E6 x MUC1 x HPV E7

摘要：mRNA疫苗作为有前景的癌症疗法已经发展起来。这些疫苗可以编码与肿瘤相关的抗原，从而实现个性化的治疗方法。它们还可以针对癌症特有的突变，并克服免疫逃逸机制。它们通过操纵身体的细胞功能来产生抗原，引发免疫反应，并通过克服与特定组织相容性白细胞抗原分子相关的限制来抑制肿瘤。然而，成功地将mRNA传递到目标细胞是一个关键挑战。病毒和非病毒载体（脂质纳米颗粒和阳离子脂质体）在保护mRNA免受破坏和协助细胞摄取方面显示出了巨大的能力。细胞穿透肽、水凝胶、基于聚合物的纳米颗粒和树状分子已被研究以增加mRNA的传递效率和免疫原性。这篇全面的综述探讨了mRNA疫苗及其用于癌症的传递平台，涉及设计考虑、多种传递策略和最新进展。总体而言，这篇综述为mRNA疫苗作为有效癌症治疗的创新策略的进展做出了贡献。 1.引言 mRNA疫苗领域在mRNA疫苗成功对抗传染病之后经历了突破性的进步。mRNA疫苗在提供针对病毒病原体的特异性和引人注目的免疫反应方面的空前成功，激发了对mRNA治疗癌症疗法的强烈研究努力。癌症疫苗历来包括与癌症相关的抗原（CAAs）、免疫刺激剂和癌症特异性抗原（Ags）。与传统疫苗相比，它们提供了多种优势，如编码多种蛋白质、引发强大的免疫反应以及促进快速开发和生产。mRNA疫苗可以表达包含众多表位的完整Ags，同时绕过主要组织相容性复合体（MHC）的限制。然而，将mRNA疫苗传递到目标细胞面临着重大挑战。 mRNA疫苗的成功在很大程度上取决于推进有效的传递平台，这些平台确保mRNA的稳定性、保护和有效的细胞内传递。各种传递平台被开发出来，以提高mRNA疫苗的效力，同时最小化潜在的不良反应。基于脂质的纳米颗粒（LNPs）在mRNA疫苗开发中至关重要，它们可以成功地封装和保护mRNA分子，促进细胞摄取，实现内质网逃逸，并帮助有效地转化为Ags。脂质化学和配方技术的最新进展显著提高了LNPs的效力，导致在临床前和临床环境中成功传递mRNA。 病毒载体长期以来被用于基因传递，并作为mRNA疫苗载体获得了相当大的关注。这些载体可以有效地转导目标细胞，实现mRNA的细胞内传递以进行后续翻译。病毒载体提供高转导效率，并可以触发强大的免疫反应。然而，安全问题、预先存在的免疫力和有限的货物容量提出了挑战，这些挑战必须得到解决，以便它们在mRNA疫苗传递中的成功应用。 基于聚合物的载体作为mRNA传递平台被探索，并由于其多功能性、生物相容性和可调节属性提供了多种优势。它们与细胞膜的有害电荷组分进行静电连接，帮助细胞摄入并促进从内质网转移。此外，将靶向配体整合到聚合物载体上允许特定部位的传递和提高效力。基于肽的传递平台作为mRNA传递平台得到了发展，它们利用其低毒性、合成简便和潜在的靶向传递能力。肽可以被设计成具有固有的细胞穿透属性或针对特定细胞表面受体，促进有效的mRNA摄取和细胞内传递。细胞穿透的、pH响应的和自组装肽在增强mRNA疫苗传递和随后Ags表达方面显示出了有希望的结果。这篇综述讨论了不同mRNA疫苗在临床前和临床开发中的现状。它通过关注关键考虑因素，如mRNA修饰、Ags选择和佐剂整合，来优化它们的设计。此外，它探讨了用于将mRNA传递到目标细胞的多种策略，包括病毒载体和基于脂质的纳米结构、基于聚合物的载体、基于肽的支架系统和纳米材料。此外，这篇综述强调了最近的进展和创新方法，如树状分子和离子电渗技术，旨在克服与mRNA疫苗传递相关的挑战。这些进步旨在提高mRNA疫苗传递平台的安全性、效力和转化潜力。我们的综述最后通过追踪mRNA疫苗及其传递策略的演变，从它们在传染病和癌症治疗中的成功应用开始。这篇综述为mRNA疫苗和先进的传递平台提供了深入的分析，为这一有前景的领域的当前状态和前景提供了宝贵的见解。 2.mRNA疫苗 RNA分子作为一类治疗药物获得了显著的认可，尤其是在成功开发2019冠状病毒病（COVID-19）疫苗之后。这一突破为针对传统上具有挑战性和“不可成药”的目标以及在基因层面治疗疾病开辟了新的可能性。mRNA疫苗代表了一种有前景的癌症治疗方法，提供了特定且耐受性良好的治疗选择，已在临床前研究中显示出对实体肿瘤的有效性。例如，采用生物信息学驱动的策略开发了一种专门针对卵巢癌和乳腺癌中的癌症抗原125（CA-125）的mRNA疫苗。疫苗设计包括自佐剂特性和计划增加树突状细胞（DCs）抗原呈递能力的元素。检测到干扰素-γ（IFN-g）和分化簇8阳性（CD8+）T细胞激活，验证了疫苗的潜力。为了获得强大的抗肿瘤效果，必须有效地传递和翻译编码肿瘤抗原的mRNA，并同时触发先天免疫反应以促进抗原呈递。因此，针对DCs是提高疫苗效率的有利方法。目前，已经探索了多种策略来特别针对DCs。一种方法涉及使用抗原传递载体，包括纳米颗粒或脂质体，这些载体装饰有与DC受体、DC-SIGN或CD40特异性相互作用的配体。这些配体促进DCs选择性地摄取抗原，促进抗原呈递给T细胞。此外，在疫苗配方中加入佐剂可以激活DCs，进一步增强其刺激免疫反应的能力。这种针对性疫苗在提高包括癌症和传染病病原体在内的各种疾病的疫苗精确度和效力方面具有巨大潜力。这一进展是治疗性癌症疫苗研究的一个重要里程碑。表1总结了不同的mRNA疫苗、目标抗原和临床前及临床试验的关键发现（表1）。 2.1.mRNA疫苗在临床前试验中 众多的临床前研究已经调查了针对多种类型癌症的各种mRNA疫苗。最近的研究调查了肿瘤衍生RNA作为设计基于树突细胞（DC）疫苗的抗原来源及其在肿瘤疫苗策略中的有效性。Kyte等人进行了自体肿瘤mRNA树突细胞（tDCs）作为针对黑色素瘤的疫苗的临床前评估。tDCs诱导了对肿瘤特异性抗原的T细胞反应。该研究表明tDC特异性反应，包括所有六名患者中的T细胞增殖，在两名患者中分泌干扰素-γ（IFN-g），以及一名患者中HLA的阻断。此外，Kyte等人证明tDC疫苗无毒性，并成功在黑色素瘤患者中诱发T细胞反应。Key等人的另一项研究旨在评估有趣的T细胞反应并调查它们作为加强剂量的持续长期效力。他们展示了针对抗原的显著细胞介导的免疫反应。此外，研究确认即使在来自单一细胞的T细胞克隆中，辅助性T细胞1/2（Th1/Th2）细胞因子谱也是混合的。这表明疫苗本身可能不足以作为单一疗法，并为其与免疫检查点抑制剂（ICIs）的结合提供了强有力的理由。这项评估突出了这种组合作为恶性黑色素瘤疫苗策略的潜在用途。 佐剂用于选择性激活不同的免疫组分，从而增强疫苗的免疫刺激性活性。mRNA疫苗中使用的佐剂可分为三组：（1）具有自我佐剂特性的RNA，（2）传递系统的组成部分，以及（3）外部免疫刺激剂。临床前调查提供了证据，证实了将ICIs和癌症疫苗结合用于非免疫原性肿瘤治疗的使用。这种方法在免疫治疗领域呈现了一个有希望的途径。Liu等人合成了带有血凝素（HA）标签的黏蛋白1（MUC1）mRNA，以制定mRNA疫苗。使用脂质/钙/磷酸盐（LCP）系统作为佐剂开发mRNA疫苗。在这项研究中，评估了编码MUC1新抗原的mRNA疫苗的有效性，旨在激活位于淋巴结内的DCs。研究展示了成功的T细胞刺激和扩增，特别是针对三阴性乳腺癌（TNBC）肿瘤。为了进一步提高mRNA疫苗的抗肿瘤效力，它与明确针对细胞毒性T淋巴细胞蛋白4（CTLA-4）的抗体结合使用。疫苗诱发了强大且针对性的CTL反应，疫苗和特定CTLA-4抗体的同时给药显著增强了对肿瘤的免疫反应。Gu等人调查了通过将Toll样受体（TLR）2/6 mRNA，特别是Pam2Cys（一种佐剂），纳入脂质纳米颗粒（LNPs）来增强mRNA疫苗效力。用这种疫苗进行免疫调节了引流淋巴结（dLNs）中的免疫微环境，导致包括白介素-12（IL-12）和IL-17在内的关键细胞因子的释放。抗原呈递主要由迁移性和dLN驻留的传统2型DCs促进，导致CD4+和CD8+ T细胞介导的强大抗肿瘤反应。 在另一项研究中，Tse等人证明编码构成型激活的干扰素基因刺激物V155M（STINGV155M）蛋白的mRNA作为增强CD8+ T细胞反应的有效遗传佐剂。疫苗诱导的干扰素刺激反应元件和核因子kB途径激活了I型干扰素反应，并增强了抗原特异性T细胞。用编码E6和E7肿瘤蛋白和STINGV155M的mRNA进行疫苗接种，导致人乳头瘤病毒阳性（HPV+）TC-1肿瘤小鼠模型中肿瘤生长减少。这项研究为mRNA编码佐剂在增强疫苗效力方面的有效性提供了令人信服的证据。 另一种方法涉及将mRNA疫苗NP与佐剂C16-R848结合使用，这增强了合成mRNA疫苗在癌症治疗中的效力。这种由编码卵清蛋白（OVA）的mRNA和带有C16-R848涂层的脂质-聚乙二醇（PEG）壳组成的配方，保留了佐剂的活性。它显著提高了mRNA转染效率，并通过MHC类I促进了抗原的呈递。这种方法通过增强OVA特异性CD8+ T细胞的增殖及其在肿瘤床中的积累，刺激了有效的T细胞介导的免疫反应。张和夏开发了一种自佐剂mRNA纳米疫苗用于癌症治疗。这种纳米疫苗由编码肿瘤抗原的mRNA和类似脂质的材料（C1）组成。它有效地将mRNA传递给DCs，并同时刺激TLR4，从而激活T细胞。重要的是，这种纳米疫苗在几个小鼠模型中显示出显著的抗肿瘤效果。 TriMix由CD40L和CD70 mRNA以及TLR4组成，在晚期黑色素瘤中展示了佐剂活性。TriMix和TriMixDC-MEL的配方，由自体单核细胞衍生的mRNA共电穿孔DCs组成，在晚期黑色素瘤中展现了安全性和抗癌效果。Van Lint等人调查了CAA mRNA（酪氨酸酶相关蛋白-2 [Trp2]、Wilms肿瘤基因1 [WT1]或酪氨酸酶）与佐剂TriMix的淋巴结内递送。这种方法诱导了DCs的成熟，促进了LNs内CAA特异性T细胞的激活。研究表明选择性地摄取mRNA疫苗，导致CD11c+细胞在LNs中编码Trp2、WT1或酪氨酸酶。TriMix mRNA的存在创造了一个吸引和刺激CD4+和CD8+ T细胞的环境，特别是针对抗原。此外，这种疫苗在诱导CTLs和在小鼠模型中产生治疗反应方面显示出与mRNA电穿孔DCs相当的效力。这项研究强调了淋巴结内递送CAA mRNA，结合免疫调节mRNA作为一种有希望的疫苗策略的潜力。 Ramos da Silva等人进行了一项研究，涉及将自扩增mRNA以及未修饰和核苷修饰的非复制型mRNA封装进脂质纳米颗粒（LNPs）中，以开发疫苗。这些疫苗编码一种嵌合蛋白，包括HPV-16 E7肿瘤蛋白和1型单纯疱疹病毒糖蛋白D（gDE7）。该研究发现，即使是单次低剂量免疫接种这些gDE7 mRNA疫苗中的任何一种，都能激活特异性E7 CD8+ T细胞。此外，这些疫苗诱导的记忆T细胞反应能够预防肿瘤复发，并在不同生长阶段有效消除皮下肿瘤。此外，gDE7 mRNA-LNP疫苗在单剂量疫苗后，对同种异体小鼠肿瘤模型显示出显著的肿瘤保护效力。比较分析强调了这些mRNA-LNP疫苗比gDE7 DNA和gDE7重组蛋白疫苗的优越性。这项研究强调了基于mRNA的疫苗在癌症治疗免疫疗法中的潜力。 2.2.处于临床试验阶段的mRNA疫苗 最近的研究评估了使用mRNA疫苗针对癌症的可行性。在临床治疗的子宫癌患者中，给予含有WT1 mRNA的自体DC基础疫苗。HLA-A2阳性的患者观察到积极的肿瘤学和免疫学反应，而HLA-A2阴性的患者没有表现出这种反应。另一项临床试验涉及使用来自自体癌症干细胞的mRNA的单核细胞衍生的自体DC基础疫苗。接种疫苗的患者显示出强大的免疫反应和延长的无进展生存期。用剂量强度的替莫唑胺和编码pp65溶酶体相关膜糖蛋白的DC基础mRNA疫苗治疗胶质瘤患者，显示出延长的无进展生存期和增加的pp65细胞反应。Cafri等人开发了mRNA-4650，它编码自体癌症抗原。该疫苗包含来自患者肿瘤的肿瘤蛋白53（TP53）、KRAS或磷脂酰肌醇3激酶、催化亚单位α（PIK3CA）突变，以及多达15个预测的I类HLA新抗原。mRNA-4650在I/II临床阶段是安全的，并触发了针对预期新表位的突变特异性T细胞反应。由携带mRNA编码的肿瘤抗原癌症睾丸（CT）7、黑色素瘤抗原基因（MAGE）-A3和WT1的朗格汉斯型DC（LCs）组成的疫苗，通过抗原特异性CD4和CD8 T细胞诱导了干扰素-γ（IFN-γ）、白介素-2（IL-2）和肿瘤坏死因子（TNF）-α的释放，以及接种组内的克隆扩增。