HER2 x CD47 x CD3ε

摘要：基于嵌合抗原受体（CAR）免疫疗法的过继细胞治疗取得了巨大进展，美国食品和药物管理局批准了五种用于血液系统恶性肿瘤的CAR T疗法。然而，实体瘤的CAR免疫疗法明显落后。CAR免疫疗法在实体瘤中的一些主要障碍包括CAR T细胞制备、缺乏肿瘤特异性抗原、CAR-T淋巴细胞运输和渗透到肿瘤部位的效率低下、免疫抑制肿瘤微环境（TME）、治疗相关毒性和抗原逃逸。CAR自然杀伤（NK）细胞比CAR T细胞有几个优势，因为NK细胞可以由预先存在的细胞系或异基因NK细胞制备不需要进行主要组织相容性复合体（MHC）的配型；可以通过CAR依赖性和CAR非依赖性途径杀死癌症细胞；并且毒性较小，尤其是在细胞因子释放综合征和神经毒性。至少有一项临床试验显示了CAR-NK细胞治疗的疗效和耐受性。巨噬细胞是主要的免疫调节因子，可以有效地渗透到肿瘤中，并大量存在于TME中。免疫抑制性M2巨噬细胞与促炎性M1巨噬细胞在吞噬靶细胞方面有一样的效果。并且还可以诱导M2巨噬细胞分化为M1型。因此，开发用于癌症免疫治疗的CAR巨噬细胞以克服与CAR T/NK治疗相关的一些主要障碍，特别是在实体肿瘤中，具有重大的意义。尽管如此，CAR-NK和CAR 巨噬细胞都有其自身的局限性。这篇综合性综述文章将讨论CAR-T和CAR-NK治疗的现状和主要障碍，接下来将讨论将CAR巨噬细胞发展为癌症特异性吞噬细胞、抗原提呈物、免疫刺激物和TME修饰物的结构和前沿研究。背景：免疫疗法最近已经彻底改变了癌症治疗的方法，是继手术、放疗和化疗之后癌症治疗的第四个基石。这对于无法治愈的转移性肿瘤来说更是如此，现在在经历免疫治疗后一部分患者可以达到长期缓解甚至治愈。目前，免疫疗法研究探索并利用免疫系统的各个方面，其中最成功的案例是免疫检查点抑制剂（ICIs）和嵌合抗原受体（CAR）T细胞的过继细胞疗法（ACT）。其他免疫疗法方法主要在临床前研究和临床试验中。对于免疫检查点抑制剂，有1种抗体是针对细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白（CTLA-4）、6种PD-1抗体和PD-L1抗体已经被FDA批准针对超过15种不同类型的恶性肿瘤。相比之下，到目前为止，只有5种CAR-T疗法被批准用于治疗B细胞来源的血液恶性肿瘤。目前超过700个CART疗法的临床试验在clinicaltrails.gov上注册，其中许多试验集中于实体肿瘤。这篇综述文章讨论了CAR-T和NK细胞治疗的现状及其局限性，然后是新兴的CAR-巨噬细胞的治疗。CAR 结构初始T细胞的激活需要两个信号，一个是通过T细胞受体（TCR）与主要组织相容性复合体（MHC）上的抗原结合的第一信号；另一个是通过CD28的共刺激信号。TCR由两条高度可变的链组成通常为α和β链，有少数的T细胞是γ和δ链。这两条链形成抗原识别和结合位点，并由非常短的细胞质位点。除此之外，TCR与6个CD3受体（CD3εγ, CD3εδ andCD3ζζ）结合形成四种CD3受体蛋白（CD3δ,CD3γ, CD3ε and CD3ζ,），来形成1个八聚体的复合物。CD3的胞内结构域包含基于免疫受体酪氨酸的激活基序（ITAM），在TCR接合过程中传递主要信号。TCR-CD3复合物的主要信号和CD28与B7.1（CD80）或B7.2（CD86）结合的共同信号激活T细胞。CAR是一种合成的细胞表面受体，通常不依赖于MHC就可与靶细胞表面抗原结合将细胞毒性细胞与靶细胞结合。它的主要功能比如第一代CAR是替代TCR-CD3复合物并传递T细胞激活的主要信号；第二代和第三代CAR主要替代TCR-CD3复合物的信号和CD28的共刺激信号。CAR通常由四个区域组成：细胞外抗原结合区域、间隔或者铰链区、跨膜区和细胞内信号区域。抗原结合区域通常由抗体的重链（VH）和轻链（VL）通过链接器链接，形成单链片段可变区（ScFv），并决定其抗原结合特异性。有时，可以用一种与靶细胞上的受体结合的天然蛋白质或者肽来代替单链抗体。单链抗体识别并结合细胞表面标位来决定靶标特异性和TCR识别通过MHC呈递抗原的形式是不同的。铰链区域是一个间隔区域，它暴露了CART细胞表面的抗原结合区域，以便抗体与目标抗原结合。临床上常使用的铰链区通常来源于CD8、CD28或者IgG。铰链区域的长度根据经验由靶抗原的位置决定，靠近细胞膜的抗原需要较长的铰链，暴露在细胞表面的抗原需要较短的铰链。跨膜结构域的主要功能是将CAR固定在免疫细胞膜上。然而一些研究表明，该区域可以影响CAR的表达、稳定性、二聚化和信号转导。细胞内信号域在CAR的领域被广泛研究，以用来产生具有最活跃的抗肿瘤的CAR免疫细胞。当CAR参与时，细胞内信号域会传到信号激活免疫细胞攻击目标细胞。第一代CAR-T包含一个CD3ζ信号域。由于T细胞活化需要TCR-CD3和CD28两个信号通路的信号，因此第一代CART细胞治疗在过继转移后的疗效和持久性有限。未提高抗癌活性，设计了第二代CAR-T细胞。除外CD3ζ信号域外还包含一个共刺激域。两个最常用的胞内信号结构域是CD28和4-1BB(CD137)。FDA批注的axicabtagene ciloleucel和brexucabtagene autoleucel 均使用了CD28的结构域，两者都是针对CD19靶点的CAR-T。FDA批准的靶向CD19的lisocabtagene maraleucel和tisagenlecleucel，以及靶向B细胞成熟抗原(BCMA)的idecabtagene vicleucel均使用4-1BB的共刺激域。其他细胞内共刺激域如OX40、CD27、和诱导性T细胞共刺激域（COS）也在临床前研究中进行了测试，与CD28和4-1BB结构域的效果差不多。其中一些共刺激域可能对CAR-T细胞有更好的有益效果，有一项研究表明CD27共刺激结构域比CD28共刺激域在体内更能增强CAR-T的持久性。它们在CAR T细胞中的活性尚未在大型临床试验中得到验证。已经发现细胞内CD28和4-1BB结构域对CAR T细胞的分化和代谢有不同的影响。4-1BB和CD3ζ可联合诱导中枢记忆T细胞的分化和持续性，增加线粒体的生物合成，促进脂肪酸氧化和氧化代谢；CD28和CD3ζ结合诱导记忆细胞分化和糖酵解。为了利用不同性质的共刺激域并增强CAR T细胞的疗效，第三代CAR T治疗被设计在CD3ζ并联设置两个共刺激域。结合CD28和4-1BB可以使得CAR T细胞能靶向低亲和力的目标抗原，增强增殖能力，增强中央记忆细胞的分化，提高体内的抗肿瘤活性。一个包含可变数量共刺激域的CAR构建库测试时发现包含两个共刺激域的CAR T细胞。DAP10和CD27在体内取得最好的抗肿瘤活性。除外CAR的基本结构，生物工程的最新进展使进一步武装CAR免疫细胞成为可能，其可以增强抗肿瘤的功能并降低毒性。如CAR-T细胞上表达趋化因子受体，以促进趋化并向肿瘤微环境浸润；促炎性细胞因子的表达可以克服免疫抑制TME；敲除抑制性受体可以防止CAR-T细胞衰竭；双CAR-T细胞可以产生靶向两个抗原并克服抗原逃逸；自杀或抑制基因可以用来预防或减少毒性，包括靶向性、非肿瘤效应及细胞因子释放综合征。CAR-T治疗的现状到目前为止， FDA已经批准了五种CAR-T细胞。5个B细胞表面标记物， 4个靶向CD19，1个靶向B细胞成熟抗原(BCMA) (表1和图1)这五种药物均已被批准用于复发或难治性血液恶性肿瘤的治疗:B细胞来源的淋巴瘤、白血病和多发性骨髓瘤。第一个FDA批准的CAR-T疗法是Tisagenlecleucel，75例复发或难治性B细胞前体急性淋巴细胞白血病(ALL)患儿和年轻成人患者。在3个月内，总缓解率为81%，其中完全缓解(CR)为60%，不完全血液恢复(CRi)为21%。75例患者中55例(73%)出现3级或4级tisagenleckel相关不良事件。3级和4级细胞因子释放综合征(CRS)分别发生在21例和25%的患者中， 75例患者中有35例(47%)住进重症监护病房(ICU)进行治疗。基于该试验， CAR-T疗法于2017年8月30日获得FDA批准，用于治疗年龄≤25岁的B细胞前体ALL患者，且难治性或二次或以后复发。Tisagenlecleucel于2018年5月1日获批，用于治疗复发或难治的大B细胞淋巴瘤，包括弥漫大b细胞淋巴瘤(DLBCL)、高级别B细胞淋巴瘤和滤泡性淋巴瘤引起的DLBCL，基于多中心试验。在92例可评估的患者中，最佳的总缓解率为52%，其中CR为40%，部分缓解(PR)为12%。63%发生3级或4级不良事件，怀疑与tisagenlecucel有关。Axicabtagene ciloleucel(Yescarta™)于2017年10月18日成为FDA批准的第二种CAR-T疗法，用于治疗大B细胞淋巴瘤，包括DLBCL、原发性纵隔大B细胞淋巴瘤、高级别B细胞淋巴瘤和滤泡性淋巴瘤引起的DLBCL，经过至少两行系统治疗。