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摘要：癌细胞对化疗药物的耐药性大大降低了癌症患者的治疗效果，化疗引起的毒副作用也严重影响了患者的生活质量。茶中主要活性成分表没食子儿茶素-3-没食子酸酯（EGCG）与顺铂、5-FU、多柔比星和紫杉醇的联合使用，增强了它们对肿瘤的增敏效果，并对抗了癌细胞的耐药性。这些效应似乎通过多种机制介导，包括对抗癌症干细胞介导的药物耐药性、增强药物敏感性、诱导细胞周期停滞和凋亡，以及阻断血管生成。此外，EGCG可以通过其抗炎和抗氧化作用，抑制化疗引起的一系列不良反应，如胃肠功能紊乱、肾毒性和心脏毒性，从而改善患者的生活质量。然而，EGCG的生物利用度低、脱靶效应以及与某些化疗药物的反应性限制了其临床应用。EGCG和化疗药物的纳米改性不仅增强了抗肿瘤活性，还延长了荷瘤小鼠的生存时间，并具有低毒性的优势。因此，本综述旨在讨论EGCG与化疗药物联合治疗癌症的现状和挑战。总体而言，EGCG是一个有前景的化疗辅助剂。 1.引言 恶性肿瘤的发病率和死亡率持续上升，已成为对人类生命健康的主要威胁。恶性肿瘤的治疗方法主要包括手术、放疗和化疗，其中化疗在恶性肿瘤治疗中发挥着关键作用。然而，肿瘤细胞常常产生耐药性，使得通过化疗彻底杀死所有肿瘤细胞变得困难，限制了治愈率。目前，现有的癌症化疗药物不仅价格昂贵，还会改变多个信号通路组分的表达水平，从而不可避免地带来不同程度的副作用。这些副作用的产生与化疗药物的剂量和个体对药物的敏感性有关。化疗药物在抑制或杀死肿瘤细胞的同时，也对其正常组织造成一定的损伤。化疗的常见副作用包括胃肠功能紊乱、心脏毒性、神经病变、血管毒性等。这些副作用严重影响了肿瘤治疗效果和患者的生活质量。一些植物化学物质被报道具有化疗增敏作用，并能减少化疗引起的毒性副作用的发展。表儿茶素没食子酸酯（EGCG）就是其中之一。 EGCG是绿茶中最重要的活性成分之一，约占儿茶素化合物的50-60%。EGCG清除自由基，减少氧化损伤，对正常细胞和组织无毒性，但对肿瘤预防和治疗有积极作用。此外，EGCG还被报道能够对抗癌细胞干细胞的耐药性，增强化疗药物的敏感性，从而减少药物用量，缓解胃肠道功能紊乱和肾毒性等副作用，并降低肿瘤引起的恶病质发生率和发展。 尽管EGCG在癌症预防和治疗方面显示出了强大的优势，但其疗效与一线化疗药物相比仍有一定差距，作为单一抗癌药物开发的可能性有限。然而，当EGCG作为辅助化疗药物用于治疗肿瘤时，它们表现出强烈的化疗增敏作用，并减轻化疗副作用（图1），因此有望作为化疗辅助药物使用。本文综述了EGCG与化疗药物联合增强抗癌效果的现状和挑战，并为包含EGCG的组合策略在肿瘤治疗中的发展提供了参考。 图1. EGCG 在辅助化疗中的优势 2.增强化疗效果  单独的EGCG具有强大的抗癌活性，当与化疗药物（5-氟尿嘧啶、塞来昔布、顺铂、多柔比星、他莫昔芬）联合使用时，其协同治疗效果得到放大。这些作用机制包括减少癌细胞干细胞的药物抗性、增强化疗药物敏感性、诱导细胞周期停滞和凋亡、抑制血管生成，以及诱导抗炎和促氧化效应（图2）。我们将在下面简要阐述这些机制。 图2. EGCG与化疗药物联合作用增强抗肿瘤效果的机制 2.1. 减少癌细胞干细胞的药物抗性 在肿瘤组织的细胞群中，癌细胞干细胞（CSCs）数量较少，但在肿瘤抗性和复发过程中起着重要作用。CSCs通过不对称分裂维持自我更新和多向分化潜能，导致肿瘤细胞继续增殖，并促进肿瘤异质性和多样性的形成。因此，靶向CSCs是预防癌症和克服药物抗性的重要策略。在针对CSCs的研究中，发现EGCG对CSCs药物抗性有积极影响。EGCG单独使用时已显示出对CSCs生长和干性的强烈抑制作用。当EGCG与其他化疗药物联合对抗CSCs时，联合的肿瘤抑制效果比单一作用效果更显著（图2）。这些效应主要是EGCG通过减少CSCs的干性和降低细胞内流出泵活性来降低CSCs对化疗药物的抗性。 集落和球状体形成能力被用作实验指标，以测试CSCs的干性能力。低浓度的EGCG（5μM）未能抑制胰腺导管腺癌的集落和球状体形成，但当与PDE3A抑制剂曲前列醇联合使用时，它降低了FOXO3和CD44蛋白水平，并上调了cGMP表达，导致CSCs形成集落和球状体的能力显著降低。肿瘤抗性通常由增加的细胞内药物流出介导，由膜转运蛋白介导。作为最大的细胞内转运蛋白基因家族，ABC超家族已被报道参与肿瘤的多药耐药性。EGCG可以通过抑制CSC膜上的转运蛋白（ABCC2和ABCG2等）的活性和表达，增加CSCs中的药物浓度，减少药物从细胞中泵出的量，并增强抗癌药物对CSCs的杀伤效果（图2）。在头颈癌、胆管癌和鼻咽癌等癌症的CSCs中发现了这一点。在胶质瘤CSCs中，尽管EGCG对ABCG2表达没有影响，但EGCG下调了另一种膜转运蛋白P-糖蛋白（P-gp），减少了肿瘤细胞的球状体形成和迁移能力，最终增强了化疗药物替莫唑胺对CSCs的杀伤。 除了影响膜转运蛋白的表达外，EGCG还可以通过调节miRNAs的表达来保护CSCs。5-氟尿嘧啶（5-FU）处理的药物耐药性结直肠癌细胞比亲本细胞具有更强的球状体形成能力。低剂量EGCG与5-FU联合使用抑制了多个自我更新驱动途径，包括Notch和Bmi1、Ezh2和Suz12，通过上调关键肿瘤抑制miRNAs（miR-34a、miR-145和miR-200c）的表达，从而增强了耐药性结直肠癌细胞的凋亡并抑制了球状体形成。在动物实验中，EGCG与5-FU或顺铂的联合使用也可以减少小鼠中各种CSCs的肿瘤体积和重量，如结直肠癌、头颈癌和鼻咽癌。 2.2. 提高药物敏感性 EGCG与化疗药物的结合可以显著降低化疗药物的IC50值（表1），同时减少药物剂量也能显著增强效果。三氧化二砷（ATO）是治疗急性早幼粒细胞白血病（APL）的有效化疗药物，长期使用可能导致严重的副作用和癌细胞耐药性。EGCG与ATO的结合有效降低了抑制APL HL-60细胞和U937细胞所需的ATO浓度。EGCG增强了三苯氧胺和顺铂在胶质瘤细胞中的增敏效果，并抑制了端粒酶的表达。它还可以通过抑制核酸修复酶ERCC1/XPF的活性，增强各种癌细胞对顺铂的敏感性。EGCG和吉西他滨的结合增强了胆管癌细胞对吉西他滨的敏感性，促进了凋亡，并显著抑制了移植肿瘤的生长。 EGCG可以通过多种途径增强化疗药物的增敏效果，包括促进药物摄取相关蛋白的表达和抑制药物在细胞内的翻译或流出（图2）。铜转运蛋白1（CTR1）是一种跨膜溶质载体转运蛋白，之前已被证明可以增加顺铂的细胞摄取和敏感性。EGCG在卵巢和肺癌细胞中上调了CTR1的转录和翻译水平，并抑制了癌细胞中顺铂介导的CTR1降解。羰基还原酶1（CBR1）将抗肿瘤药物柔红霉素和阿霉素转化为柔红霉素醇（DNROL）和阿霉素醇（DOXOL），这些新产生的醇代谢产物不仅具有低抗肿瘤活性，还会引起心脏毒性和心肌细胞损伤。EGCG还直接结合肝脏中的CBR1，增加癌细胞中柔红霉素的积累，增强抗肿瘤活性，同时减少DNROL诱导的心脏毒性（图3）。EGCG和萝卜硫素的联合治疗通过时间和剂量依赖性地降低细胞活性并增强顺铂诱导的凋亡和G2/M期阻滞，增强了顺铂在顺铂敏感和顺铂耐药卵巢癌细胞中的疗效。 图3. EGCG 提高癌细胞对多柔比星的化疗敏感性。