不是一种病毒”，因为它不具备许多病毒的常见特性。在临床应用中给予的高病毒载量的先天免疫反应令人惊讶地温和，但足以强烈激活适应性免疫反应。然而，随着临床试验中载体剂量的增加，与AAV基因治疗相关的免疫毒性也在增加，显然有一个被认为是安全的极限。限制这些观察到的免疫毒性将是rAAV基因治疗未来发展的一个关键挑战，并且正在为此目的开发几种策略。最终需要多个学科之间的协作努力来设计安全和高效的基因治疗，包括更好地理解病毒生物学、介导病毒-宿主相互作用的分子机制以及宿主免疫反应。本综述讨论了AAV免疫学研究的现状，以加强基因治疗科学家和临床医生之间的理解。这有望促进新的研究方向，例如短暂的宿主免疫调节，以提高细胞特异性靶向效率，减少需要输送以实现疗效的剂量，并减轻免疫毒性。关于派真生物

摘要：疫苗是对抗传染病的最重要的医学干预措施之一。自1796年爱德华·詹纳发现以来，疫苗已经将包括天花、白喉、肝炎、疟疾和流感在内的传染病的全球传播降低到根除水平。然而，开发安全有效的疫苗的复杂性仍然是对抗更多传染病的障碍。免疫刺激剂（或佐剂）是疫苗开发中不可或缺的因素，尤其是对于灭活和亚单位疫苗，因为与整个病原体疫苗相比，它们的免疫原性降低。佐剂在结构上非常多样；然而，它们在疫苗构建中的总体功能是相同的：增强和/或延长免疫反应。然而，必须承认并仔细管理由于使用佐剂可能导致的不良反应。了解佐剂效力和安全性的具体机制是疫苗中使用佐剂的关键先决条件。因此，对佐剂开发进行严格的临床前和临床研究至关重要。总体而言，佐剂的加入为推进疫苗开发提供了更多机会，免疫刺激剂的重要性推动了新型和更有效佐剂的出现。本文重点介绍了疫苗佐剂开发的最新进展，并提供了针对传染病的临床前和临床研究的详细数据。疫苗佐剂开发的未来展望也被强调。 关键词：免疫佐剂；传染病；临床前和临床试验 1.引言 传染病（或称传染性疾病）是由一个人（或动物）传给另一个人的传染性病原体引起的，这些病原体对全球人类健康产生了巨大影响。这些感染是由细菌、寄生虫、病毒或真菌（或其有毒副产品）引起的，传播方式包括直接、间接或通过媒介（例如蚊子）。根据世界卫生组织（WHO），低收入国家（占世界人口的36%）的十大主要死因与主要传染病有关，包括疟疾、结核病、人类免疫缺陷病毒（HIV）和流感（例如H1N1和H5N1），这些疾病在过去十年中严重影响了全球经济。最近，COVID-19（来自SARS-CoV-2冠状病毒家族）首次在中国武汉市被观察到，并且在2020年3月11日被世界卫生组织宣布为大流行后，现在已经占据了全球头条新闻。 Baker等人的综述强调了城市化对传染病的影响，以及气候、技术和人口变化对疾病出现、动态和传播的影响。在过去的几十年里，病原体的传播发生在野生和/或家养动物与人类之间，导致了全球严重的致命流行病（例如HIV-1、HIV-2、1918年流感和中东呼吸综合征冠状病毒）。农业和畜牧业的扩张导致了家养动物中抗生素的过度使用和杀虫剂的使用，对人类健康产生了负面影响。 存在一个界面，即人口老龄化与免疫功能下降，以及可能增加的控制传染病的任务，这增加了病原体出现的概率。随着全球景观的变化，药物和抗生素抗性增加的证据已经演变（例如抗疟疾药抗性）。尽管抗菌药物/抗生素已经显示出对治疗几种传染病（例如败血症、脑膜炎、白喉）的增加效果，但疫苗被视为长期预防（和/或治疗）全球传染病的最佳方法，因为疫苗在限制疾病爆发和疾病负担方面发挥着关键作用。 疫苗是18世纪晚期Jenner等人进行的开创性研究的结果，他们研究了针对牛痘病毒的疫苗开发，现在是全球用于刺激对传染病的保护性免疫的最有效公共卫生策略，并被认为每年拯救了数百万人的生命。尽管已经开发了一系列成功的疫苗，这些疫苗基于减毒或灭活的微生物（或其毒素），但至今仍缺乏有效疫苗用于治疗和/或预防当今已知的许多传染病。 随着疫苗开发的进展，从传统的疫苗（由整个、灭活（或减毒）的有机体组成）到最近发现的亚单位疫苗（使用感染性抗原的一小部分），疫苗显示出巨大的商业潜力，副作用最小。由于大多数临床开发中的疫苗候选物是高度纯化的蛋白质和肽，由于它们自身免疫原性差（主要与去除危险信号和它们的小尺寸有关），需要免疫学佐剂（免疫刺激剂）来增强和/或指导免疫反应。然而，尽管公认需要新型佐剂，但目前许可的人类疫苗中佐剂仍然非常少。 本综述总结了佐剂在临床前和临床传染病研究中的应用，评估了佐剂在有效疫苗开发中的作用，重点关注了它们的药物和免疫学特性。佐剂按其来源、作用机制或化学特性进行分类，表1识别了在临床前和临床开发中研究的传染病疫苗的佐剂类型。 2.疫苗佐剂  尽管有些模糊，但佐剂是根据其来源、作用机制和/或物理化学特性进行分类的（表1）。后基因组时代的疫苗开发进展使得设计高度纯净、安全和简单的疫苗成为可能。其他疫苗开发挑战也同时出现，包括蛋白质和肽的固有缺乏免疫刺激性特性。因此，疫苗佐剂被认为是现代疫苗学中的关键组成部分，提供了增强和/或塑造免疫反应所需的帮助。尽管基于整个（或灭活）细菌或病毒的疫苗对病原体具有固有的免疫原性，但佐剂是低免疫原性抗原疫苗（例如肽、小半抗原）所需的组成部分。此外，佐剂还具有许多其他有利特性，包括能够克服老年人的免疫衰老，延长疫苗的记忆，扩大抗体库（包括抗体反应的幅度和功能性），提供剂量节约的手段，以及增强有效的T细胞反应。一般来说，佐剂通常执行两种免疫学功能：（1）免疫刺激剂，它们本质上作用于免疫系统，以改善抗原的免疫反应；以及（2）疫苗载体（例如乳液、脂质体、病毒体、类病毒颗粒、聚合物纳米颗粒佐剂和基于脂质的纳米颗粒佐剂），它们准确地传递和呈现疫苗抗原，以有效的方式和速度被抗原呈递细胞摄取，以诱导和/或增强抗原特异性免疫反应。 2.1.佐剂功能中的T辅助细胞相互作用 佐剂对于增强和指导疫苗抗原的适应性免疫反应至关重要，这种反应由两种类型的淋巴细胞——B细胞和T细胞介导。在细胞因子激活后，B细胞分化为记忆B细胞（长寿命的抗原特异性B细胞）或浆细胞（负责分泌大量抗体的效应B细胞）。在这里，大多数抗原通过激活的T辅助（Th）细胞激活B细胞，主要是Th1和Th2细胞（图1）。 Th1细胞分泌干扰素（IFN）γ激活巨噬细胞，并诱导Th2细胞产生吞噬抗体，导致对细胞内病原体（侵入性细菌、原生动物和病毒）的细胞反应。Th1反应激活细胞毒性T淋巴细胞（CTL），诱导感染细胞内病原体的细胞死亡。自然杀伤（NK）细胞也被Th1反应激活，这些细胞在诱导病毒感染细胞的凋亡中起着重要作用。 图1.疫苗接种后的免疫反应示意图。在适应性免疫中，与佐剂结合的抗原被传递给并结合到未成熟的树突状细胞，形成抗原呈递细胞（成熟的树突状细胞），这些细胞被主要组织相容性复合体(MHC)类I和MHC-II识别，从而分别与未成熟CD8+细胞和未成熟CD4+T细胞上的T细胞受体结合。未成熟的CD4+细胞刺激产生Th1（或Th2），分别负责分泌不同的细胞因子，并诱导细胞和体液免疫。 Th2细胞分泌细胞因子（例如，白细胞介素和I型干扰素），这诱导B细胞，导致中和抗体的产生。Th2细胞通常诱导体液（抗体）反应，这对于身体防御细胞外病原体至关重要。识别免疫球蛋白Fc部分的受体(FcR)在应对传染病和预防慢性炎症或自身免疫疾病中起着重要作用。不同的FcR识别并结合不同的免疫球蛋白，将信号传递到细胞内。典型的免疫球蛋白(Ig) G(IgG)、IgM和IgA被FcR受体识别，由异质受体激活产生的细胞信号控制，通常称为内外控制。 由于通过使用佐剂大大调节了对疫苗的Th反应的幅度和类型，随着我们对“免疫原性”和“佐剂性”机制的理解增加，正在开发和/或优化新的佐剂和佐剂配方。2.2.模式识别受体在佐剂功能中的重要性 Toll样受体(TLR)激动剂构成了一个大的佐剂家族。它们已被证明在刺激对传染病疫苗开发的先天和适应性免疫中发挥关键作用（表1）。Toll样受体作为模式识别受体家族，是先天免疫系统识别入侵病原体的主要感应器。 在1988年，TLRs最初被识别为参与果蝇Drosophila胚胎发育和抵抗细菌及真菌感染的因素，甚至低至线虫（例如秀丽隐杆线虫和肠线虫）也发现了TLRs。人类中有10种TLRs（TLR1-TLR10），小鼠中有12种TLRs（1-9和11-13）。TLRs位于细胞表面（TLR1、2、4、5和6）或细胞内腔室（TLR3、7、8和9）。TLRs识别微生物中的不同结构（激动剂），这些结构被称为病原体相关分子模式或损伤相关分子模式。这些结构的配体与TLRs结合，引发一系列细胞内信号传导途径，诱导产生参与炎症和免疫的因素。这些激动剂针对的是病原体细菌、病毒、寄生虫和真菌中常见的广泛模式，包括核酸、脂肽、肽聚糖和脂蛋白。TLR激动剂佐剂（表达在巨噬细胞和树突状细胞上）的主要优势在于它们在配体结合后激活信号传导途径的能力，刺激先天和适应性免疫。小分子TLR激动剂佐剂的设计对于根除炎症、癌症、感染和自身免疫具有巨大潜力。例如，TLR1/2和TLR3佐剂（L-pampo）与SARS-CoV-2抗原结合，形成COVID-19疫苗候选物。Jeong的研究小组将这种疫苗候选物接种给雌性BALB/c小鼠和雌性雪貂。据报道，L-pampo佐剂对SARS-CoV-2抗原刺激了强烈的体液和细胞介导的免疫反应。抗体水平高于其他佐剂（例如，氢氧化铝、AddaS03TM和氢氧化铝与CpG的结合。L-pampo不仅产生了中和抗体，而且在雪貂中保持了保护效果。 TLR激动剂在临床传染病疫苗研究中具有巨大潜力。TLR激动剂的使用受到某些信号传导途径中炎症反应过表达的限制，这在加强炎症性疾病方面产生了显著影响。不可能作为抗感染或抗肿瘤剂载体特异性激活免疫细胞，导致激活自身克隆，从而产生自身免疫反应。TLR激动剂的另一个缺点是增加了对肿瘤的易感性风险。因此，对于TLR激动剂作为传染病疫苗佐剂的使用，尤其是对人类，需要严格监管，以最小化不良反应的风险。 在最近的研究中，鞭毛蛋白、Pam3CSK4、L-pambo衍生物作为TLR 1/2激动剂，GLAAF、单磷酸脂A（MPL）作为TLR4激动剂，Resiquimod（R-848）作为TLR7/8，以及胞嘧啶和鸟嘌呤的寡脱氧核苷酸，带有磷酸二酯骨架（CpG ODNs）作为TLR9激动剂，在临床前和临床试验中显示出改善的效力和安全性。 3.基于矿物的佐剂  铝盐（100-1000纳米不溶性凝胶状颗粒）在佐剂发现中有着悠久的使用历史，大部分在人类疫苗中显示出极佳的安全性，始于20世纪30年代的白喉和破伤风疫苗中的氢氧化铝佐剂。铝佐剂的商业来源包括磷酸铝、氢氧化铝、无定形磷酸硫酸铝、硫酸磷酸氢氧化铝或铝和镁氢氧化物的混合物，具有不同的物理化学特性（包括大小和电荷）。 氢氧化铝能够刺激强烈的体液反应（Th2），尽管氢氧化铝与免疫系统的相互作用尚未明确。氢氧化铝佐剂允许短期储存库效应，这使得抗原在注射部位得到控制释放。这种储存库形成是在静电相互作用（可溶性抗原与氢氧化铝之间）之后发生的，间接延长了注射部位的抗原释放，而氢键、范德华力、疏水相互作用和配体交换也起着重要作用。此外，研究表明，免疫后14天抗原-氢氧化铝储存库减少，对免疫反应没有任何影响。相反，也有关于氢氧化铝在引发这种储存库效应方面作用的相反说法。 氢氧化铝盐有可能刺激Nod样受体（NLR）家族，含吡啶结构域3（NLRP3）炎症体激活。一些研究得出结论，氢氧化铝佐剂诱导NLR3炎症体诱导的caspase-1激活，以及分泌IL-1β、IL-18和IL-33细胞因子到其生物活性形式，这影响了氢氧化铝介导的细胞招募、树突状细胞成熟、抗原摄取和T细胞分泌。然而，炎症体在氢氧化铝盐佐剂活性中的作用仍在讨论中。氢氧化铝佐剂的刺激性因子直接触发辅助T细胞类型2（Th2）免疫反应，通过招募免疫球蛋白（Ig）G1、IgE、IL-4、IL-5和嗜酸性粒细胞，提高氢氧化铝佐剂疫苗的免疫刺激性活动。 作为佐剂，磷酸铝与抗原的亲和力比氢氧化铝高，仅仅是由于体内更强的配体交换。在这里，通过使用适当的磷酸盐缓冲液预处理氢氧化铝盐来修改氢氧化铝佐剂的亲和力。对铝盐的扩展研究增强了它们作为疫苗佐剂的作用方式的理解，并导致它们在传染病疫苗开发中的广泛使用（表2）。氢氧化铝盐价格低廉，安全且易于配制、储存和运输，但通常比现代乳液型佐剂弱。氢氧化铝佐剂（例如TWINRIX®、PEDIARIX®、Alhydrogel®和Adju-Phos®）已获得美国食品药品监督管理局（FDA）的监管批准，用于25种商业传染病疫苗（例如甲型肝炎、甲型流感和脑膜炎球菌B群），尽管它们最突出地用于白喉和破伤风疫苗，在那里它们与类毒素和灭活有机体结合使用（表2）。 矿物基佐剂的局限性包括免疫沉淀不足（与其他佐剂类别相比）、Th1介导的和细胞毒性T淋巴细胞（CTL）细胞反应的低产生，以及嗜酸性粒细胞和IgE分泌的增加，导致过敏反应和/或过敏性反应的风险增加。由于矿物基佐剂不可生物降解，肾功能受损的患者已被证明会因系统性积累铝矿物而引发神经系统疾病和骨骼疾病。 钙磷酸盐（CaP），最初在法国用作白喉、破伤风、百日咳和脊髓灰质炎疫苗的佐剂，在1980年代末被氢氧化铝盐完全替代。今天，CaP佐剂仍然是世界卫生组织批准的人类疫苗佐剂，被认为是疫苗中铝盐的安全替代品。CaP佐剂已被证明能对病原体引发体液、细胞和粘膜免疫反应，具有出色的生物降解特性。与基于铝的佐剂相比，CaP佐剂增强了IgG1抗体的分泌，同时减少了IgE抗体。 3.1.矿物基佐剂的临床前和临床开发 随着各种基于氢氧化铝的佐剂在商业疫苗中的成功，对矿物基佐剂的临床研究继续更深入地探索它们的功能、机制和安全概况（表2）。 3.1.1.氢氧化铝佐剂 尽管氢氧化铝佐剂在疫苗开发中已被广泛使用数十年，但这些佐剂的宿主代谢途径尚未完全理解。Khoomrung等人的临床前研究评估了小鼠接种含有2%氢氧化铝的结核病（M. tuberculosis H56融合蛋白）疫苗后血清中脂质浓度的水平（表2）。这项研究发现脂质代谢参与了小鼠皮下给药后氢氧化铝佐剂疫苗的摄取。在这里，接种H56融合蛋白加氢氧化铝和单独H56融合蛋白的小鼠中发现了代谢物和脂质的差异。据报道，与接种抗原单独的小鼠相比，接种H56加氢氧化铝的小鼠在接种后24小时的甘油三酯（TAGs）的脂质代谢反应显著增加。与单独抗原相比，接种后24小时的长链不饱和脂肪TAGs的脂质代谢在接种后24小时减少，短链脂肪酸在接种后168小时减少。最近的证据强调了脂肪酸合成和脂质氧化显著影响免疫细胞分化和功能。需要进一步研究以评估氢氧化铝佐剂给药后刺激的脂质氧化和脂肪谱是否代表特征性的Th2免疫反应，以及与其他佐剂相比如何。 氢氧化铝佐剂的主要局限性是它们刺激IL-10的产生，这抑制了Th1反应。与单独用PBS处理的小鼠相比，用氢氧化铝结合利什曼病主要抗原（来自利什曼物种的重组多蛋白，MML多蛋白）的小鼠在腹腔内注射后迅速产生IL-10，以确定腹膜腔、引流淋巴结和脾脏中活细胞和IL-10阳性细胞的总数。由于Th1免疫反应对于消除几种传染病（例如，HIV、肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、百日咳杆菌）至关重要，氢氧化铝在刺激树突状细胞和巨噬细胞产生的IL-10分泌中的参与，以及氢氧化铝对Th1反应的潜在抑制作用，因此阻碍了氢氧化铝成为通用疫苗佐剂。 氢氧化铝的免疫原性和安全性继续是其在新型传染病疫苗中使用的强大优势。2017年完成了一项含氢氧化铝的呼吸道合胞病毒（RSV）疫苗的1期临床研究（NCT01905215）（表2）。在这项1期临床试验中，用两种氢氧化铝佐剂配方（30 µg RSV-PreF/氢氧化铝和60 µg RSV-PreF/氢氧化铝）对128名健康志愿者进行了纯化的重组RSV蛋白F疫苗（设计为优先保持融合前构象的RSV-PreF）的免疫接种，分析了安全性和免疫原性。这种RSV-PreF疫苗对氢氧化铝佐剂配方的免疫反应增强，而所有研究组从接种后60天起免疫反应下降，突出了疫苗接种时机在疾病保护中的重要作用。在两种氢氧化铝佐剂RSV疫苗中，除了常见的疫苗副作用（例如，注射部位疼痛、疲劳）外，疫苗配方在安全性和反应原性方面没有显著差异，没有报告与疫苗相关的严重不良事件或退出。 此外，还测试了与磷酸铝共同给药的重组RSV融合蛋白疫苗（RSV F）在育龄女性中的安全性和免疫原性2期研究（NCT01704365；表2）。得出结论，所有疫苗都是可耐受的，最常见的不良反应（注射部位反应、中度疼痛、疲劳、可接受的头痛）是可以接受的。与单独疫苗相比，与磷酸铝结合的RSV F疫苗增强了更强的免疫反应和保护性抗体。基于2期临床试验的成功结果，对孕妇进行了RSV F疫苗的3期临床试验（NCT02247726），表明接种RSV疫苗的孕妇所生的婴儿在出生时的抗F免疫球蛋白G（IgG）和帕利珠单抗竞争抗体水平高于接受安慰剂疫苗的妇女所生的婴儿。在这里，这种呼吸道合胞病毒融合（F）蛋白疫苗（RSV F）的耐受性更好，只有轻微和短暂的注射部位疼痛，与安慰剂组报告的类似。 由于HIV在人类免疫系统中的快速变异，开发安全有效的HIV疫苗已被证明极其困难。在HIV患者中发现广泛中和抗体，促使研究将HIV-1包膜作为疫苗抗原进行研究。HIV包膜糖蛋白（Env）刺突是病毒编码的抗原，暴露在病毒表面，触发中和抗体的分泌。HIV疫苗设计已集中在产生可溶性Env三聚体模拟物，以克服原始Env三聚体的固有不稳定性和灵活性。在过去的几十年中，HIV-1疫苗的安全性和有效性已在早期人体试验中进行了测试，导致选择了几种包膜蛋白（例如，1086.C gp120、1086.C gp140、BG505 SOSIP.644 gp140）作为有希望的HIV疫苗候选物。 2005年，AIDSVAX B/E（含有gp120抗原并用氢氧化铝佐剂的HIV疫苗候选物）未能通过3期临床试验（NCT00006327；表2），因为它未能成功预防HIV感染。2013年，优化的HIV衍生BG500 SOSIP，gp140三聚体被证明能分泌中和抗体，消除了大多数循环HIV病毒的中和表型（滴度1），中和自体病毒株（滴度2），以及一些异质（滴度2）HIV病毒。2019年，与氢氧化铝共同给药的HIV Env三聚体（BG505 SOSIP.664 gp140）在临床前开发中提供了增强的免疫原性和安全概况，与单独的Env三聚体相比，从这一结果出发，这种疫苗在1期临床研究中进行了评估（NCT04177355），结果未知。 2019年冠状病毒病爆发（COVID-19），由SARS-CoV-2（严重急性呼吸综合征冠状病毒2）病原体引起，对全球人类健康和经济造成了重大影响。由于疫苗接种被视为预防这种致命传染病进一步传播的主要方法，发现冠状病毒病毒表面的糖基化刺突蛋白对病毒进入宿主细胞至关重要。因此，这种刺突蛋白成为人类免疫抗体和全球协作疫苗开发的首要目标。 用氢氧化铝盐佐剂的灭活SARS-CoV-2疫苗（PiCoVacc）增强了啮齿动物中S特异性、受体结合域（RBD）特异性和N特异性IgG。此外，任何SARS-CoV2疫苗引发的T细胞反应都得到了很好的控制，以消除免疫病理。基于这一临床前评估，PiCoVacc疫苗在3期临床研究（NCT04456595）中进行了评估，再次诱导了RBD特异性IgG和中和抗体，但未在人类中引发特定的细胞免疫反应。未报告不含氢氧化铝的抗原评估。 SCB-2019是领先的COVID-19亚单位疫苗候选物之一，是通过哺乳动物细胞系中的三聚体标签技术工程化的重组SARS-CoV-2融合蛋白。在1期临床试验中，这种抗原与AS03或氢氧化铝/CpG佐剂（NCT04405908；表2）联合进行了临床评估，与不同的SCB-2019抗原剂量配方。在测试剂量水平下，佐剂化的SCB-2019（AS03或CpG/Alum）分泌了更高的IgG滴度和更强的免疫原性，与非佐剂化的SCB-2019相比。在两次免疫后，CpG/Alum和AS03佐剂化的SCB-2019疫苗均显示出增强的Th1极化和CD4+ T细胞反应，分泌针对SARS-CoV-2的保护性抗体。与AS03佐剂疫苗相比，用CpG/Alum佐剂的致病性抗原增强了较低剂量依赖性免疫反应，特别是在老年疫苗组中。 当前的临床前和临床研究继续改进我们对氢氧化铝作为传染病疫苗佐剂的理解和应用。氢氧化铝在新型疫苗试验中的持续突出使用，包括最近的COVID-19疫苗，证明了其有效性和安全性。在这里，氢氧化铝在人类中诱导了中等强度的IgG抗体反应，但未能产生细胞免疫反应。尽管先进的研究增加了对氢氧化铝作为疫苗佐剂的知识，但研究诱导细胞反应和生物功能（例如，IL-1β和中性粒细胞积累）仍然对于推进其在全球传染病疫苗开发中的作用至关重要。 3.1.2.钙磷酸盐佐剂 钙磷酸盐（CaP）佐剂在几种针对传染病的临床前疫苗试验中进行了探索（表2）。人类口蹄疫病毒（FMDV）是亚太地区（包括马来西亚、新加坡和日本）最常见的致死原因。自1969年发现以来，数百万儿童（5至10岁之间）受到这种传染病的影响。人类肠道病毒71（也称为肠道病毒A71或HEV-71），是小RNA病毒科肠道病毒属的一种病毒，以其在儿童中引起严重神经系统疾病和手足口病的流行而闻名。遗憾的是，市场上尚未有疫苗和有效的抗病毒疗法来预防这种疾病。Saeed及其同事证明，与单独抗原相比，用CaP共同给药的灭活HEV-71在兔体内经皮给药后刺激了更高水平的EV-7特异性和保护性IgG抗体。此外，这一临床前试验表明，纳米级（73纳米）CaP佐剂产生了更高的HEV-71抗体滴度和显著的保护性免疫反应，与微米级（1.7微米）CaP佐剂相比。此外，Jopappa及其同事用CaP包裹的FMDV'O'P1-3CD DNA抗原（包括口蹄疫病毒衣壳的所有结构和非结构基因）在纳米级（直径50-100纳米）给小鼠和豚鼠腹腔内给药（表2）。与裸露（未佐剂化的）DNA疫苗相比，CaP包裹的FMDV DNA疫苗诱导了更强、显著的细胞介导和体液免疫反应。尽管这种纳米颗粒DNA疫苗的中和抗体滴度低于传统的FMD疫苗（与氢氧化铝或皂角苷佐剂结合的化学灭活全病毒抗原），但在这一临床前试验中，观察到小鼠（100%）和豚鼠（87.5%）对FMD病毒的更高保护。这种疫苗显示出疗效潜力，但迄今为止尚未记录临床试验。另一种使人衰弱的传染病是单纯疱疹病毒（HSV），它属于包括1型（HSV-1）和2型（HSV-2）的单纯疱疹病毒亚科。HSV-1主要引起口腔和眼部感染，而HSV-2引起生殖器感染。HSV-1和HSV-2均在神经系统上引起严重感染和神经系统疾病（例如，失明、脑膜炎和脑炎）。一个研究HIV疫苗的研究小组，He等人，评估了一种含有灭活HSV-2病毒蛋白的CaP纳米颗粒包裹的疫苗。在小鼠腹腔内给药后，CaP佐剂HSV-2疫苗刺激了增加的IgG2a反应，有效保护了活HSV-2感染，并与氢氧化铝佐剂疫苗配方相比减少了IgE反应。迄今为止，只报告了矿物基佐剂HSV疫苗的临床前数据，其他佐剂类别（例如，AS04、Matrix-M和QS-21）已进入临床试验（表2）。尽管CaP佐剂的作用机制未知，但它被认为与铝佐剂类似，允许储存库效应，并解释了抗原随时间的缓慢释放。通过在CaP纳米颗粒中包裹病原体（例如，HIV-1病毒蛋白），宿主细胞有效地摄取复合物，促进随后的抗原表达。因此，由于其简单的配方、物理化学特性以及能够用于需要不同给药途径的疫苗，CaP佐剂将在具有持续释放能力的单剂量疫苗的未来设计中发挥巨大潜力。CaP纳米颗粒已在临床试验中获得广泛批准，用于诊断目的和骨再生，预计将在未来几年开始评估CaP纳米颗粒疫苗的临床试验。 3.1.3.其他矿物佐剂 除了铝和钙佐剂外，其他金属盐（例如，铁和铍）也被用作疫苗佐剂。例如，具有出色的安全性和低成本生产的氧化铁（IO）纳米颗粒（<20纳米），被用作寻找疟疾疫苗的疫苗传递平台。Pusic及其同事选择了红细胞表面蛋白1（rMSP1）作为重组疟疾抗原，并与IO纳米颗粒佐剂（rMSP1-IO），在小鼠模型中皮下给药后，这一临床前试验报告了100%的响应性，抗体滴度（IgG），与用Montanide ISA-51佐剂的rMSP1小鼠相比，诱导了高水平的抑制寄生虫抗体。 4.微生物/细菌佐剂  4.1.鞭毛蛋白佐剂  鞭毛蛋白是鞭毛的结构组成部分（亚单位蛋白），鞭毛是革兰氏阴性细菌上发现的一种鞭毛状运动器官。鞭毛蛋白由高度保守的N-和C-末端域（D1和D2域）组成，中间是一个高度可变区域（D3域）。每个细丝包含超过20,000个单体鞭毛蛋白（Flic）。鞭毛蛋白具有很强的寡聚潜力，可以在体外聚合成细丝，通过胚系编码的模式识别受体，Toll样受体（TLR）5，刺激先天和适应性免疫反应。在这里，鞭毛蛋白的D1和D2域对TLR5的识别至关重要，刺激促炎反应。鞭毛蛋白有助于激活B细胞和T细胞上的TLR5，增强长期、T细胞依赖的抗体免疫反应，而聚合鞭毛蛋白佐剂通过交联B细胞受体激活B细胞，刺激体液IgM免疫反应，无需T细胞的帮助。鞭毛蛋白还刺激大量先天和非免疫细胞（例如，B细胞和T细胞、树突状细胞、自然杀伤细胞和上皮细胞）分泌促炎细胞因子和趋化因子，这导致激活抗原特异性适应性免疫反应。使用鞭毛蛋白作为疫苗佐剂，引流淋巴结中实现了更高浓度的趋化因子和细胞因子，最大化了抗原特异性淋巴细胞遇到其抗原的机会。 Flagellin佐剂的临床前和临床开发 VAX-102流感疫苗（表2）包含流感A病毒基质蛋白（M2e）抗原，这是一种24个氨基酸的小型非糖基化外域，与来自鼠伤寒沙门氏菌的鞭毛蛋白佐剂结合。VAX-102在小鼠肌肉免疫后，与未佐剂化的抗原相比，显示出更强的免疫反应。VAX-102的1期临床试验（NCT00603811）在健康志愿者中得出了有希望的安全性数据，M2e/鞭毛蛋白疫苗显示出增强的强烈免疫反应，并最大化了接种后的保护反应。这次试验的结果暗示了针对老年人口的改进型流感A疫苗，目前的流感A疫苗需要每年免疫，诱导新的免疫反应，目前随着年龄的增长，这种反应显著恶化。 针对老年人口的疫苗开发是公共卫生服务面临的一个重大挑战，因为不可避免的老化免疫系统。这是由于先天免疫系统细胞受体的故障、未成熟T细胞的减少、T细胞组成群体的改变以及记忆细胞的复制性衰老。因此，与年轻群体相比，老年人的疫苗接种效果显著降低。因此，有必要为老年人设计特定疾病的疫苗，同时考虑到诱导长期和保护性免疫反应的重要性。 VAX-125结合了流感A血凝素（HA）1域的球形头部（氨基酸62-84）和鞭毛蛋白，这种疫苗旨在保护老年人口免受季节性流感的侵害。VAX-125在65岁以上健康人（NCT00966238）和18至49岁之间的年轻成人（NCT00730457）的1期临床试验中进行了评估。两项试验的结果表明，VAX-125在所有剂量水平上的肌肉给药均能良好耐受，注射部位有轻度至中度疼痛，没有严重不良事件。研究表明，年轻健康成人分泌IgG抗体，并诱导针对原生病毒的功能体液免疫。此外，VAX-125在65岁以上疫苗组中产生了增强的（10倍）IgG抗体水平增加，并保持了疫苗后的保护。因此，鞭毛蛋白被视为消除老年人口免疫衰老的有用和有效佐剂，使VAX-125成为预防年轻人和老年人口流感A流行的有希望的新疫苗候选物。此外，VAX2012Q疫苗（表2）包含四种季节性流感株（H1N1流感A的HA1-2亚单位；H3N2流感A的HA1球形头部的57个氨基酸蛋白；山形流感B的HA1亚单位；维多利亚流感B的HA1-2亚单位），每个都与鞭毛蛋白佐剂结合。