Streptokinase

注：本文不构成任何投资意见和建议，以官方/公司公告为准；本文仅作医疗健康相关药物介绍，非治疗方案推荐（若涉及），不代表平台立场。任何文章转载需要得到授权。急性缺血性脑卒中是一种高发病率、高致残率的疾病，其治疗手段和药物研发一直是医学界关注的焦点。随着医疗技术的进步，急性缺血性脑卒中的治疗策略不断优化，从传统的静脉溶栓到机械取栓，再到多靶点脑保护药物的研发，治疗手段日益多样化。本文基于摩熵咨询发布的《急性缺血性脑卒中药物——市场研究专题报告》部分精华内容，着重分析了血管再通治疗、抗血小板治疗、抗凝治疗和降纤治疗的诊疗指南及药物市场竞争格局，并分析了急性缺血性脑卒中药物的市场趋势，旨在为临床医生、科研人员及患者提供全面的参考信息。 01急性缺血性脑卒中诊疗指南及药物市场竞争格局分析  缺血性脑卒中急性期治疗主要分为再通治疗与综合药物治疗。再通治疗包括静脉溶栓（阿替普酶、尿激酶）和机械取栓，综合药物治疗主要有改善循环的丁苯酞与人尿激肽原酶（尤瑞克林）、神经保护类的依达拉奉、依达拉奉右莰醇等。据摩熵医药销售数据统计，国内缺血性脑卒中急性期主要治疗药物近几年市场规模均在百亿元以上，2023年市场规模已达129亿元。阿替普酶与尿激酶受治疗窗口限制，2023年销售额合计为25.96亿元，占比20.19%。丁苯酞作为石药核心品种，2023年销售额69.68亿元，占比54.19%。首批国家重点监控合理用药目录发布之前神经保护类药物市场巨大，依达拉奉作为佼佼者2019年销售额43.13亿元，但在重点监控目录发布后销售额断崖式下跌，2023年仅剩1.77亿元。依达拉奉右莰醇（先比新，1类新药）作为依达拉奉接棒产品，2020年上市至2023年销售额就已达到23.45亿元，仅次于丁苯酞。数据来源：摩熵医药销售数据库01替奈普酶可能成为阿替普酶的替代品血管再通治疗方案包括静脉溶栓、血管内机械取栓及动脉溶栓。（1）静脉溶栓治疗：目前静脉溶栓药物主要包括阿替普酶、替奈普酶、瑞替普酶和尿激酶。（2）血管内机械取栓：血管内介入治疗是近年急性缺血性卒中治疗的重要进展，可显著改善急性大动脉闭塞所致缺血性卒中患者的预后。（3）动脉溶栓治疗：由于缺乏充分的证据证实动脉溶栓的获益，因此，目前首选的血管内治疗方式是血管内机械取栓，而不是动脉溶栓。阿替普酶是由勃林格殷格翰（BI）研发，已成为全球公认的静脉溶栓治疗的标杆药物。在国内市场，阿替普酶也是静脉溶栓领域的佼佼者，2023年销售额高达15.31亿元，BI占据全部市场。相较于阿替普酶，尿激酶虽然在溶栓治疗中更易出现出血副作用，但其显著的价格优势使它在国内基层医疗机构中广泛使用。2022年尿激酶销售额突破10亿元大关，南大药业和人福药业占据了大部分市场份额。02抗血小板治疗对于不符合静脉溶栓与血管内机械取栓患者应在发病后尽快给与抗血小板治疗。急性出血性脑卒中抗血小板药物主要为阿司匹林、氯吡格雷、替格瑞洛及替罗非班。03抗凝治疗急性期抗凝治疗虽已应用50多年，但一直存在争议。Cochrance系统评价纳入28个随机对照（RCT）研究，所用药物包括普通肝素、低分子类肝素、口服抗凝剂和凝血酶抑制剂等。荟萃分析结果显示，抗凝药物治疗不能降低随访期末病死率，随访期末的病死率及残疾率亦无显著下降；抗凝治疗能降低缺血性卒中的复发率、降低肺栓塞和深静脉血栓形成发生率，但被症状性颅内出血增加所抵消。04降纤治疗降纤治疗适用于不适合溶栓，特别是高纤维蛋白血症患者。很多研究结果显示缺血性卒中急性期血浆纤维蛋白原和血液黏滞度增高，降纤制剂可显著降低血浆纤维蛋白原，并有轻度溶栓和抑制血栓形成作用。降纤酶是以五步蛇毒和白眉蝮蛇毒为原料的制剂，在国内销售额不高，2023年销售额仅0.24亿元。巴曲酶是巴西矛头蝮蛇毒分离，由日本东菱药业研发，国内由托毕西药业独家销售，2023年销售额达3.5亿元。02急性缺血性脑卒中药物市场趋势分析  01替奈普酶可能成为阿替普酶的替代品 缺血性卒中急性期治疗主要是溶栓和血管内治疗，目的是实现血管再通，恢复脑组织血流灌注。临床上常用的溶栓药物主要分为三代：（1）第一代代表药物是链激酶和尿激酶。链激酶其生产成本低，半衰期适中，但因其来源于细菌，有一定的免疫原性，且缺乏纤维蛋白特异性，在临床使用时易出现出血副作用。尿激酶是从人尿发现并分离出来的，可将纤溶酶原转化为纤溶酶，同样无纤维蛋白特异性。（2）第二代代表药物为阿替普酶。具有纤维蛋白特异性，可以有效减少出血风险。但半衰期较短，临床使用需要较高剂量，会导致血脑屏障的破坏，增加脑出血和水肿风险，价格也比较高。（3）第三代代表药物为替奈普酶。纤维蛋白特异性更高，半衰期更长。在美国2019年卒中急性期指南中，在某些情况下，推荐替奈普酶可以替代阿替普酶。比如：对无静脉溶栓禁忌证同时也适合行机械取栓的患者，选择替奈普酶（单次静脉团注0.25mg/kg，最大剂量25mg）而非静脉阿替普酶溶栓可能是合理的。对于轻度神经功能障碍且不伴有颅内大血管闭塞的患者，可以考虑替奈普酶替代阿替普酶。我国药品审评数据显示，截至2024年9月10日，勃林格殷格翰、世贸天阶医药、丰华生物注射用替奈普酶均已进入申请上市阶段。02多靶点脑保护药物拥有巨大的发展潜力急性缺血性卒中的治疗核心是挽救缺血半暗带的脑组织。早期再灌注治疗是目前为止被循证医学证实的最有效的治疗方法，但仍有至少一半的患者可能由再灌注损伤导致预后不良。另一个极有希望技能挽救缺血半暗带，又能防止再灌注损伤的治疗措施，是针对缺血级联反应的脑细胞保护。《缺血性卒中脑保护科学声明——来自脑卒中学会的科学声明》指出，多靶点药物可以在缺血级联反应的多个层面进行干预，从而实现多重效应终点。依达拉奉右莰醇作为我国自主研发的多靶点脑细胞保护剂，有基础研究显示，其具有清除自由基和抑制神经炎症双效协同机制，可有效阻断缺血性脑卒中缺血级联反应，打破了既往脑细胞保护药物在临床转化过程中不断面临失败的困境。研究者不断针对系列新靶点进行相关研究，并从传统脑保护靶点转向更上游、更广泛的领域，包括小RNA、蛋白质修饰等，既不局限于脑细胞保护的特定环节或药物靶点，而是关注脑细胞保护的整体病理生理过程，从更深层次、更广泛的角度探索脑细胞保护机制。目前比较热门的领域包括非编码RNA和多靶点保护。（1）非编码RNA：可通过与蛋白、DNA和RNA相互作用，参与多种细胞活动（如细胞凋亡、氧化应激、炎症反应和血管生成等），有望作为新型的AIS脑细胞保护药物。尤其是环状RNA，在组织中显示出高度的时空特异性，有望成为AIS的潜在治疗靶点。（2）多靶点保护：通过影响缺血级联反应的多个方面，包括兴奋性毒性、氧化应激和神经炎症等进行多个层面进行干预，实现多重效应终点。此外，由中医药多组分、多途径、多环节、多靶点的协同作用引申出的“以药试靶”“以靶组方”“态靶结合”等观点，也是一种多靶点保护新模式，拥有巨大的发展潜力。小结急性缺血性脑卒中的治疗正在经历一场深刻的变革，从单一的溶栓治疗到多靶点脑保护药物的研发，治疗手段不断丰富，治疗效果显著提升。随着替奈普酶等新一代溶栓药物的上市，以及多靶点脑保护药物的广泛应用，急性缺血性脑卒中的治疗前景更加光明，更多创新药物和治疗方案的涌现将为患者带来更多希望。END本文为原创文章，转载请留言获取授权急性缺血性脑卒中药物市场研究专题报告下期内容预告目录一、2024年急性缺血性脑卒中药物市场格局：先声药业创新药先必新势不可挡近期将持续更新，敬请期待近期热门资源获取数据透视：中药创新药、经典验方、改良型新药、同名同方的申报、获批、销售情况-2025042023H2-2024H1中国药品分析报告-2025042024年中国1类新药靶点白皮书-202503中国AI医疗健康企业创新发展百强榜单-202502解码护肤抗衰：消费偏好洞察与市场格局分析-2025022024年FDA批准上市的新药分析报告-2025012024年NMPA批准上市的新药分析报告-2025012024年医保谈判及市场分析报告-2025.012024年中国医疗健康投融资全景洞察报告-202501小分子化药白皮书（上）-2025012024医美注射材料市场发展分析报告-202412中国放射性药物产业白皮书-202410近期更多摩熵咨询热门报告，识别下方二维码领取联系我们，体验摩熵医药更多专业服务会议合作园区服务数据库咨询定制服务媒体合作👆👆👆点击上方图片，即可开启摩熵化学数据查询点击阅读原文，申请摩熵医药企业版免费试用！

近日，来自中山大学药学院、珠海联邦制药股份有限公司、联邦生物科技（珠海横琴）有限公司的研究人员在《合成生物学》上发表评述：蛋白质工程在医药产业中的应用。蛋白质工程，通过定向进化、半理性或理性设计、计算机辅助设计等手段，实现对蛋白质特定功能的设计和改造，获得的工程化蛋白质在食品、医药、能源、材料等行业具有重要的应用价值。在医药化工领域，工程化酶可作为化学原料药及其中间体合成的高效生物催化剂，实现医药工业绿色制造。在生物制药领域，多肽或蛋白修饰酶的改造可显著提升候选药物的制备效率，诊断酶的改造则可以大幅增强检测的准确性和灵敏度。此外，蛋白质工程在提升治疗性酶和治疗性抗体等生物制剂的生物活性、增强药物稳定性、降低免疫原性等方面也发挥重要作用，从而提高药物的可开发性、安全性和有效性。因此，本文简要回顾了蛋白质工程的发展历程，具体阐述了其在化学原料药合成和生物制药两大产业中的一系列应用实例，旨在剖析蛋白质工程在科技成果转化及医药产业应用中存在的问题与挑战，并展望医药产业中蛋白质工程的未来发展方向，以期为促进产学研一体化发展提供借鉴。随着DNA合成、测序技术、生物信息学和人工智能（artificial intelligence，AI）的发展，生物催化引领了一轮又一轮的技术革新浪潮，医药产业也迎来了快速的发展和升级。酶作为合成生物学重要的催化元件，被视为生物制造产业的“芯片”，在大宗产品、精细化工、化学原料药合成以及生物制药产业中均有广泛应用。在医药化工领域，生物催化能够在温和条件下实现水溶液中区域选择性和立体选择性的手性化合物的合成，且通常具有更高的反应速率、特异性、产品收率、产品质量和操作安全性。为了释放生物催化的潜力，必须采取有效策略尽可能地把酶催化整合到整个化学转化过程中，以此来减少合成步骤，提高原材料的利用率，减少环境不友好的操作过程。然而，野生型的酶可能由于以下原因无法满足工业生产的需求：①对非天然底物的催化效率较低，②对映体选择性不够高，③在极端条件（包括pH和温度等）下易失活，④对有机溶剂的耐受性不佳，⑤存在底物抑制或产物抑制等。因此，需要通过酶工程改善上述特性以满足工业生产的要求，这包括：快速发现新功能或性质更优的酶；选择合适的策略如定向进化、半理性设计或蛋白从头设计构建或生成突变库；在接近工业生产条件下筛选性质提升的突变体并进行多轮迭代。多维度优化后的生物催化剂使得化学原料药及其中间体的合成工艺遵循绿色化学原则，环境友好，并且节约生产成本，经济效益明显。近年来，生物制品如多肽药物、抗体药物、疫苗、细胞疗法和活体生物药等发展势头迅猛。在生物制药领域，酶具有修饰、诊断和治疗的重要价值，对于抗体药物研发也已经发展出了系统的抗体工程。整体来讲，蛋白质工程在生物制药行业的应用包括两方面。一类是生物催化，比如通过酶工程提高多肽和蛋白修饰酶的区域和立体选择性，加速候选药物分子的制备；提高诊断酶的反应特异性和检测准确性，增加酶的稳定性并将其开发为可居家使用的试剂盒。另一类是生物药（大分子药物）研发，治疗酶和治疗性抗体等的改造要达到更高的标准。除了催化或结合以及激动或阻断活性之外，还需要考虑免疫原性、给药方式和药代动力学性质等因素来进行蛋白质改造，以提高药物的可开发性、安全性和有效性。比如，结合人工智能预测和实验来删除或遮蔽T细胞和B细胞表位以降低免疫原性；通过位点改造或生物偶联延长药物的半衰期，减少给药频率；若采用口服给药，需要将药物开发成耐受胃肠道蛋白酶的形式。蛋白质工程加快了生物制药的创新，为业界开发出更多生物制品提供了技术保障。