一项有101名患者参加的多中心ZUMA-1试验显示， 18个月时客观缓解率(CR54%)为82%，总生存率为52%。约13%的患者发生3级或以上CRS。2021年3月5日， axicabtageneciloleucel也被批准用于复发或难治性滤泡性淋巴瘤，基于单臂、开放标签的ZAMA-5试验，经过两个或多个系列的全身治疗。91%的患者达到了缓解，约8%的患者出现了3级或3级以上的CRS。中位随访时间为14.5个月，在18个月时， 74%的患者持续缓解。基于一项单臂、开放标签的ZUMA-2试验， FDA于2020年7月24日批准了第三个靶向CD19的CAR-T疗法Brexucabta或难治性套细胞淋巴瘤。在这个多中心II期试验中，74名患者被纳入， Brexucabtageneautoleucel生产了71名患者，给药68名患者。总体而言缓解率为93%，缓解率为67%。12个月时，总生存率为83%。约15%的患者发生3级或以上CRS。Lisocabtagene maraleucel (Breyanzi™)是最近批准的针对复发或难治性大B细胞淋巴瘤的CD19靶向CAR-T治疗，经过两个或多个系列的系统治疗，包括未指定的大B细胞淋巴瘤(包括由惰性淋巴瘤引起的大B细胞淋巴瘤)、高级B细胞淋巴瘤、原发性纵隔大B细胞淋巴瘤和滤泡性淋巴瘤3b阶段。在这项多中心TRANSCEND试验中，有192名可评估患者参与，客观缓解率为73% (50×106、100×106和150 ×106给药方案分别为68、74和73%)，CR为53% ((50 ×106、100 ×106和150 ×106给药方案分别为60、52和51%)，中位缓解持续时间为17个月。3级或以上CRS发生在约2%的患者中。Idecabtagene vicleucel (Abecma®)是唯一的FDA-批准的CAR-T治疗不针对CD19。它针对多发性骨髓瘤(MM)细胞的BCMA靶点，并于2021年3月26日获得FDA批准，用于复发或难治性MM，经过4个或更多系列的系统治疗，包括免疫调节剂、蛋白酶体抑制剂和基于KarMMa研究的抗CD38单克隆抗体。在128名接受治疗的患者中，总有效率为73%(150×106、300×106和450×106给药方案分别为50、69和82%)，CR为33% (150×106、 300×106和450×106给药方案分别为25、29和39%)。约2%的患者中发生了3级或以上CRS。到目前为止，已经有超过700个恶性肿瘤的临床试验被注册。此外，CAR-T细胞疗法正在探索用于其他疾病，如自身免疫疾病和病毒感染)。表1 FDA近期批准的CAR-T治疗图1 FDA批准CAR-T治疗的时间线CAR-T细胞在癌症免疫治疗中的局限性许多因素导致了CAR-T治疗的失败，如患者的疾病进展、单采时T细胞数量不足、推迟的CAR-T生产、CAR-T细胞未满足回输剂量、固有的T细胞缺陷等。下面是与CAR-T细胞生产和治疗相关的因素。抗原选择尽管CAR-T治疗取得了巨大的成功，但仍存在一些明显的局限性。到目前为止，所有FDA批准的CAR疗法都以B细胞的标记物为靶点。CAR-T细胞治疗实体瘤落后于血液瘤的原因是多样的。缺乏癌症特异性的靶点是主要的障碍之一。尽管CD19靶向CAR T治疗会导致B细胞再生障碍，但静脉注射免疫球蛋白补充剂可以很容易地补偿大多数B细胞功能。实体瘤中很少存在这种不影响正常功能的特异性抗原。在实体肿瘤中，靶向肿瘤相关抗原的CAR-T细胞的临床试验，如被T细胞识别的黑色素瘤抗原1(MART1)和糖蛋白100(gp100)，表明确实发生非靶向肿瘤的副作用，有时不能轻易逆转。这种毒性可能发生在没有或只有最低的抗肿瘤活性的情况下，甚至当靶向被认为在健康成人组织中不表达的癌症睾丸抗原时，也可导致死亡。CAR-T细胞转移和浸润到肿瘤中的效率低下转移和渗透到肿瘤部位是静脉注射CAR-T细胞的要克服的下一个主要障碍。粘附分子异常表达的异常脉管系统降低CAR-T细胞附着的附着、迁移和浸润;密集的细胞外基质，包括癌症相关的成纤维细胞(CAFs)，为CAR-T细胞进入肿瘤部位创造了一个物理屏障;紊乱的细胞因子表达会优先吸引被抑制的免疫细胞。目前已经探索了各种策略来增加T细胞对肿瘤的浸润。比如CAR-T与另一种靶向CAFs的CAR-T治疗相结合，或将CAR-T细胞与细胞因子受体结合，结合到肿瘤中上调的细胞因子上。然而，这些策略有时是有代价的，因为这些目标通常存在于机体中。一项临床前研究表明，靶向CAFs的CAR-T细胞能够识别多能骨髓基质细胞，这导致小鼠产生恶病质和死亡，这些研究提醒人们不要在人类患者中使用这种策略。恶性的肿瘤微环境进入TME后，免疫抑制环境会抑制CAR-T细胞的功能。在某些癌症中尤其如此，如胰腺癌，细胞和基质成分都为癌症免疫治疗创造了不利的微环境。细胞成分如肿瘤相关的巨噬细胞(TAMs)，调节性T -细胞(Treg)，骨髓源性抑制细胞(MDSCs)和肿瘤相关的成纤维细胞(TAFs)可以直接抑制CAR-T功能，有助于免疫抑制细胞因子和代谢微环境抑制CAR-T细胞功能。血管内皮生长因子(VEGF)在肿瘤新生血管中起着至关重要的作用。最近发现VEGF几乎可以影响免疫系统的各个方面，导致抗肿瘤免疫的抑制。此外，转化生长因子β（TGF-β）、IL-4、IL-10等也会使得T细胞功能障碍，促进免疫抑制细胞的浸润。许多策略已经存在并用在TME下促进CAR-T的治疗，例如将CAR T疗法与ICIs或其他免疫刺激疗法相结合，使CAR T细胞对免疫抑制细胞因子不敏感。抗原逃逸T细胞发挥抗癌活性，抗原丢失和下调是治疗失败的重要机制。尽管有很高的初始缓解率，但7~25%的患者接受靶向CD19的CAR-T治疗后， CD19表达减少的恶性肿瘤复发。靶向两种不同抗原的CAR-T构建或连续的CAR-T治疗正在积极地进行，以尽量减少抗原逃逸和下调。CAR-T细胞扩增和持久性不足除了靶向抗原的逃逸， CAR-T细胞扩张和体内持续存在被认为是长期缓解的关键。特别是那些需要长期治疗的恶性肿瘤，如ALL。对于其他恶性肿瘤，如非霍奇金淋巴瘤，短时间的强化化疗无需巩固和维持治疗就足以诱导缓解。在后一种情况下，尽管CAR-T细胞未被检测到， B细胞在抗cd19CAR-T治疗后恢复，但完全缓解持续存在。缺乏CAR- T细胞持久性可能与宿主对CAR-T细胞的抗转基因免疫反应有关。在这种情况下，基于氟达拉滨的淋巴消耗状态治疗可以减少抗转基因免疫反应，改善CAR-T细胞的扩张和持久性，并增强CAR- T细胞的疗效。更常见的是，CAR-T细胞扩增和持久性的缺乏是由直接与CAR-T细胞相关的因素引起的。人们设计和研究了各种策略来增强CAR-T细胞的扩展和持久性:CAR-T细胞构建、亲本T细胞选择、 T细胞培养条件、药物操作、修饰CAR-T基因表达和代谢、逆转T细胞衰竭、促进记忆表型发展等。关于CAR-T结构，大多数临床测试和FDA批准的CAR-T细胞产品含有CD3ζ一个共刺激域，通常是CD28或4-1BB。临床前研究和一些临床观察表明，共刺激结构域可以影响CAR-T细胞的表型和体内持续时间， 4-1BB结构域持续时间更长，为168天。而CD28为基础的CAR-T细胞治疗约持续30天。体外培养、激活和扩增不仅能引导T细胞转导CAR-T基因，扩大到产生足够的CAR-T细胞用于临床应用，而且对维持CAR-T功能和输注后的持久性也至关重要。体外培养导致T细胞终末分化，倾向于激活诱导细胞死亡(AICD)和衰竭，可影响体内扩张和持久性。优化培养条件可促进记忆型CAR-T细胞的发育和体内扩展和持久性。全身毒性CAR-T细胞治疗有很高的反应率，特别是在耐药或者难治的疾病中，但也与较高的副作用率相关。全身细胞因子毒性发生在急性期，当CAR-T细胞被激活并释放细胞因子作为CAR-T细胞与抗原结合的生理反应。所有有效的CAR-T治疗都观察到严重甚至致命的影响。对于大多数患者，它表现为与发热、低血压、缺氧和与高水平炎症细胞因子相关的多器官衰竭相关的CRS。一些患者也可发展为免疫效应细胞相关神经毒性综合征(ICANS)。ICANS具有明显的神经学表现，继发于脑脊液细胞因子水平升高和血脑屏障破坏，表现为失语症、精神状态改变、震颤、癫痫和头痛。各种方法已经被采用，其中一些已经转化为临床应用。糖皮质激素和抗白细胞介素-6 (IL-6)抗体西妥昔单抗是最常用的药物干预。其他几种方法正在积极探索以控制或改善全身细胞因子的毒性，如根据肿瘤负荷量身定制CAR-T细胞剂量，修改CAR-T构建，在CAR-T细胞中加入关闭开关或自杀基因。在CAR-T细胞治疗后，偶尔会发生噬血细胞性淋巴组织细胞增多症(HLH)/巨噬细胞活化综合征(MAS)。基于一项多中心调查，大约3.5%(7/201例)的患者接受CAR-T细胞治疗后发生HLH/MAS。