在临床研究中，基于DC的mRNA疫苗在多种癌症类型中显示出有希望的免疫反应和改善的生存期。 BNT162b2是一种核苷修饰的RNA和含有LNP的疫苗。Shroff等人比较了接受细胞毒性治疗的癌症患者和对照组对BNT162b2 mRNA疫苗的反应。首剂后，67%的癌症患者产生了中和抗体，第二剂后增加了3倍。尽管癌症患者显示出针对Spike蛋白的抗体和T细胞，但他们的反应比对照组弱。在癌症患者中识别出特定于Spike受体结合域的记忆B细胞亚群，可能预示着对额外剂量的更好反应。一项针对20名癌症患者的I期研究发现，给予第三剂疫苗使中和抗体增加了3倍，伴随轻微的不良反应，但没有T细胞改善。Harrington等人评估了16名慢性髓性白血病（CML）患者接受BNT162b2疫苗单剂量后的免疫效应，这些患者之前接受了酪氨酸激酶抑制剂治疗。在接种疫苗后21天内，87.5%的CML患者表现出抗Spike免疫球蛋白G（IgG），产生了中和抗体。在可评估的患者中，93.3%检测到T细胞反应，80%表现出多功能性反应，包括CD4+和CD8+ T细胞。慢性淋巴细胞性白血病/小淋巴细胞性淋巴瘤（CLL/SLL）患者在2剂BNT162b2 mRNA疫苗接种后没有显示出体液反应。然而，近四分之一的人对第三剂疫苗有积极反应。在接受积极治疗的个体和在接种前1年内接受抗CD20治疗的个体中，抗体反应率较低。Thakkar等人发现，第三剂BNT162b2疫苗在最初血清阴性的癌症患者中诱导了57%的血清转换。这种反应保持强劲，抗体水平、T细胞活性和中和能力持续6个月。在接受第三剂疫苗后没有产生足够反应的严重免疫受损的血液恶性肿瘤患者中，临床试验中的第四剂疫苗在67%的患者中增强了免疫力。然而，BNT162b2在不同队列中的免疫原性表现出差异。在骨髓增生性恶性肿瘤患者中反应强劲，达到88%，但多发性骨髓瘤患者表现出明显较低的反应，尤其是那些接受基于抗CD38的治疗的患者。总之，基于LNP的BNT162b2疫苗对接受积极化疗的癌症患者似乎是安全和有益的。 将编码抗原的mRNA和佐剂纳入阴离子脂质体配方可以增强mRNA疫苗的有效性。Tockary等人将RNA工程化，将佐剂与编码抗原的mRNA链结合起来。最终，双链RNA（dsRNA）-连接的mRNA被装载进脂质体配方中，有效地诱导了小鼠和人类DCs，导致大量促炎细胞因子的分泌。OVA mRNA配方已在临床上评估，并在小鼠淋巴瘤（E.G7-OVA）模型中取得了显著的治疗效力。精蛋白是一种小的阳离子肽，作为药物递送候选物质显示出前景。在自然界中，它通过静电键与DNA形成复合物，在精子发生过程中保护DNA的完整性。科学家采用了这种自然方法来开发药物递送平台，使用精蛋白作为RNA载体。在一项显著的应用中，为转移性黑色素瘤开发了一种受精蛋白保护的mRNA疫苗。这种疫苗编码多种肿瘤抗原，导致在I/II期疫苗接种试验中疫苗诱导的T细胞增加和免疫抑制细胞减少。RNActive由CureVac开发，使用编码OVA的修饰mRNA与精蛋白结合，赋予自我佐剂活性，触发针对癌症抗原的免疫反应。这一过程涉及TLR4的激活。RNActive疫苗可以引发强大的免疫反应，包括体液和细胞成分。它们还可以激活包括Th1和Th2细胞在内的耐药细胞亚群，这些细胞在协调免疫反应中至关重要。此外，这些疫苗可以触发短期效应反应和长期记忆反应。基于RNActive技术的mRNA疫苗CV9202显示出固有的自我佐剂特性。它可以针对非小细胞肺癌中常见的六种抗原，并刺激针对广泛CAAs的免疫反应。 CV9103和CV9104是基于RNActive技术开发的抗癌疫苗，专门设计用于针对被诊断为前列腺癌（PC）的个体的靶向治疗。在CV9103在I/II期试验成功后，目前正在对特定的去势抵抗和高风险PC患者进行CV9104作为术前新辅助治疗的临床评估。RNActive基础疫苗CV9201旨在治疗非小细胞肺癌（NSCLC）。它携带表达在NSCLC中的五种抗原的遗传信息。在一项I/IIa期剂量递增研究中，该疫苗显示出有希望的反应，在治疗后检测到免疫反应，支持进一步的临床研究。 最近，IIb期KEYNOTE-942/mRNA-4157-P201试验的积极结果代表了黑色素瘤治疗的重要进展。这项研究调查了Moderna的mRNA-4157个性化癌症疫苗，该疫苗包括一个合成的mRNA，编码34个新抗原，根据患者肿瘤的独特突变特征定制。它与Keytruda（pembrolizumab）联合作为辅助治疗，在完全切除后的III/IV期黑色素瘤患者中使用。 mRNA-4157/V940是一种开创性的基于mRNA的个性化癌症疫苗，专门针对每位患者量身定制，根据他们肿瘤的突变特征编码34个新抗原。当给药时，这种合成mRNA触发适应性免疫反应，为针对患者肿瘤突变的高度靶向的抗肿瘤反应做好准备。 将mRNA-4157/V940与Keytruda（一种增强免疫系统检测和对抗肿瘤细胞能力的免疫疗法）结合使用，预计将通过促进T细胞介导的肿瘤细胞破坏提供额外的好处。试验的突出成就是与单独使用Keytruda相比，复发或死亡的显著减少（44%）。这标志着首次证明由于程序性细胞死亡蛋白1（PD-1）阻断，高风险黑色素瘤患者的无复发生存期得到改善，并表明个性化新抗原方法在革新癌症免疫疗法中的潜力。mRNA-4157/V940的不良事件与早期I期试验一致，Keytruda的安全性概况保持一致。总之，这些开创性的结果突出了像mRNA-4157/V940这样的个性化mRNA癌症疫苗与Keytruda等免疫疗法结合使用的前景，以推进黑色素瘤治疗。它们强调了定制化新抗原方法在癌症免疫疗法中的重要性，为改善患者结果和癌症斗争中的生存带来了希望。 3.mRNA疫苗传递平台 正在评估几种mRNA疫苗技术以引发靶向免疫反应。最近的文献综述探讨了将mRNA治疗剂纳入创新纳米级配方以增强癌症免疫疗法的潜力。此外，一项全面的综述检查了各种专注于提高基于mRNA的癌症疫苗效力的策略。这些综述强调了使用mRNA技术进行癌症治疗和免疫疗法的持续研究和兴趣。 基于现有科学数据，mRNA疫苗技术大致可分为两组：裸mRNA传递方法，包括电穿孔和离子电渗（IP）技术；以及靶向传递系统，包括基于脂质的传递系统，如脂质纳米颗粒（LNPs）和脂质体；聚合物纳米系统，如胶束、树状分子和聚合物水凝胶；基于肽的传递系统；基于碳纳米材料的传递系统；以及病毒载体介导的传递系统。选择这些标准是为了确保对mRNA疫苗传递格局进行全面准确的概述，从而在这个关键领域做出有力的结论和明智的决策。 3.1.裸mRNA传递方法 直接使用mRNA在DCs中产生T细胞反应（抗原特异性）并创造能够消除癌细胞的防御性抗体。通过使用电穿孔将mRNA传递给患者的DCs，这些疫苗技术有望增强免疫系统识别和靶向肿瘤细胞的能力。在结直肠癌的背景下，一项研究对疫苗接种方案进行了比较。具体来说，这项研究评估了两种不同方法的有效性：一种是使用与HLA-A2结合的源自癌胚抗原（CEA）的肽段脉冲的DCs，另一种是使用CEA mRNA电穿孔的DCs。分析表明，使用CEA肽段脉冲DCs有效地刺激了针对结直肠癌的特异性免疫反应。使用针对晚期黑色素瘤患者的单核细胞衍生DCs的mRNA疫苗，显示出显著的CD8+ T细胞反应。同样，将编码WT1抗原的自体成熟mRNA电穿孔DCs皮内注射给急性髓系白血病（AML）患者，也显示出积极的结果。含有自体DCs电穿孔自体癌症mRNA的黑色素瘤疫苗诱导了针对抗原的强烈免疫反应，表明其在体内引发免疫反应的潜力。从人类CD34+前体获得的LCs并用电穿孔WT1 mRNA，显示出持续呈现抗原肽段并诱导强烈的自体CTLs。这种方法消除了对外部细胞因子的需求，展示了mRNA电穿孔LCs作为癌症免疫疗法疫苗的潜力。然而，mRNA基治疗的更广泛应用面临着与它们对核酸酶的敏感性、进入抗原呈递细胞的细胞内传递以及免疫共刺激相关的挑战。克服这些挑战需要确保在传递过程中的稳定性和保护的靶向传递系统。为了推进这个领域，许多研究集中在开发针对癌症治疗背景下mRNA疫苗的靶向传递策略。 最近的一项综述提供了对合成RNA修饰的尖端方法的见解。这些创新方法主要关注核苷酸的改变，包括在50 UTR和30 UTR中纳入假尿苷以及RNA甲基化。这些修饰已被证明显著增强了基于RNA的疫苗的稳定性和效力。通过提高合成RNA的耐用性和性能，这些方法在推进疫苗开发和分子治疗领域具有巨大的潜力。这个研究方向强调了核苷酸工程在优化基于RNA的干预措施结果中的作用。 将IP技术与经皮传递系统相结合，成功地给药了最少的编码gp10025-33肽（KVPRNQDWL）的mRNA疫苗。IP刺激的mRNA疫苗传递引发了免疫反应并激活了皮肤驻留的免疫细胞。这种组合导致了免疫系统的强烈刺激，显著抑制了植入黑色素瘤细胞的小鼠中的肿瘤细胞。它还上调了IFN-γ并增加了肿瘤内CD8+ T细胞的浸润，从而有助于清除肿瘤。研究证明了IP用于传递mRNA疫苗的成功，对黑色素瘤治疗具有潜在的影响。 3.2.基于脂质的纳米系统用于mRNA疫苗传递 LNPs已被记录为mRNA疫苗的多功能传递平台。这些LNPs具有多个优点，包括易于组合和成分增强传递效率及最小化毒性。此外，通过包含佐剂或免疫细胞靶向配体，实现了对免疫反应的定制。LNPs目前在临床应用中最为先进。然而，这些系统涉及多个组分，并引起必须最小化以确保安全的炎症效应。近年来，有几项研究解决了提高LNP安全性的问题。这些努力包括开发可生物降解的LNPs，工程化具有不同脂质样分子的阳离子LNPs，设计增强内质网逃逸的LNPs，以及配制聚乙二醇化LNPs以减少不良免疫反应。此外，具有与环胺辅助的头基的环保阳离子脂质，已被证明可以提高LNPs的有效性和保护力。此外，基于交替共聚物的低炎症mRNA癌症疫苗载体PHTA展示了强大的抗肿瘤免疫反应及最小的炎症副作用，使其成为开发mRNA癌症疫苗的可能策略。 LNP颗粒的大小显著影响其免疫原性。包括稳定性和对目标蛋白的亲和力在内的多种因素，可以影响依赖LNP的RNA传递。例如，带有阳离子基团的脂质促进与内质网膜的静电相互作用，并使疫苗释放到细胞质中。此外，磷脂和聚乙二醇脂质共同促进了LNP介导的RNA传递的有效性。它们影响LNP在体内的清除和分布，进而影响基于LNP的RNA传递系统的性能。此外，包括像C12-200这样的立体纯衍生物在内的阳离子脂质可以影响LNPs的mRNA传递效率，这是由于它们的立体化学。此外，胆固醇和辅助脂质的结合显著促进了使用LNPs进行mRNA转染的有效性。因此，这些不同的脂质组分对于定制LNPs以有效传递RNA至关重要。 在四个LNP组分中，阳离子脂质起着基本作用。这些脂质在其常规pKa下带有正电荷，这使得在自组装过程中加载负电荷RNA到LNPs中成为可能。重要的是，它们在中性pH下保持不变，这有助于最小化毒性并保持LNPs在储存和传递过程中的稳定性。细胞摄取后，随着内质网pH的降低，这些LNPs重新获得正电荷，这有助于它们从内质网逃逸。磷脂中的乙醇胺基团由于其融合特性，可以增强内质网逃逸。此外，LNPs中磷脂的选择可以影响其传递特性。观察到中性磷脂主要促进肝脏传递，而带有负电荷的磷脂改变了LNPs从肝脏到脾脏的靶向。这种器官靶向的选择性可能是设计治疗应用RNA传递系统的有价值特性。 胆固醇通常被纳入作为调节LNP物理性质和纳米结构的调节剂，增强细胞内传递和体内LNP稳定性。结合聚乙二醇化脂质可能增强LNPs的胶体稳定性，延长它们的循环时间。同时，这可以减少它们被细胞摄取并阻碍它们从内质网释放。 通过使用微流体系统，可以制造精确大小的NPs，实现高效RNA封装，以高效率传递。在一项研究中，LNPs在保持一致的脂质组成的情况下系统地修改了大小。有趣的是，小鼠中较小的LNPs显示出显著较低的免疫原性，包括减少的免疫反应，包括抗体产生、免疫细胞激活和记忆细胞的产生。这些发现强调了优化LNP大小以最大化mRNA疫苗治疗效果的重要性。 LNP配方作为mRNA疫苗传递载体显示出显著潜力，证明了其引发强大CTL反应的能力。LNP介导的传递方法涉及分离患者的自体DCs及其随后与编码CAAs的mRNA转染。许多基于脂质的NPs正在作为mRNA疫苗载体进行调查，从而突出了一个积极的研究和开发领域。