MAP3K13

2024年12月13日，薛定谔公司（Schrödinger Inc.）团队在国际顶级药物化学期刊《Journal of Medicinal Chemistry》上发表了一篇题为“通过计算机辅助发现的KAI-11101，一种用于治疗神经退行性疾病和神经元损伤的临床前DLK抑制剂”的研究论文。 该研究通过前沿的计算化学方法，成功发现了一种新的、具有神经保护特性的临床前候选药物KAI-11101，这是一种针对双亮氨酸拉链激酶（DLK）的小分子抑制剂，有望用于治疗神经退行性疾病和神经损伤，如阿尔茨海默病、帕金森病、肌萎缩侧索硬化症（ALS）以及化疗引起的周围神经病变（CIPN）。这篇论文详细介绍了KAI-11101的发现过程，包括利用自由能量微扰（FEP）技术进行的虚拟筛选、构效关系（SAR）的研究、以及对候选药物的体外和体内药效学评估。研究团队通过精确的计算化学模型预测了化合物的亲和力，并在实验中验证了这些预测，从而快速识别出具有高潜力的候选药物。该研究不仅展示了通过计算化学手段加速药物发现的潜力，还为神经退行性疾病的治疗提供了新的策略和希望。 研究背景 双亮氨酸拉链激酶（DLK，也称为MAP3K12）是混合谱系激酶（MLK）家族的成员，包含一个N端激酶结构域，后面是两个亮氨酸拉链结构域和一个富含甘氨酸/丝氨酸/脯氨酸的C端结构域。它主要在神经元细胞中表达，特别是在神经元的突触末端和轴突中。轴突损伤或其他细胞应激会导致DLK二聚化、自磷酸化、MKK7的磷酸化和JNK/cJun通路的激活。近期的研究表明，抑制DLK可以减轻阿尔茨海默病和ALS模型中的突触丢失、神经元退化和功能下降。基于这些发现，DLK抑制被认为能为以轴突退化为特征的伤害或疾病提供功能性保护，使DLK成为治疗ALS和CIPN等疾病的有吸引力的治疗靶点。鉴于未满足的医疗需求，寻求开发一种强效、选择性且能穿透中枢神经系统的DLK抑制剂，适用于治疗这些神经退行性疾病。 药物设计 苗头（Hits）发现策略 研究团队使用自由能量微扰（FEP）这一计算化学技术，预测化合物与蛋白质结合的强度，从而在实际合成之前评估化合物的潜在效果。他们选择了一个高效的最小铰链结合片段作为起点，并通过FEP评分系统逐步筛选和评估不同的化学结构，快速识别出可能的强效化合物。这种方法让他们在实验开始前就能筛选出有潜力的化合物，节省了时间和资源。在确定了合适的核心结构后，团队通过迭代优化进一步细化化学系列，并合成了一小部分代表性分子进行测试，验证了FEP模型的准确性。他们从基序出发，评估了约800个未取代的杂芳香核心结构，并通过FEP产生了约2400个新的想法，进一步通过对接筛选排除了可能与蛋白质发生冲突的配体，然后高效地分析了这组化合物。这项工作最终确定了23个可合成、未取代的核心结构，这些化合物显示出强大的效力、药物效率和低分子量，且有较高的概率能够穿透大脑。第一轮合成的结果证明了FEP模型的预测性，为后续使用FEP引导的迭代开发提供了信心。通过这种方法，研究团队能够快速确定最适合替换的位置，并在咪唑吡啶核心中实现了单位数纳摩尔的效力，FEP预测的结合亲和力与实验测量的抑制数据保持了良好的相关性。 基于咪唑并吡啶的苗头到先导 ①研究团队起初考察了三个化合物系列，经过多轮设计、评估、合成和测试后，发现咪唑并吡啶系列因其优秀的DLK抑制效果和口服药代动力学特性而最有望。其中，化合物12表现出强大的DLK抑制活性和较高的配体效率，以及尚可的细胞内效力。通过共晶结构分析，确认了12与DLK的结合方式，包括氢键和π堆叠相互作用，以及异丙基和咪唑氮的疏水和水桥作用。这些发现指导了团队进一步优化C3和C6位置，以改善化合物的性质和效力。 ②他们发现，对C6位置的取代可以通过合理设计来优化，而C3位置的取代则显著提高了化合物的效力和溶解度。