主要临床表现为发热、肝脾肿大、肝功能异常、血细胞减少、高脂血症铁蛋白水平，高甘油三酯血症和低纤维蛋白原血症。有时表现与CRS相似。HLH/MAS有几种诊断标准以HLH2004为临床最常用。以皮质类固醇为基础的免疫抑制治疗是主要的治疗方法，但仍有较高的死亡率。CAR-T细胞治疗实体肿瘤的特殊考虑目前，超过70%的CAR-T细胞临床试验集中于血液恶性肿瘤，超过40%的CAR-T细胞治疗CD19，而不到30%的CAR-T细胞治疗实体肿瘤。CAR-T在实体肿瘤中的治疗遇到了上述所有的挑战。在设计实体肿瘤的CAR-T治疗时需要特别考虑。首先，靶抗原的选择至关重要。目标抗原列表和一些临床试验实例可以在之前的综述中找到，并正在扩大。在CAR-T治疗中，理想的目标抗原是那些仅表达在恶性细胞上的肿瘤特异性抗原。事实上，除了癌症新抗原和可能的表皮生长因子受体变异III(EGFRvIII)，几乎所有其他在实体肿瘤CAR-T治疗中使用的抗原都是由正常细胞共享的。在血液系统恶性肿瘤中靶向非癌症特异性抗原的主要优势是:1)在正常细胞被破坏的情况下存在挽救性补救，如图所示，免疫球蛋白补充靶向B细胞标记物的CAR-T治疗(CD19和BCMA);2)细胞更新快，有新的细胞来补充。因此，在血液系统恶性肿瘤的靶内，肿瘤外的副作用通常是可控的。相反，在实体肿瘤中靶向肿瘤相关抗原(TAAs)通常与更显著的副作用相关，因为通常难以修复实体器官中正常细胞的肿瘤外损伤。已经设计了几种策略来解决实体肿瘤和血液病中肿瘤特异性抗原的缺乏。一种是将主要和共刺激信号域分成两种不同的CARs。因此，除非靶细胞同时表达靶抗原，否则这些分裂细胞和CAR-T细胞不会被强烈激活。一个类似的分裂和方法是合成Notch(synNotch)受体系统，在该系统中，第一个目标抗原的结合触发CAR的表达， CAR的表达可以被附近表达第二个目标的细胞激活并杀死。另一种方法被称为非方法，如在分裂、通用和可编程（SUPRA）CAR系统中所见，在该系统中，CAR可以与TAA结合并激活CAR T细胞，但第二种抗原（通常是在正常细胞上表达的抗原）的存在可以竞争CARTAA结合，并阻止CART细胞激活。一些其他的方法也被探索过，比如微调CAR亲和力，以实现靶抗原过度表达的癌症细胞而非低抗原表达的正常细胞激活CAR T细胞，靶向癌症细胞中异常糖基化，并使用靶向癌症新抗原的T细胞受体。在实体肿瘤的CAR-T治疗中，抗原异质性也是一个需要考虑的关键因素。在FDA批准的CAR-T疗法中，靶向抗原CD19和BCMA是在恶性细胞的干细胞中表达的发育性生物标记物。在实体肿瘤中，这种发育性抗原/生物标志物与正常细胞共享，因此，针对这些抗原可能导致严重的靶向性、非肿瘤毒性。对于非发育性生物标志物，异质性表达在癌细胞中很常见。为了克服靶抗原的异质性，人们提出了双特异性或多特异性CAR，其中一个CAR可以识别多个靶抗原。另一种方法是将几个靶向不同抗原的CARs导入相同的T细胞中。在这两种方法中，靶向性和非肿瘤性都是一个主要问题，因为很少有肿瘤特异性抗原存在。CAR-T细胞浸润肿瘤和保留细胞毒性是实体肿瘤的主要障碍。在CAR-T细胞直接与靶细胞接触的白血病或淋巴细胞在淋巴器官中正常流动和积聚免疫反应的淋巴瘤中，这两个障碍就不那么重要了。目前正在探索几种增强CAR-T细胞在实体肿瘤中的活性的方法。一种方法是增强CAR-T功能，并添加分子武装这些细胞以增强抗肿瘤活性。例如，用趋化因子受体武装CAR-T细胞可以通过上调目标趋化因子来增强T细胞向肿瘤的浸润。TGF-β 是TME抗癌免疫的主要负调控因子。在CAR T细胞中敲除TGF-β 可以增强其抗癌活性。然而，一种更常见的方法是将CAR-T细胞与另一种药物结合，以克服障碍并提高疗效。有人提出了一种基于药理学的抗癌药物排名，这可能会指导免疫疗法联合的发展。CAR NK细胞解决与CAR T治疗相关的未满足需求NK细胞是先天免疫系统的一组细胞毒性淋巴细胞，可以对非自身细胞产生快速反应。与识别MHC上呈递的抗原的T细胞不同，NK细胞可以在没有MHC的情况下直接识别靶细胞。事实上，MHC与NK细胞上的杀伤细胞免疫球蛋白样受体（KIR）结合，抑制NK细胞的功能。此外，与可以释放炎症细胞因子并导致CRS和神经毒性的CAR T细胞的参与和激活不同，NK细胞具有不同的细胞因子谱。因此，目前正在积极探索NK细胞作为过继细胞治疗的替代方法(表2)。表2 CAR T，NK和巨噬细胞的比较CAR-NK细胞相对于CAR-T细胞的一个主要优势是免疫细胞的来源。由于同种异体反应性和移植物抗宿主病(GVHD)， CAR-T治疗需要使用自体T细胞。由于这些患者通常在接受CAR-T治疗之前接受了大量治疗，他们中的许多人在外周血中T细胞计数较低。因此，获因此，采集足够的自体T细胞会显著延迟治疗，有时不可能采集足够的细胞用于CAR T制备。在一项研究中，22.5%(16/71)的患者使用低于目标的CD3+ T细胞的自体淋巴细胞来生产CAR-T细胞。冗长而繁琐的CAR-T制造过程使得更多的患者要么不适合治疗，要么在参与治疗过程后出现疾病进展。例如，在导致FDA批准的ALL的tisagenlecucel的I期试验中， 83名患者中只有54名患者接受了CAR-T细胞输注， 9名患者在治疗前病情进展或死亡， 15名患者接受了其他治疗。由于NK细胞不通过MHC途径激活，并且降低了异源反应的风险， CAR-NK细胞的制造不需要自体NK细胞。它可以使用现有的NK92细胞系、脐带血和诱导多能干细胞(iPSCs)。事实上，有5项临床试验使用NK-92细胞系在人类患者身上进行。在一项使用脐带血开发的HLA-不匹配CAR-NK疗法的试验中，11例患者中没有一例出现GVHD。因此，CAR-NK治疗的一个主要优势是，“现货的”准备使用的CAR-NK细胞可以通过批量生产生产，并在任何时候注入患者。CAR-NK治疗相对于CAR-T治疗的第二个主要优势在CRS和神经毒性。CAR-T细胞激活导致大量炎症细胞因子的释放，导致CRS和神经毒性。在使用tisagenlecucel治疗ALL的I期试验中，85%(45/53)的患者发生了3级或以上毒性的CRS，26%(14/53)的患者发生了3级或以上毒性， 41.5%的患者发生了3级或以上神经毒性。其他CAR-T治疗也观察到类似的毒性。在11例使用来自脐带血的HLA未配对的 anti-CD19 CARNK细胞治疗的患者中，没有一例出现CRS或神经毒性。CAR-T和NK细胞之间这两种毒性的差异可能是由于细胞激活时释放的细胞因子的差异。CAR-T细胞的活化导致炎症细胞因子的释放，如肿瘤坏死因子α，IL-1β，IL-2和IL-6等，而接受CAR-NK治疗的患者这些炎症细胞因子并没有增加。CAR-NK细胞释放不同类型的细胞因子，如粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。第三，除了CAR途径外， NK细胞还有多种靶向和消灭癌细胞的机制(图2)。NK细胞是抗体依赖的细胞介导的细胞毒性的关键媒介，NK细胞表达的CD16能够识别IgG结合在肿瘤细胞上的Fc部分并杀死癌细胞。此外， NK细胞可以激活，通过接触和/或脱离癌细胞在细胞表面激活和抑制杀伤igg样受体(KIRs)。激活型和抑制性KIRs分别通过ITAMs(免疫受体酪氨酸基激活基序)和ITIMs(免疫受体酪氨酸基抑制基序)传递信号。应激细胞和癌细胞下调MHCI类表达并脱离抑制性KIRs，或上调应激诱导的分子，如MICA/MICB (MHCI类链相关蛋白A/B)，激活KIRs，使得NK细胞的激活以杀死目标细胞。第四， NK细胞的寿命有限。NK细胞的平均寿命约为2周。这意味着，在靶向非肿瘤毒性发生的情况下，它可以随着CAR的消失而自我限制。然而，这也创造了一把双刃剑，反复输注CAR-NK细胞可能需要延长缓解期。CAR结构的比较到目前为止，大多数CAR-NK细胞研究使用的CAR-T细胞使用的相同的CAR-T细胞结构，具有与第一代CAR-T细胞相同的细胞内CD3ζ域，或CD3ζ加一个共刺激域4-1BB，与第二代CAR-T细胞使用的一样(图1)。添加4-1BB共刺激域显著改善NK细胞激活，细胞毒性和细胞因子的产生，如干扰素-γ 和粒细胞-巨噬细胞集中性刺激因子。由于NK细胞有自己相互关连的激活和抑制受体来控制NK细胞的激活和细胞毒性，因此有人提出，利用NK细胞特异性的细胞内信号域，如适配器分子DAP10或含ITAM的信号域，如DAP12和2B4，可以提高细胞毒性。2B4属于信号淋巴细胞活化分子(SLAM)家族受体，通过SLAM相关蛋白(SAP)在NK细胞中转导活化信号。2B4与CD48结合在靶细胞上诱导NK细胞活化，增加细胞毒性和干扰素-γ产生。与含有4-1BB-CD3ζ 的CAR-NK细胞相比，含有2B4- CD3ζ的CAR-NK细胞具有更好的细胞毒性、干扰素γ的产生和体内抗肿瘤功效。