因此，本文简要回顾了蛋白质工程的发展历程和技术革新，聚焦于化学原料药合成和生物制药两大工业应用领域，从产业化的角度展示了蛋白质工程在医药产业中的应用，阐述了蛋白质工程如何赋能医药原料及中间体的绿色制造，如何助力生物制药加速创新。旨在展示蛋白质工程在医药产业中的应用和科技成果转化，促进产学研深度融合。1  蛋白质工程的发展历程20世纪80~90年代，由于对蛋白质改造的巨大需求，定向进化应运而生，Frances H. Arnold团队在这一领域作出了杰出贡献。通过易错PCR（error-prone PCR）和DNA改组（DNA shuffling）等技术构建突变文库，定向筛选特定突变体，重复数轮突变和筛选连续积累有益突变，最终实现具有新功能或功能提升的蛋白质。这种方法构建的突变文库通常较大，因此需要合适且灵敏可靠的高通量筛选方法。传统的筛选技术包括琼脂平板筛选和孔板筛选法，通量偏低。近十年来，荧光激活细胞分选技术（fluorescence-activated cell sorting，FACS）、液滴微流控分选（droplet-based microfluidic sorting，DMFS）等方法的开发极大地提高了筛选通量，也减少了筛选试剂的用量。这些筛选技术的原理、应用场景及案例已被详细综述。随着结构生物学的发展，人们对蛋白结构-活性关系的认识逐渐加深，半理性设计在蛋白质工程中逐渐占据了重要地位。基于已掌握的序列、结构和活性信息，选定特定位置进行改造，结合密码子的合理选用，构建“小而精”的突变体文库深受青睐。Manfred T. Reetz和孙周通等提出的组合活性中心饱和突变策略（combinatorial active-site saturation test，CAST）、迭代饱和突变技术（iterative saturation mutagenesis，ISM）、CAST/ISM和聚焦理性迭代定点诱变策略（focused rational iterative site-specific mutagenesis，FRISM），在扩展底物范围、区域选择性和立体选择性改造等方面得到了很好的应用。随着机器学习（machine learning，ML）和深度学习（deep learning，DL）的蓬勃发展，计算机辅助蛋白质设计越来越多地被应用于蛋白质工程。例如，类似于在药物研发中的定量构效关系（quantitative structure-activity relationship，QSAR），在蛋白质定向进化领域发展出了蛋白质序列-活性关系（protein sequence-activity relationship，ProSAR）算法。ProSAR适合用来同时改善酶的多种生化特性，已成功应用于几种酶的定向进化。相对于巨大的蛋白质序列空间，结合了高通量筛选的传统定向进化仍然是局部采样，是对蛋白质适应度景观（fitness landscape）的局部探索，因此Frances H. Arnold团队提出了ML辅助的定向进化（machine learning-assisted directed evolution，MLDE）概念，并介绍了MLDE的工作流程和应用案例。在传统定向进化中性质未提升的序列被舍弃，而MLDE可以利用这些数据学习序列-功能关系，加速蛋白质进化过程，有更大概率达到全局最优。除了对天然蛋白质进行改造之外，蛋白质的从头设计也发展迅速，其目标是创造自然界不存在但具有特定功能的蛋白质。比如，David Baker团队成功从头设计了能够催化Retro-Aldol反应、Kemp消除反应和Diels-Alder [4+2]环加成反应的酶。由于各大产业通常需要热稳定性好、有机溶剂耐受强等结构稳定的催化酶，因此在蛋白稳定性改造方面已经形成了一系列的理论和设计方法。其中包括基于进化分析、结构分析和折叠自由能（ΔΔG）计算的蛋白质稳定性设计，也开发出了综合多种稳定性计算策略的一站式蛋白设计工具PROSS2（protein repair one stop shop）、FRESCO和FireProt等。总之，近半个世纪以来，蛋白质工程的发展历程已在其他多个综述中有详尽的阐述，在此我们仅作上述简要概述，而正是蛋白质工程的飞速发展，为医药产业的升级迭代奠定了重要的技术支撑。2  蛋白质工程在化学原料药合成中的应用我国科技部长期以来将“绿色生物制造”作为国家重点研发计划的重要组成部分，已连续多年给予滚动支持。这种持续性的支持不仅体现了国家对绿色、可持续发展理念的重视，也反映了我国在生物制造领域的战略眼光和长远规划。在全球范围内，“绿色生物制造”也受到了广泛的关注和重视。随着环保意识的不断提高和可持续发展的需求日益迫切，越来越多的国家和地区开始将生物制造作为实现绿色转型的重要途径。例如，欧美一些国家已经制定了详细的生物经济发展蓝图，通过政府引导和市场驱动相结合的方式，推动生物制造技术的创新和应用。同时，许多公司也在积极布局生物制造领域，以积极态度拥抱“绿色生物制造”这一新兴的产业形态和技术模式，在化学原料药合成领域其应用尤为显著。化学合成通常存在多个反应位点，需要通过官能团的保护和脱保护来避免形成副产物，因而导致反应步骤变多，收率下降。一些化学合成反应需要采用极端温度、极端pH或高压等剧烈的反应条件，造成了大量的能源消耗。此外，大量有机溶剂的使用（通常占标准批量化学操作质量的50%~80%）不仅不够环保，增加成本，还存在操作安全的问题。自20世纪末绿色化学概念诞生以来，E因子（E-factor）和原子经济性（atom economy）概念的提出和应用使我们对一个反应总效率的评价更为真实，而不再是仅仅关注产率。药品生产质量管理规范（Good Manufacturing Practices，GMP）和国际人用药品注册技术协调会（International Council for Harmonisation of Technical Requirements for Pharmaceuticals for Human Use，ICH）指导原则中关于可持续性工艺开发的部分内容与绿色化学的12项原则一致。由于生物催化很好地契合了“绿色化学12项原则”，因此在这几十年间迅速发展并越来越多地应用在化学原料药的合成中，极大地减少了化学品和能源消耗。在小分子药物的新药研发中，美国食品药品监督管理局（Food and Drug Administration，FDA）和中国国家药品监督管理局（National Medical Products Administration，NMPA）以及大部分国家的卫生机构都要求提供手性候选药物两种对映体的毒性和其他生物学数据，且只允许活性形式上市。制药公司通常需要获得这两种立体异构体，因此不对称催化合成一直是医药化工领域的研究热点，也是生物催化领域的重要研究方向。通过酶改造获得立体选择性好的酶在不对称催化合成领域具有十分明显的优势。而对于已上市小分子药物的生产工艺优化，需要催化活性高、区域和立体选择性好、稳定性佳的生物催化剂来匹配生产流程，降低生产成本。一般来说，如果通过筛选发现已有的酶对目标反应的底物仅有弱催化活性甚至无催化活性，则需要从环境样品中挖掘新酶或从现有的酶库中筛选出最合适的起始酶，其次通过改造实现特定区域和立体选择性的催化，提高催化活性；之后需要考虑活性、选择性和稳定性等多种性质的同步提升，并将工艺反映在生物催化剂筛选条件中，根据实际需要进行多轮迭代。本节选取部分在化学原料药产业中实现绿色制造的酶改造范例，从酶的发现、酶改造过程以及由此带来的经济效益等多个方面进行剖析。2.1  转氨酶合成手性胺胰高血糖素样肽-1（glucagon-like peptide-1，GLP-1）是一种肠促胰岛激素，能抑制胰高血糖素分泌、减少食欲和减缓胃排空。然而活性形式的GLP-1半衰期仅数分钟，这是由于丝氨酸蛋白酶二肽基肽酶Ⅳ（dipeptidyl peptidase Ⅳ，DPP-4）会将其迅速降解成非活性形式。西格列汀（sitagliptin）是第一个上市的口服DPP-4抑制剂，可单独使用或与其他药物联合使用治疗Ⅱ型糖尿病，已上市的药物有JANUVIA®、JANUMET®和JANUMET® XR等。基于绿色化学和原子经济性的原则，西格列汀的化学合成工艺经过了多次优化改良，从用手性辅基控制引入手性中心到通过不对称的催化氢化引入手性。其中，采用以铑盐为手性催化剂的第二代化学合成路线生产西格列汀减少了合成步骤，提高了对映体过剩率（enantiomeric excess，ee），减少了80%以上的废弃物，并完全消除了工业废水（图1）。Merck公司的西格列汀化学工艺团队因此荣获美国环境保护署（United States Environmental Protection Agency，EPA）颁发的“总统绿色化学挑战：2006年更绿色合成途径奖”。然而，该工艺仍然存在一定的缺陷，反应需要高压设备，而且铑作为一种极为罕见的金属，稀缺不可再生，价格波动大。因此，Merck公司和Codexis公司借助于CodeEvolver®平台合作开发了通过转氨酶引入手性氨基的生物催化路线。图1  西格列汀的生产工艺优化及ATA-117的定向进化转氨酶（transaminases，EC 2.6.1）催化氨基从胺供体到酮受体的可逆转移，产生手性胺或氨基酸。转氨酶都需要相同的辅酶，5'-磷酸吡哆醛（pyridoxal 5′-phosphate，PLP），所有的转氨酶都催化同一类型的反应，但具有不同的底物特异性，大部分转氨酶仅能催化酮羰基的邻位取代基比甲基更小的底物。研究团队测试了各种商业化的转氨酶，没有酶对西格列汀酮（prositagliptin ketone）表现出可检测的转氨活性。Arthrobacter sp.来源的转氨酶ATA-117对甲基酮和小环酮具有R构型选择性的转氨活性，适合作为酶工程的起始酶。同源模建和分子对接分析发现，ATA-117的活性腔不具备结合底物西格列汀酮的能力，因此研究团队首先使用底物游走（substrate walking）策略对ATA-117进行改造，先以截短的西格列汀酮为底物（图1中结构式蓝色部分）进行生物催化，将大活性口袋中与其有相互作用的氨基酸残基饱和突变建库，使转氨酶的活性向所需目标底物方向进化；之后再设计三氟苯基侧（图1中结构式红色部分）的突变文库打开小的活性口袋。将上述获得的所有有益突变组合，最终首次获得对西格列汀酮有催化活性的转氨酶ATA-117Rd1b。第二轮基本完成了对活性腔形状的改造，获得的ATA-117Rd2的活性相比于ATA-117Rd1b提高了75倍。基于ProSAR、随机突变和理性设计等策略的3~11轮改造侧重于提高酶活性和过程稳定性以满足生产工艺要求。具体实施方式为在越来越有挑战性的反应条件下进行筛选：增加底物负载，增加i-PrNH2浓度，增加有机溶剂浓度，提高pH和温度等。最终获得的含27个突变的ATA-117Rd11在底物转化率、有机溶剂的耐受程度、耐受氨基供体的浓度、高温下的稳定性和产物的对映体纯度等多个维度均实现了性能提升。相比于铑催化的工艺路线，生物催化工艺避免了高压加氢操作和金属催化剂回收，总收率增加了10%~13%，增产53% [以kg/(L·d)计]，降低了生产成本，还减少了19%的废料产生。Merck公司和Codexis公司因此获得EPA颁发的“总统绿色化学挑战：2010年更绿色反应条件奖”。2009年，Merck已将新工艺扩大到中试规模，2012年，Codexis和Merck签订了该酶的供应协议，又于2015年签署了一项多年延长协议。2021年9月，两家公司再次修订并延长了用于西格列汀生产酶的供应协议。用于治疗急性偏头痛的口服降钙素基因相关肽（calcitonin gene-related peptide，CGRP）受体拮抗剂rimegepant的制备过程涉及类似的立体选择性转氨反应，其化学合成也涉及过渡金属催化的两步高压还原氨化反应。