特别是化合物18，在生化和细胞实验中表现出强大的DLK抑制作用，溶解度好，稳定性高，且具有良好的口服生物利用度和脑渗透性。然而，由于化合物18在hERG实验中显示出过强的抑制作用，研究团队决定停止对其的进一步研究。 Table 3. Imidazopyridine Series SAR ③为了降低化合物对hERG通道的抑制作用，研究团队采取了多种策略，包括降低LogD值、增加分子的三维结构和调节分子的碱性。他们发现，增加极性基团或分子的三维结构并没有显著减少hERG抑制。随后，团队通过Jaguar软件预测并合成了预计碱性较低的化合物，发现调节胺基的pKa值可以有效减少hERG抑制。特别是，当pKa值调节到中性范围时，化合物的hERG特性得到了显著改善。团队最终确定了pKa值低于6.5的化合物更有可能具有较弱的hERG抑制作用，并将这一标准应用于后续化合物的选择和合成。 Table 4. Mitigating the hERG Liability in the Imidazopyridine Series ④在体外ADME特性测试中，咪唑并吡啶系列的大多数化合物表现出高水溶性和高通透性，属于BCS I类化合物。特别地，化合物26因其强大的DLK抑制作用、良好的溶解度、低清除率、高通透性和较低的hERG抑制作用而被认为是一个有潜力的候选药物。在小鼠的体内药代动力学研究中，化合物26显示出良好的口服生物利用度和大脑穿透性。此外，通过使用DRG神经元的体外模型，研究团队证明了化合物26能够保护轴突免受紫杉醇诱导的退化，这与其在细胞实验中的效果相一致。尽管化合物26及其类似物能够与目标蛋白结合，但它们显示出对CYP3A酶的时间依赖性抑制作用，可能会增加药物相互作用的风险。研究团队尝试了多种方法来减少这种抑制作用，包括改变化合物结构，但这些尝试大多未能成功。 Table 5. In Vitro and in Vivo ADME Properties of Imidazopyridine Series Exemplar  ⑤最终，他们通过FEP指导设计了新的化合物核心，以保持对DLK的抑制效果同时减少对CYP3A的抑制。新设计的化合物中，吡唑并吡啶酮41不仅减少了对CYP3A的抑制，还显示出良好的体外ADME特性，因此被选为进一步开发的对象。 Table 7. CYP3A TDI SAR for a Set of De Novo Designed Bicyclic Cores 先导优化 ①在吡唑并吡啶酮系列的先导化合物优化中，研究团队的目标是提高药物的大脑穿透能力，这对于中枢神经系统激酶药物发现项目至关重要。他们最初使用了多种公认的预测指标来指导药物设计，但发现这些指标与实际的大脑穿透性数据并不总是相关。因此，团队开发了一个新的预测模型E-sol（能量溶剂化），这是一个基于量子力学的计算方法，能预测化合物在水和真空之间的分配，从而估计其大脑穿透性。E-sol考虑了分子的三维构象、大小、极性以及pKa值等多个因素。通过分析，他们发现E-sol与大脑药物分配系数Kp,uu有很强的相关性，并使用这个新模型来指导后续的化合物设计和筛选。这使得他们能够更准确地预测和优化化合物的大脑穿透性，从而提高药物的效果和安全性。 ②化合物41具有THP基团，对DLK的抑制能力强，稳定性好，且在小鼠中显示出良好的大脑穿透力。研究团队通过FEP和E-sol计算优化了化合物的结构，发现七元环结构的效力最强，而较小的氧杂环庚烷环结构效力最弱。哌啶类似物47与THP类似物效力相似，具有良好的体外ADME特性和大脑穿透力，但hERG抑制作用较弱。通过调整哌啶的pKa值，得到了hERG IC50更高的化合物48，但其大脑穿透力下降。此外，研究发现较小的R1取代类似物49虽然DLK抑制力强，但水溶性差。