范等人调查了阳离子脂质辅助NPs（CLAN）作为mRNA疫苗载体。他们的发现揭示了CLAN有效地触发了DC成熟和抗原特异性T细胞增殖。此外，使用OVA mRNA封装的CLAN对携带淋巴瘤的小鼠进行静脉免疫接种，诱导了强大的OVA特异性T细胞反应，减少了肿瘤生长。这些发现突出了CLAN作为mRNA疫苗传递平台的有效性。 在一项相关研究中，一种名为C1脂质（C-12）的阳离子脂质类似化合物有效地将mRNA传递给抗原呈递细胞（APCs），同时激活TLR4并促进强大的T细胞激活。C1脂质可以通过吞噬作用促进mRNA疫苗摄取。此外，C1 LNP可以通过激活DC中的TLR4信号通路，刺激IL-12（一种炎症细胞因子）的表达。值得注意的是，依赖C1脂质的mRNA疫苗在癌症预防和治疗疫苗背景下展示了强大的抗肿瘤反应。此外，这些纳米复合物通过激活细胞质和内质网中的模式识别受体，诱导了先天DC免疫反应。它们还诱导了具有显著Th1特征的DC介导的适应性免疫。这项研究展示了阳离子脂质作为mRNA疫苗传递系统平台的潜力。 此外，一种针对淋巴结（LN）的LNP，称为113-O12B，增强了mRNA癌症疫苗的传递。它还增加了LN中的mRNA表达，并显著改善了对mRNA编码抗原的细胞介导的免疫反应。与PD-1抗体结合使用的LN靶向LNP系统在肿瘤模型中展示了改进的保护和治疗效果，展现了其作为mRNA疫苗多功能平台的潜力。 另外，一种包含棕榈酸-R848（TLR7/8的激动剂）的佐剂脉冲mRNA疫苗NPs的配方，展示了改善的mRNA转染效率和强大的获得性免疫反应。这种配方促进了特定抗原T细胞向肿瘤部位的渗透。它对淋巴瘤和前列腺癌模型有效，预防肿瘤生长和抑制已建立的肿瘤。因此，这种方法为开发有效的癌症免疫疗法提供了希望。 装载编码癌症相关抗原（CAAs）的mRNA的LNP显著减少了肿瘤，并在黑色素瘤模型中延长了总生存期。进一步包含脂多糖（LPS）增强了LNPs的免疫反应。包含修饰的N1-甲基假尿苷的mRNA的LNPs-mRNA疫苗配方在B16黑色素瘤模型中展示了显著的肿瘤减少、延长生存期和强大的免疫反应。这种配方增加了肿瘤内CD40+ DCs和多功能OVA特异性CD8+ T细胞，显示了有效传递mRNA疫苗的潜力。此外，携带OX40L mRNA的LNP显著减少了小鼠中H22肿瘤的大小。这表明LNPs可以是用于肝癌免疫疗法中系统传递mRNA疫苗的有价值工具。它们也可以作为传递mRNA疫苗的支架。Qiu等人对包裹在LNPs中的mRNA疫苗进行了系统评估。这种疫苗编码HPV的E7蛋白（HPV mRNA-LNP）。接种HPV mRNA-LNP疫苗激活了整体和HPV特异性CD8+ T细胞。此外，它通过肿瘤微环境中的不同IFN反应指导了CD8+ T细胞的功能承诺。与ICIs结合使用时，HPV mRNA-LNP疫苗进一步增强了HPV特异性CD8+ T细胞，同时保持了它们的抗肿瘤功能，导致肿瘤消退增强。这项研究突出了这种方法在癌症免疫疗法中的潜力。 包含甘露糖作为肿瘤特异性mRNA的靶向传递配体的改良LCP-NPs在正位模型中对三阴性乳腺癌（TNBC）展示了强大的CTL反应，通过与抗CTLA-4抗体共传递进一步增强。这突出了LCP系统用于靶向传递肿瘤特异性mRNA的潜力。此外，LCP-NPs被用作由RNAi基于的免疫治疗剂组成的纳米配方的载体。这种方法导致增强的T细胞反应，减少肿瘤生长，并降低转移。这些发现展示了使用LCP作为载体开发mRNA疫苗和其他基于RNA的免疫疗法的潜力。 脂质微粒（LMPs）最近作为传递mRNA疫苗的替代平台出现。像LNPs一样，LMPs可以有效地传递mRNA。它们在与免疫佐剂结合使用时显示出预防癌症的前景，确立了它们作为高效mRNA疫苗传递系统的价值。 这项研究强调了LNPs作为癌症免疫疗法框架中有前景的mRNA疫苗载体的潜力。 mRNA疫苗面临的一个重大障碍是它们易受降解。为了保护mRNA免受降解，设计了新的脂质体介导的传递方法。最近，一种通过将精蛋白和mRNA封装到1,2-二油酰-3-三甲基铵丙烷/胆固醇/1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-聚乙二醇（DOTAP/chol/DSPE-PEG）阳离子脂质体中的mRNA疫苗被研究。这种配方展示了增强的摄取效率，并成功刺激了DC成熟，导致对特定肿瘤的显著抗肿瘤免疫反应。此外，由DOTAP、胆固醇缀合阳离子肽DP7、载体佐剂和mRNA组成的脂质体有效地抑制了肿瘤生长，同时增强了淋巴细胞反应。此外，合成了称为甘露糖-胆甾-缀合物（MPn-CHs）的靶向DC的脂质体，并用于配制靶向DC的脂质体（MPn-LPs），增强了mRNA表达并展示了靶向DC的mRNA疫苗的显著潜力。基于脂质体的mRNA疫苗LPX-mLMP2通过将mLMP2封装在DOTAP中合成。LPX-mLMP2展示了APCs对其的印象深刻的抗原摄取，导致有效的LMP2表达。疫苗在脾脏中积累，促进了DC成熟，并在体内引发了针对抗原的T细胞反应，最终在三次疫苗接种后显著减少了表达LMP2的肿瘤模型中的肿瘤生长。在另一种方法中，开发了修饰甘露糖的脂质体以传递总肿瘤mRNA，导致减少转移和黑色素瘤特异性CTL的产生。 最近的研究调查了阳离子脂质体用于mRNA疫苗传递，导致增强的DC成熟、肿瘤生长抑制和特异性免疫反应。 脂质体复合物（Lipoplexes）是阳离子脂质体非病毒合成脂质载体，广泛研究用于个性化癌症疫苗的临床应用。脂质体复合物用于第二代RNA疫苗。从实验室进展到临床使用的第一个产品是设计用于静脉给药的疫苗。它包括四种RNA脂质体药物产品，每个都编码黑色素瘤免疫治疗的常见肿瘤抗原。 I/II期临床试验正在评估针对非突变型癌症相关抗原（CAAs）的RNA-脂质体复合物疫苗，这些抗原包括MAGE-A3、酪氨酸酶、纽约食管鳞状细胞癌1和带有tensin同源性的跨膜磷酸酶，作为单一疗法或与抗PD1抗体联合治疗。这种疫苗能在经预处理、检查点抑制剂经验丰富的IIIB-C期和IV期黑色素瘤患者中引起持久的客观反应。值得注意的是，部分反应的患者表现出强烈的多表位CD4+/CD8+ T细胞免疫的诱导。 由聚乙二醇胆固醇（PEG-chol）和N-十六烷基-N,N-二甲基十六烷-1-溴化铵组成的mRNA脂质体复合物疫苗可以增强细胞内的蛋白表达。当作为免疫接种给小鼠时，这种疫苗增加了肺和脾脏中的蛋白表达，导致抗原特异性IgG1水平升高。尽管这些发现是有希望的，但需要进一步的研究和测试来评估这种疫苗用于人类潜在使用的安全性和有效性。 3.3.聚合物纳米系统用于mRNA疫苗传递 聚合物NPs在促进mRNA传递方面发挥着至关重要的作用，作为支架。在最近的一项综述中，概述了基于聚合物的系统的mRNA传递的关键组成部分，特别强调了分子设计标准、稳定性和生物分布等因素。 聚（β-氨基酯）（PBAE）聚合物可以与mRNA形成复合物。这些聚合物具有生物可降解性的优势，并且能够与水溶液中的带负电荷的mRNA自发自组装。它们具有独特的特性，包括高缓冲能力有助于内质网逃逸，正电荷有助于有效结合mRNA，以及能够水解降解为无毒副产品。最近，Kim等人开发了一种使用PBAE的冻干优化的mRNA疫苗传递载体。这项研究表明，通过胃肠道给药这种疫苗可以有效地传递并刺激免疫系统，导致诱导抗原特异性的细胞和体液免疫。 李等人开发了氟烷基化聚乙烯亚胺PEI（F-PEI）用于mRNA传递。F-PEI增强了细胞内mRNA传递并激活了TLR4介导的信号传导。此外，该团队使用了由F-PEI和编码肿瘤抗原的mRNA组成的自组装纳米疫苗。这些纳米疫苗诱导了DC成熟，实现了有效的抗原呈递，并随后触发了强大的抗肿瘤免疫反应。此外，基于F-PEI的mRNAOVA癌症疫苗在延迟已建立的B16-OVA黑色素瘤生长方面证明了其有效性。与ICIs结合使用时，基于F-PEI的MC38新抗原mRNA癌症疫苗成功抑制了已建立的MC38结肠癌并预防了肿瘤复发。因此，这些疫苗与ICIs的联合使用可能代表了一种增强对癌症的免疫反应并改善治疗结果的潜在策略。未来的临床试验需要验证这些方法在临床设置中的安全性和有效性。 为了mRNA传递，开发了一种新型自组装聚合物胶束，使用改性的PEI共聚物和维生素E琥珀酸酯（PVES）。这种胶束有效地将mRNA传递到各种细胞系，同时造成最小的细胞毒性。在小鼠研究中，使用PVES作为传递载体通过肌肉内给药mRNA疫苗。结果显示出强大的抗体反应，表明PVES是传递mRNA疫苗的安全有效载体。 树状分子是一类具有明确定义的树突状结构和协同多价性的聚合物，可以利用来传递mRNA疫苗。两亲性树状分子载体代表了先进的树状分子，是结合了脂质和聚合物载体特性的混合构建物。脂质组分赋予了与mRNA在其核心内部相互作用和包封的疏水性质。聚合物段提供了修改其表面性质和化学功能的灵活性，以增强靶向和细胞摄取。此外，脂质组分使树状分子能够像基于脂质的载体一样与膜融合，而聚合物段促进了类似聚合物载体的内吞作用，从而减少mRNA传递。这些载体具有精确且稳定的纳米尺寸结构，使它们适合传递mRNA疫苗。树状分子载体有效传递mRNA疫苗依赖于其两亲性质。亲水实体促进RNA结合和疏水性，从而稳定RNA复合物。这一独特的特性使得RNA作为稳定的复合物被包封，促进了其依赖内吞作用的摄取和释放到细胞质中。树状分子的两亲性质在成功的RNA传递中起着至关重要的作用。 基于聚合物水凝胶的疫苗传递系统因其在将疫苗有效地传递到特定生理部位方面的能力而受到研究关注。这些系统以其独特的属性为特征，增强了抗原传递并作为佐剂，增强了抗原诱导的免疫反应。例如，装载mRNA的聚(2-羟乙基甲基丙烯酸)水凝胶成功地传递到DC2.4细胞中。这种方法展示了延长释放和增强转基因表达的潜力，表明其作为提供免疫疗法中mRNA疫苗的替代方法的潜力。此外，聚乙烯亚胺和氧化石墨烯水凝胶被用来开发含有OVA mRNA和佐剂(R848)的纳米疫苗。这种水凝胶实现了mRNA至少30天的持续释放。释放的mRNA保护淋巴结免受降解，并促进了它们的目标传递。此外，实验数据表明，水凝胶显著增强了CD8+ T细胞特异性抗原产生，抑制了肿瘤生长。它还产生了抗原特异性抗体，有效地预防了转移。总的来说，这些发现强调了可注射水凝胶作为mRNA传递有前途方法的潜力。 3.4.基于肽的mRNA疫苗传递 细胞穿透肽(CPPs)因其能够穿越细胞膜并有效地传递核酸而迅速发展。CPPs作为肿瘤免疫疗法药物的潜力巨大。此外，通过结合适当的佐剂和应用如纳米技术等先进技术，可以显著提高mRNA疫苗传递的有效性。为mRNA疫苗传递设计了不同类型的肽(图2)。 图1. mRNA传递系统的示意图，用于高效编码抗原和激活树突状细胞（DCs） 包括封装在DOTAP/胆固醇/DSPE-PEG-精氨酸阳离子脂质体中的mRNA、阳离子DOTAP-胆固醇修饰肽（DP7）脂质体、MPn-CHs脂质体、甘露糖修饰脂质体、mRNA-脂质复合物和脂质复合物+ PEG-胆固醇在内的各种传递系统，有效地将mRNA传递到DCs中。mRNA编码的抗原刺激分泌如TNF-α等细胞因子，导致DC成熟。这些成熟的DCs随后释放IL-2和IL-12，激活CD4+和CD8+细胞，从而抑制肿瘤生长。 Lou等人开发了一种用GALA功能化的mRNA聚合物复合物的方法，展示了高转染效率和无细胞毒性的细胞摄取。用携带OVA mRNA的PPx-GALA配方处理，导致T细胞反应增加和DCs成熟，突出了其作为mRNA疫苗平台的潜力。作为mRNA疫苗传递平台，开发了一种富含精氨酸的CPP变体RALA。这种肽的独特序列和结构组织在作为mRNA疫苗载体的角色中至关重要。它与mRNA形成纳米复合物，能够在酸性pH依赖性方式中破坏膜，促进mRNA内质网逃逸并使其在DCs的细胞质中表达。RALA和修饰的mRNA含有假尿苷和5-甲基胞嘧啶，诱导了针对mRNA编码蛋白的强大CTL反应，突出了它们的优越效力。另一种方法涉及使用阳离子CPP(LAH4-L1)和聚乳酸NPs(PLA-NPs)。产生的纳米复合物通过吞噬作用和有衣小窝被DCs内化，导致大量蛋白表达。CPPs的不同肽序列，连同它们良好的生物相容性和它们所具有的特定目标内化能力，使它们成为一个有前途的替代mRNA传递平台。