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摘要:免疫细胞治疗作为一种革命性的治疗方式，显著改变了癌症护理。这是一种专业的免疫疗法，利用活的免疫细胞作为治疗癌症的疗法。与传统药物不同，细胞疗法被认为是“活药”，这些产品目前是定制的，需要先进的制造技术。尽管嵌合抗原受体（CAR）-T细胞疗法在治疗血液恶性肿瘤方面受到了行业的极大关注，但其在治疗实体瘤方面的有效性常常受限，导致替代性免疫细胞疗法的出现。肿瘤浸润性淋巴细胞（TIL）细胞疗法、细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK）细胞疗法、树突状细胞（DC）疫苗和DC/CIK细胞疗法旨在利用身体的自然防御机制来定位和消除癌细胞，通常具有较少的副作用或风险。另一方面，如嵌合抗原受体-T（CAR-T）细胞、T细胞受体（TCR）-T、嵌合抗原受体-自然杀伤细胞（CAR-NK）或CAR-巨噬细胞（CAR-M）等细胞疗法通常使用自体干细胞、同种异体或异种细胞，或基因修饰细胞，需要更高水平的操作，被认为是高风险的。这些高风险细胞疗法通常在肿瘤靶向和信号传导方面具有特殊特性，触发新的抗肿瘤免疫反应。最近，在抗肿瘤机制和细胞疗法产品设计的基本和临床研究以及技术创新方面取得了显著进展。随着技术的迅速整合和高创新格局，关键的未来发展方向已经出现。为了满足细胞疗法技术进步治疗癌症的需求，我们在本研究中全面系统地调查了免疫细胞疗法的技术创新和临床进展。基于免疫细胞疗法的治疗机制和方法学特点，我们分析了这些疗法的主要技术优势和临床转化风险。我们还分析和预测了应用前景，为相关企业提供必要的信息，以便他们做出关于研发方向选择的明智决策。 1.引言 癌症是一种利用多种逃逸机制来躲避抗癌免疫的全身性疾病，并且显著改变整个免疫系统的功能和组成。抗癌治疗的演变跨越了一百多年，其效果和特异性不断提高，旨在消除癌细胞的同时尽量减少对健康组织的损害。为了实现这一目标，免疫细胞治疗在现有方法中脱颖而出，成为了一种改变游戏规则的解决方案。2017年，食品药品监督管理局（FDA）批准了两种嵌合抗原受体-T（CAR-T）细胞疗法，即Kite Pharm的axicabtagene ciloleucel（Yescarta）和Novartis的tisagenlecleucel（Kymriah），用于治疗淋巴瘤。这些批准标志着抗癌治疗加速发展的一个重大里程碑。免疫细胞治疗的基本概念是通过外部供应具有所需功能的细胞来增强免疫反应，以帮助患者对抗癌症。它不仅重新激活了现有的免疫反应，还推动了新的免疫反应加入到抗肿瘤努力中。免疫细胞治疗的反应通常涉及多种免疫细胞类型的激活和协作，包括抗原呈递细胞，如树突状细胞（DCs）和巨噬细胞，T淋巴细胞（T细胞）和自然杀伤（NK）细胞。肿瘤负担的免疫系统不仅在免疫细胞数量上失衡，而且在调节抗癌免疫反应的分子和信号通路上也表现出功能异常。因此，精确施用适当的治疗策略是必要的，以防止免疫细胞治疗的效果不佳。 根据癌症类型及其机制，免疫过程的各个领域为治疗干预提供了途径。方法包括，例如，提取和扩增具有预先癌症识别能力的免疫细胞（例如，肿瘤浸润性免疫细胞），外部分化有效的细胞类型[例如，细胞因子诱导的杀伤（CIK）细胞]，以及基因修饰细胞以实现特定识别和肿瘤细胞消除[例如，T细胞受体（TCR）工程，嵌合抗原受体（CAR）]。在本综述中，我们将讨论最新的免疫细胞治疗，总结应用于实现和优化这些治疗类别的策略，并提供未来的展望。 2.用低风险免疫细胞治疗癌症 低风险免疫细胞治疗旨在使用患者自己的免疫细胞来消除癌细胞。需要注意的是，“低风险”强调的是细胞治疗领域内某些治疗相对更安全、副作用较少，属于再生医学或先进治疗药物产品（ATMPs）。低风险免疫细胞治疗包括四种关键技术：肿瘤浸润性淋巴细胞（TIL）疗法、CIK细胞疗法、DC疫苗和DC/CIK细胞疗法。为了更全面地理解这些方法，必须深入研究促进这些细胞治疗的基本机制和临床进展。 2.1.TIL细胞治疗 TILs是存在于实体肿瘤微环境（TME）中的天然单核细胞，包括肿瘤内肿瘤浸润性淋巴细胞（iTILs）和基质肿瘤浸润性淋巴细胞（sTILs）。与iTILs相比，sTILs主要是效应记忆T细胞，更容易被检测到。作为一群已经接触过肿瘤组织的异质性淋巴细胞，TILs“预训练”攻击癌细胞，同时留下健康的细胞。在小鼠肿瘤模型中，这些异质细胞已经显示出治疗晚期癌症的潜力，第一个人类TIL治疗导致转移性黑色素瘤显著消退。实体瘤缺乏理想的肿瘤标志物，使得靶向肿瘤相关抗原（TAAs）具有挑战性。TILs作为具有多样化受体的多克隆细胞，为实体瘤提供了独特的治疗选择。与基因修饰的免疫细胞相比，TILs在克服实体瘤的异质性方面表现出优越性，特别是像黑色素瘤这样高度异质性的肿瘤。此外，它们具有注射后迁移至TME的趋化因子受体，并且与CAR-T细胞相比，它们的非靶向毒性较低，这归因于T细胞成熟过程中的负选择。 TILs可以从切除的肿瘤组织中分离出来。鉴于TIL在原始TME中的稀缺性，可供扩增的TIL数量有限，以及阻碍TIL抗肿瘤细胞毒性的额外因素（例如，Treg，肿瘤相关巨噬细胞，髓系抑制细胞和各种免疫抑制分子）。TIL的生产和扩增是TIL治疗成功的至关重要步骤。TIL在体外的扩增涉及快速扩增协议（REP）。在REP前阶段，TILs在高剂量白细胞介素（IL）-2下进行初级扩增。一些方法涉及选择肿瘤特异性TILs进行进一步扩增，而其他方法则扩增大量TILs以保持疗效。在REP阶段，同时给予高剂量IL-2和抗CD3，并使用辐照的同种异体外周血单核细胞（PBMCs）作为饲养细胞，直到获得足够数量的细胞。然后，经过质量控制的扩增细胞产品准备用于患者给药后进行淋巴细胞减少。 自1988年Rosenberg等人成功将TIL治疗应用于转移性黑色素瘤患者以来，一系列临床试验相继出现。1996年，TIL治疗首次被引入用于治疗非小细胞肺癌（NSCLCs），在涉及113名患者的临床研究中。结果显示，TIL与IL-2联合使用对NSCLCs是一种有效的治疗方法，与II期或IIIa期相比，对IIIb期NSCLCs有选择性益处。在初步成功后，TIL治疗的后续发展一直朝着提高治疗其他肿瘤类型的疗效方向发展，包括皮肤、肾脏和胃癌。这些发展中的具体方法旨在阐明TIL细胞类型的组成及其与临床结果的相关性。例如，成功生成的肿瘤浸润性B淋巴细胞（TIBs）已被发现可以预测转移性肾细胞癌（mRCC）患者的临床结果改善。另一项关于胃癌TIL治疗的研究表明，TIL的组织学亚群与不同的存活时间相关。目前，TIL治疗的临床转化仍处于初步阶段，缺乏长期临床观察。然而，初步成功表明有机会开发具有更有效分离和扩增方法的有希望的治疗性TILs，并可能与其他抗肿瘤疗法结合使用。 2.2.CIK细胞疗法 CIK细胞是具有混合T和NK细胞样表型的异质免疫效应细胞。它们是通过将人的PBMC或脐带血单核细胞与干扰素γ（IFN-γ）、抗CD3抗体、重组人IL-1和IL-2一起体外培养产生的。CIK细胞独特地表现出对肿瘤的主要组织相容性复合体（MHC）不受限制的靶向性，减少异体反应性，并能够攻击各种肿瘤类型。在体外培养过程中，CIK细胞分泌各种细胞因子以激活巨噬细胞、NK细胞和CD8+ T细胞的细胞毒性活性，从而直接抑制肿瘤细胞的生长并促进间接杀伤效果。CIK细胞诱导凋亡基因和抗肿瘤基因的表达，进行细胞毒性活动并促进肿瘤细胞凋亡。它们主要通过粘附分子淋巴细胞功能相关抗原-1/认知配体细胞间粘附分子-1（LFA-1/cam-1）与肿瘤细胞上的抗原结合的机制来实现肿瘤杀伤效果。这促进了MHC-I或MHC-II分子的表达，导致增强的呈递、激活、识别和直接杀伤肿瘤细胞。 激活的CIK细胞分泌各种细胞因子，包括IL-2、IL-6、肿瘤坏死因子α（TNF-α）、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）和其他细胞因子，不仅直接增强细胞毒性效果和抑制肿瘤细胞，还通过调节免疫系统间接杀死肿瘤细胞。主要由CIK细胞产生的IFN-γ增强了NK细胞、巨噬细胞和细胞毒性T淋巴细胞（CTL）的活性。它还可以促进肿瘤细胞上MHC-I分子的表达，导致CTL杀伤增加。最近的研究指出，CIK细胞分泌的IFN-γ可以促进慢性淋巴细胞性白血病（CLL）细胞上ICAM-1的表达，对细胞毒性效应细胞的凋亡诱导产生积极影响。肿瘤细胞的凋亡基因也可以被CIK细胞激活，因为这些细胞表达FasL，一种属于TNF超家族的Fas配体，它诱导肿瘤细胞凋亡。Verneris指出，某些肿瘤细胞（如黑色素瘤和卵巢癌）通过诱导表达FasL的淋巴细胞凋亡来逃避免疫清除，但它们对CIK细胞敏感。这是因为，在CIK细胞的诱导过程中，Fas敏感或激活的T细胞被IFN-γ等细胞因子的作用或激活诱导的细胞死亡机制选择性地消除。结合CIK细胞中高水平的抗凋亡基因表达，这些因素使CIK细胞能够耐受表达FasL的肿瘤细胞诱导的凋亡。 尽管存在复发和无反应性的担忧，CIK细胞的异质性使它们能够靶向并杀死各种肿瘤细胞。自1991年引入CIK细胞疗法以来，已有超过5,000名患有多种肿瘤类型的患者，包括肺癌、乳腺癌、脑癌和结肠癌等，参与了CIK细胞疗法。全球CIK细胞（或CIK细胞与DC联合）的临床试验已超过80项。CIK细胞的治疗潜力超出了它们与NKG2D的相互作用，包括抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）轴。与其他免疫疗法、常规化疗或放疗一起，CIK疗法表明了协同的抗肿瘤效果，正在发展中，是治疗癌症的一条令人鼓舞的途径。虽然临床前景看好，但一些公开讨论是必要的。与其他免疫细胞相比，CIK细胞输注后的毒性效应、最小化额外的支持性护理、确定与其他免疫疗法的优势、了解与CIK细胞在癌症微环境中的串扰的关键决定因素，以及在多个中心推广这种方法需要探索。 2.3.DC疫苗 操纵患者的自体DCs进行“疫苗接种”以对抗肿瘤组织是一种有前景的方法。DC疫苗涉及用TAAs（如肽、蛋白质、DNA/RNA或病毒）处理体外培养的DCs。DCs将摄取抗原，然后在仔细控制的培养过程中激活。DCs作为强大的抗原呈递细胞，对影响免疫系统起着至关重要的作用。虽然未成熟的DCs处理外来抗原，触发成熟和迁移到淋巴结，成熟的DCs可以在TME内促进肿瘤耐受，可能导致T辅助型2反应。 DC疫苗，通常采用体外成熟的自体单核细胞并用抗原冲击，已在多种肿瘤患者中显示出良好的耐受性和最小的毒性。然而，抗原特异性免疫反应的幅度和持续时间普遍较弱，限制了客观的临床反应。尽管在儿童肿瘤中的反应有限，正在进行的研究集中在增强疫苗生产的每一步上。策略包括扩大DC来源、提高免疫原性、优化抗原选择、开发新的免疫佐剂以及探索同时进行的免疫调节或化疗。 Sipuleucel-T是唯一获得FDA批准的自体DC疫苗，为有效的成人恶性肿瘤治疗提供了希望，特别是对于去势抵抗性前列腺腺癌。通过培养患者的PBMCs与一种由TAA（前列腺酸性磷酸酶（PAP））和GM-CSF组成的重组蛋白（PAP-GM-CSF）来生产。这种开创性的疫苗代表了DC疫苗领域的一个重要进展，展示了在成人和儿童恶性肿瘤中改善结果的潜在途径。在临床试验中，DC主要用于与CIK细胞、免疫检查点抑制剂（ICI）以及化疗和放疗结合的免疫疗法中以改善结果。研究表明DC能够激活自然杀伤T（NKT）细胞，或同时激活CD4+和CD8+ T细胞。 2.4.DC/CIK细胞疗法 当多种低风险的免疫细胞疗法一起使用时，可以实现积极的综合协同效应，特别是在DC和CIK的共同应用中尤为明显，它们是可适应和协同的。这种协同作用旨在增强身体对疾病的免疫反应。CIK细胞以其广谱的肿瘤杀伤效果而闻名，但由于缺乏特定的识别能力而受到限制。DC目前被认为是最有效的抗原呈递细胞，最近的研究表明CIK和DC之间的相互作用会在两个群体内部引起免疫刺激性表面分子表达的变化。实际上，与CIK细胞共同培养DCs发挥了互补作用，相互促进成熟，共同增加抗肿瘤活性，并展现出有希望的协同效应，即使在之前对CIKs有抵抗力且之前未与DCs共同培养的肿瘤细胞系上也是如此。DC分泌的细胞因子，如IL-2、IL-12和IFN-γ增强了CIK细胞的成熟，导致CIK细胞中CD3+、CD8+和CD56+亚群的水平增加。值得注意的是，DCs显著增加的IL-12分泌显著增强了CIKs的细胞溶解功能。