对THP环进行甲氧基取代后，得到了效力更强、具有良好ADME特性和大脑穿透力的化合物50和51。 Table 9.Initial SAR on Pyrazolopyridinone Series ③吡唑并吡啶酮类似物41在激酶选择性方面表现不错，其S-scores显示了较好的靶点选择性。为了进一步提高选择性，研究团队通过FEP模型预测和实验验证，确定了几种关键的非靶激酶，并以此为基础优化化合物结构。他们发现，在THP基团上添加手性甲氧基团可以提高选择性，其中顺式构型的类似物51相比其反式异构体50和母体化合物41显示出更好的选择性。这些发现帮助团队在保持药效的同时，减少了对非靶激酶的抑制，提高了药物的安全性。 Table 10.Top off-Target Kinase Kd Ratio over DLK Potency ④化合物51的共晶结构显示了它与DLK激酶活性位点的关键相互作用，特别是与GLN197和VAL131残基的关系。研究团队假设，通过改变甲氧基团的空间排列，可以提高化合物的选择性，使其更倾向于与DLK而非其他非靶激酶结合。基于这个假设，他们设计并测试了新的化合物，发现在甲氧基位置添加较大的基团可以提高选择性。此外，他们还研究了铰链区域的变化对选择性的影响，并发现某些变化能够提高DLK的效力和选择性。 Table 11.Pyrazolopyridinone Series SAR to ImproveSelectivity ⑤在进行药物选择性研究的同时，化合物51虽然整体表现良好，但在狗体内的清除率较高。研究团队通过代谢物鉴定发现，高清除率主要是由于THP环的氧化和甲氧基团的脱甲基作用引起的。他们尝试了不同的化学修饰来降低清除率，最终发现用顺式取代的二氟环己基替换THP环的化合物59在三个物种中都稳定，且具有皮摩尔级别的效力和优秀的激酶选择性。在小鼠体内的药代动力学研究显示，化合物59具有低清除率、长半衰期和良好的生物利用度，以及良好的大脑穿透能力。因此，KAI-11101（化合物59）被选为进一步研究的对象。在体外实验中，KAI-11101显示出对DLK活性的强效抑制和对紫杉醇诱导的轴突退化的保护作用，其效果优于Genentech的临床一期候选药物GDC-0134。 Table 12.Pyrazolopyridinone Series SAR to Improve dLM CLint 体内活性评价 KAI-11101在体内实验中显示出随着剂量增加，大脑中的药物浓度也线性增加，并且能有效抑制小鼠小脑中的p-cJun，表明药物能够达到预期的靶点。此外，KAI-11101在多个物种中展现出良好的口服药代动力学特性和大脑穿透能力。尽管在狗体内清除率较高，可能涉及肝外清除机制，但在其他物种中未观察到N-甲基化。KAI-11101在体外安全性测试中表现良好，对激酶选择性高，且预测的人体剂量能够达到神经保护效果。虽然对CYP3A有轻微抑制作用，但预计临床药物相互作用风险低。因此，KAI-11101因其整体良好的特性被选为进一步毒理学评估的临床前候选药物。 亲脂性分析：从苗头到候选 作者强调了自由能微扰（FEP）技术在预测DLK抑制剂的生物活性方面的高效性和准确性。FEP预测的pKi值与实验值高度一致，平均误差仅为0.4个pKi单位，意味着预测值通常在实验值的2.5倍范围内。此外，FEP预测的稳定性和DLK抑制剂的生化与细胞效力之间的强相关性进一步证实了FEP技术在药物开发中筛选和优化化合物的实用性，有助于提高药物研发的效率。 总结 这篇论文描述了通过计算化学方法，特别是自由能微扰（FEP）技术，发现并优化了一种新型DLK抑制剂KAI-11101的过程。该抑制剂针对神经退行性疾病和神经损伤，展现了良好的体外效力、激酶选择性、药代动力学特性和安全性，被选为临床前候选药物。研究中利用FEP预测化合物的生物活性，优化了化合物设计，并最终确定了具有准皮摩尔级别效力和良好大脑穿透性的KAI-11101，为未来治疗相关疾病的药物开发提供了有力候选。 参考来源： https://doi.org/10.1021/acs.jmedchem.4c02074 --------- End --------- 感兴趣的读者，可以添加小邦微信加入读者实名讨论微信群。添加时请主动注明姓名-企业-职位/岗位 或  姓名-学校-职务/研究方向。