具体来说，使用大小<200 nm的双极CPP/mRNA复合物已证明能够有效地表达蛋白和细胞摄取。这些发现强调了CPPs作为癌症mRNA传递载体的有效性。 3.5.碳纳米材料用于mRNA疫苗传递 在癌症免疫疗法中，碳纳米材料因其独特的传递抗原和刺激免疫反应的能力而激增，以碳点(CDs)作为杰出的候选材料。Chen等人合成了能够结合mRNA并形成ACDs@mRNA纳米复合物的两亲CDs，显示出对脾脏的最佳目标传递。ACDs@OVA-mRNA配方有效地抑制了E47肿瘤生长，并增强了脾脏和癌症部位的癌症浸润T细胞，为推进肿瘤免疫疗法提供了有希望的结果。此外，荧光CDs被用作疫苗开发中的佐剂，与肿瘤蛋白抗原OVA结合。这种方法导致针对抗原的强大的细胞介导的免疫反应，成功地抑制了黑色素瘤癌症生长。这些研究强调了CDs作为疫苗接种中多功能工具的潜力。它们为改善包括癌症在内的各种医疗环境中的治疗结果提供了激动人心的机会。 图2. 肽介导的mRNA疫苗传递及免疫反应 携带OVA mRNA、RALA、含有假尿嘧啶和5-甲基胞嘧啶修饰的mRNA、阳离子CPP LAH4-L1、PLA-NPs、环肽纳米管（cPNTs）、两性CPP/mRNA复合物以及与海藻酸钠结合的SA@DOTAP-mRNA的聚阳离子肽GALA配方，有效地将mRNA传递到DCs中。信使RNA转录本被转化为蛋白质，然后被蛋白酶体（酶）切割成片段。由此产生的肽片段通过内质网运输，并通过MHC I类（MHCI）呈现给CD8细胞，增强T细胞反应。ER，内质网；TCR，T细胞受体。 碳纳米管（CNTs）因其固有特性，包括惰性、非免疫原性、无毒性和高稳定性，已成为疫苗开发的有希望的传递平台。CNTs的一个关键优势是它们能够有效地运输特定的抗原目标并促进它们向免疫系统的呈递。它们独特的结构允许同时有效附着多种抗原，在其表面产生多种抗原。然而，使用尺寸大于100纳米的碳纳米材料作为mRNA疫苗传递的支架存在几个挑战。这些挑战源于诸如不溶解性、形态不均匀、较大尺寸（小于100纳米）和潜在的肺部毒性等因素。这些考虑使得CNTs在mRNA疫苗传递中的实际应用更加复杂，尽管它们具有明显的优势。研究人员必须解决这些挑战，以充分发挥CNTs在基于mRNA的疫苗领域的全部潜力。 3.6.病毒载体介导的mRNA疫苗传递 病毒载体疫苗属于使用携带编码特定抗原的外来基因的遗传改变病毒颗粒的疫苗类别。在癌症疫苗开发领域，工程化的病毒载体、自复制RNA（小干扰RNA）病毒载体和重组病毒载体已成为有前景的溶瘤病毒（OVs）。这些OVs具有携带单链RNAs、特异性靶向肿瘤细胞并启动适应性免疫的能力。这种新方法在癌症疫苗和疗法的开发中具有巨大潜力。 TroVax()是一种改良的病毒载体疫苗，表达5T4癌症相关抗原。在I/II期人体试验中，它被耐受，没有不良反应，并在前列腺癌、肾细胞癌和结肠癌中诱发了特异性抗体反应。在随后的II期人体试验中，TroVax与化疗药物或ICIs结合使用，增强了抗原交叉呈递和免疫抑制细胞的清除。值得注意的是，与TroVax和同时低剂量IL-2的治疗在肾癌和结肠癌患者的存活率上表现出改善。 图3. 病毒载体介导的mRNA疫苗传递及其对免疫反应的影响的示意图 溶瘤病毒、重组病毒和自复制病毒被设计用于高效地将mRNA疫苗传递到肿瘤部位。这触发了包括先天/适应性免疫机制在内的强大抗肿瘤反应，导致激活凋亡途径、抑制血管生成，以及随后的肿瘤溶解和退行。 一项临床前研究展示了携带与前列腺癌相关的mRNA编码的六跨膜上皮抗原前列腺1的病毒载体平台的有效性。该研究观察到对抗原具有强大、持久的CD8+ T细胞反应，特别是在雄性BALB/c和C57BL/6小鼠株中。令人惊讶的是，尽管疫苗具有高度免疫原性，但其在小鼠PC模型中的保护效率相对较低，无论是可移植的还是自发的。然而，ChAdOx1-MVA疫苗和PD-1抗体组合在临床环境中显示出有希望的抗肿瘤反应。尽管如此，使用病毒载体也存在显著的限制，包括病毒基因组整合到宿主基因组以及宿主排斥的可能性，这可能导致细胞毒性和免疫原性。这些缺点促使人们探索癌症免疫疗法中传递mRNA疫苗的替代策略。 4.结论和未来方向 mRNA疫苗已被公认为一种强大的癌症治疗方法，提供了独特且耐受良好的治疗选择，已在临床前研究中证明有效。这些疫苗可以诱导多克隆免疫反应，并促进保护性抗体的产生，这是通过直接mRNA给药或将其引入DCs实现的。mRNA疫苗的优势在于它们能够编码多种蛋白质，从而克服与特定HLA分子相关的限制。COVID-19 mRNA疫苗的成功激发了人们对其在癌症治疗中潜力的强烈研究努力。 基于mRNA的癌症疫苗提供了编码多种蛋白质、引发强大免疫反应以及促进快速开发和生产的多种优势。然而，一个持续的挑战在于实现有效的mRNA疫苗传递，专门针对肿瘤细胞，这需要进一步的研究和开发。临床前试验已经证明了针对不同类型肿瘤的各种mRNA疫苗的有效性。临床研究集中在针对CAAs的有效mRNA疫苗上。在临床环境中，涉及分离患者自己的DCs并用编码CAAs的mRNA转染的技术正在被研究。基于mRNA的癌症治疗疫苗领域正在迅速发展，有几个领域需要进一步探索和发展。 通过各种传递平台实现mRNA疫苗的有效性，同时最小化不良反应。LNPs可以封装和保护mRNA，促进细胞摄取，并有效地转化为抗原。病毒载体也作为有效的mRNA疫苗载体，但需要解决与安全性、预先存在的免疫力和有限的货物容量相关的挑战。基于肽的传递平台有望增强mRNA疫苗传递和抗原表达。此外，纳米材料如CDs、CNTs和可注射水凝胶已被用于临床前和临床免疫疗法中的mRNA传递。其他技术，包括树状分子和离子电渗，正在被探索。总体而言，癌症免疫疗法中的mRNA疫苗显示出巨大的希望，正在进行的研究努力旨在优化它们的传递、改善免疫反应，并在临床环境中评估它们的有效性。 未来的研究应该集中在改进和优化传递系统，如LNPs、病毒载体和基于肽的平台。这些努力应该旨在提高它们的效率、稳定性、安全性和可扩展性。此外，识别和选择最佳的肿瘤特异性抗原对于提高mRNA疫苗的有效性至关重要。对CAAs和新抗原的额外研究可以导致针对个体肿瘤的有效靶向的个性化疫苗，提高它们的特异性和治疗潜力。探索将mRNA疫苗与ICIs或细胞免疫疗法相结合的协同方案，有望增强抗肿瘤免疫反应。这些联合策略可以克服免疫抑制的TMEs并改善总体治疗结果。进行稳健的人类试验以评估癌症治疗中mRNA疫苗的安全性、有效性和长期效益也是必要的。扩大临床研究的范围并探索不同类型的癌症将为mRNA疫苗的医疗效用提供宝贵的见解，并指导它们未来的发展。 为大规模疫苗接种建立成本效益的mRNA疫苗是具有挑战性的。应努力优化制造技术，降低生产成本，并确保一致的质量和批次间可重复性。对mRNA疫苗的免疫原性和潜在不良反应进行深入调查是必要的，以确保它们的安全性并最小化任何意外的免疫反应。了解mRNA疫苗引起的长期效应和免疫记忆对于它们在临床上的成功实施至关重要。开发稳健的生物标记和标准化的检测方法对于监测mRNA疫苗接种后的免疫反应至关重要，这对于评估疫苗效力、预测患者结果和指导治疗策略至关重要。将免疫监测方法整合到临床试验中可以为优化疫苗设计和剂量方案提供有价值的数据。通过解决这些问题，癌症免疫疗法中的基于mRNA的疫苗领域可以继续发展，为患者提供创新和有效的治疗选择，并有可能改变癌症治疗的格局。

两种基于mRNA的严重急性呼吸综合征冠状病毒（SARS-CoV-2）疫苗在病毒序列公布约11个月后获得紧急使用授权（EUA），突显了这种核酸技术平台的转化潜力。迄今为止，大多数mRNA的临床应用都集中在传染病和癌症疫苗上，由于某些mRNA种类和配方固有的免疫刺激特性，因此低剂量、低蛋白表达和局部传递也可能有效。此外，关于mRNA编码蛋白或细胞免疫疗法的研究工作也已开始进行，但由于需要最小的免疫刺激、靶细胞和组织中的高蛋白表达以及重复给药，导致了临床转化上制造与配方的挑战。在这一势头的基础上，去年mRNA技术在COVID-19疫苗、Omicron特异性加强针和季节性流感疫苗、Epstein-Barr病毒、人类免疫缺陷病毒（HIV）和癌症疫苗方面取得了临床进展。在此，我们回顾了mRNA治疗的临床进展，并对这些基于mRNA的药物背后的转化技术进行了概述和展望。­­随着两种针对COVID-19的mRNA疫苗：Comirnity（BNT162b2）和Spikevax（mRNA-1273）的全面批准，mRNA的医学前景终于实现。2020年3月16日，在2020年1月11日公布病毒序列后的几周内，Moderna的mRNA-1273（针对SARS-CoV-2 spike（s）蛋白的几种mRNA疫苗之一）首次给人类志愿者注射。这一显著成就得益于近十年来感染性疾病和癌症mRNA疫苗的临床经验（见图1）。图1   2020年抗SARS-CoV-2 mRNA疫苗快速发展的时间线1990年，Wolff等人证明了在小鼠中肌肉注射（i.m.）mRNA可产生靶蛋白，首次在体内验证了使用mRNA编码蛋白质用于疫苗接种或蛋白质替代的概念。然而，这项技术的前景经过几十年的临床验证后才得以实现，部分原因是由于mRNA稳定性和传递方面的技术瓶颈，以及2000年期间研究重点、资金投入和行业重点向DNA疫苗的暂时转移。与此同时，mRNA作为疫苗的潜在优势（设计和测试的容易性和速度、固有免疫原性、快速扩大和制造以及插入突变的风险可忽略不计）使得少数学者继续对这种单链核酸展开研究。­­­mRNA技术的一个特别重要的优势来自其作为蛋白质翻译模板的生物学作用。传统疫苗技术依赖于在生物反应器中使用哺乳动物细胞或鸡胚批量生产疫苗，而mRNA疫苗只在患者细胞内一次转化为最终产物。事实上，mRNA利用人体作为自己的疫苗生产设施，具有一些附带的优势。首先，它允许人类对蛋白质产品进行翻译后修饰（PTM），具有降低免疫原性和完整功能的潜力。其次，不适合在生物反应器中生产的多聚体蛋白质可以在患者细胞中正确翻译、折叠和组装（例如，Moderna为研究性巨细胞病毒（CMV）疫苗（mRNA-1647）设计了五种mRNA混合物，产生五聚体蛋白）。第三，mRNA疗法可以产生跨膜和细胞内蛋白质，并将其运输到细胞环境中的适当位置。­与基于病毒载体的方式相比，mRNA还降低了针对载体的预先存在的抗体或产生给药后抗体的可能性（会降低后续给药的疗效）。尽管临床前模型中观察到了RNA纳米制剂的抗载体抗体，但已开发出消除这些反应的方法，使重复给药不会降低疗效。当然，也有一些成功的重复人体给药和重复人体给药相关短干扰 RNA 纳米制剂的例子。与其他药物类似，mRNA的剂量可以很容易地上下调整，间隔更长或更短，具体取决于个体患者的需要、体重和疾病状态。此外，作用的持续时间本质上是有限的，从而降低了不可逆副作用的可能性并能够治疗急性适应症；由于mRNA降解受正常细胞过程的调节，因此可以通过对分子和递送方法的修饰来调节体内半衰期。­mRNA作为医疗产品mRNA药物分为三个基本类别：预防性疫苗、治疗性疫苗和蛋白质编码疗法。尽管每个应用程序都有其独特的挑战，但所有应用程序都面临一个共同的挑战，即在保持mRNA稳定性的同时，需要将mRNA部分在细胞内输送到靶细胞。RNA本质上是一种不稳定的分子，早期将mRNA药物的概念转变为现实的许多工作都集中在稳定性上。为此使用了各种技术，包括优化5′帽结构和3′聚（A）尾长度，以及5′和3′非翻译区域内的调节元件。除了在改善mRNA稳定性方面取得的进展，有效的体内mRNA药物还需要高效的细胞内传递。研究探索了将mRNA浓缩成纳米制剂，逐渐集中于脂质制剂以实现传递。典型的脂质纳米颗粒（LNP）配方由（1）与聚阴离子RNA相互作用的可电离或阳离子脂质组成，（2） 一种辅助磷脂（例如，1,2-二油基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺和1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱（DSPC）），类似于细胞膜中的脂质并支持双层结构（3） 一种胆固醇类似物，用于调节脂质双层的流动性和（4） 聚乙二醇（PEG）-改善胶体稳定性和减少调理作用的脂质（图2）。图2   mRNA递送纳米颗粒的组成尽管在临床上远不如LNP先进，但聚合物纳米颗粒（PNP）也显示出作为输送系统的前景。