2022年，凯莱英生物合成技术研发中心使用底物游走、定向进化和迭代饱和突变等策略，得到了活性提高近50 000倍的转氨酶突变体M20，其在优化的工艺条件下对底物的转化率达99%。上述两个转氨酶的改造过程对转氨酶在手性胺合成中的应用具有重要价值，Brendan F. Gilmore等对转氨酶的机制、转氨酶的改造、工艺优化（包括去除丙酮酸以减少产物抑制）以及与其他酶的级联反应进行了综述，本文在此不再详细展开。2.2  酰基转移酶利用硫酯合成酰基酯衍生物洛伐他汀（lovastatin）是20世纪70年代从丝状真菌中分离得到的天然产物，其作为羟甲戊二酰辅酶A（hydroxymethylglutaryl-CoA，HMG-CoA）还原酶抑制剂，在1987年被美国FDA批准成为首个上市的他汀降脂药物。在其基础上改造的非天然产物辛伐他汀（simvastatin，商品名为Zocor®）是Merck公司销售的一种降胆固醇药物，其疗效和安全性优于洛伐他汀。常用的辛伐他汀化学合成路线为：将洛伐他汀水解得到莫那可林J（monacolin J），之后经过内酯化、羟基的保护、二甲基丁基侧链酰化、脱保护多步反应得到辛伐他汀。化学合成路线反应步骤多且能耗高，因此辛伐他汀的价格曾经几乎是洛伐他汀的5倍。酰基转移酶（acyltransferase，EC 2.3.1.X）催化酰基从供体分子转移到受体分子的羟基、氨基或巯基上，从而产生酰基酯衍生物。2006年，唐奕课题组发现洛伐他汀生物合成基因簇编码的LovD对酰基载体、酰基底物和十氢萘酰基受体有一定的杂泛性。以DMB-S-NAC和DMB-S-MMP等多种硫酯作为酰基供体，用全细胞催化对莫那可林J的C-8位羟基实现了区域选择性的酰基化（图2）。这意味着从洛伐他汀到辛伐他汀的合成过程被极大简化。2009年，该课题组通过有限的突变将LovD催化辛伐他汀合成这一非天然反应的kcat提高了5倍。Codexis研究团队获得了工艺许可之后进一步对酶和工艺进行了优化，基于ProSAR对LovD进行了9轮定向进化，建库216个，筛选突变体61 779个，最终获得了含有29个突变的LovD9。LovD9催化辛伐他汀合成的kcat/Km是野生型LovD的330倍，产生辛伐他汀的效率是LovD的1000倍。一些企业使用该酶和工艺实现了辛伐他汀的大规模生产。Codexis公司和唐奕教授因此获得EPA颁发的“总统绿色化学挑战：2012年更绿色合成途径奖”。LovD9对天然底物α-甲基丁基-酰基载体蛋白（acyl carrier protein，ACP）的活性完全丧失。LovD被改造为了一个能够接受小的游离酰基硫酯，而不再需要ACP的酶。分析突变体晶体结构发现，在进化过程中底物通道逐渐变窄使得LovF的ACP结构域无法进入活性位点。通过较长时间尺度（1~1.5 μs）的分子动力学模拟发现，突变显著改变了催化残基的构象动力学。此外该研究团队还从理性设计的角度对LovD9定向进化的路径进行了阐释，为这类酶的改造提供了宝贵经验。图2  LovD9利用非天然酰基供体DMB-S-MMP催化monacolin J的酰化合成辛伐他汀2.3  酮还原酶合成手性醇酮还原酶（ketoreductase，KRED）可以催化链状酮、环酮、脂肪酮和芳香酮等的不对称还原，引入1~2个手性中心，因此在医药工业的手性醇合成中应用广泛。辉瑞的Lipitor®是世界上第一个年销售额超过100亿美元的药物，其活性成分为阿托伐他汀（atorvastatin）。据估计，阿托伐他汀的中间体羟基腈（hydroxynitrile，HN）的年需求量接近20万千克。传统的商业化HN工艺需要动力学拆分（最大收率50%）并且涉及溴化学或不对称氢化的手性池前体合成。由于副产物多，需要高真空分馏来纯化最终产品，导致产量更低。使用腈酶、脂肪酶等的化学酶法合成并未商业化，这类工艺需要用的酶量较多使得产物难以分离，也增加了成本。因此，Codexis开发了二步三酶法制备HN（图3），第一步使用KRED（EC 1.1.1.184）将羰基立体选择性地还原为羟基，并组合NADP依赖的葡萄糖脱氢酶（glucose dehydrogenase，GDH，EC 1.1.1.47）用于辅因子再生；第二步使用卤代醇脱卤酶（halohydrin dehalogenase，HHDH，EC 3.8.1.5）将氯取代为氰基。由于这三个酶均不能满足大规模制备HN的需求，因此研究团队使用DNA shuffling构建突变库，在接近生产工艺的条件下进行高通量筛选，催化性质提高的突变体被用于下一轮进化，最终提高了所用KRED和GDH的活性和稳定性，同时保持了天然KRED近乎完美的对映选择性，提高了HHDH的活性并在很大程度上解除了底物抑制。新的生产工艺满足绿色化学的12项原则。不包含工艺用水时，整个工艺的E因子（每千克产物对应废弃物的质量）为5.8，如果包含工艺用水，E因子为18。在生物催化剂的基础上，这三种酶将还原反应的体积生产率（volumetric productivity，VP）提高了约100倍，将氰化反应的VP提高了约4000倍。这极大地改善了Lipitor®的关键中间体的生产，Codexis公司因此获得EPA颁发的“总统绿色化学挑战：2006年更绿色反应条件奖”。图3  二步三酶法制备阿托伐他汀的中间体羟基腈工程化KRED在医药工业中的应用实例还有很多，关于KRED的挖掘、通过改造提升其催化活性和热稳定性、各种辅因子再生方法的优劣以及还原时遵从Prelog规则或反Prelog规则的改造已有文献综述，在此不做赘述。2.4  酰胺酶水解酰胺生成羧酸酰胺酶（amidase，EC 3.5.1.X）对酰胺化合物（包括脂肪酰胺、杂环酰胺和芳香酰胺等）的C—N键具有水解和酰基转移的活性，是合成手性羧酸、α-氨基酸和酰胺的多功能生物催化剂。酰胺酶因其高活性和优异的对映体选择性而被广泛开发和研究，在制药和农药工业具有广泛应用。研究发现，不同物种来源酰胺酶的底物谱差异较大，根据底物偏好性，可以将酰胺酶分为几个亚家族：青霉素酰胺酶（3.5.1.11）、烟酰胺酶（3.5.1.19）、甲酰胺酶（3.5.1.49）等。2-氯烟酸是一种重要的医药和农药中间体，应用范围广，市场需求大。在医药行业，2-氯烟酸作为中间体可用于生产人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）逆转录酶抑制剂奈韦拉平（nevirapine）、非甾体抗炎药尼氟灭酸（niflumic acid）和抗抑郁药物米氮平（mirtazapine）；在农药行业，2-氯烟酸可作为生产除草剂烟嘧磺隆（nicosulfuron）和吡氟草胺（diflufenican）的中间体。其中一种具有吸引力的2-氯烟酸生产方式是用酰胺酶催化2-氯烟酰胺（图4），但是过去已有的酰胺酶对该反应的催化活性均较低。郑裕国院士团队致力于筛选和改造催化该反应的酰胺酶。2018年，团队从Pantoea sp.中筛选出新的酰胺酶Pa-Ami，对烟酰胺及其氯代衍生物具有较好的活性，其催化2-氯烟酰胺产生2-氯烟酸的酶活为16.4 U/mg，比之前从Delftia tsuruhatensis ZJB-05174、Brevibacterium epidermidis ZJB-07021和Rhodococcus erythropolis中鉴定的酰胺酶的活性更好，且对底物的耐受程度更高。通过适当降低反应温度使产物析出解除产物抑制，Pa-Ami对底物的转化率可达94.2%，产生370 mmol/L的2-氯烟酸，但其活性仍然偏低。图4  酰胺酶Pa-Ami催化2-氯烟酰胺生成2-氯烟酸Pa-Ami具有保守的催化三联体Ser177-Ser153-Lys80，通过分子对接分析发现，吡啶环上2位氯取代基改变了亲核进攻残基Ser177与底物之间的距离，也影响了Ser153对底物的质子化，而氯的电子效应又增加了反应的活化能。这种由于邻位氯取代引起的强空间位阻和电子效应导致Pa-Ami催化2-氯烟酰胺的kcat/Km只有催化烟酰胺kcat/Km的0.79%。为了解决这一问题，该团队基于结构分析，选定底物周围的三个非严格保守氨基酸Thr172、Thr174和Gly175，以及涉及底物进入通道的Ala305、Ser309、Leu398和Asn400进行突变。实验结果表明，单突变体Pa-AmiG175A和双突变体Pa-AmiG175A/A305T催化2-氯烟酰胺的kcat/Km相比野生型分别提高了3.1倍和10倍。以Pa-AmiG175A+A305T作为催化剂，可产生1220 mmol/L的2-氯烟酸，时空收率（space-time yield）达到575 g/(L·d)。分子对接和通道分析发现，突变G175A拉近了Ser177与底物之间的距离，亲核进攻的方向更合适，而A305T突变重塑了通道使得底物的进入和产物的释放更加容易。酶的门控指的是一个动态系统，其可以在酶的开放和封闭构象之间可逆切换，从而控制底物、产物、离子和溶剂分子进出蛋白质，因此对门控残基的改造也是一种有效的理性设计策略。2023年，研究团队基于经典分子动力学模拟和通道分析选定候选改造残基，继续对底物进入和产物释放通道进行重点改造，实验筛选获得的四突变体Pa-AmiG175A+A378V+V402L+L403V对2-氯烟酰胺的催化活性为127.4 U/mg，在2 h内积累了1330 mmol/L产物，时空收率达到2515 g/(L·d)。通道分析发现，V402L和L403V将扭曲的通道变得更加平滑。拉伸分子动力学模拟（steered molecular dynamics，SMD）和量子力学计算结果显示，相比野生型，在四突变体中底物进入和产物释放的活化能均明显降低，因此具有更高的催化效率。这项持续了约十年的系统性工作为2-氯烟酸的工业化生产奠定了基础，也为其他酰胺酶的理性设计和工程化改造提供了很好的示范。2.5  其他口服抗病毒药物波塞普韦（boceprevir）被批准上市用于慢性丙型肝炎的治疗。其中间体双环[3.1.0]脯氨酸（P2部分）的合成涉及去对称化，传统的拆分方法收率很低。Codexis和Schering-Plough（现属于Merck）研究团队对黑曲霉来源的单胺氧化酶（monoamine oxidase，EC 1.4.3.4）MAON进行了四轮进化，获得的突变体MAON401活性提高了8倍，稳定性也明显增加。相比于拆分方法，酶法合成工艺的产品收率提高了150%，原材料使用量减少了59.8%，用水量减少了60.7%，总工艺浪费减少了63.1%，该工艺已成功用于波塞普韦的商业生产。亚胺还原酶（imine reductase，IRED）是一类NAD(P)H依赖的氧化还原酶，可催化前手性亚胺的不对称还原合成手性胺。IRED具有催化效率高、区域及立体选择性强等优异的特性。孙周通团队和瞿旭东团队已对亚胺还原酶的机制、多酶级联反应、化学酶法合成及其工业应用作了详尽综述。魏东芝团队对甾体化合物的绿色生物制造进行了详尽的综述，其中包括甾体羟化酶和甾体脱氢酶的挖掘及改造等。随着越来越多的生物催化剂被整合进化学转化过程，多酶级联反应得到了较多的关注和研究。基于逆合成分析和多酶工具箱，以及体外辅酶循环和ATP再生系统，构建协同高效的多酶催化体系可以避免中间产物的纯化，实现复杂的药物的合成。比如，Merck基于多酶级联优化了抗病毒药物LAGEVRIOTM（molnupiravir）的生产工艺，开发的第二代合成路线直接使用尿嘧啶和核糖作为构建块，提高了合成效率，减少了废物的产生并将总产量提高了1.6倍。综上，在E因子和原子经济性概念以及绿色化学12项原则的指导下，生物催化的价值已被制药公司广泛认可，工程化酶在化学原料药及高附加值产品合成中取得的各项成果振奋人心。在酶改造的同时关注工艺优化，可以获得与生产工艺相匹配的优良生物催化剂，增加化学原料及其中间体的产量，减少废弃物，减少有机溶剂使用，降低了药物生产成本，既减轻了患者的用药负担，又提高了制药企业的经济效益（表1）。