MAPK（丝裂原活化蛋白激酶）通路是细胞内一种重要的信号传导途径，广泛参与调控细胞生长、分化、死亡、应激反应等多种生物学过程。MAPK通路对于细胞应对外界环境变化具有核心作用，涉及到多种疾病的发生发展，包括癌症、炎症性疾病等。 一、MAPK通路的组成 MAPK通路主要由三类蛋白激酶组成，它们按照特定的顺序激活： 1.MAPKKK（MAPK激酶激酶）：最上游的激酶，响应信号分子的刺激。 2.MAPKK（MAPK激酶）：由MAPKKK激活，进一步放大信号。 3.MAPK：最终的执行者，被MAPKK激活后，转移到细胞核内，通过磷酸化特定的基因调控蛋白，影响基因表达。 图：MAPK通路的基本组成（来自Targeting the Raf-MEK-ERK mitogen-activated protein kinase cascade for the treatment of cancer.） 二、MAPK通路的主要分支 MAPK通路可以分为几个主要分支，每个分支由不同的MAPK蛋白构成，主要包括：ERK通路，JNK通路和p38 MAPK通路。 1. ERK通路（Extracellular signal-Regulated Kinases） ERK通路，也称为经典的MAPK通路，主要响应生长因子和一些其他刺激。它通常与细胞增殖和分化过程相关联。 主要组成： ●上游激酶：包括Ras小GTPase，它激活RAF激酶（如BRAF）。 ●中间级激酶：RAF激活MEK1和MEK2（MAPK/ERK激酶）。 ●下游激酶：MEK激酶进一步激活ERK1和ERK2。 生物学功能： ●细胞增殖：ERK通路的激活促进细胞周期蛋白的表达，推动细胞周期进程。 ●细胞分化：在某些细胞类型中，ERK激活是细胞分化必需的。 ●生存信号：ERK可以激活抗凋亡蛋白，如Bcl-2，帮助细胞逃避程序性细胞死亡。 MAPK/Erk 信号级联放大通过生长和分化中涉及的各种不同受体进行激活，包括受体酪氨酸激酶 (RTKs)、整合素以及离子通道。由不同的刺激物激活的级联反应的特定组分差异较大，但通路的结构通常包含一组对接蛋白（Shc、GRB2、Crk 等），它们将受体连接到一个鸟苷酸交换因子上（SOS、C3G 等），信号则转导至小分子 GTP 结合蛋白 (Ras，Rap1)，后者再激活级联中的核心单位，包括一个 MAPKKK (Raf)、一个 MAPKK (MEK1/2) 和 MAPK (Erk)。激活的 Erk 二聚物可在胞质中调控靶蛋白，也可转运入胞核，在核内磷酸化多种调控基因表达的转录因子。 图：生长和分化中的 MAPK/Erk（来自Cell signaling） 2. JNK通路（c-Jun N-terminal Kinases） JNK通路，也称为应激激活蛋白激酶通路，主要响应应激信号，如紫外线照射、热休克和炎症因子。 主要组成： ●上游激酶：包括MKK4和MKK7。 ●下游激酶：它们激活JNK1、JNK2和JNK3。 生物学功能： ●细胞应激反应：JNK通路在细胞对环境应激做出反应中发挥关键作用。 ●调节细胞死亡：JNK的活化通常与细胞凋亡相关，尤其是在病理条件下。 ●炎症反应：JNK能够调节多种炎症细胞因子的表达。 