EGCG 通过抑制 CBR1 和 P-gp 的活性，减少柔红霉素和多柔比星的转化和外排，从而增强抗肿瘤活性并降低心脏毒性。 EGCG可以抑制结直肠癌和肺癌中多药耐药蛋白1（MRP1/MDR1）的活性，并抑制化疗药物从癌细胞中的流出，从而促进细胞内积累。EGCG下调MDR1及其蛋白产物P-gp，减少肝癌细胞中多柔比星（DOX）的流出泵活性（图3）。DOX和EGCG的结合使口腔癌细胞中的DOX浓度增加了51%，并与单独使用DOX相比，增加了肿瘤细胞的凋亡率。进一步研究表明，EGCG通过协同抑制MEK/ERK和PI3K/Akt信号通路，抑制DOX诱导的P-gp过度表达。在EGCG-三苯氧胺联合测定中，P-gp和乳腺癌耐药蛋白显著受到抑制，增强了乳腺癌细胞对三苯氧胺的敏感性。 2.3. 诱导细胞周期停滞 EGCG和顺铂的联合治疗通过降低多种细胞周期相关基因（cyclin A2、cyclin B1、cyclin D1和cyclin E1）的mRNA表达水平，并增加细胞周期抑制因子p21和DR5的表达（图2），诱导细胞在G1期停滞，并增强胆道癌和非小细胞肺癌（NSCLC）中的凋亡。EGCG衍生物不仅可以增强EGCG的稳定性和生物利用度，还可以促进NSCLC细胞的凋亡，并在与顺铂联合使用时抑制小鼠肿瘤的生长。 EGCG和DOX的结合抑制了肿瘤中磷酸化NF-κB和MDM2的表达，并上调了p53，从而显著抑制了膀胱癌细胞（T24和SW780）的增殖，增强了DOX对癌细胞的凋亡诱导效果，并降低了膀胱癌细胞的迁移能力。EGCG和曲司他丁A的结合通过上调p16表达促进淋巴瘤细胞在G1期停滞，从而减少细胞增殖。与vorinostat单独使用相比，EGCG的联合治疗上调了p21、p27、caspases（3、7和9）和Bax，并抑制了cdk2、cdk4、cyclin A、NF-κB和Bcl2的活性，从而显著降低了黑色素瘤细胞的增殖并促进了它们的凋亡。 2.4. 诱导凋亡 EGCG和顺铂的结合抑制了头颈鳞状细胞癌的形成并增强了细胞凋亡。EGCG减轻了化疗药物吉非替尼诱导的CYP1A1/CYB1B1、EGFR、cyclin D1、p-Akt（Ser473）和survivin在转录和翻译水平上的表达增加，并增强了p-p53（Ser15）的表达（图2），从而增强了吉非替尼对苯并[a]芘诱导肺癌的治疗效果。EGCG还降低了EGFR的磷酸化水平，抑制了乳腺癌细胞中的AKT信号，并增强了雷洛昔芬诱导的癌细胞凋亡。此外，EGCG与三苯氧胺在小鼠中的结合通过抑制mTOR和EGFR的表达，减少了肿瘤体积71%和肿瘤重量80%。EGCG和博来霉素的结合显著促进了Mia Paca-2胰腺癌细胞的凋亡。EGCG和丁酸钠的结合也在结肠癌细胞中诱导了细胞周期停滞、凋亡和DNA损伤。 EGCG与紫杉醇（例如，紫杉醇和多西他赛）的结合上调了p53和caspase-3，增加了前列腺癌细胞的凋亡率，并使肿瘤携带小鼠的无病生存率提高到90%。EGCG与5-FU的结合可以通过抑制葡萄糖调节蛋白78（GRP78）的表达来阻断5-FU的流出，激活NF-κB信号，增强miR-155-5p的表达水平，并进一步抑制靶基因MRP1的表达。5-FU的积累导致caspase-3和PARP激活，Bcl-2降低和Bad增加，最终导致结肠癌细胞的凋亡。EGCG和阿霉素的结合也下调了bcl-2并增加了bax和caspase-3的表达，从而促进了食管癌细胞的凋亡。EGCG结合GRP78并将其从活性单体转化为非活性二聚体和寡聚体，干扰了抗凋亡GRP78-caspase-7复合体的形成，导致依托泊苷、紫杉醇和长春新碱诱导的癌细胞凋亡增加。EGCG和ATO的结合显著诱导了HL-60细胞的线粒体依赖性凋亡，凋亡细胞占总死亡细胞的70%以上。 NS-398和化疗药物塞来昔布都是环氧化酶-2（COX-2）抑制剂，EGCG和NS-398的联合治疗促进了前列腺癌细胞（LNCaP、PC-3和CWR22Rnu1）中Bax、pro-caspase-6和pro-caspase-9以及裂解的PARP的表达，并降低了前列腺特异性抗原和IGF-I水平，从而诱导凋亡并抑制小鼠肿瘤的生长。单独的EGCG或塞来昔布都没有诱导PC-9肺癌细胞中DNA损伤基因GADD153的表达，而联合治疗通过ERK信号通路上调了GADD153，从而促进了肺癌细胞的凋亡。 肝源性生长因子（HDGF）是一种分泌的肝素结合生长因子，调节肿瘤侵袭和转移，并促进血管生成。EGCG和顺铂的结合可以破坏线粒体膜电位，并通过下调HDGF上调caspase-3和caspase-9，从而诱导NSCLC细胞凋亡（图2）。EGCG还通过下调Axl和Tyro 3的表达抑制顺铂耐药肺癌细胞的增殖。此外，EGCG可以通过抑制hsa-miR-98-5p的表达并进一步上调p53，增强顺铂对NSCLC细胞的治疗效果。 2.5. 抑制血管生成 EGCG显著抑制了semaxanib诱导的内皮素过度表达，并抑制了肿瘤血管生成，为解决对抗VEGF疗法的抗性提供了新策略。EGCG治疗导致微血管密度、微血管周细胞覆盖指数和胶原IV表达降低；血管灌注和通透性的短暂增加；间质液压力和缺氧降低。在顺铂诱导的血管正常化期间共同给予顺铂，显著降低了在肿瘤组织中诱导效果所需的顺铂药物浓度（1.8 μg/g组织对比0.8 μg/g组织，P < 0.01），并抑制了移植肺肿瘤的生长。使用聚乙二醇（PEG）偶联的EGCG（PEG-EGCG）作为载体制备的载药胶束纳米复合物（SU-MNC），也能特异性地抑制VEGF诱导的内皮细胞增殖。 2.6. 抗炎和促氧化效应 EGCG与塞来昔布联合使用，降低了胰岛癌细胞（Colo357）中IL-6、IL-8、VEGF和MMP-2的表达，并减弱了塞来昔布诱导的COX-2表达增加，减少了细胞炎症水平。这种组合在偶氮甲烷加硫酸葡聚糖钠诱导的结肠癌发生模型中也显示出类似的抗炎效应。核因子E2相关因子2（Nrf2）是一个重要的细胞保护性转录因子，在抗氧化和解毒过程中发挥关键作用。激活Nrf2-Keap1通路诱导相II酶的表达，并通过ARE信号通路阻止癌症发展。EGCG和顺铂的组合通过上调Nrf2/HO-1表达增强了凋亡，从而抑制了宫颈癌和乳腺癌的发展。此外，EGCG和顺铂的组合可以促进各种卵巢癌细胞系中H2O2的表达，加剧氧化应激以放大顺铂的毒性，从而抑制卵巢癌细胞的生长。 3.减少化疗副作用  长期化疗药物的使用除了药物抗性外，还可能导致某些有毒副作用（如胃肠疾病、心脏毒性、肾毒性、耳毒性、神经毒性等），从而限制了药物的有效性和治疗效果。EGCG不仅作为出色的辅助化疗增强剂，而且在减少化疗药物用量和增强抗肿瘤治疗效果的同时，减轻了化疗药物引起的有毒副作用。 3.1. 胃肠疾病 化疗引起恶心、呕吐、食欲减退等副作用，主要是由于药物或辐射对胃肠道细胞的损伤，导致胃肠道粘膜炎症。EGCG通过减少氧化损伤，改善了小鼠中伊立替康引起的胃肠副作用。接受同期放疗的不可切除III期NSCLC患者经常发生食管炎，这可能导致治疗中断并影响肿瘤治疗。在一项包括24名AJCC IIIA（6名）和IIIB（18名）期患者的研究中，化疗（顺铂和依托泊苷）与放疗（中位剂量64 Gy）同时进行。