这些配方通常由可生物降解的含胺聚合物组成，可与RNA自组装。根据应用情况，PNP也可与辅助磷脂、胆固醇和PEG脂质调配（图2）。LNP和PNP都可以用特定配体进一步修饰，以促进细胞特异性靶向。正在开发的非病毒载体制剂的具体成分差异很大，可能对细胞内传递的效率、纳米粒子-mRNA复合物靶向的细胞类型以及所给mRNA药物的免疫原性产生重大影响。­­在需要时激发适当的免疫原性（疫苗）或为其他适应症（mRNA蛋白替代疗法）而逃避它是制造和配制mRNA药物时需要考虑的一个重要方面。RNA作为RNA病毒的遗传物质或DNA病毒复制的副产品，可以对先天免疫系统产生强大的刺激。微生物RNA具有许多结构和序列特征，这些特征将其与宿主细胞中模式识别受体可以识别的自身RNA区分开来。模式识别受体的两个系统通过产生I型干扰素（IFN）和炎性细胞因子来协调适当的免疫反应：第一个是Toll样受体（TLR）系统，位于上皮细胞和免疫细胞（包括DC，单核细胞和巨噬细胞）的质膜、内体和溶酶体中；第二种是视黄酸诱导基因I（RIG-I）样受体，位于大多数细胞的胞浆中。TLR3由双链RNA（dsRNA）激活，而TLR7和TLR8由单链RNA激活。RIG-I和黑色素瘤分化相关蛋白5（MDA5）在胞浆中分别被5′-三磷酸化短（18–19 bp）dsRNA和长（>1000 bp）dsRNA差异激活。TLR3激活导致通过含TIR结构域的适配器分子1（TICAM-1）途径产生I型IFN，而其他TLR使用MYD88依赖性级联，导致核因子（NF）-κB依赖性或IFN调节转录因子（IRF）3依赖性产生促炎性细胞因子。这些途径被mRNA产物及其传递载体激活的程度在很大程度上取决于应用，是mRNA药物开发的一个关键方面。­­­mRNA的生物医学应用前景继续快速发展。下面，我们将分三个方面进行讨论：直接体内注射用于预防传染病疫苗的mRNA（表1）、治疗性癌症的mRNA疫苗（表2）和mRNA编码的免疫疗法（表3）。表1   过去和正在进行的感染性疾病mRNA疫苗II期或III期临床研究总结表2   过去和正在进行的仅用于癌症II期或III期的mRNA疫苗临床研究总结表3   过去和正在进行的mRNA用于蛋白质替代应用的II期或III期临床研究总结传染病疫苗在美国食品和药物管理局（FDA）批准COVID-19疫苗后，mRNA现在被认为是传染病中潜在的转化疫苗形式（表1），针对SARS-CoV-2以外病原体的mRNA疫苗的进一步验证十分迫切。­mRNA分子固有的免疫刺激性质和作为免疫佐剂的功能被视为疫苗应用的关键优势，但将这些特性转化为一种安全有效的临床产品面临着平衡免疫刺激与编码抗原表达之间的挑战。迄今为止，临床上最先进的产品是具有化学修饰和未修饰核苷酸碱基的非复制性mRNA疫苗。辉瑞生物科技公司的BNT162b2和摩德纳的mRNA-1273这两种经批准的mRNA产品，是含有化学修饰的尿嘧啶碱基的疫苗。相比之下，迄今为止，针对COVID-19的未修饰RNA疫苗试验的结果令人失望。尽管最终数据仍有待公布，但CureVac报告称，其未经修饰的CureVac 2019冠状病毒疾病疫苗（CVnCOV）对冠状病毒感染的保护率仅为47%。对于未经修饰的CureVac疫苗与经修饰的疫苗相比的效力较低，学者提出了各种解释。CureVac在试验过程中提出SARS-CoV-2变异情况的变化，而BNT162b2或mRNA-1273的情况并非如此；其他学者注意到，与BNT162b2（30µg）和mRNA-1273（100µg）相比，CureVac使用较低剂量（12µg）（选择为未修饰RNA比修饰RNA更具反应性）可能不足以产生有效的中和抗体反应；另有学者假设，未修饰RNA的翻译效率可能较低，导致表位水平较低。­­­除了上述非复制性mRNA疫苗外，还有几个研究小组也在研究编码RNA依赖性RNA聚合酶的自我扩增结构，这些RNA依赖性RNA聚合酶可以扩增传递的RNA，从而增加抗原蛋白表达。到目前为止，这些药物只完成了早期临床试验。最后一种疫苗的一个潜在缺点是任何mRNA递送技术都必须应对与自我复制mRNA疫苗相关的显着更大的mRNA构建体大小。与重组蛋白疫苗类似，上述所有mRNA疫苗都具有不产生传染性颗粒的优点。因此，与减毒活病毒疫苗或具有复制能力的病毒载体相关的担忧及其恢复为致病形式或导致某种形式的加重疾病的可能性（如在呼吸道合胞病毒（RSV）减毒活疫苗中观察到的）不适用。与DNA疫苗或某些病毒载体相比，mRNA疫苗的另一个主要优点是没有因整合到受体DNA中而导致插入突变的风险。加快发现和开发时间SARS-CoV-2大流行在全球的迅速传播突出了能够快速部署用于人体试验的疫苗技术的重要性。mRNA疫苗的发展速度如此之快，以至于在非人灵长类动物的研究证实通过感染SARS-CoV-2或通过DNA疫苗可以实现保护性免疫之前，首批产品已经进入临床试验。­­图1所示的时间顺序说明了mRNA公司以前所未有的速度转向生产SARS-CoV-2候选疫苗。Pfizer-BioNTech和Moderna两项独立工作的时间线非常相似，表明监管机构从病原体的基因鉴定到EUA的发展轨迹，比典型的疫苗开发时间短11个月或几年。其他mRNA公司也能够以相对快速的方式利用其先前在疫苗开发方面的专业知识。例如，CureVac宣布批准于2020年6月开始CVnCOV的I期临床研究（NCT04449276），并于一年后获得其第II-III试验的中期结果（HERALD，NCT04652102）；2020年11月9日，Arcturus宣布了ARCT-021（NCT04480957）I期研究的中期结果；Sanofi Pasteur–Translate Bio（NCT04798027）、伦敦帝国理工学院（ISRCTN17072692、Eudract 2020-001646-20）和云南华威生物技术（ChiCTR2000034112）都在SARS-CoV-2序列公布后不到一年的时间内将mRNA疫苗用于人体试验。­COVID-19大流行挑战了疫苗开发的传统方法，并为促进mRNA疫苗研究创造了独特的环境。一个关键的区别是公司从生物医学高级研究与发展局和防疫创新联盟获得的大量注资。突发公共卫生事件推动了开发工作的快速发展，并促使制造商找到缩短临床时间的方法（例如，通过并行化系列开发过程的不同部分，尽量减少试点研究和进行最低限度的产品质量发布测试）；相反，针对已建立疫苗的新mRNA技术的广泛验证（正如之前在mRNA疫苗CV7202与灭活菌株疫苗Rabipur的并行评估中所做的那样）被取消了优先级。制造和扩大规模mRNA（和某些类型的DNA）疫苗的许多优点与制造的速度和灵活性有关，而制造的速度和灵活性在很大程度上取决于含有化学成分的体外过程。由于mRNA编码相关免疫原性蛋白，不需要活病毒，因此不需要专门的设施或生物安全实验室。与以鸡胚为基础的疫苗相比，mRNA疫苗不受鸡胚生产能力的限制，允许对鸡蛋过敏的个人进行疫苗接种。在无细胞系统中生产可将细菌污染的风险降至最低，无需生物反应器工艺。所有基于核酸的疫苗（无论是mRNA还是DNA）都编码感兴趣的免疫原，但其特性独立于该免疫原。具有mRNA平台的不同疫苗的制造依赖于相同的化学成分，这意味着，一旦对该平台进行了投资，就可以很容易地适应新的病原体。在为新出现的流行病或季节性疫苗做好准备的情况下，这是一个特别有吸引力的特点。­此外，相同的制造工艺可用于疫苗和其他基于mRNA的药物，提供了效率和灵活性。鉴于在第一代疫苗推出的同时出现了新的SARS-CoV-2株，这种在同一运载工具中切换编码mRNA的灵活性尤其有用。尽管对制造成本没有达成共识，但预计该技术比旧方法更具成本效益。快速的抗原特异性序列优化mRNA技术的另一个优势是能够在引入核酸变化的基础上设计和重新设计抗原，与不同蛋白质或肽的生物工程相比，这是一个相对简单的过程。对于SARS-CoV-2，则主要是以引入脯氨酸的形式将免疫原性S蛋白稳定在融合前结构中。BioNTech应用了这种技术灵活性，将不少于五种不同的COVID-19 mRNA疫苗候选疫苗投入临床（三种使用核苷修饰的mRNA，一种使用含尿苷的mRNA，一种使用自扩增mRNA）。BNT162b1候选疫苗使用核苷修饰的mRNA编码SARS-CoV-2 S蛋白受体结合域，该结合域通过添加T4原纤维蛋白衍生的foldon三聚体结构域进行修饰，以增加其免疫原性。最终选定的候选基因BNT162b2编码由两个脯氨酸取代修饰的全长S蛋白，以将其锁定在融合前构象中。来自CureVac29、47、Moderna48和Translate Bio49的其他COVID-19 mRNA疫苗也使用经过各种修饰的S蛋白。目前正在开发的几种疫苗至少经历了一个迭代优化步骤，这是mRNA产品开发的一个特点。例如，针对RSV的mRNA-1777在一期试验中进行了测试，临时数据显示，单次给药后通过中和抗体水平测定的体液免疫反应。然而，这种药物的开发已经暂停，转而支持mRNA-1172，在动物模型中，它被证明比mRNA-1777更有效。类似地，寨卡病毒疫苗候选基因mRNA-1325（NCT03014089）的开发也被暂停，取而代之的是mRNA-1893，该基因使用了不同的序列，据报道在非人灵长类动物研究中的效力是mRNA-1325的20倍。截至2020年2月，90名黄病毒血清阳性和血清阴性的参与者接受了mRNA-1893或安慰剂的给药方案，两次给药间隔1个月，剂量分别为10、30和100µg（NCT04064905）。编码多种蛋白质和/或蛋白质亚单位­­对于SARS-CoV-2，S蛋白免疫原是同源三聚体，因此只需引入单个mRNA序列。对于主要免疫原由多个亚单位组成的病原体，生产重组蛋白亚单位并以正确的化学计量将其成功重组为完整蛋白质的挑战很容易想象。相比之下，mRNA很容易用于此应用。单独的亚单位可以编码在单个长mRNA中，也可以作为单独的mRNA链。例如，针对CMV的疫苗mRNA-1647包含六种mRNA，其中五种编码五种不同的蛋白质，结合形成五聚体蛋白质，第六种编码CMV糖蛋白B（gB）蛋白质。在一种相关的方法中，单一疫苗可以针对两种不同的病原体，如mRNA-1653，它结合了两种mRNA，针对人类偏肺病毒（hMPV）和副流感病毒3型（PIV3）的F蛋白。调节mRNA免疫原性除了反复优化序列以优化抗原的免疫原性外，还可以利用完整mRNA转录本本身和其制造过程中产生的其他RNA产物的固有免疫原性来增强对mRNA疫苗的免疫应答。RNA的先天潜在免疫原性在疫苗接种中可能是有利的，因为它可以激活免疫反应途径，如TLR系统，从而导致DC成熟，随后产生强大的B和T细胞免疫反应。如前所述，CureVac的CVnCoV具有未经修改的mRNA。然而，这种RNA驱动的免疫抑制也可能是有害的，导致临床副作用以及相关蛋白的表达减少。例如，RNA依赖性蛋白激酶R（PKR）的激活与翻译抑制有关。­­近年来，学界在如何调节体外转录mRNA免疫原性方面取得了进展。调节mRNA免疫原性的主要方法之一是用化学修饰的核苷酸替代未修饰的核苷酸。Kariko、Weissman及其同事的研究报告称，某些核苷修饰，如假尿苷和5-甲基胞苷，显著降低TLR信号传导和PKR激活，导致小鼠中蛋白质表达水平增加。值得注意的是，BioNTech和Moderna批准的COVID-19 mRNA疫苗（BNT162b2和mRNA-1273）均以尿苷被N1甲基假尿苷完全替代为特征。然而，与带有修饰核苷的mRNA相比，其他人随后证明，未修饰核苷的掺入实际上会导致HeLa细胞中蛋白质表达水平较高，而在小鼠的肝脏中表达水平相似。我们假设，mRNA纯化的改进和RNA污染物的去除可能部分解释了这些与早期工作的差异。通过柱纯化（高压液相色谱（HPLC）或快速蛋白质液相色谱）去除dsRNA，以及最近通过较便宜的过滤结合技术去除dsRNA，可显著提高翻译效率。CureVac的研究人员报告，HPLC纯化、序列优化、未修饰的核苷mRNA没有免疫原性，在小鼠体内产生的蛋白质表达水平高于化学修饰的核苷mRNA。最近， Genentech的科学家报道，白细胞介素（IL）-1β和白细胞介素-1受体激动剂（IL-1RA）是控制系统对mRNA反应的关键调节因子，表明小鼠体内这些调节因子之间的差异，灵长类动物和人类可以解释观察到的尿苷修饰和未修饰mRNA在这些物种体内的反应性差异。