应激活化蛋白激酶 (SAPK)/Jun 氨基末端激酶 (JNK) 是 MAPK 家族的成员，可由各种不同环境应激、炎症细胞因子、生长因子以及 GPCR 激动剂激活。应激反应信号经 Rho 家族（Rac、Rho、cdc42）的小分子 GTP 酶传递到这个级联。和其他 MAPK 一样，膜近端激酶是一个 MAPKKK（通常为 MEKK1–4），或是混合性谱系激酶（MLK）中一员，能磷酸化并激活 MKK4 (SEK) 或 MKK7（即 SAPK/JNK 激酶）。此外， MKK4/7 能由生发中心激酶 (GCK) 家族成员以独立于 GTP 酶的方式激活。SAPK/JNK 转运入胞核后可调节多种转录因子的活性。 图：SAPK/JNK信号级联放大（来自Cell signaling） 3. p38 MAPK通路 p38 MAPK通路同样响应应激信号，包括细胞因子和环境应激，常与细胞生存和炎症反应相关。 主要组成： ●上游激酶：包括MKK3、MKK4和MKK6。 ●下游激酶：p38 MAPK有四个不同的同源体：p38α、p38β、p38γ和p38δ。 生物学功能： ●炎症反应：p38 MAPK是许多炎症介质表达的调节者，对免疫细胞的活化起重要作用。 ●细胞周期调控：p38在某些情况下可以抑制细胞周期的进程，从而影响细胞增殖。 ●细胞分化：特别是在骨骼肌细胞和神经细胞的分化中，p38 MAPK的激活对某些分化途径至关重要。 p38 MAPK（α、β、γ 和 δ）是 MAPK 家族的成员，各种环境应激和炎症细胞因子均可将其激活。对于其他 MAPK 级联，膜近端组分是一个 MAPKKK，其为典型的 MEKK 或混合性谱系激酶 (MLK)。MAPKKK 磷酸化并激活 MKK3/6，后者即是 p38 MAPK 激酶。MKK3/6 也可在凋亡因素的刺激下直接由 ASK1 激活。p38 MAPK 参与调节 HSP27、MAPKAPK-2 (MK2)、MAPKAPK-3 (MK3) 和其他几种转录因子，包括 ATF-2、Stat1、Max/Myc 复合体、MEF-2 和 Elk-1，而 CREB 通过激活 MSK1 间接调控。 图：p38 MAPK信号转导相互作用通路（来自Cell signaling） 三、MAPK通路的激活机制 MAPK通路通常是通过细胞表面的受体如受体酪氨酸激酶（RTKs）或G蛋白偶联受体（GPCRs）接收信号，触发一系列下游事件： 1.受体激活：受到外界信号分子（如生长因子）的结合后，受体自身活化或聚合，激活与其相连的适配蛋白。 2.Ras蛋白的激活：在ERK通路中，适配蛋白进一步激活小G蛋白Ras。 3.MAPKKK的激活：Ras激活RAF家族蛋白（MAPKKK的一种），后者激活MEK（MAPKK）。 4.MAPK的激活：MEK进一步激活ERK，ERK磷酸化核内的靶蛋白，如转录因子，从而改变基因表达。 四、MAPK通路的生理与病理意义 MAPK通路在维持正常细胞功能和发展中起着关键作用，但当这些通路异常激活或抑制时，可能导致多种疾病的发生： ●癌症 MAPK通路的持续激活常见于多种肿瘤，促进肿瘤细胞的增殖和存活。 MAPK信号通路与细胞增殖和分化密切相关。在许多恶性肿瘤中发现MAPK信号的持续激活。细胞增殖在很大程度上有助于肿瘤发生。肿瘤转移和侵袭是致命原因。在哺乳动物MAPK通路中，ERK通路是研究最充分的，在大约三分之一的人类癌症中失调。 ERK1/2通路在肿瘤细胞的增殖、分化、转移和侵袭中起重要作用。 温等人发现乙型肝炎病毒x蛋白通过p38/MAPK通路使p53基因失活，从而诱导原发性肝癌（PLC）。Kim MS等人证明，p38 MAPK是Ras诱导的乳腺癌细胞侵袭和转移的关键信号分子。许多研究表明，p38 MAPK通路在细胞外刺激产生的MMP（基质金属蛋白酶）中发挥重要的调节功能。