经过EGCG治疗（平均治疗持续时间34.8天，建议EGCG浓度440 μmol/L），在24名患者中有22名观察到食管炎显著回归至0/1级。 3.2.心脏毒性 阿霉素诱导的活性氧物种产生是心肌病的主要原因，也是限制其临床使用的主要副作用[68,69]。EGCG可以通过靶向结合抑制CBR1活性，进一步减少DOX的乙醇代谢产物DOXOL的产生，并减少DOXOL在心肌细胞中的损伤。EGCG还通过清除活性氧（ROS）和增强心肌细胞中Ca2+瞬态的幅度来减轻DOX诱导的心脏毒性。EGCG和DOX的联合给药显著抑制了肿瘤生长，同时减少了心肌Ca2+超载和乳酸脱氢酶释放，减轻了心肌细胞凋亡，从而降低了DOX的心脏毒性。与DOX和EGCG共载的多离子复合胶束增强了联合药物的稳定性，胶束核心中的EGCG除了抑制P-gp表达和逆转癌细胞的多药耐药性外，还保护心肌细胞免受DOX介导的心脏毒性。 3.3.肾毒性 顺铂诱导的肾毒性与肾脏中氧化应激和炎症细胞因子的增加有关。Nrf2和HO-1表达水平降低，顺铂处理的大鼠中NF-κB和4-羟基壬醛水平显著增加。EGCG逆转了这些顺铂介导的变化，并增强了肾脏抗氧化酶（过氧化氢酶、超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶）和谷胱甘肽的活性，从而减少肾脏氧化应激和炎症反应，并改善顺铂诱导的肾毒性。另一方面，EGCG减轻了顺铂诱导的线粒体氧化/硝化应激、线粒体电子传递链活性和线粒体抗氧化防御酶活性的线粒体损伤，并减少了肾小管细胞中线粒体ROS的产生，而PAS染色显示EGCG改善了顺铂诱导的肾脏结构损伤，如小管扩张、小管形成、颗粒空泡变性和小管细胞坏死。EGCG和CoQ10的多剂量组合也通过改善肾脏氧化/硝化状态、炎症和凋亡减轻了顺铂介导的肾毒性的发展。 3.4.耳毒性 除了肾毒性外，耳毒性是限制顺铂在临床实践中进一步使用的另一种有毒副作用。顺铂的耳毒性基于对耳蜗外毛细胞、螺旋神经节和血管纹的损害，包括不仅由药物本身引起的内外部环境的变化，还包括其激活caspase途径引起的凋亡。在大鼠中口服EGCG减轻了顺铂诱导的听力损失，减少了耳蜗基底区外毛细胞的丢失，并减少了氧化应激和凋亡标志物。它还保护了与内毛细胞相关的血管纹和螺旋韧带中的Na+/K+腺苷三磷酸酶（ATPase）α1的丢失以及与丝带突触相关的。体外研究发现，顺铂通过ROS/MAPK途径激活STAT1，降低磷酸化STAT3水平并减少p-STAT3/p-STAT1水平，从而诱导耳蜗炎症和凋亡。相比之下，EGCG通过抑制STAT1表达和保护p-STAT3，增加p-STAT3/p-STAT1比例，并调节bcl-2等促生存因子的表达，促进耳蜗细胞存活。 3.5.神经毒性 神经毒性通常与使用基于铂的药物、长春碱和紫杉醇类药物有关。EGCG对大鼠顺铂诱导的神经毒性的保护机制包括下调炎症因子TNF-α和IL-6的表达以减少大脑皮层的炎症负荷；激活抗氧化Nrf2/HO-1通路以减少NF-κB表达；下调与凋亡相关的蛋白Bax和caspase-3并增加抗凋亡因子Bcl-2的表达以减少大脑皮层的凋亡；最后，上调脑源性神经营养因子和乙酰胆碱酯酶并抑制乙酰胆碱表达以保护大脑皮层免受顺铂诱导的神经化学紊乱。 3.6.肺纤维化 博来霉素是一种诱导DNA损伤的化疗药物，长期使用可能导致肺纤维化的发展。EGCG显著下调了博来霉素诱导的炎症因子NF-κB、TNF-α和IL-1β的表达水平，增加了抗氧化调节因子Nrf2的表达，并促进了体内氧化还原动态平衡，同时减少羟脯氨酸和胶原蛋白的合成和积累，从而改善了博来霉素诱导的肺纤维化。另一方面，EGCG还促进了博来霉素诱导的糖结合物恢复正常水平，并增加了基质降解溶酶体酶的活性。电子显微镜的超微结构观察还发现EGCG促进了肺泡II型细胞的空泡化和核收缩，并减少了胶原蛋白沉积。 4.辅助化疗的限制  尽管EGCG已经显示出与化疗药物的强烈辅助作用，增强了化疗效果，但EGCG和某些化疗药物也存在一定的拮抗作用，降低了化疗效果。硼替佐米是一种用于治疗多发性骨髓瘤的临床蛋白酶体抑制剂。由于硼替佐米的硼酸成分可以与EGCG的儿茶酚反应形成环状硼酸酯（图4），EGCG与硼酸基抗癌药物如硼替佐米的组合可能导致药物失活。由于它们的共同特征，任何含有儿茶酚或间苯二酚结构的化合物都不应与硼酸基药物同时服用。在EGCG与舒尼替尼联合使用的研究中，口服EGCG也被发现降低了舒尼替尼的生物利用度。EGCG还被报道通过减少丁酸诱导的癌细胞分化，降低了丁酸对结肠癌细胞的治疗效果。因此，需要进一步研究EGCG与不同化疗药物之间的相互作用，并确定临床上合适的组合治疗策略。 图4. 硼替佐米与 EGCG 的相互作用。A). 硼替佐米和 EGCG 的化学结构。B). 硼替佐米与 EGCG 的结合模式。C). 在酸性条件下，硼替佐米、EGCG 和 Fe3+ 纳米材料可以重新释放。 EGCG的口服生物利用度低也是限制其进一步应用的原因之一。大多数细胞实验中使用的EGCG浓度为10-100 μM，而口服3克脱咖啡因绿茶后的最大血药浓度(Cmax)为0.7 μM，增加剂量至4.5克并未显著增加Cmax值，表明存在饱和现象。在大多数研究中，EGCG只有在动物或人类胃消化后达到20-100 μM或更高浓度时才有效。例如，在前列腺癌患者的临床试验中，患者在手术前3-6周服用EGCG（800毫克/天），结果显示组织中无法检测到EGCG的存在。因此，如果要在临床试验中观察到体外实验的结果，就需要考虑儿茶素的生物利用度。这是因为EGCG在口服给药能达到的低生理浓度下的生理效应将非常有限。特别重要的是提高EGCG的稳定性和生物利用度。 5.纳米改性增强化疗效果  近年来，微囊化和纳米囊化技术作为提高EGCG稳定性和生物利用度的技术手段受到了广泛关注[87]。EGCG与化疗药物结合，通过纳米材料包封的组合药物的缓慢释放和靶向研究已经相当深入（表2）。EGCG与化疗药物的纳米改性不仅发挥其自身的抗肿瘤效应，减轻化疗的有毒副作用，还通过引入纳米材料增强了组合物的稳定性，减缓释放，并增强了药物动力学参数。它还具有低毒性、肿瘤靶向和定位成像能力的优势（图5）。其中，EGCG与DOX的组合是研究最深入的儿茶素相关二元组合策略。 图5. 包裹化疗药物和 EGCG 的纳米材料的多重有益效应 5.1.聚合物纳米粒子 通过抗乳腺癌药物赫赛汀与EGCG和PEG的自组装形成的胶束纳米复合物Herceptin-MNC，在肿瘤中的积累比游离赫赛汀多2.3倍，赫赛汀-MNC的血液半衰期比后者高29倍，而赫赛汀-MNC在肝脏、肾脏和肺部的积累速率比游离赫赛汀低1倍，表明基于EGCG的组合疗法比单一化疗药物具有更好的抗癌效果。使用PEG偶联的EGCG（PEG-EGCG）作为载体形成SU-MNCs，与口服/静脉注射舒尼替尼相比，在人类肾细胞癌异种移植小鼠中产生了更强的抗癌效果（更强的抗血管生成、诱导凋亡和抑制肿瘤增殖效果）和更低的毒性（图5）。DOX和EGCG之间的高效相互作用在PEG-EGCG胶束纳米复合物中实现了DOX的88%药物载荷，提高了DOX的循环稳定性和肿瘤靶向性，同时减少了DOX剂量依赖性副作用。 海藻酸具有对P选择素的强亲和力，诱导凋亡并抑制癌细胞增殖；透明质酸（HA）通过范德华力和氢键与癌细胞膜表面糖蛋白CD44结合。