­­­­­­­用于 mRNA 递送的纳米制剂尽管早期的mRNA疫苗交付工作主要集中在裸mRNA或鱼精蛋白的使用上，但mRNA疫苗开发的最新趋势集中在mRNA交付的LNP上。早期狂犬病疫苗（CV7201）是用鱼精蛋白配制的，但由于免疫原性水平似乎严重依赖于疫苗接种方法，只有无针系统在皮内（i.d.）给药（NCT02241135）后才能提供所需的免疫反应，因此研发被中断；该产品的开发被暂停，以支持LNP配方的候选疫苗CV7202（NCT03713086）。在其他地方，结合TriMix（三种编码组成性活化TLR4、CD40配体和CD70的mRNA物种的混合物，所有这些都是免疫刺激分子）和HIV免疫原的裸mRNA试剂（iHIVARNA-01）在三次血管内注射（NCT02413645）后对HIV患者的安全性和有效性进行了评估；然而，由于缺乏免疫原性，这项研究已经中止（NCT02888756）。­目前，临床上大多数mRNA药物都使用LNP进行递送。FDA批准的第一种基于RNA的寡核苷酸药物（patisiran，一种用于治疗遗传性转甲状腺素（TTR）介导的淀粉样变性多发性神经病的短干扰RNA药物）是一种LNP制剂，包含可电离脂质d-Lin-MC3-DMA（MC3）和DSPC，胆固醇和1,2-二甲基-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇-2000（PEG2000-DMG）。BioNTech 的COVID-19疫苗BNT162b2是使用（（4-羟基丁基）氮杂二烯基）双（己烷-6,1-二基）双（2-己基癸酸酯）（ALC-0315）、2-（PEG）-2000）-N，N-二贸易酰乙酰胺（ALC-0159）、DSPC和胆固醇配制而成的。看来，在确定进入临床试验的速度方面，识别、测试和生产合适的脂质制剂可能很重要。例如，mRNA-1273使用与mRNA-1647（CMV病毒疫苗）和mRNA-1653（hMPV–PIV3病毒疫苗）相同的LNP，已经建立了一些临床和监管先例（表1）。­­LNP制剂的组合物可显著影响细胞内递送效率，确定递送的细胞特异性并调节免疫原性。尽管所有脂质成分对LNP的功能都很重要，但LNP的可电离脂质成分在RNA传递的多个方面起着关键作用，包括颗粒形成、细胞摄取和内体逃逸，因此受到了广泛关注。在LNP配方中发现的可电离脂质的结构多样性很大，为了促进可电离脂质的快速合成和评估，已经开发了用于合成大型新脂质库并在体内对其进行评估的组合、高通量方法。能够在体内传递mRNA的有效可电离脂质的列表继续扩大，通过引入生物可降解链接，传递载体的效力和耐受性都有所提高。虽然脂质发展的最新趋势集中于加入水解键以促进清除，但这些可降解键可能会影响配方稳定性，这仍然是LNP配方的一个挑战。mRNA LNP冻干的进展似乎有可能改善配方稳定性，但对于低剂量应用（例如疫苗），抗水解脂质可能证明是有利的。­­­­­­除了系统输送的RNA纳米粒外，其他RNA应用模式也有可能为神经系统、眼睛、心脏和肺提供治疗。特别值得注意的是，基于生物可降解聚合物和低聚聚合物以及脂质的纳米制剂已经开发出来，以便于通过雾化输送到肺上皮。例如，囊性纤维化患者反复服用MRT5005，MRT5005是一种LNP配方mRNA的雾化制剂，编码囊性纤维化跨膜调节蛋白（NCT03375047）。­储存和运输与配方相关的一个重要方面是储存和运输条件。2014-2016年埃博拉疫情期间，维持疫苗冷链运输和储存的挑战凸显出来，当时基于减毒重组水泡性口炎病毒（2019年批准为Ervebo）的研究疫苗必须储存在−80°C至−60°C，这在非洲最需要疫苗的地区并不总是可行的。COVID-19影响所有大陆；从全球应急准备的角度来看，当务之急是数百万剂可以在全球范围内，跨越一系列极端温度，运往医疗保健基础设施标准迥异的国家。据报道，CureVac的CVnCoV在标准冰箱温度+5°C（+41°F）下储存至少3个月，在室温下储存最多24小时，在规定的规格范围内保持稳定。Moderna的mRNA-1273在−20°C，最多6个月，在制冷条件下最多30天，在室温下最多12小时。相比之下，BioNTech的疫苗最初需要储存在−70°C时，BioNTech的合作伙伴辉瑞公司开发了含有干冰的特定装运箱，以便于物流配送。随后，申办方提交了额外信息，支持在标准冷冻柜温度下最多储存2周。­­第一次人体试验通常只涉及有限数量的参与者和临床试验地点，有时使用不太理想的配方进行，改善储存条件的开发与临床计划并行进行。例如，摩德纳的mRNA-1647是一种CMV候选疫苗，在I期研究中作为冷冻液体配方提供，但在II期研究中作为冻干配方提供，在冷藏温度下稳定18个月。­­­靶向CMV磷蛋白65 T抗原的mRNA-1443突出了运输、储存和稳定性考虑的重要性。这在与mRNA-1647相同的试验中进行了评估，但2018年8月，mRNA-1443的临床材料在储存1年后未达到内部规范，随后被临床封存。这种疫苗的研制似乎已经暂停。将配方转变为干粉形式是许多药品运输和长期储存最常用的方法之一。然而，冻干过程中结晶和真空脱水产生的应力可能会降低大分子或LNP的稳定性，导致活性损失。据报道，添加适当的低温保护剂，如海藻糖、蔗糖和甘露醇，可以在特定配方的甘露醇中保持LNP的稳定性。辉瑞已经启动了一项III期研究，以比较冻干BNT162b2配方与其冷冻液体BNT162b2配方（NCT04816669）的安全性和耐受性。­给药途径尽管已批准的SARS-CoV-2 mRNA疫苗采用i.m.给药，但对于最佳给药途径尚未达成共识。大流行性流感疫苗的全球推广理想的支持方式是采用低技术的给药途径­只需对众多被要求接种疫苗的医疗保健提供者进行少量培训。通过腹腔注射给药BTN162b2、CVnCoV、ARCT-021和mRNA-1273。伦敦帝国理工学院的一个研究小组正在考虑研究他们吸入后自我扩增mRNA的COVID-19疫苗，类似于对季节性流感所做的研究。吸入疫苗或鼻内疫苗可引起细胞和体液反应，这些反应在中和传染性呼吸道病毒（如SARS-CoV-2）方面特别有效；然而，鼻内mRNA疫苗的研究仅限于临床前动物模型，进一步开发LNP载体可能需要有效靶向上呼吸道的适当细胞类型。­­在更广泛的mRNA领域，i.d.和i.m.注射都用于评估候选疫苗，有时用于同一研究中的同一疫苗。这两种给药途径在免疫原性和耐受性方面可能产生不同的结果。针对H10N8流感毒株的血凝素（HA）蛋白的mRNA-1440（VAL-506440）在健康志愿者（NCT03076385）的一期研究中进行了测试，使用i.m.（25–400µg）和i.d.给药（25–50µg）路线。­­­­与i.m.途径相比，i.d.途径引起的注射部位反应更多，因此没有进行研究，即使在25μg时，它似乎比i.m.途径更具免疫原性。三名接种400µg i.m.疫苗的参与者中有两名经历了头痛和红斑等严重不良反应，安全委员会停止了在此水平下的进一步给药。如我们所见，狂犬病疫苗CV7201仅在通过无针系统注射时才引发免疫反应，这是针对i.m.和i.d.途径（NCT02241135）的。联合国注射了早期HIV疫苗（iHIVARNA-01），但这似乎是唯一的此类研究。目前，注射i.m.似乎是最广泛使用的传染病mRNA疫苗给药途径，与蛋白质和DNA疫苗的情况相同。­给药方案理想的给药方案，尤其是对于全球预防，是单次给药，给药后不久100%血清转化。但由于增强免疫力的现象，大多数给药方案包括至少两次注射，通常间隔几周。SARS-CoV-2 mRNA疫苗也是如此：BNT162b2分两次注射，间隔21天；对于CvnCOv和mRNA-1273，在初始注射4周后进行强化注射。BNT162b2和mRNA-1273获得了各自给药方案的EUA。然而，由于早期疫苗短缺和单次注射后观察到的部分保护，一些人主张免疫更大的人群使用单剂量，而不是为第二次注射保留部分供应，或将注射间隔的时间长于关键临床试验的研究。一项针对80岁以上成年人的小型试验数据表明，两次BNT162b剂量间隔约3个月而非3周，可提高抗体生成峰值，而有关细胞免疫的结果则不太清楚。与此同时，公众越来越认识到，第三次（助推器）射击是为了实现最佳控制。最近的数据显示，疫苗的有效性在6个月后略有下降以及新毒株变体的出现，为这个问题注入了新的紧迫感。­­­自扩增mRNA疫苗，如ARC-021和BNT162c2，打算作为单剂量给予。还描述了更为详细的治疗方案。例如，在I期研究（NCT03382405）中，对健康志愿者施用针对CMV的mRNA-1647，健康志愿者在第0、2和6个月接受了三剂30、90、180或300µg mRNA-1647或安慰剂。RSV疫苗mRNA-1345作为三剂注射方案（间隔2个月）正在一项I期研究（NCT04258719）中进行研究，该方案现已作为单剂方案进入III期。­尽管在技术和抗原选择上有相似之处，但正在研制的SARS-CoV-2 mRNA疫苗的剂量范围很广。正如基于该技术所预期的那样，自扩增mRNA疫苗每剂使用的量较小：帝国理工学院自扩增mRNA 2019冠状病毒疾病疫苗正在以0.1至1μg的剂量进行试验。ARCT-021在1至10μg的剂量下进行了单次剂量试验，并采用了prime-boost方案；7.5μg的剂量将用于进一步开发。BNT162b2和mRNA-1273分别在30μg和100μg剂量下成功预防了约95%的COVID-19病例。CVnCOV正在进行III期试验，剂量为12μg（NCT04652102）。在SARS-CoV-2领域之外，剂量范围同样广泛。在不同的疫苗中，研究的剂量水平为300倍，从1μg（CV7202）到300μg（mRNA-1653和mRNA-1657）。给药剂量和方案，以及mRNA疫苗的储存物流，对全球免疫计划有着巨大的影响：最具影响力的COVID-19疫苗或针对未来大流行病毒的疫苗可能不是第一个接受EUA的疫苗，而是第一个生产数百万剂并将其有效交付服务点的疫苗。­­作为佐剂的作用如上所述，RNA可以具有固有的免疫激活特性。作为通过天然RNA感应进行免疫刺激的补充或替代，一些研究小组已经在疫苗中添加了刺激分子，以增强对编码抗原的免疫反应，并取得了不同程度的成功。例如，CureVac使用CV8102，一种与阳离子肽载体复合的非编码无盖单链RNA，以增强狂犬病疫苗的免疫原性。CureVac的RNActive疫苗技术平台是之前提到的已停产CV7201疫苗的基础，它依赖于一种双组分mRNA疫苗，其中裸mRNA用于抗原表达，而与鱼精蛋白复合的相同mRNA用作激活TLR7和TLR8信号-ING的佐剂。然后，刺激TLR信号通路导致DC激活，作为鱼精蛋白复合物天然免疫反应的一部分。另一种产品，iHAVARNA-01，结合了编码TriMix的DC激活mRNA物种和编码HIV免疫原的mRNA（来自HIV-1分支A的普遍Gag蛋白和一系列CD8+T细胞表位）。然而，在mRNA疫苗中使用佐剂似乎是一个例外；BNT162b2和mRNA-1273都只依赖mRNA-LNP配方，不使用佐剂，大多数公司在临床上开发mRNA疫苗都遵循无佐剂的方法。这可能是因为LNP成分本身刺激免疫系统的特定元件，如IFN-γ（STING）途径的刺激因子和先天免疫反应的TLR-RIG-I样受体（RLR）-非依赖性介质。纳米制剂既能将mRNA传递到适当的细胞靶点，又能通过设计选择性刺激免疫系统，这是mRNA作为疫苗平台的另一个优势。不良反应由于其作为预防性、非治疗性药物的性质，针对传染源的疫苗具有高标准的安全性和耐受性。迄今为止，本综述中讨论的RNA疫苗的安全性与基于蛋白质的疫苗的安全性一致。局部注射疼痛和局部或全身炎症反应（发热、不适）是最常见的不良反应。这两种COVID-19 mRNA疫苗已接种于300000多名健康志愿者，包括老年人，是评估副作用的最佳数据集，但比较时必须记住，BNT162b2（30μg）和mRNA-1273（100μg）之间的剂量水平（因此给药的mRNA和脂质）有三倍的差异。此外，这些试验有排除标准，排除了一些风险最高的参与者（例如，既往过敏史），因此不一定代表需要保护的全部人群。