除了前文提到的CodeEvolver®平台之外，近年来国内企业建立的BioEngine®和ZymeEditorTM等蛋白质改造平台在行业内占有举足轻重的地位。这些平台将高通量筛选、理性设计与人工智能有机结合，实现了高效和系统的蛋白质工程，为小分子药物绿色生物制造的快速发展提供了保障。表1  蛋白质工程在化学原料药合成中的应用3  蛋白质工程在生物药产业中的应用近年来，生物药（biopharmaceuticals）如重组蛋白和多肽、抗体、生物偶联物、疫苗、治疗性酶和核酸药物等，因较高的临床及商业价值得到蓬勃发展，这标志着一直以来由小分子主导的药物研发进入了一个新时代。出于改善药物分子药代动力学或其他因素的考虑，生物药的制备过程可能涉及非天然氨基酸的引入、特定位点的侧链修饰或生物偶联，通过酶工程提高多肽和蛋白修饰酶催化的区域和立体选择性，可以加速候选药物分子的制备。在生化检测领域，蛋白质工程可以提高诊断酶/抗体的反应特异性和检测准确性，增加其稳定性，加快诊断速度。对于治疗性酶和治疗性抗体，除了要考虑候选药物的催化或结合以及激动或阻断活性外，还需要考虑免疫原性、给药方式和药代动力学性质等因素，以提高药物的可开发性、安全性和有效性。在药物开发阶段，为了减少生物药的免疫原性，需要对重组多肽、重组蛋白和抗体等进行人源化改造，并基于计算和实验遮蔽或消除T细胞和B细胞表位，尽可能增加人源化程度，避免产生抗药抗体（anti-drug antibody，ADA）。目前生物药大多采用注射的给药方式，开发多肽和蛋白药物的口服制剂可以极大提高患者的依从性。然而，多肽和蛋白药物一般无法耐受极端pH且极易被胃肠道蛋白酶（胃蛋白酶、胰蛋白酶和糜蛋白酶）消化降解，生物利用度极低。因此，口服多肽和蛋白药物的开发一直是业内的关注重点：开发口服给药的生物制剂不仅要选择适合胃肠道的递送方式（肠溶胶囊、纳米粒等），还需要对分子进行稳定性改造，消除蛋白酶切割位点，提高生物分子对极端pH和蛋白酶的耐受能力。因此，本节从修饰酶、诊断酶、治疗性酶和治疗性抗体四个方面阐述蛋白质工程在生物医药产业中的应用。3.1  修饰酶出于改善药物分子药代动力学或其他原因的考虑，蛋白和多肽等生物大分子通常需要进行修饰或生物偶联，且这种修饰是位点特异性修饰，即在维持蛋白和多肽结构的基础上，温和且高度选择性地修饰多个重复官能团中的一个，这是有机化学中的一项重要挑战。采用化学修饰法需要依赖这些重复氨基酸残基的pKa、亲核性和氧化还原电位的细微差异，且选择性差，导致分离纯化较为困难。而采用基因工程法插入非天然氨基酸或者将识别基序预嵌入蛋白中，可能会导致生物分子结构改变，进而影响蛋白功能。因此，需要发展一种稳健的位点特异性的蛋白修饰策略，能够进行大规模的批量反应，以满足候选药物的制备需求。Merck和Codexis于2022年报道了一项开创性的工作，通过定向进化获得了一系列青霉素G酰化酶（penicillin G acylase，PGA）突变体，实现了胰岛素特定位置的修饰，可以方便地获得各种胰岛素类似物候选药物（图5）。大肠杆菌来源的PGA催化肽链上N-苯乙酰水解的活性较低，不能满足特定位点保护和解除保护的需求。团队通过筛选发现来源于Kluyvera cryocrescens的KcPGA对A1，B1，B29-苯乙酰基胰岛素的A1、B1、B29位苯乙酰基均有水解能力，当反应时间足够长时，3个苯乙酰基均会被水解。此外，KcPGA对3个位置表现出水解速率差异，B29>A1>B1，这说明通过酶改造实现胰岛素的位置特异性修饰具有可行性。之后通过定向进化获得的一套工具酶实现了胰岛素特定位置的选择性保护和脱保护，得到了A1、B1和B29三个位置分别具有苯乙酰基保护或未保护的共8种中间体。这个苯乙酰基胰岛素工具箱可以作为基础模块合成由胰岛素衍生的候选药物分子，缩短了合成路线，提高了产物的产量和纯度，加速了药物研发进程。此外，作者还证明了工程化的PGA可以耐受其他的酰基供体，也可以拓展至胰高血糖素等其他多肽的生物选择性偶联。图5  青霉素G酰化酶的定向进化实现胰岛素特定位置的生物偶联此外还有许多修饰酶在生物医药产业中具有广泛应用。比如，赖氨酰内切酶（lysyl endopeptidase，Lys-C，EC 3.4.21.50）能够特异性酶切赖氨酰肽键，可用于重组胰岛素类似物及GLP-1受体激动剂的制备和生产；蛋白质、多肽和抗体药物的测序、质谱分析和质量检测等。基于酶发现和工程化获得高活性和区域选择性的工具酶对生物药产业具有重要的意义和价值。3.2  诊断酶诊断酶也是生物医药产业中一个强劲的发展领域，诊断酶的开发能够极大地增加检测的便利性，加快检测速度。糖化血红蛋白（glycated hemoglobin，GHb）是指红细胞中的血红蛋白与血清中的糖类相结合的产物。根据结合位置及糖的不同分为多种类型，其中糖化血红蛋白A1c（hemoglobin A1c，HbA1c）是由葡萄糖与血红蛋白的β链氨基末端缬氨酸残基缩合而成，其含量最多且浓度相对稳定，因此临床上常以HbA1c代表总的糖化血红蛋白的水平。HbA1c可以稳定地反映过去2~3个月的平均血糖水平，其与糖尿病的慢性并发症相关，也是糖尿病控制的目标之一。HbA1c的检测方法有很多，酶法测定HbA1c不需要色谱或质谱设备，其基本原理为：将HbA1c裂解为果糖酰缬氨酰组氨酸（fructosyl valyl histidine，Fru-ValHis），Fru-ValHis经果糖基肽氧化酶（fructosyl peptide oxidase，FPOX，EC 1.5.3）催化氧化生成非糖化氨基酸、葡糖酮醛和H2O2，再利用过氧化物酶进行显色。然而除Fru-ValHis以外，FPOX还能催化果糖酰赖氨酸（fructosyl lysine，Fru-Lys）产生H2O2，对结果产生干扰，导致诊断不够准确。Hamid Shahbazmohammadi等结合分子动力学模拟和突变实验对FPOX进行改造，获得的Y261W突变体对Fru-ValHis的催化活性提高了5.1倍，对Fru-Lys的催化活性降低了13.7倍，提高了FPOX对底物Fru-ValHis的特异性，从而减少了干扰。目前该酶已经商业化用于酶法糖化血红蛋白试剂的研发和大量配制。3.3  治疗性酶酶在人体的生命活动过程中扮演着十分重要的角色，某种酶的缺乏或其活性的降低会导致身体出现不适症状甚至疾病，治疗性酶（therapeutic enzymes）是指用来治疗这些不适症状或疾病的生物催化剂。治疗酶在代谢、消化、抗菌、抗癌、抗凝、抗炎、前药激活等方面具有广泛的应用。通常来讲，一种酶需要满足以下条件才能够达到有效的治疗效果：①在生理条件下具有较高的活性；②尽可能小的免疫原性；③呈现合适的药代动力学和生物利用度；④能够被递送到治疗位置；⑤对本身的细胞功能没有干扰或很少干扰。然而，自然界中的酶很少能满足上述所有标准，因此治疗酶的改造在生物制药工业中具有十分重要的地位。通过酶工程技术（定向进化、理性设计、聚乙二醇化和糖工程等）增加酶的特异性、提高其催化活性、增加对胃肠道蛋白酶的耐受、延长半衰期、减少免疫原性，达到提高临床用药的长期安全性和有效性的目的，这将为治疗酶的蓬勃发展带来更多机会。目前已经有一些工程化的治疗酶被批准上市，还有一些治疗酶的改造研究正在开展。3.3.1  纤维蛋白溶解酶血块形成或血管内血栓是全球心血管疾病和中风相关死亡的首要原因。目前基于酶的纤维蛋白溶解药物（fibrinolytic enzymes）主要包括链激酶（streptokinase，SK）、组织纤溶酶原激活剂（tissue plasminogen activator，tPA）、尿激酶（urokinase，UK）和纳豆激酶（nattokinase）。其中，tPA是一种丝氨酸蛋白酶，通过裂解Arg-561和Val-562之间的肽键将纤溶酶原转化为活性的纤溶酶并分解血凝块从而发挥溶栓作用。因此，tPA被Genentech开发为Alteplase（Activase®）用于治疗急性缺血性中风。1987年，Activase®作为第一个重组治疗酶被FDA批准上市，但其血浆清除快，半衰期短，需要长时间静脉输液。为了解决这一问题，Genentech通过酶改造在Lys-His-Arg-Arg（296~299）之后引入4个Ala，并引入了突变T103N和N117Q，获得了Activase®的变体Tenecteplase（TNKase®）。这些改造降低了内源抑制剂介导的酶失活，增加了酶的特异性和半衰期，提高了临床有效性，TNKase®于2000年被FDA批准上市。3.3.2  尿酸氧化酶尿酸氧化酶（urate oxidase/uricase，EC 1.7.3.3）能够将尿酸转化为可溶和容易排泄的尿囊素，降低血清和尿液中的尿酸水平。然而，在人类进化过程中，尿酸氧化酶发生遗传突变并失活，不能将尿酸氧化为尿囊素。体内过量的尿酸积累会导致高尿酸血症和痛风，临床上常使用非布司他、别嘌呤醇、苯溴马隆和重组尿酸氧化酶等药物进行治疗。第一代尿酸氧化酶药物为uricozyme，是直接从黄曲霉中提取纯化得到；第二代尿酸氧化酶药物为Sanofi的重组尿酸氧化酶（黄曲霉来源）拉布立海（rasburicase）；第三代尿酸氧化酶药物为Crealta的聚乙二醇（PEG）化重组尿酸氧化酶培戈洛酶（pegloticase），是来自猪和狒狒尿酸氧化酶的嵌合序列。这三代药物为微生物来源序列或经过PEG修饰，虽然疗效较好，但多次注射给药后患者体内会产生抗尿酸氧化酶抗体或抗PEG抗体，降低了疗效并导致患者出现过敏反应。因此获得更接近人源尿酸氧化酶基因的高活性和高稳定性序列是很有必要的。有报道以人源尿酸酶基因和野猪的尿酸酶基因为模板，使用DNA shuffling获得了嵌合尿酸酶，提高了酶活性，并增加了与人源尿酸酶基因的同源性。为了解决这类药物免疫原性高的问题，还需要在酶的人源化方面做出更多努力。为了提高患者的依从性，也有一些口服尿酸氧化酶进入临床阶段，通过促进肠道中尿酸盐的分解和分泌，用于治疗痛风和晚期慢性肾病患者的高尿酸血症。3.4  治疗性抗体截至2021年，FDA批准上市的抗体药物已达100种，这些药物在肿瘤免疫疗法和自身免疫疾病等领域表现出突出的疗效。常见的抗体药物包括经典免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）抗体、抗体片段、双/多特异性抗体、纳米抗体（nanobody，Nb）和抗体偶联药物（antibody drug conjugate，ADC）。抗体工程指的是通过对抗体分子结构和功能关系的研究，有计划地对抗体的基因序列进行改造，改善抗体某些功能的技术，一般包括：抗体亲和力成熟（增加抗体的互补决定区与抗原表位的相互作用）、抗体可结晶片段（fragment crystallizable， Fc）工程化改造以改变抗体的效应功能或延长半衰期、设计重链-重链和重链-轻链配对防止错配、抗体人源化改造降低免疫原性等。对于诊断抗体的抗体工程，一般只需要关注与抗原的结合活性以及溶解度和稳定性等理化性质。抗体工程常用的方法包括定向进化和理性设计，以抗体亲和力成熟为例，定向进化主要是将抗体的互补决定区进行随机突变，随后表达突变体库，筛选高亲和力的突变体并重复数轮进化筛选；而理性设计主要是基于结构分析，有针对性地设计抗原抗体之间的相互作用，最终获得亲和力明显提升的抗体。纳米抗体又称单域抗体（single-domain antibody），是在骆驼科动物体内发现的仅重链抗体的重链可变区（VHH），因其具有较高的物理化学稳定性，容易在微生物宿主中进行表达，可被开发成口服制剂和诊断试剂等特点，近年来受到较多关注。仔猪口服高剂量的K609（一种抗大肠杆菌F4菌毛的重组VHH），可减少大肠杆菌引起的仔猪腹泻，而低剂量无效。原因是很大一部分K609在胃中被蛋白水解酶降解。