此外，这种合作环境还减少了IL-10的分泌和调节性T细胞（CD4+CD25+ Treg细胞）的数量，减弱了它们对肿瘤免疫的抑制作用，并增强了CIK细胞的肿瘤杀伤效果。同时，CIK细胞增强了DCs的抗原呈递特异性和共刺激分子的表达，有助于整体增加抗肿瘤活性。此外，DC和CIK细胞的共同培养抑制了人类端粒酶逆转录酶（hTERT）蛋白的表达，抑制了端粒酶活性，并阻碍了肿瘤细胞的增殖。 基于上述机制，DC-CIK疗法以相互适应和协同为特点，已成为近年来肿瘤治疗领域的研究焦点。基础和临床研究迅速发展，并证明了在显著增强抗肿瘤免疫方面的有效性。尽管存在轻度移植物抗宿主病（GvHD）的担忧，试验经验表明结果是可控的。案例研究已经证明了安全性和提高的疗效。DC/CIK细胞疗法针对免疫系统的多个方面，从而形成了更全面的对抗疾病的方法。这在复杂情况或难治性恶性肿瘤中尤为有益，其中多种免疫功能障碍发挥作用。总的来说，低风险的免疫细胞疗法可以帮助增强免疫系统识别和消除有害实体的能力，从而改善健康结果。这些疗法的协同效应有潜力显著提高基于免疫的治疗的有效性，并为患者提供更好的结果。然而，评估和定制这些疗法的确切组合和剂量以确保其对个体患者的安全性和有效性至关重要。 3.高风险免疫细胞治疗技术的进步 高风险免疫细胞治疗使用自体干细胞、异体或异种细胞，或基因修饰细胞，所有这些细胞都需要进一步的操作和评估。这些治疗的设计非常适合其预期目的。这些治疗刺激针对肿瘤的新免疫反应，通常有潜力重新激活已有的反应。在这里，我们描述了高风险免疫细胞治疗中的特征设计、转染方法、细胞来源，以及克服抑制性肿瘤微环境（TME）的方法，包括CAR-T、T细胞受体-T（TCR-T）、CAR-NK和CAR-巨噬细胞（CAR-M）。此外，我们提供了对未来趋势的见解。 3.1.CAR的设计 CAR是工程受体蛋白，为免疫细胞提供了识别癌细胞表面特定抗原的新能力，从而可能触发免疫细胞消除癌细胞的潜力。当前研究表明，即使是对CAR结构的微小修改也可能会显著影响治疗效果。它通常由三个模块化域组成：细胞外域、跨膜域和细胞内域。 细胞外域：靶向的艺术。细胞外域包括一个用于目标结合的单链可变片段（ScFv）和一个铰链区域，通常在CAR工程细胞中的免疫球蛋白（Ig）样域铰链，并通过跨膜域锚定到细胞膜。通过CAR的细胞外域引入了驱动免疫细胞激活的新功能，包括T细胞、NK细胞和巨噬细胞。CAR工程免疫细胞能够识别癌症特异性靶标表位，不受MHC和共受体的限制，使它们在寻找和杀死癌细胞方面更有效。 CAR工程免疫细胞已经从针对单一抗原发展到针对两种不同抗原，以优化治疗阴性抗原癌细胞逃逸或抗原丢失的复发，并且结合任一抗原都将触发CAR工程免疫细胞的激活。这可以通过几种方式实现（图1A-C），例如将编码两个独立CAR分子的单个双顺反子向量转导到单个细胞中，或将编码双价CAR分子的向量转导到细胞中，或共同给药两种不同的CAR工程免疫细胞产品，或共同转导两个向量到单个免疫细胞中编码不同的CAR。这些方法对于B细胞淋巴性白血病特别有前景，尤其是对于复发或难治性B细胞急性淋巴性白血病（B-ALL），因为临床研究表明CD19/CD22共转导CAR-T细胞具有显著的疗效，以及CD19/CD22双特异性CAR-T细胞。同样，I期临床试验表明，双特异性CD20/CD19 CAR-T也可用于治疗复发和难治性B细胞恶性肿瘤患者，治疗28天后的总体反应率为82%，显示出治疗目的的安全性和有效性。此外，Wang等人表明，CD19/CD22双顺反子CAR-T与单特异性CD19或CD20 CAR-T细胞相比，在体外和体内表现出相当或更好的功能。 除了ScFv的优化，细胞外区域也得到了改进。与传统CAR直接作用于靶细胞不同，研究人员提出了一个新概念：模块化CAR（modCAR）。这种CAR-T（图1D、E）通常与其适配器一起工作，适配器的一端结合到细胞上，另一端用于识别和结合肿瘤表面抗原。适配器分子可以是单克隆抗体、抗体片段（图1D）、小分子或任何结构（图1E），只要能针对至少一个所需的抗原并介导目标与效应细胞之间的交联。它提供了一种高度灵活、可定制和通用的方法，以快速优化效应细胞活性，潜在地实现智能抗原靶向。 图1. CAR的设计策略。针对肿瘤的CAR设计示意图。(A) 通过将编码两个独立CAR分子的双顺反子载体转导到单个细胞中，可以生成双顺反子CAR工程细胞。(B) 通过将编码串联CAR分子的载体转导到细胞中，生成双价CAR。(C) 通过共同给予两种不同的CAR工程免疫细胞产品（上图）或共同转导两种编码不同CAR的载体到免疫细胞中（下图），实现双特异性，但产品将复杂且昂贵。可以使用抗体（D）或其他适配器（E）生成modCAR。(F) 设计装甲CAR以共表达分子，包括细胞因子和/或趋化因子，以增加效果和持久性。(G) SynNotch CAR通过添加分泌蛋白和结合剂，并利用特设计对机制执行AND、NOT和OR布尔逻辑门。这也可以通过特设计的转录因子和转录机制（H）实现。CAR：嵌合抗原受体；modCAR：模块化CAR。 装甲CAR细胞（图1F）旨在分泌细胞因子或其他分子，以帮助抵消肿瘤微环境（TME）的免疫抑制特性，潜在地提高CAR工程细胞的持久性和有效性。有时被称为第四代CAR细胞或TRUCKs（T细胞重定向用于抗原无限制的细胞因子启动的杀伤），它们为CAR靶向组织提供了一种多功能治疗，超越了传统CAR-T细胞的能力。TRUCK概念目前正在通过共表达分子如趋化因子配体或基于第二代或第三代CAR的细胞因子组合进行探索。其中，IL-7、IL-12、IL-15、IL-18、IL-23以及这些分子的各种组合正在早期阶段试验中。值得注意的是，IL-7和IL-15已被发现可以促进CAR-T细胞的增殖，而IL-12和IL-18增强了T细胞的效应能力。此外，表达特定分子的工程CAR-T细胞，如CCL-19或CCL-21，能够趋化其他免疫细胞或CAR-T细胞向附近的癌细胞移动。这增强了免疫细胞的渗透和CAR-T细胞的存活，从而提高了CAR-T细胞的有效性。 CAR设计中的最新发展是合成Notch（SynNotch）受体（图1G，H），它提供了一种精确的靶向策略，允许精确控制CAR工程细胞的激活，同时通过引入可诱导的开关来最小化非靶向效应。一个典型的案例使用了布尔逻辑和逻辑门的原理，当所有条件满足时，通过构象变化激活的共定位依赖的蛋白开关（Co-LOCKR）可以执行AND、NOT和OR布尔逻辑门。在体外已经证明了针对癌细胞的特异性，但在临床应用中仍面临各种挑战。 细胞内域：信号和细胞功能。细胞内域由一系列共刺激域组成，CAR的分类基于共刺激域的数量。第一代CAR仅由CD3ζ组成，而第二代CAR除了CD3ζ外还含有一个共刺激域，第三代CAR则涉及一个以上的共刺激域以及CD3ζ。 在T细胞中，第一代CAR已构建包含编码针对2,4,6-三硝基苯酚（TNP）抗体的可变区域的重组基因片段，这些片段被拼接到α或β T细胞受体（α或β TCR）的C区之一。转导T细胞后，这种结构可以稳定地表达在T细胞表面，并能够识别MHC非限制性的肿瘤细胞，但在临床试验中显示出较弱的抗肿瘤效果。第二代CAR-T利用T细胞激活的经典信号，并增加了一个共刺激分子，如4-1BB（也称为CD137）或CD28，这显著提高了CAR-T细胞的激活水平和增殖能力。临床数据支持接受第二代CAR-T细胞治疗的患者对其肿瘤负担有延长和有效的控制。新发现的共刺激分子包括可诱导的共刺激分子（ICOS）、OX40（也称为CD134）和CD40等。第二代CAR结构在临床实践中最广泛使用。第三代CAR-T细胞包含两个共刺激分子，导致增强的细胞毒性。在临床试验中，当共同给予淋巴瘤患者CD19导向的第二代CAR-T细胞（带有CD28共刺激域）和第三代CAR-T细胞（带有CD28和4-1BB）时，观察到更长的持久性和优越的扩张。然而，目前评估仅第三代CAR-T的临床数据有限。在一个研究者发起的试验中，HD-CAR-1，一种第三代CAR-T治疗，在成人复发/难治性ALL患者中进行了评估。在90天的研究期结束时，80%的患者实现了完全缓解。此外，最近的研究表明，配备有4-1BB和CD28共刺激域的CAR-T细胞增强了T细胞记忆表型，与仅有一种共刺激分子的细胞相比，表现出更好的增殖和细胞因子释放水平。 迄今为止，大多数涉及CAR-NK细胞的研究都使用了最初用于T细胞的CAR构建。已经开发了包含CD28或4-1BB共刺激域的第二代CAR-NK。最近的研究报告称，含有细胞内域的CAR-NK，包含4-1BB和CD3ζ，克服了抑制信号并诱导了NK细胞特异性，导致杀死CD19+ aALL细胞。然而，已经为NK细胞特别创建了新的CAR设计，这些不同的CAR构建对NK细胞的细胞毒性和细胞因子产生有不同的影响。研究表明，包含NK特异性共刺激域2B4（也称为CD244）的CAR-NK细胞对肿瘤细胞有显著增强的细胞毒性活性，诱导快速增殖，增加细胞因子产生，并减少凋亡。这表明，与NK细胞上的常规4-1BB CAR相比，NK细胞特异性激活信号在CAR性能中起着至关重要的作用。此外，利用不同的信号域，如CD3ζ、DAP10和DAP12的CAR构建，在原代NK细胞或NK92细胞系中表现出不同的抗肿瘤活性。具体来说，与包含DAP10域的CAR相比，具有CD3ζ信号域的CAR表现出优越的性能，而使用DAP12域的CAR优于包含CD3ζ域的CAR。 CAR-M细胞与CAR-T细胞具有相同的结构和代级分类，但其细胞内信号域的功能不同，主要是为了增强吞噬作用。CAR-M细胞能够直接利用CD3ζ细胞内域传递吞噬信号。Fc受体（FcRγ）的γ亚基和多个表皮生长因子样域蛋白10（Megf10）也可以作为细胞内信号域。最近的研究结果表明，添加一个串联的PI3K招募域可以增加对癌细胞的吞噬。CAR-M的第一个临床试验产品是第一代产品，包含CD3ζ作为其细胞内域，并且第一阶段的临床试验结果显示了有希望的初步安全性和有效性结果，并获得了FDA的快速通道指定。 4.提高基因转移方法的效率 在免疫疗法中引入核酸，包括基因表达和CRISPR基因编辑，是一个至关重要但具有挑战性的步骤。近年来，非病毒转染技术因其在克服与病毒载体生产相关的劳动密集和昂贵程序以及cGMP合规性方面的经济利益而越来越受欢迎。例如，转座子或移动遗传元素被用来实现高效和持久的转基因表达，在产生稳定的CAR-T细胞方面引起了极大的兴趣。此外，电穿孔或机械穿孔能够使免疫细胞如T细胞短暂表达基因组编辑核酸酶，例如CRISPR-Cas9的表达，并已在基于mRNA的人类T细胞修饰中进行了探索。这些非病毒转染技术在程序简单性、容量和吞吐量以及有利的安全概况方面提供了优势。 与非病毒转染相比，病毒转导方法在临床环境中是主流模式，并被广泛认为是转染困难细胞类型（如免疫细胞）的一种高效方法。常用的病毒载体，如腺相关病毒载体和腺病毒载体，不能整合到宿主基因组中。然而，逆转录病毒载体和慢病毒载体可以整合，并且表现出高传递效率，使它们非常适合转导高度复制的细胞，如免疫细胞。Tecartus和Yescarta都是由Kite Pharma生产，依赖于γ逆转录病毒（GRV）载体将CAR构建体转导到T细胞中，而Kymriah则使用慢病毒（LV）载体进行转导。一般来说，γ逆转录病毒和LV系统经常用于将基因转移到T细胞中，研究表明它们通常可以获得30%-80%的转导效率。然而，安全性、效率和便利性问题是必须考虑的问题。 与T细胞相比，病毒基因传递到原代NK细胞已被证明既具挑战性又效率低下，可能由于NK细胞的固有特性。研究表明，使用逆转录病毒载体成功转染原代扩增的NK细胞，单轮转染效率范围为27%-52%，经过两轮转染后为47%-75.4%。虽然逆转录病毒已被广泛用于最近的临床前和临床研究中生产CAR-NK细胞，但缺乏有效的基因转移方法仍是NK细胞在免疫疗法中使用的主要障碍。此外，与逆转录病毒转染相关的插入性突变和对原代NK细胞活性的有害影响是临床应用中的主要限制。与逆转录病毒载体相比，基于慢病毒的转染具有较低的遗传毒性和插入性突变风险。然而，原代NK细胞在LV转导中的效率很低，需要多轮转染。最近，Bari等人表明，用狒狒包膜糖蛋白变体（BaEV-LV）伪型的LV载体的转导效率比用泡状口炎病毒糖蛋白（VSV-G-LV）伪型的高20倍以上，这是用于伪型LV载体的第一种且仍最广泛使用的糖蛋白。他们通过这种转染方法成功地在约70%的不同供体的原代人类NK细胞中表达了CD19-CAR，这些CD19-CAR NK细胞有效地且特异性地根除了CD19阳性肿瘤细胞。用BaEV-gp伪型的慢病毒带有肿瘤特异性CAR在NK92细胞中的转导率几乎达到100%，在iPSC衍生的NK细胞或激活的原代NK细胞中为50%-80%。