为了进一步优化NK细胞CAR-T的构建，Li等人将一个CAR-T细胞构建与九个不同的CAR-NK细胞进行了比较，这些细胞包含四个不同的跨膜结构域和不同的细胞内信号域，并靶向相同的间皮素抗原。CAR-NK细胞包含NKG2D跨膜结构域， 2B4共刺激结构域和CD3ζ 信号域，表现出强烈的抗原特异性细胞毒性。CAR-NK细胞由携带该构建物的人iPSC发展而来，具有典型的NK细胞表型，具有显著的抗肿瘤活性，并延长了在体内的生存时间。CAR-NK细胞治疗的现状到目前为止，至少有24个CAR-NK细胞的临床试验已经计划或正在进行中。恶性肿瘤、靶抗原和临床试验信息见表3和补充信息1。这些临床试验均处于I/II期试验阶段。使用“嵌合”和“NK”这两个关键词， PubMed仅确定了一项临床试验(表4)。Liu等人发表了一项针对cd19阳性淋巴类肿瘤的CAR-NK细胞I期临床试验。在这个试验中，一个类似的CAR-T细胞结构被用来建立CAR-NK细胞与抗cd19单链抗体抗原结合的细胞外域和CD3ζ 作为细胞内信号域。此外， CAR-NK细胞表达白细胞介素-15以增强CAR-NK细胞在体内的扩张，而rimiducid诱导的caspase-9作为一种安全措施，在发生严重不良事件时可触发CAR-NK细胞凋亡。11名b淋巴恶性肿瘤患者被纳入试验。这些患者在入组前接受了四种治疗线的中位数。CAR-NK细胞来自部分HLA匹配的脐带血标本(前9例患者)或没有考虑HLA匹配的脐带血标本。11例患者均未出现CRS、神经毒性、噬血细胞性淋巴组织细胞增多症或移植物抗宿主病。在这些患者中没有观察到炎症细胞因子的增加。11例患者中有8例(73%)获得客观缓解，包括7例CRs(3例CLL和4例淋巴瘤)， 1例CLL Richter's转化患者的高级别淋巴瘤完全缓解。CAR-NK细胞可以持续至少12个月。表3 CAR NK细胞的临床试验表4 一期靶向CD19的CAR NK的临床试验总结CAR-NK细胞的局限性虽然CAR-NK细胞治疗比CAR-T细胞治疗的优势是显而易见的，正如上面讨论的，显著的局限性也存在。几乎所有与CAR-T治疗相关的限制也适用于CAR-NK细胞，从目标抗原选择，抗原异质性， CAR-T设计，制造到输注后挑战，如NK细胞迁移到肿瘤部位，敌对的肿瘤微环境。目前正在进行积极的研究，以改善CAR-NK的制造和储存，特别是“现成的”CAR-NK细胞，优化CAR-NK的结构，以增加CAR-NK渗透到肿瘤中，并保持免疫抑制TME的细胞毒性，并最大限度地减少靶向性和非肿瘤毒性。此外， NK细胞的半衰期较短(< 10天)，这是CAR-NK治疗中的一把双刃剑。这在发生严重毒性的情况下具有优势，但也产生了一个挑战，可能需要反复给药，以实现持久的反应。重新编程CAR-NK细胞，使其具有记忆细胞特性，并在体内长期存活，以进行持续的免疫监测和预防癌症复发是目前一个积极探索的领域。此外，与T细胞相似， NK细胞在细胞表面同时具有活化和抑制KIRs。有核细胞上普遍表达的MHC分子可抑制NK细胞功能。CAR-巨噬细胞来解决与CAR-T和CAR-NK治疗相关的未被满足的需求CAR-T治疗已经在血液系统恶性肿瘤中取得了很高的成功，但它还没有在实体肿瘤中取得成果，即使具有很强的临床前研究。血液病和实体恶性肿瘤之间存在着一些明显的区别。例如，在B细胞恶性肿瘤中观察到的CD19在实体肿瘤中存在罕见的靶抗原。这种显著的差异也可能是继发于血液肿瘤和实体肿瘤之间潜在的生理差异。当考虑癌症免疫周期时， CAR-T细胞绕过了该周期的前三个步骤:癌症抗原释放和呈现， T细胞启动和激活。然而， CAR-T细胞的有效性仍然受抗癌免疫的最后四个步骤的控制，即T细胞转移(步骤4)和渗透(步骤5)到肿瘤，识别(步骤6)和杀死肿瘤(步骤7)。如上所述，这四个步骤为T细胞创造了巨大的障碍。例如，许多实体瘤是免疫“冷”瘤，免疫细胞很少渗入TME。由于TME具有免疫抑制作用，即使在那些有显著免疫细胞浸润的癌症中，免疫细胞也不能消灭癌细胞。尽管CAR-NK细胞相对于CAR-T细胞有一些优势，但与CAR-T细胞相关的大多数障碍也适用于CAR-NK细胞。NK细胞通常不是TME中主要的免疫细胞群。武装CAR-NK细胞可以解决一些障碍。例如，在CAR-NK细胞中加入IL-15可以显著增强CAR-NK细胞在体内的扩张和持久性，提高小鼠模型的抗肿瘤活性和总生存期。由于迄今为止只有一项I期临床试验报道，尚不清楚用细胞因子武装CAR-NK细胞是否可以推广到其他恶性肿瘤。NK细胞一旦进入肿瘤部位，具有免疫抑制作用的TME可以抑制NK细胞的功能。由于与CAR-T和CAR-NK细胞治疗相关的障碍，最近CAR-巨噬细胞已经成为一种替代疗法。CAR巨噬细胞和CAR-T细胞有许多共同的特点和障碍，如特异性抗原的需求，抗原逃逸和下调，以及全身细胞因子的毒性。然而， CAR巨噬细胞在实体肿瘤的其他两个主要障碍上比CAR-T细胞具有独特的优势:免疫细胞贩运和渗透到TME，以及免疫抑制TME(表2)。由于免疫细胞向TME转运和浸润，巨噬细胞在许多肿瘤中大量存在，而T细胞浸润较差。新鲜冷冻肿瘤切片显示，巨噬细胞在许多癌症类型中占肿瘤浸润细胞的大多数，在黑素瘤、肾细胞癌和结直肠癌中高达50%。TME巨噬细胞的浸润是继发于肿瘤部位分泌的许多细胞因子。缺氧诱导肿瘤细胞和间质产生细胞因子，如CCL2 (C-C motif chemokine ligand 2)、 CXCL12 (CX-C motif chemokine ligand 12)、 CSF1 (ColonyStimulating Factor 1)和VEGF招募巨噬细胞。一旦被募集到缺氧的TME中，这些可溶性因子的受体就会被下调，从而将巨噬细胞锁定在TME中。此外，巨噬细胞可以直接感知缺氧状态及其代谢产物，如低pH，并迁移到TME中。TME的另一个特点是免疫抑制微环境，这对T细胞来说是一个主要障碍，而对巨噬细胞来说则不是。由于这种环境，渗透到肿瘤部位的T细胞往往发展衰竭表型，有时不能被免疫检查点抑制剂逆转。巨噬细胞的情况可能并非如此。巨噬细胞大致分为两大类，经典活化的促炎M1巨噬细胞和交替活化的抗炎M2巨噬细胞。TAMs，尤其是M2 TAMs，被广泛认为是TME的中枢免疫抑制细胞群之一。甚至M2巨噬细胞虽然抑制了其他免疫细胞的功能，但仍具有吞噬功能。事实上， M2巨噬细胞比M1巨噬细胞具有更高的吞噬能力。此外，巨噬细胞具有较高程度的表型可塑性，可以对环境刺激作出反应，改变表型。CAR巨噬细胞中的CAR结构CAR -T细胞中的CAR-巨噬细胞具有与CAR-T细胞相同的结构，具有细胞外抗原结合域、铰链区、跨膜域和细胞内域(图1)。它们在细胞内信号域上有所不同。CAR-T巨噬细胞可以直接使用CD3ζ 胞内区域，就像CAR-T细胞使用的那样，CAR-T细胞包含基于免疫受体酪氨酸的激活基模(ITAMs]。在CAR-T细胞中， ITAMs在CAR结合时被Src家族激酶磷酸化，与串联的SH2 (tSH2)激酶ZAP70结合，并激活CAR-T细胞发挥细胞杀伤作用。巨噬细胞不表达ZAP70。它们表达另一种含有tSH2结构域的激酶Syk，可以结合CD3ζ并在巨噬细胞中转导吞噬信号。除了CD3ζ，其他含有itam的细胞内结构域，如Fc受体的γ亚基(FcRγ )和多个表皮生长因子样结构域蛋白10(Megf10)，也被使用，并可诱导类似CD3ζ 的吞噬作用。FcRγ 转化巨噬细胞中抗体依赖细胞吞噬(ADCP)的典型信号转导。Megf10在巨噬细胞吞噬凋亡细胞中发挥着重要作用。与第二代和第三代CAR-T细胞相似，一个额外的信号域增强了吞噬作用。含有CD3结构域而没有共刺激结构域的CAR-T细胞，正如第一代CAR-T细胞所见，其体内活性有限。因此，所有FDA批准的CAR-T产品都包含一个共刺激的细胞内结构域，要么是CD28，要么是4-1 BB(表1)。在CAR-巨噬细胞中也观察到类似的结果。此前有报道称，磷脂肌醇3-激酶(PI3K)信号通路对大颗粒吞噬作用十分重要。CD19 PI3K招募域与CAR -FcRγ 的串联融合使目标全细胞的吞噬能力增加了三倍。CAR-巨噬细胞的现状到目前为止， CAR-巨噬细胞研究主要处于临床前阶段，一项I期试验正在进行中，该试验使用自体CAR-巨噬细胞靶向HER2过表达的实体肿瘤(表5)。Morrissey等人系统分析了可用于构建靶向CAR-巨噬细胞的CD19-和CD22-的胞内结构域。CAR-巨噬细胞含有任何含有ITAM的细胞内结构域，CD3ζ，FcRγ或Megf10，具有相当的吞噬效率，而含有Bai1和MerTK细胞内结构域的CAR-巨噬细胞不能结合到目标珠。大多数CAR-巨噬细胞只内在化目标细胞的碎片，类似于trogocytosis或啃噬活细胞的现象。全细胞吞噬少见。