MMP是一种与肿瘤侵袭和迁移密切相关的蛋白水解酶。此外，p38 MAPK通路促进维持肿瘤细胞生长所必需的肿瘤血管生成。 癌症经常暴露于各种压力条件下，例如缺氧和炎症。许多MAPK通路都参与应激信号传导。因此，一些激酶在癌症中被应激激活，以响应炎症、DNA 损伤和细胞凋亡。缺氧状态在实体瘤中广泛存在。缺氧信号刺激MKP-1的激活。MKP-1 进一步激活 SAPK/JNK，从而激活 c-Jun。活性 c-Jun 促进多个下游基因转录，这对癌细胞的增殖和存活很重要。 MAPK信号转导的畸变会影响大多数致癌过程，对癌症的发展和进展至关重要。大多数癌症相关病变，如受体酪氨酸激酶的过表达、受体酪氨酸激酶的激活突变、激活配体的持续自分泌或旁分泌产生、Ras 突变和 B-Raf 突变导致 ERK 信号转导的组成型激活。据报道，c-Jun 的 JNK 活性和磷酸化在 Ras 诱导的肿瘤发生中起关键作用。 ●炎症性疾病 在炎症性疾病中，MAPK通路通过影响细胞因子、生长因子和应激反应等因素的表达和活性，起到了至关重要的调控作用。 MAPK通路参与调控包括肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素（如IL-1, IL-6）等多种炎症性细胞因子的产生。这些细胞因子是炎症反应中的关键介质，能够激活更多的免疫细胞和促进炎症反应的发展。MAPK通路通过调节各种趋化因子和黏附分子的表达，影响免疫细胞（如巨噬细胞、T细胞）的活化、迁移和入侵到炎症部位。在炎症和其他应激条件下，JNK和p38 MAPK的激活促进细胞应对损伤和恢复平衡。 由于MAPK通路在炎症反应中的核心角色，研究者开发了多种针对该路径的抑制剂，以治疗如类风湿性关节炎、银屑病等炎症性疾病。例如，p38 MAPK抑制剂已被证明可以减轻炎症反应，通过减少炎症性细胞因子的产生。 ●神经退行性疾病 在神经退行性疾病的研究中，MAPK通路显示出其在神经保护和神经损伤中的双重作用，这些疾病包括阿尔茨海默病（AD）、帕金森病（PD）、亨廷顿病（HD）和肌萎缩侧索硬化症（ALS）等。 AD中，异常的tau蛋白磷酸化与MAPK通路的过度活化有关。特别是JNK和p38 MAPK在tau磷酸化和神经纤维缠结的形成中起着重要作用。PD中，JNK和p38 MAPK的活化与多巴胺神经元的死亡相关。MAPK通路参与了氧化应激和炎症反应的调控，这些都是PD的关键病理过程。在HD中，JNK的激活与疾病相关的神经毒性密切相关。JNK抑制剂显示出在预防神经退行方面的潜力。 五、MAPK通路的治疗应用 由于MAPK通路在多种疾病中的核心作用，该通路的组分成为了药物开发的重要靶点。目前已有多种针对MAPK通路的抑制剂被开发用于治疗特定类型的癌症（如BRAF抑制剂在黑色素瘤中的应用）和其他疾病。此外，针对JNK和p38 MAPK的抑制剂也在被研究中，以期治疗炎症和神经退行性疾病。 六、总结 MAPK通路是一条复杂的信号传导途径，涉及到多种生理和病理过程。对其深入研究不仅有助于我们理解细胞如何响应外界信号并调控各种细胞功能，还可以为疾病的预防和治疗提供新的策略。随着研究的深入，未来可能会发现更多的关于这一信号通路的调控机制和治疗潜力。 声明：发表/转载本文仅仅是出于传播信息的需要，并不意味着代表本公众号观点或证实其内容的真实性。据此内容作出的任何判断，后果自负。若有侵权，告知必删！ 长按关注本公众号  粉丝群/投稿/授权/广告等 请联系公众号助手 觉得本文好看，请点这里↓