因此，它可能是NK细胞CAR基因转移的有希望的载体。此外，用长臂猿白血病病毒（GaLV）包膜蛋白伪型的慢病毒可以有效转导原代NK细胞。电穿孔和脂质体介导的转染方法也用于在NK细胞中传递外源基因。与上述病毒转染相比，这些方法提供了更快的转基因表达、降低的凋亡水平、更小的个体间差异和更高的基因转移效率。然而，外源DNA通常不会整合到目标细胞的基因组中，导致转基因表达在转染后约3-5天内下降。但当与DNA整合技术结合时，这些方法可以产生稳定转染并表达转基因的细胞。DNA转座子是可以通过切割和粘贴机制在载体和染色体之间有效转座的移动DNA元素。PiggyBac（PB）和Sleeping Beauty（SB）是迄今为止最常用的两种转座子系统，与其他系统相比，在哺乳动物细胞中显示出最高的转座活性。通过将含有CAR的质粒和转座酶DNA转染到iPSC中，成功地稳定创建了表达CAR分子的CAR-iPSC-NK细胞。 与病毒载体相比，转座子系统提供了许多好处，例如较低的免疫原性、增加的生物安全性、降低的生产成本，以及能够转移基因片段，其载荷能力接近9-10 kb。这些优势使其成为将CAR整合到NK细胞基因组中以实现持久表达的一个有力选择。然而，要充分利用转座子系统对原代NK细胞进行转染，需要进行优化，例如通过电转染提高转导效率和细胞活性。 巨噬细胞比其他造血系统中的细胞更难转染和抵抗遗传操作，因为它们有能力识别并响应外来核酸。Bobadilla及其同事创建了一种基于HIV-1的慢病毒系统，该系统通过感染时Vpx诱导的SAMHD1降解，已被证明可以有效传递转基因到骨髓细胞。Klichinsky团队使用复制缺陷的嵌合腺病毒载体Ad5F35有效地传递CAR到巨噬细胞，并同时促进M1表型的表达，最终增强了肿瘤杀伤活性。这些结果强调了基因工程巨噬细胞在癌症免疫疗法中的潜力。与生成CAR-NK细胞的方法类似，转座子系统也被用来将感兴趣的基因整合到宿主基因组中。 4.1.新型细胞来源方法推动现成的免疫细胞治疗产品 迄今为止，所有商业批准的癌症免疫细胞疗法都依赖于自体使用，即使用的材料是患者自己的细胞。尽管这种方法已证明有效，但存在一些重要的限制，例如在处理快速癌症进展的患者时制造的不良等待时间，由于患者T细胞功能障碍可能导致的生产失败，与健康淋巴细胞一起提取的恶性白血病细胞污染产品的风险，高生产成本，标准化的复杂性，以及再剂量机会的限制。因此，当前的研究工作集中在开发同种异体疗法上，以克服自体疗法的限制。特别是，CAR-NK是一种有前景的同种异体细胞治疗，对实体瘤和血液系统恶性肿瘤均无重大毒性副作用。它是一种更简单、可再注射、更实惠的通用治疗。 然而，当前的治疗尚未显示出强大的疗效和/或长期持久性，并且NK细胞更难进行工程改造。CAR-NK细胞的研究主要在临床前和早期临床试验阶段，很少有临床试验报告。尽管如此，通用的同种异体CAR-NK细胞在癌症治疗中仍显示出巨大潜力。 目前，CAR-M主要是自体疗法，但“现成的”同种异体CAR-M已经出现并正在进行进一步研究。 在开发同种异体方法时，必须系统地解决最重大的风险：免疫排斥和GvHD（移植物抗宿主病）的发展。免疫排斥可能限制治疗的效力，因为接受者的免疫系统可能会排斥移植物。GvHD可能是致命的，由供体T细胞内源性的αβ TCR复合体识别宿主肽-人类白细胞抗原（HLA）复合体引起，导致组织损伤。为了解决同种异体风险，可以采用两种主要策略。第一种是在供体αβ T细胞上除了引入CAR转基因外，还进行额外的遗传修改。另一种是选择替代的细胞来源或亚群，如诱导多能干细胞（iPSCs）、脐带血（UCB）细胞、γδ T细胞、记忆T细胞亚群、病毒特异性T细胞（VST）等。 为了消除内源性αβ TCR介导的GvHD，最直接的方法是破坏编码T细胞受体恒定（TRAC）α链的基因。Eyquem等人开发了一个案例，通过腺病毒转染和CRISPR-Cas9敲入技术将CAR构建体整合到TRAC位点，同时诱导CAR表达和TCR失活。与随机整合相比，CAR表达可以由内源性TCR启动子调控，并在暴露于抗原时模仿TCR转录，防止恒定的和过度的T细胞激活，这可能导致T细胞分化和耗竭。此外，研究结果表明，这些TRAC-CD19 CAR-T细胞在ALL小鼠模型中显示出比用逆转录病毒编码的CAR的T细胞更大的抗肿瘤效力。 此外，除了CRISPR-Cas9，基因编辑技术，如TALENs和锌指核酸酶（ZFNs），也被发现在消除TCR表达以创建“通用”供体T细胞方面有效。然而，尽管TCR缺失的CAR-T细胞降低了GvHD的风险，但其长期持久性较短，可能是由于免疫排斥。因此，科学家们敲除了β2-微球蛋白（B2M）基因以限制HLA类I分子的表达。这种方法防止了异体CAR-T细胞通过它们的TCR被识别为外来物，但仍然容易受到宿主NK细胞的溶解。因此，一项研究使用突变的B2M融合蛋白来解决这个问题。为了在激活的异体CAR-T细胞生产过程中提高HLA-II消除的效率，一些学者提出抑制CIITA或HLA-DRA、HLA-DQA和HLA-DPA基因。 iPSCs具有无限的增殖和分化潜力，使它们成为创建众多同质HLA组合库的理想资源。通过从库中选择一个HLA匹配的iPSC来源，可以最小化宿主和移植物之间CAR-T细胞的免疫排斥风险，但必须进行严格的质量控制以确保安全，因为未分化的、增殖的iPSCs可能引发不良结果。Wang等人生成了缺乏HLA-I/II、B2M和CD155的低免疫原性iPSC衍生的CAR-T细胞。 研究通过体内发挥效应功能证明了它们抑制肿瘤进展的有效性。此外，iPSCs也为生产满足临床需求的CAR-NK和CAR-M细胞铺平了道路。与分化的NK细胞或巨噬细胞相比，iPSCs可以更有效地被工程化以稳定表达CARs。Li等人通过在培养基中添加各种细胞因子和促分化蛋白来分化CAR转染的iPSCs为CAR-NK细胞。这些iPSC衍生的CAR-NK细胞在体外和体内都显示出强大的抗肿瘤活性。Zhang等人建立了一个骨髓/巨噬细胞分化协议，诱导CAR-iPS向骨髓细胞系分化，成功产生了足够的CAR-iMac细胞（iPSC衍生的CAR-M细胞）。然而，当在小鼠模型中测试时，CAR-iMacs的有效性有限。总的来说，iPSC衍生的工程免疫细胞的发展涉及复杂的生产程序，需要精确的细胞产品制造和质量保证，以支持更广泛的临床应用。 γδ T细胞表达TCRγδ并以HLA独立的方式识别恶性细胞。它不需要消除TCR表达或信号，并且GvHD的风险低或不存在。研究表明，γδ CAR-T细胞显示出与传统的αβ CAR-T细胞相似或更大的细胞毒性效应，并且在体内没有观察到GvHD。然而，它们在体外的细胞毒性能力持续性较差。此外，针对CD20的γδ CAR-T细胞在B细胞淋巴瘤的动物模型中取得了有希望的结果，目前正在进行第一阶段的临床试验。 脐带血（UCB）提供了一个容易获得的NK细胞和同种异体T细胞来源。它们富含γδ T细胞和造血干细胞（HSCs），尽管总细胞数量有限。UCB衍生的CAR-T细胞在体内显示出增强的肿瘤抑制作用，减少了IL-10的分泌，并降低了调节性T细胞（Tregs）的比例，表明了改善的治疗潜力。Van Caeneghem等人从脐带血中分离出CD34+ HSCs，然后生成CAR-T细胞。这些CAR-T细胞具有原始表型（CD45RA+ CD62L+），并且不表达TCRαβ复合体，显著降低了GvHD的风险，并有效地消除肿瘤细胞。 记忆T细胞的特征是CD45RA−CD45RO+表型，它们不太可能发展为GvHD，也不太可能迁移到表现GvHD的器官。研究表明，T记忆干细胞（TSCM）和中央记忆T细胞（Tcm）与它们的分化对应物相比，具有优越的增殖和干细胞潜力，并且在T细胞转移后的临床研究中表现出高扩张和持久性。 VSTs拥有能够识别病毒抗原的TCR，如巨细胞病毒（CMV）、Epstein-Barr病毒（EBV）等。经过CAR改造的VSTs在实体瘤中显示出有希望的结果，但与CARs相比，工程化针对肿瘤的转基因TCR VSTs更具挑战性。在肿瘤细胞中表达EBV相关抗原的霍奇金淋巴瘤患者中，输注CAR-VST细胞取得了良好的耐受性和缓解率。针对HER2的CAR-VST细胞产品在CMV血清阳性和进行性胶质母细胞瘤患者的第一阶段临床试验中显示出既安全又临床有效。值得注意的是，可以建立VST库，以覆盖大多数患者，并促进CAR-T或TCR-T重定向到肿瘤的临床使用。 PBMCs通常来自外周循环或脐带血等。它是临床目的的主要NK细胞来源。PBMC衍生的NK（PB-NK）细胞可以从HLA匹配和不匹配的供体中分离出来，扩大了潜在供体池。通常，它们显示出成熟的表型，增殖能力降低，细胞毒性增加，没有GvHD的风险。Töpfer等人已经证明，表达CAR的NK细胞系YTS以及PB-NK细胞可以成功地重定向针对前列腺干细胞抗原（PSCA）阳性肿瘤，导致大部分治疗小鼠的肿瘤被完全根除。一种短暂表达针对间皮素的mRNA CAR，MCY-M11的CAR-PBMC细胞产品已进入临床试验，它是一种混合产品，包含不同的CAR工程T细胞亚群、单核细胞和B细胞群体，展现出理想的功能和免疫表型特征。 NKT细胞，也称为CD1d限制性T细胞，是一类同时具有T细胞和NK细胞特性的异质性T细胞群。这些细胞主要识别非多态性CD1d分子，这是一种结合自身和外来脂质以及糖脂的抗原呈递分子。I型NKT细胞或称为iNKT细胞不具有HLA限制性，可能作为通用供体细胞发挥作用，但其在体内的持久性尚未知晓。研究表明，CAR19-iNKT细胞表现出抗淋巴瘤活性，并且具有增强的消除脑淋巴瘤的能力。另一种异体NKT细胞，表达带有CD28和IL-15的抗CD19嵌合受体，目前正在进行临床试验，针对复发或难治性B细胞恶性肿瘤患者（NCT03774654）。 4.2.改善肿瘤微环境以增强治疗性免疫细胞的效果 免疫细胞治疗实体瘤的效果受限于低持久性和注入后的不充分增殖，这在很大程度上归因于免疫抑制微环境，它不是被动的旁观者，而是癌症进展的积极推动者。肿瘤细胞居住在这个由浸润和驻留宿主细胞（如T细胞和巨噬细胞）、分泌因子（如IL-10和转化生长因子-β（TGFβ））以及细胞外基质（ECM）组成的异质微环境中。这些组分可以相互作用，为恶性细胞的生长、迁移和转移创造支持性环境，从而逃避免疫系统和肿瘤特异性细胞毒性T细胞。为了根除肿瘤，科学家们开发了几种策略来促进CAR工程或TCR工程治疗性免疫细胞向癌症焦点的迁移和渗透，包括利用趋化因子受体如CCR2、CXCR2、CCR4、CXCR4等。这些研究表明，CAR-T、TCR-T和NK细胞显示出增加的肿瘤渗透率，导致肿瘤退缩和增强的抗肿瘤效果。然而，将基因工程免疫细胞渗透到肿瘤中只是抗癌的第一步。有时，可能需要直接转化方法来修改免疫抑制微环境。使用免疫检查点抑制剂，如抗PD-1、抗PD-L1抗体和抗CTLA4抗体，可以改善免疫抑制肿瘤微环境。然而，它可能导致药物抗性的出现、T细胞耗竭和复发，有时甚至会导致危及生命的毒性。在肿瘤微环境中阻断TGF-β信号是另一种提高检查点抑制剂效果和增强抗肿瘤反应的方法，因为它在肿瘤信号、重塑和代谢中起着至关重要的作用。临床证据也表明TGF-β信号与对检查点阻断剂无反应的患者之间存在相关性。为了解决这个问题，已经开发了双功能抗体-配体陷阱，使用针对CTLA-4或PD-L1的抗体与TGFβ受体II外域（TGFβRIIecd）融合。它可以在肿瘤微环境中隔离TGF-β，耗尽调节性T细胞，并促进CTL共刺激。此外，通过转导优势负性TGFβ受体-II（dnTGFβRII），开发了对TGFβ有抵抗力的肿瘤特异性T细胞，并已在动物模型和临床研究中显示出治疗益处。另一种新策略是利用肿瘤微环境中高浓度的免疫抑制信号分子，通过引入嵌合开关受体（CSR），如PD-1:CD28、TIGIT:CD28、CTLA-4:CD28、TGF-βRII:4-1BB、Fas:4-1BB。CSR由PD-1、CTLA-4或TGF-βRII的细胞外域和CD28或4-1BB的细胞内域组成。T细胞与CSR一起被转导，与CAR或TC共表达，以产生工程化CTL。这些工程化CTL仍然与肿瘤细胞上的免疫抑制分子相互作用，但通过细胞内域传递共刺激信号而不是抑制信号。最近，这一策略已经进行了临床测试。这些工程化细胞被发现能有效克服免疫抑制肿瘤微环境，例如分泌更多的IFN-γ，积聚在肿瘤中，并展现出优越的抗肿瘤功能。细胞外基质为各种抗癌疗法创造了物理屏障。然而，巨噬细胞在调节ECM和展示肿瘤归巢行为方面发挥着关键作用。