这种疫苗已完成成人季节性流感疫苗的1期临床研究，现在正在进行2期临床研究（NCT02434276；表2）。1期研究的结果（NCT02015494；300名健康成人；年龄在18至40岁之间）表明，VAX2012Q疫苗在所有剂量水平上都能耐受，除了轻度注射部位疼痛和短暂的寒战和发烧外，没有不良事件。VAX2012Q在所有剂量水平上产生了IgG抗体，并增强了体液免疫反应，具有保护性免疫反应。 鼠疫是一种急性和致命的人类和动物传染病，由革兰氏阴性球杆菌耶尔森氏菌引起，迄今为止，没有商业疫苗针对肺鼠疫提供保护。Mizel及其同事设计了两种保护性抗原（F1和V蛋白）的耶尔森氏菌重组蛋白，然后与鞭毛蛋白的高变区域结合，形成最终的疫苗候选物（鞭毛蛋白-F1-V）。在小鼠和两种非人灵长类动物中进行鼻内免疫后，所有动物种均报告了强效的抗F1和抗V体液免疫反应，细菌在接种后3天内完全清除，与未佐剂化的疫苗相比，显示出显著的接种后保护性免疫反应。 在这些出色的结果之后，开始了一项1期临床试验（NCT01381744），将鞭毛蛋白F1-V重组融合蛋白肌肉免疫到45岁的健康志愿者中；然而，迄今为止，这次试验没有进一步的信息。 4.2.脂多糖佐剂 脂多糖是革兰氏阴性细菌外膜上的内毒素，由三部分组成：多糖O抗原、核心寡糖和疏水性脂质A（图2）。 图2.大肠杆菌脂多糖的结构。缩写：Gal：D-半乳糖；Glu：D-葡萄糖；Hep：L-甘油-D-甘露-庚糖；KDO：3-脱氧-D-甘露-辛-2-酸；P：磷酸盐。 许多革兰氏阴性生物的脂多糖（包括细菌和病毒）衍生的内毒素与模式识别受体复合体（例如，TLR4、CD14）和髓样分化蛋白2（MD-2；一种25-kD糖蛋白）结合，导致免疫细胞的激活和炎症细胞因子的产生，进而诱导对致病抗原的先天和适应性免疫反应。作为佐剂，脂多糖已被证明能诱导Th1偏向的免疫反应，然而，脂多糖结构的修饰触发了疫苗对抗特定病原体所需的免疫反应，同时降低其毒性。 脂多糖的化学处理与脂多糖生物合成途径的遗传修饰相结合，已导致内毒素的有希望的减少，同时仍保持脂多糖的免疫刺激性特性。对佐剂开发重要的修饰脂多糖衍生物的例子包括MPLA（单磷酸脂A）和GLA。 脂多糖佐剂的临床前和临床开发 由于TLR激动剂具有强大的免疫原性潜力，新型给药途径一直是疫苗研究的前沿。TLR4是哺乳动物中首次鉴定的类视黄醇受体，它在炎症途径中起着关键作用，使其成为佐剂开发的理想的激动剂。MPLA是革兰氏阴性细菌脂多糖内毒素的生物活性部分，也是TLR4激动剂，已被批准用于几种FDA和欧洲疫苗中的人类佐剂。例如，MPLA已在乙肝疫苗、Fendix®（从乙肝病毒中选择的致病DNA序列）中获得许可，该疫苗广泛用于肾功能衰竭患者，以及人类乳头瘤病毒（HPV）疫苗、Cervarix®（来自HPV-16和HPV-18的病毒样颗粒），在减少持续性感染和宫颈病变方面非常有效（表2）。有趣的是，MPLA的临床级形式（3-O-去酰基-40-单磷酸脂A[MPL]佐剂™）与其他佐剂（例如，氢氧化铝、佐剂系统[AS]01，AS02）结合，形成了一种组合佐剂，以改善疫苗抗原的“机械”传递（表2）。GLA是一种合成的TLR4激动剂，从明尼苏达沙门氏菌中纯化而来，是一种去毒化的细菌脂多糖，是一种六酰化分子。与异质的MPLA相比，作为佐剂，GLA在摩尔基础上更具效力，当测试激活人类树突状细胞和外周血单核细胞时，增强了共同给药重组抗原的免疫原性，允许细胞因子分泌（例如，IL-1、IL-10和INF-α）并产生细胞介导和Th1免疫反应。皮肤是疫苗给药的有效部位，可以作为皮下、肌肉内或皮内给药等传统免疫途径的替代。皮内疫苗技术（例如，微针贴片，其表面含有一层干燥的抗原，通过接种后微针将其嵌入皮肤内）能够以较低剂量产生相当于其他给药途径的抗体反应，这被称为“剂量节省”。这些微针贴片易于自行在皮肤上给药，减轻了需要训练有素的卫生专业人员来接种疫苗的必要性。狂犬病是一种在世界100多个国家发生的动物源性疾病，一旦症状出现就是致命的。然而，通过肌肉内给药的狂犬病疫苗的全剂量成本限制了其在低收入国家的广泛应用。狂犬病疫苗的皮内给药提供了一种同样安全和免疫原性的疫苗，仅需要20%的剂量用于暴露后预防，显著降低了传统疫苗的成本60%至80%。因此，狂犬病的皮内疫苗接种在印度、斯里兰卡和泰国得到接受和使用，每年大约接种1500万剂。有趣的是，使用不同给药途径（肌肉内和皮内）对患者进行相同的乙肝疫苗免疫接种，结果显示皮内给药比肌肉内给药具有更高的免疫原性，血清转换率显著优于肌肉内给药的疫苗。然而，已经使用了几种类型的微针（例如，涂层或溶解型）在疫苗传递中，将干燥的抗原释放到表皮和真皮中，而没有控制抗原释放。Du及其同事开发了一种空心微针，用于将模型抗原（卵清蛋白）与四种不同的佐剂（包括PLGA纳米颗粒、脂质体、明胶纳米颗粒和二氧化硅纳米颗粒）一起传递到小鼠体内。这四种佐剂的临床前结果表明，空心微针传递诱导了强烈的体液免疫反应，其中PLGA纳米颗粒和脂质体比明胶纳米颗粒和二氧化硅纳米颗粒诱导更强的IgG2a反应，作为本研究的一部分。最近的一项临床研究使用皮内疫苗接种治疗流感，使用从致病性流感病毒株H5N1中鉴定出的Medicago H5-VLP抗原。这种Medicago H5-VLP抗原与TLR4 GLA佐剂一起作为水性配方（GLA-AF）共同给药。在小鼠、豚鼠和雪貂中进行了临床前研究，每个体内试验都有不同的目的。第一项研究（小鼠）评估了免疫原潜力，其中佐剂组与对照组（未佐剂）相比，诱导了增加的IgG2c水平。在这里，GLA佐剂被证明能诱导Th1偏向的免疫反应。除此之外，只有在GLA-AF接种的小鼠中检测到骨髓源性浆细胞，这表明当GLA存在时，可以产生更持久的免疫反应。第二项微针研究（豚鼠）评估了疫苗的安全性，皮肤状况、体重和体温变化是三个主要的调查元素。在这里，测试和对照动物都没有显示出任何安全问题。第三项，也是最后一项研究，调查了GLA佐剂的功能和必要性，使用雪貂挑战模型来确定保护效果。流感疫苗（Medicago H5-VLP抗原+GLA-AF佐剂）旨在刺激对大流行威胁的快速反应，因此，在接种疫苗后3周，对异源A/Vietnam/1203/04 H5N1流感病毒株的挑战中，GLA-AF佐剂疫苗提供了80%的生存率，与没有GLA-AF的对照动物相比。这些临床前研究为开始多剂量第1阶段临床试验（NCT01657929；表2）提供了足够的证据，该试验包括多个中心的105名志愿患者。这项试验评估了安全性、免疫原性和耐受性，包括高血凝抑制（HAI）滴度、血清转换和血清保护。免疫原性数据显示，GLA-AF佐剂疫苗比单独抗原具有更高的血凝抑制滴度。有趣的是，疫苗反应在皮内和肌肉内给药途径之间没有统计学上的显著差异。正如预期的那样，皮内接种的参与者经历了短暂的红斑，但没有发生严重不良事件。肌肉内接种组报告的最常见不良反应是注射部位的疼痛、触痛、红斑、疲劳和轻度头痛。GLA目前与其他佐剂成分（例如，稳定乳液或氢氧化铝盐）配制而成，以改善疫苗相容性，作为对抗流感的组合佐剂。除了由基于二棕榈酰磷脂酰胆碱（DPPC）的胶束（GLA-AF）组成的水性配方外，GLA-SE佐剂（与稳定乳液配制而成GLA）是获批的季节性疫苗Fluzone®的一部分，与单独的Fluzone®相比，它增强了对H1N1和H3N2流感的免疫原性。此外，灭活四价分裂病毒流感疫苗（包括四种流感病毒株的血凝素）与GLA-SE佐剂配制而成，通过肌肉内给药进入老年人体内，产生了更多的外周血单核细胞，并增强了Th1免疫反应，克服了老年人的免疫衰老。这突显了含有GLA的组合佐剂的优势，提高了潜在疫苗抗原的免疫原性和稳定性。 4.3.霍乱毒素佐剂 霍乱毒素（通常缩写为CT、Ctx或CTX），是由霍乱弧菌分泌的致病蛋白复合物，其中CT在感染患者中引起腹泻。近几十年来，CT作为一种强大的粘膜佐剂，已被证明可以改善疫苗抗原的B细胞和T细胞反应。CT由两个主要蛋白组成：亚单位A（CTA；作为球形结构表达的单一蛋白链，具有突出的C末端α-螺旋延伸）和亚单位B（CTB；由五个CTB单体连接的五聚体结构，每个单体通过氢键和盐桥与两个邻近分子相连）。CTA被蛋白水解裂解为两个亚单位（CTA1和CTA2），分泌CT，导致霍乱感染/症状。CTB，一个无毒亚单位，由于其受体的细胞分布，被认为是疫苗开发中潜在的佐剂，由于其受体的细胞分布。CT的佐剂作用源于其与不同细胞类型相互作用的能力，并与上皮细胞结合，增加粘膜屏障的通透性，允许CT和共传递的抗原穿过粘膜屏障，诱导树突状细胞的成熟，激活原始T淋巴细胞。 CT佐剂通过CD40配体激活的树突状细胞成熟。此外，CT佐剂能够通过脂多糖抑制白细胞介素-12（IL-12）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、C-C基序配体-5（也称为RANTES）、巨噬细胞炎症蛋白-1α（MIP-1α）和MIP-1β的产生，作为诱导树突状细胞成熟的第二条途径[143]。Snider等人指出，使用CT佐剂的一个潜在缺点是可能刺激对旁观者抗原的不需要的免疫反应。 霍乱毒素佐剂的临床前开发 CT主要作为粘膜佐剂（表1），导致树突状细胞成熟，诱导与Th2相关的细胞因子和抗体的产生，以及诱导（或抑制）Th1反应。Th17细胞是最近鉴定的CD4 T细胞的一个亚群，Th17细胞分泌IL-17，在自身免疫和粘膜部位的细胞外病原体控制中起着重要作用。Datta及其同事假设Th17细胞有助于粘膜CT佐剂对抗传染病。在这里，Datta的研究小组将源自炭疽芽孢杆菌（含有或缺乏编码炭疽保护性抗原的基因）的灭活芽孢与粘膜CT佐剂结合作为炭疽吸入的候选疫苗。小鼠通过鼻腔接种与PBS、卵清蛋白（OVA）或CT加OVA（CT + OVA）结合的灭活芽孢。这一研究表明，与对照组相比，接种CT + OVA的小鼠在对抗炭疽吸入时，无论是粘膜IgA还是系统IgA和IgG1抗体都存在。Naegleria foeleri是一种自由生活的嗜热阿米巴，在环境中无处不在，引起原发性阿米巴脑膜脑炎（PAM），这是一种罕见且致命的中枢神经系统感染。PAM的第一个病例发生在20世纪60年代的南澳大利亚，现在全球范围内有更多的PAM病例报告。对这种致命疾病的认识和诊断很差且有限，目前还没有针对PAM感染的疫苗。Lee等人评估了一种口服疫苗，该疫苗由重组Naegleria fowleri（rNfa1）蛋白与CTB共同给药，以对抗阿米巴N. fowleri感染和致命的阿米巴脑膜脑炎。在小鼠模型中进行了临床前评估，通过鼻腔给药后，与单独接种Nfa1的小鼠（0%存活率）相比，CTB佐剂疫苗增强了IgG和IgA滴度，小鼠存活率达到100%。然而，需要额外的研究来确定抗原呈递途径、小鼠的免疫状态以及对N. fowleri感染的保护。 疟疾是世界上最常见和最严重的传染病之一，特别是在低收入和中等收入地区，死亡率和发病率很高，每年报告的新疟疾病例超过5亿，估计有110万人死亡。抗生素、化疗和物理保护方法（例如，经杀虫剂处理的蚊帐）已经显著减少了这种疟疾流行，然而，疟疾疫苗是消除这种致命疾病的重要和有用的方法。有100多种疟原虫，其中5种主要物种（P. falciparum、P. malariae、P. ovale、P. vivax和P. knowlesi）导致高死亡率。P. vivax是疟疾相关发病率的主要原因，也是复发性疟疾的主要原因，其中P. falciparum和P. vivax是疟疾疫苗开发的主要病原体。Miyata及其同事将P. vivax疟疾卵囊表面蛋白（Pvs25）与CTB粘膜佐剂物理结合，作为针对疟疾的传播阻断疫苗（AdPvs25）。在这项临床前研究中，AdPvs25疫苗通过皮下、肌肉内或鼻腔给药到小鼠体内，并提供了CTB佐剂疫苗减少向蚊子传播寄生虫的证据，与未佐剂疫苗相比，通过皮下和鼻腔给药增强了更强的免疫原性。 有趣的是，CTB与其他佐剂（例如，IFA、细胞因子）共同给药，对传染病抗原产生了更强的免疫反应。例如，CTB和编码IL-12的质粒与HIV致病蛋白（HIV Env蛋白）结合。通过鼻腔给药到小鼠体内后，佐剂疫苗导致了强大和提升的HIV特异性CD8反应，与单独的CTB佐剂相比具有保护能力。尽管在多种动物模型中记录了CT作为粘膜疫苗佐剂的潜在用途，但天然的CT对人类来说作为粘膜佐剂具有很高的毒性。此外，在小鼠中，环状二核苷酸（CDNs）似乎比CT更安全的粘膜佐剂，促进了对H5N1流感、金黄色葡萄球菌、链球菌和克雷伯氏菌感染的保护性免疫。 4.4.卡介苗 卡介苗（BCG）是牛分枝杆菌的减毒株，其发现和开发可以追溯到一百多年前。分枝杆菌种，包括M. tuberculosis和M. bovis，统称为结核杆菌，是哺乳动物宿主严重结核病的原因。在1908年，Albert Calmette和Camille Guérin从患有结核性乳腺炎的奶牛中分离出一株M. bovis的有毒株。他们继续在牛胆汁-土豆培养基中培养有毒的牛型结核杆菌，经过13年和200多次传代后，豚鼠实验表明有毒的结核杆菌最终被减毒为一种稳定的非毒性形式（现在更普遍地被称为卡介苗，BCG）。作为佐剂，BCG增强了非特异性免疫反应，提供了保护，BCG在预防性临床前和临床疫苗开发中被广泛用于预防传染病（例如，TB、肺炎、COVID-19）。 卡介苗的临床前和临床开发 预防性BCG佐剂疫苗对抗TB表现出控制结核病所需的细胞免疫反应，允许在肺组织中分泌系统记忆反应，以防止未来的TB感染（表2）。BCG的皮内（和肌肉内）给药在肺部没有引起强烈的记忆反应，Darrah等人表明在恒河猴中静脉注射高剂量的BCG疫苗导致抗原反应性T细胞显著增加，对TB感染的保护更强。在481名青少年中进行了一项BCG疫苗接种（与重组蛋白疫苗H4:IC31和H56:IC31）和BCG重新接种的1b期临床试验（NCT02378207），其中两次H4:IC31和H56:IC31疫苗肌肉内给药相隔56天，单剂量BCG皮内给药（表2）。这项临床试验表明，这三种TB疫苗是安全且可耐受的，没有报告严重副作用。H4:IC31和H56:IC31疫苗均诱导了分泌IgG抗体的CD4+ T细胞免疫反应，这些抗体被证明能够与TB抗原结合。此外，BCG重新接种刺激了强大和多功能的BCG特异性CD4+免疫反应，没有IgG结合抗原，并减少了临床试验组中发生的CD8+ T细胞免疫。一项涉及990名以前接种过BCG疫苗的青少年的2期临床试验（NCT02075203）表明，BCG重新接种对于预防未感染人群的TB感染是必要的（表2）。BCG还被评估为与COVID-19致病抗原（SARS-CoV-2衍生的非结构蛋白3肽）结合的佐剂，以激活适应性免疫反应并提供持久的保护。许多国家（例如，德国、芬兰和比利时）由于其对抗TB和麻风病的有效性，要求新生儿接种BCG疫苗（一种活的减毒M. Bovis株）。 在这里，Escobar及其同事发现卡介苗（BCG）疫苗接种与COVID-19死亡率之间存在负相关。据报道，作为佐剂的BCG诱导了针对相应COVID-19衍生肽段的人类CD4+和CD8+ T细胞反应性。此外，BCG疫苗接种增加了干扰素-γ的产生，并通过佐剂效应增强了非特异性人类免疫反应，这种反应可以作为对COVID-19流行的交叉保护。在法国对1120名医疗工作者进行了SARS-CoV-2包膜蛋白与BCG佐剂结合的3期临床试验（COVID19-BCG），与安慰剂接种组相比，COVID-19感染有所减少（NCT04384549；表2）。此外，在荷兰（NCT04328441）和澳大利亚（NCT04327206）对医疗工作者进行了这种COVID-19-BCG疫苗的随机3期临床试验，参与者（分别为1500人和10078人）与安慰剂接种组相比，也显示出对COVID-19感染的显著保护。尽管BCG尚未被认可为商业疫苗佐剂，但鉴于最近对其作为针对COVID-19感染的疫苗佐剂的研究，其作为基于蛋白疫苗的领先佐剂的潜力是有希望的。 5.乳液佐剂  水包油（和油包水）是乳液基础佐剂的两个子类型，这些混合物的油性相成分来源于角鲨烯（从鲨鱼肝脏或植物中获取，包括米糠、橄榄和小麦胚芽）。这些佐剂通过持续的抗原释放诱导库效应，这一类别的常见佐剂包括完全弗氏佐剂（CFA）、不完全弗氏佐剂（IFA）和蒙旦剂（例如，MF59®、AS03和糖基化脂质佐剂-稳定乳液（[GLA-SE]））。MF59®和AS03都是水包油乳液系统，而GLA-SE是油包水乳液。 5.1.完全和不完全弗氏佐剂 将热杀死的M. tuberculosis、M. butyricum或其提取物（在接种部位聚集巨噬细胞）与矿物油和表面活性剂甘露单油酸酯结合，构成CFA乳液。与CFA佐剂疫苗观察到的库效应促进了免疫宿主内长达六个月的缓慢抗原释放。CFA佐剂通过激活TLR2、4和9来引发细胞和体液免疫。在某些情况下，CFA在注射部位引起过度炎症，有报道称由于非代谢矿物油引起的免疫毒性。因此，目前CFA不适用于人类使用，尽管对CFA激活的研究为临床疫苗开发提供了可靠的结果。IFA的配方与CFA相同，但去除了Mycobacterium。IFA旨在最小化与CFA观察到的过度炎症效应，结果，IFA佐剂已经被（并继续）用于兽医疫苗。然而，对于人类疫苗，当IFA在流感、破伤风和霍乱疫苗的临床试验中使用时，报告了一系列严重的副作用（例如，注射部位持续疼痛的肉芽肿和无菌脓肿），限制了其在基于人类的疫苗开发中的应用，以对抗传染病。水包油乳液（例如，IFA和CFA）由于使用非代谢矿物油而具有高风险的不良反应，这种矿物油在疫苗中未获许可。弗氏佐剂诱导强烈的适应性免疫，但如此反应原性，以至于即使在实验室动物中的使用也不鼓励。弗氏佐剂的临床前和临床开发 CFA通常被用作实验性抗体产生的有效佐剂，其一般的免疫刺激性能力尚未被任何其他佐剂所取代。然而，CFA的各种损伤，包括注射部位肉芽肿、脊髓压迫、坏死性皮炎和肾脏肉芽肿形成，导致了CFA（和IFA）在临床试验中使用的显著限制。IFA已经在人类中广泛测试，它比商业佐剂（例如，氢氧化铝和MF59）增强了更强大的体液免疫反应。IFA与其他佐剂（例如，皂苷或细胞因子）结合使用，可在动物模型中导致强大的适应性免疫反应，并可能很快在临床研究中进行测试。IFA的毒性通过使用高等级油和纯化表面活性剂来控制，结果，IFA已经出现在最近的传染病（例如，HIV；表2）的临床试验中。在最近的HIV疫苗开发中，Levine及其同事对25名参与者（NCT00381875）进行了IFA乳化的HIV-1免疫原的临床研究。这种HIV-1疫苗在人类免疫后没有显示出显著的不良反应，有趣的是，参与者在6年的跟踪期内，有12名（25名参与者中的）维持了更高水平的抗体反应。必须考虑这种HIV免疫原的临床效果以及HIV延迟型超敏反应与更有利的临床过程之间的显著相关性。 5.2.蒙旦剂 蒙旦剂是包含角鲨烯的水包油乳液，与表面活性剂（例如，甘露单油酸酯表面活性剂）稳定。蒙旦佐剂有效地诱导Th1/Th2细胞因子的分泌，以刺激体液和细胞反应。与此同时，库效应、抗原呈递细胞的激活，以及通过与细胞膜的相互作用改善抗原摄取，使蒙旦剂能够比基于氢氧化铝的佐剂刺激更高的免疫反应。 蒙旦剂的临床前和临床开发 蒙旦ISA-51是一种乳液佐剂，由甘露单油酸酯家族与矿物油结合而成。ISA-51增强了临床研究中的抗原特异性抗体滴度和细胞毒性T淋巴细胞（CTL）反应。ISA-51佐剂在免疫部位缓慢释放抗原，刺激抗原呈递细胞摄取，并增强淋巴结中淋巴细胞的积累。乳剂佐剂的按蚊唾液疫苗（AGS-v）是一种亚单位疫苗，由四种不同的按蚊唾液蛋白组成，与ISA-51佐剂结合，以对抗这种蚊子传播的疾病。在49名健康志愿者中进行了AGS-v疫苗的1期临床试验（NCT03055000；表2），表明与单独的抗原（AGS-v）相比，佐剂疫苗刺激了更快和更强的免疫反应。顺便说一句，与未佐剂疫苗相比，ISA-51疫苗在注射部位报告了更多的局部副作用（例如，发红、肿胀、瘙痒），没有报告其他严重的安全问题。这项研究为蒙旦ISA-51在唾液蛋白疫苗中的有效性和安全性提供了第一证据，导致未来几年在其疫苗开发中的使用增加。 5.3.MF59® MF59®（图3）是一种包含角鲨烯油（胆固醇的前体）的油包水乳液，是第一个在1992年作为流感疫苗临床试验的一部分获得FDA批准的油包水佐剂。MF59®于1997年首次在意大利获得许可，现在作为流感疫苗佐剂在全球范围内获得广泛批准（例如，季节性、大流行和禽流感疫苗）。 图 3.MF59®的化学成分，MF59由角鲨烯和两种表面活性剂（Span 85和Tween 80）组成。MF59®和AS03不仅成分相似，而且组成也类似。这些成分在油相中混合，形成油包水乳液。 为了制备乳液，亲脂性和亲水性乳化剂（特定配方）分别溶解在油相和水相中，通过非常高的搅拌速率（例如，高剪切搅拌器）混合两相形成粗乳液。对粗乳液施加高压（例如，高压均质器）或强烈的声波处理后，通过过滤形成平衡乳液。 MF59®佐剂激活肌肉中的单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞，从而分泌各种趋化因子，导致注射部位免疫细胞显著迁移。在这里，MF59®招募抗原特异性抗体，刺激Th1和Th2免疫反应。MF59®的间接库效应允许延长免疫细胞反应和长期抗体分泌。因此，基于乳液的传递系统在发现角鲨烯后有着强大的开发历史，这促进了MF59®和AS03（在H5N1和H1N1疫苗中获批）的创造，为在其他传染病疫苗中的应用铺平了道路。 MF59®的临床前和临床开发 MF59®已在人类流感疫苗中获批，这些疫苗在全球30多个国家使用。MF59®在流感（Novartis）和H1N1大流行流感疫苗（Focetria®和Celta®）中的使用尤为突出。尽管MF59®通常具有高安全性记录，但由于老年人口免疫系统较弱，佐剂在成人>65岁疫苗中的效果促使进行更严格、针对性的测试。随后，Kelly Linbert进行了统计分析，确认了MF59佐剂三价流感疫苗（aIIV3；Fluad®）（NCT04576702）在老年患者中的安全性。 MF59®还佐剂了在I期临床试验中评估的SARS-CoV-2 sclamp抗原（NCT04495933；表2）。在这里，发现MF59佐剂SARS-CoV-2 sclamp疫苗是安全且耐受性良好，两剂疫苗诱导了强烈的SARS-CoV-2特异性多功能CD4+ T细胞反应，偏向于Th1型。 角鲨烯油在油包水乳液中很突出；然而，其围绕油组成结构/功能的免疫学机制尚不清楚。此外，由于角鲨烯的主要来源是鲨鱼肝脏，这限制了其大规模生产。来自松科（松树）的乳化油提供了一个潜在有效的补充选择，并且最近在小鼠、猪和雪貂中作为乳化油疫苗针对大流行流感进行了评估。 尽管MF59®是传染病疫苗中获批的佐剂，但这种佐剂的副作用仍然需要考虑和针对新疫苗进行测试。此外，理解基于乳液的佐剂的作用机制预计将扩大这些系统的使用。 5.4.GLA-SE 佐剂 GLA-SE包含TLR4激动剂葡萄糖基脂质佐剂（GLA）和稳定的乳液纳米乳液角鲨烯油-水（SE）。GLA-SE诱导针对各种传染病（例如，结核病、利什曼病或麻风杆菌感染）的强大Th1和平衡的IgG1/IgG2反应。添加GLA-SE还产生了来自CD4+ T细胞的大量多功能细胞因子或/和趋化因子（例如，TNF-α、IL-6和IL-12），具有可接受的安全性和耐受性。 GLA-SE的临床前和临床开发 过去三十年中，GLA-SE已在疫苗开发中广泛使用。呼吸道合胞病毒（RSV）是老年人中的致命疾病，迄今为止，还没有获批的疫苗。Patton及其同事评估了包含RSV可溶性融合蛋白的选定抗原的RSA疫苗的免疫原性，并将它们与GLA-SE结合（表2）。在猕猴免疫后，与未佐剂的RSV疫苗相比，GLA-SE佐剂RSV抗原刺激了更强大和持久的体液和Th1偏向的细胞免疫反应。Cauwelaert等人证明，这种GLS-SE佐剂刺激了先天免疫反应，导致NK细胞和记忆CD8+细胞的IFN-γ表达，以及刺激Th1免疫反应。GLA-SE还增强了适应性免疫反应，导致结核病保护。 血吸虫病（也称为比尔哈尔齐亚病或蜗牛热）是由寄生虫引起的疾病，感染生活在热带气候中的人。血吸虫病是仅次于疟疾的最具破坏性的寄生虫病，全球有超过8亿人处于风险之中，在74个国家约有2亿人感染。使用Sm14抗原（来自S. mansoni致病蛋白）和GLA-SE佐剂的抗血吸虫病疫苗在巴西进入了1期临床试验（NCT01154049；表2）。与安慰剂组相比，这种疫苗刺激了增强的抗Sm14 IgG抗体反应，除了注射部位轻微疼痛和发红外，没有副作用。此外，包含M. tuberculosis蛋白（ID93）和GLA-SE佐剂的结核病疫苗的1期临床试验（NCT01599897）。在60名健康志愿者免疫后，ID63-GLA-SE疫苗产生了更高滴度的ID93特异性抗体（IgG和Ig4亚类），并刺激了更强大的Th1型细胞和体液反应，与单独的ID93疫苗相比，多功能性CD4+ T细胞细胞因子的幅度更大。 5.5.TiterMAX 佐剂 TiterMax佐剂（TiterMax®和TiterMax Gold®）包含可代谢的角鲨烯油、山梨醇单油酸酯80、非离子嵌段共聚物（CRL8941和CRL8300）和微粒二氧化硅。典型的水包油乳液TiterMax®佐剂，毒性低于CFA，不含生物材料。非离子嵌段共聚物由亲水性聚氧乙烯和亲脂性聚氧丙烯的线性链组成，分泌补体免疫细胞，并增强巨噬细胞上的MHC-II表达，导致更高水平的IgG1和IgG2a抗体免疫反应。TiterMax Gold®被认为是传统TiterMax佐剂的改进版本。TiterMax Gold®是动物研究中增强细胞和体液免疫反应的有效佐剂，作为完全弗氏佐剂的替代品，因为更安全、更易使用。TiterMax Gold®佐剂的免疫潜力取决于稳定的水包油乳液，它包裹来自病原体的有效抗原。由于产生类似的抗体滴度，TiterMax佐剂常被用作CFA的替代品，尽管TiterMax已被证明可诱导免疫引起的病变。例如，Leenaars及其同事证明，腹腔内免疫TiterMax引起了严重病变，而皮下免疫相同疫苗佐剂后发现的病变最小（和低免疫原性），显著限制了TiterMax作为临床研究中佐剂的使用。 TiterMAX佐剂的临床前开发 TiterMax®和TiterMax Gold®是基于它们的安全性和有效性，在动物研究中作为Freund完全佐剂的替代品。Henker等人将重组肌球蛋白调节轻链包裹在TiterMax Gold®佐剂中，然后皮下免疫大鼠。这项研究表明，与未佐剂组相比，吸虫负担显著减少61.5%（p < 0.001），混合Th1/Th2免疫反应。此外，Leite等人评估了TiterMax®佐剂作为抗血吸虫病疫苗的一部分，表明产生了更强的招募肥大细胞和嗜碱细胞，导致更多的IgG2a抗体。 5.6.RIBI 佐剂 与Freund佐剂不同，RiBi佐剂系统（RAS）是自1985年以来一直在研究的水包油佐剂。这种RAS佐剂系统由可代谢的角鲨烯油、免疫刺激剂和Tween 80表面活性剂组成，其中抗原在乳化前被油包裹。RAS水包油乳液易于通过过滤灭菌，RIBI佐剂系统中常用的三种免疫刺激剂：海藻糖6,60-二肌酸肌醇脂（TDM）、细胞壁骨架（CSW）和单磷酸脂A（MPL）。