阻断“don’t eat me”信号CD47或CAR的抗体含有FcRγ-PI3Kk招募域，增强了整个细胞的吞噬作用，但在孵育4-8小时后，仍只有不到10%的巨噬细胞包含整个细胞。Klichinsky等人报道了CD3ζ-based anti-HER2 CAR-巨噬细胞的产生和表征。在本研究中，一个复制无能腺病毒载体被用来高效和可复制地将CAR传递到巨噬细胞。腺病毒感染诱导CAR-巨噬细胞M1分化，并使TME向促炎状态倾斜，而不是与大多数肿瘤相关的抗炎M2状态。此外，腺病毒转导的CAR-巨噬细胞作为专业的抗原呈递细胞，除了靶向抗原外，可以交叉呈递肿瘤来源的抗原，从而更有效地激活T细胞。与这些体外发现一致，这些CAR-巨噬细胞显著延长了携带肿瘤植入物的小鼠的生存时间，并减少了肺转移。L.Zhang等人报道的一项研究通过诱导多能干细胞(iPSCs)来源的CAR-巨噬细胞解决了生物工程巨噬细胞用于癌症免疫治疗的低效问题。在本研究中，利用非整合的episomal载体编码重编程因子来诱导iPSC克隆。然后含有CD86和FcRγ 细胞内结构域的CAR被转导到iPSC诱导的巨噬细胞中。这些iPSC衍生的CAR-iMACs巨噬细胞(CARiMACs)具有M2表型。然而，在与目标细胞相遇时，这些CARiMACs可以吞噬目标癌细胞，并向促炎M1状态倾斜。体内研究表明， CARiMACs可以扩展、持久并发挥其抗肿瘤活性。W.Zhang等人利用CAR-巨噬细胞来解决细胞外基质(ECM)引起的肿瘤免疫细胞浸润不足。ECM为T细胞渗透到肿瘤部位并发挥其抗癌免疫功能创造了一个物理屏障。CAR-T细胞靶向癌症相关的成纤维细胞或基质降解酶，肝素酶，可以促进免疫细胞浸润和增强抗癌免疫。在Zhang的CAR-巨噬细胞中，靶向HER2的scFv是结合到铰链区域和CD147跨膜和细胞内结构域，生成CAR-147巨噬细胞。CD147通过基质金属蛋白酶（MMPs)的表达对ECM重构至关重要。由于CD147不转导吞噬信号， CAR-巨噬细胞与靶细胞的结合显著上调了某些MMPs的表达，但不影响其他巨噬细胞功能，如吞噬、活性氧(ROS)的产生和炎症细胞因子的分泌。与体外实验结果一致， CAR-147巨噬细胞上调少量MMPs的表达，显著降低肿瘤中胶原含量，诱导CD3+ T细胞浸润，抑制肿瘤生长。Niu等人报道了一项使用CAR-巨噬细胞靶向表达ccr7的免疫抑制细胞进行癌症免疫治疗的研究。这个组以前发现脂滴高-(LDhi)免疫抑制细胞表达cc趋化因子受体7(CCR7)，在肿瘤组织中积累，抑制抗癌免疫。因此， CAR巨噬细胞被设计表达CCR7自然配体CCL19 (C-C Motif Chemokine ligand19)作为细胞外结构域，以靶向表达CCR7的免疫抑制细胞。为了开发一个最佳的CAR结构，我们使用并比较了以下细胞内结构域:TLR2, TLR4, TLR6,MerTK，或经典的CAR- t激活域，4-1BBCD3ζ。含有MerTK或CAR-m(MerTK)的CAR-巨噬细胞在体外具有最强的吞噬和细胞杀伤活性。由于CCR7也在毛囊和肠绒毛中表达，当使用大剂量CAR-M(MerTK)时，观察到靶向非肿瘤毒性。低剂量时，能诱导CD3+T细胞向肿瘤浸润，增加促炎细胞因子的产生，抑制肿瘤生长，延长总生存期，减少转移，且毒性小。表5 近期CAR-巨噬细胞研究CAR-巨噬细胞的临床发展现状进展到目前为止，只有一项CAR-巨噬细胞的I期临床试验(Clinicaltrials.gov标识号:NCT04660929)。如上文所述，本临床试验是基于Klichinsky等人开发的CAR-巨噬细胞。本试验使用嵌合腺病毒载体Ad5f35修饰的CAR-巨噬细胞，并携带靶向HER2的单链抗体。腺病毒感染诱导巨噬细胞分化为促炎性M1样表型。该临床试验于2021年2月开始。到目前为止，还没有报告结果。第二项CAR-巨噬细胞研究也被注册(Clinicaltrials.gov标号:NCT05007379)。这是不是临床试验。本研究是一项观察性研究，目的是确定CAR-巨噬细胞在来自100名患者的患者源性类器官中的抗肿瘤活性。CAR-巨噬细胞的局限性CAR-巨噬细胞仍处于初期阶段，仅启动了一项临床试验，尚无结果报道。因此，许多限制还有待揭示。类似于CAR-T和NK细胞，CAR-巨噬细胞将需要经过7个步骤沿着癌症免疫周期来实现细胞毒性作用。巨大的努力正在优化CAR-巨噬细胞的结构，制造，储存，肿瘤浸润，和保留细胞毒性在TME。重复给药可能需要维持足够的CAR-巨噬细胞水平，以进行积极的癌症监测。使用巨噬细胞进行ACT治疗的一个主要优点是它有向肿瘤迁移和浸润的倾向。随着促炎型M1和抗免疫型M2表型间分化的可塑性，巨噬细胞向肿瘤的高浸润和向M2表型分化可促进肿瘤的生长和转移。M1表型的分化和保留正在研究中。结论综上所述， ACT联合CAR-T治疗已取得了较好的疗效迄今为止， FDA批准的5种CAR-T疗法在血液系统恶性肿瘤方面取得了巨大进展。实体肿瘤的CAR-T治疗由于缺乏癌症特异性抗原、 CAR-T细胞迁移到肿瘤部位的效率低、免疫抑制TME等原因而滞后。CAR-NK细胞也被研究并转化为临床试验。CAR-NK细胞有几个优点。有限的NK细胞寿命意味着更低的靶向/非肿瘤毒性风险;NK细胞释放的不同细胞因子谱降低了细胞因子释放综合征和神经毒性的风险；和降低的异源反应性的风险，允许使用NK细胞系生成现成的异源CAR-NK细胞。巨噬细胞是TME主要的浸润细胞之一。即使是免疫抑制的M2巨噬细胞也具有很强的吞噬活性。最近， CAR-巨噬细胞正在被探索作为一种替代方法的ACT。一项针对HER2表达实体肿瘤的CAR-巨噬细胞的临床试验正在进行中，临床前研究已经显示出有希望的抗肿瘤活性。未来的CAR-巨噬细胞治疗仍然需要克服CAR-T治疗遇到的一些其他障碍。由于肿瘤相关的巨噬细胞是TME的主要细胞类型和主要的免疫调节因子，因此开发CAR是一个主要的研究方向巨噬细胞不仅是一种吞噬机制，更重要的是，它是一种抗原呈递剂、TME修饰剂和免疫刺激剂，以促进抗肿瘤免疫。由生物制品圈&抗体圈主办的“2023生物制品工艺发展大会”将于9月22-23日在上海举办，本次大会将主要聚焦生物制品前沿技术、CMC、生产、工艺等热点话题进行探讨交流，涉及人用疫苗、兽用疫苗、抗体药、细胞治疗、基因治疗等生物制品领域。届时将邀请生物制品领域经验权威的专家进行报告，欢迎各界同仁参会学习交流。1.会议名称：2023生物制品工艺发展大会2.会议时间：2023年9月22-23日（周五、周六）3.会议地点：上海（酒店定向通知）4.主办单位：生物制品圈、抗体圈5.媒体支持：药时空、药创客、细胞基因研究圈6.报名方式及费用：扫描识别下方二维码进行报名登记。转发分享福利：生物医药研发企业、科研院校和监管机构人员，前100位报名人员转发分享至朋友圈本通知可免费参会（不含餐饮）报名后，加微信13585867695发截图给工作人员即可。组委会获得报名信息后，根据报名信息进行初筛，并进一步与报名者沟通确认，实现精准邀请，最终有机会进入大会微信群（严格审核通过）。各类商务合作咨询：13585867695（同微信）大会日程识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入生物制品微信群！请注明：姓名+研究方向！版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

阅读指南篇幅较长，可根据兴趣选择阅读1T细胞与CD分子 预计阅读时长 1 min2靶点结构           预计阅读时长 1 min3信号通路           预计阅读时长 1 min+ 8 min4疾病&药物类型  预计阅读时长 1 min5研究现状           预计阅读时长 1 min6活性检测细胞株  预计阅读时长 3 minT细胞与CD分子T淋巴细胞（T lymphocyte) 简称T细胞，起源于骨髓的多能干细胞，在胸腺内胸腺激素的诱导下，分化为成熟的T淋巴细胞，再通过淋巴及血液循环分布到全身免疫器官及组织，发挥免疫杀伤及免疫调控等功能。分化簇（cluster of differentiation, CD）专指白细胞膜上的抗原或抗原识别的抗体，又称为白细胞分化抗原（leukocytedifferentiation antigen，LDA），如CD3、CD20和CD25等。它们多是细胞膜上的穿膜蛋白或糖蛋白（目前“CD”不仅代表白细胞表面抗原，还有红细胞、血小板和髓系细胞表面抗原，以及其他组织细胞表面或细胞内容的抗原）。这些CD分子是T淋巴细胞及其亚群之间相互识别的分子基础，广泛参与免疫细胞的抗原识别、细胞黏附及信号转导，是炎症发生、免疫应答、肿瘤转移等一系列重要生理和病理过程的分子基础。T细胞的活化是启动适应性免疫应答的关键步骤。下面我们将介绍CD3 /T细胞受体（T cell receptor，TCR）的信号转导。