CAR工程巨噬细胞被证明能主动迁移到肿瘤部位，可以作为药物递送系统在抗原特异性环境中局部递送细胞因子和/或细胞毒性物质，显著改变免疫抑制肿瘤微环境，并通过吞噬作用消除肿瘤细胞。张等人使用CAR修饰的巨噬细胞解决了ECM引起的免疫细胞渗透不足的问题。体外研究表明，CAR-147巨噬细胞能够重塑肿瘤的ECM，诱导CD3+ T细胞渗透，并提高肿瘤微环境中IL-12和IFN-γ的水平，最终展现出抗肿瘤效果。 4.3.临床研究进展 从临床进展的角度来看，自2017年FDA批准首个CAR-T细胞疗法产品以来，全球已有10个CAR-T产品获得批准（补充表1）。自2013年以来，CAR-T、CAR-NK和TCR-T疗法的临床研究迅速增加，到2022年CAR-T细胞疗法的数量达到258例，值得注意的是，2023年的数据来自1月至10月（图2A）。从国家角度看，高风险细胞疗法的临床研究主要分布在美国和中国，占全球研究的80%以上（图2B）。CAR-T疗法的主要临床治疗靶点是CD19、CD22、CD20和B细胞成熟抗原（BCMA）。在血液肿瘤中，增长最快的适应症是淋巴瘤和骨髓瘤。目前，TCR-T有一种治疗产品在市场上，用于转移性葡萄膜黑色素瘤。总的来说，TCR-T在实体瘤中的进展速度比血液肿瘤快（图2C）。TCR-T的靶抗原主要集中在MART-1、HPV16-E6、NYESO、HPV16-E7等。在病症方面，TCR-T的临床研究主要用于实体瘤的治疗。这些实体瘤大多与病毒感染有关，如与人类乳头瘤病毒（HPV）感染相关的宫颈癌。此外，TCR-T在头颈、肝脏和结肠癌症的临床研究正在迅速进展（图2C）。就CAR-NK病症而言，血液肿瘤仍然是进展最快的，其中淋巴瘤病症的进展速度更快（图2C）。 图2. CAR-T、TCR-T和CAR-NK疗法的临床试验。临床试验数据统计。(A) 2018年至2023年细胞疗法临床研究的数量，分为CAR-T、TCR-T和CAR-NK几组。(B) 按国家分组的细胞疗法临床研究数量，同样分为CAR-T、TCR-T和CAR-NK几组，Y轴在50到450之间中断。(C) 针对不同适应症的细胞疗法药物的临床进展，细胞疗法药物的分组与(A)相同，适应症分为液体和固体肿瘤两组。原始数据下载自https://classic.clinicaltrials.gov/，更新至2023年10月30日。CAR-T：嵌合抗原受体T细胞；CAR-NK：嵌合抗原受体自然杀伤细胞；CNS：中枢神经系统；HPV：人乳头瘤病毒；TCR-T：T细胞受体T细胞。 CAR-NK的临床治疗靶点主要是血液肿瘤的CD19、CD22和BCMA，以及实体瘤的PSMA、HER2、ROBO1和MUC1。总的来说，TCR-T和CAR-NK仍处于早期临床开发阶段。到目前为止，CAR-M的临床研究仍处于起步阶段，只有一个I期临床试验（NCT04660929）。图2的数据可从补充表2获得。 5.结论与展望 免疫细胞治疗在肿瘤治疗中变得越来越重要。与替代免疫治疗方法（如免疫检查点抑制剂和细胞因子）相比，免疫细胞治疗表现出了优越的疗效、特异性，并倾向于引起可接受的副作用。当作为某些癌症的独立治疗时，特别是采用性T细胞转移疗法，在血液系统恶性肿瘤如白血病和淋巴瘤中显示出了显著的成功。然而，由于免疫抑制肿瘤微环境、肿瘤异质性、靶标抗原表达低等因素，一些实体瘤对单独的免疫细胞治疗更具挑战性。在许多情况下，转向另一种免疫细胞治疗或将免疫细胞治疗与其他治疗策略（如化疗、放疗、其他免疫治疗或靶向治疗）结合起来被认为是有益的，可以通过不同的机制增强整体治疗效果。目前，全球已有10个CAR-T产品获批，而DC疫苗和TCR-T各有一个获批产品。在低风险免疫细胞治疗方面，TIL和DC疫苗在治疗实体瘤方面显示出了希望。此外，CIK治疗与其他免疫策略结合使用时显示出协同的抗肿瘤效果。这些方法通常由具有不同功能特征的异质细胞组成，在治疗相对高异质性的恶性肿瘤方面具有优势。另一方面，高风险免疫治疗如CAR-T和TCR-T通常是定向的和高度特异性的，使它们特别适合相对快速增殖的恶性肿瘤。在血液肿瘤中，CAR-T和TCR-T已经得到了临床验证，它们在治疗实体瘤方面的应用正在稳步进展。而基于其生物学特性，CAR-NK和CAR-M在治疗实体瘤方面具有固有优势。TCR-T专注于特定的肿瘤相关抗原和新抗原，使它们在外来抗原如病毒相关恶性肿瘤方面受益。研究人员目前正在努力突破包括CAR-T在内的细胞治疗技术的瓶颈。新的细胞来源和降低GvHD风险和其他风险的方法为“现成的”或同种异体细胞治疗创造了机会，这些治疗可以事先准备并在需要时轻松地给多个患者使用，实现更快的诊断和癌症治疗。此外，针对CAR的新颖设计最小化了对健康组织的损害，并与传统治疗相比减少了副作用。某些设计甚至为治疗实体瘤提供了可能性。此外，修改肿瘤环境和诱导记忆T细胞的策略使得实现长期效果成为可能。同时，由于这些疗法新颖、复杂和技术性，它们可能对公共卫生和个体患者构成以前未探索的风险。TIL细胞治疗、DC/CIK细胞治疗和DC疫苗被认为是低到中等风险。风险因素包括生产中使用的生物活性物质，如抗体、细胞因子、血清、生长因子和抗生素，以及在保存、冷冻、解冻和冷链运输过程中的产品稳定性和活性风险。此外，产品本身可能存在固有风险，如不完全去除肿瘤细胞或其他不需要的细胞，以及与归巢、植入、迁移和增殖相关的潜在并发症或降低的产品活性。然而，高风险免疫疗法需要更多的操作，使用基因修饰细胞、自体干细胞或同种异体或异种细胞，这需要额外的评估。在临床上，这些疗法有时可能引发细胞因子风暴和细胞因子释放综合征（CRS），这两种都是危及生命的全身性炎症综合征。因此，这些产品的风险管理考虑相应更具挑战性。必须仔细评估产品与患者相互作用产生的即时和延迟影响的潜在风险。这些风险包括不需要的免疫原性及其相关效应，包括CRS、GVHD、移植物排斥、过敏反应、超敏反应和免疫缺陷。此外，评估与患者细胞的预期和非预期遗传修饰相关的潜在风险也很重要，包括细胞功能、细胞凋亡、生长或分化的变化、插入性突变或遗传毒性以及恶性转化的可能性。然而，准确评估免疫细胞治疗的风险仍然具有挑战性。一些真正的风险超出了预期或在临床前研究中没有被揭示。重要的是要理解风险在临床研究中无处不在，它被定义为在特定时间框架内发生不利结果的可能性。评估可接受的免疫细胞治疗风险水平涉及权衡各种因素，而不仅仅是绝对风险，而是可能随之而来的潜在治疗益处。与患有较轻微肿瘤或癌症适应症且存在适当治疗方法的患者相比，患有危及生命的晚期或严重恶性肿瘤的患者可接受的风险水平要高得多。总的来说，免疫细胞治疗的技术障碍相对较高，创新动力强，技术发展多。近年来进展呈爆炸性增长。尽管CAR-T、TCR-T和DC疫苗已获批准，但其他免疫细胞治疗仍处于早期临床和临床前研究阶段。低风险疗法如TIL面临由于无法完全消除Tregs而有限的效力。CIK细胞治疗在获取和扩增方面遇到困难。DC肿瘤疫苗受到缺乏理想的肿瘤特异性抗原、TAA免疫原性弱、难以高效诱导免疫原性DC以及体外DC致敏方法的静脉回输无法有效激活DC分化和成熟的影响。高风险细胞治疗在克服肿瘤异质性的障碍方面仍有很长的路要走。CAR-T细胞仍面临效应T细胞耗竭、细胞因子风暴和免疫抑制微环境等挑战。TCR-T细胞治疗的挑战包括如何减少TCR不匹配和针对新抗原的最小选择。CAR-NK疗法正在经历遗传操作和细胞增殖困难。尽管CAR-M可能成为有希望的抗癌疗法，但它们尚未完全实现。临床研究需要确认肿瘤相关巨噬细胞在决定TME是否可以将肿瘤靶向CAR-M转化为肿瘤支持表型方面的高适应性。然而，免疫细胞治疗在抗癌疗法的未来开发中仍具有至高无上的潜力。人们普遍认为，快速的技术创新将使这些疗法成为高效的癌症治疗手段，显著改善治疗效果，推进人类医疗保健。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

2024医美与器械创新前沿华西论坛，与您共探药企转型之道，解锁消费医疗市场新机遇。10月12日，成都等您来！ 肿瘤免疫治疗旨在激活宿主的抗肿瘤免疫，形成肿瘤抑制微环境，最终实现消除肿瘤，提高患者的整体生存率。肿瘤疫苗是一种很有前途的抗肿瘤免疫治疗手段。针对肿瘤相关抗原（TAAs）或肿瘤特异性抗原（TSAs）的疫苗可以特异性攻击和摧毁这些抗原高水平表达的恶性肿瘤细胞，并通过免疫记忆实现持续的肿瘤杀伤。因此，与其他类型的免疫治疗相比，癌症疫苗理论上可以提供特异、安全和耐受性良好的治疗效果。 基于mRNA的核酸疫苗是在30多年前提出的，mRNA疫苗比传统疫苗有许多优点：与某些病毒疫苗不同，mRNA不会整合到基因组中，从而避免了对插入突变的担忧；mRNA疫苗可以以无细胞的方式制造，从而实现快速、经济、高效的生产。此外，单个mRNA疫苗可以编码多种抗原，增强针对适应性病原体的免疫反应，并能够以单一配方针对多种微生物或病毒变体。 mRNA疫苗是一类重要的癌症疫苗，能够编码和表达TAA、TSA及其相关细胞因子。mRNA癌症疫苗可以刺激体液免疫和细胞免疫，提高这些疫苗对不同疾病和患者的适应性。目前，多种mRNA癌症疫苗正在临床中进行开发，为癌症免疫治疗带来新的曙光。 1 mRNA疫苗制备策略 体外转录（IVT）mRNA模拟内源性mRNA的结构，有五个部分，从5ʹ到3ʹ包括：5ʹcap，5ʹ非翻译区（UTR），一个编码抗原的开放阅读框，3ʹUTR和一个PolyA尾。 与天然真核mRNAs一样，5′端帽结构包含一个7-甲基鸟苷核苷，5′端结构会在空间上保护mRNA不被核酸外切酶降解，并与翻译起始因子蛋白协同工作，招募核糖体以启动翻译。PolyA尾的长度间接调节mRNA翻译和半衰期。 编码区两侧的5′和3′UTR调节mRNA翻译、半衰期和亚细胞定位，来自高表达基因（如α-和β-珠蛋白基因）的天然UTR是合成mRNAs的首选。此外，UTR可根据细胞类型进行优化，如通过去除3′UTR中的miRNA结合位点和富含AU的区域，将mRNA降解降至最低。 mRNA疫苗的开放阅读框是最关键的组成部分，尽管开放阅读框不像非编码区那样具有可塑性，但可以通过优化密码子，从而在不改变蛋白质序列的情况下增加翻译。例如，CureVac AG公司发现人类mRNA密码子很少在第三位有A或U，从而用G或C替换开放阅读框第三位的A或U。并将此优化策略用于其SARS-CoV-2疫苗CVnCoV，目前正处于III期试验阶段。 为了最大化翻译，mRNA序列通常包含修饰的核苷，例如假尿苷、N1-甲基假尿苷或其他核苷类似物。修饰核苷的使用，特别是修饰尿苷，阻止了模式识别受体的识别，保证了翻译过程产生足够水平的蛋白质。Moderna和Pfizer–BioNTech SARS-CoV-2疫苗都含有核苷修饰。另一种避免模式识别受体检测的策略，由CureVac首创，使用序列工程化和密码子优化，通过提高疫苗mRNA的GC含量来消耗尿苷。 除了mRNA序列的改进外，在简化mRNA生产方面也取得了重大进展。临床上使用的合成mRNA通过使用噬菌体RNA聚合酶T7（也可以使用T3和SP6聚合酶）从DNA质粒在体外转录。另外，使用CleanCap的共转录封盖技术，简化了纯化步骤。 2 mRNA递送系统 由于mRNA较大（104–106Da）且带负电，因此无法通过细胞膜的阴离子脂质双层。此外，在体内，它会被先天免疫系统的细胞吞噬，并被核酸酶降解。因此，体内应用需要使用mRNA递送载体，该载体转染免疫细胞而不会引起毒性或不必要的免疫原性。目前，已经为此开发了许多基于创新材料的解决方案。 01 脂质纳米颗粒（LNP） 脂质纳米颗粒是临床上最先进的mRNA载体。截至2021年6月，所有正在研制或批准临床使用的SARS-CoV-2 mRNA疫苗均采用LNPs。LNP为mRNA递送提供了许多好处，包括制剂简单、模块化、生物相容性和较大的mRNA有效载荷容量。除RNA药物外，LNP通常包括四种成分，可电离脂质、胆固醇、辅助磷脂和聚乙二醇化脂质，它们共同封装和保护脆弱的mRNA。 可电离脂质与mRNA在酸性缓冲液中形成纳米颗粒，使脂质带正电荷并吸引RNA。此外，它们在内涵体的酸性环境中带正电荷，这促进了它们与内涵体膜的融合，将其释放到细胞质中。 DODAP和DODMA是第一种用于RNA输送的可电离脂质。通过设计提高DODMA的功效，产生了DLin-MC3-DMA。这是第一个FDA批准的药物制剂中使用的可电离脂质：siRNA药物patisiran（Onpattro）。除了有效且安全地递送siRNA外，DLin-MC3-DMA还用于mRNA的递送。 