Harmsen等使用抗原免疫大羊驼（llama）并构建噬菌体文库，通过对文库中克隆的蛋白酶稳定性进行半定量，挑选出比K609的稳定性提高了7~138倍的7个克隆。之后通过DNA shuffling获得了稳定性进一步提高1.5~3倍的4个克隆。其中最稳定的突变体K922在胃液和空肠液中37 ℃孵育1 h后仍保持41%和90%的活性，有望作为预防仔猪腹泻的候选药物。该研究对其他口服重组抗体片段的改造具有指导意义。各种生物技术和自动化平台的发展使抗体工程的湿实验效率得到了提升。与此同时，抗体数据库也在不断完善和发展，计算机辅助设计和机器学习已初步应用于抗体结构预测、提高抗体亲和力、抗体表位预测和结合特定表位抗体的设计、抗体的人源化、可开发性评估和成药性评价。目前，针对单个模块的抗体工程已经相对成熟，有较好的干湿实验结合基础，但多特异性抗体的改造和设计以及多价纳米抗体的组装仍需要开展大量的实验评估。最近，Peter S. Kim团队使用蕴含结构信息的蛋白语言模型进行抗体设计，实现了抗体病毒中和活性、亲和力以及热力学稳定性的提高。David Baker团队基于重新训练的扩散模型RFDiffusion和逆向折叠模型ProteinMPNN首次实现了纳米抗体的从头设计，这些基于深度学习的技术突破将在未来极大简化抗体药物的早期分子发现流程，有望节省抗原免疫动物以及抗体工程化改造的时间和费用。综上，蛋白质工程不仅能够提升用于结构修饰的工具酶的催化特性，提高诊断酶/抗体的特异性以及生物化学检测的准确性，还可以在一定程度上解决治疗酶和治疗抗体等蛋白药物的多目标优化问题，在生物药产业中发挥着十分重要的作用（表2）。蛋白质工程加快了生物制药的创新，为业界开发出更多生物大分子药物提供了技术保障。表2  蛋白质工程在生物制药产业中的应用挑战和展望随着核酸合成、测序技术和生物信息学的发展，转录组和基因组的获得以及基因的功能验证变得十分方便，这极大提升了从自然界挖掘新功能蛋白的效率。为了满足工业化生产的需求或实现疾病治疗的目的，野生型蛋白质往往需要工程化改造。因此，本文简要回顾了蛋白质工程的发展历程和技术革新，特别聚焦于化学原料药合成和生物制药两大板块，从产业化的视角出发，展示了蛋白质工程在医药产业中的应用，阐述了蛋白质工程如何赋能医药原料及中间体的绿色制造，以及怎样助力生物制药的加速创新。生物催化剂赋能的化学原料药及其中间体的合成工艺更符合绿色化学原则，具有环境友好和生产成本节约性，经济效益显著。在酶工程化改造中，通常需要实现多维度的提升，包括非天然底物的适配性、区域和立体选择性、催化活性和稳定性（耐热和有机溶剂）等。这通常需要在多轮改造中舍弃不利突变、保留优良突变，不断迭代最终获得优良的生物催化剂。值得注意的是，生物催化剂的进化和工艺发展是相辅相成的，在筛选、优化生物催化剂时，必须考虑其与生产工艺的适配性。将生物催化技术整合到已上市化学小分子药物的生产工艺中也面临诸多挑战，比如成本效益（由于化学原料药价格通常较低，改进后的工艺需要有绝对的成本优势才能在产业中得到应用）和药物市场变化（因为酶改造的时间跨度有时较长、难度大，得到理想的催化剂时，有些药物可能已经不是一线药物，市场规模变小，前期的投入难以得到回报）。这就需要不断地革新技术以缩短发现-设计-测试的循环周期，并在药物发现早期就考虑更符合绿色化学理念的合成工艺。蛋白质工程同样也加速了生物大分子药物研发的创新，为生物制药领域开发出更多生物制品提供了技术保障。对于修饰酶和诊断酶的改造，本质仍然是生物催化过程，方法相对成熟。但对于治疗性酶和治疗性抗体等生物大分子药物，候选分子必须满足多个标准，包括针对生物靶点的活性、合适的生物物理和药代动力学性质以及安全性。蛋白质工程作为大分子药物早期研发中的关键一环，可以在一定程度上提高药物的安全性和有效性。虽然各种生物技术和自动化平台的发展使大分子药物研发中的各种湿实验效率得到了提升，但要解决这样的高度复杂的多目标优化问题，仍然需要开展大量的实验评估候选分子的功能活性、可开发性、免疫原性、药代动力学和药效学，不仅费时费力，药物研发费用也居高不下。因此在临床前研究中也需要更多的技术迭代来缩短药物研发周期，提高药物研发效率。科技创新推动了产业创新，而产业中的需求又反过来加速了科技创新，两者的深度融合形成新质生产力。不管是生物催化剂还是大分子药物的研发，通过技术革新缩短研发循环周期都是行业进步必不可少的。人工智能和实验室自动化可以在生物催化剂和药物研发的设计-制造-测试-分析周期中增强人类的决策、制备工艺和生物活性测试的能力。最近，以预测（结构、功能、性质），优化（性质）和生成（功能蛋白）为目标的深度学习在医药行业的发展和应用日新月异。结构预测工具如RoseTTAFold All-Atom（RFAA）、RFdiffusion All-Atom（RFdiffusionAA）以及AlphaFold3将结构预测能力又提升了一个新台阶，在复杂生物分子系统的建模和设计中得到广泛应用，为蛋白质-小分子、蛋白质-核酸以及抗体-抗原的相互作用分析提供了技术支撑。由于目前数据库中被注册为酶的大部分蛋白序列都缺少其催化反应的高质量注释，因此通过功能和性质预测掌握酶-底物关系的综合映射可以加速起始酶的发现，基于酶-小分子对（enzyme-small molecule pairs）负样例训练的ESP（https：//esp.cs.hhu.de/）对酶-底物对的预测准确率超过91%。基于深度学习的kcat预测工具TurNuP对于和训练集中的酶一致性小于40%的酶也有比较好的预测准确度。此外，基于深度学习的功能预测工具PhiGnet不仅可以准确预测蛋白质的功能，还可以精确定位对特定功能重要的残基，指导蛋白质的定向进化和辅助设计。对于蛋白的性质优化，自MLDE提出以来，定向进化的速度被大大加快，MLDE的工作流程也在不断改进，通过对每个步骤做出不同的设计，尤其是减少训练数据中的低适应度蛋白可以明显提高MLDE的效率，优化后的算法获得全局适应度最大值的概率是传统定向进化的81倍。有研究表明，在某种程度上，突变效应机制、适应度景观的拓扑结构及上位效应模式在不同蛋白之间具有普遍性，这说明使用多种蛋白的突变数据集训练一个有效的模型来加快定向进化是可行的。此外，赵惠民等提出了结合ML和自动化的连续MLDE流程框架，创造了一个闭环的蛋白质进化平台，极大地提升了研究人员改造蛋白的能力。实验室自动化可以提供高质量的数据采集以及快速可重复的实验迭代周期，进一步释放机器学习的全部潜力。Philip A. Romero等提出了一种用于蛋白质景观探索的自动机器平台SAMPLE，该平台可代理学习蛋白质序列-功能关系，设计新蛋白质并将设计发送给全自动机器人系统，之后通过湿实验测试设计的蛋白质并提供反馈以提高代理对系统的理解。该平台预计可在2个月内完成20轮包含设计-测试-学习循环的优化，成本预计5200美元。这种人机协作将把人类的直觉和创造力与智能自主系统执行实验、解释数据和有效搜索大型假设空间的能力结合起来，从而提高分子设计和发现的效率与精度。对于功能蛋白设计的机器学习，除了前文提及的重新设计以增强蛋白现有功能和重新设计使蛋白具有新的功能外，从头生成蛋白质在医药产业中的应用崭露头角。比如，扩散模型RFdiffusion可以根据所给的目标蛋白质和热点残基从头生成蛋白质结合物（binder），并解释和预测蛋白质之间的复杂相互作用，这一模型已经成功应用于药物靶点结合物的生成。深度学习语言模型ProGen可以基于标签（包括物种信息、蛋白质家族和催化功能等）生成蛋白质序列，经训练后生成的人工溶菌酶与天然溶菌酶具有相似的催化效果且具有更多样的序列。此外，这些模型还成功应用于从头设计纳米抗体，从头设计能够与生物活性螺旋肽高亲和力结合的结合蛋白，从头设计细胞因子类似物（与细胞因子竞争性结合靶点但不传导下游信号从而达到治疗疾病的目的），以及从头设计抗菌肽等。最近，谷歌DeepMind团队发布的AlphaProteo在高亲和力蛋白结合物设计方面有了新的进展，相比于之前的方法，其设计出的蛋白实验成功率更高，最佳结合亲和力也更优，是首个成功设计出VEGF-A靶点结合物的计算方法。对于上述多种模型生成的序列，经过实验验证的计算过滤工具COMPSS采用基于序列的ESM-1v打分和基于结构的ProteinMPNN打分的复合指标，可以有效地帮助研究人员选择突变体进行测试，提高实验成功率。以上这些技术将极大简化生物催化剂或药物分子的发现过程，不需要从自然界中挖掘新的酶或使用动物免疫来获得起始蛋白质，有望缩短研发时间并减少研发费用。目前的蛋白质从头设计主要关注亲和力，未来纳入可开发性和免疫原性的生成指引，更新生成框架，将提高药物设计的成功率。上述新的端到端流程（end-to-end pipelines）减少了设计蛋白质所需的时间和精力，降低了设计蛋白质的进入门槛，随着技术的不断改进和更多数据的积累，蛋白设计将更加精准和自动化。在未来的药物研发中，AI赋能的蛋白药物设计-可开发性优化-处方设计，再结合机器学习赋能的生物标志物的选择，临床试验设计和数据分析，药物研发的成功率有望得到明显提升，或许可以打破新药研发中的“倒摩尔定律”（Eroom’s law）。通讯作者及团队介绍巫瑞波，教授，博士生导师，担任中国化学会计算机化学专业委员会委员、中国生物信息学会（筹）计算合成生物学专委会委员。作为通讯作者在Nat Catal、Nat Comm、JACS、PNAS、Angew Chem、Sci Adv、New Phytol 和ACS Catal 等期刊发表论文50余篇，授权发明专利及软件著作权6项。主持科研基金11项，包括国家WR计划青年拔尖、国自然面上、广东省重点研发计划子课题和广东省杰出青年基金等。研究方向为基于多尺度模拟的萜类天然产物生物智造与药效挖掘。E-mail: wurb3@mail.sysu.edu.cn。中山大学药学院巫瑞波教授课题组聚焦于萜类化合物，主要借助QM/MM等多尺度模拟与大数据挖掘，开展天然产物生物智造与药效挖掘研究。课题组网站：http://www.qmclab.com/。曹春来，制药高级工程师，硕士生导师，珠海联邦制药股份有限公司生物研究所所长，联邦生物科技（珠海横琴）有限公司总经理，广东省糖尿病生物药物工程技术中心主任。从事重组蛋白药物开发特别是糖尿病生物药物的开发和研究18年。发表文献15篇，公开专利近50项，主持完成多个国家、省、市多个药物研发和产业化项目，获得广东省科学技术奖励二等奖一项，珠海市和中山市科学技术奖励一等奖共三项。--------- End ---------感兴趣的读者，可以添加小邦微信加入读者实名讨论微信群。添加时请主动注明姓名-企业-职位/岗位或姓名-学校-职务/研究方向。