TDM是从致病性分枝杆菌菌株中分离出的分枝杆菌菌体成分的脂质成分，已知在疫苗接种后诱导体液和细胞免疫反应。CSW从分枝杆菌细胞壁中提取，CSW的强烈免疫原性与来自分枝杆菌细胞的免疫反应性肽聚肌苷二肽（MDP）的聚合形式有关。MDP增强抗体产生，增加对病原体（包括细菌、真菌、病毒和寄生虫）的非特异性免疫反应和细胞因子释放，诱导自身免疫和细胞介导的免疫。MPL是一种TLR4激动剂，可诱导B细胞和T细胞免疫反应，是从脂质A化学改性而来，细胞毒性降低。然而，RIBI佐剂系统已知在动物中引起病理性病变，Johnston等人在1991年证明，RIBI在兔子中引起的病变与CFA相同。因此，RIBI佐剂获准用于动物研究中疫苗开发，而不是临床试验。 RIBI佐剂系统的临床前开发 Mullerad及其同事在Mycobacterium paratuberculosis (MPT)中评估了RASs的免疫原性。在这里，他们过表达并纯化了MPT的85B抗原，并将其与RAS结合后给小鼠接种。这项临床前试验的结果显示，与无佐剂疫苗相比，RIBI佐剂产生了更高水平的IL-10、一氧化氮和IgG1和IgG2a抗体的分泌。Cargnelutti及其同事开发了重组病毒核蛋白（NP）作为流感大流行的主要病原体，并用RAS佐剂。在小鼠免疫后，与未佐剂的NP疫苗相比，NP-RAS疫苗观察到更高水平的IFN-γ、IgG2a抗体和更强大的体液和细胞介导的免疫反应。 比较和评估RIBI佐剂引起的病理性病变的临床前研究产生了不同的结果。Johnston及其同事（1991年）和Leenaars及其同事（1994年）在兔子中发现了与CFA引起的病变相似的病变，而其他研究在使用RIBI作为佐剂时只发现了最小的病变。与CFA和RIBI在小鼠中腹腔内给药的比较研究一致报告RIBI引起的病理性病变较少。除了Lipman小组在小鼠中的报告外，比较RIBI和CFA/IFA之间的抗体反应的一般研究表明，CFA/IFA方案的抗体产生量要高得多。 6.免疫刺激性复合物  6.1.细胞因子  非毒性佐剂增强针对特定疾病的免疫反应。细胞因子作为一种非毒性佐剂，影响免疫反应的功能多样性，并在抗体和细胞介导的免疫反应之间发挥重要作用。细胞因子是细胞释放的小蛋白，直接影响细胞之间的相互作用和通信。细胞因子是这些小而重要的蛋白的广泛和松散的类别名称，其他名称包括：淋巴因子（由淋巴细胞产生的细胞因子）、单核因子（由单核细胞分泌的细胞因子）、趋化因子（具有趋化活性的细胞因子）和白细胞介素（IL）（由一种白细胞产生并作用于其他白细胞的细胞因子）。细胞因子可能作用于分泌它们的细胞（自分泌作用）、附近细胞（旁分泌作用）或某些情况下的远距离细胞（内分泌作用），由于它们的冗余，不同细胞因子诱导相似的功能。通常，一种细胞因子激活其目标细胞，导致额外细胞因子的分泌和常见的级联反应。由于多种细胞因子负责诱导先天和适应性免疫反应，这影响了抗原呈递细胞的成熟、Th1和Th2细胞的分化以及细胞毒性自然杀伤细胞和CTL的分泌，最终形成针对侵入性感染的有效保护层。因此，几种细胞因子（包括粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子[GM-CSF]、干扰素[INFs]、IL-1、IL-2、IL-6、IL-12、IL-15、IL-18和趋化因子）具有作为疫苗佐剂的巨大潜力，用于刺激针对感染的强效免疫反应，特别是在DNA疫苗中。质粒DNA疫苗包含编码所需抗原及其相应表位的基因，这些表位刺激适应性免疫（但免疫原性差）。然而，商业和传统疫苗佐剂无法增强DNA疫苗所需的免疫原性。因此，分子佐剂（例如，细胞因子、趋化因子和免疫靶向基因）作为质粒编码蛋白，已被评估为疫苗佐剂。这些靶向先天免疫受体或调节信号识别。通过感染细胞在注射部位适度分泌重组细胞因子有效限制了细胞因子的不良反应。细胞因子编码基因作为单独的质粒传递，以及在特定抗原内编码的额外基因，这些抗原包含针对感染的质粒（例如，HIV、流感和SARS-CoV）。GM-CSF直接影响树突状细胞形成的刺激，导致成功的抗原摄取、CD4+和/或CD8+ T细胞的产生，并刺激针对感染的特定适应性免疫反应。干扰素（INFs）佐剂最初被发现是一种抗病毒因子，它干扰哺乳动物细胞中病毒的复制。感染的细胞和活跃的先天免疫反应可以分泌干扰素，以及细胞因子的产生以及自然杀伤细胞功能的诱导和抗原呈递。根据它们的结构同源性和相关特定受体，INFs被分类为三种不同类型（I型、II型和III型）。I型IFNs诱导侵入性病毒的凋亡，增强交叉启动和病毒肽段的呈递。I型IFNs作为B细胞激活剂，分泌各种抗体，并通过鼻内（或肌肉内）给药诱导强烈的体液免疫反应。T淋巴细胞、自然杀伤细胞（NK）和自然杀伤T（NKT）细胞产生2型INFs，具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节功能。这种2型INF细胞因子通常控制巨噬细胞的分化、抗原呈递细胞中MHC表达和Th1（CD4+）和细胞毒性CD8+细胞的成熟。此外，2型INF调节免疫球蛋白类别转换。白细胞介素（IL）家族细胞因子（例如，IL-1、IL-2、IL-12、IL-15和IL-18）在佐剂开发中显著参与。IL-1是一种古老且重要的促炎细胞因子，对宿主免疫系统产生强效影响。IL-1增强了先天免疫反应所需的细胞（中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、肥大细胞和NK细胞）的活性，激活并加强了极化T细胞的功能。IL-2主要由CD4+ T细胞产生，影响T细胞的增殖和诱导，刺激体液和细胞免疫反应。IL-2参与树突状细胞上CD48和CD80的表达，以及它们在CD4+ T细胞上相应配体（CD2和CD28）的上调。IL-12是一种Th1促炎细胞因子，由吞噬细胞和树突状细胞在对致病微生物感染的反应中产生。IL-12增强NK、T和B细胞的产生，并调节Th1细胞的分化。IL-15由单核细胞、树突状细胞、上皮细胞、骨髓基质细胞和成纤维细胞产生，与IL-12具有高度同源性和结构相似性。IL-15调节NK和T细胞的分泌和增殖，以及B细胞抗体产生。IL-18由巨噬细胞和Kupffer细胞产生，调节IL-2和IL-12的分泌，并增强NK和CD8+ T细胞的增殖和活性。IL-18作为Th1免疫反应的主要促进剂，影响Th1免疫细胞的分化和IFN-γ的产生。 细胞因子的临床前和临床开发 GM-CSF是一种多效性细胞因子，已在针对结核分枝杆菌、Epstein-Barr病毒和人类免疫缺陷病毒的传染病研究中使用。Kasahara及其同事确定GM-CSF受体（由配体结合亚单位[GM-CSFRα/Csf2ra]组成的异二聚体）是针对曲霉的共同信号转导亚单位（GM-CSFRβ/Csf2rb）。在这里，没有GM-CSF受体B链的小鼠表达了侵入性菌丝生长，并在感染A. fumigatus后表现出生存率降低。然而，给予重组GM-CSF的小鼠增强了中性粒细胞NADPH氧化酶（催化电子转移到氧产生超氧化物）功能、抗白念珠菌活性和强大的真菌清除。作为佐剂，GM-CSF与伪狂犬病病毒（PrV）糖蛋白结合并作为疫苗给小鼠接种。这导致IgG的产生改善和更强的T细胞介导的免疫反应偏向Th1型反应，从而增强了针对PrV感染的保护性免疫，与无佐剂疫苗相比。此外，GM-CSF与HIV-1包膜糖蛋白（Env）结合作为HIV疫苗送入恒河猴。这项临床前试验得出结论，GM-CSF佐剂与HIV抗原的结合诱导了更高的中和抗体水平，并且比单独的抗原疫苗更好地控制了初次感染和病毒再出现。此外，Fabrizi及其同事使用GM-CSF结合乙型肝炎病毒表面蛋白开发了乙型肝炎病毒（HBV）疫苗，并在187名患者中进行了元分析。这项研究表明，GM-CSF/HBV疫苗显著提高了这些晚期肾病患者的血清保护率。Brekke及其同事将HIV Vacc-C5（包含HIV-1病毒C5结构域489-511残基）与GM-CSF佐剂结合作为基于肽的治疗性疫苗针对HIV。在这个1/2期临床研究中，用GM-CSF佐剂的Vacc-C5肌肉内给药36名参与者，并为GM-CSF佐剂疫苗在所有患者中的安全性和耐受性提供了证据，并与单独疫苗相比诱导了更强的T细胞免疫反应（NCT01627678）。正在进行的1期临床试验正在评估含有用GM-CSF作为佐剂的S-蛋白装载的树突状细胞的疫苗，该疫苗肌肉内注射175名未感染参与者，以评估其安全性和抗SARS-CoV-2免疫（NCT04386252）。 这个试验刚刚开始，临床结果尚未出来。作为疫苗佐剂，GM-CSF增强了疫苗的免疫原性，以产生强烈的免疫反应。GM-CSF已经在动物和人类试验中作为疫苗佐剂进行了测试，针对感染以及前列腺、乳腺或肺癌的抗肿瘤免疫疗法。1型干扰素（IFN）是用于粘膜疫苗接种的常见佐剂，针对H1N1病毒、H3N2病毒、乙型肝炎病毒和流感B病毒。例如，Bracci及其同事将灭活亚单位H1N1流感蛋白抗原与1型IFN结合，该IFN在C243-3细胞系中制备，并通过硫酸铵沉淀和透析对磷酸盐缓冲液（PBS）进行浓缩和部分纯化，作为流感亚单位疫苗，通过鼻内给药到小鼠。这项临床前研究表明，这种流感亚单位疫苗产生了更高的抗体滴度（IgG2a和IgA），并增加了鼻粘膜层中与抗原相关的吞噬细胞的百分比，与单独的流感抗原相比，导致对A/New Caledonia/20/1999（H1N1）流感病毒的流感挑战产生了强大的体液保护。1型IFN佐剂增强了实验性疫苗在小鼠中针对流感病毒的效力，产生了抗体和长期免疫记忆。1型IFN佐剂通过刺激树突状细胞以及B和T细胞，使疫苗诱导的体液免疫。然而，Couch等人将灭活流感病毒疫苗与MPL、1型IFN或霍乱毒素B结合，作为流感疫苗通过鼻内给药到健康成年志愿者。接种疫苗耐受性良好，而1型IFN对于通过鼻内给药到人类中的灭活流感病毒的体液免疫反应没有表现出佐剂效果。慢性乙型肝炎病毒（CHB）感染是一个重要的全球公共卫生问题，是严重疾病（例如，肝硬化、肝衰竭和肝细胞癌）的原因，影响着超过2.8亿人，每年有超过80万人死亡。乙型肝炎病毒感染后6个月以上检测呈阳性的患者被诊断为慢性乙型肝炎病毒感染，人类免疫系统无法清除病毒。目前没有预防和/或治疗CHB感染的疫苗。BRII-179是一种基于病毒样颗粒的疫苗，包含所有三种乙型肝炎病毒表面包膜蛋白（Pre-S1、Pre-S2和S），与IFN-α结合作为CHB疫苗。这种CHB疫苗的1期临床试验已经完成，肌肉内给药到年龄在18至60岁之间的健康志愿者（ACTRN12619001210167）。在这里，BRII-179作为一种新型配方蛋白疫苗，包含所有三种乙型肝炎病毒表面包膜蛋白（Pre-S1、Pre-S2和S），与IFN-α佐剂结合，安全、耐受性好，并诱导乙型肝炎病毒特异性T细胞免疫反应，但在病毒抑制、非肝硬化的CHB患者中效力有限。最近进行的2期临床试验（NCT04749368）进一步评估了BRII-179和与INF-α佐剂结合的BRII-179以及另一种乙型肝炎病毒特异性疫苗BRII-835的效力，它们是研究性的乙型肝炎病毒靶向siRNA序列，与IFN-α佐剂结合，皮下给药到135名患者。预计这项2期临床试验将在2023年公布其临床结果。流感是一种从鼻子到末端细支气管的呼吸道粘膜病毒感染，大部分抗体分泌发生在粘膜表面。因此，流感疫苗应诱导粘膜免疫反应和Th2细胞反应，分泌抗体和记忆细胞。此外，从流感病毒A（H1N1和H3N2）中选出的20至99个氨基酸株与INF-α佐剂结合，在90名年龄在18至40岁之间的健康志愿者中通过鼻内免疫后进行了临床评估（NCT00436046）。这项1期试验得出结论，与安慰剂组相比，鼻内给药产生了更高水平的IgA和IgG2抗体，并诱导了所需的保护性粘膜免疫。1989年，Stürchler及其同事将疟疾孢子体肽与INF-α佐剂结合，作为疟疾疫苗候选物肌肉内给药到健康志愿者。这项临床试验表明，与安慰剂组相比，INF-α佐剂组产生了更高的抗体滴度和更强的针对孢子体肽的体液免疫反应。然而，产生针对孢子体的保护性免疫反应所需的抗体量未知，但由于对INF-α作为佐剂的了解不清楚，因此对INF-α与孢子体疫苗结合后产生的抗体量提出了质疑，表明这项临床研究有显著的局限性。INF-α佐剂是具有长期临床使用记录的多效性细胞因子。INF-α影响先天和适应性免疫，并引发INF-DC相互作用，以刺激适应性免疫反应。INF-α佐剂是使用IFN-α或IFN-α条件树突状细胞针对感染（例如，疟疾、流感和乙型肝炎病毒）以及抗肿瘤疗法。此外，流感疫苗研究一直是白细胞介素研究发展的基础，针对IL-1、IL-2和IL-12。IL-2是流感疫苗开发中的第一个佐剂。2006年，Henke及其同事生成了流感病毒A病毒双顺反子质粒时，与IL-2共同传递了DNA疫苗。这种DNA疫苗候选物通过鼻内注射到小鼠体内，与未用IL-2佐剂接种的疫苗相比，有效地预防了流感病毒的致命挑战。此外，Hu及其同事在2009年针对严重急性呼吸综合征（SARS）设计了IL-2编码的DNA疫苗质粒。IL-2基因作为细胞因子佐剂编码的SARS-CoV核蛋白DNA疫苗通过肌肉内给药到小鼠体内，与未用IL-2佐剂接种的疫苗相比，产生了更高的IgG滴度和更有效的特异性免疫反应。单一疫苗使用IL-1作为传染病疫苗的佐剂。在这里，IL-1是另一种安全有效的佐剂，已在流感粘膜疫苗开发中使用。Kayamuro等人设计了一种含有IL-1家族细胞因子（IL-1α、IL-1β、IL-18和IL-33）的重组流感病毒血凝素结合物，通过鼻内给药到小鼠。这项临床前试验表明，接种疫苗后，血浆IgG和粘膜IgA显著增加，并产生Th1和Th2细胞因子，与非佐剂组相比，导致针对流感病毒的体液免疫反应，没有急性毒性。特定的IL-1细胞因子已被用作疫苗佐剂，以诱导针对感染（流感）或癌症的强烈适应性和记忆免疫反应，是粘膜疫苗的有效佐剂。IL-18负责激活肥大细胞，并增强IL-33作为粘膜佐剂引发的CTL免疫反应。尽管IL-1家族细胞因子是针对传染病的有效鼻内疫苗佐剂，但将IL-1细胞因子与商业佐剂（MF59或氢氧化铝佐剂）结合是诱导针对进入粘膜层的病原体的体液和粘膜免疫反应的有效途径。为了进一步针对流感的佐剂研究，也调查了IL-12（粘膜佐剂）。小鼠通过鼻内给药流感疫苗候选物（包含可溶性血凝素（H1）、神经氨酸酶（N1）和可溶性重组IL-12佐剂），导致血清中IgG2a抗H1N1抗体水平增加，以及与单独的抗原相比，支气管肺泡灌洗液中的IgG1、IgG2a和IgA抗体水平增加。此外，IL-12佐剂显著增强了小鼠的存活率，刺激了更强的保护性粘膜免疫反应。Kumar等人将IL-12与灭活的耶尔森氏菌CO92激动剂结合，并通过鼻内给药到小鼠。结果表明，与肺炎鼠疫相比，安全性、免疫原性和保护效力增强。来自HIV株的RNA优化HIV-1基因DNA通过肌肉内单独给药或与IL-12或IL-15质粒细胞因子佐剂剂量递增结合在健康志愿者中给药（NCT00111605）。这项1期临床研究表明，与细胞因子佐剂结合的HIV免疫原疫苗接种是安全且耐受性好的，没有显著的不良事件，而IL-12和IL-15细胞因子佐剂对增强细胞免疫的能力很小。 IL-12是一种典型的异二聚体细胞因子，由巨噬细胞、树突状细胞和朗格汉斯细胞分泌，诱导小鼠模型针对感染（如流感或HIV）的粘膜和适应性免疫反应。然而，由于免疫原性低，很少有关于IL-12作为疫苗佐剂针对感染的临床试验。编码IL-15的细胞因子质粒与克氏锥虫（查加斯病的病原体）跨唾液酸酶（TS）基因质粒共给药到小鼠，显著改善了CD8+记忆T细胞分泌后的长期保护。此外，IL-15还被评估为基于病毒的HIV gp160疫苗的一部分在小鼠模型中。在这里，IL-15的结合诱导了长期、抗原特异性的CD8+ T细胞免疫反应以及长期且强大的抗体介导的免疫反应。最后，IL-18，被称为IFN-γ诱导因子，是IL-1细胞因子家族的成员。它的最初发现可以追溯到上个十年，IL-18似乎包含独特的特性，其中一些可以治疗脓毒症和感染（流感、脑炎和HSV-1）。例如，IL-18佐剂的单纯疱疹病毒DNA疫苗（HSV-1），在小鼠模型中经过临床前评估后，IL-18佐剂疫苗大大增强了Th1免疫反应，对HSV-1感染具有强大的保护性免疫。细胞因子是针对传染病疫苗的潜在佐剂，因为它们诱导有效的粘膜和记忆免疫。因此，细胞因子作为鼻内疫苗佐剂与商业佐剂（氢氧化铝、MF59和AS03）结合，可以增强强大的适应性免疫，简单的鼻内给药。 6.2.趋化因子 趋化因子是一类小蛋白，以其刺激细胞迁移的能力而闻名，已鉴定出超过50种趋化因子（和18种趋化因子受体）。这些趋化因子根据前两个保守的半胱氨酸残基的排列分为四个不同的家族（CC、CXC、C和CX3C）。趋化因子影响淋巴细胞的增殖和成熟，调节先天和适应性免疫反应，因此，基于其影响适应性和/或保护性免疫反应的能力，趋化因子已被用作疫苗佐剂。与DNA疫苗共给药的趋化因子佐剂增强了APC传递到注射部位，其中抗原被摄取，改善了针对感染的免疫反应。然而，关于趋化因子佐剂剂量相关毒性问题和稳定性的限制已有报道。 趋化因子的临床前开发 CCL3趋化因子吸引NK和CD8+ T细胞，已用作HIV-1疫苗的佐剂。在这里，Kuczkowska等人创建了一个截短的HIV-1 Gag抗原与小鼠趋化因子CCL3作为HIV疫苗，导致诱导强烈的抗体滴度和CD4+ T细胞反应。此外，CCL28已在流感疫苗中使用，其中CCL28与流感病毒样颗粒佐剂并鼻内给药到小鼠。这项研究表明，CCL28趋化因子增强了IgA（而不是IgG或IgM）的产生，促进IgA迁移到不同的粘膜部位，并与未佐剂疫苗相比，增加了粘膜抗体滴度和长期保护性免疫反应。RANTES，也称为CCL5趋化因子，识别单核细胞、记忆T细胞和嗜酸性粒细胞，诱导粘膜和系统性免疫反应。在2000年，Kim等人编码RANTES表达质粒与乙型肝炎表面抗原（HBsAg）共给药作为DNA疫苗，并通过肌肉内（或阴道内）免疫小鼠。结果表明，与霍乱毒素佐剂相比，RANTES编码质粒与HBsAg的阴道给药产生了更高水平的血清IgG和粘膜IgA，并具有更强的保护性免疫反应。此外，在2001年，一种巨噬细胞炎症蛋白2（MIP-2）质粒，与编码单纯疱疹病毒（HSV gB）糖蛋白B的DNA疫苗共给药，鼻内给药到小鼠，产生了比MIP-2 DNA疫苗更强的IgG免疫反应和Th1样免疫反应。巨噬细胞炎症蛋白2（MIP-2）是一种α-趋化因子，具有强烈的中性粒细胞趋化吸引。Eo及其同事将MIP-2质粒与编码单纯疱疹病毒（HSV gB）糖蛋白B的DNA疫苗结合，鼻内给药到小鼠，产生了与单独的DNA疫苗相比更高水平的IgG滴度和Th1免疫反应，而MIP-2 DNA疫苗没有粘膜免疫反应。胸腺源性趋化因子3（TCA 3）对单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和嗜酸性粒细胞表达趋化活性。Tsuji及其同事（1997年）将编码小鼠TCA3的质粒与表达HIV-1的DNA疫苗共给药，通过肌肉内给药到小鼠，导致强烈的HIV-1细胞介导的免疫反应，而没有显著的体液免疫。迄今为止，尽管这些临床前结果充满希望，但尚未报告使用趋化因子作为传染病疫苗佐剂的进一步临床研究。 趋化因子可以轻易地工程化为DNA疫苗构建体或作为单独的质粒给药，增强系统性或粘膜免疫反应。因此，与细胞因子相比，趋化因子更稳定，毒性更小，有潜力成为针对传染病的DNA疫苗佐剂。 7.颗粒佐剂  7.1.咪唑喹啉  咪唑喹啉源于核苷类似物的开发，尽管它们的分子结构与核苷类似，但咪唑喹啉具有与核苷样活性不同的机制。咪唑喹啉主要与TLR7（和/或TLR8）结合，分别产生1型和2型INF细胞因子IL-12和TFN-α，从而诱导先天免疫反应和强大的Th1偏向适应性免疫反应。咪唑喹啉作为小合成分子，成本效益高，纯度高，最初于2010年获得食品药品监督管理局（FDA）批准，作为5%乳膏，广泛用于治疗生殖器疣和皮肤癌。未配方的咪唑喹啉（例如，R848）由于其大小和溶解度影响系统性免疫激活。然而，咪唑喹啉作为疫苗佐剂已参与癌症治疗性疫苗的临床试验，而这种佐剂尚未在针对感染的人类研究中使用。 咪唑喹啉的临床前开发 咪唑喹啉已在癌症和细菌疾病的临床评估中使用，但未在传染病中使用。与共价连接的咪唑喹啉佐剂的鼻内RSV疫苗在小鼠中的临床前评估表明，与未佐剂小鼠相比，当小鼠肺部发生炎症传播时，IgG1抗体水平更高，具有强大的体液免疫反应。Resiquimod（R848），一种咪唑喹啉，是一种双重TLR7和TLR8合成激动剂，已被用作针对病毒疾病的人类免疫刺激剂。R848与灭活流感病毒（IPR8-R848）结合，在新生儿非人灵长类动物模型中显示出强大的效力和安全性，与未佐剂灭活病毒疫苗相比，刺激增强的病毒特异性T细胞反应和IgG和IgM抗体。 7.2.病毒样颗粒和病毒体佐剂 微米和纳米颗粒已被用作疫苗的佐剂（或传递系统），在传染病研究中常用的包括病毒样颗粒（VLPs）和病毒体。在这些系统中，通过物理吸附或化学键合的方式将抗原包裹在这些颗粒的表面（或内部）。 VLPs保留了病毒衍生的结构，具有与原生病毒颗粒相似的大小和形态，但不包含病毒本身的DNA/RNA成分，使其无法感染宿主细胞。VLPs中存在二十面体和杆状结构，这些是由病毒结构蛋白自组装形成的。VLPs可以在各种表达系统中实验性地生产（例如，哺乳动物细胞系、植物、细菌、酵母和昆虫细胞系），作为生物和纳米材料（包括疫苗或药物）的载体，利用其结构内的腔体。在这里，具有自组装结构衣壳蛋白的VLPs的形态类似于原生病毒，其中抗原展示在外部表面。从注射部位运输到淋巴结的VLPs被抗原呈递细胞和树突状细胞有效摄取，引发强烈的免疫反应。VLP上抗原的重复排列激活B细胞，刺激更强的体液免疫反应，同时诱导T细胞激活和细胞介导的免疫反应。基于VLPs的结构，可以分为非包膜VLPs和包膜VLPs（eVLPs）。非包膜VLPs包含特定病毒的单个或多个衣壳蛋白，具有简单和相对的结构。包膜VLPs在结构上更为复杂，包含病毒和宿主膜成分。包膜VLPs的免疫刺激性有限（基于所使用的结构蛋白），更有效地作为抗原和佐剂的传递系统，免疫原性材料展示在VLP的外表面（图4），而脂质双层也包含免疫原性颗粒以增强抗体反应。几种预防性疫苗（例如，针对乙型肝炎病毒的Recombivax HB和Engerix-B，针对人乳头瘤病毒的Gardasil、Cervarix和Gardasil-9，以及针对乙型肝炎病毒的Hecolin）是非感染性病毒结构蛋白，作为基于VLP的疫苗使用，并在市场上商业化。 图 4. 病毒样颗粒（VLP）的示意图，其表面由嵌入天然脂质双层（包围细胞膜）中的抗原（例如，衣壳蛋白）构成，形成包膜VLPs。(a) 非包膜VLPs仅包含单个或多个衣壳蛋白。两种类型的VLP均不含传染性材料（例如，DNA/RNA）。(b) 双层包膜VLPs的配方与其表面多个糖蛋白有关。 作为疫苗传递系统的病毒样颗粒（VLPs）的优势包括特定靶向、有效的宿主细胞穿透、生物相容性和可降解性。VLPs与天然病毒相似，VLPs表面暴露的抗原，被抗原呈递细胞有效摄取，并促进内吞作用和抗原在宿主细胞中的穿透。此外，VLPs的蛋白酶解机制可以使基于VLPs的疫苗易于降解，且降解产物具有生物相容性。 尽管有许多细胞平台用于生成病毒样颗粒（VLPs）（例如，昆虫、哺乳动物、细菌、酵母和植物），但VLPs无法表达对人类最佳免疫原性至关重要的翻译后修饰。在细菌平台中，VLP配方中可能会发生内毒素污染。酵母和昆虫细胞在形成VLPs方面具有成本效益且可扩展，同时可能会形成意外的修饰或污染物，包括真核翻译后修饰（例如，糖基化）和分别的杆状病毒污染物。这些成分或修饰可能会对刺激针对疾病的适应性免疫反应产生负面影响。由于人类病毒病原体污染和复杂的翻译后修饰的存在，哺乳动物细胞是最难生产VLPs的。 病毒体是球形的单层囊泡（60-200纳米），由去除了核衣壳的病毒包膜磷脂组成（图5）。 图 5. 病毒体佐剂示意图。病毒体是由磷脂双层合成的（类似于脂质体），其中使用了获批的流感疫苗作为病毒体的病毒结构，允许与流感表面蛋白血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）结合。 病毒体，一种“人造病毒”，可以作为免疫原、表位展示纳米载体或传递纳米平台，用于将疫苗抗原直接传递到宿主细胞。抗原可以通过病毒体表面的疏水域和脂质链进行共轭，此外，整合到磷脂双层中，传递到抗原呈递细胞的细胞质中，刺激体液或细胞免疫。病毒体与病毒共享的特性基于它们的结构，病毒体是安全修改的病毒包膜，包含磷脂膜和表面糖蛋白。作为疫苗传递系统，病毒体是可生物降解的，并且与许多宿主生物体相容。尽管含有类似磷脂双层的脂质体在体内外传递生物活性分子方面具有显著潜力，但由于与细胞融合的效率低，它们无法有效地将包裹的分子传递到细胞中。相比之下，病毒体由于具有受体结合和膜融合特性的病毒包膜糖蛋白，保证了细胞传递表位。 流感病毒的病毒体疫苗，名为Inflexal V，已在欧洲获得许可，而乙型肝炎病毒疫苗，名为Epaxal，在亚洲、欧洲和南美获得批准。病毒体传递系统具有显著优势，包括高质量和长期抗体反应、抗原的构象稳定化、保护抗原免于降解、安全概况，以及适用于特定人群（例如，老年人、婴儿或免疫受损人群）。然而，病毒体传递系统的显著缺点是可能由于表面病毒糖蛋白诱导的免疫反应，这可以通过使用疏水聚合物（如聚乙二醇和聚乙烯吡咯烷酮）来修饰病毒体表面来消除。此外，病毒体传递系统在血液间隔中的快速解聚是第二个潜在问题。为了解决这个问题，与抗原共轭的病毒体能够在给药后短时间内到达目标部位。 病毒样颗粒和病毒体佐剂的临床开发 流感A病毒（H3N2）是寻找改进流感疫苗过程中的一个巨大挑战，因为流感疫苗在老年人中的免疫原性较差。Shinde及其同事使用了重组血凝素三价纳米颗粒疫苗（tNIV），该疫苗是在含有保守H3N2表位的宽型病毒序列的Sf9昆虫细胞-重组杆状病毒平台上生产的，作为流感疫苗候选物，肌肉内给药到330名成人（50岁以上）（NCT03293498）。这项1/2期临床试验发现，这种基于VLP的流感疫苗是安全且耐受性好的，与获批的Fluzone®高剂量流感疫苗相比，刺激了更高水平的中和抗体，具有长期保护性免疫反应。 在加勒比地区的传染病流行区域完成了针对基孔肯雅病毒（Chikungunya）VLP疫苗（VRC-CHKVLP059-00-VP）的2期临床研究（NCT02562482）。该疫苗是通过转染DNA质粒的人类胚胎肾（VRC293）细胞生产的，主要包含编码结构蛋白E1（细胞融合功能）和E2（细胞结合功能）的单链RNA，以及来自基孔肯雅病毒37,997病毒株的灭活衣壳DNA。对试验中400名随机志愿者的分析证明了疫苗的安全性和耐受性，并显示免疫反应在接种后72周持续存在。尽管与VLP相关的16起轻度至中度自发不良事件（多于安慰剂疫苗组），但所有不良事件均已解决，患者没有临床后遗症。 HPV VLPs与HPV L1衣壳蛋白自组装形成高免疫原性颗粒，随后在酵母（或昆虫）细胞中表达蛋白。