目前，学术界和工业界的许多团体使用组合反应方案来合成潜在的传递材料，这种方法产生了许多有效的脂质，包括C12-200、503O13、306Oi10、OF-02、TT3、5A2-SC8、SM-102（用于抗SARS-CoV-2的Moderna疫苗mRNA-1273）和ALC-0315（用于辉瑞疫苗BNT162b2）。 除了寻求提高疗效外，人们越来越关注提高药物的特异性，特别是对疫苗和免疫疗法的特异性。含有多环金刚烷尾的脂质11-A-M58，和含有环咪唑头的脂质93-O17S59，已被设计用于体内靶向T细胞。尽管机制尚不清楚，但这些脂质的环状基团对于靶向T细胞至关重要。 尽管电离脂质可以说是LNP最重要的成分，但其他三种脂质成分（胆固醇、辅助脂质和聚乙二醇化脂质）也促进了纳米粒子的形成和功能。胆固醇是一种天然存在的脂质，它通过填充脂质之间的空隙来增强纳米颗粒的稳定性，并有助于在摄取到细胞的过程中与内涵体膜融合。 辅助脂质通过促进有助于膜与内涵体融合的脂质相变来调节纳米颗粒的流动性并增强功效。最佳辅助脂质的选择取决于可电离脂质材料和RNA载体。例如，对于类脂质材料，饱和辅助脂质（如DSPC）最适合传递短RNA（如siRNA），而不饱和脂质（如DOPE）最适合传递mRNA 。DSPC已被用于FDA批准的SARS-CoV-2疫苗mRNA-1273和BNT162b2中。 LNPs的聚乙二醇化脂质成分由聚乙二醇（PEG）与锚定脂质（如DMPE或DMG）结合而成。亲水性PEG可以稳定LNP，通过限制脂质融合调节纳米颗粒大小，并通过减少与巨噬细胞的非特异性相互作用增加纳米颗粒半衰期。mRNA-1273和BNT162b2 SARS-CoV-2疫苗均含有聚乙二醇化脂质。 02 聚合物和聚合物纳米颗粒 尽管临床进展不如LNP，但聚合物具有与脂质相似的优势，能够有效传递mRNA。阳离子聚合物将核酸浓缩成具有不同形状和大小的复合物，可通过内吞作用进入细胞。 聚乙烯亚胺是研究最广泛的核酸传递聚合物。尽管其功效卓越，但由于其高电荷密度，其毒性限制了应用。此外，已经开发出几种毒性较小的可生物降解聚合物。例如，聚（β-氨基酯）在mRNA传递方面表现出色，尤其是对肺。 最近开发出了一种新型的含脂聚合物，称为电荷改变可释放转运体（CARTs），它能有效地靶向T细胞，操纵T细胞是非常困难的，因此，CART 是一种极具吸引力的传递材料，在mRNA疫苗和基因治疗领域具有巨大潜力。 03 其他递送系统 除了脂质和聚合物载体外，肽也可以将mRNA传递到细胞中，这要归功于其主链和侧链中的阳离子或两亲胺基（例如精氨酸），这些阳离子或两亲胺基与mRNA静电结合并形成纳米复合物。例如，含有重复的精氨酸-丙氨酸-亮氨酸-丙氨酸（RALA）基序的膜融合细胞穿透肽。 富含精氨酸的鱼精蛋白肽在中性pH下带正电荷，也可以浓缩mRNA并促进其传递。鱼精蛋白与mRNA复合物激活识别单链mRNA的Toll样受体（TLR7，TLR8）通路，因此，它还可以作为疫苗或免疫治疗应用的佐剂。CureVac AG正在评估一种含有鱼精蛋白的递送平台RNActive，用于黑色素瘤、前列腺癌和非小细胞肺癌的临床试验。 最后，基于角鲨烯阳离子纳米乳液也可以传递mRNA，这些纳米乳剂由油性角鲨烯核组成。一些角鲨烯制剂，如诺华的MF59，在FDA批准的流感疫苗中用作佐剂。MF59使注射部位的细胞分泌趋化因子，从而招募抗原呈递细胞，诱导单核细胞分化为树突状细胞，并增强抗原呈递细胞对抗原的摄取。角鲨烯基阳离子纳米乳剂从内涵体逃逸并将mRNA输送到细胞质中的机制尚不清楚。 3 mRNA疫苗的免疫作用 在注射mRNA癌症疫苗后，mRNA编码的蛋白质由核糖体合成，然后翻译后修饰以产生正确折叠的功能蛋白质，并呈现给免疫系统。该过程类似于RNA病毒感染和连续诱导保护性免疫反应的自然过程。外源mRNA进入细胞质导致与内源性mRNA类似的反应。 01 诱导先天免疫反应 宿主免疫系统通过PRRs检测病原体相关分子模式（PAMP）激活固有免疫反应。注射疫苗后，mRNA和传递系统成分将通过一系列PRR识别为外源性物质，导致Toll样受体（TLR）的激活，例如主要在抗原呈递细胞（APC）上表达的TLR3、TLR7和TLR8。外源性IVT mRNA可被细胞膜、内体以及细胞质中的各种PRR识别，并在刺激内源性免疫反应中发挥作用。 IVT mRNA的免疫原性主要由TLR7和TLR8介导。TLR7由B细胞、巨噬细胞和树突状细胞表达，并介导识别单链RNA（ssRNA）的过程。在细胞质中，其他一些PRR可以感应不同类型的RNA，例如dsRNA和ssRNA。 在非免疫细胞中，细胞质维甲酸诱导基因I样受体（RLR）和黑色素瘤分化相关基因5（MDA5）感应外源mRNA并调节细胞因子和趋化因子的产生，导致天然免疫细胞募集到mRNA注射部位。 02 诱导适应性免疫反应 mRNA疫苗接种后，编码的蛋白质将被翻译并呈递给免疫系统，并刺激适应性免疫。mRNA编码的蛋白质通过内吞或吞噬作用被APC吸收，它们可能形成吞噬小泡或含有抗原蛋白的内体，抗原蛋白通过树突状细胞上的主要组织相容性复合体呈递。 mRNA癌症疫苗通常编码在癌细胞上表达的TAA。这些TAA可进一步分为组织分化抗原（如MART-1）、肿瘤生殖系抗原（如NY-ESO-1或MAGE-3）、肿瘤细胞过表达的正常蛋白（如EGFR、MUC1、Her2/neu）、病毒蛋白（如EBV、HPV）和肿瘤特异性突变抗原（如MUM-1、β-catenin或CDK4）。此外，体细胞突变可能产生新抗原表位，码新抗原的mRNA疫苗被认为是最佳的候选癌症疫苗。 除了诱导T细胞免疫外，mRNA疫苗还诱导中和抗体。滤泡辅助性T细胞（Tfh）不仅对生发中心的发育至关重要，而且还驱动免疫球蛋白样转化、亲和力成熟和持久的B细胞记忆反应。这些细胞可以被mRNA疫苗激活，产生足够数量有效和持久的中和抗体。 4 mRNA癌症疫苗的临床开发 基于IVT mRNA的疫苗正在逐步开发，用于多种肿瘤治疗。目前，mRNA癌症疫苗根据最终产品类型可以分为编码TAA、TSA、细胞因子和抗体的癌症疫苗。 01 编码TAAs 的mRNA疫苗 在多项临床试验中，NY-ESO-1、酪氨酸酶、MAGE-A3、MAGE-C2和TPTE已被用作黑色素瘤mRNA疫苗的TAA。 BNT111是一种BioNTech FixVac平台开发癌症疫苗，该平台利用TAA的固定组合，旨在触发针对癌症的强大而精确的免疫反应。2021年底，FDA批准了BNT111快速通道资格，这是一种治疗晚期黑色素瘤的新型癌症免疫疗法，目前BNT111正在两项临床试验中进行研究。一项I期试验（NCT02410733）的中期分析报告表明，BNT111是有效的免疫疗法。随后的II期试验（NCT04526899）研究BNT111单独或与抗PD-1抗体cemiplimab联合的安全性和有效性。 CV9201和CV9202是两种针对非小细胞肺癌中表达的靶抗原的mRNA疫苗。临床试验（NCT00923312、NCT01915524、NCT03164772）表明，这两种疫苗耐受性良好，治疗后可以检测到免疫反应，从而支持在非小细胞肺癌中的进一步临床研究。 02 编码TSA的mRNA疫苗 编码多种突变抗原的mRNA疫苗是治疗突变诱发的恶性肿瘤的理想疫苗，这种类型的癌症疫苗进行的临床试验最多。随着下一代测序技术的发展，可以生产编码突变抗原的个性化mRNA癌症疫苗，这种个性化的癌症疫苗具有非常诱人的前景。 两种个性化mRNA癌症疫苗目前正在进行二期临床试验，即Moderna的mRNA-4157和BioNTech的BNT122（RO7198457）。mRNA-4157在单个mRNA分子上特异性筛选和编码20-34个新抗原，这取决于患者的癌症突变。一期试验（NCT03313778）的中期数据表明，mRNA-4157单药治疗或与PD-1抑制剂Keytruda联合治疗在所有测试剂量下都具有良好的耐受性，并引发新抗原特异性T细胞反应。该疫苗目前正在黑色素瘤患者进行二期临床试验（NCT03897881）。 BioNTech 的BNT122已经探索了与PD-L1抗体联合治疗的有效性和安全性，在黑色素瘤、非小细胞肺癌和大肠癌的II期临床试验已于2021上半年启动。 03 mRNA编码免疫刺激剂 理论上，mRNA癌症疫苗可以编码任何蛋白质，包括免疫刺激剂，其可以重塑肿瘤免疫微环境（TIME），克服肿瘤免疫耐受，这已成为mRNA肿瘤疫苗研究的一个重要方向。 在过去几年中，已经进行了编码细胞因子的mRNAs癌症疫苗的临床试验。目前，临床试验中只有七种候选产品，它们属于Moderna和BioNTech。2017年，Moderna开发了第一个表达mRNA编码的免疫刺激剂（mRNA-2416），其编码OX40L，一项1期临床试验（NCT03323398）评估了mRNA-2416单独和与durvalumab联合的安全性和耐受性。 已有的数据表明，mRNA-2416单药在所有剂量水平下都是可耐受的，没有报告剂量限制毒性，大多数相关不良事件为1级或2级。更重要的是，在PD-L1上调的时间内观察到广泛的促炎活性和有益的变化。目前，mRNA-2416瘤内注射已进入晚期卵巢癌的临床II期试验。 另一种mRNA疫苗mRNA-2752编码OX40L/IL23/IL36γ，早期的临床结果表明，mRNA-2752与抗PD-L1抗体durvalumab联合使用，在所有剂量下都具有良好的耐受性，并显示出抗肿瘤活性的迹象。 此外，BioNTech还开发了编码IL-12sc、IL-15sushi、GM-CSF和IFNα的BNT131，其作为单一疗法或与cemiplimab联合用于晚期实体瘤患者。 — 小结 — 几十年来，mRNA设计和核酸递送技术的进步，加上新抗原靶点的发现，使得mRNA疫苗成为对抗癌症的有力工具。mRNA疫苗的优势体现在mRNA癌症疫苗具有同时编码多种抗原的能力，以及非整合、高度降解和无插入突变潜力。IVT产生的mRNA不含细胞和致病性病毒成分，没有感染的可能性；在正在进行的临床试验中测试的大多数mRNA疫苗通常耐受性良好，注射部位特异性免疫反应很少。 快速生产是mRNA癌症疫苗的另一个优势，并且mRNA制造技术的成熟允许在短时间内生产新型疫苗。最近新抗原的发现和鉴定促进了个性化疫苗治疗的发展。BioNTech和Moderna进行的几项临床研究表明，在一些治疗多发性实体瘤的临床试验中，使用个性化疫苗具有强大的抗肿瘤免疫，开创了治疗性肿瘤疫苗的新时代。我们有理由认为，mRNA疗法将可能改变现代医学的疫苗接种方法以及癌症免疫疗法。 参考文献： 1. mRNA Vaccines: The Dawn of a New Era of Cancer Immunotherapy. Front Immunol.2022; 13: 887125. 2. mRNA vaccines for infectious diseases: principles, delivery and clinical translation. Nat RevDrug Discov. 2021 Aug 25 : 1–22. 3. Recent advances in mRNA vaccine technology. Curr Opin Immunol. 2020 Aug;65:14-20. 同写意媒体矩阵，欢迎关注↓↓↓