靶点结构CD3分子作为重要的白细胞分化抗原表达于所有T淋巴细胞表面，是T淋巴细胞鉴定的重要标记。CD3分子包括εδ、εγ 和ζζ 二聚体。在CD3γ，δ，ε 三条链中含有高度保守的酸性氨基酸残基( CD3γ 为谷氨酸，CD3δε 为天冬氨酸) ，这使三条肽链中的酸性氨基酸残基可以与TCR α 和β 链上的碱性氨基酸残基形成稳定的结构。在CD3胞质段含免疫受体酪氨酸活化基序( immunoreceptor tyrosine-based activation motif， ITAM) ，CD3γ，ε 和δ 链，每个包含一个单一的ITAM，而每个ζ 链含三个不同的ITAM( ζa，ζb 和ζc) ，共计10个ITAM 序列。成熟的TCR是由α 和β 链以共价连接的异源二聚体( TCR αβ) ，TCR的二级结构分别由259(α)个和296(β) 个氨基酸残基组成。TCR的α，β 链包含一个可变结构域(V) 和一个恒定的免疫球蛋白结构域(C) ，其中V主要功能为识别抗原,C的功能是通过一个半胱氨酸与另一个链形成巯基桥。图1.CD3结构示意图信号通路CD3靶点参与的信号通路主要有以下几个：TCR信号通路：CD3靶点与TCR复合物结合后，可以促进TCR复合物的聚集和激活，从而启动TCR信号通路。T 细胞受体 (TCR) 激活可促进许多信号转导级联反应，通过调控细胞因子产物、细胞生存、增殖和分化来最终决定细胞命运；PI3K-Akt信号通路：CD3靶点激活后，可以通过激活PI3K-Akt信号通路，促进T细胞增殖和生存，并调节T细胞的免疫应答； MAPK信号通路：CD3靶点激活后，可以通过激活MAPK信号通路，促进T细胞的增殖、分化和功能调节； NF-κB信号通路：CD3靶点激活后，可以通过激活NF-κB信号通路，促进T细胞的增殖、分化和生存，并调节T细胞的免疫应答；Ca2+信号通路：CD3靶点激活后，可以通过激活Ca2+信号通路，促进T细胞的增殖、分化和功能调节，并调节T细胞的免疫应答；总之，CD3靶点参与的信号通路非常复杂，其作用涉及到T细胞的增殖、分化、生存和免疫应答等多个方面。CD3/TCR信号通路（详解篇）拓展篇图2.CD3 /TCR 复合物信号通路示意图CD3 /TCR 复合物是CD3分子通过盐桥与TCR以非共价键相连而成，参与T淋巴细胞识别、黏附、活化抗原和信号转导。而CD3 /TCR复合物不仅负责抗原识别和信号传递，还利用不同的模块和分子控制抗原在细胞表面的表达。在未成熟的T淋巴细胞，CD3 /TCR识别由主要组织相容性复合体( major histocompatibility complex，MHC) 呈递的内源性抗原肽触发出信号，使未成熟T淋巴细胞在胸腺经历阳性选择和阴性选择，从而成为外周幼稚T淋巴细胞。在成熟T淋巴细胞，外来抗原肽与自身MHC结合后活化CD3 /TCR复合物，后者是抗原特异性T淋巴细胞分化为效应或记忆T淋巴细胞的关键性一步。在这一过程中，CD3ε发挥关键作用，阻断CD3ε 可导致T淋巴细胞停留在双阴性阶段，而阻断CD3δ 和CD3γ 没有造成这样的缺陷，而缺陷的TCR信号同样可导致T淋巴细胞的选择不当和自身反应性T淋巴细胞的产生，或使T细胞无法识别、清除抗原。免疫突触是一种特殊的细胞间连接，CD3+T 细胞和APC之间免疫突触的形成依赖于TCR和整合素的参与,TCR信号在细胞间接触部位的边缘激活Arp2 /3与支链肌动蛋白丝复杂聚合反应，驱动CD3+T细胞在APC表面聚集，触发免疫突触的形成。这涉及表面受体、胞内小泡和APC或靶细胞快速、协调的移向接触点。而TCR与MHC特异性结合是导致免疫突触装配的主要事件。TCR识别并结合由MHC分子呈递的抗原肽，导致CD3的ITAM 保守序列的酪氨酸残基被T细胞内的酪氨酸蛋白激酶磷酸化。淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶( lymphocyte-specific protein tyrosine kinase，Lck) 和原癌基因酪氨酸蛋白激酶都属于Src 家族激酶，其中Lck 有4个监管结构域: SH4，UD，SH3和SH2。ITAM酪氨酸残基已被发现可以与Lck结构域相互作用，影响Lck的底物选择性。Lck对CD3链具有强选择性，而CD3ε 是最有利的，这是因为CD3ε残基序列和Lck UD 的酸性残基之间丰富的离子相互作用。功能试验表明，通过CD3ε 募集Lck控制TCR磷酸化的启动。在生理pH 值，人CD3ε 和CD3ζ 分别携带+11，+5的电荷，而CD3δ 和CD3γ携带0电荷。静息T 细胞表面的CD3ε 和CD3ζ 可以通过离子相互作用绑定到质膜的酸性磷脂上，这可以使双层膜上的关键酪氨酸发生磷酸化。而这种安全的绑定控制可以被Ca2+和其他因素去除活化的T细胞，使酪氨酸磷酸化时CD3ε 和CD3ζ是可用的。可逆的脂质结合CD3ε 和CD3ζ 使调控ITAM的磷酸化更精确。这种机制是否也适用于CD3δ 和CD3γ 仍不清楚。ITAM 的磷酸化是T细胞活化信号转导过程早期阶段的重要生化反应之一，而有缺陷的TCR信号可导致T细胞的选择不当。骨髓衍生抑制细胞介导CD3 /TCR的抑制作用，这些细胞产生过度的活性氧类和过氧化亚硝酸盐从而改变TCR识别抗原肽的能力，同时肿瘤微环境中炎性因子亦诱导骨髓衍生抑制细胞的聚集，增加其抑制活性，从而促进肿瘤生长。其机制为有效的免疫反应的开发提供了药理学干预的可能性。疾病&药物类型CD3靶点是一种常见的免疫治疗靶点，它能够激活T细胞，诱导它们攻击癌细胞。基于对CD3的认识加深，近年来CD3靶点在以下领域展露出成药的潜力和希望： CAR-T细胞治疗：CAR-T细胞（嵌合抗体受体T细胞）是一种最先进的靶向治疗方法，它可以改造患者的自身T细胞，美国国家过敏和传染病研究所针对免疫缺陷综合征在研的靶向CD3×CD19的一款CAR-T药物目前处于临床2期；单克隆抗体：如Teplizumab（泰普利单抗，Provention Bio），作为CD3抑制剂，是一个可以延缓1型糖尿病前期的药物。该药物也于2022年11月17日获得FDA批准上市，是除了胰岛素外，全球首个用于1型糖尿病的first-in-class生物药.双特异性抗体：双特异性抗体是一种能够同时识别CD3和肿瘤细胞上的抗原的抗体，它可以促进T细胞攻击靶细胞。这种治疗方法还处于研究阶段，但已经显示出很大的潜力；三特异性抗体：近日，Sanofi RD的科学家们设计了一款HER2/CD3×CD28三特异性抗体（通过CD3和CD28双信号通路刺激T细胞的激活和增殖），并调查了这类三抗抵抗乳腺癌的潜力；2021年底，博锐生物的三特异抗体BR110（CMG1A46）的临床试验请求获国家药品监督管理局同意，这是全球首个获批临床的CD3/CD19/CD20三抗产物；2022年6月，惠和生物首个靶向CD19/CD3/CD28的三特异性抗体CC312的IND申请获得FDA默示许可，这是国内首个、全球第三个基于CD28共刺激信号进入临床研发阶段的三特异性抗体。 融合蛋白：2022年1月，Immunocore公司的Tebentafusp被FDA批准用于治疗HLA-A*02:01阳性、不可切除或转移性葡萄膜黑色素瘤成年患者。Tebentafusp作为 一种双特异性融合蛋白，通过高亲和力 T 细胞受体 (TCR) 结合域和抗 CD3 T 细胞接合域引导 T 细胞杀死表达 gp100 的肿瘤细胞。图3.CD3-BsAbs在肿瘤中的作用机制CD3靶点作为新型的免疫治疗方法，正在不断地发展和完善，它将为患者提供更为有效的肿瘤治疗方案。研究现状目前，海内外布局CD3靶点相关生物药研究管线的公司和机构很多。在国内市场，CD3同样是药物研发的主要靶点，国内有2款CD3相关抗体药已经获批上市，为安进开发的靶点为CD3×CD19的倍利妥（Blinatumomab）和抗人T细胞CD3鼠单抗（武汉生物制品研究所）。全球范围内，以CD3为双抗药物研发主要靶点的在研项目总计262项。除此之外，共有124款处于临床阶段，121款处于临床前或申报临床阶段。从靶点组合看，CD3×CD20组合的双抗药物布局最多共26款，其中3款已经获批（Epcoritamab、Glofitamab、Mosunetuzumab），9款已进入临床阶段；CD3×BCMA组合的双抗布局数量排名第二，共21款，其中一款批准上市（Teclistamab），一款上市申请中（Elranatamab），14款已进入临床阶段。靶点组合为VEGF×CD3组合的双抗共计16个项目，8款处于临床阶段，1款处于IND申报阶段。相较于其它类型的双抗产品，CD3双抗研发目前遇到的主要问题有严重的细胞因子风暴(CRS)、招募泛T细胞亚群和实体瘤疗效不明显等，这些问题大大降低了CD3双抗临床试验的成功率，也亟待新技术的解决。