最近获批的HPV VLPs九价HPV（9vHPV）疫苗，在临床试验中显示出显著的效力和安全性，它触发了比二价和四价疫苗更广泛的免疫反应，以预防更多HPV亚型。2014-2018年的3期临床试验确认了9vHPV疫苗在16至26岁男性中的效力，HPV四价疫苗（4vHPV）用作阳性对照（NCT02114385）。对两组人群分别给予三剂9vHPV（或4vHPV），两种疫苗均显示出对四种常见HPV亚型（6、11、16和18）的相似免疫原性。然而，9vHPV疫苗在HPV亚型31、33、45、52和58上的免疫功能明显高于4vHPV。尽管两种疫苗触发了类似的系统性不良事件比率，但接受4vHPV疫苗的六名志愿者出现了严重不良事件。 在VLPs中嵌入抗原，以flagellin佐剂支持，可能是传染病疫苗的新策略。嵌入蛋白的自由组合可能会增加疫苗的免疫原性以及疫苗设计的范围。该系统在HPV疫苗开发中的显著成功为进一步的疫苗研究和疾病提供了模型。实际上，这已经在发生，因为一种针对SARS-CoV-2的新型VLP疫苗已进入1期临床试验（NCT04818281），并附加了早期结果。 病毒体传递系统参与增强针对感染的疫苗的免疫原性。1期临床试验的HIV病毒体疫苗，通过肌肉内、皮内或皮下给药到健康志愿者，显示出良好的安全记录，没有不良效果（NCT04553016）。在这项研究中，使用流感包膜病毒来生产病毒体传递系统，与HIV-1毒力抗原（包括gp41和p1肽）结合，分泌类似细胞的辅助T细胞和巨噬细胞。此外，一种抗疟疾病毒体疫苗，名为PEV3A，进入了2期临床试验，使用来自P. falciparum K1分离株的环孢子蛋白和顶端抗原-1（AMA-1）的两个疟疾肽段的病毒体配方（NCT00408668）。PEV3A安全且耐受性好，与安慰剂组相比，诱导了高抗体滴度，并增强了抗疟疾免疫反应。 病毒样颗粒和病毒体传递系统广泛用于对抗传染病。一些疫苗通过病毒样或病毒体传递系统佐剂（例如，流感疫苗、乙型肝炎病毒疫苗或HPV疫苗）在市场商业化，并且更多的VLP和病毒体佐剂临床研究已进入不同阶段，产生了高抗体滴度并诱导适应性免疫。 病毒样颗粒和病毒体递送系统被广泛用于对抗传染病。市场上有几种疫苗使用病毒样或病毒体递送系统作为佐剂（例如，流感疫苗、乙型肝炎（HBV）疫苗或人类乳头瘤病毒（HPV）疫苗），并且更多的临床研究已经进入不同阶段，这些研究使用VLP和病毒体佐剂，产生了高抗体滴度并诱导适应性免疫。 7.3.合成多核苷酸佐剂 合成的双链RNA复合物，聚肌苷酸：聚胞苷酸（通常缩写为Poly I:C或Poly(I:C)），激活先天和适应性免疫成分。它通过触发特定的模式识别受体（PRRs）和TLR3受体来模拟病毒感染并引发宿主免疫反应。Poly(I:C)的衍生物也是有效的佐剂，包括poly-IC12U和poly-ICLC。Poly-IC12U的毒性低于Poly I:C，半衰期缩短，意味着它不会引发针对双链核酸DNA的抗体。Poly-ICLC保留了亲本Poly(I:C)的生物活性，同时也显著增加了对核酸溶解的抵抗力。 含有未甲基化环状二鸟苷酸（CpG）基序的合成寡脱氧核苷酸（ODNs）在结构/功能上类似于细菌DNA，能够结合TLR9。根据不同的结构和免疫反应，已经鉴定出四类CpG ODN（D型、K型、C型、P型）。这四类CpG ODN包含一个中心未甲基化的‘CG’二核苷酸和侧翼区域。作为佐剂的CpG ODN识别TLR9受体（例如，浆细胞样树突状细胞和B细胞），导致Th1和促炎细胞因子的分泌以及先天免疫反应的诱导。此外，CpG ODN增强了专业抗原呈递细胞，导致对传染病的体液和细胞免疫反应的诱导。随着CpG作为HBV疫苗佐剂的商业应用，对其在其他疫苗中的潜力的研究正在进行中。 多核苷酸佐剂的临床前和临床开发 已经报道了许多有前景的多核苷酸佐剂的临床前和临床试验（例如，Poly I:C、poly-ICLC和ODNs及其衍生物），用于传染病，突出了这类佐剂在未来疫苗设计中的前景。这里和表2中提到了一些这些研究。 Poly I:C与重组HIV-1包膜糖蛋白（gp120；介导病毒包膜与目标细胞膜的融合）结合，注射到小鼠体内，表明未成熟的树突状细胞呈递抗原并产生增加水平的CD8+细胞，与使用脂多糖（一种TLR4激动剂佐剂）相比，对HIV产生了强烈的细胞免疫反应。此外，当Poly I:C与HIN1流感血凝素蛋白PR8结合使用时，也被证明是一种有效的粘膜佐剂。在小鼠鼻内免疫后，这种PR8/Poly(I:C)疫苗刺激了IgA滴度的增加，与单独使用流感抗原相比，产生了强大的体液免疫反应。2014年，Saxena等人将血浆HIV-1 RNA与TLR-3激动剂Poly-ICLC佐剂物理结合作为HIV疫苗。在这项临床研究中，HIV疫苗被肌肉注射到健康志愿者和患者体内，结果显示这种疫苗在Poly-ICLC给药后没有显著改变与CD4+ T细胞相关的HIV免疫，尽管安全性好且耐受性良好（NCT0207195）。在临床上，poly-ICLC已被证明是安全的，并使我们能够诱导疫苗的免疫原性，广泛使用佐剂对抗肿瘤而不是传染病。Rintatolimod（Ampligen®），一种合成的双链RNA（Poly I:Poly C12U）与甲醛灭活全病毒抗原（NIBRG14）结合，源自重组H1N5禽流感病毒，进入了55名健康志愿者的1/2期临床试验（NCT01591473）。鼻内免疫后，流感疫苗被耐受，最常见的不良反应是注射部位疼痛、疲劳和可耐受的头痛。这种Rintatolimod（Ampligen®）佐剂产生了更高的IgA滴度，并在疫苗后保护时诱导了针对H5N1的强大粘膜和体液反应，与未佐剂组相比。有趣的是，疫苗的较低剂量水平出现了增加的粘膜和体液免疫反应，进一步的3期研究正在进行中，比较活减毒流感疫苗佐剂安慰剂、低剂量和高剂量Rintatolimod的免疫原性（NCT00711295）。 CpG ODN佐剂疫苗的临床前试验涉及多种疾病模型。例如，CpG ODN作为HSV疫苗的佐剂已经得到了广泛的研究。在小鼠阴道内免疫HSV-2疫苗佐剂CpG ODN后，观察到对致命HSV-2感染的强烈粘膜和保护性Th1免疫反应的快速刺激。此外，这种HSV-1/CpG ODN佐剂疫苗在兔子体内产生了显著的Th1免疫，同时在泪液和血清中产生了高水平的中和IgA和IgG。黄等人对新生小鼠进行了超声裂解沙门氏菌蛋白与CpG ODN结合的口服给药，针对沙门氏菌肠炎感染，显示出比单独疫苗更高的IgG滴度和更强的粘膜和系统免疫反应，存活率更高。此外，Klinman等人证明了用CpG ODN佐剂的小鼠腹腔（或鼻内）免疫接种的许可炭疽疫苗吸附（AVA）诱导了强烈的系统反应和显著的保护性免疫。 CpG 1018（唯一获得FDA批准用于人类疫苗的CpG佐剂）正在进行乙型肝炎疫苗（HBsAg-1018; HEPLISAV-B™）的3期临床试验（NCT02117934）。这项3期临床试验在8374名患者中进行，显著减少了乙型肝炎感染及相关的发病率和死亡率。最近，Kuo等人选择了一种前融合稳定的SARS-CoV-2刺突蛋白（S-2P [SARS-CoV-2 S-2P]）作为新型疫苗抗原。这种COVID-19抗原与FDA批准的人类佐剂（CpG 1018）和氢氧化铝结合，形成了COVID-19疫苗候选物，肌肉注射到小鼠和大鼠体内。临床前结果表明，这种疫苗刺激了Th1免疫反应，并产生了高中和抗体滴度，具有强大的保护性免疫反应。 炭疽AV70909疫苗候选物（AVA蛋白和CPG 7909佐剂[专门设计用于激活TLR9的CpG ODN佐剂类型]）的1期临床试验在25名健康成人中进行，结果显示与安慰剂组相比，抗体滴度增加，适应性免疫迅速诱导（NCT01263691）。此外，Mullen等人临床评估了与这种CpG 7909佐剂结合的疟疾抗原顶端膜抗原1（AMA1）作为抗疟疾疫苗。这项1期临床试验（NCT00344539）涉及75名疟疾易感志愿者，表明含有CPG 7909的疫苗诱导了更高水平的抗AMA1 IgG抗体，并增加了同源寄生虫生长抑制水平，副作用较小（例如，注射部位发红/疼痛）。此外，CpG 7909是商业流感疫苗（Fluarix®）的一部分，该疫苗已在健康成人中作为1期临床试验（NCT00559975）。这项试验再次支持了NCT01263691和NCT00559975试验中看到的结果，具有良好的疾病保护和轻微的疫苗副作用。 IC31是一种新型的两组分TLR9激动剂佐剂，包含一个11-mer抗菌肽（KLKL（5）KLK）和一个不含胞嘧啶磷酸鸟嘌呤（CpG）基序的合成寡脱氧核苷酸（ODN1a）。这种多核苷酸佐剂已应用于结核病疫苗研究，其中来自两种M.结核菌（Mtb）抗原（Ag85B和TB10.4）的调查性结核病融合蛋白（H4:IC31（AERAS-404））被肌肉注射到60名健康志愿者体内。1/2期临床试验（分别为NCT02066428和NCT02074956）结果显示，H4:IC31（AERAS-404）疫苗耐受性良好，具有优秀的安全特性。与安慰剂组相比，这种H4:IC31（AERAS-404）疫苗在两次剂量给药后，诱导了抗原特异性的CD4+ T细胞反应，并产生了细胞因子（例如，干扰素-γ）。 7.4.脂质体作为佐剂（粘膜粘附性抗原递送系统） 脂质体是球形的小型人工囊泡，由一个（或多个）脂质双层包裹着一个水核心（图6）。脂质体的发现可以追溯到1956年；然而，脂质体作为疫苗递送系统的第一应用直到1974年才出现。脂质体由天然（或合成）的生物可降解、无毒和无免疫原性的磷脂合成，形成水核心。包括古菌质体（用古菌域特有的一个或多个醚脂质制成的脂质体）和阳离子及中性脂质体在内的脂质体，因其大小、生物相容性和物理化学特性，在疫苗应用中得到了广泛使用。脂质体可以根据需要（例如，大小、电荷）进行定制，以增强疫苗的效力，这是通过使用不同的脂质、靶向基团（例如，抗体、蛋白质）、合成/配方程序（允许大小调整/细化）和抗原（例如，DNA、肽）来实现的（图6）。 图6. 脂质体示意图。 在脂质体递送系统中，水溶性化合物（例如，肽、核酸和碳水化合物）被包裹在脂质体的水性内部，而疏水性化合物则位于脂质双层中。通常情况下，根据抗原的性质，它们可以被包裹在亲水核心中，封装在疏水双层中，通过静电结合到脂质体表面，或者通过抗原上的酰链修饰而被吸收。巧合的是，脂质体递送系统保护抗原免受酶降解，提高吸收率，并增强疫苗的生物利用度。脂质体被用来针对特定的细胞位点，以及释放抗原到炎症部位，因此，已经被用于多种疫苗接种途径（例如，皮肤、口服、粘膜和局部）。脂质体与其他类型的佐剂（包括TLR激动剂）结合使用，增加了疫苗候选物的生物稳定性，诱导更强的体液或细胞免疫反应。脂质体作为抗原的递送系统，是有效的免疫刺激剂，增强了抗原对抗原呈递细胞的暴露，并允许CD4+和CD8+细胞的成熟，以及强效的体液或细胞免疫反应。然而，脂质体的可复制配方是一个主要障碍。 脂质基纳米载体已被广泛用作疫苗佐剂，具有在体内传递核酸抗原的能力。由脂质和包裹的核酸组成的脂质基纳米载体（10-500纳米）已克服了系统障碍，控制释放时间，并在注射部位递送抗原。脂质基纳米载体的配方受到脂质组成、核酸与脂质比例和配方方法的影响。阳离子佐剂配方CFA01含有N,N0-二甲基-N,N0-二十八烷基铵（DDA），以及合成的分枝杆菌免疫调节剂α,α0-海藻糖6,60-二苯甲酸酯（TDB）插入到脂质双层中，作为典型的脂质基纳米载体。令人兴奋的是，CFA01激活抗原呈递细胞，诱导B细胞和T细胞分化，具有将抗原呈递给相关细胞群体的能力。CAF01脂质体是高度多分散的多囊泡，平均粒径约为450纳米。CAF01（或CFA01）表面显著带正电，电荷约为+60 mv。CAF01脂质体的脂质膜在生理温度下处于有序固体状态，因为相变温度高于37°C。阳离子脂质体配方CAF01的使用可以追溯到19世纪，目前正参与针对传染病疫苗的临床研究。离子化脂质在低pH值下表达正电荷，而在生理pH值下保持中性。离子化脂质的pH敏感性对疫苗中核酸货物的传递是有益的，因为与中性脂质的血细胞阴离子膜的相互作用较少，增强了脂质纳米颗粒的生物相容性和稳定性。 脂质体佐剂（和/或传递系统）的临床前和临床开发 作为传递系统或佐剂的脂质体已广泛参与传染病疫苗的开发。Ghaffar等人使用阳离子脂质体包裹基于脂肽的A组链球菌（GAS）抗原，通过鼻内途径传递给小鼠。这种GAS疫苗产生的IgA和IgG滴度更高（免疫后5个月检测到），并且与单独的基于脂肽的疫苗相比，产生了更强的粘膜和系统免疫反应。聚乙烯亚胺（PEI）辅助的阳离子脂质体含有GAS肽抗原J8，通过鼻内途径给小鼠。结果表明，高比例的PEI诱导了比低比例PEI更强的免疫反应。Pfs25疫苗是预制的钴卟啉-磷脂脂质体，包裹了重组疟疾蛋白抗原。这种Pfs25疫苗在小鼠和兔子中进行了免疫，导致自发的纳米脂质体抗原特异性化，并诱导了高IgG抗体体液免疫。此外，这种预制的钴卟啉-磷脂脂质体与双TLR配体（GLA [TLR4激动剂]和3M-052 [TLR7/8激动剂]）共给药，被Abhyankar等人评估为COVID-19疫苗（SARS-CoV-2蛋白抗原）[252]。通过鼻内途径传递到SARS-CoV-2K18-hACE2小鼠后，这种双TLR配体脂质体系统的免疫结果产生了更高的IgA滴度，并诱导了比单独抗原更强的粘膜和系统免疫。COVID-19 mRNA-1273是一种脂质纳米颗粒包裹的、核苷酸修饰的信使RNA（mRNA）菌株，编码SARS-CoV-2刺突（S）糖蛋白作为COVID-19疫苗候选物，通过肌肉注射给30,420名志愿者。这个3期临床试验表明，疫苗是可耐受的，没有安全问题，预防COVID-19感染（包括严重疾病）的有效性为94%（NCT04470427）。BNT162b2，辉瑞/BioNTech疫苗是一种COVID-19 mRNA疫苗。核苷酸修饰的mRNA编码SARS-CoV-2全长刺突蛋白被包裹成离子化脂质纳米载体。这种BNT162b2疫苗通过了3期临床试验（NCT 04368728），有43,548名参与者，是安全的，并表达了95%的预防COVID-19流行的有效性，具有保护性抗COVID-19免疫反应。Smith等人进行了基于阳离子脂质的Vaxfectin®佐剂的质粒DNA疫苗的1期临床试验，编码流感病毒H5血凝素（NCT00709800），作为流感疫苗，通过肌肉注射给大约100名健康志愿者。这个临床试验表明，Vaxfectin®辅助的DNA质粒流感疫苗耐受性良好，并刺激了抗体免疫反应，具有大流行控制的保护性免疫。沙眼衣原体是一种热带革兰阴性专性细胞内细菌，是全球细菌性传播疾病的病原体，每年有超过9000万新病例的生殖器C. trachomatis感染。国家筛查项目和抗生素药物不能减少这种疾病的发病率。1期临床试验的新型C. trachomatis重组蛋白亚单位（CTH522）与CAF01脂质体佐剂结合，通过肌肉注射给19至45岁的健康女性志愿者（NCT02787109）。除了在局部注射部位的轻微不良事件外，没有报告严重副作用。这种CTH522:CAF01疫苗产生了更高的IgG滴度，并增强了粘膜抗体谱，与铝佐剂疫苗抗原（CTH522: 铝）相比，细胞介导的免疫反应更为一致。此外，这种CAF01佐剂与包含TB抗原（Ag85B和ESAT-6 (H1)）的重组融合蛋白结合，在1期临床试验中进行了评估（NCT00922363）。在健康志愿者中进行肌肉免疫后，没有观察到局部或系统性副作用。这种疫苗的两剂方案显示出在接种后150周后诱导更强的抗原特异性T细胞反应和疫苗接种后的保护。作为传递系统，脂质体包裹抗原并在作用部位释放。为了优化脂质体佐剂免疫学，通过修改大小和电荷，表面装饰与免疫细胞结合的抗原，并增加体内循环时间来工程化脂质体属性。在这里，包括阳离子脂质体和离子化脂质在内的脂质基纳米载体，它们刺激细胞和体液免疫反应，并具有高佐剂性，已被用于针对人类感染的临床研究。 7.5.多糖作为佐剂 多糖佐剂（包括壳聚糖、葡聚糖、菊粉、甘露聚糖和一些中药）是一种天然聚合物，包含糖苷键合的碳水化合物单体。多糖作为疫苗佐剂，由于其有效的免疫调节、生物相容性、生物可降解性、低毒性和安全性，已广泛参与疫苗开发。多糖已知能激活巨噬细胞和NK细胞，导致细胞因子和促炎趋化因子的产生，并刺激先天免疫反应。此外，多糖作为有效的免疫刺激剂，诱导体液、细胞和粘膜免疫反应，以对抗感染。常见的多糖佐剂包括壳聚糖及其衍生物，如葡聚糖、菊粉和甘露糖。壳聚糖来源于甲壳类动物的外骨骼，具有低毒性、适当的生物相容性和生物可降解性，支持其在生物医学应用中的广泛使用。壳聚糖能够产生促炎趋化因子、各种细胞因子（例如，IL-1、IL-6、TNF），并诱导先天和适应性免疫反应。此外，壳聚糖衍生物（包括壳聚糖季铵盐和N,O-羧甲基壳聚糖）已知能激活系统免疫反应和粘膜免疫反应以对抗感染。葡聚糖佐剂由重复的D-葡萄糖单元组成，通过糖苷键连接，主要来源于植物和微生物。葡聚糖根据其构象分为α-和β-葡聚糖，其中β-葡聚糖是疫苗应用中主要的葡聚糖佐剂，因为它们与受体（例如，TLRs和dectin-1）结合，刺激先天和适应性免疫反应。 菊粉，从菊科植物的根部提取，包含线性的β-D-多果糖基-α-D 葡萄糖[258]。菊粉分为四种不同类型（α、β、γ 和 δ），其中 γ- 和 δ- 菊粉已被证明能诱导细胞和体液免疫。甘露糖，是醛六糖系列碳水化合物的单糖单体，对人类代谢（例如，蛋白质糖基化）很重要。甘露糖（作为佐剂）与巨噬细胞和树突细胞结合，刺激先天免疫，以及 Th1 和/或 Th2 免疫反应。 多糖佐剂的临床前和临床开发 在这个佐剂类别中，壳聚糖是研究用于疫苗开发的主要多糖佐剂，针对传染病。McNeela 等人将壳聚糖与白喉毒素的交叉反应物质（CRM197）共给药，作为通过鼻内途径传递给小鼠的白喉疫苗。这项临床前评估表明，壳聚糖的存在引发了更高水平的 IgG 和 IgA 抗体以及强烈的 Th2 免疫反应。此外，CRM197 白喉毒素加壳聚糖的鼻内免疫在豚鼠中引发了针对白喉毒素的保护性抗体，显示了壳聚糖作为疫苗佐剂的前景。 一种 H5N1 流感疫苗用两种壳聚糖衍生物（壳聚糖的谷氨酸盐，CSN 和壳聚糖的三甲基衍生物，TM-CSN）佐剂化。在雪貂模型中通过鼻内途径给药后，两种疫苗都产生了更高的抗体滴度，强烈的 Th2 和粘膜免疫反应，并显著减少了与单独 H5N1 流感疫苗相比的复制。有趣的是，由于 TMC 的高电荷密度改善了粘膜上皮的细胞旁通透性，TM-CSN 在这项研究中比 CSN 诱导了更高的保护性抗体。 一种单价诺沃克病毒 VLP 针对急性胃肠炎与 MPL/壳聚糖（MPL/壳聚糖-VLP 疫苗）结合，在 2 期临床试验中进行了评估（NCT00973284）。通过鼻内免疫后，与安慰剂组相比，报告了更高的 IgA 抗体和显著减少的疾病/感染。Advax，一种 delta 菊粉佐剂，已在乙型肝炎病毒（HBV）疫苗试验中使用，诱导了体液和细胞免疫反应。Advax 与灭活 HBV（或酵母表达的重组乙型肝炎表面抗原；HBsAg）（ACTRN12607000598482）的 1 期临床试验与单独的乙型肝炎表面抗原相比是有希望的。此外，与 Advax 佐剂共给药的 HIV-1 疫苗候选物的 1 期临床试验在健康成年人中进行，并且没有显示与疫苗相关的严重不良副作用（NCT00249106）。 多糖作为潜在的佐剂，在疫苗开发中已被分散。然而，多糖的活性以及生产和提取多糖的适当过程仍然大部分未被探索。深入研究多糖结构和生物功能、物理化学性质和多糖结构的修饰可以增强体液或细胞免疫，具有长期保护性免疫反应。 7.6.聚合物纳米粒子佐剂 近年来，聚合物纳米粒子作为载体，在疫苗佐剂的开发中已进行了测试（图 7）。纳米粒子包含纳米胶囊和纳米球，具有不同的形态。纳米胶囊包含来自疫苗候选物的油性核心，被聚合物壳包围，控制核心抗原的释放概况。 图7. 聚合物纳米粒子示意图。纳米粒子 纳米球是一个连续的聚合物网络，其中抗原可以位于内部或吸附在表面。这两种类型的聚合物纳米粒子被定义为储库系统（纳米胶囊）和基质系统（纳米球）。聚乳酸（PLA）和聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）是人工聚合物纳米粒子（包裹抗原和/或佐剂）。PLA 和 PLGA 是最常见的生物可降解和生物相容性聚合物颗粒，已获准用于人类使用（包括结构和骨植入物），并得到 FDA 批准。PLA/PLGA 颗粒延长了抗原释放，并减少了长期保护所需的重复剂量数量，从而降低了疫苗接种成本。PLA 和 PLGA 颗粒被用作疫苗佐剂，以提高抗原呈递细胞摄取和 MHC-I 和 MHC-II 处理的效率，导致抗原向 Th1 或 Th2 免疫反应的呈递。尽管 PLA/PLGA 基微粒已被用作疫苗佐剂/传递系统，但封装方法的不适当条件（有机溶剂/水界面、剪切或空化力、冷冻和干燥）显著降解了疫苗抗原。这些问题正在通过优化制造方法或与稳定剂（例如，Mg (OH)2 其他蛋白质、表面活性剂或糖）结合来解决。 聚合物纳米粒子佐剂的临床前和临床开发 聚合物纳米粒子表现出显著的免疫学特性，识别抗原呈递细胞，刺激细胞因子，并为疫苗候选物提供免疫刺激。聚合物纳米粒子是一系列疫苗抗原的有希望的传递系统和佐剂，它们的普及源于它们易于合成、生物相容性、生物可降解性，以及它们是非免疫原性的、无毒的且相当便宜。聚合物纳米粒子的缺点包括微胶囊中抗原的稳定性和最佳剂量问题。存在许多不同类型的聚合物纳米粒子，最常见的类型由壳聚糖、PLGA 和 PLA 组成。PLA 与 HIV p24 蛋白共给药通过静脉途径给药到小鼠。这项临床前评估表明，用 PLA 包裹 HIV p24 抗原诱导了更高的 IgA 滴度和对 HIV 感染的更强 Th1 免疫反应，与单独的 HIV p24 抗原相比。基于 DNA 的 HBV 抗原被包裹在 PLGA 佐剂中作为 HBV 疫苗，传递到小鼠模型。PLGA 佐剂的免疫产生了更高的抗体滴度和强烈的体液免疫反应，与单独的 HBV 疫苗相比。DermaVir，一种实验性的 HIV/AIDS 局部疫苗，由编码 HIV-1 抗原的 DNA 质粒组成，包裹在聚合物佐剂中的纳米粒子大小。 DermaVir通过皮肤准备后，通过贴片经皮给药到36名HIV患者。2期临床试验于2020年完成，结果表明，与安慰剂组相比，DermaVir疫苗安全且耐受性良好，具有持久的HIV特异性免疫反应（NCT00711230）。 聚合物纳米粒子，作为一种常见的传递系统，由于抗原的控制释放以及简单且成本效益高的生产工艺，被用作病原体抗原的佐剂，而最佳剂量问题可以通过适当的给药途径和纳米粒子的修饰来消除。尽管聚合物纳米粒子已在针对感染的疫苗的临床前试验或临床研究中进行了测试，但这种纳米粒子广泛用于抗肿瘤治疗性疫苗或药物。7.7.糖鞘脂作为佐剂 糖鞘脂（GSL）是一类脂质（特别是鞘脂），构成细胞膜的一部分。GSL由疏水性神经酰胺和糖苷键合的碳水化合物部分构成，在免疫动物中表现出免疫原性。最近研究发现，α-连接的单糖神经酰胺（来自海洋海绵和细菌）作为iNKT细胞的配体，与自然杀伤T（NKT）细胞结合，作为iNKT细胞激动剂，并引发细胞因子的分泌。 NKT细胞作为先天免疫和适应性免疫之间的桥梁，是一个小而非常规的T细胞亚群。主要的NKT细胞形成不变的T细胞受体（TCR）x链重排-Vx14Jx18在小鼠中，但在人类中是V-x14Jx18，具有有限的Vβ链多样性，称为不变NKT（iNKT）细胞。与传统的T淋巴细胞不同，它们结合MHC类I和类II分子背景下的肽抗原，iNKT细胞结合由MHC类I相关糖蛋白CD1d分泌的脂质（或糖脂）抗原，迅速分泌细胞因子，介导细胞毒性。分泌的细胞因子诱导NK细胞、巨噬细胞的激活，并与CD40/CD40L相互作用形成成熟的树突细胞，影响先天和适应性免疫。因此，设计适当的iNKT细胞激动剂作为疫苗中的佐剂，能够通过增强体液和细胞免疫反应的幅度来提高疫苗的效力。目前，iNKT细胞激动剂（及其类似物）作为疫苗佐剂已被触发用于传染病和癌症。 糖脂α-半乳糖神经酰胺（α-GalCer；图8），是软体动物的天然产物，激活iNKT细胞，触发肿瘤细胞上的内源性糖脂质并根除它们，模拟适应性T细胞免疫反应的佐剂特性。 图8. α-半乳糖神经酰胺的结构。糖鞘脂佐剂的临床前和临床开发 Tsujii等人证明，将α-GalCer（见图8）包含在疟疾疫苗中，通过激活iNKT细胞导致分泌Th1型细胞因子（INF-y）和针对疟疾寄生虫的CD8+ T细胞，显著提高了两周内的保护性免疫，与单独的疫苗相比。此外，α-GalCer在HIV疫苗开发中已被评估，目前的研究集中在与α-GalCer（pADVAX）结合的DNA疫苗上。这种pADVAX疫苗在较低的免疫剂量下，刺激了CD4+和CD8+特异性IFN-y反应和高IgG反应，与仅含DNA的疫苗相比。这种降低的疫苗剂量与Ko小组的流感研究一致，该研究发现，α-GalCer与流感病毒疫苗的鼻内共给药增强了强烈的体液、细胞因子和T细胞反应，并且所需的剂量低于单独的抗原。2007年，Youn等人得出结论，通过将α-GalCer作为佐剂与流感病毒疫苗共给药，特异性体液免疫反应得到了增强。此外，基于各种Th2细胞因子（例如，IL-4和IL-5）的释放，免疫细胞介导的反应比单独的疫苗更强。对于流感疫苗，Th1和Th2细胞因子环境都很重要，并且通过添加α-GalCer得到了增强。2017年，一种编码流感A病毒基质蛋白2（M2）的DNA流感疫苗，与α-GalCer佐剂一起，通过肌肉注射给小鼠，导致与单独的DNA疫苗相比，产生了更高的IgG滴度和Ig2a/IgG1比率以及长期保护性免疫。尽管α-GalCer已在流感疫苗的临床前研究中使用，但目前尚无报道与α-GalCer佐剂结合的流感病毒疫苗的临床试验。 Woltman等人将HBV蛋白抗原与合成α-GalCer（KRN 7000）结合，随后通过静脉注射给参与者，1/2期临床试验显示，尽管α-GalCer佐剂耐受性差，但证明了其安全性，并且现在没有合适的佐剂疫苗针对HBV（NCT00363155）。 总体而言，α-GalCer作为佐剂诱导了强大的体液和细胞免疫反应，其中用α-GalCer佐剂化的流感疫苗的临床前研究已在动物模型中进行了测试，尚未过渡到临床试验。α-GalCer在开发针对癌症（例如，肺癌、乳腺癌和白血病）的治疗性疫苗方面具有巨大潜力，无论是在临床前还是临床研究中都取得了显著进展。8.张力活性佐剂 皂苷佐剂，发现于1925年，最初来源于树皮或植物皮肤的粗提取物。然而，在20世纪50年代，皂苷作为对抗口蹄疫病毒的兽医疫苗佐剂后，其发展加快了。 发现皂苷中发现的类固醇的天然糖苷、类固醇生物碱和三萜化合物改变了细胞膜，刺激细胞产生信号因子，从而增强了免疫反应。Quil-A，是从皂角树Quillaja sapomari提取物，及其衍生物是最广泛使用的皂苷作为佐剂目的。由于Quil-A（一种异质混合物）对人体使用过于有毒，从Quil-A中分离和分析各个部分（例如，QS-21；见图9）是用于传染病疫苗（例如，疟疾、肝炎；表2）中最常用的皂苷作为佐剂目的。 图9. QS-21佐剂结构。 皂苷类佐剂（例如，QS-21）有效地产生Th1细胞因子、亲细胞抗体和强烈的抗原特异性细胞毒性T细胞反应，以诱导体液和细胞反应。