TIS2024第四届自免疾病细胞疗法与干细胞疗法论坛重磅来袭，点击图片查看重磅嘉宾，合作详询：王晨 180 1628 8769 （扫码立即报名获取TIS2024免费票） 肿瘤免疫治疗群雄并起，TCR疗法在实体肿瘤治疗中展现出了巨大潜力。随着TCR蛋白药Kimmtrak (tebentafusp)和TCR-T细胞药Tecelra (Afami-cel)的陆续上市，TCR疗法终于全面进入商业化阶段，开启肿瘤免疫治疗新篇章。 ——维渡纵横 作    者  |  郭维；郭允乐 来    源  |  维渡纵横 微    信  |  Yunle_G 刊    号  |  Vol.116 目   录 [向上滑动阅览]              1. TCR功能结构和工程化              2. TCR抗原筛选技术简介              3. TCR疗法的靶点分布情况              4. TCR疗法的药物形态分类              5. TCR疗法的临床研究进展              6. TCR疗法的生产工艺研究              7. TCR疗法的的产业链分析              8. TCR疗法的市场和商业化              9. TCR疗法的资本市场表现              10. 总结与展望 TCR疗法起源于1986年，巴塞尔免疫研究所Michael Steinmetz博士首次将一个T细胞的TCR基因转移到另一个T细胞中，从而赋予第二个T细胞相同的抗原特异性。2002年，Rosenberg团队率先从黑色素瘤组织中分离出肿瘤浸润淋巴细胞（Tumor infiltrating lymphocyte，TIL），体外扩增回输后特异性杀伤黑色素瘤细胞，但由于TIL的提取扩增工艺等难点，科学家开始探究能否在正常外周血淋巴细胞（Peripheral blood lymphocyte，PBL）上导入已知的抗原特异性TCR基因进行治疗。2004年，Rosenberg团队首次将靶向MART-1的自体TCR-T进行回输，参与试验的17名患者中有2人出现了肿瘤缩小，证明了基因改造TCR用于肿瘤治疗的可行性(Science 2006, 314, 126)，拉开了TCR疗法的帷幕[盘点TCR-T细胞疗法, 维渡纵横, 2021]。 TCR疗法已经演变成基于peptide-MHC（pMHC）识别为主的“TCR-T细胞疗法”、“TCR蛋白药”、“TCR类抗体药”三种疗法，其中，TCR-T细胞疗法领域于2024年8月1日获批一款上市，TCR蛋白药领域于2022年1月27日获批一款上市。 Vol.1 TCR的结构和工程化   TCR是T细胞表面的特异性受体，以非共价键与CD3结合，形成TCR-CD3复合物，通过识别并结合MHC呈递的抗原，从而激活T细胞，促进T细胞的分裂与分化。MHC（Major Histocompatibility Complex，MHC）即主要组织相容性复合体，是一组编码动物主要组织相容性抗原的基因群的统称，人类的MHC被称为HLA，可将细胞内蛋白分解后的片段呈现在细胞表面，TCR通过与MHC相结合来判断靶细胞是否正常，如果T细胞发现MHC呈现出的蛋白片段是变异的，就会杀死该靶细胞。 1.1 TCR功能和信号转导 TCR是T细胞表面的特异性受体，以非共价键与CD3结合，形成TCR-CD3复合物。TCR的作用是识别抗原，是T细胞表面的特征性标志。TCR基因重排能够形成约10E18种TCR序列，形成容量庞大的TCR库，赋予个体几乎是无限的抗原识别和应答能力，保证个体在多变环境中能和外来抗原(病原体)发生有效的免疫应答。在不同个体中同一TCR能够识别相同pMHC，为TCR的通用性奠定了基础。 为了提供宿主保护，免疫系统将病原体和肿瘤等转化为短肽(抗原肽，最多24个残基)，与主要组织相容性复合体(MHC)结合形成“抗原肽-MHC分子复合物”(肽负载MHC ，pMHC)，呈递给T细胞受体（TCR）特异性识别，激活T细胞增殖并引发特定的细胞免疫应答。（注:人类的MHC被称为HLA，对应抗原肽-HLA分子复合物为pHLA） 图1. TCR-CD3与pMHC复合物 小贴士 MHC        主要组织相容性复合体(Major Histocompatibility Complex，MHC)是一组编码动物主要组织相容性抗原的基因群的统称。人类的MHC被称为HLA (Human Leukocyte Antigen，HLA)， 即人白细胞抗原，位于人6号染色体短臂上。小鼠MHC被称为H-2，位于小鼠17号染色体上。MHC分为MHC I、MHC Ⅱ、MHC Ⅲ三类。       MHCⅠ位于一般细胞表面上，提供一般细胞内部的特殊状况。比如该细胞遭受病毒感染，则将病毒外膜碎片之氨基酸链透过MHC提示在细胞外侧，可以供CD8+ T细胞等辨识以进行杀伤。       MHC Ⅱ大多位于抗原呈递细胞(APC)上，如巨噬细胞、DC等，提供细胞外部的状况，如组织中有细菌侵入，则巨噬细胞进行吞噬后，把细菌碎片利用MHC提供给辅助T细胞，启动免疫反应。        MHC Ⅲ 主要编码补体成分、肿瘤坏死因子(TNF)、热休克蛋白70(HSP70)、21羟化酶基因(CYP21A、CYP21B)等。         HLA是人类多态性最丰富的遗传系统，位于第6号染色体短臂6P21.31区，长3600kb。1999年已完成全部序列分析及基因定位，在此区域内共确认了224个基因座位，其中128个为功能性基因，其中39.8%和免疫功能相关。HLA基因根据其编码分子的分布与功能不同分为3个区，即Ⅰ类基因区，Ⅱ类基因区，Ⅲ类基因区。 TCR激活可促进许多信号转导级联反应，通过调控细胞因子产物、细胞生存、增殖和分化来最终决定细胞命运。 图2. TCR的激活过程 TCR激活的早期事件是由淋巴细胞蛋白质酪氨酸激酶 (Lck)对TCR-CD3复合体胞质一侧的免疫受体酪氨酸依赖性活化基序 (ITAMs) 的磷酸化作用。CD45受体的酪氨酸磷酸酶可调节Lck和其他Src家族酪氨酸激酶的磷酸化和激活。Zeta链相关蛋白激酶(Zap-70)受到招募，聚集至TCR-CD3复合体处并激活，从而启动对下游接头蛋白或骨架蛋白的招募和磷酸化。SLP-76被Zap-70磷酸化后促进招募Vav(一种鸟苷酸交换因子)、接头蛋白NCK和GADS以及一种可诱导T细胞激酶 (Itk)。磷脂酶Cγ1 (PLCγ1) 被Itk磷酸化后导致磷脂酰肌醇-4,5 二磷酸 (PIP2) 的水解，产生第二信使甘油二酯(DAG)和三磷酸肌醇(IP3)。DAG激活PKCθ和MAPK/Erk 通路，二者均可促进转录因子NF-κB活性。IP3触发Ca2+从ER释放, 并促使细胞外 Ca2+通过钙离子释放活化Ca2+ (CRAC)通道进入细胞。钙离子结合的钙调蛋白 (Ca2+/CaM) 激活钙调磷酸酶，后者通过转录因子NFAT促进IL-2的基因转录。取决于细胞类型和环境，这些通路中某些位点的反馈调节可得到不同结果。来自其他的细胞表面受体(如 CD28 或 LFA-1)信号的参与会进一步调控细胞反应。 图3. TCR信号转导 1.2 TCR的结构组成 根据TCR组分的不同，T细胞可被分为αβT细胞、γδT细胞 (1-5%外周血T细胞和粘膜部位的T细胞)，αβTCR和γδTCR虽然相似，但也有诸多不同。目前研究较多的是αβT细胞。 TCR分为可变区(V)和恒定区(C)，V区包括具有抗原结合位点的膜远端免疫球蛋白样结构域；C区是一个完整的基因片段，包括膜-近端免疫球蛋白样结构域、连接肽(CP)、跨膜区(TM)区、细胞质尾部 [J Leukoc Biol. 2020, 107(6):1045-1055]。TCRαβ和TCRγδ的V区表现出相似的总体结构，但C区却有很大差异。 αβTCR由α链和β链 (TCRαβ) 组成。α链和β链是跨膜糖蛋白，通过二硫键连接形成了抗原结合异二聚体 (图3, 蓝色)，即TCR；TCRαβ分为可变区(V)和恒定区(C)，V区中CDR(互补决定区)形成抗原结合位点，可进一步分为CDR1、CDR2、CDR3。TCR识别抗原的信号主要通过TCR-CD3复合体 (CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ，图3灰色) 转导，与CD3通信的β链中的FG环(FG Loop)显示为紫色。图3还标出了CD3糖基化模式和细胞内基序，如基于免疫受体的活化基序 ITAM (绿色) 、CD3ε中的富含脯氨酸的序列PRS (红色)。 γδTCR由γ链和δ链组成，形成抗原结合异二聚体 (TCRγδ，橙色) 。与αβTCR不同的是，CD3亚基排列不同、FG环短得多、配体结合亚基之间的二硫键位置不同、CD3糖基化模式也不同。 图4. 人类αβ和γδTCR的结构 αβTCR和γδTCR的配体识别涉及α、β、γ、δ链的CDR1、CDR2和CDR3，CDR3是配体结合TCR链中变化最大的区域。αβTCR的激活配体为pMHC，通常CD4+ T细胞识别MHC II类上呈递的肽，CD8+ T细胞识别MHC I类上呈递的肽。相反，大多数γδTCR无法识别MHC分子，其配体是多种多样的，缺乏共同性质，不像αβ TCR的配体那样遵循一般原则，包括脂质呈递、应激诱导的MHC样分子、其他非MHC细胞表面分子、可溶性蛋白质、小肽，导致γδTCR活化的分子机制复杂，这与大多数γδT细胞缺乏CD4和CD8表达高度相关。 图5. 人类αβ和γδTCR的激活机制 小贴士 CD4+/CD8+       T淋巴细胞分为CD4+和CD8+两大类。       CD4+ T细胞为辅助性T细胞，是免疫应答的“指挥官”，CD4+T细胞识别MHCⅡ类分子所提呈的外源性抗原肽，活化后主要分化为Th，主要通过膜表面的分子和所分泌的细胞因子与其它细胞交换信息，发号施令。       CD8+ T细胞为杀伤T细胞，CD8+ T细胞识别MHCⅠ类分子所提呈的内源性抗原肽，活化后主要分化为CTL，能够直接杀伤被微生物感染的宿主细胞，清除病原体在体内的“加工厂”和“避风港”。       CD4+ T细胞是不均一的细胞群，按其功能可包括"辅助性T细胞"和"迟发型超敏性T细胞"， 前者为调节性T细胞，后者为效应性T细胞。CD8+ T细胞也是不均一的细胞群，按其功能可包括"抑制性T细胞"和"杀伤性T细胞"，前者为调节性T细胞，后者为效应性T细胞。 αβTCR识别pMHC可能是使CD4/CD8偶联Lck靠近αβTCR所必需的，以启动信号转导。由于γδT细胞缺乏CD4和CD8，γδTCR可以形成大量游离Lck池，以诱导对任何抗原的反应信号转导。这表明，如果Lck未被CD4或CD8隔离，则可以正向选择识别除pMHC之外的抗原的αβT细胞。 图6. 野生型及嵌合型αβ/γδTCR的抗原结合异二聚体 来自αβTCR的区域以蓝色表示，来自γδTCR的区域以橙色表示。第1、3、5、6、7、8列中的TCR的天然配体是pMHC，而第2和第4列中的TCR天然配体是T22 (图5、图4)。这为TCR工程化提供了一定的设计基础。 1.3 工程化TCR技术 基于TCR的结构，利用工程化TCR的新技术有ImmTAC、TCRm、TRuCs、TAC、STAR/HIT等。 1.3.1 ImmTAC ImmTACs (免疫激动单克隆T细胞受体) 是使用工程化、可溶性、亲和增强的单克隆TCRs (mTCRs) 设计的。ImmTACs是一种新型的双特异性生物大分子，基本上是融合蛋白，结合了工程化的TCR靶向系统和单链抗体片段 (scFv) 效应器功能。Immunocore公司的核心技术就是ImmTACs，由工程化改造的TCR以及抗CD3的scFv组成，改造后的TCR显著提高亲和力，比抗原抗体亲和力高出9倍，特异性识别并结合肿瘤细胞表面的pHLA，抗CD3的scFv则能够吸引、招募T细胞至肿瘤细胞周围并激活T细胞发挥肿瘤杀伤作用。2022年美国和欧盟分别批准了Immunocore公司的全球首个TCR蛋白药物tebentafusp，用于治疗转移性葡萄膜黑色素瘤。2023年该药物销售额高达2.387亿美元(折合人民币约17.37亿元)，其中1.698亿美元来自美国，6760万美元来自欧洲，130万美元来自其它地区。 图7. 免疫激动单克隆T细胞受体(ImmTAC) 在ImmTACs的构建中， TCR能够识别来自人类白细胞抗原 (HLA) 呈递的细胞内靶点的肽。ImmTAC通过特异性靶向肿瘤细胞表面的HLA-肽复合物，并通过scFv抗体片段与CD3的相互作用促进T细胞介导的效应器功能。ImmTAC还以剂量依赖性方式激活CD8+ T细胞，并能有效地重定向和激活效应和记忆CD8+和CD4+细胞。ImmTAC通过分泌多种细胞因子表现出多功能反应，如TNF-α、IFN-γ、IL-6、MIP1α-β和IFN-γ诱导蛋白10。 选择合适的"靶抗原"是ImmTACs的关键，质谱技术、pMHC多聚体技术有助于识别合适的抗原。值得注意的是，TCR工程化T细胞也表现出非预期靶向毒性。总的来说，ImmTACs已被证明能增强TCR-T细胞的抗肿瘤反应，但其安全性有待进一步研究。 1.3.2 TCR mimic 除了ImmTACs，另一类双特异性T细胞结合蛋白称为TCR mimic（TCRm），使用两个抗体来源的单链抗体，通过多肽接头共价连接。一个scFv与癌细胞上的pHLA分子表位结合，而另一个scFv与T细胞上CD3复合体的成员结合。使用单链抗体作为抗原结合域的一个优点是，它们可以使用高通量技术如噬菌体和酵母展示文库从头产生。TCR mimic很小(~55 kDa)，使靶细胞和T细胞之间能够密切相互作用。TCR mimic的形式更多样，包括TCRm-CD3双特异性抗体形式、TCRm-ADC形式、CAR形式 [Front Oncol. 