摘要：缺血性中风（IS）在全球范围内导致严重的残疾和高死亡率。干细胞（SC）治疗展现出了与当前治疗方法不同的、对IS具有独特治疗潜力的特性。SC的细胞归巢、分化和旁分泌能力为神经保护带来了希望。近期对SC的改良研究增强了对IS的治疗效果，包括基因转染、纳米粒子修饰、生物材料修饰和预处理。这些方法提高了在缺血区域的生存率、归巢能力、神经分化和旁分泌能力。然而，在SC治疗可以临床应用之前，必须解决许多问题。这些问题包括生产质量和数量、运输和储存期间的稳定性，以及使用规定。在这里，我们回顾了IS的简要病理机制、SC治疗IS的“多机制”优势、各种SC改良方法和SC治疗挑战。我们旨在揭示使用SC治疗IS的潜力，克服挑战，并传达修改SC的创新思路。 干细胞微信群 扫描二维码，符合加群要求者， 即可加入干细胞治疗的微信群！ 1.引言 中风是全球第二大死亡原因，2019年约有655万人死亡。中风后30天内的死亡率可达24.6%，61.0%的中风患者在12个月内死亡或残疾，导致严重的社会经济负担。大约62.4%的中风患者经历了缺血性中风（IS），这通常发生在血管闭塞抑制了大脑的充足氧气和血液供应时。由于世界人口老龄化的延长，IS的发病率正在增加。高血压、高脂血症、高同型半胱氨酸血症、高血糖、吸烟和酗酒等风险因素都可能导致IS。 另一个严重问题是，IS越来越多地影响年轻成年人，约占总患者的10%。在IS之后，应尽快通过静脉注射组织型纤溶酶原激活剂或进行机械性血栓切除术以恢复受影响区域的血流。不幸的是，溶栓药物（尿激酶、链激酶和阿替普酶）在分布上特异性较弱，而机械性血栓切除术对患者的身体状况和医院设施有广泛的要求。此外，恢复脑血流可能导致大脑的二次再灌注损伤。这种反应将进一步加剧活性氧（ROS）的产生，破坏血脑屏障（BBB），并引起炎症，从而加重病情。 然而，大多数神经保护剂仅具有单一治疗效果，且对大脑的靶向能力有限。此外，BBB阻止了大多数药物进入缺血性脑实质。因此，迫切需要具有多靶点治疗效果和高靶向能力的新药物，以满足当前的临床需求。 干细胞（SCs）可以在特定条件下增殖、自我更新，并分化成各种功能细胞。目前有许多研究正在探索SCs治疗各种疾病（如IS、肺纤维化、肝衰竭和癌症）的潜力。在这些研究中，广泛开展了使用多种SC类型治疗IS的研究。SC的强烈归巢、细胞替代和分化以及旁分泌能力为IS引入了优越的治疗效果。迄今为止，SC治疗对IS的益处已在众多研究中得到证明，其显著的治疗价值引起了广泛关注。研究人员最近专注于改良SCs以提高治疗效果并减少毒性。这些改良通常增强了SC的能力，如归巢特性、神经再生和血管生成。SC治疗为IS治疗提供了新的机会。目前有65项正在进行或已停止的关于SC治疗IS的临床试验，但均未获批准用于临床（clinicaltrials.gov）。因此，研究人员必须取得非凡的突破以解决SC治疗的局限性。因此，本综述详细描述了IS的病理机制，承认了使用SC治疗IS的优势和挑战，并专注于改良SCs以获得更好的治疗效果。我们打算揭示SCs在治疗IS中的潜力和挑战，并传达设计各种SCs以有效治疗IS的创新思路。 2.IS概述 IS是由大脑中动脉突然阻塞引起的，引发了一系列风险，包括兴奋性毒性、炎症浸润、氧化应激和凋亡。由于药物和机械性血栓溶解的发展，IS治疗已大大改善。 2.1.病理机制 在IS后缺血区域会出现一系列级联反应。了解IS的病理过程有助于提高SC治疗的疗效。由于血管阻塞，大脑经历缺氧和血液供应不足，导致下游组织缺氧和葡萄糖缺乏。通常观察到两个区域：缺血核心区和缺血半影区。核心区域的血液供应不足以维持细胞生存，尽管有补偿性侧支循环。半影区的细胞可以短期存活，半影区的受损脑组织在迅速恢复血流后可以恢复。然而，半影区长期缺氧和葡萄糖缺乏将导致ATP供应不足，鼓励异常离子泵和膜去极化。从过量释放和细胞外积累的谷氨酸，长期的异常膜去极化导致明显的兴奋性毒性。具体来说，过度激活谷氨酸相关受体导致大量Ca2+内流。随后，Ca2+依赖性酶大大放大了ROS和活性氮物种（RNS）的产生，这反过来导致脂质过氧化和DNA损伤，刺激了众多炎症因子的释放。这个过程通常伴随着线粒体功能障碍，诱导细胞色素C的释放和凋亡（图1）。 图1 缺血性中风的病理过程。 2.2.当前治疗方法 目前，IS的临床治疗主要包括以下方法：中风后使用抗血栓药物或机械性取栓术来恢复血管通畅；使用神经保护剂保护神经元免受缺血或再灌注后引起的死亡（表1）。 抗血栓药物主要包括抗血小板药物、抗凝药物和溶栓药物。由于血小板在形成血栓中起着关键作用，抗血小板治疗可以有效预防血栓形成。抗血小板药物，如氯吡格雷和阿司匹林，通常用于治疗动脉或静脉血栓的血小板粘附和聚集。相比之下，包括肝素和华法林在内的抗凝药物通常用于治疗血栓性疾病，预防血栓形成并改善预后。此外，在医生监督下，符合条件的患者可以给予尿激酶和阿替普酶溶栓药物。与抗血小板治疗和抗凝治疗不同，溶栓药物激活纤溶酶原，形成纤溶酶，直接促进血栓溶解。此外，机械性血栓切除术可以增强溶栓治疗的效果。研究已证实，将机械性血栓切除术和溶栓药物结合起来，比单独使用溶栓药物具有更好的疗效和安全性。 神经保护剂在治疗IS中至关重要。尽管它们不能恢复脑血流以减少缺血性脑损伤，但神经保护剂可以抵消缺血区域的有害分子事件。由于兴奋性毒性、氧化应激和炎症介质对IS进展至关重要，它们为神经保护治疗策略提供了广泛的靶点。神经保护剂，包括人尿激酶原、牛脑苷肽和依诺金、依达拉奉、他汀类药物和铁没食子酸配位聚合物纳米点，通过各种靶点机制发挥不同的神经保护效果。 尽管抗血栓药物和神经保护剂在临床实践中广泛使用，但它们仍有一定的局限性，并可能导致不良后果。例如，溶栓药物在分布上特异性差，出血转化风险高，治疗患者再入院率高。另一方面，大多数神经保护剂半衰期短，分布特异性差，难以穿越BBB。这些挑战阻碍了它们实现最佳治疗效果的能力。许多研究目前正在致力于确定更安全、更有效的IS治疗方法以满足临床需求。 3.SC治疗IS的现状 在过去几十年中，SC治疗的临床应用取得了显著进展，SC的增殖和分化能力为再生医学奠定了基础。尽管许多研究已经证明了SCs在治疗IS中的好处，科学家们仍在寻求改良以增强它们的治疗效果。 3.1.用于治疗的不同SC类型 各种SC已被广泛研究用于IS治疗。尽管这些SC具有不同的治疗机制，但它们在治疗IS中至关重要（表2）。 3.1.1.间充质干细胞 间充质干细胞（MSCs）可以从多种组织类型中获得，如骨髓、外周血和脂肪组织。目前，MSCs是用于治疗IS和其他疾病最广泛研究的SC群体。MSCs可以自我更新，表现出多向分化，并分化成成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞。然而，大量证据表明，MSCs的主要有益效果并不是因为它们能够分化成受损组织中的组织细胞；相反，它们的价值在于它们的旁分泌效应，这对IS具有强大的治疗效果。此外，MSCs可以用于自体或异体移植。移植的MSCs通过旁分泌途径产生许多治疗性生长因子，如血管内皮生长因子（VEGF）和肝细胞生长因子（HGF）。有趣的是，在这一过程中，MSCs还分泌富含各种治疗性微小RNA（miR-133b和miR-184）和生长因子的细胞外囊泡（EVs）。这些因子和EVs随后发挥多靶点治疗效果，如抗炎、抗凋亡、促血管生成和神经生成。 MSCs的易于培养和低免疫原性使它们成为最常用的SCs。然而，需要几周的体外培养才能获得用于免疫系统治疗所需的MSCs数量。对于体外扩增的MSCs，冷冻保存可以维持它们的活性和功能。不幸的是，MSCs的冷冻保存和复苏可能会损害它们的活力、膜完整性和体内持久性，特别是在静脉注射后。由于其他SC的应用也遇到这些问题，MSCs仍然相对更接近临床应用的成功。 3.1.2.神经干细胞 神经干细胞（NSCs）源自中枢神经系统，它们能够自我更新并分化成多种配置，如神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。由于它们能够分化成神经元，NSCs对缺血性卒中（IS）患者发挥着重要的神经保护作用。此外，NSCs通过旁分泌途径分泌各种神经营养因子，这有助于它们的治疗效果。例如，NSCs可以在大脑中动脉闭塞（MCAO）的小鼠模型中增强脑源性神经营养因子（BDNF）的表达。同时，杨等人证明，NSCs的条件培养基改善了神经缺陷，减少了脑梗死体积，同时保持了线粒体的超微结构。这些发现表明，NSCs可以通过分泌各种营养因子来进行治疗。在移植到恶劣的微环境中后，只有少数外源性NSCs能够存活。这种情况是SC治疗中的一个常见问题，设计适当的方法以提高缺血区域各种SC存活率是一个关键的探索领域。然而，使用NSCs的潜在伦理问题也限制了它们的应用。令人兴奋的是，研究表明NSCs没有肿瘤形成的风险。从鼠、大鼠或其他动物胚胎干细胞（ESC）系中获得的NSCs在移植到正常裸鼠动物后不会形成肿瘤。 3.1.3.胚胎干细胞 胚胎干细胞（ESCs）源自胚胎或胚泡，具有强大的分化潜力。ESC移植是治疗神经系统疾病，如缺血性卒中（IS）的理想方法，主要是因为它们可以分化成三个神经系统：神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。基于ESCs的细胞治疗可以促进神经再生，减少小鼠IS的梗死区域，并改善中风后的感觉和行为恢复。此外，源自ESCs的小外泌体（ESC-sEVs）对IS过度激活的免疫微环境具有强大的免疫调节能力。ESC-sEVs可以显著减少IS后的炎症细胞因子、白细胞浸润和神经元死亡表达。所有这些特性表明ESCs是IS的潜在治疗剂。然而，一些研究表明，人类ESCs衍生的神经细胞有发展成畸胎瘤的风险。此外，由于ESCs的来源是胚胎，因此存在潜在的破坏胚胎的伦理问题。尽管ESCs具有出色的治疗效果，但这些恶性转化风险和伦理问题限制了它们的应用；因此，它们在治疗IS中的应用将非常有限。 3.1.4.牙髓干细胞 牙髓干细胞（DPSCs）是围绕牙髓血管的多能SCs，源自神经嵴，可以分化成神经元、肌肉和软骨。一些研究报告称DPSCs可用于治疗IS，包括促进认知功能恢复，鼓励神经元分化和血管生成，减少梗死区域，并发挥抗炎作用。DPSCs对IS的巨大治疗效果可能归因于它们的神经系统起源。尽管先前的研究已经验证DPSCs可以分化成神经元并与脑组织整合，但只有少数DPSCs能在缺血区域存活，大多数分化成星形胶质细胞。因此，IS治疗更可能通过旁分泌途径而非细胞替代和分化来整合DPSCs。DPSCs还可以通过抑制过度激活的T细胞反应发挥有效的免疫调节特性。由于从废弃牙齿中分离DPSCs的便利性，伦理问题不是问题。此外，DPSCs由于分化能力较弱，没有肿瘤形成的风险。从牙齿中提取DPSCs及其外泌体用于IS治疗是有希望的未来治疗选择。然而，需要进一步研究DPSCs治疗IS及其早期临床转化。 3.1.5.诱导多能干细胞 诱导多能干细胞（iPSC）技术指的是重新编程终末分化因子，最初由Takahashi和Yamanaka在2006年开发。他们发现，通过重新编程人类和小鼠的成纤维细胞，可以生成类似于ESCs的iPSCs。这项研究的结果揭示了基础研究、药物研究开发和SC治疗中充满希望的多能SC潜力。iPSCs在治疗IS方面表现出多种效果，包括迁移到缺血性脑组织，分化成神经元，促炎因子下调，抗炎因子上调，最终改善运动功能。同时，iPSCs增强了低剂量组织型纤溶酶原激活剂的溶栓效果。最近的一项研究发现，源自iPSCs的小外泌体可以恢复老年小鼠的血脑屏障，预防IS的发生。有趣的是，从iPSCs衍生的NSCs（iNSCs）可以分化成神经元、少突胶质细胞和星形胶质细胞，展现出显著的神经保护效果。此外，从iPSCs衍生的其他SCs在MCAO大鼠模型中显示出相同的治疗效果，包括调节炎症和免疫反应，促进神经分化。iPSCs直接源自患者，行为类似于ESCs，克服了免疫排斥和伦理问题。不幸的是，有报道称MCAO大鼠在iPSC移植后四周形成了畸胎瘤，这是限制其临床应用的主要原因。近年来，移植前使用多能细胞特异性抑制剂可以显著抑制畸胎瘤形成，提高iPSC在未来IS治疗中的安全性。目前，有65项SC治疗IS的临床试验，其中一半以上的临床试验集中在中国和美国（图2A）。其中，有15项正在进行或即将进行的临床试验，包括11项针对MSCs和2项针对NSCs，这进一步说明了实施MSCs和NSCs治疗IS的科学兴趣和优势（图2B）。然而，大多数关于其他SCs的临床试验已经完成或撤回，需要进一步调查以确定它们的效果。（来源：https://ClinicalTrials.gov） 图2  干细胞治疗缺血性中风的临床试验。(A) 通过搜索“stem cell | ischemic stroke”找到的65项研究的地图。来源：https://ClinicalTrials.gov。（注：由于网络原因，无法解析上述网页内容，可能是链接问题或网络连接问题，请检查链接的合法性并适当重试。）(B) MSCs、NSCs或其他SCs的临床实验状态和数量。 