d-α-生育酚PEG琥珀酸酯（TPGS）通过阻断ATP结合位点并防止P-gp ATPase水解ATP来抑制ATPase活性。使用上述三种组分装载EGCG和DOX的纳米药物靶向胃癌治疗，比EGCG/DOX组合疗法显示出更好的抗肿瘤效果。装载EGCG/DOX的NPs的IC50为200/4 mg/L，是EGCG/DOX组合溶液（400/8 mg/L）的一半，纳米药物中DOX的细胞摄取率为60.42% ± 1.56%，远大于裸药中Dox的摄取率（28.62% ± 0.97%）。然而，将EGCG和多西他赛封装在TPGS偶联的透明质酸和海藻酸基纳米粒子中，纳米粒子通过靶向识别CD44和P选择素配体内化进入前列腺癌细胞，诱导G2/M期细胞周期停滞。进一步研究表明，纳米粒子比EGCG和多西他赛的组合显著更多地抑制肿瘤生长（53%对比31%），并且对非靶向器官无毒性。由HA-EGCG/顺铂偶联制成的胶束纳米复合物，其中HA暴露在表面，有效地传递到过度表达CD44的癌细胞，增加了纳米复合物在卵巢癌中的积累并延长了血液循环时间。通过铂纳米粒子和EGCG的pH可逆硼酸酯反应制备的基于酚的肿瘤渗透纳米框架（EGPt-NF），不仅诱导肿瘤细胞的免疫原性死亡和缓解肿瘤缺氧，还有效促进了树突细胞的成熟并下调癌细胞中的PD-L1，从而显著抑制了小鼠肿瘤的生长和转移。 光热疗法在控制药物释放、减少多药耐药和提高疗效方面具有很高的应用潜力，是抗癌治疗的有希望的策略。由叶酸（FA）、多巴胺（DPA）、DOX和EGCG开发的双重药物输送系统DOX-EGCG/DPA-FA NPs，在近红外光（NIR）组中DOX的细胞摄取率是游离DOX组和无NIR照射的对照组的三到六倍。DOX-EGCG/DPA-FA NPs通过抑制肿瘤生长和血管生成，增强乳腺癌细胞中的凋亡和坏死，提高了60%的乳腺癌小鼠存活70天以上，从而提高了治疗效果。由氧化铁、靛青绿和葡萄糖氧化酶合成的磁性光热剂（ICGOx@IO）装载了DOX和EGCG，最终开发了纳米药物ICGOx@IO-Dox-EGCG-PPP，结合化学-光热-饥饿疗法几乎消除了小鼠的肿瘤，并显著减少了Dox诱导的心脏毒性。 5.2.金属纳米粒子 甲氨蝶呤（MTX）和DOX与含有EGCG的花状金纳米簇通过半胱氨酸桥结合，形成了有效的药物输送系统（Au-Cys-MTX/DOX NCs），纳米复合物在体外和体内都显示出良好的抗肿瘤活性，因为MTX的引入为纳米药物提供了良好的靶向。由EGCG、铁离子和DOX自组装而成的纳米粒子与单独的DOX相比，肿瘤体积减少了66%，转移结节减少了73.7%，表明药物输送系统显著抑制了肿瘤的生长和转移，而铁离子作为磁共振成像（MRI）的优秀对比剂，为药物输送系统的准确定位提供了潜力。 使用Fe3+与多酚的配位将DOX和EGCG自组装成FDEP NPs，增加了药物在血液中的循环时间和其在肿瘤内的积累。FDEP NPs的循环半衰期是单独DOX的36倍以上。FDEP30 NPs对小鼠肿瘤形成的肿瘤生长抑制率为74.38%，显著高于DOX + EGCG（44.13%）。末端脱氧核糖核酸转移酶dUTP缺口末端标记（TUNEL）对肿瘤切片的染色显示，FDEP30 NPs和DOX + EGCG的凋亡/坏死率分别为45.06%和27.9%。有趣的是，FDEP NPs在显著降低CBR1活性、减轻DOXOL产生和随后的心脏毒性的同时，抑制了肿瘤生长并促进了凋亡。 包括DOX、EGCG、Fe3+和HA的自组装纳米反应器，可以穿透血脑屏障靶向胶质母细胞瘤并抑制肿瘤生长，从而延长了携带肿瘤的小鼠的生存时间。尽管以前的研究报告称EGCG可以与硼替佐米复合以抵消后者的抗肿瘤效应，但最近的研究显示这种拮抗效应可以通过纳米技术逆转。由EGCG、硼替佐米和Fe3+组成的纳米药物可以促进纳米粒子在肿瘤部位的释放，由于肿瘤微环境的弱酸性，具有低毒性和肿瘤定位功能，并最终显著抑制了MDA-MB-231细胞携带肿瘤的小鼠的肿瘤生长（图4）。 由EGCG与5-羟基多巴胺修饰的顺铂(IV)前药(Pt–OH)、含多酚链段的嵌段共聚物(PEG-b-PPOH)复合制备的有机纳米治疗药物(PTCG NPs)，设计用于使纳米粒子聚乙二醇化，从而延长纳米粒子的循环时间，抑制蛋白吸附，并增强所获纳米药物在肿瘤中的积累（图5）。由于Fe3+与多酚基团之间的强配位作用，PTCG NPs中Pt–OH和EGCG的载药比例可以精确调节至治疗水平，从而实现协同效应。此外，纳米粒子可以掺杂钆离子(Gd3+)，借助MRI功能监测纳米药物的递送和释放行为，赋予纳米药物诊断能力。在低pH环境下，活性药物通过亚胺连接键的断裂和Pt–OH激活为顺铂，在HepG2细胞内化后有效释放。生成的顺铂通过级联反应提高细胞内H2O2水平，由Fe3+催化产生有毒的活性氧(ROS)，从而通过化学动力疗法增强疗效。 5.3.其他类型的纳米粒子 通过将生物相容性的介孔硅纳米粒子与天然多酚涂层结合，并装载抗肿瘤药物DOX，开发的给药系统MSN-Dox@EGCg-Apt，旨在在酸性环境或细胞内GSH的刺激下向肿瘤病灶释放药物；该系统允许实时荧光追踪，对正常细胞无毒，即使在500 μg/mL的高浓度下也不影响CEM、Ramos和K562细胞的活性。在PLGA-酪蛋白核壳中包裹紫杉醇与EGCG的纳米药物表现出比游离紫杉醇更长的循环时间、更好的可用性，并且没有器官毒性。该纳米药物降低了紫杉醇诱导的P-gp表达，增加了对紫杉醇耐药的MDA-MB-231细胞的紫杉醇敏感性，诱导凋亡，抑制NF-κB激活，并下调与血管生成、肿瘤转移和存活相关的关键基因。多酚胶体球(CSs)是由EGCG在水溶液中分子凝聚自组装而成，但在有机溶剂中分解并在水溶液中重新组装。重新组装的CSs/DOX的最大包封率和载药率达到90%和44%，该纳米药物可以逆转肿瘤细胞的耐药性，增强对乳腺癌的治疗效果。重要的是，单次生产运行产生了37.3克多酚CSs，为重组纳米药物的规模化应用奠定了基础。基于EGCG和熊果酸的纳米载体系统可以靶向EpCAM释放至肝细胞癌，可以增加CD4+和CD8+ T细胞的激活及其在肿瘤组织中的免疫浸润，从而产生显著的协同抗肿瘤治疗效果。 总之，EGCG和化疗药物的纳米化可以显著增强抗肿瘤治疗的效果，但在考虑EGCG和化疗药物的纳米组装时，需要精心设计纳米药物的形状、大小和靶向策略。形状和大小是纳米粒子的重要参数，球形颗粒最为常见。直径大于5 μm的颗粒在静脉注射后会引起肺部毛细血管栓塞。直径大于0.2 μm的颗粒不能通过过滤方法进行灭菌。网状内皮系统更快地清除大颗粒，并且不能通过血管外渗逃离血管系统。直径小于5 nm的颗粒可以被肾脏过滤迅速清除。纳米药物的靶向策略包括主动靶向和被动靶向。被动靶向在很大程度上依赖于肿瘤生物学(血管和渗漏性)和药物载体属性(循环时间、孔隙性和大小)。而主动靶向依赖于配体-受体结合，这提高了对目标部位的选择性积累。例如，可以向纳米粒子中添加HA或FA，以增强纳米药物的靶向，利用肿瘤细胞中CD44和叶酸受体的高表达。此外，向纳米粒子中添加金属离子(Fe3+, Gd3+)可以使纳米药物的递送和释放通过MRI检测。尽管基于EGCG和化疗药物的纳米药物很有前景，但目前还缺乏体内安全性研究，大多数现有研究集中在细胞和小鼠实验上。