2022,12:1027548]。 TCR和TCR mimic的功能、结构和分子动力学比较表明，这两种抗原受体以不同的方式结合他们的靶标，这些差异部分归因于抗体的可变区与TCRs的取向不同。TCR通常结合pHLA复合体的广泛区域，以肽的核心为中心；许多TCR mimic偏向于HLA结合肽的末端或HLA螺旋。 图8. TCRmimic 1.3.3 TRuC TRuC (T细胞受体融合结构) 是一种与T细胞受体亚单位融合的抗体结合域，设计用于有效识别肿瘤表面抗原。TRuCs由靶向肿瘤相关抗原的特异性抗体融合到5个TCR亚基（TCRα、TCRβ、CD3ϵ、CD3γ和CD3δ）的胞外N-末端组成，为工程化T细胞提供了新的靶向特异性和HLA非依赖性靶细胞清除能力，可被相应的靶细胞激活。 图9. T细胞受体融合结构 (TRuC) 与第二代CAR-T细胞相比，该方法显示出更好的抗肿瘤效果。此外，TRuCs支配TCR复合体的全部信号机制，而CARs仅利用分离的CD3ζ胞内段的有限信号。 1.3.4 TAC TAC (T细胞抗原偶联剂) 是另一个工程化TCR细胞，以非MHC依赖性方式诱导更有效的抗肿瘤反应并降低毒性。TAC嵌合蛋白通过与CD3结构域的结合，从而形成TCR/CD3复合物并获得更多的T细胞应答。 图10. T细胞抗原偶联剂 (TAC) TAC受体的活性与CD3结合域的选择密切相关。例如，与UCHT1相比，来自OKT3（muromonab-CD3）的单链抗体具有较低的细胞因子产生和细胞毒性，这可能导致实质上不同的功能结果。与第二代CARs相比，TAC基因工程化的T细胞不仅有利于过继后在实体瘤的更大浸润，而且减少了T细胞在表达抗原的健康组织中的扩增和肿瘤外毒性。 1.3.5 STAR/HIT 合成TCR抗原受体(STAR)/HLA非依赖性TCR(HIT)是一种非HLA限制性受体，是一种异源二聚体，它用抗体的VH/VL结构域取代TCR的可变区(图11g)。由于TCR可变区与VH/VL结构域具有相似的大小和三维折叠，可以互换替换。通过保留TCR恒定域，STAR/HIT受体重新招募CD3信号分子的完整复合体。在抗原刺激后，STAR/HIT受体诱导TCR-like信号，使对抗原位点密度较低的靶细胞的反应性增强。 图11. 基于TCR疗法的分子结构汇总 Vol.2 TCR的抗原筛选技术   近年来，随着高通量测序技术、质谱流式细胞技术、计算生物学的快速发展，研究人员开发了多种TCR抗原筛选技术用于解析TCR及其特异性识别的抗原信息。 2.1 抗原筛选靶向TCR 肿瘤新抗原被不断挖掘并成为潜在靶点，目前已经开发出多种利用目的抗原来反向筛选肿瘤新抗原靶向的高特异性、高亲和力TCR [朱润棣，李贵登. 肿瘤精准靶向免疫治疗的关键：T细胞受体抗原筛选技术 [J]. 中国肿瘤生物治疗杂志. 2024, 31(1): 10-18]。 2.1.1 细胞杀伤/因子筛选法 酶联免疫斑点检测 (ELISPOT技术) 通过抗体检测T细胞受到抗原刺激后分泌的细胞因子的变化来评估TCR的抗原反应性，该方法操作简单，灵敏度高，但计数误差、抗体特异性等对筛选结构影响较大。 铬释放法是一种细胞毒测定方法，将T细胞与放射性同位素51Cr标记的靶细胞共培养，检测上清中靶细胞裂解后所释放的51Cr放射脉冲数，量化T细胞对靶细胞的特异性杀伤。该法51Cr半衰期较短，难以多次测定。 NFAT-荧光素酶筛选技术是在T细胞中表达活化T细胞核因子(NFAT)-荧光素酶报告基因，靶细胞与T细胞共培养时，抗原与特异性TCR的结合启动NFAT信号通路，激活下游荧光素酶的表达，荧光素酶催化底物的氧化反应，产生荧光，通过检测荧光强度来测定T细胞中荧光素酶活性，以此评估T细胞的抗原特异性。该法灵敏度高、结果重复性好、易于检测且相对安全。 2.1.2 基于pMHC筛选法 基于TCR-pMHC识别特异性，一系列TCR抗原筛选技术被开发出来，由于可溶性pMHC单体与TCR的亲和力较弱，通过pMHC多聚化可增强pMHC与TCR之间的结合稳定性，其中pMHC四聚体是由四个pMHC单体分子通过链霉亲和素聚合形成可溶性的四聚体，已成为鉴定抗原特异性T细胞的“金标准”，具有较高的特异性和敏感性。研究者们开发了多种携带不同标记、标签的pMHC多聚体技术用于高通量抗原特异性TCR的筛选，如荧光标记的pMHC多聚体、重金属离子标记的pMHC多聚体、DNA条形码标记的pMHC多聚体，其中DNA条形码标记的pMHC多聚体可实现高通量TCR抗原筛选。pMHC四聚体已广泛应用于疫苗研发、细胞治疗研究等，并具备诊断试剂开发潜能。但这一技术需要预先确定的抗原肽信息，需要合成多肽文库和pMHC多聚体组装。 图12. pMHC四聚体筛选法 2.1.3 微流控和单细胞测序筛选法 结合液滴微流控与单细胞测序技术，为TCR抗原筛选提供了新的策略和方向，同时获得了抗原特异性TCR的序列信息。微流控系统生成的微液滴可作为细胞反应容器，每个微液滴都是独立的反应单元，将T细胞与靶细胞包裹其中，避免细胞间相互干扰，独立地进行相互作用，再通过单细胞测序获得序列信息，大大提高了检测的灵敏度和TCR筛选通量。 2.2 TCR定向筛选抗原 单细胞测序和免疫组库测序的应用积累了大量双链配对的TCR序列数据库，如IMGT、IEDB、VDJdb等，为了获得这些TCR特异识别的肿瘤抗原信息，研究者利用噬菌体、酵母细胞、哺乳动物细胞、病毒等蛋白表达系统，构建出多种抗原表位展示文库以实现对TCR抗原的筛选，包括：酵母抗原展示系统、哺乳动物细胞展示系统、噬菌体抗原展示系统。 2.3 库对库双向筛选 个体TCR和肿瘤突变抗原的数量巨大，开发“抗原文库”对“TCR文库”的筛选技术具有重要的意义。 2.3.1 基于慢病毒感染的筛选技术 研究人员开发了一种携带荧光蛋白基因的突变型VSV-G假型慢病毒感染体系，使其失去与细胞表面低密度脂蛋白受体结合的能力，无法感染靶细胞，但保留了膜融合能力。通过在体外病毒生产过程中共表达特定表面结合蛋白的方式，将外源蛋白展示在病毒表面，成为以外源蛋白承担受体结合作用的病毒抗原展示系统。改造后的慢病毒通过其表面展示的靶蛋白与细胞膜上受体相互作用实现细胞特异性感染。将多种携带不同pMHC的突变型VSV-G病毒混合后，感染表达TCR文库的T细胞群，通过流式细胞术分离被感染的细胞并进行测序，同时获得配对的TCR和抗原的序列信息。 研究者进一步将“荧光蛋白”与“病毒结构蛋白”相融合，使得编码荧光蛋白的基因无需整合到细胞基因组中，两小时即可在被感染的细胞表面检测到荧光蛋白，缩短了筛选时间。 该法解决了仅能通过单一抗原或单一TCR筛选的局限性，实现了TCR文库与抗原文库的双向筛选。 2.3.2 YAMTAD筛选技术 酵母抗原展示系统具有较大的展示规模和筛选通量，可与流式细胞术有效结合。研究人员建立了酵母凝集介导的TCR抗原发现系统(YAMTAD)。在MATa酵母和MATα酵母中分别转入TCR-CDR3突变体-报告基因与pMHC突变体基因，同时转入交配启动的荧光报告子。将表达同源TCR与pMHC的酵母细胞共培养，经流式细胞术筛选双荧光的二倍体，通过NGS获得TCR与抗原的基因序列。该法具有更高的展示效率，并可达到10E8的筛选规模。YAMTAD系统对低亲和力相互作用的灵敏度较低，可能会遗漏部分TCR与pMHC的配对信息。 Vol.3 TCR疗法的靶点分布   上述多种TCR抗原筛选技术的升级将TCR疗法靶点选择范围进行了扩容，它不仅可以识别细胞表面抗原，同时也可以识别一些抗体、小分子难以靶向的细胞内抗原。 选择理想的抗原是提高抗肿瘤效率和降低相关毒性的关键，肿瘤特异性、免疫原性是选择抗原的首要考虑因素。人类肿瘤抗原主要分为肿瘤相关抗原（tumor-associated antigen，TAA）和肿瘤特异性抗原（tumor-specific antigen，TSA）两大类。表面抗原通常是TAA，正常组织也可以表达。而近90%的实体瘤靶向依赖于TSA。尽管TCR-T可以靶向所有肿瘤抗原，但迄今为止已确定的有足够安全性和有效性的靶点数量仍然有限，通常选择在肿瘤中高表达但在正常组织中低表达的靶抗原来限制潜在的脱靶效应，导致当下可用的靶点有限，主要集中在NY-ESO-1、MAGE、KRAS、AFP、HBV、HPV、PRAME、WT1、EBV等已被证实的抗原进行开发。 维渡纵横从公开信息总结TCR疗法的靶点分布统计如下表所示。 表1. TCR疗法的靶点分布统计 Vol.4 TCR疗法的药物类型   随着研究的不断深入，TCR疗法呈现出不同的药物类型，包括TCR-T细胞疗法、TCR蛋白药、类TCR抗体药物，并逐渐成为国内外药企的热门布局方向。 4.1 TCR-T细胞疗法 肿瘤浸润淋巴细胞（tumor-infiltrating lymphocyte，TIL）治疗是最早被研究并开展临床试验的，但TIL成分复杂且来源受患者个体情况的影响较大，极大地限制了TIL治疗的应用。为了获得靶点明确、作用专一且来源容易的肿瘤杀伤T细胞，研究人员利用病毒载体或非病毒载体途径开发出TCR-T细胞，通过向外周血来源的T细胞转入特异基因就能获得肿瘤特异性杀伤细胞。 图13. TCR-T治疗流程 TCR-T细胞临床治疗肿瘤的一般流程为①抽取外周血分离T细胞；②加入CD3/CD28磁珠和IL-2活化T细胞；③通过病毒载体等途径将TCR基因转导入活化的T细胞形成TCR-T；④TCR-T细胞继续培养扩增至合适数量；⑤将足够数量的TCR-T细胞经静脉回输给患者。 2024年1月31日，Adaptimmune宣布其靶向MAGE-A4的TCR-T细胞疗法Afami-cel的上市申请获得FDA受理并获得优先审评资格，2024年8月1日，Afami-cel获得批准，成为全球首个上市的TCR-T细胞药物，也是十多年来治疗滑膜肉瘤的第一个有效疗法。 4.2 TCR蛋白药物 相对于TCR-T细胞技术而言，TCR可溶蛋白是一种新型的双特异性或多特异TCR蛋白药物，是一种T细胞重定向分子，融合了“抗原识别域”和“T细胞激活域”两个功能结构，即工程化改造的高亲和力TCR和抗CD3(或CD28、4-1BB等)的scFv组成，改造后的TCR部分负责识别肿瘤pHLA复合物，T细胞活化抗体部分负责招募并活化T细胞发挥杀伤肿瘤作用。 与双特异性抗体通过结合靶细胞表面蛋白发挥作用[双特异性抗体掀起投资热潮. 维渡纵横, 2020]不同，TCR蛋白药物则是通过特异性结合提呈到靶细胞表面的pHLA，模拟了自然的T细胞识别过程，实现T细胞向肿瘤细胞的定向攻击。 图14. T细胞重定向免疫肿瘤药物的不同平台 图15.  T细胞重定向作用机制 (A)结合细胞表面蛋白方式; (B)结合pHLA复合物方式; (C)ImmTAC分子(结合pHLA复合物方式)和BiTE分子(结合细胞表面蛋白方式)的双特异性靶向 2022年1月27日FDA批准的全球第一款治疗不可切除或转移性葡萄膜黑色素瘤疗法Kimmtrak（tebentafusp）就是在天然的TCR上进行亲和力优化，通过识别靶抗原gp100-pHLA并结合T细胞上的CD3募集T细胞，来实现肿瘤杀伤作用，打破了眼睛来源黑色素瘤近40年的新药空窗期。 图16. TCR蛋白药Kimmtrak (tebentafusp) 图17. 首款TCR蛋白药作用机制 4.3 TCR类抗体药物 TCR类抗体（TCR mimic antibody, TCR mAb, TCRm）主要是通过筛选出亲和力和特异性远高于TCR的抗体来替代TCR，即将TCRαβ结构域替换为抗体片段的可变域，从而做到有效靶向胞内/外抗原。TCR类抗体拥有抗体的优良成药性以及较长的半衰期，兼具TCR独有的识别细胞内抗原的特性，是近年来逐渐兴起且拥有巨大发展潜力的新型免疫治疗大分子。 图18. TCR蛋白和TCR类抗体的结构差异 不同于传统抗体，TCRm抗体模拟TCR的识别方式靶向肿瘤细胞内抗原，识别肿瘤细胞表面上的肽/MHC复合物。并且TCRm抗体的作用机制广泛，可以触发ADCC、CDC、抗体依赖性细胞吞噬(ADCP)。此外，TCRm抗体还可以转化为嵌合抗原受体(CAR)结构，通过T细胞介导肿瘤细胞的特异性识别和杀伤。 Vol.5 TCR疗法临床进展   5.1 海外TCR疗法临床进展 根据维渡纵横和医药魔方数据，截至2024年8月5日，海外地区共计2个TCR疗法获批上市，分别为Immunocore的TCR蛋白药tebentafusp和Adaptimmune的TCR-T细胞药物afamitresgene autoleucel (Afami-cel)；此外共计57个进入注册制临床试验阶段。 