这可能是由于抗原呈递细胞的表面凝集素与QS-21的糖区域相互作用，促进了抗原的摄取，从而增强了T细胞和B细胞的反应。在使用QS-21和灭活的Aujeszky病病毒作为抗原的小鼠的临床前研究中，也观察到了平衡的IgG1（通过Th2免疫促进）和IgG2a（由Th1免疫增强）的产生。另外有人提出，QS-21和抗原通过内吞作用被吸收，因为发现QS-21对树突细胞的内体膜胆固醇有很高的亲和力。通过内吞作用的吸收导致刺激CD8+ T细胞和细胞毒性淋巴细胞。尽管QS-21作为疫苗佐剂在过去几十年中取得了显著的成功，但有必要深入理解其作用模式，加速新疫苗的开发。此外，Matrix-M佐剂是一种新的皂苷类似物，从Q. saponins中提取，并与胆固醇和磷脂制成纳米颗粒。Matrix-M佐剂增强了Th1和Th2反应，改善了免疫细胞的迁移，并允许抗原剂量减少，因此，由于其安全性和有效性，已广泛用于临床前和临床疫苗试验。 虽然皂苷佐剂由于其能够产生所需的免疫反应而在疫苗开发中显示出巨大的前景，但由于从天然来源商业规模地持续获取这些化合物是不可持续的，并且缺乏以可复制的方式合成制造它们的技术。还有人指出，这些佐剂的稳定性低，有剂量相关毒性导致不良反应的报告（例如，溶血）。 免疫刺激复合物（ISCOMs）是球形的、开放式笼状结构（40-60纳米大小，图10），当胆固醇、磷脂和Quil-A皂苷（例如，QS-21或其变体）以特定的化学计量通过自组装结合时，它们会自发形成。组装后，使用不同的方法（例如，超速离心、透析、脂膜水合、乙醇注射）产生胶体分散体。作为佐剂中的主要免疫刺激物，Quil-A增强了抗体的分泌和细胞免疫反应。胆固醇的作用是将Quil-A与磷脂结合，形成笼状几何结构，并提高佐剂与细胞膜的亲和力，提出改善抗原呈递细胞对抗原的内吞作用。抗原通过疏水（或静电）相互作用被封装在复合孔中（或绑定在复合表面）形成独特的疫苗传递系统，该系统是抗原特异性的。值得注意的是，当这些佐剂与胆固醇结合时，尽管保留了佐剂能力，但Quil-A皂苷的毒性溶血活性显著降低。 图10. 免疫刺激复合物（ISCOMs）示意图。 QS-21是一种有效的免疫刺激剂，但其局限性包括潜在的剂量相关毒性、低化学稳定性、低提取产量（来自天然来源）以及对其作用机制理解不完全。为了克服这些局限性，过去几十年通过化学合成对QS-21佐剂进行了结构修饰，发现了近50种皂苷类似物。只有微小结构变化的衍生物与一系列疫苗抗原在体内进行了测试，以确定它们的免疫原性和安全性。在QS-21变体的临床前研究中，分析了QS-21的结构-活性关系，以及分子不同区域的免疫刺激潜力。研究发现，通过简化糖酰链改变线性寡糖域创造了更有效的QS-21变体。例如，通过这种结构-活性关系方法发现了低毒性、高稳定性和高佐剂免疫原性的刺囊酸变体74（SQS-1-8-5-18）。Wang等人成功合成了QS-21的非天然类似物。这些非天然皂苷包含一个通过稳定的酰胺键（而不是QS-21中的酰侧链）连接到C3三糖域的脂肪链。这些QS-21类似物在适应性免疫反应期间增强血清抗原特异性IgG反应方面比QS-21更有效。Marciani等人开发了半合成皂苷类似物GPI-0100[280]。这种合成化合物完全去除了原始的酰侧链，随后通过酰胺形成引入了十二碳内酰胺链。GPI-0100引起了体液和细胞免疫反应，与QS-21相比毒性较小。 Matrix-M佐剂与全长SARS-CoV-2刺突（S）糖蛋白结合，被开发为COVID-19疫苗（NVX-CoV2373），其中NVX-CoV2373的1/2期临床试验已完成（NCT04368988）。在欧洲进行了这种疫苗的3期临床试验（EudraCT编号，2020-004123-16），证明两剂NVX-CoV2373疫苗接种是安全的，对症状性COVID-19的有效性为89.7%。 针对致病性禽流感病毒的H5N1疫苗未能在2003年重大爆发后提供满意的粘膜免疫反应，也未能完全阻止疾病的传播。鼻内给药疫苗（AIV-H5N1灭活疫苗）中的抗原是由A/Chicken/Denpasar/01/2004(H5N1)菌株在鸡蛋中产生的，并通过甲醛灭活。ISCOMS-AbISCO-300（ISCOMs的一个亚型）和inmunair（INM：用于动物疫苗的不活跃的丙酸杆菌与脂多糖的混合物）被作为佐剂与相同的AIV-H5N1灭活抗原结合，以增强经鼻内免疫后的免疫原性。在临床前试验中，鸡和老鼠接种了与抗原共给药的INM、与抗原结合的ISCOMs、与INM和抗原结合的ISCOMs，以及单独的抗原。INM和ISCOMs的结合增加了老鼠和鸡的免疫反应，而单独给药的INM没有增强老鼠的免疫反应。ISCOMATRIX（源自ISCOM）已广泛用于人类丙型肝炎病毒和流感。与ISCOMATRIX佐剂结合的H7N9流感病毒的1期临床试验表明，ISCOMATRIX佐剂的添加比单独的H7N9疫苗增强了针对禽流感的更高抗体免疫反应（NCT01897701）。ISCOMATRIX与其他TLR激动剂佐剂（例如，CpG ODN，MPL）结合，作为治疗性或预防性疫苗，也已进行了研究。总体而言，ISCOMs衍生物的免疫原功能及其与其他佐剂结合的强大潜力为未来新型佐剂提供了新的可能性。 9.蛋白酶佐剂  蛋白酶分为不同的家族（例如，半胱氨酸、丝氨酸、天冬氨酸和苏氨酸蛋白酶），在蛋白质水解中具有重要作用。木瓜样半胱氨酸蛋白酶（被认为是最丰富的半胱氨酸蛋白酶类型）来源于病毒、细菌、酵母、原生动物、植物和动物，并在活性位点含有亲核的半胱氨酸硫醇。这类蛋白酶刺激Th2免疫反应，是疫苗开发中潜在的佐剂。 蛋白酶佐剂的临床前开发 木瓜样半胱氨酸蛋白酶已在针对血吸虫病的疫苗开发中使用。曼氏血吸虫甘油醛3-磷酸脱氢酶（SG3PDH）、过氧化物酶（TPX）和其他幼虫排泄-分泌产物（ESP）是诱导Th1和Th17免疫反应的血吸虫抗原，但自然感染不具有保护性。Ribi和同事选择了与木瓜结合的重组SG3PDH和TPX衍生肽，注射到小鼠模型中。这项临床前试验表明，半胱氨酸蛋白酶的免疫接种产生了更高的抗体滴度，并增强了Th2类型的免疫反应。半胱氨酸和丝氨酸蛋白酶作为佐剂，产生高水平的IgE抗体，并诱导Th2免疫反应，这些佐剂已广泛用于对抗过敏反应和哮喘（而不是感染）。 10.结合佐剂系统  佐剂系统（由GlaxoSmithKline开发）是各种经典佐剂和免疫刺激物的组合，以刺激适应性免疫反应对抗病原体。免疫刺激物（例如，铝佐剂、TLR激动剂或QS-21）已与油包水乳液或脂质体结合到佐剂系统中。这些组分相互协同作用，刺激广泛的免疫反应，选定的佐剂组合显示出优越的安全性和免疫原性。目前，各种佐剂系统（包括AS01、AS02、AS03和AS04）已广泛开发，一些已在临床试验中进行，AS01（例如，疟疾疫苗RTS, S或Mosquirix；带状疱疹疫苗HZ/su或Shingrix）、AS03（大流行前H5N1疫苗和大流行H1N1流感疫苗）和AS04（HPV疫苗Cervarix；HBV疫苗Fendrix）已在商业疫苗中使用。结合皂苷-脂质体佐剂系统（AS01）使用MPL作为TLR4激动剂，并包含皂苷QS-21。这个系统增强了CD8+细胞介导的免疫和细胞反应。在这里，MPL直接促进表达TLR4的抗原呈递细胞，激活细胞因子和共刺激分子的分泌。QS-21刺激抗原特异性抗体反应和细胞毒性T细胞免疫反应。AS01需要实现最高的抗原特异性适应性反应。QS-21直接激活抗体免疫反应，通过添加MPL显著增强。AS02佐剂结合了水包油乳液与MPL和QS-21，并已显示出提供主导的细胞反应。QS-21和MPL之间的这种协同作用产生了高水平的IFN-γ，这是CD4型细胞反应的典型细胞因子，其中水包油乳液刺激了体液和细胞免疫反应。AS01和AS02佐剂最初是针对疟疾和带状疱疹的带状疱疹疫苗开发的，它们进入了临床试验（表2）。AS03佐剂系统由基于角鲨烷的水包油乳液组成，添加了DL-α-生育酚（抗氧化剂）和Tween 80（聚山梨醇酯80，作为表面活性剂）（图11）。AS03具有与MF59类似的机制，刺激Th1/Th2细胞，导致体液和细胞免疫反应。此外，AS03还产生趋化因子和促炎细胞因子，这允许免疫细胞（例如，巨噬细胞）的招募，改善抗体的分泌。 图11. (a) 佐剂系统AS03的组成部分（由角鲨烯、聚山梨醇酯80和α-生育酚[一种维生素E]组成）。(b) 作为TLR4激动剂的佐剂系统AS04的MPL结构，与铝混合。 AS04（表2）是一种基于铝的佐剂系统，铝与TLR4激动剂单磷酸脂A（MPL）物理混合，MPL是一种用于人类使用的许可佐剂。AS04已用于开发HPV疫苗，Cervarix(R)。 这种佐剂系统保留了铝的核心佐剂特性，同时也促进了与TLR4激动剂相关的Th1免疫反应，从而产生了更有效的佐剂。MPL（在AS04佐剂中）保持了其结合TLR4的能力，并刺激先天免疫反应，在注射部位激活NF-κB并分泌各种细胞因子和趋化因子。促炎趋化因子和细胞因子促进招募的免疫细胞（例如，单核细胞、巨噬细胞）分泌，形成成熟的抗原呈递细胞，这些细胞迁移到淋巴结激活Th1和Th2免疫反应。AS04克服了仅刺激Th2免疫反应的铝盐的局限性，以及铝盐既不增强也不抑制的促炎细胞因子的数量。最后，与铝结合使用时，MPL在注射部位刺激的局部细胞因子反应显著延长。组合佐剂系统的临床前和临床开发 在P. falciparum与其人类宿主长期共同进化的过程中，P. falciparum已经发展出多种逃避人类免疫反应影响的方法，这使得疟疾疫苗的开发变得更加困难。其中最大的挑战之一是寄生虫表面多态蛋白表达。FMP2.1/AS02A疫苗候选物包含来自顶端膜抗原1（AMA1）的保守P. falciparum多态蛋白，与AS02佐剂共同给药。2018年在马里完成的FMP2.1/AS02A疫苗的2期临床研究涉及400名1至6岁的儿童，这些儿童被认为比成年对照组有更高的疟疾感染风险（NCT00460525）。作为对照，使用了一种不表达针对P. falciparum的特定抗体的狂犬病疫苗。结果显示，接种FMP2.1/AS02A的儿童诱导了CD4+ T细胞反应。AS02佐剂可能影响了AMA1特异性CD4+ T细胞反应的表型，因为诱导了T细胞反应倾向于Th1（或Th2）反应。佐剂疫苗足以预防大多数类型的P. falciparum感染。 沃尔特里德陆军研究所（WRAIR）和GSK在1987年开发了RTS, S疟疾疫苗。RTS, S疫苗中的“R”代表由N-乙酰神经氨酸-9-磷酸（NANP）氨基酸串联重复四肽组成的中心重复区域。“T”代表T淋巴细胞的免疫优势分离表位，“S”是乙型肝炎的表面抗原。这种RTS, S疟疾疫苗含有环孢子蛋白和佐剂系统（AS01和AS02），并在儿童和婴儿中进行了临床评估。AS02佐剂系统包含含有MPL的水包油乳液和QS-21。与AS03（水包油乳液）和AS04（铝和MPL的组合）佐剂相比，带有AS02的重组蛋白疟疾抗原诱导了更高的抗体水平和针对疟疾的保护性免疫反应。尽管临床结果如此，RTS, S/AS02, AS01（Mosquirix™）作为一种新的组合佐剂系统，由于诱导了抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞反应和强大的体液免疫，被纳入疟疾疫苗。 2009年，Polhemus等人对高疟疾传播区的成人进行了RTS, S/AS02A和RTS, S/AS01B的2期临床试验，显著说明了RTS, S/AS01B与RST, S/AS02A相比具有更强的免疫原性（NCT 00197054）。因此，RTS, S/AS02的开发被停止，RTS, S/AS01组合佐剂系统被推进到非洲的3期临床试验（NCT00866619）。在这里，RTS, S/AS01疟疾疫苗在婴儿（5至7个月大）注射后大约12个月内将疟疾发病率和严重疟疾减少了约一半，而疟疾死亡率在接种后并没有显著降低。RTS, S/AS01与疟原虫亚单位抗原结合使用，被证明可以分泌抗原特异性免疫球蛋白和CD4+细胞，刺激细胞介导和抗体免疫反应，有效阻断孢子体在肝细胞的定植，保护免受新的P. falciparum感染。然而，这种RTS, S/AS01疟疾疫苗的3期临床试验没有提供足够的保护，由于时间的推移。此外，在年轻测试组中出现了潜在的安全性风险，这意味着需要进一步优化RTS, S/AS01疟疾疫苗，专注于延长免疫原性和消除儿童中的安全问题。 GSK Biologicals的许可HPV疫苗（GSK 580299）在完成1、2和3期临床研究后被证明是安全的、具有免疫原性和有效性的。该疫苗由HPV-16和HPV-18 L1蛋白VLP与AS04佐剂系统（吸附在氢氧化铝盐上的MPL）组成。然而，为了确认疫苗在HIV阳性女性中的有效性（因为这一人群感染HPV的风险更高），在2019年完成了一项4期临床试验（NCT01031069）。在这项试验中，AS04-HPV-16/18疫苗与许可的4vHPV疫苗在546名志愿者中进行了比较，其中一半是HIV阳性女性。来自这项试验的数据表明，AS04-HPV-16/18疫苗比4vHPV疫苗诱导了更高的免疫原性。这个积极的结果也证实了佐剂的重要作用，并提供了一种有效的方法，即使用佐剂结合目标抗原以提高免疫原性。 AS03佐剂与SARS-CoV-2的可溶性灌注稳定化刺突三聚体（preS dTM）结合，作为一种新的COVID-19疫苗候选物，作为两剂给非人灵长类动物接种。这项临床前评估的结果显示，AS03佐剂疫苗引起了强烈的抗体免疫反应，并保护上下呼吸道免受COVID感染。此外，大量分泌的IgG抗体提供了针对SARS-CoV-2感染的保护。此外，与AS03佐剂结合的SARS-CoV-2重组蛋白纳米颗粒疫苗（GBP510）被肌肉注射到328名15至85岁的参与者中。这项1/2期临床试验（NCT04750343）证明，疫苗接种是安全的，耐受性良好，副作用最小。与未佐剂疫苗相比，AS03佐剂疫苗在两次疫苗接种后产生了更高的IgG滴度，并增强了更强的Th2免疫反应和疫苗后保护反应。 为了比较MF59®和AS03的佐剂潜力，进行了一项研究。该研究考虑了pdm09疫苗（针对H1N1），在临床试验中测试了这两种佐剂（NCT00616928）。这项研究在成人和儿童中进行，分为对照组（无佐剂的pdm09疫苗）和测试组（含佐剂的pdm09疫苗）。使用随机对照测试的间接比较meta分析，比较了不同年龄组（包括成人和儿童）中MF59®佐剂、AS03佐剂和未佐剂pdm09疫苗的免疫原性和安全性。在安全性方面，与未佐剂的受试者相比，两种佐剂都增加了注射部位红斑和疼痛的风险。与MF59®相比，AS03在成人测试组中也有更多的疲劳和注射部位疼痛。在儿童中没有记录到安全性的显著差异。佐剂组显示出比各自的对照组更高的免疫反应，AS03证明是有利的。然而，在某些情况下，MF59®在产生免疫学反应方面似乎更有效。因此，AS03是H1N1流感疫苗开发中的有效佐剂。 佐剂系统（AS0x）旨在针对特定年龄群体（例如儿童、老年人和免疫受损人群）诱导对病原体的适应性免疫。AS03和AS04已获得美国和欧洲药品机构的批准，广泛应用于大流行流感疫苗和预防HPV或乙型肝炎病毒的预防性疫苗。AS02佐剂疫苗已在疟疾、乙型肝炎或与癌症免疫治疗联合应用中进行了测试。11.展望和结论 作为有效的免疫刺激剂，佐剂显著改变了疫苗抗原的安全性和有效性。因此，佐剂的开发是疫苗开发中的一个重要变量，在选择佐剂时应全面了解免疫系统和抗原触发的反应。为了充分理解佐剂的容量和定义刺激的免疫反应，对佐剂机制的研究是必不可少的。包括铝、MF59、AS03或AS04在内的传统佐剂，是商业化佐剂，它们在疫苗开发中有广泛的应用。 另一方面，诸如病毒样颗粒、病毒体、脂质体和聚合物纳米粒子等佐剂递送系统，有潜力作为强效的免疫佐剂。这些系统控制抗原释放到特定部位，保护抗原生物活性，并增强抗原循环时间，刺激强效和保护性的适应性免疫反应。然而，这些递送系统的稳定性和毒性以及疫苗的最佳剂量问题是需要克服的重大缺点，通过使用针对性的功能团进行定制工程来克服。 细胞因子、趋化因子、多糖和糖鞘脂已知能诱导体液免疫反应，以及针对感染的细胞免疫反应，同时在抗肿瘤疫苗中也被广泛使用，通过几项临床研究观察到其诱导强效细胞免疫。 佐剂衍生物的发现改进了佐剂选择，可能出现高质量的佐剂。例如，QS-21的新合成工艺是QS-21衍生物的杰出发现；增加具有增强佐剂特性和减少副作用的QS-21衍生物数量是传染病疫苗佐剂设计的重要步骤。此外，从致病细菌中选择和灭活的微生物或细菌佐剂（例如，鞭毛蛋白、脂多糖、霍乱毒素和卡介苗）刺激适应性免疫反应，可能带来意外的副作用。尽管单独使用佐剂可以刺激强烈的适应性免疫反应，但将两种以上的佐剂结合使用，作为一种组合系统，有增加潜力提高疫苗的免疫原性，限制副作用并优化剂量要求，具有成本效益和简单的配方优势。 随着亚单位和合成疫苗使用的增加，对高属性佐剂的需求也在增加。来自不同策略的佐剂突破为佐剂的发展提供了强有力的支持，这些领域内的进步将逐渐允许人们对佐剂有更全面的理解，从而产生更安全、更有效的疫苗。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

摘要：由结核分枝杆菌（MTB）引起的结核病（TB）是一种普遍的全球性传染病，也是全球主要的死亡原因之一。目前，唯一可用的预防结核病的疫苗是卡介苗（BCG）。然而，BCG在成人中的效力有限。近一个世纪以来，开发有效的结核病疫苗的努力一直在进行中。在这篇综述中，我们审视了结核病疫苗研究中目前存在的障碍，并强调了理解MTB与宿主之间相互作用机制的重要性，以便为研究提供新的途径，为新型疫苗的开发奠定坚实的基础。我们还评估了各种结核病疫苗候选物，包括灭活疫苗、减毒活疫苗、亚单位疫苗、病毒载体疫苗、DNA疫苗，以及新兴的mRNA疫苗和基于病毒样颗粒（VLP）的疫苗，这些疫苗目前处于临床前阶段或临床试验中。此外，我们还讨论了开发不同类型的结核病疫苗所面临的挑战和机遇，并概述了结核病疫苗研究的未来方向，旨在加快有效疫苗的开发。这篇全面的综述提供了新型结核病疫苗领域所取得进展的总结。 1.引言 结核病（TB）是一种古老且在全球广泛分布的疾病，是细菌感染导致的死亡的主要原因。在17-18世纪的欧洲，结核病被称为“白色瘟疫”，几乎有100%的欧洲人感染，其中25%死于这种疾病。1882年，德国微生物学家罗伯特·科赫（Robert Koch）破译了结核分枝杆菌（MTB）作为导致TB的病因，从而开启了结核病预防、诊断和治疗的新篇章。随着抗结核药物的不断发展以及卫生和生活条件的改善，结核病的发病率和死亡率显著下降。然而，自20世纪90年代以来，由于耐药MTB菌株的出现、免疫抑制剂的使用、药物成瘾、贫困和人口流动等因素，全球结核病疫情恶化。结核病已成为最主要的重新出现的传染病和严重的全球健康问题，尤其是在发展中国家。 尽管抗结核药物有效，但根除结核病仍面临许多挑战。2022年10月27日，世界卫生组织（WHO）全球结核病报告显示，全球约有四分之一的人口感染了MTB。2021年，全球估算的新发结核病例数为1060万，比2020年增加了4.5%，结核病死亡人数为160万，比2020年增加了6.7%。中国是结核病负担较重的国家之一，估算的结核病例数仅次于印度和印度尼西亚，占全球结核病发病率的7.4%。2015年，WHO推出了“终结结核病战略”，这是一个雄心勃勃的全面计划，为2020-2035年期间设定了宏伟目标。这些目标包括到2035年将结核病发病率比2015年显著降低90%，结核病相关死亡率显著降低95%。 疫苗接种是预防和管理结核病最经济有效的方法，是实现WHO 2035年全球终结结核病战略的关键途径。在这方面最成功的措施之一是卡介苗（BCG）疫苗，自其诞生以来已在全球广泛使用140年。尽管BCG对婴儿和幼儿的重症结核病（如播散性结核病和脑膜炎型结核病）提供了显著的保护，但其对成人肺结核（PTB）的保护作用有限，效果不一，对MTB引起的原发性或潜伏性结核病感染无有效保护。目前，全球约有四分之一的人口存在潜伏性结核病感染（LTBI），无临床症状，约90%的LTBI患者不会发展为结核病。然而，这种潜伏状态是活动性结核病的潜在来源，也是结核病根除的主要障碍。因此，迫切需要开发更有效的结核病疫苗，以预防和控制由MTB引起的潜伏性和活动性感染。 随着免疫学和分子生物学的快速发展，一些新疫苗已进入临床试验阶段，并显示出一定的安全性和保护效果。然而，设计理想的结核病疫苗仍面临许多挑战，如MTB的致病机制不明确、筛选特定抗原的困难、缺乏理想的佐剂以及动物模型的限制。本文综述了MTB-宿主相互作用的免疫机制和当前新结核病疫苗研究的临床试验现状。还讨论了结核病疫苗研究面临的挑战和未来发展的方向，为未来结核病疫苗的发展提供新视角。 2.对MTB的感染和免疫 MTB的主要传播途径是通过空气飞沫，通过呼吸进入人体，并开始感染肺泡巨噬细胞。以前的研究表明，大约5%的感染个体可以完全清除体内的MTB，大约5-10%的个体会发展为活动性结核病，近90%的感染个体保持在LTBI状态。这表明，在MTB感染后，只有一小部分个体的免疫系统能够有效识别、监测和清除MTB，而绝大多数个体处于LTBI状态。因此，MTB与其宿主之间的相互作用极其复杂，结核病的发生、发展和结局不仅与MTB的毒力有关，而且与结核病患者的免疫力密切相关。遗传差异导致结核病患者的某些免疫缺陷或异常，影响身体抵抗MTB感染的能力。MTB感染后，会诱导一系列免疫反应，主要包括先天免疫（也称为非特异性免疫）和适应性免疫（也称为特异性免疫）（图1）。在本文中，我们将重点关注MTB诱导的先天和适应性免疫反应，并为新结核病疫苗研究提供新的见解。 图1. 由MTB诱导的先天和适应性免疫反应。MTB通过呼吸道进入肺泡后，首先被肺泡巨噬细胞、未成熟的树突状细胞（iDCs）和自然杀伤（NK）细胞等驻留免疫细胞识别。iDCs捕获MTB后，从感染部位迁移到淋巴结，细菌诱导它们分化为表达增强抗原呈递和MHC能力的成熟树突状细胞（mDCs）。在CD28-CD80和CD40-CD40L的协助下，树突状细胞上的MHC I和MHC II分子识别并激活CD4+和CD8+ T淋巴细胞。CD4+ T淋巴细胞根据微环境中的细胞因子分化为Th1、Th2或Th17亚群，有助于控制MTB感染。Th1和Th2免疫相互制衡并维持免疫稳态。CD8+ T淋巴细胞进一步分化为产生颗粒酶、穿孔素、Fas-FasL、干扰素-γ（IFN-γ）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等分子的细胞毒性T淋巴细胞（CTLs），以激活巨噬细胞并清除细菌。根据先天和适应性免疫反应之间的相互作用以及MTB的毒力，感染可能导致恢复、潜伏性结核病感染（LTBI）或活动性结核病（ATB）。 2.1. MTB诱导的先天免疫反应 先天免疫反应在针对MTB的非特异性防御中起着至关重要的作用，它负责启动针对MTB的特异性适应性免疫反应。因此，先天免疫是MTB的第一道防线，至关重要。先天免疫系统是进化形成的，负责先天免疫的防御功能，包括屏障、细胞和分子成分。为了抵抗MTB入侵，宿主的先天免疫系统依赖于粘膜屏障等组织屏障、物理和化学屏障。同时，包括巨噬细胞、中性粒细胞、自然杀伤（NK）细胞、树突状细胞（DCs）、自然杀伤T（NKT）细胞和γδT细胞在内的各种先天免疫系统组分，有助于产生免疫反应以对抗结核病感染。此外，宿主通过细胞因子如干扰素-γ（IFN-γ）、白介素-12（IL-12）、白介素-1β（IL-1β）、MIP-1α/CCL3、趋化因子、补体分子、抗菌肽、溶菌酶和β防御素等免疫分子，发挥其抗结核免疫反应和免疫调节功能。 巨噬细胞通过其强大的吞噬和杀菌能力，在针对MTB的保护性免疫反应中发挥关键作用。巨噬细胞具有通过特定的模式识别受体（PRRs），如C型凝集素受体（CLRs）、Toll样受体（TLRs）、视黄酸诱导基因I（RIG-I）样螺旋酶受体（RLRs）和核苷酸结合寡聚化结构域（NOD）样受体（NLRs），检测MTB展示的病原体相关分子模式（PAMPs）的能力。随后，在识别MTB后，巨噬细胞采用包括自噬、吞噬作用、凋亡、产生活性氧（ROS）和炎症体激活等一系列机制，从系统中清除MTB。PAMPs与PRRs之间的相互作用诱导巨噬细胞表达各种炎症细胞因子，包括干扰素-γ（IFN-γ）、白介素-12（IL-12）、IL-1β和巨噬细胞炎症蛋白-1α（MIP-1α/CCL3）。这些细胞因子招募中性粒细胞、T淋巴细胞和单核细胞至感染部位，围绕感染细胞形成肉芽肿以限制细菌传播。 从结构上看，肉芽肿是围绕感染部位的巨噬细胞和其他免疫细胞（包括中性粒细胞、树突状细胞（DCs）和自然杀伤（NK）细胞）紧密组织的聚集体。DCs在抗结核感染中发挥关键作用，因为它们是最有效的抗原呈递细胞（APCs）。DCs不仅向初始T细胞呈递结核病抗原，还连接先天免疫和适应性免疫。根据DC细胞的发育阶段，它们可以分为未成熟DCs（iDCs）和成熟DCs（mDCs）。iDCs没有分泌细胞因子的能力，但它们具有很强的抗原摄取能力。在抗原摄取后，它们逐渐迁移到淋巴结，并向效应T细胞呈递抗原，从而启动适应性免疫反应。mDCs具有产生细胞因子和刺激T细胞分化的能力，从而激活T细胞介导的适应性免疫反应。 此外，自然杀伤（NK）细胞和中性粒细胞也通过产生非特异性细胞因子和趋化因子参与了对结核分枝杆菌感染的早期先天免疫反应。在机体感染MTB后，NK细胞可以迅速响应。NK细胞不受MHC和抗体的限制，能够通过产生含有穿孔素、颗粒素和颗粒酶的细胞毒性颗粒，直接杀死细胞内外的MTB。NK细胞可以通过分泌如干扰素-γ（IFN-γ）等细胞因子，介导CD8+ T效应细胞的反应。IFN-γ是NK细胞分泌的主要细胞因子，可以通过促进单核细胞和巨噬细胞中MHC类分子的表达，增强抗原呈递细胞（APCs）的抗原呈递能力，从而在MTB被识别后的肉芽肿阶段参与控制MTB感染。MTB被识别后，中性粒细胞迅速到达感染部位，然后激活并分泌大量趋化因子，包括白介素（ILs）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）、干扰素诱导的T细胞α趋化因子（I-TAC）、巨噬细胞炎症蛋白-1α（MIP-1α）、单核细胞趋化蛋白（MCP）、干扰素-γ诱导蛋白-10（IP-10/CXCL10）和干扰素-γ诱导的单核因子（MIG, CXCL9）。这些趋化因子可以有选择地招募免疫细胞，包括Th1 T细胞、Th17 T细胞、中性粒细胞、树突状细胞（DCs）和NK细胞到感染部位。此外，中性粒细胞分泌的趋化因子可以进一步增强类似细胞的招募。 2.2.MTB诱导的适应性免疫反应 在MTB抗原的刺激下，抗原特异性T/B淋巴细胞经历自我激活、增殖和分化成效应细胞，产生一系列生物学杀菌效应。根据参与免疫反应的细胞类型和机制的不同，适应性免疫反应可分为两种类型：B细胞介导的体液免疫反应和T细胞介导的细胞免疫反应。 2.2.1. CD4+ T细胞及其分化和平衡 CD4+ T细胞在宿主对MTB感染的反应中至关重要。