这些实验结果是否能够在临床环境中复制还有待进一步探索。纳米材料的质量稳定性和储存条件也需要进一步研究。 6.结论和未来展望  体外和体内实验表明，EGCG可以与多种化疗药物（如5-FU、顺铂、多柔比星、紫杉醇和他莫昔芬）联合使用，增强抗肿瘤治疗效果。这些作用机制包括减少CSCs的药物抗性、增强药物敏感性、诱导细胞周期停滞和凋亡、减少细胞自噬调节、阻断血管生成以抑制癌细胞侵袭和转移、抑制炎症和调节氧化应激。此外，EGCG可以减少化疗药物引起的胃肠疾病、心脏毒性、肾毒性、耳毒性、神经毒性和肺纤维化的发生率。但需要注意的是，EGCG可以与某些化疗药物（硼替佐米和舒尼替尼）结合，降低化疗效果。尽管EGCG可以通过多种方式增强化疗药物的治疗效应，但目前对EGCG的作用机制和进一步的药物学优化研究还不足。此外，由于基本上没有研究报告EGCG和化疗药物在临床治疗中一起使用，EGCG辅助化疗的概念应该在可能性/展望和临床验证方面得到更多关注。同时，考虑到EGCG的生物利用度低，我们探索了将纳米技术应用于EGCG化疗药物策略以增强化疗效果的可能性。共载EGCG和化疗药物的纳米粒子增强了药物的药代动力学和循环时间，增加了肿瘤细胞中药物的浓度，显著抑制了肿瘤的生长和转移，对非靶向器官表现出低毒性，并最终显著延长了小鼠的生存时间。总之，EGCG是化疗的良好辅助剂；利用纳米技术双重载药EGCG和化疗药物进行靶向肿瘤治疗，提高了EGCG的临床应用价值，突出了EGCG治疗策略作为有前景的研究方向。

首先，引用 CDE 于 2021 年发布的《体重控制药物临床试验技术指导原则》中几个“人人自危”且“难以言说”的术语和指标吧！ 超重和肥胖的判定标准 体重指数（BMI） BMI = 体重（kg）/ 身高²（m²），用于判定超重和肥胖的标准 中国标准：24 kg/m² ≤ BMI ＜ 28 kg/m²为超重，BMI ≥ 28 kg/m²为肥胖 当 BMI ≥ 24 kg/m²且有合并症或 BMI ≥ 28 kg/m²不论是否有合并症，经过 3-6 个月调整仍不能减重 5%，可考虑药物治疗 腰围（WC） 中心型肥胖是指脂肪主要在腹壁和腹腔内沉积过多 中国标准：男性腰围≥90 cm，女性腰围≥85 cm为中心型肥胖 腰围与内脏脂肪含量相关，是代谢异常风险的独立预测因素 在前期文章（《减脂保肌，INHBE有态度，KBI有招数》点击查看原文）中，鼎泰团队具体介绍了 INHBE siRNA 的独特优势、INHBE 的生物学背景和种属同源性、鼎泰集团旗下子公司昆明科灵（KBI）非人灵长类肥胖模型和药效学研究平台。本期文章将聚焦与肥胖相关的另一个潜力靶点 —— ALK7（Activin receptor-like kinase 7）的相关生物学信息，并学习以 ALK7 为靶点、脂肪组织递送的 siRNA ARO-ALK7 的临床前概念验证数据、未来的临床研究规划及 TRiMTM 肝外递送技术平台（实现骨骼肌、脂肪等组织的靶向递送）。期待为助力该类药物更高效地实现临床转化和推动产品上市提供借鉴和启示。 肥胖，是个问题 根据 WHO 公开资料，2022 年有 25 亿 18 岁及以上的成年人超重，其中超过 8.9 亿成年人患有肥胖症。 2021 年 CDE 发布的《体重控制药物临床试验技术指导原则》中指出，超重和肥胖是由多因素引起的慢性代谢性疾病，特征为体内脂肪过度蓄积。超重和肥胖显著增加心脑血管、呼吸、内分泌等多种系统疾病的风险，严重影响生活质量。生活方式的改善是体重管理的首要手段，但对于无法通过这种方式获得满意效果的患者，药物治疗也是一种选择。我国肥胖患者数量显著增加，成年居民中超重或肥胖的比例超过 50%，6-17 岁和 6 岁以下儿童的超重/肥胖率分别达到 19% 和 10.4%。本指南的主要内容包括：早期探索性研究（药代动力学、药物相互作用、探索性研究），确证性临床试验及安全性和特殊人群考虑等。 GLP-1 激动剂在减重方面表现出色，曾一度被认为是体重管理的救命稻草。这类药物存在停药反弹、肌肉流失等问题（点击查看《减脂保肌，INHBE 有态度，KBI 有招数》）。因此，众多药企纷纷布局新机制药物，寻求减脂不减肌、不反弹的减肥药物。 2024 年 8 月14 日 Arrowhead Pharmaceuticals 于美国东部时间下午 2:00 举办了肥胖/代谢研发网络研讨会，会议议程包括： ◆ 介绍两款基于 RNAi 用于治疗肥胖和代谢疾病的候选药物 —— ARO-INHBE（点击查看《减脂保肌，INHBE 有态度，KBI 有招数》）和ARO-ALK7 ◆ 初步非临床研究结果：ARO-INHBE 和 ARO-ALK7 可通过新的机制改善对肌肉质量的影响，有望克服 GLP-1 激动剂的不足 ◆ 介绍 ARO-ALK7 的初步临床研究计划 ◆ 介绍 Arrowhead 的 TRiMTM 脂肪组织递送平台 PASADENA, Calif.–(BUSINESS WIRE)–Aug. 14, 2024–Arrowhead Pharmaceuticals, Inc. (NASDAQ: ARWR) today presented preclinical data and detailed its plans to advance two next generation RNAi-based candidates, ARO-INHBE and ARO-ALK7, into upcoming clinical studies for the treatment of obesity and metabolic diseases. In preclinical studies to date, these candidates demonstrated the potential to reduce body weight and fat mass with a novel mechanism of action that may lead to improved preservation of lean muscle mass compared to currently approved obesity therapies. Arrowhead plans to submit clinical trial applications with regulatory authorities for both programs by the end of 2024 with the goal of initiating clinical studies in volunteers with obesity in early 2025. 全文共：13996 字 54 图 预计阅读时长：35 分钟 ★ 目录 ★ 1 肥胖是怎样产生的？—— 脂肪代谢障碍 2 肥胖症治疗现状—— GLP-1 激动剂的局限性 3 脂肪代谢管家 ALK7—— ALK7 的生物学背景和种属同源性 4 肥胖治疗，夜空中最亮的星—— ARO-ALK7 临床前概念验证数据 5 未来展望 —— ARO-ALK7 临床概念验证计划 6 TRiMTM Platform—— 脂肪组织递送系统 7 影像学小蛮腰 —— 鼎泰 KBI 非人灵长类肥胖动物模型和药效学平台 1 肥胖是怎样产生的？ 