图19. 海外TCR疗法临床进展统计 TCR疗法的疾病领域主要聚焦在肿瘤领域、罕见病领域、血液领域。已经获批适应症分别为滑膜肉瘤、葡萄膜黑色素瘤；其余适应症处于临床试验阶段，包括非小细胞肺癌、黑色素瘤、卵巢癌、HPV相关癌症、多发性骨髓瘤、肝细胞癌、肛门癌、宫颈癌、骨髓增生异常综合征、滑膜肉瘤、急性髓系白血病、急性淋巴细胞白血病、胃癌、结直肠癌、黏液样/圆细胞型脂肪肉瘤、胰腺癌、尿路上皮癌、乳腺癌、头颈癌、食管癌、头颈部鳞状细胞癌、子宫内膜癌等。 维渡纵横根据公开信息整理海外进入注册制临床试验的产品如下表所示。 表2. 国外进入临床试验阶段的TCR疗法 5.2 国内TCR疗法临床进展 国内TCR疗法起步较海外晚，共计15个产品进入中国注册制临床试验阶段，包括TCR-T和STAR-T类型，其中香雪制药TAEST16001进入II期临床，天科雅、可瑞生物、恒瑞源正等处于I期临床阶段。 表3. 国内进入临床试验阶段的TCR疗法 国内布局TCR蛋白药物的企业较少，进展最快的为“可瑞生物”，其次为“肽源生物(鼎成肽源)”、“镔铁生物”、“立凌生物”、“灵识质源”。对TCRm有一定布局的企业为百奥赛图。国内TCR蛋白药和TCRm均处于临床前阶段。 Vol.6 TCR疗法生产流程   6.1 TCR-T生产工艺流程 TCR-T细胞疗法是通过单采技术，从患者的外周血中收集和分选出自体淋巴细胞，再使用慢病毒载体或mRNA等基因工程手段，将特定的肿瘤抗原特异性T细胞受体(TCR)基 因导入离体T细胞的基因组(DNA)中，使得这些细胞能够一致性地在细胞膜上装载这种TCR的蛋白分子，再将这些细胞的数量经过体外扩增后回输给患者，直接杀伤肿瘤或激发机体免疫功能间接杀伤肿瘤。 图20. TCR-T生产简图 (来源:赛科成) 具体步骤如下： ① 筛选和确定肿瘤上合适的特异性抗原，以及对抗原有高度特异性的TCR αβ链序列； ② 从患者体内分离出T细胞； ③ 将TCRαβ序列包入病毒基因组，构建病毒载体； ④ 病毒转染T细胞，将目标TCR序列引入T细胞，从而获得特异性TCR-T细胞； ⑤ TCR-T细胞体外培养、大量扩增； ⑥ 将数量合适的TCR-T细胞回输患者体内。 TCR-T产品的上游研发工作是"筛选"及"亲和力优化"针对肿瘤抗原特异性的TCR，该TCR分子决定了TCR-T细胞安全有效的抗肿瘤能力；下游的TCR-T"细胞制备"和"质量控制"则决定了TCR-T终产品质量。 TCR-T制备工艺与质量研究仍处于起步阶段，国内工业界仍没有成熟的体系可以借鉴套用。建立完整的工艺及质控体系是保障TCR-T产品的有效性、稳定性和一致性的关键。TCR-T产品在生产原材料、生产工艺、过程控制、辅料、包装容器、稳定性等方面与CAR-T细胞产品有相似之处，在质量评价方面可参考相关的指导原则和考虑要点及国外如美国FDA和欧盟EMA先进疗法相关的指导原则。 6.2 TCR蛋白药生产流程 TCR蛋白药弥补了TCR-T细胞治疗的一些局限性。首先，自体TCR-T往往成本高昂，制备复杂，部分患者不适宜单采，导致这一方法可及性较差。TCR蛋白药在成本、生产、可及性、PK特性、安全性方面都更具有优势，并且能够应用到更多疾病领域。 TCR蛋白药的开发需要极高的"TCR亲和力优化"，高技术门槛限制了大部分公司进入该领域，全球只有少数几家公司如Immunocore、Immatics、可瑞生物具有TCR蛋白药管线。可瑞生物长期致力于高通量天然TCR筛选平台和SMART-TCR亲和力优化体系，是国内最早开展和进展最快的TCR蛋白药生物科技公司。 TCR蛋白药开发的核心技术是TCR亲和力优化，然后经由工程化改造的高亲和力及特异性的TCR和抗CD3的scFv组成双特异性融合蛋白分子，通过重组蛋白生产工艺即可完成，具体开发流程如下： ① 利用超灵敏质谱等手段确定样本库中最佳的肽-人类白细胞抗原(pHLA)； ② 利用专有的亲和力优化技术筛选更高特异性的TCR； ③ 利用TCR质量评估平台确保只有最佳的TCR才会进入到亲和力优化步骤； ④ 在有六个pHLA结合区域的数十亿个离散突变的TCR中利用专有的筛选技术如噬菌体展示技术等筛选亲和力高达百万倍同时特异性高的TCR； ⑤ 利用体外毒理性评价平台评估分子潜在脱靶结合或交叉反应性，以确定治疗窗口，并提供首次入人体的起始剂量； ⑥ 利用基于大肠杆菌等微生物发酵制造平台规模化生产重组蛋白，商业化推出TCR蛋白药产品。 Vol.7 产 业 链 分 析   7.1 TCR-T细胞药产业链 TCR疗法中，TCR-T为免疫细胞治疗之一，免疫细胞治疗作为一种前沿的治疗方法，从细胞的采集、存储到科研与临床应用，已经形成了一个完整的产业链。 7.1.1 上游分析 上游包括细胞资源库、仪器设备、试剂耗材、模式动物，是行业的基石，为中下游提供了必要的资源和支持。 细胞资源库的建立是免疫细胞治疗的第一步。这些库存储了大量的免疫细胞，可以在需要时迅速提供。目前，中国已有多家企业如中源协和、南京新百等在全国范围内建立了细胞资源库，为研究和治疗提供了强大的支持。  仪器设备、试剂耗材和模式动物是研究的另一大支柱。细胞治疗中使用的仪器设备和试剂耗材大多依赖进口，如生物反应器、细胞分离设备、检测设备、培养基等，国际知名品牌如通用、贝克曼、赛默飞、思拓凡、安捷伦等都在中国市场有着广泛的业务。 模式动物和类器官研究目前正实现国产化替代，国内企业包括昭衍新药、药康生物、大橡科技等。 7.1.2 中游分析 免疫细胞治疗的中游是行业的核心，直接决定了治疗的效果和前景。中国已经在全球免疫细胞治疗研究领域中占据了重要的位置，处于第一梯队。特别是基于CAR-T、TCR-T、TIL、CAR-NK、CAR-M等技术的研究，中国在这一领域的研究已经达到了国际先进水平。 CAR-T领先企业包括传奇生物、科济生物、驯鹿生物、恒润达生、合源生物、艺妙神州等； TCR-T领先企业包括香雪制药、可瑞生物、天科雅、恒瑞源正、科士华、镔铁生物、肽源生物(鼎成肽源)、呈源生物等； TIL领先企业包括沙砾生物、君赛生物、西比曼、卡替医疗、劲风生物、智瓴生物、循生生物、蓝马医疗、华赛伯曼等； CAR-NK/NK领先企业包括英百瑞、先博生物、国健呈诺、达博生物、晨泰医药、中盛溯源、启函生物、星奕昂、恒润达生、传奇生物、恩瑞恺诺、贝斯昂科、恩凯赛药、优凯瑞等； CAR-M领先企业包括赛元生物、元迈细胞、鲲石生物、巨世康济等 [巨噬细胞疗法行业研究报告. 维渡纵横, 2022]。 7.1.3 下游分析 免疫细胞治疗的下游是行业的终端即临床应用，直接关系到治疗的普及和应用。截止目前，中国市场只有CAR-T产品获批上市，其他领域尚未获批。随着政策的支持和医疗机构的参与，免疫细胞治疗在中国的临床应用也将得到更广泛的推广，不仅为患者带来了新的治疗机会，也为整个行业带来了巨大的市场潜力。 7.2 TCR蛋白/TCRm产业链 TCR蛋白即融合蛋白，TCRm即类抗体，其产业链适用于重组蛋白产业链和抗体产业链，上游包括细胞株、菌种转染试剂、培养基、耗材、仪器设备等；中游即为TCR蛋白和TCRm药物生产商，领先企业包括可瑞生物、肽源生物(鼎成肽源)、镔铁生物、灵识质源、立凌生物、百奥赛图；下游即临床应用单位。 Vol.8 市场规模和商业化   8.1 市场规模 根据沙利文公司发布的数据显示，预计全球肿瘤患者年度新增人数将从2022年的2023万增长至2030年的2445万，肿瘤药物市场将从2022年的2050亿美元增长至2023年4586亿美元，细胞与基因治疗占比将从24.5%上升到47.9%。根据Business Research Insights数据，2022年全球免疫细胞治疗市场规模为24.56亿美元 (175.39亿元人民币)，到2029年将达到171.4亿美元 (1223.98亿元人民币)，预测期内复合年增长率为74.1%。 根据医药经济报统计，中国免疫细胞治疗市场正迅速扩张，预计从2021年的13亿元增长至2030年的584亿元，年均增长率达到53%。在这一增长中，CAR-T细胞疗法市场预计将从2亿元增长至287亿元，包括TCR-T在内的其他免疫细胞治疗市场将从10亿元增长至297亿元。而根据头豹研究院2021年数据显示，单从中国TCR疗法的潜在需求来预测，2021至2025年中国TCR疗法潜在市场容量从387亿元增长至1041亿元，年复合增长率为28.1%。 8.2 TCR疗法商业化 首个获批的TCR疗法是Immunocore公司的TCR蛋白药Tebentafusp，商品名为Kimmtrak，于2022年1月获批上市，是一款靶向gp100的TCR与靶向CD3的scFv的融合蛋白，在III期临床数据中打败了K药和CTLA-4单抗，获FDA批准用于治疗HLA-A*02:01基因型、转移性或不可切除的葡萄膜黑色素瘤，美国定价为40万美元/年。2022年首年销额达1.41亿美元，2023年销售额达2.49亿美元；2024年第一季度净销售额达到7034.2万美元，同比增长36%，在获批的38个国家和地区中，美国净销售额占比71.1%，欧洲占比26.9%，欧美销售合计占比98%，是绝对主战场。 第二个获批的TCR疗法是Adaptimmune的TCR-T细胞药物Afami-cel （afamitresgene autoleucel），商品名Tecelra，FDA于2024年8月1日批准用于二线治疗既往接受过化疗治疗的不可切除或转移性滑膜肉瘤成人患者，且肿瘤表达MAGEA4，同时HLA-A*02:01P阳性、HLA-A*02:02P阳性、HLA-A*02:03P阳性、HLA-A*02:06P阳性。Tecelra定价为72.7万美元，公司预计该产品的年销售峰值可能高达4亿美元。 Vol.9 资 本 市 场 表 现   近日，香雪制药发布其TCR-T细胞疗法纳入优先评审后，在九个交易日股价涨幅超过210%；东北制药收购TCR-T细胞疗法企业肽源生物(鼎成肽源)，连续两个交易日股价涨幅21.22%。可见国内资本对TCR疗法的热度颇高。 截至目前，涉及到TCR疗法的相关公司共计10家上市公司：Immunocore (IMCR) 是一家纳斯达克上市公司，聚焦于TCR蛋白药物的开发，当前市值18.5亿美元；Immatics (IMTX) 是一家纳斯达克上市公司，具有TCR-T和TCR蛋白药双平台，当前市值12.1亿美元；东北制药 (000597) 通过并购方式进入到TCR-T和TCR蛋白药领域，当前市值62.2亿元；香雪生命是创业板上市公司香雪制药 (300147) 的控股子公司，香雪制药当前市值为53.2亿元；Lyell Immunopharma (LYEL) 是一家纳斯达克上市公司，具备TIL、CAR-T和TCR-T平台，当前市值3.7亿美元；TScan (TCRX) 是一家纳斯达克上市公司，公司对T细胞的生理靶点进行迅速和无偏倚筛选来开发治疗癌症和传染病的TCR药物，当前市值3.18亿美元；百奥赛图 (HK2315) 是一家港股上市公司，主要技术平台为抗体技术，包括TCR抗体，当前市值24.4亿港币；Adaptimmune (ADAP) 是一家纳斯达克上市公司，聚焦于TCR-T疗法，当前市值2.9亿美元；永泰生物 (HK6978) 是一家港股上市公司，主要技术平台为EAL和CAR-T疗法，同时拓展到TCR-T领域，当前市值15.9亿港币；Tevogen (TVGN) 是一家纳斯达克上市公司，主营未经基因修饰的现成T细胞治疗产品，当前市值1.1亿美元； 从2020年至2024年8月20日，共有57家TCR相关概念的公司获得多轮融资，主要地区在美国和中国，维渡纵横统计了涉及TCR概念的生物科技公司近年来的最新融资情况，如表4所示。 表4. 具备TCR疗法概念的公司融资情况 Vol.10 总 结 与 展 望   随着TCR蛋白药Kimmtrak (tebentafusp)和TCR-T细胞药Tecelra (Afami-cel)的陆续上市，TCR疗法终于全面进入商业化阶段，开启肿瘤免疫治疗新篇章。但由于TCR疗法的高技术壁垒，目前上市产品的定价颇高，这也是未来TCR疗法冲刺高销售峰值的可能障碍之一。维渡纵横更加期待国内TCR疗法的商业化和全球化，或将带来更高的性价比，期盼香雪生命科学、可瑞生物、天科雅等新锐生物科技公司给全球实体肿瘤患者带来福音。 END 免责声明：本文仅作知识交流与分享及科普目的，不涉及商业宣传，不作为相关医疗指导或用药建议。文章如有侵权请联系删除。 TIS2024第四届免疫细胞疗法与干细胞疗法论坛重磅来袭，合作详询：王晨 180 1628 8769