最初，原始的CD4+ T淋巴细胞（Th0细胞）缺乏效应T细胞功能，仅产生少量的IL-2，同时无法产生干扰素（IFN-γ）、IL-4或IL-5。树突状细胞（DC细胞）摄取MTB抗原，主要通过MHC II呈递给Th0细胞。在不同细胞因子的调节下，激活的Th0细胞分化成不同类型的辅助T细胞，包括Th1、Th2、Th17、调节性T细胞（Treg细胞）等（图2）。DC细胞分泌的IL-12和IFN-γ能够诱导Th0细胞分化为Th1细胞，而在IL-2和IL-4的微环境中，Th0细胞分化为Th2细胞。Th1和Th2细胞都是效应T淋巴细胞，在宿主抵抗MTB感染中发挥重要作用。在MTB感染期间，Th1细胞主要释放关键效应分子，如IFN-γ、IL-2和TNF-α，这些分子在激活巨噬细胞系统以有效控制和消除MTB中发挥至关重要的作用。这些机制涉及自噬、活性氧和氮中间体的使用、抗菌肽、启动下游抗菌途径和溶酶体酶来对抗感染。尽管Th1在细胞内病原体感染中起主要作用，但Th2在抗击MTB感染中的作用也很重要。Th2细胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-10等细胞因子，协助B细胞的激活和增殖，并参与体液免疫的调节。Th1和Th2细胞通过它们分泌的细胞因子相互调节，它们处于动态平衡状态，在维持免疫反应的平衡中发挥重要作用（图2）。Th1和Th2细胞之间的不平衡也被认为是结核病的一个重要原因。结核病不是由于缺乏有效的Th1反应，而是由于Th2反应的过度转移，Th2细胞因子抑制了Th1细胞因子的作用。 图2. MTB感染中CD4+ T细胞亚群的相互作用和平衡。抗原呈递细胞（APCs），如巨噬细胞，通过MHC II分子将MTB抗原肽呈递给初始T细胞（Th0细胞），诱导T细胞根据细胞因子微环境分化成不同亚型。在巨噬细胞分泌的IL-12和IFN-γ的刺激下，Th0细胞激活STAT4和T-bet，分化成Th1亚型，并释放如IFN-γ和TNF-α等细胞因子来对抗MTB感染。同样，巨噬细胞也可以通过分泌不同的细胞因子，包括IL-2和IL-4、IL-6、IL-23和TGF-β，以及IL-10和TGF-β，促进Th0细胞分化成Th2、Th17和Treg亚型。Th1、Th2、Th17和Treg亚型之间的相互作用是复杂和平衡的，它们协同工作，发挥免疫反应并维持宿主对MTB感染的防御。 同样，在IL-6、IL-21、IL-23和TGF-β等细胞因子的作用下，Th0细胞可以分化成Th17细胞。Th17细胞是最近在人体中发现的一种新的CD4+效应T细胞亚群。这些细胞表现出分泌各种效应细胞因子的能力，包括IL-17、IL-17F、IL-21和IL-22。通过产生这些细胞因子，Th17细胞促进中性粒细胞和IFN-γ阳性CD4+ T细胞招募到感染部位，随后在抗击MTB感染中发挥关键作用。有趣的是，Th17细胞的招募功能并非始终持续。如果其活性过强，Th1和Th2细胞通过分泌如IFN-γ和IL-4等细胞因子，抵消Th17细胞的效应，从而维持免疫反应的动态平衡（图2）。 Th0细胞可以响应IL-10和TGF-β分化成Treg细胞，除了分化成Th1、Th2和Th17细胞外。无论是体外还是体内，Treg细胞都表现出免疫抑制功能，其特征是高度表达Foxp3、CD45RO、CTLA-4、CCR4、mTGF-β、GITR和CD62L，以及低表达CD45RA和CD127（IL-7R），以及在激活时呈现记忆样表型。以前的研究表明，老年结核病患者中Treg细胞频率更高，IFN-γ阳性T细胞频率更低，Treg细胞的扩张与MTB负荷密切相关。人类队列研究报告了健康个体中Treg细胞的频率最低，其次是LTBI患者，ATB患者中的频率最高。CD4+CD25highFoxP3+细胞的增加与LTBI和TB队列中观察到的Th1反应损伤和体外微生物杀伤活性降低有关。 有趣的是，Treg和Th17细胞也具有相互抑制和平衡的关系。TGF-β可以在Th0细胞中诱导Foxp3或RORγT的表达，IL-6的表达在决定Th0细胞是否向Treg或Th17细胞分化方面起着关键作用（图2）。在IL-6存在的情况下，平衡倾向于Th17分化，而在其缺失的情况下，Treg细胞的分化占主导。FoxP3抑制RORγT的功能，先前的研究发现CD4+CD25+Foxp3+CD39+ Treg细胞在抑制致病性Th17细胞中发挥作用。此外，最近的研究表明，Treg细胞可以通过表达共抑制分子T细胞Ig和ITIM域（TIGIT）来抑制促炎性Th1和Th17细胞。 2.2.2. CD8+ T细胞和B细胞 尽管CD4+ T细胞在控制MTB感染中的关键作用已经确立，但CD8+ T细胞和B细胞的作用也越来越被认识到。在吞噬MTB后，树突状细胞通过MHC I类分子向CD8+ T细胞呈递抗原，激活它们成为细胞毒性T淋巴细胞（CTLs）。CTLs可以通过释放穿孔素和颗粒素裂解失去免疫活性的巨噬细胞。因此，MTB失去了保护，并可以被激活的巨噬细胞和NK细胞清除。此外，激活的CTLs可以分泌如IFN-γ等细胞因子，刺激单核细胞和巨噬细胞产生活性氧（ROS）和活性氮中间体（RNIs），引起直接的细胞毒性。 T淋巴细胞在介导适应性免疫以清除MTB中发挥关键作用。然而，最近的研究表明，体液免疫在预防MTB感染中的重要性也得到了揭示。可以肯定的是，体液免疫在获得性免疫反应中起着重要作用。它涉及产生针对入侵病原体或疫苗抗原的抗原特异性抗体。在结核病的情况下，研究表明B细胞和体液免疫确实可以调节免疫反应。这表明B细胞和抗体的产生可能在免疫防御结核病感染中发挥作用。激活的B细胞可以通过产生IL-10来调节炎症反应，并通过产生IL-12、IFN-γ和TNF-α来刺激Th1反应。此外，B细胞可以通过产生抗体介导细胞毒性。 3.结核病疫苗的临床管线  对MTB的遗传系统、蛋白质组学和免疫机制的科学理解的进步，加速了更安全、更有效的新型结核病疫苗的开发。结核病的理想疫苗策略应包括三个组成部分：预防暴露后的原发性感染和疾病，预防潜伏感染的重新激活，以及作为标准结核病治疗的免疫治疗辅助以促进患者恢复。目前正在进行临床试验的新结核病疫苗包括灭活疫苗、减毒活疫苗、重组BCG疫苗、亚单位疫苗、病毒载体疫苗和DNA疫苗。灭活疫苗主要用于结核病治疗；减毒活疫苗针对新生儿的初次免疫或预防青少年和成人的结核病；亚单位疫苗主要用于MTB的暴露前后预防；而病毒载体疫苗旨在增强BCG的免疫效果。本综述提供了目前正在临床管线中开发的19种候选结核病疫苗的发展进展和面临的障碍的概述（图3）。 图3. 结核病疫苗临床管线。当前管线提供了正在进行临床开发的疫苗候选物的数据，而临床前开发候选物的信息尚未收集。缩写：RIBSP，生物安全问题研究所；SRII，Smorodintsev流感研究所；NIAID，国家过敏和传染病研究所；NIH，国立卫生研究院；SSI，Statens血清研究所；IAVI，国际艾滋病疫苗倡议；ICMR，印度医学研究理事会；CADILA，Cadila制药有限公司；DHMC，达特茅斯希区柯克医疗中心；SIIPL，印度血清研究所私人有限公司；VPM，疫苗项目管理有限公司；Gates MRI，比尔和梅琳达·盖茨医学研究所；GSK，葛兰素史克。 3.1. 灭活结核病疫苗 灭活疫苗使用整个或片段化、裂解形式的MTB来诱导对多种MTB抗原的免疫反应。灭活疫苗长期以来一直用于结核病的预防和治疗。这些疫苗诱导Th1细胞介导的和体液免疫反应，防御细胞外MTB感染，并已显示出在控制结核病方面的良好免疫治疗效果。灭活疫苗的缺点包括免疫时间短、免疫期短和需要多剂量。然而，灭活疫苗在稳定性、安全性和生产方面具有优势，使它们成为一种快速发展的疫苗类型。目前正在进行临床试验的灭活疫苗包括MIP、RUTI、Vaccae和DAR-901（表1）。 3.1.1. MIP 印度产牛型结核菌（MIP）是一种非致病性、生长迅速的非结核分枝杆菌（NTM）。MIP最初被广泛用作麻风病的免疫调节剂，后来发现它能够预防小鼠和豚鼠的结核病。此外，MIP在结核病复治患者中被证明是安全的，并且可以通过TLR-4信号通路激活NF-KB，诱导感染MTB的巨噬细胞分泌促炎细胞因子和一氧化氮（NO）。在印度坎普尔（Ghatampur）进行的一项临床试验评估了MIP（印度产牛型结核菌）在约28,948名居住在272个村庄的农村人群中的保护效果。结果显示，与安慰剂组相比，接种组的肺结核发病率显著降低。这种降低在接种后10-13年观察到，统计分析显示p值为0.002，卡方值为11.604。此外，据报道，同时接受MIP和DOTS治疗的结核病患者在痰液清除方面恢复更快，与仅接受DOTS治疗的患者相比。这表明在治疗方案中加入MIP增强了DOTS在结核病患者中的治疗效果。由印度科学与技术部和印度Cadila制药有限公司赞助的III期随机、双盲、安慰剂对照、多中心临床试验（NCT00265226）评估了MIP在印度II类结核病患者中的治疗效力和安全性。观察到MIP治疗患者和安慰剂治疗患者在两周后的痰涂片转化率没有显著差异，分别为53.35%和48.72%。然而，在四周治疗后，MIP组（67.1%）的痰培养转化率显著高于安慰剂组（57%），表明MIP具有清除细菌的能力。尽管MIP组的局部反应明显高于安慰剂组，但它们很快自行解决并消失。这些结果表明MIP具有良好的安全性，并且有潜力在结核病患者中清除MTB。 3.1.2. RUTI疫苗 RUTI疫苗是一种设计用来对抗结核病感染的治疗性疫苗。Archivel Farma S.L.（西班牙巴塞罗那）和Parexel（美国加州格兰岱尔）之间的合作努力开发了一种疫苗，该疫苗结合了纯化和脂质体的MTB杆菌细胞片段。这些杆菌在应激条件下培养，以模拟肉芽肿内部的环境，从而诱导产生通常对免疫系统隐藏的潜伏特异性抗原。这种疫苗可以提供对复制和非复制细菌的强大和有效的免疫反应。涉及小鼠、豚鼠、山羊和小型猪的实验模型已经证明了RUTI在短暂化疗后控制LTBI的效力。基于这些令人满意的结果，2007年在健康志愿者中进行了一项随机、双盲、安慰剂对照的I期临床试验（NCT00546273），以评估四个剂量（5微克、25微克、100微克和200微克）的RUTI的安全性和免疫原性。试验确认，不同剂量的RUTI疫苗只会导致志愿者注射部位的抽搐症状，两个人（2/16）经历了无菌性肉芽肿性炎症，可能与RUTI疫苗产品中使用的非活性化合物有关。此外，这项临床试验证明了RUTI疫苗可以在志愿者中诱发特异性的体液和细胞介导的免疫反应。作为评估RUTI疫苗的首次临床试验，这项I期试验的结果为RUTI疫苗的后续临床试验提供了基础。在发布这项I期临床试验结果的同年（2010年），在南非三个地区启动了RUTI疫苗的II期临床试验（NCT01136161），以评估三个RUTI剂量（5微克、25微克和50微克）在HIV阳性（n = 47）和阴性（n = 48）LTBI个体中的安全性、耐受性和免疫原性。2014年，II期临床试验的结果发布，展示了接受RUTI疫苗的个体不良反应的发现。RUTI接受者最常见的不良反应与局部注射部位反应有关。这些包括红斑（91/92）、无菌性脓肿（6/6）、硬化（94/92）、肿胀（74/83）、局部结节（46/25）、局部疼痛（66/75）、溃疡（20/11）、鼻咽炎（20/5）和头痛（17/22）。值得注意的是，这些反应大多数性质温和，并且参与者能够很好地耐受。此外，结果表明，接受5微克或25微克RUTI的HIV阴性患者在第二次接种后显示出良好的免疫反应，并在免疫反应强度上略有增加，而HIV阳性患者在第一次接种25微克或50微克RUTI后显示出类似的多抗原免疫反应轮廓，第二次接种后未观察到免疫反应的显著增加。这些结果表明，RUTI疫苗诱发的免疫反应在HIV阴性和阳性人群中不同，可能由于HIV阳性个体中CD4+ T淋巴细胞受损。 尽管上述两项临床试验的结果已经证明了RUTI疫苗的可接受的耐受性和安全性，以及诱发体液和细胞介导的免疫反应，但需要更多的大规模临床试验来验证疫苗的效力。目前，两项IIb期临床试验（NCT04919239和NCT05455112）正在招募志愿者，以评估RUTI作为结核病化疗辅助的有效性，以及RUTI免疫疗法在结核病患者中的有效性和安全性与标准治疗相比较。此外，从已经发布的临床试验数据来看，接受志愿者的RUTI疫苗剂量与不良事件的频率之间似乎存在相关性。我们认为，在未来的RUTI临床试验中，主要考虑之一将是如何改进疫苗以减少志愿者的不良反应，并确定疫苗的适当剂量范围。 3.1.3. 疫苗用结核菌 疫苗用结核菌（M. vaccae）是一种对人类病原性低的快速生长环境分枝杆菌。它最初由Boenickse R和Juhasz E从牛的乳腺中分离出来。M. vaccae包含许多与免疫调节特性共享的分枝杆菌抗原。这些共享的分枝杆菌抗原可以通过诱导Th-1型免疫反应来帮助宿主防御MTB感染，从而在结核病治疗中发挥作用。 尽管如此，早期研究主要集中在热杀死的M. vaccae在抗结核化疗中的辅助免疫治疗作用上，但结果表现出异质性。1995年，在尼日利亚北部城市卡诺进行的一项临床试验评估了M. vaccae免疫疗法在治疗PTB中的疗效，显示在接受M. vaccae免疫疗法的患者中，与仅接受安慰剂（单独化疗）的患者相比，在抗结核药物治疗3周时的痰液转化率显著更高（73%对19%，p = 0.00001）。这些发现表明M. vaccae免疫疗法在注射后的第一周和第二周有益处。两年后，另一项临床试验显示，M. vaccae免疫疗法显著提高了难治性结核病患者的治疗成功率（77%对52%，p < 0.02）。这些临床试验结果表明，M. vaccae免疫疗法在结核病治疗中具有一定的辅助作用；然而，一些临床试验得出了相反的结论。1999年，《柳叶刀》上发表的一项临床试验评估了M. vaccae在标准短期抗结核化疗中的作用，发现M. vaccae免疫疗法并没有显著减少结核病患者的痰液转化时间，表明M. vaccae免疫疗法在标准抗结核化疗中没有提供任何益处。同样，临床试验评估了在标准抗结核化疗中加入单剂量SRL172（杀死的M. vaccae）免疫疗法对HIV感染结核病患者（n = 760）死亡率的影响，结果显示单剂量SRL172疗法安全且耐受良好，但作为标准抗结核治疗的辅助免疫疗法，并没有显著影响成人PTB患者的存活率或微生物学结果。为了解决上述临床试验结果的异质性问题，陈怡黄等人在2017年进行了一项荟萃分析，包括了13项临床试验的数据。这项研究的结果显示，与安慰剂组相比，接受M. vaccae免疫疗法的TB患者在1-2个月和6个月时痰涂片阴性率显著更高。此外，在这些ATB患者中，在1或2个月时更有可能观察到痰培养阴性的结果。这些来自荟萃分析的发现表明，M. vaccae免疫疗法有望成为PTB的有效治疗。 上述临床试验表明，热杀死的M. vaccae制剂有潜力作为抗结核化疗的辅助治疗手段，最近的临床试验也验证了M. vaccae疫苗预防结核病的能力。在芬兰和赞比亚对HIV感染成人进行的I期和II期临床试验中，之前接种过卡介苗的受试者显示，全灭活M. vaccae具有良好的安全性和免疫原性，并发现M. vaccae可以预防HIV阳性人群中的结核病。此外，在坦桑尼亚进行的一项双盲、安慰剂对照的III期临床试验中，显示M. vaccae作为预防疫苗使用时，既安全又耐受良好。此外，该疫苗对结核病感染具有显著的保护效果。这些发现突出了M. vaccae作为预防结核病措施的潜力。 令人兴奋的是，中国北京的国家食品药品监督管理总局与中国人民解放军总医院第八医学中心合作，改进了Mycobacterium vaccae，并将其命名为VaccaeTM。VaccaeTM最初由安徽智飞龙科马生物制药有限公司生产（现由安徽智飞生物制品有限公司，中国合肥提供），以其增强免疫力、刺激吞噬作用、双向调节免疫反应和最小化病理损害的能力而闻名。在中国广西进行了一项III期临床试验（NCT01979900），包括10000名15-65岁的结核菌素皮肤试验（TST）阳性患者，TST结果大于15毫米，以评估VaccaeTM预防LTBI患者结核病的效力和安全性，其结果尚未公布。VaccaeTM已获得中国食品药品监督管理局（CFDA）批准（批准号：S20010003）作为结核病辅助治疗。此外，VaccaeTM是世界卫生组织推荐的唯一用于结核病免疫治疗的疫苗。VaccaeTM疫苗在接种后也在极少数人中引起局部皮疹、硬化或发热等问题。 3.1.4.DAR-901 DAR-901是一种源自M. vaccae的灭活全细胞疫苗，代表了SRL172的一种新颖且可扩展的制造工艺。DAR-901在临床前研究中作为卡介苗增强剂显示出效力，有效预防结核病，因此是进一步临床开发的有希望的候选疫苗。DAR-901疫苗已知能诱导Th1免疫反应，并加快和加强针对结构和生长相关抗原的特异性免疫，从而减少MTB负担并缓解肺部病理损害。在美国进行的一项I期临床试验（NCT02063555）中，评估了该疫苗在不同剂量（0.1毫克、0.3毫克和1毫克）下对之前接种过卡介苗的成人，无论是否感染HIV的安全性、耐受性和免疫原性。试验表明，疫苗在所有三个剂量水平上都耐受良好，诱导了针对MTB抗原的细胞和体液免疫反应，并且没有严重的不良事件。在坦桑尼亚进行的另一项II期临床试验（NCT02712424）中，评估了该疫苗在减少之前接种过卡介苗的青少年结核病感染风险方面的效力。结果表明，1毫克DAR-901的三剂系列被认为是安全且耐受良好的。然而，它在预防初始或持续性IGRA转化方面并未表现出效力。有趣的是，转化为IGRA的DAR-901接受者对ESAT-6的免疫反应增强。因此，由于预防疾病可能需要与抵御感染不同的免疫反应，因此有必要进行DAR-901预防结核病的临床试验。 3.2.减毒结核病疫苗 通过去除MTB中的一些毒力基因来制备具有基因缺陷的减毒结核病疫苗，使其失去致病性，显著表达多种抗原，激活不同类型的T细胞，并增强免疫原性。它可以作为预防疫苗使用，并替代新生儿卡介苗接种。与其他疫苗相比，其优点是能够激活复杂多样的免疫反应，具有更广泛的抗原表位范围，诱导与自然感染类似的免疫反应，从而产生长期保护。然而，减毒疫苗也有一些缺点，如潜在的恢复毒力风险和免疫复合物的并发症。MTBVAC和BCG（重新接种）目前是正在进行临床试验的减毒结核病疫苗（表1）。 3.2.1.MTBVAC MTBVAC是一种基于phoP-fadD26基因缺陷减毒MTB菌株的新型结核病活疫苗。PhoP和fadD26基因被敲除，以灭活包括ESAT-6在内的各种毒力因子的表达，并在MTB细胞膜合成中发挥作用。该疫苗主要针对新生儿作为卡介苗接种的替代品，以及青少年和成人以增强免疫力。迄今为止，MTBVAC是第一个进入临床试验的减毒结核病活疫苗，并显示出与卡介苗相当的安全性。2013年，在瑞士对HIV阴性志愿者进行了一项I期双盲、随机、对照、剂量递增试验，以评估MTBVAC与卡介苗的安全性和免疫原性（NCT02013245）。结果显示，在三个剂量组中MTBVAC的安全性与卡介苗相当（第一组接受5 × 103 CFUs MTBVAC，第二组接受5 × 104 CFUs MTBVAC，第三组接受5 × 105 CFUs MTBVAC），并且在接种疫苗后没有触发严重的不良事件。此外，为了评估MTBVAC在结核病流行区的成人和新生儿中的安全性和免疫原性，一项Ib期随机、双盲、剂量递增临床试验在南非高结核病负担地区进行（NCT02729571）。结果显示，两组的不良事件的频率、严重程度和类型相似，并且没有与疫苗相关的严重不良事件。此外，试验观察到Th1型CD4细胞对MTBVAC有剂量依赖性反应，MTBVAC的峰值反应（即在第70天）在2.5 × 105 CFUs剂量组中高于卡介苗疫苗，并且MTBVAC的反应在第360天高于卡介苗。低剂量组（2.5 ×103CFUs）的Th1型CD4细胞对MTBVAC的反应显著低于卡介苗或高剂量MTBVAC在第70天和第360天的反应。上述免疫原性结果表明，高剂量MTBVAC诱导了强烈的免疫反应，在未来的研究报告中，可能考虑省略MTBVAC的低剂量组。 目前，南非正在进行两项MTBVAC的临床试验，即NCT02933281和NCT03536117，研究MTBVAC的不同方面。NCT02933281专注于评估MTBVAC在有无LTBI的成人中的安全性和免疫原性的四剂（5 × 103、5 × 104、5 × 105和5 × 106 CFUs）疫苗接种。另一方面，NCT03536117旨在评估MTBVAC在新生儿中的三剂（2.5 × 104、2.5 × 105和2.5 × 106 CFUs）疫苗接种的安全性和免疫原性。然而，这些试验的结果尚未披露。此外，一项MTBVAC的随机、双盲、对照III期临床试验（NCT04975178）正在撒哈拉以南非洲的结核病流行区进行，以评估其在有无HIV暴露的新生儿中的效力、安全性和免疫原性，目前正在招募参与者。 3.2.2. BCG重新接种（Gates MRI-TBV01-201） 如前所述，卡介苗接种为婴儿提供了益处，但对其他人群则不然。近年来，比尔和梅琳达·盖茨医学研究所（Gates MRI）、Aeras和赛诺菲巴斯德进行了临床试验，重新利用现有的卡介苗在青少年和儿童中。2015年，在南非开普敦进行了一项随机、安慰剂对照、部分盲法Ib期临床试验（NCT02378207），研究健康、未感染HIV和MTB、之前接种过卡介苗的青少年参与者重新接种卡介苗的安全性和免疫原性。该临床试验于2020年发表在EClinicalMedicine上，显示重新接种卡介苗具有可接受的安全性，并诱导了强健的、多功能的BCG特异性CD4+ T细胞。此外，在南非开普敦对健康青少年进行了一项随机、安慰剂对照、部分盲法II期临床试验（NCT02075203），以评估重新接种卡介苗预防MTB感染的效力。结果表明，重新接种卡介苗具有免疫原性，并降低了持续QFT转化的比率，效力为45.4%（p = 0.03）。然而，该研究还发现，尽管重新接种卡介苗没有引起严重的不良事件，但轻度至中度的注射部位反应在重新接种卡介苗中比H4:IC31疫苗更常见。 因此，卡介苗重新接种的安全性已成为日益受到关注的话题。2022年，在npj Vaccines杂志发表的一篇文章调查了卡介苗注射部位脓肿和局部淋巴结病变的发生率及风险因素。结果显示，在1387名接种卡介苗的参与者中，有3%出现了注射部位脓肿，其中大多数（34/41，83%）无需治疗即可自行恢复。此外，接种卡介苗重新接种的参与者中，注射部位脓肿的发生率更高（OR 3.6，95% CI 1.7–7.5）。此外，在1387名接种卡介苗的参与者中，有48人（3%）观察到局部淋巴结病变。有趣的是，在重新接种卡介苗的个体中，这些病变的发生率更高（比值比（OR）2.1，95%置信区间（CI）1.1–3.9）。值得注意的是，初始卡介苗接种和重新接种相关的不良事件的频率和类型在不同地理区域有所不同。为了解决这种变异性并阐明卡介苗重新接种的安全性，进行了一项全面的系统综述。该综述包括了22项研究，包括随机试验（n = 8）、病例系列或报告（n = 6）、病例对照研究（n = 4）和观察性研究（n = 4）。研究结果表明，卡介苗重新接种后轻度局部和全身反应的发生率略有增加；然而，在接种疫苗的免疫能力正常的个体中没有严重不良事件。基于上述临床试验和研究获得的数据，2019年，盖茨MRI进行了一项随机、观察者盲法、安慰剂对照的IIb期研究（NCT04152161），以评估卡介苗重新接种在预防南非健康儿童和青少年持续MTB感染方面的有效性、安全性和免疫原性。该临床试验旨在招募年龄在10至18岁之间的1820名儿童和青少年志愿者。志愿者将被随机分配到两个组，并接受单一剂量的0.1 mL卡介苗SSI或生理盐水，两者都通过上臂三角肌区域皮内注射。这项临床试验的结果尚未公布。 3.3.重组卡介苗疫苗 卡介苗对成人的保护效力差异很大，但其他新疫苗的保护效力仍无法超越现有的卡介苗。因此，对现有卡介苗进行合理的重组和修改是结核病疫苗研究的一个方向。到目前为止，卡介苗的修改研究越来越多地受益于现代分子生物学的研究方法和结果，即通过将外源目标基因插入现有细菌或病毒中，使它们作为载体来构建重组卡介苗（rBCG）疫苗。已经开发了几种类型的rBCG，它们在动物模型和人类中的保护效果和体液及细胞免疫反应已经得到了评估。目前，有三种rBCG已经进入临床试验（VPM1002、rBCG30和AERAS-422），其中rBCG30和AERAS-422由于效力和安全问题已经停止（表1）。 VPM1002是通过用单核细胞增生李斯特菌的listeriolysin O（LLO）编码基因替换脲酶C基因而创建的rBCG疫苗。这种替换导致LLO的分泌，促进抗原和DNA进入宿主细胞的细胞质中。结果，VPM1002显著增强了抗原特异性CD4+ T和CD8+ T细胞的产生。此外，已发现它诱导自噬、激活炎症体并促进细胞凋亡。已经证明VPM1002可以有效诱导Th1和Th17类型的免疫反应。此外，在对小鼠、免疫缺陷小鼠、豚鼠、家兔和非人灵长类动物进行测试时，与卡介苗相比，VPM1002显示出更高的效率和安全性。此外，该疫苗已被用于免疫疗法治疗非肌层浸润性膀胱癌，作为卡介苗的替代品。 在德国进行了一项随机对照剂量递增的I期临床试验，以评估VPM1002在男性人类志愿者中的安全性和免疫原性（NCT00749034）。结果显示，VPM1002诱导了特异性和剂量依赖性的免疫反应，在最高剂量（5 × 105 CFUs）下安全且耐受良好。随后在南非高负担环境中进行了一项II期临床试验（NCT01479972），以评估VPM1002和卡介苗在未接触HIV且未接种卡介苗的新生儿中的安全性和免疫原性。结果表明，VPM1002在新生儿中单剂量后安全、免疫原性和免疫耐受性良好。由VPM1002诱导的CD4+和CD8+ T细胞反应与卡介苗诱导的反应相当。为了进一步评估VPM1002与卡介苗在接触HIV和未接触HIV的新生儿中的安全性和免疫原性，一项双盲、随机、对照的IIb期临床试验（NCT02391415）在南非四个医疗中心的416名新生儿上进行。结果显示，VPM1002在接触HIV和未接触HIV的新生儿中都是安全的。尽管两种疫苗都具有免疫原性，但VPM1002产生的免疫反应低于卡介苗。 上述临床试验的一个限制是样本量小，使得两种疫苗引起的免疫反应的统计比较难以建立。在两项最近的III期临床试验（NCT03152903和NCT04351685）中，尚未招募志愿者，样本量已分别增加到2000和6940名参与者。这些临床试验旨在评估VPM1002在预防已成功治疗结核病的个体中结核病复发的有效性和安全性，以及在预防新生儿结核病感染方面的有效性和安全性。 3.4.亚单位结核病疫苗 亚单位结核病疫苗由从MTB中分离和纯化的免疫活性成分组成，如蛋白质、肽、氨基酸和糖。这些疫苗具有高效、安全和低成本的优势。然而，它们有限的抗原数量导致激活广泛免疫的能力较弱，免疫原性持续时间较短，记忆免疫能力较低。因此，亚单位疫苗需要佐剂来诱导免疫保护或免疫疗法，增强其免疫原性，并确保靶向递送。