脂肪代谢障碍 脂肪组织（adipose tissue）是身体重要的内分泌器官，能够产生和分泌多种脂肪因子（adipokines），调节众多生理功能。 脂肪组织功能障碍（adipose dysfunction），可能导致脂肪因子的失衡，从而引发脂质代谢异常，并与多种代谢性疾病密切相关，包括：肥胖、II型糖尿病、脂质代谢异常、炎症性疾病、心血管疾病和癌症等。 在肥胖状态下，脂肪组织的扩张（expansion）和功能改变可能导致炎症反应和胰岛素抵抗，进一步加剧了脂质代谢的失调。因此，脂质代谢异常不仅是肥胖的结果，也是其发展的重要因素。通过对脂肪组织生物学和基础功能的研究，可以为肥胖及相关代谢疾病的治疗提供新的思路和策略。 ■ 脂肪组织（AT）细胞有三种主要类型 ● 位于白色脂肪组织（WAT）中的白色脂肪细胞，占脂肪质量 >95%。白色脂肪细胞具有大的单目脂滴（unilocular lipid droplets），是肥胖患者 AT 扩张的主要原因 ● 棕色脂肪组织（BAT）内的棕色脂肪细胞，占脂肪的 1-2% ● 米色脂肪细胞，散布在 WAT 内，可在寒冷暴露或肾上腺素刺激下转化为棕色样脂肪细胞 ■ 热量过剩和代谢应激可导致 AT 不健康扩张 ● 脂肪生成减少、脂肪细胞肥大增加、免疫细胞浸润增加、慢性轻度炎症和胰岛素敏感性降低 ● 脂肪细胞功能障碍导致脂肪因子分泌失衡（图1），促炎性促糖尿病脂肪因子（红点）分泌增加，抗炎性抗糖尿病脂肪因子（绿点）分泌减少 ● 干扰 AT 与脂肪因子效应器官（如胰腺β细胞、肝脏和心脏）的生理信号传递（physiological communication） 图 1. 肥胖状态下的脂肪组织功能障碍[1] 通过对脂肪组织功能的深入研究，可以为肥胖及相关代谢疾病的治疗提供新的思路和策略。 2 肥胖症治疗现状 GLP-1 激动剂的局限性 肥胖症的治疗方式包括生活方式干预、药物治疗、手术治疗、心理支持以及新兴技术应用等多种方法，目的是通过综合手段实现长期有效的体重管理。 ■ GLP-1 激动剂仍需要长期用药 FDA 已批准了多种 GLP-1 激动剂用于肥胖治疗（表1）。 根据文献报道，患者在停用 Semaglutide（皮下注射，2.4 mg/week）以及采取生活方式干预治疗 1 年后体重会快速反弹（图2）。该研究结果提示，肥胖症长期性治疗面临的挑战。 表 1. 美国食品和药物管理局批准的抗肥胖药物[4] 图 2.  Semaglutide 停药后体重迅速反弹[2] ■ 急需新的作用机制的治疗药物 GLP-1 激动剂依从性也存在挑战，在治疗的第一年，依从率为 27.2%。同时，依从性也因产品而异，每周注射产品的依从性最高，每日注射和口服的依从性最低（图3）。因此，急需新的作用机制的治疗药物。 未来的肥胖治疗应该更加关注改善整体健康状况，而不仅仅是体重的减轻。同时，需要针对不同亚型的肥胖采取个体化的治疗方案，以取得更好的疗效。 图 3. GLP-1 激动剂用药 1 年 Kaplan-Meier 疗效分析（n=4066）[3] 3 脂肪代谢管家 ALK7 ALK7 的生物学背景和种属同源性 ■ ALK7（ACVR1C）的基本信息[5][10] 激活素受体样激酶 7（ALK7），又名 ACVR1C，是一种Ⅰ型转化生长因子 β（TGF-β）受体，在维持代谢平衡中发挥重要作用。 ● TGF-β 超家族 TGF-β 超家族由超过 35 个配体和 12 个受体组成。TGF-β 配体包括 TGF-β 1~3，激活素（activins）A、B 和抑制素（inhibins），十几种生长/分化因子 （growth/differentiation factors，GDF）、骨形成蛋白 （bone morphogenetic proteins，BMP） 和 Nodal 蛋白。 ● TGF-β 受体类型 分为两类，即 I 型和 II 型受体，均为跨膜激酶。在没有配体的情况下，可以单体、同源二聚体或/和异二聚体的形式存在于细胞表面。在哺乳动物中，已知 7 种 I 型 受体（ACVRL1/ALK1、ACVR1/ALK2、BMPR1A/ALK3、ACVR1B/ALK4、TGFBR1/ALK5、BMPR1B/ALK6 和 ACVR1C/ALK7）， 在C 末端具有 Ser-Thr 激酶部分、柔性近膜结构域（flexible juxtamembrane domain）和相对较短的细胞外结构域。和 5 种 II 型 受体（TGFBR2、ACVR2A、ACVR2B、BMPR2 和 AMHR2）。 ● TGF-β 受体复合物 TGF-β 超家族配体的受体是四聚体复合物，分别由 I 型和 II 型亚基的两个同型二聚体组成，一些 I 型亚基也可以形成异源二聚体。大多数 I 型受体对配体只有中等亲和力，需要与更大的 II 型亚基结合才能实现有效的配体结合和信号传导。 ● ALK7（ACVR1C）受体复合物及其配体 ALK7 与 II 型受体 ActRIIB（ACVR2B）一起发挥作用，可被激活的 ALK4 的相同配体激活，特别是激活素B、GDF1、GDF3 和Nodal。然而，尽管GDF11和GDF8（Myostatin，MSTN；肌肉生长抑制素）也能与 ALK7 相互作用，但它们更倾向于与 ALK5 结合。 此外，文献报道 GDF15 通过 ALK7 激活 SMAD2 和 SMAD3 信号通路，改善炎症诱导的胰岛素抵抗[6]。其他研究表明，ActE（INHBE 编码）是一种 ALK7 特异性配体[7]。 图 4. TGFβ 家族受体和配体[10] ■ ALK7（ACVR1C）的结构和表达 ALK7（ACVR1C）在结构上属于单次跨膜蛋白，不同组织中表达水平变化较大，但在白色和棕色脂肪组织中表达水平最高。 图 5. ALK7 在脂肪细胞中高表达 （Arrowhead TIDES 2024 Adipose） ■ ALK7（ACVR1C）基因变异和腰臀比的关系 根据文献，研究人员对超过 400,000 人的基因变异（genetic variants）进行分析，以鉴别与较低的经身体质量指数（BMI）调整后的腰围/臀围比例（waist-to-hip ratio adjusted for BMI，WHRadjBMI）相关的变异，并进一步验证这些变异是否也与 II 型糖尿病的风险相关。 结果表明，预测导致 ACVR1C 基因功能丧失的变异会影响体脂分布并降低 II 型糖尿病的风险。ACVR1C 中的四个变异与较低的 WHRadjBMI 相关，并且这些变异携带者患II型糖尿病的风险降低了 30%。 ACVR1C 基因中的四个特定变异体（Asn150His, Ile195Thr, Ile482Val 和 rs72927479）对腹部脂肪分布和腰臀比（WHRadjBMI）有显著影响。图6展示了 UK Biobank 中 4,215 名参与者进行 DEXA 扫描后，腹部脂肪百分比（腹部脂肪占总身体脂肪的比例）与 ACVR1C 基因四个变异体之间的关系。结果表明，携带更多 ACVR1C 变异体的人群具有较低的腹部脂肪百分比。图7表明这四个变异与较低的 WHRadjBMI 相关。 