活性检测细胞株传统CD3 靶点活性是以体外刺激T细胞的强弱程度来检测抗体体外活性的强弱，该方法重复性差、不够稳定，导致结果准确性差。甲贝医药通过构建报告基因细胞株作为效应细胞，抗体的Fab区结合靶细胞的抗原区，和报告基因细胞株表面的CD3结合，从而激活下游信号通路，诱导报告基因Luciferase 的表达， Luciferase 的信号值高低和抗体活性成正比。图4.CD3活性检测细胞株机制图甲贝医药构建的报告基因法优势如下：方法稳定、变动小；实验窗口大、响应值高；利用转基因构建的效应细胞可稳定传代；该细胞株可以作为所有CD3靶点抗体活性检测的效应细胞；适合放行、长期稳定性检测，方便方法验证；数据展示物料信息细胞：Jurkat-CD3-Luc（甲贝医药,CAT#SBTCL008）药物：Anti-CD3 Ab （甲贝医药）实验培养基：99%RPMI 1640+1%FBS反应底物：ONE-Glo Luciferase Assay System数据流式结果利用流式细胞仪FACS检测Jurkat-CD3-Luc 细胞株表面CD3的表达情况，用Jurkat空细胞做阴性对照对比，结果表明Jurkat-CD3-Luc 细胞株的CD3阳性率高达97%，细胞株表面高表达CD3，结果见图5和表1。图5.Jurkat-CD3-Luc 细胞株表面CD3表达流式结果图表1.Jurkat-CD3-Luc细胞株流式结果数据表 专属性考察用Anti-CD3 Ab 抗体和不相关抗体Human IgGs检验Jurkat-CD3-Luc 细胞株的专属性，结果显示Jurkat-CD3-Luc 细胞株对Anti-CD3 Ab 抗体有明显的剂量依赖效应，而无关抗体Human IgGs没有剂量依赖效应。专属性结果如下图6。图6.Jurkat-CD3-Luc 细胞株专属性考察结果（Ab1和Ab2都是CD3抗体）代次稳定性考察验证细胞Jurkat-CD3-Luc的代次稳定性，用P10、P21 和P29 代次的细胞对比做活性实验，结果显示在P29 次内实验方法依然稳定，曲线表现一致，EC50 变化在接受标准范围内，因此此细胞株在P29 次内稳定。代次稳定性考察结果图如下图4。图7.Jurkat-CD3-Luc 细胞株放入代次稳定性考察结果文献引用[图12] 川大生物治疗国重杨金亮课题组[1] 殷和松,孔英君,李世敏等.CD3/TCR的信号转导及CD3+T淋巴细胞在实体肿瘤中的表达[J].医学综述,2018,24(11):2150-2154.[2] Combined Immunoscore of CD103 and CD3 Identifies Long-Term Survivors in High-Grade Serous Ovarian Cancer[J]. Hans-Christian B?smüller;;Philipp Wagner;;Janet Kerstin Peper;;Heiko Schuster;;Deborah Lam Pham;;Karen Greif;;Christine Beschorner;;Hans-Georg Rammensee;;Stefan Stevanovi?;;Falko Fend;;Annette Staebler.International Journal of Gynecological Cancer,2016[3] https://diabetes.ucsf.edu/teplizumab甲贝医药活性检测平台在抗体药物的临床前研发中，一旦确定抗体药物的分子形式并在哺乳动物细胞中表达出抗体蛋白分子后，就需要对抗体的活性进行验证与测定。活性测定是对药物的有效成分和含量以及药物效价的测定，是确保抗体类药物有效性的重要质控指标。现阶段抗体药物的活性分析方法主要是体外(in vitro)检测，主要有基于细胞、转基因细胞以及新技术应用三方面对抗体药物活性测定的方法。报告基因检测系统就是其中一种方式，由于其方法稳定，方便验证，被广泛用于批次放行、稳定性检测。甲贝医药提供多种热门靶点的活性报告基因细胞株，拥有完善的单抗、双抗及多抗的活性细胞株检测体系，如CD3/EGFR、PD-1/CTLA4、PD-L1/CD47、PD-L1/TGFβ和PD-L1/VEGF等双抗分子活性检测，可按照客户需求，提供定制化方案。相关细胞株产品具有构建资料完整、溯源性好、稳定性好和便于方法验证等优势，符合客户GMP检测的需求，非常适合放行/稳定性检测，能够满足客户IND/NDA申请要求。我们的产品具有：试剂采购发票完整，细胞株构建记录完整，溯源性好，可以满足中美双报要求大量数据验证，专属性，重复性、精密度，代次稳定性表现良好产品手册ROA指导客户建立方法根据客户需求建立相应活性用细胞株及方法甲贝医药活性细胞系目录（限时优惠）点 击 链 接 靶 点 专 题Insulin|GIP|GLP1|GH|FSH|PD-1/PD-L1|CTLA4|CD32a|CD47|CD16a|VEGF|TRKA【近期活动】甲贝医药（Shell BioTech）是一家线上和线下联动的新型生物药 CDMO技术服务平台，致力于为客户的蛋白抗体类药物提供从“Shell DA™（可开发性评估） 到 IND”一站式技术服务，如靶点调研、市场分析、分子设计和筛选、成药性评估、细胞株构建、生产工艺开发、IND 申请和 cGMP 生产等,同时提供美国及欧盟报批所需的全部药学资料，也为核酸类和 XDC 药物提供专业高效的研发服务和技术支持。目前，已经与40多家医药企业合作，加速生物药创新开发。我们将始终坚守让好药、让健康属于每一位患者的使命，坚持客户第一，加速生物药创新，赋能未来！甲贝医药测试事业部（STD）依托甲贝医药一站式CDMO平台丰富的生物药生产和质量分析经验，为抗体、重组蛋白、细胞因子、蛋白偶联物、多肽、mRNA类、小分子核酸类和细胞疗法等新型药物，提供从Discovery到 Manufacturing全流程、个性化的质量解决方案，特色服务有mRNA药物的可开发性评估、分析检测和加帽率检测等。固定电话：021-5470 6068手机：191 2130 9459邮箱：service@shellbiotech.com网址：www.shellbiotech.com地址：中国上海闵行区梅陇镇景联路258号6号楼期待您的来电！

免疫球蛋白的开发和临床应用已经产生了一类强大的新的癌症治疗方法。以高亲和力和特异性、长血清半衰期和细胞杀伤力为特征，抗体在20世纪90年代出现，第一个基于抗体的肿瘤药物（利妥昔单抗）在1997年获得批准。从那时起，全球抗体肿瘤市场已经增长到2021年的460亿美元，预计到2026年底将增长到近800亿美元，有多种新的治疗方式处于后期临床开发阶段。 2023年2月20日，来自悉尼加文医学研究所的Daniel Christ教授等在Nature Cancer上发表了题为Advances in antibody-based therapy in oncology的综述，概述了领域的主要进展，特别关注于最近和新兴的工程抗体候选物，讨论其分子结构和作用机制，为临床开发和实践提供信息。 人类抗体的分子特性 人类抗体分子有五种不同的同种型，分别为IgG、IgA、IgM、IgD和IgE。其中，人类IgG同型和相关的抗体片段最常用于治疗目的。人类IgG分子约为150 kDa，由两条重链和两条轻链组成，通过二硫键连接（图1）。单克隆抗体表现出相对缓慢的组织渗透性和较长的血清半衰期。优化单克隆抗体药物的分子工程包括旨在延长其血清半衰期，增强靶亲和力，增强效应功能，降低免疫原性和改善其可发展性的策略（图1b）。 作用机理 单克隆抗体能够通过一系列的机制来执行其治疗作用，这些机制包括从简单的阻断到激活和增强我们的自然免疫反应。 受体和配体阻断 由于其高亲和力和特异性，单克隆抗体可以与特定的细胞群相互作用，从而能够干扰对肿瘤存活和增值至关重要的受体。这种作用模式在一定程度上与表皮生长因子受体(EGFR)/人上皮生长因子受体(HER)1、HER2、HER3和HER4的受体酪氨酸激酶相互作用的曲妥珠单抗(Herceptin)和西妥昔单抗(Erbitux)的活性有关。相反，配体阻断是贝伐珠单抗（Avastin）的主要作用机制，它能阻止血管内皮生长因子（VEGF）与其同源受体（VEGFR1和VEGFR2）的结合，抑制血管生成和新血管的形成（图2）。抗体可以竞争性地与这些受体和配体结合，从而阻断配体与受体的相互作用和下调信号传导，也可以抑制受体的多聚化。 直接细胞毒性 靶细胞的直接细胞毒性是B细胞恶性肿瘤中靶向CD20的II型单克隆抗体的作用机制。这和类似于细胞坏死的程序性细胞死亡过程相反，后者依赖于肌动蛋白重组、溶酶体膜通透化和随后释放的活性氧和组织蛋白酶B。除了II型抗CD20抗体，靶向CD52、CD47、HLA-DR、CD74和CD99的抗体已被报道通过类似的肌动蛋白依赖性、caspase非依赖性机制诱导靶细胞的直接细胞毒作用。 