它们通常用作卡介苗初次接种后的增强疫苗，以增强卡介苗介导的保护或延长保护持续时间。目前正在进行六种亚单位结核病疫苗的临床试验，包括M72/AS01E、GamTBvac、H56: IC31 (AERAS-456)、H4: IC31 (AERAS-404)、ID93+GLA-SE和AEC/BC02，以评估它们对MTB感染或结核病的能力（表1）。 3.4.1.M72/AS01E M72/AS01E是由英国葛兰素史克（GSK）公司开发的亚单位候选结核病疫苗，由免疫原性高的MTB蛋白Mtb39A和Mtb32A以及佐剂AS01E组成。M72/AS01E亚单位疫苗已显示在诱导免疫反应方面的效力，其特征是激活产生γ-干扰素的CD4+ T细胞和抗体产生；然而，其确切的作用机制仍不清楚。为了更好地理解M72/AS01E疫苗的免疫保护机制，必须进行进一步的基础研究。 这种疫苗旨在预防结核病，其在激活T细胞和抗体产生方面的成功使其成为未来结核病预防工作的有希望的候选疫苗。为了评估其安全性、免疫原性和保护效力，已经进行了一些临床试验。在肯尼亚、南非和赞比亚进行了一项随机、双盲、安慰剂对照的II期临床试验（NCT01755598），包括3575名18-50岁的成年人，他们生活在结核病高发国家。该试验旨在评估两剂M72/AS01E与安慰剂相比对预防肺结核的保护效果。结果显示，该疫苗安全有效，疫苗相关的不良反应轻微，成人MTB感染的保护效力为54%。三年的随访表明，M72/AS01E疫苗接种至少提供了三年的免疫保护，以防止潜伏感染发展为活动性结核病病例。然而，在36个月的随访后，最终的保护效力被发现为49.7%（图4）。此外，在结核病流行地区进行了一项双盲、随机、对照的II期临床试验（NCT00950612），以评估M72/AS01E在健康的HIV阴性青少年中的安全性和免疫原性。研究结果表明，M72/AS01E疫苗表现出可接受的临床安全性和反应原性概况。此外，这种疫苗接种方法引发了强大且持久的CD4+和CD8+ T细胞反应，以及NK细胞中CD4+ T细胞依赖的干扰素-γ（IFN-γ）反应。这些效应在MTB感染的个体和居住在结核病流行地区的未感染健康青少年中都有观察到。这些试验表明M72/AS01E在青少年和成人中具有良好的安全性和免疫原性。目前，南非正在进行一项随机、安慰剂对照的III期临床试验（NCT04556981），以评估M72/AS01E在正在接受病毒抑制和抗逆转录病毒治疗的HIV阳性受试者中的安全性和免疫原性。 图4. M72/AS01E亚单位疫苗对无HIV感染个体中确诊的肺结核病例的效力。该分析在效力队列中使用了协议中规定的未调整的Cox回归模型。本图所使用的数据来源于之前的研究。版权所有 © 2019 马萨诸塞州医学会。 3.4.2. GamTBvac GamTBvac是一种结核病亚单位候选疫苗，由改性的葡聚糖结合域的Ag85a和MTB的ESAT6-CFP10抗原组成，以及CpG寡核苷酸佐剂和葡聚糖。Ag85a是MTB分泌的乙酰转移酶85复合体的蛋白质组分，ESAT6-CFP10是两种MTB蛋白质的融合。这两种抗原都与来自肠膜明串珠菌的葡聚糖结合域（DBD）融合，使它们能够与葡聚糖结合。DBD融合通过促进它们被APCs摄取和呈递，提高了抗原的稳定性和免疫原性。CpG寡核苷酸是免疫刺激剂，激活Toll样受体9（TLR9）信号，这是先天免疫反应的关键组成部分。这些寡核苷酸固定在DEAE-葡聚糖核心上，由修饰过的500 kDa DEAE-葡聚糖组成，附有二乙基氨基乙基多阳离子，以增强抗原递送并促进TLR9信号。这些佐剂的加入增强了对抗原的免疫反应，从而提高了疫苗的效力。GamTBvac疫苗的免疫原性和保护效力在小鼠和豚鼠结核病模型中使用GamTBvac-prime/boost和BCG-prime/GamTBvac-boost方案进行了评估。结果显示，GamTBvac疫苗表现出强大的免疫原性，并在两种模型中对MTB H37Rv菌株的气溶胶和静脉挑战都展示了极佳的保护。2017年进行了一项I期临床试验（NCT03255278），以评估GamTBvac疫苗的安全性和免疫原性。这项研究包括之前接种过卡介苗的健康志愿者，采用五组的比较安慰剂对照设计，包括两组安全性评估（安全性和便携式研究组；安慰剂安全性研究组）和三个免疫原性评估组，剂量逐渐增加（0.25剂量组、0.5剂量组和1剂量组）。两年后的结果表明，该疫苗候选物具有可接受的安全性概况，0.5剂量疫苗组（含有12.5微克DBD-Ag85a、12.5微克DBD-ESAT6-CFP10、75微克CpG（ODN 2216）、250微克DEAE-葡聚糖500 kDa和5毫克葡聚糖500 kDa）展示了最高的免疫原性，通过IFN-γ体内IGRA反应和IgG ELISA分析显著增加。随后，进行了一项双盲、随机、多中心、安慰剂对照的II期临床试验（NCT03878004），以评估GamTBvac在180名未感染MTB、接种过卡介苗的健康志愿者中的安全性和免疫原性。结果证实了在I期试验中展示的可接受的安全性概况，并表明该疫苗诱导了高水平的抗原特异性IFN-γ、Th1细胞因子和IgG抗体。在前面提到的I期和II期临床试验的有希望的结果基础上，2021年进行了一项III期临床试验（NCT04975737）。这项多中心试验采用了双盲、随机设计，疫苗与安慰剂的比例为1:1。该试验的目的是评估GamTBvac疫苗在预防18-45岁未感染HIV的个体中的肺结核方面的安全性和效力。这项临床试验目前正在招募志愿者，其结果将决定该疫苗是否有潜力用于结核病预防。 3.4.3. H56:IC31 H56:IC31是一种由Valneva Austria GmBH生产的亚单位疫苗，由三种MTB抗原（Ag85B、ESAT-6和Rv2660c）和IC31佐剂组成。研究表明，在小鼠或NHP模型中感染LTBI或ATB后接触H56:IC31可以防止MTB的重新激活，并与接受佐剂或卡介苗的对照组相比显著减少细菌负荷。H56:IC31的安全性和免疫原性已在四项临床试验（NCT01967134、NCT02378207、NCT02503839和NCT01865487）中进行了评估。最初的I期临床试验（NCT01967134）在南非进行，旨在评估H56:IC31疫苗在HIV阴性成年人中的安全性和免疫原性，无论他们是否患有LTBI。该试验的发现表明，该疫苗安全可接种。此外，它成功刺激了抗原特异性IgG抗体的产生，并触发了表达Th1细胞因子的CD4+ T细胞的发展。这些免疫反应观察到在接种疫苗后持续了最多210天。一项Ib期随机安慰剂对照试验（NCT02378207）在南非进行，以评估H56:IC31在健康、接种过卡介苗、HIV阴性青少年中的安全性和免疫原性。该疫苗的整体安全性和耐受性良好，没有发生严重的疫苗相关不良事件。H56:IC31诱导了良好的CD4+ T细胞反应和血清IgG。另一项I/IIa期临床试验（NCT01865487）在南非进行，评估了疫苗的最佳剂量和对感染和未感染MTB的成年人的影响。结果显示，无论剂量（5、15、50微克H56/500纳摩尔IC31）、接种次数或MTB感染如何，免疫原性都是可接受的。两次或三次注射最低剂量的H56:IC31（5微克H56/500纳摩尔IC31）在感染和未感染MTB的成年人中诱导了持久的抗原特异性CD4+ T细胞反应。在另一项随机、开放标签的I/II期临床试验（NCT02503839）中，主要评估了H56:IC31在肺结核和肺外结核患者中的安全性和免疫原性，以及H56:IC31和环氧合酶-2抑制剂（依托考昔）联合应用的情况。结果显示，H56:IC31诱导了抗原特异性T细胞的强烈扩增和更高的血清转化比例。值得注意的是，依托考昔的联合应用不仅未能增强免疫反应，而且还减少了H56:IC31诱导的T细胞反应。这些数据表明，在接种疫苗的个体中，H56:IC31的给药是可行且耐受良好的，展示了进一步临床开发的有希望的安全性概况。这些临床试验还表明，H56:IC31疫苗在不同程度LTBI感染的人群中展示了出色的免疫原性。 目前正在进行的IIb期双盲、随机、安慰剂对照试验（NCT03512249）旨在进一步评估H56:IC31在减少HIV阴性成年人结核病复发方面的安全性和有效性。该试验计划招募900名参与者，但尚未招募志愿者。 3.4.4. H4:IC31 (AERAS-404) H4:IC31疫苗，也称为AERAS-404，是由SSI、赛诺菲巴斯德、Valneva和Aeras共同开发的，由重组融合蛋白Ag85B-TB10.4（H4）和IC31佐剂组成。临床前研究表明，H4:IC31可以为动物提供对肺结核的保护。此外，在人体研究中，该疫苗已被证明可以刺激抗原特异性CD4+ T细胞，导致分泌重要的细胞因子，如IFN-γ、TNF-α和IL-2。在瑞士（NCT02420444）、南非（NCT02109874）、瑞典（NCT02066428）和芬兰（NCT02074956）的HIV阴性、卡介苗未接种的成年人以及南非的HIV未感染、HIV未暴露、卡介苗初种的婴儿（NCT01861730）中进行了几项评估H4:IC31安全性和免疫原性的I期临床试验。这些临床试验产生了类似的结果，表明H4:IC31在人类中是安全的，并诱导产生IFN-γ和多功能CD4+ Th1反应。2020年，在南非开普敦进行了一项Ib期随机临床试验（NCT02378207）。该试验的目的是评估三种不同的疫苗方案：H4:IC31、H56:IC31和卡介苗重新接种的安全性和免疫反应。这项研究涉及481名未感染MTB的青少年。结果显示，H4:IC31和H56:IC31疫苗均诱导了针对Ag85B的CD4+ T细胞介导的细胞免疫反应和H4和H56抗原特异性IgG抗体，但未检测到抗原特异性CD8+ T细胞反应。此外，在2014年，进行了一项随机、安慰剂对照、部分盲法的II期临床试验（NCT02075203），以评估H4:IC31和卡介苗重新接种在预防HIV阴性、QFT-GIT阴性、之前接种过卡介苗的西开普地区青少年的MTB感染方面的安全性、免疫原性和效果。结果显示，H4:IC31疫苗和卡介苗疫苗组之间严重不良事件的发生率没有临床上的显著差异[88]。H4:IC31疫苗和卡介苗都被发现具有免疫原性。然而，QuantiFERON-TB Gold In-tube检测（QFT）的转化率在H4:IC31疫苗接种者（30.5%）中低于卡介苗接种者（45.4%）。 3.4.5.ID93+GLA-SE (QTP101) 由美国传染病研究中心开发的ID93+GLA-SE疫苗由三种与MTB毒力相关的抗原（Rv2608、Rv3619、Rv3620）、一种与潜伏相关的抗原（Rv1813）和GLA-SE佐剂组成。ID93+GLA-SE可以刺激CD4+ T细胞分泌高水平的Th1细胞因子，从而在接种和未接种卡介苗的小鼠和豚鼠中产生保护性的抗结核效果。在美国进行了一项I期随机、双盲、剂量递增的临床试验（NCT01599897），以评估健康成年人中两剂ID93抗原单独或与两剂GLA-SE佐剂联合使用的安全性和免疫原性。结果显示，所有剂量的单独ID93和ID93+GLA-SE均可接受安全性，并且ID93与佐剂GLA-SE联合使用可诱导强烈的抗体和CD4+ T细胞免疫反应。随后在南非进行了一项I期随机、对照、安慰剂对照、剂量递增的试验（NCT01927159），以评估其在HIV阴性、接种过卡介苗的健康成年人中的安全性和免疫原性。结果显示，在所有抗原和佐剂剂量水平上均表现出良好的安全性。此外，接种ID93+GLA-SE疫苗诱导了高水平和持久的抗原特异性CD4+ T细胞和IgG反应。此外，一项在南非开普敦完成的IIa期随机、双盲、安慰剂对照的临床试验（NCT02465216），旨在评估ID93+GLA-SE在完成治疗后的HIV未感染成人结核病患者中的安全性和免疫原性。结果显示，ID93+GLA-SE诱导了强烈和持久的抗体反应和抗原特异性、多功能CD4+T细胞反应，与安慰剂组相比，两剂2微克ID93 + 5微克GLA-SE剂量诱导的抗原特异性IgG和CD4+ T细胞反应水平显著更高，反应持续6个月。未观察到与疫苗相关的严重不良事件。目前正在韩国进行一项IIa期随机、双盲、安慰剂对照试验（NCT03806686），以评估接种过卡介苗的健康医疗工作者中ID93+GLA-SE疫苗的安全性、免疫原性和效力。该研究尚未招募志愿者。这些临床试验评估了不同人群中ID93+GLA-SE的安全性和免疫原性，所有试验均显示出良好的安全性和免疫原性，为进一步的临床试验提供了有力的证据。然而，这些试验的样本量小限制了统计差异的准确估计。 3.4.6. AEC/BC02 AEC/BC02是一种重组亚单位结核病疫苗，包含两个主要成分：MTB Ag85b和一个名为ESAT6-CFP10的融合蛋白。它与一种名为BC02的CpG和基于铝的佐剂系统结合使用。该疫苗由中国北京国家食品药品监督管理总局开发，并由安徽智飞龙科马生物制药有限公司（中国合肥）生产。在BALB/c小鼠模型中对AEC/BC02疫苗的免疫原性和效力进行了初步评估，表明AEC/BC02可以诱导强烈的细胞免疫反应，在小鼠中产生高频率的抗原特异性干扰素-γ分泌T细胞。此外，在豚鼠预防模型中，AEC/BC02未能预防MTB感染，但诱导Koch现象的风险较低。然而，在豚鼠潜伏感染模型中，AEC/BC02有效控制了结核分枝杆菌的重新激活，并减少了肺部和脾脏中的细菌负荷。这些结果表明，AEC/BC02可能预防潜伏感染的重新激活，并可能作为治疗性疫苗。随后的一项研究验证了AEC/BC02疫苗对小鼠MTB潜伏感染的治疗效应，并发现AEC/BC02疫苗免疫疗法显著减少了小鼠肺部和脾脏中的细菌负荷，这可能与AEC/BC02诱导的抗原特异性IFN-γ和IL-2细胞免疫反应有关。这些临床前研究表明，AEC/BC02疫苗在预防和治疗LTBI方面具有巨大潜力。因此，2017年进行了一项I期临床试验（NCT03026972），由中国安徽智飞龙科马生物制药有限公司赞助，评估AEC/BC02疫苗的安全性。该研究旨在招募四组参与者：第一组包括25名结核病-PPD阴性和IGRA阴性志愿者，他们将接受安慰剂、低剂量佐剂或低剂量疫苗的干预；第二和第三组每组30名结核病-PPD阴性和IGRA阴性，他们将接受安慰剂、高剂量佐剂或高剂量疫苗的干预；第四组由50名结核病-PPD阳性和IGRA阳性的参与者组成，他们将接受安慰剂、低剂量佐剂、高剂量佐剂、低剂量疫苗或高剂量疫苗的干预。此外，2020年1月在中国湖北进行了一项Ib期、单中心、单剂量、安慰剂对照的临床试验（NCT04239313），评估健康成年人中AEC/BC02疫苗的安全性和免疫原性。与NCT03026972不同，NCT04239313招募了结核病-PPD阴性和IGRA阴性的参与者，主要评估低剂量疫苗和低剂量佐剂的安全性。这两项临床试验已完成参与者招募，但结果尚未发布。 2022年3月，在中国湖南启动了一项II期双盲、随机、对照临床试验（NCT05284812），以评估AEC/BC02疫苗在18岁及以上LTBI个体中的安全性、耐受性和免疫原性。该研究计划招募200名受试者，主要结果指标是肌肉注射后的不良事件数量，次要结果指标是抗原特异性总IgG抗体水平和抗原特异性干扰素-γ水平的变化。该试验目前正在招募志愿者。 3.5. 基于病毒载体的结核病疫苗 基于病毒载体的结核病疫苗是一种将MTB的保护性抗原转移到相对安全的病毒载体中，以实现有效且持久的免疫保护的疫苗。基于病毒载体的结核病疫苗具有高安全性、易于制造和低成本的优势，并且可以携带较大的基因片段。然而，也存在一些缺点，如毒力恢复和外源基因表达不稳定。用于开发结核病疫苗的常见病毒载体包括改良的天花病毒安卡拉株（MVA）、流感病毒、血凝病毒、腺病毒Ad5和Ad35、仙台病毒和猴腺病毒。目前正在进行临床试验的基于病毒载体的结核病疫苗包括MVA85A、ChAdOx1.85A、TB/FLU-01L、TB/FLU-04L和AdHu5Ag85A（表1）。 3.5.1. MVA85A MVA85A疫苗是由Aeras和牛津大学开发的一种活性病毒载体疫苗，使用天花病毒安卡拉株作为载体表达MTB抗原85A并诱导T细胞免疫反应。临床前研究表明，MVA85A可以在动物模型中刺激细胞和体液免疫反应，并对小鼠、豚鼠、牛和猕猴的结核病提供免疫保护。2007年，在南非开普敦进行了一项I期临床试验（NCT00460590），以评估健康志愿者中MVA85A的安全性和免疫原性。结果显示，该疫苗耐受性良好，并诱导了持久、强烈和抗原特异性的CD4+ T细胞反应。临床试验还评估了MVA85A在儿童和婴儿中的安全性、免疫原性和效力。儿童是结核病增强疫苗的目标人群，但他们通常有较高的寄生虫负担。2014年，进行了一项II期临床试验（NCT00679159），以评估MVA85A在南非接种过卡介苗的健康儿童和婴儿中的安全性和免疫原性。七年后，该试验的结果发表，并表明MVA85A疫苗在婴儿中安全并产生了强烈、多能、持久的CD4和CD8 T细胞反应。不幸的是，这项临床试验没有揭示儿童中MVA85A疫苗的安全性和免疫原性。2009年，一项随机、安慰剂对照的IIb期临床试验（NCT00953927）评估了在2794名之前接种过卡介苗且未感染HIV的新生儿中MVA85A的安全性和免疫原性。结果于2013年发表在《柳叶刀》上，显示尽管接受MVA85A的婴儿比安慰剂组（89%对45%）有更高的轻度不良事件发生率，但两组之间在系统性和严重不良事件的发生上没有显著差异。此外，该疫苗对结核病的效力为17.3%（95% CI，从-31.9%到48.2%），对结核感染的效力为-3.8%（95% CI，从-28.1%到15.9%）。 MVA85A对婴儿结核病或感染的缺乏效力与之前的动物研究不一致，可能归因于婴儿免疫系统建立不完全，导致对MVA85A的有效免疫反应能力不足。由于感染HIV的新生儿被禁止接种卡介苗，因此需要一种新的结核病疫苗来预防HIV感染的新生儿中的结核病，并避免与卡介苗接种相关的潜在风险。2018年，在南非进行了一项II期双盲、随机、对照试验（NCT01650389），评估了HIV暴露的新生儿中MVA85A疫苗的安全性和免疫原性。结果显示，该疫苗安全，并诱导了早期适度的抗原特异性免疫反应。然而，该试验没有评估MVA85A疫苗对HIV暴露的新生儿中结核病的保护效力，因此无法与NCT00953927临床试验的结果进行比较。这些有希望的结果支持评估MVA85A在预防婴儿结核病中的效力。 3.5.2.ChAdOx1.85A ChAdOx1.85A是一种表达MTB抗原Ag85A的基于猴腺病毒载体的结核病疫苗。在一项临床前研究中，研究人员使用小鼠模型评估了ChAdOx1.85A的免疫原性和保护效果。ChAdOx1.85A的鼻内给药在小鼠中诱导了显著更高水平的IFN-γ和TNF-α分泌来自CD4+和CD8+ T淋巴细胞。然而，与阴性对照相比，单独ChAdOx1.85A免疫并没有显著减少小鼠器官中的MTB负荷。先前接种卡介苗后再接种ChAdOx1.85A和AMVA85A增强了免疫保护。在另一项动物实验中，接种ChAdOx1.85A单独的小鼠肺部的CFU与未接种疫苗的组相比没有显著减少。接种卡介苗的小鼠肺部CFU减少了（p = 0.0059），并且从随后的ChAdOx1.85A免疫中没有显著获益。此外，BCG-ChAdOx1.85A-MVA85A初免-增强方案与对照组相比进一步提高了保护效果。来自动物实验的数据表明，与单独卡介苗或ChAdOx1.85A相比，BCG-ChAdOx1.85A-MVA85A初免-增强方案在小鼠中提供了更大的保护。基于这些结果，大多数ChAdOx1.85A疫苗的临床试验都使用了BCG-ChAdOx1.85A-MVA85A初免-增强方案。实际上，一项标识为NCT01829490的I期临床试验在英国进行，以评估健康成年人中ChAdOx1.85A疫苗的安全性和免疫原性，无论是否进行MVA85A增强，在接种疫苗后。结果显示，不良反应大多是轻度到中度的，疫苗是安全的[104]。MVA85A增强增强了ChAdOx1.85A疫苗诱导的Ag85A特异性ELISpot和细胞内细胞因子CD4+和CD8+ T细胞反应。2018年，在乌干达进行了一项IIa期随机开放标签试验（NCT03681860），评估不同剂量的ChAdOx1.85A疫苗（5 × 10^9 vp和2.5 × 10^10 vp）在不同年龄组（成人和青少年）中的安全性和免疫原性，并评估BCG-ChAdOx1.85A-MVA85A初免-增强方案在增强保护效力方面的优势。通过主要结果指标的不良事件和对Ag85A的T细胞反应来评估该临床试验的安全性和免疫原性。志愿者招募已经完成，但结果尚未公布。 3.5.3.TB/FLU-01L和TB/FLU-04L TB/FLU-01L是一种减毒流感病毒株Flu NS106，表达MTB抗原ESAT-6。与此同时，TB/FLU-04L是一种表达MTB抗原ESAT-6和Ag85A的截断NS1蛋白的改良流感病毒载体。这两种疫苗是由哈萨克斯坦的生物安全问题研究所（RIBSP）和俄罗斯的Smorodintsev流感研究所（SRII）共同开发的。目前，正在进行多项临床试验，以评估TB/FLU-01L和TB/FLU-04L疫苗的安全性和免疫原性。2017年，在哈萨克斯坦进行了一项随机I期临床试验（NCT03017378），评估36名接种过卡介苗的18-50岁成年人中TB/FLU-01L结核病疫苗的两剂（第1天和第21天）方案的安全性和免疫原性。然而，这项研究的结果尚未报告。 Kira Stosman及其同事的另一项研究在动物模型中评估了TB/FLU-04L疫苗的安全性，并在急性毒性测试中未发现致命影响。在行为、临床症状、食物和水的摄入、体温和体重等重要功能上未观察到病理变化，并且在6.5 log10 TCID50和7.5 log10 TCID50的疫苗中报告的代谢和造血指标也未产生显著影响。这些发现在另一项临床前研究中得到了进一步验证。此外，最近的一项研究在小鼠模型中调查了TB/FLU-04L疫苗的保护效力，并表明单独接种TB/FLU-04L可以诱导与卡介苗相当的保护，并显著增强“卡介苗初免—TB/FLU-04L增强”方案中卡介苗的保护效果。 作为新开发的基于病毒载体的结核病疫苗，TB/FLU-04L在临床前研究中表现出色。2015年，一项I期、随机、双盲、安慰剂对照试验（NCT02501421）调查了在接种过卡介苗的健康成年人中接种两剂TB/FLU-04L（第1天和第21天）的安全性和免疫原性。该试验已完成志愿者招募，但结果尚未公布。 3.5.4.AdHu5Ag85A（前称Ad5Ag85A） AdHu5Ag85A，之前称为Ad5Ag85A，是一种基于重组人类5型腺病毒（AdHu5）的结核病疫苗，设计用于表达MTB的Ag85A抗原。这种重组腺病毒构建物经过E1和E3基因的删除，并包含MCMV启动子（跨越核苷酸1724-2251）、tPA信号序列（跨越核苷酸1573-1676）、MTB Ag85A基因序列（跨越核苷酸685-1572）和SV聚腺苷酸信号（跨越核苷酸483-641）。AdHu5Ag85A的递送可以通过肌肉注射或气雾吸入进行。在小鼠、豚鼠、山羊和牛的PTB模型中进行的研究表明，AdHu5Ag85A作为卡介苗初免后的增强剂或独立疫苗，都显示出效力。然而，AdHu5Ag85A疫苗提供的保护程度取决于免疫途径。2014年，进行了一项调查以评估AdHu5Ag85A疫苗的免疫原性，并检查腺病毒增强剂量和接种途径对其免疫原性的影响。结果显示，通过皮内递送2 × 109感染单位的方案在所有测试方案中产生了最坚定和有力的反应。 这些临床前研究支持AdHu5Ag85A疫苗在人类应用中的进一步临床研究。早在2013年，就进行了一项I期临床试验，评估了在健康成年人中接种AdHu5Ag85A的安全性和免疫原性，这些成年人要么是卡介苗未接种者，要么之前接种过卡介苗。试验结果表明，AdHu5Ag85A通过肌肉注射在人类中是安全的，并且之前接种过卡介苗的志愿者中，AdHu5Ag85A增强疫苗显著促进了多功能CD4+和CD8+ T细胞免疫。两年后，另一项I期临床试验（NCT02337270）在加拿大接种过卡介苗的健康成年人中进行，以评估AdHu5Ag85A的安全性和免疫原性。直到2022年才公布试验结果，显示无论使用低剂量或高剂量的气雾途径免疫或肌肉注射，AdHu5Ag85A疫苗都显示出良好的安全性和耐受性。特别是气雾途径免疫，尤其是低剂量免疫，在呼吸道组织驻留记忆的CD4+和CD8+ T细胞的多功能性上显著诱导。 3.6.结核病DNA疫苗 结核病DNA疫苗是一种创新的疫苗类型，它利用MTB的一小段DNA在宿主生物体中触发免疫反应。为了递送MTB DNA片段，使用含有特定MTB抗原基因的质粒。一旦质粒被引入宿主生物体，DNA片段就被受体细胞同化，并且合成抗原。经过处理后，目标抗原形成抗原肽，与宿主细胞的MHC I类和MHC II类分子结合，并呈现给宿主的免疫识别系统，诱导产生特定的体液和细胞免疫反应，以预防或治疗相应疾病。 作为第三代疫苗，DNA疫苗与第一代（减毒活疫苗、灭活疫苗）和第二代（亚单位疫苗）疫苗相比，具有几个优势：其生产过程廉价、快速、可扩展，研发（研究与开发）快速且灵活，并且在室温下相对稳定，并且可以诱导持久的体液和细胞免疫反应。然而，在应用DNA疫苗时可能需要克服一些障碍：（1）DNA疫苗易于降解，利用率低；（2）不同的生物屏障可以阻碍DNA疫苗到达目标；（3）在人类细胞核中的低表达可能导致DNA疫苗的免疫原性低；（4）它可以诱导身体产生抗DNA IgG，可能引发自身免疫疾病；（5）DNA疫苗的最大风险是外源DNA对人细胞核中DNA的干扰。 进入临床试验的唯一基于DNA的治疗性结核病疫苗GX-70因安全问题而终止（表1）。GX-70 DNA疫苗是由来自MTB的四种抗原质粒以及重组Flt3配体组成的疫苗。延世大学进行了一项开放标签、剂量递增的I期临床试验（NCT03159975），评估GX-70在高风险PTB患者中的耐受性、安全性和免疫原性，这些患者经历了治疗失败或复发。在这个试验中，参与者被分为三组，通过电穿孔到三角肌，每四周接受不同剂量的GX-70疫苗（0.26毫克、1毫克和4毫克），总共接种五次。试验的主要结果指标是确定最大耐受剂量。次要结果指标包括评估IFN-γ反应（由结核病抗原刺激）和监测每毫升皮克克的Flt3L（Flt3配体）浓度。 4.新型结核病疫苗研究的挑战与展望  结核病疫苗的开发目前正处于关键时期，众多学者致力于新型疫苗的探索。尽管出现了许多新的疫苗候选物，但大多数仍处于早期开发阶段，一些已经进行了动物实验。目前，全球只有19种结核病疫苗进入临床试验阶段，这些疫苗的效力仍需进一步评估。然而，开发一种普遍有效的结核病疫苗仍然面临重大挑战。 4.1. 结核病疫苗临床试验的不可持续性 COVID-19的全球爆发显著加快了COVID-19疫苗的开发速度，仅在一年内，全球就有超过10种COVID-19疫苗获得紧急使用批准，创造了疫苗研究历史上的显著里程碑。然而，与这种快速发展形成鲜明对比的是，结核病疫苗的开发过程通常需要10-15年，许多疫苗在后期阶段失败。