图 6. ACVR1C 基因四个变异体与腹部脂肪百分比 图 7. ACVR1C 基因中的四个变异与腰臀比（WHRadjBMI）的关系[8] ■ ALK7 调节脂肪组织脂肪分解分子机制 当 ALK7 与其配体结合后，通过激活 Smad 蛋白 2、3、4 来传递信号。Smad3 和 Smad4 能够与 CCAAT/增强子结合蛋白（C/EBP）家族成员相互作用，抑制其转录激活功能。C/EBP 蛋白是脂肪生成和脂肪细胞分化的重要调控因子，主要通过调控 PPARγ 的表达来实现。同时，C/EBPα 和 PPARγ 共同控制脂肪分解关键酶（如 ATGL 和 HSL）的表达。此外，PPARγ 还能上调 ALK7 的表达。 另一方面， ALK7 与配体结合后，可通过 β3-肾上腺素能受体（β3-AR）调节儿茶酚胺敏感性：通过抑制 β3-AR 表达和信号传导，使脂肪细胞对儿茶酚胺产生抵抗性。 图 8. BAT 中 ALK7 在与脂肪分解代谢调节有关的信号通路中的作用[10]  注：ATGL-adipose triglyceride lipase；HSL-hormone sensitive lipase；PPARγ-Peroxisome proliferator-activated receptor γ  ■ ALK7 mAb 对 ALK7 受体信号通路的干扰 根据文献[7]，在遗传性肥胖小鼠（TSOD）和高脂饮食诱导的肥胖小鼠模型中，ALK7 mAb 治疗能显著减少肥胖，并改善葡萄糖耐量异常和胰岛素抵抗；此外，ALK7 mAb 通过抑制脂肪细胞中 S100A8/A9 和下游脂肪组织巨噬细胞（ATM）中 IL-1β 的产生来下调 ATM 中的 GDF3（图9）。这些发现支持以 ALK7 为潜在靶点治疗肥胖和糖尿病的可行性。 图 9. ALK7 mAb 作用于 ALK7 受体信号通路[9] （ATM 释放的 GDF3 结合 ALK7 并诱导脂肪细胞产生 S100A8/A9 蛋白，进而激活 NLRP3 并促进成熟 IL-1β 从 ATM 中释放，细胞自主增加 ATM 中 GDF3 的表达和释放，并进一步激活脂肪细胞中 ALK7 介导的通路以促进肥胖。） ■ 不同种属间 ALK7 的同源性 根据 NCBI BLAST 氨基酸序列比对，人和小鼠、大鼠、犬、食蟹猴和恒河猴 ALK7 的同源性（Identities）分别为 95%、95%、92%、99% 和 99%，与人的同源性最高的是猴。 以上信息有助于了解靶向 ALK7 的 siRNA 的相关种属。 图 10. ALK7 蛋白结构 4 肥胖治疗，夜空中最亮的星 ARO-ALK7 临床前概念验证数据 ■ 脂肪组织递送 如前文所述，ALK7 主要在脂肪组织中表达，可借助 TRiMTM 递送技术（详见 06 TRiMTM Platform）实现向脂肪组织的靶向递送和对脂肪组织中靶基因的敲降。 图 11. 实现组织靶向递送的 TRiM™ 平台及技术特点 （Arrowhead TIDES 2024 Adipose） ■ 基于脂肪组织递送的 ARO-ALK7 的临床前概念验证 在临床前研究中，ALK7 siRNA 显示出显著的体重减轻和代谢指标改善的效果。在高脂饮食诱导的肥胖小鼠模型中，ALK7 siRNA 治疗组的体重（BW）增加显著低于对照组；脂肪质量（fat mass）减少，瘦体重（lean mass）保持稳定（图12）。 体重：与高脂肪饮食组相比，以 SC 给药（3 mg/kg）后小鼠 BW 增加减少 39%（图13） ARO-ALK7 基因沉默效率：在DIO模型中，腹股沟白色脂肪组织（iWAT）中 ALK7 mRNA 的沉默效率达 80%，性腺周围白色脂肪组织（pgWAT）中约为 40%（图13） ARO-ALK7 基因沉默持久性：NHP 模型中，可有效、持久、剂量依赖性地沉默 Lean NHP 中脂肪组织中 ALK7 mRNA（图18） 图 12. 脂肪组织 ALK7 敲除后小鼠体重增加和脂肪质量减少、瘦体重不变（Arrowhead R&D Webinar） 图 13. DIO 小鼠模型中沉默脂肪组织中 ALK7 可减少体重增加 （Arrowhead R&D Webinar） 图 14. DIO 小鼠模型中沉默脂肪组织中 ALK7 可降低脂肪质量并保留瘦体重（Arrowhead R&D Webinar） 图 15. DIO 小鼠模型中沉默脂肪组织中 ALK7 可增强对儿茶酚胺的敏感性并增加脂肪动员和氧化（Arrowhead R&D Webinar） 图 16. DIO 小鼠模型中沉默脂肪组织在 ALK7 可增强脂肪动员并减少肝脏脂肪（Arrowhead R&D Webinar） 图 17. 小鼠 DIO 模型中 ALK7 siRNA 联合替尔泊肽可提高减重效果并提高瘦体重组成（Arrowhead R&D Webinar） 图 18. ARO-ALK7 可有效、持久、剂量依赖性地沉默Lean NHP脂肪组织中 ALK7 mRNA（Arrowhead R&D Webinar） 左右滑动查看 注：DIO- Diet Induced Obesity；iWAT- Inguinal White adipose tissue；pgWAT- Inguinal white adipose tissue 5 未来展望 ARO-ALK7 临床概念验证计划 Arrowhead 研发日活动资料显示，计划于 2024 年底提交 ARO-ALK7 的临床试验申请（IND），2025 年初在肥胖志愿者中启动临床试验。拟开展的首次人体试验为在肥胖与 2 型糖尿病患者、非 2 型糖尿病志愿者开展 ARO-ALK7 的 I/IIa 期临床试验（clinictrial.gov 暂未检索到相关信息）。 根据研发日活动资料，主要研究计划如下： Part 1：随机、双盲、安慰剂对照、在肥胖志愿者中开展 ARO-ALK7 的单次给药和多次给药剂量递增试验（共给药 2 次，间隔 28 天） 图 19. ARO-ALK7 I/IIa 期临床研究计划（1） （Arrowhead R&D Webinar） Part 2：随机、双盲、安慰剂对照、评价 ARO-ALK7 单用或与 GLP-1/GIP 激动剂（Tirzepatide）联合应用的疗效 三个队列：Cohort 5A（肥胖），单用；Cohort 5B（肥胖），单用；Cohort 5C（肥胖且 T2DM），联用 Trizepatide 脂肪检测：给药前 2 次，给药后 D57、D169 各一次 ARO-ALK7 给药频率：共给药 2 次（Day1、Day29），间隔 28 天 肥胖和超重患者常常合并有其他疾病并接受相应的药物治疗（例如，与抗高血压药、降糖药、降脂药、降尿酸药等），故建议考虑与 DDI 相关的体外和/或体内试验的必要性。后续将继续关注与支持 ARO-ALK7 临床联合用药合理性相关的体内或体外试验的开展情况和研究结果，为同类产品的非临床研究提供参考。 图 20. ARO-ALK7 I/IIa 期临床研究计划（2） （Arrowhead R&D Webinar） ■ 关键终点 ▶ 安全性 ▶ 药代动力学 ▶ 探索性研究 脂肪组织中 ALK7 的表达 体重变化（千克/%） 腰围 体脂肪、脂肪分布、脂肪质量与瘦体重（MRI） 肝脏脂肪含量（MRI-PDFF） 禁食血脂和脂肪代谢参数 血糖控制参数 6 TRiMTM Platform 脂肪组织递送系统 Arrowhead 的 TRiM™ 平台利用配体介导 siRNA 的组织特异性递送。