介导靶癌细胞的直接细胞毒性的另一类治疗性单克隆抗体是那些设计用于激活死亡受体的抗体。例如，肿瘤坏死因子（TNF）相关凋亡诱导配体的受体DR4和DR5被单抗作为靶点，再现其凋亡诱导作用，导致Fas相关蛋白的募集，随后形成死亡诱导信号复合物，启动依赖caspase的凋亡性细胞死亡。目前该类药物处于临床开发阶段。 免疫效应器功能 尽管在肿瘤学中开发单克隆抗体的基本原理最初集中在直接抑制细胞信号和受体多聚化，但现在越来越明显的是，免疫效应器功能在许多治疗方式中发挥着关键作用。这种功能是通过抗体分子的Fc区与免疫细胞上的Fcγ受体（FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIIa和FcγRIIIb）以及补体的C1q蛋白之间的相互作用来介导的。不同的IgG亚型对不同的FcγR和补体有不同的亲和力和结合模式。因此，效应器功能和细胞招募可以通过选择性设计单抗来定制。 免疫检查点阻断 细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4（CTLA-4）是一种免疫检查点分子，在细胞毒性T淋巴细胞上高度表达。CTLA-4通过一系列受体-配体的相互作用和对B7配体的高亲和力，从而阻断刺激性信号和下调T细胞活性，推动免疫抑制和肿瘤逃避免疫监视，CTLA-4与共受体CD28有竞争性拮抗作用。Ipilimumab是一种针对CTLA-A的高亲和力的人类单克隆抗体。PD-1及PD-L也是单克隆抗体靶点，其他的免疫检查点也是备受关注的焦点，包括淋巴细胞激活基因-3（LAG-3）、T细胞免疫球蛋白及粘蛋白结构域分子3（TIM-3）以及T细胞免疫球蛋白和ITIM结构域（TIGIT）。将新的免疫检查点抑制剂的临床前结果转化为临床的具有挑战，所以需要建立临床前模型，更准确地确定其与该领域成熟药物的协同效应。 免疫受体激动剂 通过免疫检查点阻断诱导T细胞激活以促进抗肿瘤反应的一种相反的方法是使用激动性抗体。从蛋白质工程的角度来看，与开发阻断性抗体相比，确定能够触发激动性信号的单克隆抗体需要额外的考虑。应谨慎管理诱导明显的免疫细胞激活导致严重的毒性的风险，以避免严重的不良事件。目前正在临床开发的单克隆激动剂抗体包括针对41BB、OX40、GITR、ICOS和CD27的药物。激动性抗体的活性可以通过在FcγR阳性细胞表面的Fc交联来增强，特别是通过表达高水平抑制性受体FcγRIIb的B细胞。因此，开发以Fc交联为条件诱导T细胞激活的较弱的激动剂，可能会导致T细胞激动剂的安全性提高。除了T细胞激活，免疫受体激动剂单克隆抗体的一个意想不到的作用机制是，由于调节性T（Treg）细胞表面的共刺激受体水平增加，导致调节性T（Treg）细胞的渗入和耗竭，从而使抗肿瘤反应得到增强。这种双重作用机制在评估靶向GITR、OX40和ICOS（以及CTLA-4）的单克隆抗体活性的临床前研究中已被广泛报道。 抗体-药物结合物 这类疗法结合了抗体的靶向能力和小分子的抗肿瘤活性。目前，有13种ADCs被批准用于治疗实体瘤和恶性肿瘤。ADCs由一个靶向肿瘤抗原的抗体和一个将抗肿瘤药物（有效载荷）连接到抗体上的连接体组成。为了引起细胞毒性，ADC与癌细胞表面的靶点结合，被内化并进入溶酶体，在那里连接体或抗体的裂解和/或蛋白分解导致有毒载荷的释放。ADC靶点对于治疗实体肿瘤和血液系统恶性肿瘤来说是不同的，在实体瘤中，抗体靶点的选择主要集中在过表达的表面蛋白上，这些蛋白能够通过快速内化将ADC运送到癌细胞中。在恶性血液病中，细胞系限制性靶点的存在提供了降低健康上皮组织毒性的优势。识别成功的ADC靶点一般侧重于肿瘤和健康组织之间mRNA的差异表达；然而，人们越来越重视通过蛋白质组学方法识别可能代表靶点的细胞表面抗原，这种方法有可能发现具有重要功能的靶点。 已获批准的ADC携带的有效载荷属于三个机理类别：(1) DNA双链断裂诱导剂，如卡利卡霉素和吡咯苯并二氮杂卓；(2) 微管抑制剂，如auristatins和 maytansinoids；以及(3) 拓扑异构酶抑制剂，如SN-38和DXd。有效载荷和药物-抗体比率的选择来自于靶点特性和肿瘤生物学。有效载荷的日益多样化可能使ADC-ADC组合和顺序治疗策略在不久的将来成为可能。 许多ADCs也正在评估与癌症治疗药物的组合，这些治疗药物的作用机制与有效载荷的作用机制互补。了解特定有效载荷的作用机制，同时确定敏感性和耐药性的生物标志物，可能有助于确定提高治疗指数和/或克服耐药性的合理组合。 抗体片段、双特异性T细胞衔接器和TCR模拟物 抗体片段与全长IgG抗体的不同之处在于它们的尺寸减小，血清半衰期缩短，同时保留了大部分的特异性结合特性。因此，它们很适合于介导短期的药理作用，特别是对于治疗窗口小、不良事件风险高的适应症或靶点。 按照这一逻辑，抗体片段的主要是作为细胞毒性或放射性药物的载体，以及在双特异性T细胞衔接器（BiTEs）中的应用。BiTEs是T细胞和癌症靶细胞之间相互作用的桥梁，它通过针对T细胞受体复合体(CD3ε)的激发型抗体片段与T细胞结合，通过第二个基因融合的抗体片段与肿瘤抗原结合，从而形成一个人工免疫突触，促进T细胞介导的对靶细胞的杀伤（图2）。由于T细胞激活可导致治疗相关的不良事件发生，包括细胞因子释放综合症和神经系统毒性。BiTEs的半衰期短，有助于此类不良事件的处理；然而其较短的血清半衰期也会导致繁重的管理，患者往往需要长期持续输液。随着新一代药物进入临床，仔细处理不良事件将是至关重要的。尽管有这些挑战，但大量的BiTE候选物具有相当大的治疗前景。 近年来，使用TCR模拟抗体片段作为靶向分子的BiTE和CAR-T细胞模式的发展受到了极大的关注。这种抗体被设计用来识别MHC抗原，从而增加了靶向抗原库，包括由MHC处理和呈递的细胞内蛋白质。TCR模拟抗体的开发由于可能与其他多肽发生交叉反应、与呈现的HLA等位基因发生反应以及与其他HLA等位基因发生异体反应而变得复杂。 放射免疫偶联药物 放射免疫偶联药物（RICs）是一类新兴的癌症靶向治疗，区别于传统的外部放射治疗，RICs采用靶向剂来进行治疗性放射的系统传递。与ADC类似，靶向剂可以是完整的抗体或衍生物（例如Fabs、scFvs和minibody）、肽或小分子配体。与ADC不同，RICs中通过一种螯合剂而不是连接体来非共价地捕获放射性核素，螯合剂和放射性核素共同构成了治疗的有效载荷。 治疗性RICs主要采用两类放射性核素：α-粒子和β-粒子发射体，后者在较长的范围内提供低能量，而前者则在短距离内集中高能量。它们不同的特性为α和β发射的RIC的有效性和安全性提供了不同的优势和劣势。与ADC一样，放射性有效载荷的选择可能最好考虑几个因素，包括目标抗原概况、肿瘤微环境和肿瘤生物学。 糖基化抗体、细胞因子武装抗体和可活化的抗体 尽管天然人IgG单克隆抗体改变了肿瘤治疗方式，但改变抗体的结构可以扩大临床应用范围。这种工程变化中最常见的是调节Fc区的糖基化模式（图1b）。除了糖基化的变化，通过Fc区的点突变来调节抗体效应功能的蛋白质工程方法也已被报道。这种方法产生了特定的变体，其ADCC、CDC或FcRn结合性增加或减少，从而影响了药代动力学。 替代形式 除了IgG单克隆抗体外，在开发用于治疗的非IgG同种型方面也取得了进展。尽管非IgG抗体在某些应用中很有前景，但其临床和商业上的成功可能需要工程设计或确定特定的适应症，在这些适应症中可以证明比IgG类抗体有明显的优势。 已经描述了利用干扰素（IFN）α、TNFα以及共同的γ链受体细胞因子家族，它们通过单抗固有的免疫激活特性作为增强CDC或ADCC的替代方法。一些抗体-细胞因子融合疗法现在已经进入临床试验。 最近一项旨在扩大基于抗体疗法的治疗窗口的策略是可激活抗体的工程。蛋白酶的激活是许多蛋白酶、细胞因子和生长因子家族生物合成的一个关键特征；它们的每个成员首先以非活性或活性降低的原形表达，随后通过蛋白酶裂解将成熟的蛋白质从前体多肽中分离出来，从而激活。根据这一观察，已经研究了为单抗产生帽或掩蔽域的工程方法。 结论 距离第一个用于癌症治疗的单克隆抗体—利妥昔单抗被批准以来的25年，肿瘤学应用的抗体疗法已经进入了成熟期。尽管该领域长期以来一直由人类IgG同种型的抗体主导，但它现在正从未经修饰的形式转向高度工程化的变体，包括抗体片段、ADCs、聚糖工程和蛋白酶激活的变体以及癌症免疫疗法。然而即使是高度工程化的形式，其单一形式的治疗效果依然有限，这突出表明需要开发同时靶向多种细胞机制的组合策略。工程抗体疗法的组合及其与小分子药物和/或放射疗法的组合，可能有利于肿瘤学的变革性进展。 原文链接：https://doi.org/10.1038/s43018-023-00516-z 内容来源于网络，如有侵权，请联系删除。