目前，只有三种结核病疫苗处于I期和IIa期临床试验阶段（GX-70因安全问题已停止），在这一研究领域留下了巨大的空白。这引起了真正的担忧，即如果目前处于IIb期和III期试验阶段的疫苗，如M72/AS01E疫苗，没有显示出显著的效力，那么在新型结核病疫苗领域可能会有有限的“计划B”选项。因此，世界可能需要多种新疫苗来应对全球结核病的严重负担。即使候选疫苗在III期试验中显示出有希望的保护效力，它们也不应该被视为进一步研究的终点。相反，我们需要更深入地了解MTB与宿主之间的相互作用机制，加强临床前和早期临床研究的规划，并培养更多的候选疫苗种子，因为这些对于结核病疫苗的成功开发至关重要。 4.2. 选择适当的免疫原性抗原表位是结核病疫苗研究的重点和挑战 被宿主的巨噬细胞和树突状细胞等APCs吞噬后，MTB不能直接呈现给适应性免疫细胞以触发适应性免疫反应。相反，它在APCs内被降解成数千个肽片段，并通过MHC分子呈现给CD4+和CD8+ T细胞。目前，结核病疫苗的抗原表位筛选正处于瓶颈阶段。应该为表位预测选择哪些MTB抗原？如何选择最具免疫原性的抗原表位？是否需要结合多种抗原表位，如HTL、CTL和B细胞表位？如何确定这三种细胞表位的排列顺序和比例？哪种抗原能获得更好的免疫原性？这些是抗原表位选择中需要解决的紧迫问题。近年来，随着生物信息学和免疫信息学技术的快速发展，从在动物实验中已证明具有良好免疫原性和保护效率的MTB抗原中预测HTL、CTL和B细胞表位已成为可能，成本低廉。 此外，在预测、筛选和鉴定表位时，必须考虑MTB抗原在不同阶段的表达特征。以前的研究表明，与结核病患者相比，LTBI个体对更多潜伏抗原表现出更强的IFN-γ反应。因此，基于这一发现，可以对LTBI人群进行进一步研究，以验证对某些潜伏抗原的强烈T细胞反应及其与结核病潜伏期的关系。因此，在候选抗原的选择中，根据疫苗的目标人群，如健康个体、LTBI人群或ATB患者，有必要选择在MTB潜伏和增殖阶段表达的抗原。 4.3. 缺乏针对孕妇的结核病疫苗临床试验 女性中结核病的最大风险与生育年龄相吻合，每年有超过20万名孕妇受到ATB的影响。美国孕妇LTBI的患病率为4.2%，在印度的HIV阴性女性中为19%至34%，在南非的HIV阳性女性中高达49%。以前的研究发现，孕妇和产后妇女患结核病的风险比一般人群更高，孕期结核病对母亲和胎儿的健康和生命构成威胁。这些数据表明，孕妇是ATB和LTBI的高风险人群。然而，遗憾的是，目前处于临床研究阶段的19种结核病疫苗针对各种人群，包括婴儿、儿童、青少年、成人和老年人，但不包括孕妇。系统地将孕妇排除在结核病疫苗临床试验的目标人群之外主要是基于对孕妇的“保护”观念。然而，随着对孕期研究伦理态度的演变，逐渐认识到以保护为名排除孕妇实际上使她们面临更高的结核病风险。相比之下，其他传染病疫苗的临床试验已经将孕妇作为目标人群，如戊型肝炎、HIV和百日咳。 4.4. 结核病疫苗临床试验评估终点的争议 确定标准化的终点评估标准是临床试验中评估结核病疫苗的另一个关键问题。目前，缺乏明确标准来定义终点事件导致结核病疫苗评估标准的差异。在评估LTBI时，常用的两种方法是干扰素-γ释放试验（IGRAs）和结核菌素皮肤试验（TSTs）。尽管TST结果可能受到卡介苗接种和非结核分枝杆菌（NTM）感染的影响，但其操作简单且成本低廉，因此在发展中国家，特别是在极度贫困的国家得到了广泛采用。IGRAs则利用不受卡介苗接种或NTM感染影响的抗原（ESAT-6和CFP-10）。然而，IGRAs操作更复杂，成本更高，使其更适合在发达国家实施。因此，在发展中国家进行的结核病疫苗临床试验可能倾向于使用TST作为LTBI评估方法，而发达国家可能更倾向于使用IGRAs。此外，随着技术的进步，TST和IGRAs都引入了新的方法和技术，如Diaskintest、C-Tb皮肤试验、EC-Test、T-SPOT.TB、QFT-GIT、QFT-Plus和LIAISON QFT-Plus。这些不同的方法在LTBI的敏感性、特异性和诊断性能上存在差异。因此，选择哪种方法用于LTBI评估将直接影响疫苗保护的评估值。 4.5. 疫苗佐剂或递送系统的选择对结核病疫苗的免疫原性和保护效力至关重要 佐剂可以通过作为免疫刺激剂增强对抗原的免疫反应。它们还可以作为载体将抗原递送到适当的免疫细胞，从而提高体内免疫保护。理想的佐剂可以减少疫苗接种的频率，降低每剂疫苗的抗原剂量，改善免疫反应的质量，促进交叉免疫，并在某些情况下增强最终疫苗配方的稳定性。在过去的七十年中，包括氢氧化铝、磷酸铝和硫酸铝钾在内的铝盐在疫苗配方中证明了其安全记录。这些佐剂最初在20世纪30年代、40年代和50年代与白喉、破伤风、百日咳和脊髓灰质炎疫苗一起使用，因为科学调查揭示了它们增强免疫系统对这些免疫接种的反应的能力。系统回顾与荟萃分析综合分析了含铝的白喉、破伤风和百日咳（DTP）疫苗免疫后的不良事件，并发现没有充分的证据将疫苗中铝盐的使用与重大或持久的不良事件联系起来。 随着随后的进步，新的佐剂被设计出来，以精确针对身体免疫反应的不同方面，从而加强和延长疾病保护。目前，临床阶段结核病疫苗中的佐剂包括TLR-9激动剂CpG-ODN1a、脂质体配方和乳液（如AS01、CAF01和GLA-SE）以及其他佐剂如IC31。 4.5.1. 脂质体和乳液 脂质体和乳液目前被用作许多候选结核病亚单位疫苗的递送载体，如M72/AS01E、ID93+GLA-SE和H1:CAF01。这些佐剂通过疏水相互作用自发自组装成颗粒，携带各种疫苗或佐剂配方，可以通过淋巴引流或被APCs吞噬靶向淋巴结，激活先天和适应性免疫反应。此外，这些佐剂具有促进疫苗抗原缓慢释放的能力，它们的囊泡结构作为保护性储库，防止抗原降解。此外，带负电荷的脂质体（阳离子脂质体）的配方允许它们聚集并与带正电荷的抗原结合，进一步增强这种储库效应。然而，脂质体和乳液配方经常表现出与局部反应原性相关的相关性，这强调了在它们能够用于人类应用之前需要进行修改以提高安全性。 M72/AS01E疫苗，被认为是非常有前景的亚单位疫苗，在肌肉注射以乳液形式给药时，在无HIV感染但有LTBI的个体中显示出54%的效力。AS01被认为通过迅速诱导位于引流淋巴结的NK细胞和CD8+ T细胞产生IFN-γ，从而促进强烈的细胞Th1反应，这一理论得到了人类疫苗试验中观察到的稳健的Th1和IFN-γ反应的支持。ID93/GLA-SE疫苗利用了一种在水包油乳液（GLA-SE）中的葡萄糖基脂质佐剂，它作为TLR4激动剂。GLA-SE的佐剂作用依赖于其递送载体，最近的研究表明，单独的GLA引起的IgG2反应类似于单独的水包油乳液，而两者的结合则促进了Th1反应。另一方面，CAF01是由合成的两亲性脂质DDA和TDB组成的脂质体配方。DDA能够自组装成囊泡，TDB则嵌入DDA双层中以稳定脂质体。TDB通过激活Mincle受体发挥强大的免疫刺激作用。一旦Mincle被识别，它与Fc受体共同γ链（FcRγ）相互作用，通过Syk启动细胞内信号传导。这一信号级联导致CARD9依赖的NF-κB激活和下游促炎细胞因子的产生。此外，CAF01通过Mincle依赖的IL-1产生诱导Th1/Th17极化，随后是MyD88信号传导。在H1:CAF01疫苗的临床前试验中，已经证明CAF01佐剂显著增强了IFN-γ的产生，并引发了依赖于Th17的记忆，从而无论在感染前后，都对MTB产生了保护。 4.5.2. TLR-9激动剂CpG-ODN1a和IC31佐剂 TLR-9激动剂CpG-ODN1a和IC31是临床试验中评估的另外两种结核病疫苗佐剂。目前正在进行I/II期临床试验的GamTBvac，利用了鼠李糖偶联物和CpG佐剂，以及一个包含鼠李糖结合域的抗原融合蛋白。鼠李糖有着悠久的医学使用历史，并被FDA归类为“普遍认为安全”（GRAS）。在佐剂环境中，鼠李糖有潜力通过与Langerin、DC-SIGN家族受体和甘露糖受体的相互作用来诱导炎症反应，从而可能激活先天免疫。疫苗的另一个组成部分IC31，由抗菌肽KLKL5KLK（KLK）和TLR9激动剂ODN1a组成。假设ODN1a与TLR9结合，启动TLR9/MyD88依赖途径，并增强APCs产生IL-12。KLK本身具有免疫刺激特性，并且有效地针对细胞内TLRs。 4.5.3. 结核病亚单位疫苗佐剂或递送系统的可能未来应用 如前所述，已经在结核病疫苗的临床前研究中评估了多种新型佐剂和递送载体，如Advax™（三角刺槐糖颗粒）、PLGA、枯草杆菌孢子、壳聚糖及其衍生物、PolyI:C、环状二核苷酸、右旋糖酐、免疫刺激复合物（ISCOMs）、Lipokel（PamCys2和3NTA）、纳米乳液和结合HBHA蛋白的巴西棕榈蜡纳米颗粒。这些佐剂可以广泛地分为三组：纳米或微粒、来自植物或微生物衍生物的佐剂，以及基于递送系统的佐剂。特别值得注意的是Advax™，这是一种独特的植物衍生多糖，制成三角刺槐糖颗粒，已证明能够增强对各种疾病的免疫反应。Advax™表现出高安全性、最小的炎症反应，并诱导包括Th1、Th2、Th17 CD4+亚型以及记忆CD8 T细胞在内的广泛T细胞反应。 重要的是要考虑佐剂的选择起着重要作用，因为不同类型的佐剂激活的先天免疫反应不同，这可能会影响抗原呈递和随后的疫苗反应。因此，了解佐剂的作用机制对于确定不同疫苗最合适的佐剂至关重要。此外，佐剂的实际应用面临几个挑战。免疫刺激剂可能引起不良反应，包括自身免疫疾病，以及免疫反应。此外，由于高免疫耐受性、稳定性差和复杂的制造工艺，许多佐剂在临床开发中失败。 4.6. 结核病疫苗研究中动物模型的选择 动物模型对于理解MTB的体液和细胞免疫反应以及评估候选结核病疫苗的安全性、免疫原性和保护效力至关重要。新的结核病疫苗需要在进行人体临床试验之前，通过动物模型建立其安全性、免疫原性和保护效力。 目前，结核病疫苗研究中采用了多种动物模型，包括小鼠、豚鼠、家兔和非人灵长类动物（NHPs）。小鼠具有成本低、有效性和可得性等优点，包括纯系、杂系和转基因品系。它们是最广泛使用的小动物模型，用于初步筛选结核病疫苗候选物和评估其效力。虽然小鼠对MTB感染的免疫反应与人类相似，但在观察疫苗相关的病理损害方面存在局限性。 豚鼠通常用于评估皮肤反应性、新的结核病疫苗候选物和耐多药MTB的传播能力。它们通过呼吸道对MTB感染高度敏感，并显示出类似于人类的组织病理学特征，包括特征性的干酪性肉芽肿。此外，豚鼠可用于进一步筛选皮肤试验抗原和评估之前在小鼠模型中测试的有前景的疫苗。对豚鼠肺部感染MTB形成的病理损伤进行了广泛研究，为豚鼠PTB研究提供了基础。然而，豚鼠的维护成本较高，免疫学试剂的可用性限制了它们在临床环境中的使用。 家兔模型则广泛用于筛选和评估结核病的潜在疫苗候选物。家兔在MTB感染后发展出与人类相似的肉芽肿、液化和空洞。它们已被用于评估卡介苗、牛结核病疫苗、M. microti和亚单位疫苗等疫苗的效力。此外，家兔模型有助于理解由MTB H37Rv感染引起的空洞形成的致病因素和机制。然而，家兔模型的使用受到成本高、缺乏相关的免疫学试剂、遗传操作和伦理考虑的限制，使其不适合长期存活研究。 NHPs自然对MTB感染敏感，在结核病疫苗和药物开发中有着悠久的使用历史。NHPs，如猴子，与人类有着最密切的进化关系，它们的病理和疾病状态与人类非常相似。猴子感染后会发生广泛的干酪性坏死、液化和空洞形成，以及包含类似于人类肺肉芽肿的巨细胞的肉芽肿。然而，NHPs的使用受到伦理问题、高成本、耗时、显著的个体间变异性、新药批准的不必要性以及空间需求的限制。它们通常用于在临床试验前评估结核病疫苗的安全性、免疫原性和保护效力。 每种动物模型都有其优势和局限性，选择取决于特定的研究目标、可用性、伦理考虑和资源。结合多种动物模型可以更全面地了解结核病疫苗的反应。总之，由于成本低、有效且不同品系可获得，小鼠通常用于初步筛选和评估结核病疫苗候选物。豚鼠提供与人类结核病病理相似之处，对皮试反应和耐多药结核病研究有用，尽管它们的维护和试剂可用性可能具有挑战性。家兔表现出与人类相似的病理变化，被用于疫苗评估和理解空洞化机制。尽管存在伦理和资源考虑，但在临床试验前，NHPs（如猴子）因与人类病理高度相似而被用于安全性、免疫原性和保护效力评估。 通过利用这些不同的动物模型，研究人员可以深入了解结核病疫苗的安全性、免疫原性和保护效力，为在人体临床试验中进一步开发和测试潜在候选物奠定基础。 4.7. 深度学习赋能结核病疫苗研究 深度学习技术在疫苗开发中扮演着越来越重要的角色。疫苗研究中的一个挑战是快速准确地识别具有潜在治疗效果的分子，这是传统实验方法需要大量时间和资源才能实现的任务。通过分析和处理大量的生物数据，并将这些数据与对MTB、细胞和人类免疫系统的深入了解相结合，深度学习技术可以帮助识别具有潜在治疗效果的MTB抗原或表位候选物。具体来说，在结核病疫苗开发领域，深度学习技术可以应用于以下领域：结核病诊断的临床试验纳入标准、MTB蛋白质结构预测、表位预测和筛选、疫苗接种时机的优化和预测，以及免疫谱分析。 4.7.1. 结核病诊断的临床试验纳入标准 临床试验结果异质性的一个原因是缺乏标准化的疾病状态诊断标准和方法。深度学习技术的兴起可能为这一挑战提供了一个有希望的解决方案。深度学习技术可以用于自动和快速检测和诊断结核病病例，针对各种临床生物标志物。这些技术可以应用于自动分析和识别微生物学和成像特征，如在结核病痰液和血液样本中发现的，以及遗传和免疫因子数据。例如，2023年发表在《Insights Imaging》上的一项横断面研究开发了一个深度神经网络（DNN）算法来检测结核病患者的X光结果，区分活动性PTB和非结核性分枝杆菌性肺病（NTM-LD）。该研究表明，基于曲线下面积（AUC）的DNN模型在检测结核病和分枝杆菌性肺病方面表现出稳定的性能。此外，包括决策树、随机森林、支持向量机、贝叶斯方法、逻辑回归和层次聚类在内的各种深度学习算法已应用于LTBI和ATB的区分和诊断，显著提高了诊断效率。 4.7.2. MTB蛋白质结构预测 深度学习模型在生物学中的突破性贡献可以归因于AlphaFold解决了“蛋白质折叠问题”，这被认为是生物学中一个基本且长期存在的挑战。深度学习在结构预测和蛋白质折叠解析方面取得了显著进展，现在通常用于抗体生成，以绕过实验步骤。蛋白质结构预测和免疫原设计在疫苗开发中起着至关重要的作用，几十年来，获得蛋白质结构的唯一手段是通过实验方法。然而，最近的深度学习方法已经能够从氨基酸序列预测结构，实现与实验方法相当的准确性。MTB编码超过4000种蛋白质，如果这些蛋白质结构和蛋白质折叠的挑战能够利用深度学习进行预测，将大大加快MTB基于肽的疫苗的开发，通过识别可以被MHC分子有效识别和呈递的表位。 4.7.3. MTB表位的预测和筛选 深度学习算法在疫苗表位的预测和筛选中发现了广泛的应用。例如，共识方法、NN-align-2.3（netMHCII-2.3）、NN-align-2.2（netMHCII-2.2）、SMM-align（netMHCII-1.1）、Sturniolo、NetMHCIIpan-3.1、NetMHCIIpan-3.2、NetMHCIIpan-4.0和NetMHCIIpan-4.1等算法在预测HTL表位方面取得了显著的成功。同样，存在许多成熟的深度学习算法用于预测CTL表位，包括NetMHCcons、人工神经网络（ANN）、PickPocket、共识、稳定矩阵方法（SMM）、NetMHCstabpan、epiTCR、SMMPMBEC、AttnTAP、NetMHCpan、Comblib_Sidney2008等。丰富的文献支持这些深度学习算法在预测疫苗表位方面的高准确性，从而提高疫苗设计和效力。在以前的研究中，我们利用深度学习算法从IEDB数据库筛选潜在的MTB HTL、CTL和B细胞表位，成功构建了如MP3RT、ACP、PP19128R和HP13138PB等新型结核病疫苗，并在进一步的体外实验后。总之，深度学习技术在疫苗表位的预测和筛选方面具有巨大的潜力，并且由于其适应性和可扩展性，预计将成为未来疫苗设计和优化的重要工具。 4.7.4. 疫苗接种时机的预测和优化 深度学习技术可以用于预测和优化疫苗接种的时机和剂量，确定最佳时间和剂量。这方面的具体应用包括以下几个方面： 病原体感染和免疫状态监测：病原体感染后，人体启动对病原体的免疫反应，这些反应的时机和强度通常受到感染方式和剂量等各种因素的影响。疫苗接种的时机和剂量选择很大程度上取决于患者的免疫状态。因此，监测患者的免疫状态对于确定疫苗接种的时机和剂量至关重要。深度学习技术可以应用于监测患者的免疫状态和病原体感染，为优化疫苗接种时机提供准确的预测和建议。例如，医学研究人员可以利用深度学习技术对各种诊断数据进行全面分析，包括病原体检测和免疫学评估，预测免疫系统反应的时机和强度，从而确定疫苗接种的最佳时机。 T细胞表位免疫原性预测：深度学习技术可以应用于准确分析T细胞免疫反应的复杂性，并预测未来免疫反应的强度和时机。以结核病疫苗为例，结核病的特点是慢性感染。MTB感染后，在宿主体内长期存在，并在适当的时候触发免疫反应。因此，预测MTB潜在抗原表位的免疫原性是构建理想疫苗的关键方面。深度学习技术可以从多个角度进行T细胞表位免疫原性预测，包括基于深度神经网络的模型，如DeepImmuno-CNN、DeepImmuno-GAN、DeepNetBim和DeepHLApan。这些模型可以根据潜在的免疫因素预测未来T细胞反应的免疫原性，从而提出更合理的疫苗接种时机和策略。 疫苗剂量选择：利用深度学习技术分析和预测患者的免疫状态，可以帮助医生就疫苗剂量和接种做出更好的决策。深度学习可以考虑患者体重、年龄和疾病状况等因素，预测最佳疫苗剂量，从而确定最佳的疫苗接种时机和策略。 需要注意的是，深度学习技术在疫苗接种时机预测和优化方面仍处于发展阶段，需要大规模数据和验证来支持其应用。此外，疫苗接种时机的决策过程通常涉及多个因素的综合考虑，包括个体免疫状态、疫苗安全性和疫苗供应。因此，在实际应用中，深度学习技术的结果应与临床判断相结合，共同确定最佳疫苗接种时机。 4.7.5. 免疫谱分析 免疫谱数据的增长与深度学习的发展相一致，这使我们能够仅从测序数据中预测免疫反应特征或疾病结果。有趣的是，在不断增长的免疫谱数据基础上训练的深度学习模型能够预测免疫疗法中的治疗效果和感染状态。因此，如果能够将结核病疫苗临床试验中获得的大量数据进行全球性的汇总和整合，形成特定于结核病疫苗的免疫谱数据，并基于这些数据训练深度学习模型，就有望解决当前结核病疫苗评估中标准有限和显著异质性的挑战。 4.8. 结核病mRNA疫苗 mRNA疫苗是一种结合分子生物学与免疫学的技术。这项技术与基因疗法密切相关。通过表达系统将编码抗原的外源mRNA引入细胞，合成的抗原可以在体内引发免疫反应（图5A）。mRNA疫苗具有其他疫苗所不具备的特定优势。首先，mRNA理论上可以满足编码和表达各种蛋白质的所有遗传信息要求。通过mRNA序列的修改，可以优化疫苗的发育效率，使其比其他类型的疫苗修改更为方便。其次，尽管编码的抗原不同，但大多数mRNA疫苗的生产和纯化过程非常相似，这使得保留甚至标准化这些过程成为可能，以利于其他类似mRNA疫苗的开发。此外，体外转录的使用使mRNA疫苗的生产更加容易。然而，mRNA也面临着mRNA不稳定、过度免疫原性和缺乏有效的mRNA递送系统的挑战。mRNA疫苗可以与佐剂结合使用，以增强对抗原的免疫反应。佐剂的添加可以增强免疫原性，提高抗体滴度，改变抗体类型，并增强迟发型超敏反应。由于mRNA疫苗的不稳定性，mRNA疫苗的引入需要一些载体的辅助。因此，科学家们已经开发了基于脂质的递送、基于聚合物的递送、基于肽的递送、类病毒复制粒子递送和阳离子纳米乳液递送等。此外，裸mRNA疫苗也可以直接注射到细胞中。到目前为止，已经深入研究了各种形式的递送载体和修饰mRNA，以测试它们的治疗效果，特别是在COVID-19流行期间。mRNA疫苗的大规模生产趋向于产业化。大规模生产的规模依赖于转化科学，这对于加速生产速度至关重要。在体外，转化技术可以快速选择制剂和结构，在临床前和临床研究中。 图 5. 展示了mRNA结核病疫苗和基于VLP的结核病疫苗的生成。在(A)中，获取编码MTB目标蛋白的DNA，并将其转录成mRNA。然后，将mRNA装载到脂质纳米颗粒和其他载体中，以创建用于肌肉注射的结核病mRNA疫苗。当这些mRNA疫苗注入人体时，旁观者细胞中的核糖体协助翻译目标蛋白。旁观者细胞吞噬产生的蛋白，激活先天和适应性免疫反应以消除MTB。在(B)中，将病毒的衣壳蛋白克隆到表达载体中。然后，修改表达载体以包含MTB蛋白，如ESAT-6或CFP-10。结果得到的表达载体包含衣壳蛋白和MTB蛋白。将其转化或转染到表达系统中以产生蛋白质。最后，MTB蛋白组装成VLPs，形成基于VLP的结核病疫苗。 2004年的一项研究首次证明，使用体外合成的RNA，表达结核分枝杆菌MPT83抗原的DNA或mRNA疫苗可以在小鼠中诱导特定的体液和T细胞免疫反应，并可以诱导抗原特异性的细胞介导和体液免疫反应。然而，它们的保护效力并不优于卡介苗。这项研究的结果表明，mRNA疫苗实现了特定免疫反应的启动。RNA免疫观察到的短暂表达可能会最小化DNA疫苗接种中提出的许多安全问题。然而，RNA免疫似乎会导致短期保护性免疫。因此，这种方法可以是一个重要的工具，通过结合体内增强免疫反应的有效策略和不同载体，开发更安全、更有效的结核病疫苗。 2022年，一项研究提出了一个假定的mRNA疫苗MT.P495，该疫苗针对结核分枝杆菌的磷酸盐结合蛋白PstS1。这项研究使用了几个针对MTB的磷酸盐结合蛋白PstS1的生物信息学工具，并且已经在计算上测试了其引发免疫反应和安全性的能力，预测了该抗原中存在的几种T细胞和B细胞表位及其在宿主体内产生免疫反应的能力。PstS1蛋白是一种免疫优势蛋白，TLR-2激动剂，无机磷酸盐摄取脂蛋白，存在于MTB细胞膜表面，并且作为粘附分子通过甘露糖受体（MR）促进与巨噬细胞的结合。因此，这个mRNA疫苗模型作为一个模型，已经准备好由实验者和工业界进行体内测试。所有上述结果表明，所提出的mRNA疫苗候选物MT.P495可能会引发强烈的免疫反应，特别是针对MTB。为了将来开发可行的MTB疫苗，这种模型化的mRNA是一个很好的疫苗模型，可以立即用于实验室测试，包括体外和体内研究。 目前，在国家卫生研究院的资助下，国际艾滋病疫苗倡议（IAVI）正在与Moderna合作，探索使用mRNA疫苗技术开发结核病疫苗的潜力。IAVI/Moderna mRNA结核病疫苗构建正在进行临床前评估。 4.9. 基于病毒样颗粒（VLP）的结核病疫苗 病毒样颗粒（VLPs）指的是由于病毒衣壳、核心或包膜蛋白的表达而自我组装成的颗粒，甚至包括从多层病毒制备的单层颗粒。基于VLP的疫苗是一类具有病毒结构但不具有病毒复制能力的疫苗。与减毒疫苗和病毒载体疫苗相比，它们被认为更安全（图5B）。基于VLP的疫苗具有几个优势：(1) 由于它们与原生病毒非常相似，因此具有高度的免疫原性。这意味着它们可以刺激包括体液（抗体介导的）和细胞免疫反应在内的强烈免疫反应。免疫系统将VLP识别为外来入侵者，并进行防御，产生抗体和记忆T细胞，提供持久的保护。(2) 由于不含可能引起感染的病毒遗传物质，基于VLP的疫苗被认为是安全的。它们不能在宿主内复制，因此不会引起它们模拟的疾病。这种安全性消除了实际感染的风险，同时仍然引发强烈的免疫反应。(3) 基于VLP的疫苗已被证明具有良好的稳定性，并且可以使用已建立的生物制造工艺进行生产。它们可以大规模生产，使它们可能适用于大规模疫苗接种活动。然而，基于VLP的疫苗的发展也遇到了各种障碍，包括与稳定性、下游处理复杂性、对环境条件的敏感性和高生产成本有关的问题。 目前，已有基于VLP的疫苗获得批准，用于预防人类三种不同的病毒感染，即乙型肝炎病毒（HBV）、戊型肝炎（HEV）和人乳头瘤病毒（HPV）。有趣的是，有多达九种基于VLP的疫苗专门获得批准用于预防HBV，包括乙型肝炎疫苗（HEPLISAV-B®）、Recombivax HB、Heberbiovac HB、Euvax B、GenVac B、Hepavax-Gene和GenHevac B。 随着VLP技术在开发各种疾病疫苗方面的不断进步，它现在进入了结核病疫苗开发领域。目前，有四种基于VLP的结核病疫苗，即LV20 VLPs、HBc-ESAT-6 (HE6)、ESATVLPs和HBc-VLP-CFP-10，正在进行临床前开发。 5.结论  结核病是最致命的传染病之一，由于HIV共感染和耐药菌株的出现，其预防和控制面临着前所未有的挑战。疫苗接种是通过减少活动性结核病的发病率来应对这一挑战的最经济有效和高效的方法。然而，唯一的结核病疫苗卡介苗的保护效力不足，迫切需要开发新型结核病疫苗。目前，有19种新型结核病疫苗处于不同的临床试验阶段，包括4种处于I期（AdHu5Ag85A、GX-70、TB/FLU-01L和TB/FLU-04L）、3种处于IIa期（ID93+GLA-SE、AEC/BC02和ChAdOx1.85A）、5种处于IIb期（RUTI、DAR-901、H56:IC31、H4:IC31和MVA85A）以及5种处于III期（MIP、SRL172、MTBVAC、VPM1002和M72/AS01E）。尽管新型结核病疫苗的研究取得了进展，但仍存在几个挑战，包括结核病疫苗临床试验的可持续性差、抗原表位选择困难、孕妇被排除在现有的结核病疫苗试验之外、评估结核病疫苗临床试验终点的争议、疫苗佐剂和递送系统选择有限，以及缺乏合适的动物模型来评估结核病疫苗，特别是基于表位的疫苗。此外，新技术的应用为结核病疫苗研究提供了新的方向，如mRNA疫苗和疫苗研究中的深度学习的使用。 尽管结核病疫苗开发领域面临众多挑战，包括经济、政策和社会制约因素，但必须认识到新型结核病疫苗的开发是一项促进人类福祉的公共卫生事业。政府和国际组织应提供有力支持，并积极促进这一领域的国际合作与交流。 为了推动人用及兽用疫苗行业交流，共同探讨该领域的最新研发进展、产业化现状及未来发展趋势，生物制品圈联合四叶草会展将于2024年8月16日-17日在苏州共同举办“第三届新型疫苗研发峰会”。诚邀全国相关领域专家、学者和企业家共享学术盛会。现将有关事宜通知如下。 名称：2024第三届新型疫苗研发峰会 时间：2024年8月16-17日（周五-周六） 地点：苏州（酒店定向通知） 主办单位：四叶草会展、生物制品圈 媒体支持：药时空、抗体圈、细胞基因研究圈 会议费用：点击二维码即可查询。 报名方式：扫描下方二维码→ 填写表格 → 报名成功（报名志愿者，免交报名费，承担一定工作任务）！ 转发分享福利：疫苗研发企业、科研院校和监管机构人员，前30位报名人员转发分享会议信息可免费参会（不含餐饮）报名后，扫描下方二维码加工作人员微信后，发送截图即可。 组委会获得报名信息后，根据报名信息进行初筛，并进一步与报名者沟通确认，实现精准邀请，最终有机会进入大会微信群（严格审核通过）。 大会日程 已经确定的报告人 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。