3.2.SCs在IS中的治疗机制 许多研究已经调查了SCs对IS的神经保护效果，主要涉及细胞迁移、细胞分化、细胞替代、旁分泌效应等方面，以及其他方面，如促进线粒体转移。 3.2.1.迁移 干细胞（SCs）在治疗缺血性卒中（IS）中被广泛研究，因为它们自然地靶向缺血损伤区域。SCs首先必须穿过血脑屏障（BBB）才能到达这些缺血区域。BBB由基底层、外周细胞和星形胶质细胞组成，能够维持大脑的稳定微环境。SCs穿过内皮细胞层并被招募到缺血组织中的确切机制尚未建立。尽管如此，越来越多的证据表明，基质细胞衍生因子1α（SDF-1α）与其受体趋化因子受体C-X-C趋化因子受体4（CXCR4）之间的相互作用对于控制细胞迁移至关重要，CXCR4在SCs表面高度表达。中风后，大量SDF-1α在缺血区域释放，对表达CXCR4的SCs具有强大的招募效应，并实现目标结果。有趣的是，研究发现缺氧诱导因子-1（HIF-1）可以调节SDF-1基因表达。增加HIF-1α的表达可以提高SCs在缺血区域的存活率，这在一定程度上解释了为什么某些缺氧预处理可以增强SC归巢。 目前，许多针对IS的靶向治疗基于SDF-1α-CXCR4轴。不幸的是，通过SDF-1α-CXCR4轴，中性粒细胞和巨噬细胞也被招募到缺血区域，加剧炎症浸润。因此，史等人将SCs与Fe3O4共孵育，增强SC膜上CXCR4的表达，用于构建仿生载体。CXCR4过表达的仿生载体同时实现了靶向治疗并切断了缺血区域炎症细胞的招募。其他信号影响SC归巢，如c-MET信号。此外，大脑炎症降低了BBB紧密连接完整性的保护，允许SCs通过细胞间隙途径通过形态变化穿过BBB。 总之，积极归巢到缺血区域是SCs发挥治疗效果的前提和关键因素。此外，增强SCs的归巢能力将扩大它们的治疗能力，这是SC修饰的一个重要课题。 3.2.2.分化和替代 SCs的神经修复功能直接体现在它们分化成新的神经细胞和替代受损神经组织上，这确保了神经传导路径的完整性。由于它们强大的分化能力可以恢复正常的神经传导，NSCs可以替代受损的神经元、星形胶质细胞或少突胶质细胞。外源性SC移植也可以通过补偿分化引起的神经细胞损失来实现这种神经保护效果。此外，先前的研究已经证明，SCs归巢到缺血区域将分化成成熟的神经元，形成新的神经回路。这种强大的神经元分化通过移植后两个月超过50%的SCs表达神经元表型得到证明。 在分化成神经元的同时，位于缺血区域的SCs还可以通过与外周细胞、内皮细胞和星形胶质细胞相互作用修复受损的BBB，以加速神经回路重建。尽管SCs的确切神经分化机制尚未得到普遍认可，但Wnt/β-Catenin信号可能是SC自我分化的突出因素。这条途径可以促进NSCs分化成神经元而不是星形胶质细胞。 总之，由细胞分化引起的神经发生和细胞替代引起的神经回路重建可能是SCs改善IS后神经功能机制。SCs不能用于治疗IS的主要原因之一是它们神经分化能力不足。 3.2.3.旁分泌 SCs可以通过分泌各种治疗因子，包括外泌体、生长因子、趋化因子和细胞因子，加速神经功能的恢复。SC旁分泌功能体现在以下几点： 1.SCs可以通过分泌神经营养因子促进神经发生，如神经生长因子（NGF）、胰岛素样生长因子1（IGF-1）、胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）和BDNF。例如，BDNF可以通过与酪氨酸激酶受体相互作用促进神经发生。 2.SCs可以通过分泌促血管生成因子，如Notch 1、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、肝细胞生长因子（HGF）、血管生成素-1（Ang-1）、Ang-2和VEGF，促进血管生成。例如，VEGF可以通过促进未成熟血管的形成和内皮细胞的迁移和增殖来促进血管生成。 3.SCs可以通过改善炎症因子分泌发挥重要的免疫调节和炎症调节效应[110]。研究表明，SCs可以分泌关键的转化生长因子-β（TGF-β），减轻缺血脑组织中的免疫反应，降低因细胞死亡引起的梗死区域单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）水平，并抑制BBB损伤引起的大量CD68+免疫细胞浸润。此外，SCs可以通过上调抗炎细胞因子和下调促炎细胞因子来调节炎症环境。例如，SCs通过增加IL-10表达和减少肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β）和IL-6表达来调节炎症环境。有趣的是，调节性T细胞（Tregs）刺激缺血区域SCs的增殖，但阻断抗炎细胞因子IL-10将影响这一过程。 4.SCs通过上调抗凋亡（即Livin）和下调促凋亡（即Caspase-3）蛋白分泌，在缺血区域抑制神经元凋亡。同时，研究表明SCs也可以通过分泌粒-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）、B淋巴细胞-2（Bcl-2）和其他分子来抑制凋亡。其中，造血生长因子GM-CSF可以提高细胞存活率。除了直接的抗凋亡效应外，SCs还分泌多种神经营养因子，如BDNF、VEGF和前面提到的神经营养因子，以增强神经元存活。 SCs的旁分泌功能进一步确立了它们作为治疗IS的有利“药物”。因此，研究人员一直在追求提高SCs的旁分泌能力，以最大化它们的治疗优势。 3.2.4.线粒体转移 除了上述机制，干细胞（SCs）还可以通过线粒体转移来促进神经功能恢复。中风后，神经细胞中的大量线粒体将受损，触发线粒体自噬以确保线粒体质量。通过线粒体吞噬作用去除受损线粒体将减少活性氧（ROS）的产生，并改善缺血区域的恶劣微环境。ROS指的是体内的含氧活性物质，过量的ROS会诱导脂质过氧化和细胞损伤。尽管这部分改善了微环境，但过度的线粒体自噬可能导致受损神经元的消化和死亡。基于这些观察，将健康的线粒体转移到受损细胞是一种有前景的潜在治疗方法。许多研究已经证实，SCs可以作为线粒体供体来维持细胞线粒体平衡。SCs的线粒体转移依赖于形成Cx43调节的间隙连接通道。Cx43表达增强的SCs的线粒体转移效率几乎是正常SCs的两倍，而Cx43基因表达沉默的SCs几乎不发生。总之，将健康的线粒体传递到缺血区域的受损细胞是一种有前景的治疗技术，SCs具有出色的线粒体传递能力。然而，关于如何扩大SCs的线粒体传递效果的研究仍处于初期阶段。因此，确定SCs线粒体传递的多个信号通路是必要的。3.3.修饰方法 3.3.1.基因转染修饰 基因转染已广泛纳入基因组功能和基因治疗研究。这种技术通过将特定基因转移到细胞中来调节基因表达，最终增强或抑制特定功能。SCs的基因转染主要用于提高其治疗能力。例如，VEGF基因转染可以增强SCs的血管再生能力。一些miRNA，如miR-124，也通过促进它们分化为成熟的神经元来提高SC的治疗功能。此外，可以在SCs上进行CXCR4基因转染以增强它们的归巢能力。使用生物响应材料作为基因载体来增强SC治疗效果也已被广泛实践。例如，我们使用ROS响应材料聚[(2-丙烯酰氧基)乙基(对硼酸苯甲酸苄基)二乙基铵溴化物]（B-PDEA）作为BDNF基因载体来转染NSCs（图3A）。BDNF随后与酪氨酸激酶受体相互作用以促进神经元存活。结果表明，B-PDEA转染增加了SCs分泌的BDNF（图3C）及其在脑匀浆中的含量（图3D）。杨等人生产了一种非病毒基因载体，钙金属有机框架（Ca-MOF），并将其用于SC miRNA传递以获得更好的IS治疗效果（图3B）。Ca-MOF保护目标基因（图3E）并帮助miRNAs指导SC神经分化（图3F）。在SC基因转染过程中应仔细考虑条件。研究强调细胞形态影响转染效率。细胞形态的扩展和延伸有利于转染，且扩展良好的SCs具有更高的转染效率。粘附面积越大，转染效率越高。相比之下，细胞扩散面积对转染效率的影响相对较小。此外，载体的选择显著影响SC基因转染。病毒介导的转染是临床实践中广泛使用的基因修饰方法。尽管病毒载体具有高转染效率和使用方便的优势，但免疫原性和细胞毒性限制了它们的应用。非病毒载体已被广泛研究以避免安全问题，包括基于介孔硅和基于硅的金纳米颗粒。这些材料缺乏突变原性，但会引起促炎反应和低转染效率。这些因素在选择转染载体时需要权衡，科学家们预计将取得进一步突破，以实现高转染效率，同时避免细胞毒性。 图3 SCs的基因转染。(A) 用于BDNF转染的ROS响应型B-PDEA作为基因载体的示意图。(B) 用于miRNA-124转染的核酸酶保护型Ca-MOF作为基因载体的示意图。(C) 使用B-PDEA或PEI转染的NSCs中BDNF的累积表达。(D) 不同干细胞治疗后MCAO小鼠脑匀浆中BDNF的总量。版权所有2019 Wiley-VCH。(E) 在模拟核酸酶降解过程中Ca-MOF@miR-124或裸露miR-124的miR-124表达。(F) 在不同处理下5或10天NSCs的神经元分化标记和胶质细胞分化标记的表达。版权所有2022美国化学会。数据以均值 ± 标准差的形式呈现。 3.3.2.无机纳米颗粒修饰 已经开发了许多基于纳米颗粒的药物/基因传递系统。使用纳米颗粒修饰SCs以获得更好的IS治疗效果已得到许多研究的证实。关于纳米颗粒修饰SCs的研究主要集中在提高SCs的归巢能力。中风后，SCs上CXCR4的过表达将通过SDF-1α-CXCR4轴提高细胞归巢效率。各种基于铁的磁性纳米颗粒（MNPs）已积极增强CXCR4表达（图4B和4C）；然而，通常需要外部磁场优化以增加SC对这些基于铁的MNPs的吸收。基于这一限制，我们发明了类似磁小体的1D铁磁性氧化铁纳米链（MFION）（图4A），这是一种链状非病毒载体，有利于细胞吸收，无需外部磁力。同时，MFION在SCs上过表达CXCR4，增强SC在缺血区域的归巢（图4D-4F）和治疗效果。此外，用MNPs处理的SCs可以通过外部磁吸引靶向缺血区域。这些基于铁的纳米颗粒也可以用作基因转染的基因载体，包括超顺磁性氧化铁纳米颗粒（SPION）和MFION。纳米颗粒还被修饰以增强SC的其他能力。例如，唐等人开发了一种黑色素纳米颗粒，通过上调抗氧化防御和抑制凋亡，增强MSCs对抗缺氧缺血损伤的治疗能力。有趣的是，纳米颗粒修饰的SCs可以增强在IS治疗期间的生存和神经分化能力。其中，通过功能肽和SPION自组装形成的纳米颗粒被传递到细胞内，功能肽上调HIF-1α并诱导更高的NSC存活率。此外，Fe3O4纳米颗粒被用作“桥”连接抗氧化层与SCs，实现更高的SC存活率。 图4 通过纳米颗粒修饰SCs。(A) 基于MFION工程化MSCs用于缺血性中风治疗的示意图。(B) MSCs表面受体在与IO MNPs共孵育2小时后有无表达情况。(C) MSC CXCR4在不同浓度的IO MNPs孵育不同时间后的表达情况。版权所有2014美国化学会。(D) 不同纳米颗粒处理后MSC CXCR4的表达情况。(E) 用不同纳米颗粒处理的MSCs对SDF-1α的迁移能力。(F) 用不同纳米颗粒处理的MSCs对缺血性大脑的归巢能力。版权所有2019 Wiley-VCH。 了解移植的干细胞（SCs）在体内的迁移、分布和存活对于基础研究和临床干细胞转化至关重要。纳米颗粒也被广泛用于长期追踪治疗缺血性卒中（IS）的SCs。例如，磁共振成像（MRI）可以准确监测用基于铁的磁性纳米颗粒（MNPs）标记的间充质干细胞（MSCs）的体内行为。最近，铁氧体纳米环被报道作为一种追踪器，通过局部诱导热增强膜通透性有效地标记MSCs，用于MRI追踪和靶向IS治疗。此外，徐等人设计了一种动态增强的双模追踪系统，以改善高ROS微环境并监测长期IS治疗期间MSCs的体内命运。与其他纳米颗粒修饰不同，这项研究中的纳米颗粒锚定在SC膜上，而不是被SCs内化。此外，SCs的动态命运可以被监测长达28天。磁性纳米气泡（MNBs）可以用于长期SC追踪。李等人将MNPs组装成MNBs，然后被NSCs内化，实现MRI和超声成像监测。