在BNT162b2和mRNA-1273 III期研究中，超过80%的疫苗接种者报告了局部不良反应，主要是疼痛。全身事件主要为头痛、疲劳、体温升高、肌痛和关节痛。对于mRNA-1273，第二次给药后，不良反应的频率和严重程度往往更为明显。目前尚不清楚mRNA和LNP对这些不良反应的相对作用，因为在这些III期试验中，安慰剂是0.9%的生理盐水，而不是裸mRNA或空LNP。­­­第二次给药后不良反应严重程度的增加可能反映出反应性的增加，并且在mRNA-1647的II期研究的较小数据集中也观察到了这一点。mRNA-1647是一种CMV疫苗，用于CMV阳性和CMV阴性参与者。两个患者组之间的安全性没有差异，但在第二次接种疫苗后，出现更频繁和更严重的不良反应的趋势。­即使是非常大的试验，例如两种mRNA COVID-19疫苗，其检测非常罕见但潜在令人担忧的不良反应的能力也有限。关于年轻男性在接种疫苗后几天到几周内发生心肌炎的报告促使FDA免疫实践咨询委员会审查COVID-19疫苗的益处和风险。根据他们的计算，年轻男性人群患心肌炎的风险最高（预计12-29岁组每百万次接种疫苗39-47次），但其益处（预防11000例新冠肺炎、139例重症监护病房入院和6例死亡）大于风险。­­­­­­癌症治疗疫苗最近，癌症免疫疗法的迅速发展和成功引发了人们对使用mRNA疗法进行此项应用的兴趣（表2）。对于mRNA癌症免疫治疗，一种方法是通过表达缺失或改变的肿瘤抑制蛋白来改变免疫抑制肿瘤微环境。然而，目前的mRNA传递方式不太可能到达患者体内的每一个癌细胞。相反，人们越来越关注使用mRNA作为治疗性疫苗来训练免疫系统寻找并杀死癌细胞。mRNA疫苗的关键特性使其能够成功地作为SARS-CoV-2疫苗和一般传染病疫苗，包括快速开发和制造mRNA药物的能力以及mRNA编码整个抗原的能力，使其作为癌症疫苗的用途特别有希望。此外，许多患者对当前免疫靶向药物具有耐药性的肿瘤，为基于mRNA的方法创造了新的机会。­治疗性癌症疫苗的开发，无论其形式如何，都面临着许多挑战，必须解决这些挑战才能成功地进行临床翻译。与传染病预防性疫苗不同，治疗性癌症疫苗的抗感染保护在很大程度上（如果不是完全的话）是由强大的体液反应提供的，治疗性癌症疫苗还必须确保诱导强烈的细胞毒性CD8+T细胞反应，以根除癌细胞。尽管有可能为癌症接种预防性疫苗，但目前只有两种FDA批准的癌症相关疫苗，这两种疫苗都是针对已知的致癌病毒（人乳头瘤病毒（HPV）和乙型肝炎病毒）。另一个挑战是选择能够诱导高度肿瘤特异性免疫反应的适当抗原，因为不同个体间抗原的高度可变性。越来越多的患者特异性新抗原旨在应对这一挑战。最后，即使抗原能够诱导细胞免疫反应，抑制性肿瘤微环境也可以阻止T细胞浸润到肿瘤中，并可能导致T细胞衰竭。因此，治疗性疫苗可能需要与另一种旨在克服抑制性微环境（如免疫检查点抑制剂）的治疗方法结合使用，如下文所述的BNT111。肿瘤相关抗原肿瘤相关抗原（TAA）优先表达于肿瘤细胞表面，是肿瘤细胞免疫杀伤的靶点。针对TAA的癌症疫苗涉及生产用于多种肿瘤的固定、现成的TAA。其中最先进的是BNT111，它是四种黑色素瘤相关抗原（纽约食管鳞状细胞癌1（NY-ESO-1）、酪氨酸酶、黑色素瘤抗原家族A3（MAGE A3）和具有张力蛋白同源性的跨膜磷酸酶（TPTE）的混合物，目前正在1-2期试验（Lipo-MERIT，NCT02410733）中作为单一疗法或与检查点抑制剂联合进行评估。该疫苗以反复静脉注射（i.v.）的形式注射，从一系列八次注射开始，并可能每月额外注射，现在与cemiplimab联合治疗晚期黑色素瘤（NCT04526899）已发展到II期。­­­­上述研究中BNT111的免疫作用已有详细报道。四种TAA的mRNA序列均针对未成熟DC的翻译进行了优化。每个序列还包含一个信号肽和破伤风类毒素CD4+表位P2和P16，以及增强人类白细胞抗原（HLA）呈递和免疫原性的主要组织相容性复合体（MHC）I类转运域。脾脏的F-氟-2-脱氧-2-d-葡萄糖正电子发射断层扫描显示，脾脏的代谢活性增加，从而显示淋巴组织的激活。通过酶联免疫吸附斑点试验，50名接受评估的患者中约75%对四种TAA中的至少一种表现出IFN-γ反应，表明诱导了免疫反应。抗原特异性T细胞为OD1+CCR7−DD27+/−D45RA− 刺激后效应器记忆表型和分泌的IFN-γ和肿瘤坏死因子。在继续接受疫苗接种的患者中，TAA特异性细胞保持稳定，甚至数量增加，而在停止接受维持性疫苗接种的患者中，T细胞保持数月，随后下降。通过将克隆的TAA特异性T细胞受体转染健康供体CD8+细胞，并评估其裂解黑色素瘤细胞系的能力，证明了这些细胞杀伤黑色素瘤细胞的能力。­每次给药后，患者的IFN-α、IFN-γ、IL-6和其他细胞因子的血浆水平均升高，通常在注射后数小时达到峰值，并在24小时内恢复正常。这与观察到的不良反应特征一致，其特征是轻度至中度流感样症状，同样短暂且具有自限性。首次对42名患有放射图形可评估疾病的患者进行评估令人鼓舞。在接受疫苗单一疗法的25名患者中，3名患者出现部分反应，7名患者出现稳定反应，而接受疫苗-抗PD1联合疗法的17名患者中，有6名患者出现部分反应。一个有趣的观察结果是，两名在接受抗PD1治疗期间有所进展并接受过疫苗单一治疗的患者后来再次对抗PD1治疗作出反应，这与诱导的T细胞属于PD1+效应记忆表型的观察结果一致。BNT111目前正在进行黑色素瘤的II期研究（NCT04526899）。mRNA-5671（V941）是一种串联体，设计用于向免疫系统呈现KRAS抗原，并编码四种最常见的KRAS替换（G12D、G12V、G13D、G12C）。目前正在进行一期研究（NCT03948763），作为单一疗法，并与pembrolizumab联合使用。­­其他示例包括BNT112（编码五种前列腺癌特异性抗原）和BNT113（编码HPV16衍生的肿瘤抗原E6和E7（病毒癌蛋白））、BNT114（编码所选乳腺癌抗原的混合物）和BNT115（编码三种卵巢癌TAA编码RNA物种的混合物）。CureVac对编码TAA的未修饰mRNA物种进行了早期研究，包括作为免疫治疗方案的自体扩增肿瘤mRNA的裸mRNA物种、编码六种肾癌相关抗原的裸mRNA 和六种不同黑色素瘤相关抗原（NCT00204516、NCT00204607）的鱼精蛋白稳定mRNA。这些研究主要提供所用制剂的安全性和耐受性信息。研究肿瘤相关抗原的其他研究包括CV9103（前列腺癌四种抗原的混合物）、CV9104（前列腺癌六种不同抗原的混合物，由六种不同的mRNA物种编码和CV9201（五种非小细胞肺癌抗原的混合物）。所有这些项目和/或候选药物似乎都已停止开发。CV9202包含六种mRNA物种，它们编码六种不同的抗原（NY-ESO-1、MAGE C1、MAGE C2、滋养层糖蛋白（TPBG（5T4））、survivin和黏蛋白-1（MUC1）），目前仍在进行研究（NCT03164772）。­­­个性化新抗原在癌变过程中，恶性细胞获得体细胞突变，导致产生正常细胞不表达的蛋白质序列。这些蛋白质通过蛋白酶体加工成肽，呈现在与MHC I类受体结合的细胞表面，并在那里被T细胞受体识别。这些新抗原通常对每个患者都是独特的，因此代表了与肿瘤特异性和患者定制免疫治疗相关的机遇和技术挑战。­­­为了产生针对患者特异性新抗原的mRNA疫苗，切除单个患者的肿瘤，并通过下一代测序鉴定患者特异性新抗原。然后将编码这些新抗原的mRNA注射到同一名患者体内，期望它能诱导免疫反应，攻击患者的肿瘤。当然，整个过程必须花费最少的时间，以便在癌症发展和进展之前对患者进行治疗，据报道，治疗周期短至30-40天。这给制造业带来了额外的挑战，制造业必须满足人类使用试验产品的标准。­迄今为止，个性化新抗原疫苗的大部分工作涉及基于肽的新抗原疫苗而非mRNA疫苗的部署；总的来说，这些方法取得的成功有限。具有最高突变负担的肿瘤，理论上是这种新抗原方法的最佳候选，也最有可能对治疗产生耐药性。与肽疫苗相比，我们假设mRNA编码的新抗原疫苗具有适当的免疫刺激，可能提供更强的免疫原性反应和临床益处。与基于肽的疫苗不同，mRNA可以编码整个抗原，从而确保呈现多个表位，而不局限于定义的HLA型。此外，mRNA可以合成表达多种新抗原，既可以作为单独的分子，也可以作为多个编码序列的串联。某些类型的肿瘤可产生多达几十种新抗原，从诱导广泛免疫反应的角度来看，表达可能引起T细胞反应的多个表位是可取的。­­­­­­BioNTech已经开发了几种用于治疗癌症的临床新抗原候选疫苗。通过对13例转移性黑色素瘤（NCT02035956）患者的腹股沟淋巴结重复给药研究BNT121。这项研究的结果令人鼓舞，有强大的免疫反应和一些临床活动的证据。BNT122（RO7198457）可包含多达20个个体化患者新表位，静脉注射，目前正在四项研究中进行评估（表2）。初步结果表明，BNT122，无论是否含有抗PD-L1抗体阿替唑单抗，都具有可接受的安全性，主要是短暂的不良反应，如输液相关反应和/或细胞因子释放综合征，表现为发热和寒战。BNT122也正在胰腺癌I期研究（NCT04161755）中进行评估，非小细胞肺癌研究（NCT04267237）以及一项未公开的辅助指标研究预计将很快开始。­­­­­­mRNA-4157是另一种个性化的癌症疫苗，可包含多达34种编码在单个mRNA链上的新抗原（“新抗原结合物”），并在LNP中配制并经静脉注射。该药物目前正在对切除的原发性实体瘤患者（单药治疗）和转移性未切除肿瘤患者进行1期研究（NCT03313778）。截至2020年2月，据报道共有71名患者接受了至少一剂mRNA-4157。最常见的不良反应是疲劳、注射部位疼痛、结肠炎和肌痛。同时，还正在进行一项随机2期研究，将其作为辅助药物与彭布罗利珠单抗联合用于高危黑色素瘤患者（NCT03897881）。化合物NC-I4650与mRNA-4157密切相关，主要区别在于使用的新抗原选择方案。­­­新抗原疫苗依赖于患者特异性mRNA序列的快速转变，肯定受益于mRNA–LNP平台固有的灵活性和速度。最后，肿瘤学中的各种给药途径值得注意：瘤内给药、i.n.和i.v.或i.m.，其中一些相同的LNP用于多种给药途径。这表明单一候选药物具有广泛应用的潜力：不能通过直接瘤内注射达到或没有可触及淋巴结的肿瘤可能仍然对静脉注射或注射相关mRNA疫苗有反应。目前的挑战是确定最有效的蛋白质或蛋白质组合进行编码，以引导免疫系统攻击癌症，使免疫系统能够深入肿瘤并为每位患者提供个性化的治疗。蛋白质和细胞免疫疗法一个新的兴趣领域是使用mRNA给药，以产生治疗水平的免疫或免疫调节蛋白（表3），如抗体或细胞因子。与传染病和癌症疫苗相比，需要生产更多的蛋白质才能使此类治疗有效，在某些情况下，可能需要终身重复给药治疗。­­­蛋白质免疫疗法的另一个挑战是将mRNA输送到所需的器官和细胞类型，以实现最佳的治疗效果。例如，某些表达的蛋白质需要进一步的PTM，如糖基化和蛋白水解处理，才能发挥完全的功能。然而，PTM对蛋白质的形成方式可能是组织依赖性的，并且可能不是简单地由mRNA序列决定的，因此强调需要组织特异性地传递mRNA。­­当mRNA物种与LNP复合系统给药时，由于载脂蛋白E与LNP表面结合，导致肝细胞受体介导的摄取，许多物种倾向于回到肝脏。非肝器官选择性可以通过改变脂质成分来实现，包括调整脂质比例和特性，从而产生靶向肺内皮或脾脏的LNP。最近，通过调节PEG脂质结构改变LNP表面化学，导致LNP靶向造血干细胞生态位中的骨髓内皮细胞。­因此，与疫苗相比，mRNA蛋白质免疫治疗在传递、蛋白质生产效率和耐受性方面提出了一些独特的挑战。这可以解释为什么mRNA的应用进展比mRNA免疫慢。mRNA编码的单克隆抗体治疗通过直接注射将mRNA传递到特定组织或器官是一大障碍。相反，暴露可以简化临床应用，只要它是安全的，并且表达足够水平的蛋白质以获得治疗效果。在mRNA药物中编码单克隆抗体（mAb）就是这种方法的一个例子，并以mRNA-1944为例，mRNA-1944是一种mRNA–LNP，编码一种抗基孔古亚病毒的中和mAb，在一名免疫患者（NCT03829384）中鉴定。