近日，来自波兰科学院的Remigiusz Serwa团队和来自美国国立卫生研究院的Rolf E. Swenson教授在《Journal of Medicinal Chemistry》上合作发表了一篇题为《Selective Degradation of MLK3 by a Novel CEP1347-VHL-02 PROTAC Compound Limits the Oncogenic Potential of TNBC》的文章。该研究基于pan-MLK抑制剂CEP1347和E3连接酶VHL (von Hippel-Lindau)的配体，利用靶向蛋白水解嵌合体(PROTAC)技术，开发了一种可选择性降解混合谱系激酶3（MLK3）的化合物，研究发现化合物CEP1347-VHL-02在几种细胞系模型中可通过泛素-蛋白酶体系统有效地靶向MLK3降解，而不降解其他MLK家族成员。此外，他们发现CEP1347-VHL-02在有效降解MLK3的同时也可抑制其在TNBC中的致癌活性，进一步认为这种新型MLK3降解剂CEP1347-VHL-02在三阴性乳腺癌（TNBC）的治疗中具有潜在应用价值。 在过去的几十年里，研究人员们已经设计了几种小分子抑制剂来靶向MLK3和其他MLK家族成员，如CEP1347等，已被作为新的研究抗癌药物，但这些化合物的使用受到其低特异性的限制。针对此类抑制剂的使用缺陷，研究者们以CEP1347为药效团，设计并合成了8种由CEP1347和E3泛素连接酶VHL配体组成的PROTACs，并偶联了不同的连接体(CEP1347-VHL-01−CEP1347-VHL-08)。 图 1 为了确定实现有效降解MLK3的最佳连接体长度，研究者们利用免疫印迹检测多西环素(DOX)诱导的MLK3过表达(分别为A375_MLK3和HCC1806_MLK3)的A375和HCC1806细胞株，评估合成的PROTACs化合物对MLK3的降解效率，其中发现化合物CEP1347-VHL-02可以实现对MLK3的有效降解。 图 2 接下来，他们使用蛋白酶体抑制剂Carfilzomib处理HCC1806_MLK3细胞，确认了CEP1347-VHL-02是通过泛素-蛋白酶体途径实现对MLK3的降解作用(图3A)。此外，研究者们通过动力学实验(图3B,C)、蛋白质组学分析（图3E）以及免疫印迹分析实验（图3G），进一步验证了CEP1347-VHL-02对MLK3的选择性降解效果。 图 3 为了验证CEP1347-VHL-02是否在该激酶高表达的细胞系中降解内源性MLK3，他们使用了乳腺癌细胞系MCF-7(ER+亚型)和MDA-MB-468(TNBC亚型)进行了额外实验，这些实验均证实CEP1347-VHL-02在两种细胞系中都具有最佳的降解能力（图4）。 图 4 最后，他们对MCF-7和MDAMB-468细胞系进行了一系列表型分析。首先，他们观察到经CEP1347-VHL-02处理的MDA-MB-468细胞的克隆生成潜力显著降低（图5A右），而在MCF-7细胞系中没有观察到这种作用（图5A左）。此外，流式细胞术分析结果显示MDA-MB-468细胞增殖降低可能是由CEP1347-VHL-02处理后G2/M期细胞周期阻滞引起的(图5B)，同时研究者们观察到PROTAC对MDA-MB-468细胞凋亡产生了一定的诱导作用(图5C)。这些结果均表明，由于MLK3的降解，选择性地降低了TNBC细胞的致瘤性和侵袭潜力，其中MLK3起致瘤作用。 图 5 总之，研究团队证实了基于PROTAC技术合成的化合物CEP1347-VHL-02可实现对癌细胞系中MLK3的快速和选择性降解。该项研究为MLK3在癌症治疗中的选择性靶向提供了新的机会，并为开发下一代MLK3及相关激酶的降解物铺平了道路。 本文作者：CY 声明：发表/转载本文仅仅是出于传播信息的需要，并不意味着代表本公众号观点或证实其内容的真实性。据此内容作出的任何判断，后果自负。若有侵权，告知必删！ 长按关注本公众号  粉丝群/投稿/授权/广告等 请联系公众号助手 觉得本文好看，请点这里↓