同时，MNPs可以通过上调BMP2/Smad信号通路指导NSCs分化为神经元表型。 总之，各种纳米颗粒增强了SCs的治疗能力，并使其在体内的行为得以追踪。预计功能性纳米颗粒的进一步开发将增强SCs在IS治疗中的治疗效果。 3.3.3.生物材料修饰 一些研究已经验证了生物材料可以调节SC行为，如多肽和水凝胶。用天然或合成的特殊功能材料修饰活细胞表面，在生物医学领域开辟了新的研究前景。目前，生物材料修饰旨在加强SC在缺血区域的归巢能力或存活率。某些生物材料可以增强SCs的归巢能力。例如，我们的研究表明，将棕榈酸肽涂覆在MSCs上可以改善导向，增加缺血组织中的MSC数量，并减少在周围组织的分布（图5）。在另一项研究中，脂质-PEG（lipo-PEG）链接的重组CXCR4非侵入性地覆盖在MSCs表面，以治疗缺血性心肌病。尽管这种表面修饰尚未应用于IS治疗，但它改善了MSCs对SDF-1的梯度迁移，表明其有可能增强对IS的治疗能力。总体而言，用生物材料修饰SCs已被证明可以改善SCs对缺血区域的靶向能力。同时，SCs的生物材料修饰可以提高它们在缺血区域的存活率。最近，徐等人通过设计脂质微胶囊来诱导自噬，解决了NSCs在缺血区域的低存活率问题。脂质微胶囊为NSCs提供了物理屏障，并增强了NSCs的自噬流，减少梗死体积，减轻脑水肿，并最终提高模型小鼠的存活率。许多最近的研究集中在抗ROS材料上，以保护SCs免受损害。例如，设计了一种可降解ROS的可注射PEG水凝胶，以增强SCs的保留和抗氧化保护。已经开发了各种生物材料以增强SCs的归巢能力和在缺血区域的存活率。预计开发更多功能性生物材料以增强SCs的治疗能力。 图5 通过生物材料修饰SCs。版权所有2017 Elsevier。 3.3.4.预处理修饰 不同的处理条件和培养环境可以改变SCs的特性和体外及体内的治疗作用。最近，有许多关于三维（3D）培养和各种SCs预处理的研究。与传统培养方法相比，3D培养显著提高了SCs对IS的治疗作用。与2D培养最显著的区别是，3D使用定制的3D人工基质来模拟SCs的自然环境，更好地反映细胞内环境。最直接的表现是，3D培养中整个细胞表面会发生细胞吸附，而2D培养中只有与培养表面接触的细胞侧面发生细胞吸附。研究表明，与2D培养的SCs相比，通过尾静脉注射的3D培养SCs显著降低了促炎细胞因子水平、小胶质细胞和脑梗死体积，同时增加了缺血区域的SCs。同时，对损伤部位小胶质细胞的RNA测序证明，3D培养的MSCs对IS的治疗作用更大，可能通过抑制小胶质细胞激活（图6L）。此外，将SCs组装成3D多细胞球体可以改善它们的旁分泌效应，有利于移植细胞的存活和治疗效果。徐等人证明，将MSCs和人脐静脉内皮细胞（HUVECs）组装成3D球体显著提高了细胞活性和保留。与MSCs/HUVECs悬浮液相比，移植的3D球体具有显著的神经保护、促血管生成和抗瘢痕能力。这种3D球体促进了旁分泌因子的表达和分泌水平，最终在MCAO小鼠中实现了显著的大脑结构和运动功能恢复（图6R）。通常涉及缺氧的SC预处理，在移植前已被广泛研究以提高治疗效果。例如，缺氧预处理MSCs（HP-MSCs）最直接的影响是增加与迁移相关的蛋白表达（如CXCR4）。与在正常氧气中培养的MSCs相比，HP-MSCs显示出增强的迁移能力到缺血区域，并在感觉-运动功能测定的粘附去除测试中表现更好。胡等人列出了不同氧气含量的缺氧培养环境对SCs的影响，包括1%氧气含量以防止MSCs凋亡和2%氧气含量以减少MSCs的肿瘤潜力。 图6 SCs的预处理。SCs在3D培养或3D球状体中的潜在作用。(左) 3D-MSC发挥更强治疗效果的潜在机制。经许可转载。版权所有2021 Springer Nature。(右) (a) MSCs（红色）和HUVECs（绿色）混合的3D细胞球状体的代表性共聚焦Z堆叠图像。(b) BDNF、(c) VEGF和(d) IGF-1在细胞悬浮液（cell sus.）或3D细胞球状体（3D cell sph）中的浓度。(e) 在正常条件或缺氧和葡萄糖剥夺条件下培养的cell sus.和3D cell sph的细胞活性。比例尺，100微米。版权所有2021 Elsevier。 同时，研究表明0.1%至0.3%的氧气会促进生长因子的分泌，包括VEGF、GDNF和BDNF，促进神经发生和神经功能恢复。我们最近的工作发现，神经干细胞（NSCs）的低氧预处理可以通过调节外泌体中miRNA的表达水平来增强缺血性卒中（IS）治疗的益处，进一步展示了低氧预处理干细胞（SCs）的广泛治疗优势。除了低氧预处理，缺血性脑组织预处理也会调节体内SC的行为，包括促进CXCR4的表达以促进归巢和生长因子的释放（图7B和7C）。 图7 SCs的预处理。(A) 用或不用阿托伐他汀预处理的MSC CXCR4的流式细胞术结果。经[22]许可转载。版权所有2022 Springer Nature。(B) 未经预处理的MSCs（FBS-MSCs）、用正常脑组织预处理的MSCs（N-MSCs）和用缺血脑组织预处理的MSCs（S-MSCs）表面上CXCR4的表达。比例尺：50微米。(C) FBS-MSCs、N-MSCs和S-MSCs各种旁分泌因子的表达。版权所有2022 MDPI。 用某些药物预处理SCs也能提高它们的治疗效果。例如，用阿托伐他汀预处理间充质干细胞（MSCs）可以通过调节miR-124a/CXCR4信号通路来增强它们的归巢能力（图7A）。同样，一些细胞因子预处理，包括IL-1β，可以通过增加MSCs中各种细胞因子（TNF-α）、趋化因子（CXCL1）和粘附分子（细胞间细胞粘附分子-1（ICAM1））的表达来改善MSC的迁移。尽管一些药物或细胞因子预处理尚未应用，这些预处理方案可能会改善IS治疗。 总之，SC预处理（如缺血、低氧、药物和细胞因子，可能是治疗脑缺血损伤的有效策略。 4.挑战与展望 随着SC治疗IS的深入研究，提高SC产品的生产效率、质量和安全性的重要性也必须被强调。 4.1.生产挑战 由于细胞疗法的快速发展，对SC的需求前所未有，每年MSC的使用量接近3000万亿。提供的数据表明，成功的SC治疗需要大约1×10^9个细胞，但原始收集的SC数量有限。收集SC是一个成熟的工业项目；因此，必须通过充分的体外扩增来获得大量的SC以满足临床应用所需的细胞需求。然而，这种体外扩增耗时且需要数周时间。因此，开发新的培养技术以加快SC的体外扩增对于有效的临床治疗应用至关重要。 在制造SC时必须考虑质量。良好的生产实践（GMP）确保了药品生产的质量管理并最小化风险。一些学者已经详细描述了用于治疗的GMP级SC的生产。这个过程主要包括细胞鉴定、活性、生长活性、纯度、均匀性、异常免疫反应、致瘤性、生物效力测试、无菌测试以及检测支原体、细胞内外病原体、内毒素、培养基及其他添加剂的残留量。GMP级SC生产耗时且成本高；然而，它显著提高了SC治疗的质量和安全性。这一要求需要考虑如何在快速SC生产中降低生产成本并确保质量。 最近出现了许多SC企业，包括贝克生物和中源协和细胞技术有限公司。这些公司管理细胞收集、处理、储存和分销，形成了完整的SC产业链。此外，各种大型SC企业已经开发出基于3D微载体的大规模SC制备工艺，以满足高质量和大规模SC生产的需求。SCs在由3D微载体形成的模拟生理微环境中培养，这确保了细胞的基本质量属性和制剂稳定性。然而，在大规模制备过程中如何完全去除3D微载体，同时遵守临床应用的安全标准，仍然是一个问题。 4.2.稳定性挑战 SC的储存和运输条件将显著影响其稳定性。生产的SC将在4-10°C的冷链中运输以维持其活力，这增加了成本。大多数医院可能会在临床试验期间现场准备SC。然而，如果SC作为标准治疗方法的需求增加，医院可能无法维持自给自足的生产SC，因此仍需要外部制造商供应特定产品，使SC的运输变得不可避免。 尽管在-70°C至-196°C的冷冻保存可以维持SC的活性和功能稳定性，但使用液氮在极低温度下运输它们成本高昂，冷冻保存试剂DMSO可能具有毒性。 在环境条件下运输可能是一个可行的解决方案。先前的研究表明，哺乳动物细胞直接悬浮在培养基中，在从英国运输到中国超过36小时的环境温度下保持高活性。这些结果比使用冰袋运输的结果要好得多。有趣的是，形成SC球体可以保护SC活性，并促进在环境温度下长期储存和运输。然而，SC球体的形成需要大量的时间、财政资源，并在使用前增加处理成本。因此，需要进一步优化SC的储存和运输条件，以建立较低的运输成本并确保SC的稳定性。 4.3.使用挑战 4.3.1.使用前的预处理 即使克服了上述限制，SC治疗仍需要特定的专业操作。例如，低温储存的SC在使用前必须重新加热以恢复活性。不幸的是，冷冻保存和使用前的复苏会破坏SC的活力和细胞膜，可能减少静脉注射后体内持久性。此外，在此操作中应特别注意重新加热速率，以确保冷冻SC的存活。一般来说，重新加热速度越快越好。最终，提高SC在处理过程中的存活率和活性仍然是一个需要讨论的问题。 4.3.2.给药途径 尽管大多数IS治疗研究的方法是静脉注射，但对SC给药途径尚无统一看法。与其他给药途径相比，静脉注射是最简单、最安全的方法，侵入性最低。然而，通过这种方法只有少数细胞能够到达大脑的缺血区域，细胞在非靶器官中的积累成为一个问题。研究已经证明，颅内注射可以直接将SC输送到缺血区域，并对IS有良好的治疗效果。尽管如此，其相当大的侵入性和造成额外脑损伤的风险限制了其使用。此外，一些研究已经证明，动脉注射在将细胞输送到缺血半球方面比静脉注射更有效。然而，如果细胞团块阻塞动脉，将发生额外的缺血损伤。必须注意，不应低估注射操作的副作用，因为SC可能因注射过程中用力过猛而立即死亡。优化给药途径或加强SC的“保护”应该是研究的重点。 4.3.3.剂量 “移植的干细胞越多越好”的观点是错误的。研究已经证明，移植额外的干细胞并不能改善细胞在微环境中的存活或产生显著的治疗效果。此外，单剂量过大可能会导致血管栓塞风险。尽管移植数量不应尽可能高，但需要考虑产生目标治疗效果所需的特定干细胞浓度。值得注意的是，不同的间充质干细胞（MSCs）剂量可能会对缺血性卒中（IS）产生不同的治疗效果。与其他剂量相比，低剂量（1×10^6个细胞）更能恢复神经功能，高剂量（2×10^7个细胞）则更能抑制小胶质细胞激活。此外，由于患者个体差异和病程不同，给所有患者相同数量的干细胞是不可能的。这一观察提醒我们，移植的干细胞浓度既不宜过低也不宜过高，需要优化个体化治疗剂量，并建立更精确的剂量关系。 4.3.4.治疗时间窗 控制时间对于干细胞治疗的效果也是至关重要的。一方面，离开库后12小时内的新鲜干细胞将保持良好活性。另一方面，IS治疗的时间窗是紧凑的。在局灶性缺血后24小时内进行干细胞移植可以显著减少损伤体积并改善运动功能障碍。相比之下，在IS后24小时进行干细胞移植会减少潜在的治疗效果。此外，在此时间框架之外进行干细胞移植与MCAO组相比，在梗死大小上没有显著差异。尽管干细胞治疗的干预时间窗比组织型纤溶酶原激活剂的静脉注射时间窗更长，但它仍然面临时间框架不可控的挑战。无论是对于干细胞本身还是卒中患者，这些时间框架都是非常具有挑战性的。因此，延长维持干细胞活性的时间框架和优化干细胞治疗IS的时间窗是至关重要的。 5.结论 干细胞治疗IS的能力已被广泛报道，并显示出与传统方法相比的卓越优势，特别是在实施各种机制时。其中，修改干细胞以实现更好的治疗效果无疑是研究者目前的焦点，并且已经取得了一些突破。然而，尽管干细胞治疗存在一些共同问题，但在临床转化方面仍面临许多挑战。3D微载体技术等技术已迅速发展，以克服干细胞临床应用的限制。我们期待新兴技术加速干细胞治疗的临床转化，并使干细胞能够应用于患者。此外，我们期望揭示干细胞在治疗IS中的潜力，为干细胞转化提供新思路，并期待这些挑战尽快得到解决。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。