第一批接受治疗的健康志愿者的结果表明，在所有试验剂量下（0.1、0.3和0.6 mg/kg，静脉注射），都可以检测到中和单克隆抗体水平。然而，在最高剂量时，四名受试者中有三名出现输液相关反应，其中一名受试者出现3级心动过速和白细胞计数升高，心电图上还有2级恶心、呕吐、发热和短暂的倒置T波。同一剂量水平但经类固醇预处理的单独队列没有3级不良反应，但产生的基孔肯雅特异性抗体（Chikungunya-specific antibodies）（Emax）水平较低1.7倍。一个队列的数据显示，两次给药0.3 mg/kg，间隔2周，第一次给药与第二次给药后，不良反应没有恶化，也没有脂质积聚。­­­­利用mRNA生产抗体的应用仍然令人感兴趣，目前正在进行多个行业合作，例如CureVac和Genmab（基于mRNA的抗体抗癌疗法148）之间的合作，以及Neurimmune和Ethris（编码抗SARS-CoV-2单克隆抗体的吸入式mRNA（参考文献149））之间的合作。这里一个重要的考虑因素是从mRNA表达单克隆抗体的好处，而不是使用通过传统重组制造的相同抗体。最终，最有希望的方法将是所需剂量、作用持续时间、所需PTM类型以及输送系统和相关抗体的相对治疗指数比的函数。­­mRNA编码的免疫刺激蛋白用于癌症治疗另一种抗癌方法是注射预期具有直接治疗效果的mRNA编码蛋白，通常通过刺激免疫系统，如OX40配体（OX40L）或IL。其中一种产物mRNA-2416是编码免疫检查点调节器OX40L的mRNA，在肿瘤内给药。尽管首次报道的41名患有多种恶性肿瘤的患者的单药治疗结果不符合实体瘤部分疗效的疗效评估标准，但申办方目前正在将其纳入与杜洛单抗联合治疗卵巢癌的II期扩展队列（NCT03323398）。其他mRNA产物编码几种不同的免疫调节蛋白。一个例子是ECI-006，它是TriMix（编码DC激活分子（CD40L、CD70和caTLR4）的mRNA物种）和编码黑色素瘤特异性TAA（酪氨酸酶、gp100、MAGE A3、MAGE C2和PRAME）的mRNA的组合，该药物经静脉注射，正在切除黑色素瘤的I期研究（NCT03394937）中进行测试（TriMix单独用于乳腺癌的I期研究（NCT03788083）并给予瘤内注射）。另一个例子是mRNA-2752（编码OX40L、IL-23和IL-36γ的三种mRNA物种），它正在实体瘤和淋巴瘤的剂量递增研究（NCT03739931）中进行评估。类似地，BNT131（SAR441000）编码IL-12sc、IL-15SUSH、IFN-α和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF），目前正在研究作为一种旨在改变肿瘤微环境的瘤内注射。另一类产品是免疫调节融合蛋白。MEDI1191编码含有IL-12α和IL-12β亚单位的单链融合蛋白，亚单位之间有连接子。该药物是为肿瘤内注射而开发的，目的是与全身注射重组IL-12相比，提高耐受性。过继免疫细胞治疗中的mRNA过继细胞移植是一种相对较新的治疗方法，涉及收集和使用患者自身的免疫细胞来治疗癌症。这一点已在乳腺癌患者中进行了探索，Tchou等人观察到，肿瘤内注射转染了编码c-Met嵌合抗原受体（CAR）mRNA的T细胞的耐受性良好，并在乳腺癌肿瘤组织内诱导炎症反应；同样，Maus等报告了四名接受电穿孔自体T细胞治疗的个体，电穿孔的mRNA编码一种来自人类间皮瘤特异性小鼠抗体的CAR。其中一名受试者在第三次输注后几分钟内出现过敏反应和心脏骤停，作者将其归因于产生免疫球蛋白（Ig）E型人抗小鼠抗体（NCT01355965）。最近，Beatty等评估了转染了编码间皮素导向CAR的mRNA的T细胞作为胰腺癌的治疗，避免了T细胞启动；在I期研究中，这些细胞不会诱发细胞因子释放综合征，也不会引发神经症状。­­过去，利用逆转录病毒基因转移成功地生成了CAR T细胞，最近又利用CRISPR–Cas9介导的基因整合系统成功地生成了CAR T细胞。据报道，不仅使用mRNA，而且使用核糖核蛋白介导的传递系统都取得了成功。然而，如上所述，我们在体内中看到了生成CAR T细胞的潜力。尽管核糖核蛋白在体内的功能传递尚待描述，但最终，假设可以证明向T细胞安全有效地传递，mRNA在负载能力和氧化方面可能比病毒传递具有实质性优势。还描述了能够促进体内递送至多类免疫细胞的纳米制剂，包括巨噬细胞、B细胞和T细胞，为一系列免疫疗法提供了希望。例如，通过T细胞靶向mRNA递送，体内CART细胞的产生可能成为可能，从而为癌症创造新的治疗方法。通过识别有利于向这些细胞递送的特定脂质结构，已经实现了将LNP重新靶向T细胞。此外，靶向抗体的mRNA纳米颗粒（通过表面偶联赋予其特异性）能够对免疫细胞特异性受体（如CD4）具有亲和力。对于旨在在体内编辑免疫细胞的疗法，mRNA可能允许基因组编辑核酸酶或碱基编辑器的瞬时表达，由于RNA降解，它们会在细胞中短暂地持续表达。尽管到目前为止，已发表的关于将mRNA递送至T细胞的报告仅显示了体外绿色荧光蛋白标记物的破坏，但通过将mRNA全身递送至肝细胞的基因编辑成功已经在人类TTR淀粉样变性中得到证实，其中mRNA编码Cas9蛋白的LNP与靶向TTR的引导RNA一起被递送。在患者中，血清TTR蛋白浓度与基线相比呈剂量依赖性平均降低，只有轻微的不良反应。这一令人印象深刻的结果暗示了mRNA在系统基因编辑中的未来潜在用途。结论和未来方向mRNA在基因疗法和蛋白质疗法之间占有独特的地位，它结合了两者的许多优点，同时解决了任何一种面临的独特挑战。例如，对生物反应器中的生产造成无法克服的技术挑战的多聚体蛋白可以在患者自己的身体中通过编码不同亚基的mRNA或mRNA种类的组合来生产，这是一个已在候选者中使用的灵活性机会CMV疫苗和癌症应用，随着世界正在努力应对不同SARS-CoV-2毒株的出现，这些毒株对授权的SARS-CoV-2疫苗具有不同的敏感性。随着该领域对技术的优化和改进，mRNA药物很可能也将被开发用于传染病和癌症以外的适应症。靶蛋白表达的固有短暂持续时间使mRNA治疗成为需要单次或不超过少量蛋白质表达的情况的理想方式，例如传染病疫苗。重复给药、滴定剂量或改变给药间隔的能力为临床医生提供了经典药物治疗的灵活性，使其成为个体患者需求可能不同或对基因治疗可能存在犹豫的适应症的有吸引力的选择。从安全的角度来看，对于两个疫苗项目（SARS-CoV-2的mRNA-1273和mRNA-1647），似乎第二剂后的不良反应比第一剂后更明显。然而，这似乎不是一个普遍的观察结果。癌症疫苗BNT111已被给予超过8剂的一些患者，并且明显保持疗效。吸入mRNA治疗剂MRT5005每周给药多达五剂，在第一剂和第五剂之间没有出现安全性恶化的迹象。通过对工程化、非人类和人工蛋白质构建体的评估，mRNA疗法的潜力将进一步扩大。蛋白质治疗剂已被设计用于延长半衰期，例如，通过将Fc域与治疗域融合。同样可以在mRNA疗法中编码。也许更令人兴奋的是表达新细胞内疗法的能力。来自mRNA的基因编辑机制的瞬时表达对于减少持续表达的副作用很有吸引力。此外，抗体、抗体片段或其他蛋白质结合基序的细胞内表达提供了一种独特的治疗类别，可以与亚细胞定位结构域（例如细胞核）结合，以集中编码蛋白质的作用。mRNA的首次应用涉及刺激免疫系统，用于传染病疫苗或癌症疫苗。传染病应用一直是平台的试验场；迄今为止，癌症疫苗作为一个类别并不是特别成功，但BNT111令人鼓舞的结果暗示了高蛋白表达和免疫激活途径的结合可能会克服早期蛋白疫苗遇到的一些障碍。由于RNA通过TLR和RIG-I通路激活免疫通路的内在能力，在产品中利用RNA的免疫刺激特性非常有意义。这与编码蛋白无关，如CV8102所示，这是一种用作免疫佐剂的非编码RNA。在审查已进入临床试验的mRNA候选药物的安全性和耐受性概况时，这种免疫刺激特性的缺点就很明显了。新出现的情况是，与mRNA药物相关的最常见的不良反应是某种形式的炎症反应。这种潜在的途径可以通过多种方式表现出来：肌肉注射或皮下注射时的局部反应（局部疼痛、发红、酸痛），或者更广泛的发热综合征或静脉注射、肌肉注射或吸入药物的流感样反应.这些似乎通常可以用经典的抗炎药治疗，尽管在静脉注射编码基孔肯雅特异性mAb的mRNA的情况下，预防性类固醇的使用被用来减轻在接受最高剂量的队列中观察到的不良反应。这种干预似乎确实成功地抑制了不良反应，但也与蛋白质表达的减少有关。这些数据为研究重复给药mRNA疗法的一些潜在未来方向提供了有趣的见解。类固醇对于减轻mRNA编码的蛋白质疗法的炎症副作用谱是否有效并且是必需的？如果是这样，这是否以减少蛋白质表达为代价？同时观察到较少的副作用和减少的表达是否暗示一定程度的炎症实际上可能是良好蛋白质表达的先决条件？如果是这种情况，一个临床挑战将是穿上那根针并允许启动足够的亚临床炎症过程以促进良好的转化，而不会让它们上升到危及重复给药的临床可行性的严重程度。这些问题有些复杂，因为大多数mRNA应用不涉及简单的裸mRNA，而是封装在LNP或PNP中的mRNA，所有这些都有助于耐受性。已提议在临床试验的对照组中使用不含mRNA的“空LNP”，以帮助阐明mRNA与LNP对耐受性曲线的不同贡献。这种方法的一个理论上的限制是，当没有与带负电荷的mRNA复合时，空LNP具有不同的物理化学性质，因此不代表真正的比较器。尽管在单剂量（疫苗接种）或危及生命的疾病（肿瘤学）的情况下，短暂的炎症反应是可以接受的，但对于需要长期治疗的适应症，尤其是静脉给药时，选择适当的、耐受性良好的和安全的脂质和配方至关重要。似乎动物实验在这里的价值有限，因为注意到在人类中引发细胞因子释放的癌症疫苗BNT111的浓度在人类中比在小鼠中低1,000倍以上，并且在吸入后观察到的发热反应MRT5005不是基于动物毒性实验预测的。除了直接耐受性之外，还必须解决有关脂质积累潜力的长期问题。如果产生的蛋白质的半衰期短，那么维持表达和临床疗效所需的给药间隔可能比消除脂质的理想时间短。因此，重复给药可能导致靶组织或脱靶组织中的脂质积累，具有难以预测的长期安全风险。制剂科学将成为mRNA治疗学未来的一部分，就像进一步了解mRNA本身的生物学一样。引入临床的不同给药途径也说明了mRNA治疗的非凡潜力：i.m.、i.d.、皮下、i.n.、瘤内、i.v.、心外膜和吸入。其他应用很容易想象：鼻内疫苗、滴眼剂或滴鼻剂、皮肤软膏、栓剂、膀胱内滴注溶液、鞘内给药装置或Ommaya储液罐。我们相信未来mRNA治疗的广度将由递送纳米颗粒的进步来定义。越来越多的证据表明，可以对LNP和PNP进行工程改造，以输送到包括肝脏在内的一系列身体组织、内皮、肺、骨髓和免疫系统的多种元素。通过改进的递送材料和包含额外的靶向元件在效力和组织靶向方面的额外进展将继续为mRNA治疗的新治疗应用打开大门。两种接受EUA的SARS-CoV-2疫苗的成功凸显了mRNA的制药优势之一：临床试验材料的生产速度。最初开发用于将个体化新抗原疫苗从切除的患者肿瘤快速转变为可注射的临床产品的制造技术已通过在SARS-CoV-2发布后数周内启动候选mRNA疫苗的临床试验来证明其潜力序列。同时，我们在COVID-19疫苗方面的经验也凸显了该技术目前的局限性之一：对冷链储存和运输的依赖。能够处理-80°C温度的冷冻机是专用设备，并非在每个药房或临床试验场所都容易获得。对于打算在患者家中自行给药的治疗，即使在-20°C下储存也可能具有挑战性。将mRNA药物从实验室带到床边的下一个前沿领域很可能是制剂科学。在生产COVID-19疫苗的竞赛中，mRNA作为一个安全有效的平台的出现，为全世界提供了关于mRNA-LNP技术的益处和风险的加速教育。尽管BNT121和mRNA-1273的生产速度和储存条件以及两剂方案的副作用已经引起了很多关注，但科学和医学界正在关注这两种疫苗之外，并急切地等待进一步验证其他适应症的mRNA药物。原文标题：The clinical progress of mRNA vaccines and immunotherapies识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入微信群！请注明：姓名+研究方向！版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。