根据官方数据，TRiM™ 可实现对脂肪组织等非肝脏组织中靶基因明显的敲降（图26），对肝脏靶点（FXII）和肺靶点（RAGE）未显著敲降（图31）；此外，组织中的 siRNA 的浓度和敲降效果非正相关（图30）。 图 21. TRiM™ 平台 ■ TRiMTM 递送平台简介 根据对 Arrowhead 等公司已公开的专利信息的调研，TriMTM 递送平台可对 4 个组件进行优化： 具有序列特异性和稳定化学性质的高效 RNAi trigger 高亲和力靶向配体 各种接头和化学成分 增强药代动力学的结构 ■ TRiMTM 递送平台可能相关的专利 专利 CN 116348150 A/WO 2022/056273 A1 公开了一种包含 PK/PD 调节剂的化合物，该化合物根据式（I）（图23）进行设计，旨在将基于寡核苷酸的活性分子（如双链 RNAi）有效递送至某些特定细胞（如骨骼肌细胞、脂肪细胞）。该化合物具有特定的结构特征，包括： 连接基团 L1 和 L2 脂质 X 和 Y 基于寡核苷酸的活性分子 R 其中，L1 和 L2 中包含一定数量的 PEG 单元，X 和 Y 可以是不同类型的脂质，包括不饱和脂质、饱和脂质等。 此外，专利中还提供了多种具体化合物的结构及其在药学上可接受的盐形式。 图 22. 可能相关的发明专利：用于肝外递送的脂质 -siRNA 缀合物（CN 116348150 A，WO 2022/056273 A1） 图 23. 可能的代表性结构示例（CN 116348150 A） 左右滑动查看 图 24. 用于脂肪组织递送的脂质结构组成（部分示例） （CN 116348150 A） ■ TRiMTM 递送平台非临床研究信 ● ARO-Adiponectin：脂肪细胞分布的概念验证 小鼠给予 以 3 mpk (SC) 给药后第 15 天，采用组织染色技术确认 siRNA 在脂肪细胞中的递送及目标 mRNA 的表达情况。通过 miRNAscope 确认 ARO-Adiponectin 可悲递送至脂肪细胞；通过 RNAscope 证实脂肪细胞中 Adiponectin mRNA 水平明显降低（图25）。 图 25. 确认 TRiMTM 可实现向小鼠脂肪细胞的靶向递送和靶 mRNA 降低（Arrowhead TIDES 2024 Adipose） ● ARO-Adiponectin（lipid-siRNA）：对组织中靶基因的敲降 Adiponectin-siRNA 能够有效敲降小鼠脂肪组织中靶 mRNA 水平。 lipid-siRNA 以 1 mpk（SC）给药后第 15 天，目标基因的表达量降低了 35%；对照组（Saline）和未使用 Lipid 递送的 siRNA 组则未观察到表达量下降。以上结果提示，lipid-siRNA 可实现对脂肪组织中目标基因的敲降（图26）。 图 26. Lipid-siRNA 降低脂肪细胞特异性靶点的表达 （Arrowhead TIDES 2024 Adipose） 在小鼠中以 SC 或 IV 单次注射 2 mpk，可实现持久的 Adipoq 蛋白敲降： ◆ 皮下注射 约 90% 的血清 Adipoq 蛋白敲降，效果持续到第 6 周 至少 75% 的敲降效果持续到第 10 周 ◆ 静脉注射 约 90% 的血清Adipoq 蛋白敲降，效果持续到第 10 周 至少 75% 的敲降效果持续到第 16 周 图 27. 小鼠单次给药（SC or IV）后可维持血清中Adipoq蛋白持久敲降 （Arrowhead TIDES 2024 Adipose） ● 双脂肪递送 通过血清 Adipoq 蛋白表达、iWAT 中 Adipoq mRNA 表达检测表明：双脂质平台优于单脂质平台，双脂质平台在小鼠体内具有更高的敲除效率。 图 28. 双脂肪递送平台在小鼠体内具有更高的敲除效率 （Arrowhead TIDES 2024 Adipose） 通过检测小鼠脂肪组织中 siRNA 相对浓度，评价双脂质平台在小鼠脂肪组织中的递送效果。与单脂质平台相比，双脂质平台实现了在 iWAT、pgWAT 中 2 倍的 siRNA 递送效果。 图 29. 双脂肪递送平台可提高对小鼠不同部位脂肪组织的递送 （Arrowhead TIDES 2024 Adipose） ● 组织分布情况 小鼠以 2 mpk（IV）给药后第8天，检测组织中 siRNA 浓度。siRNA 具有广泛的全身分布的特点，肝脏中蓄积最多；进一步研究显示，较高的 siRNA 分布未造成更高的靶 mRNA 敲降（图30）。  图 30. 主要组织中的相对分布情况（Arrowhead TIDES 2024 Adipose） ● 对肝细胞和肺泡细胞中基因表达未见影响 尽管可见分布，但在其他组织中未见对靶基因的影响。在针对肝细胞特异性基因 FXII 的研究中，miRNAscope 显示大部分 siRNA 分布在非肝细胞中；在1.5 和 3 mpk 剂量下未见对 FXII 基因的敲降效果；在针对肺特异性基因 RAGE 的研究中，在 3 和 6 mpk 剂量下未见对 RAGE 基因的敲降效果（图31）。 图 31. 啮齿类动物肝细胞和肺泡细胞中未见明显的靶点敲除  （Arrowhead TIDES 2024 Adipose） 尽管在外周组织中有 siRNA 分布，对脂肪组织中靶 mRNA 的敲降作用最为显著（图32）。 图32. TRiM™ 可特异性敲降脂肪组织中靶 SOD1 mRNA 表达水平 （Arrowhead TIDES 2024 Adipose） 通过对血清 Adipoq 蛋白表达水平进行检测，评估在 NHP 中的敲降效果。结果显示，单次给药皮下（SC）与静脉（IV）注射对比，两者均能有效降低 Adipoq 蛋白表达并呈现剂量相关性（图33）。 图33. NHP 单次给药（SC或 IV），维持长时间敲降 （Arrowhead TIDES 2024 Adipose） ● 代谢和清除特点 脂质可在 24 h内被分解，预计以给药间隔 3-4 个月给药后，所有组织中约 95% 被清除。肝脏中 95% 清除时间为 9-10 周（约 2.5 个月）、肾脏中 95% 清除时间为 8-9 周（约 2 个月）、心脏中 95% 清除时间为 15-16 周（4 个月）。 图34. 双脂质 siRNA 以 3-4 个月间隔给药预计可使所有组织的清除率达到 95%（Arrowhead TIDES 2024 Adipose） ● 安全性 试验设计（大鼠） 第 1 天第 15 天 SC 给药，剂量最高可达 120mpk 第 16 天和第 29 天解剖 主要结果 未见死亡 未见明显临床观察或体重改变 血清生化、血常规和凝血功能检查结果未见显著异常 第 16 天和第 29 天，组织病理学检查未见给药相关不良影响 小结 TRiM™一种新的肝外送到脂肪组织的技术平台，在小鼠和 NHP 中实现持久的靶基因敲除 大鼠体内安全性良好 经对比分析，虽然 ALK7 和 INHBE 在调节肥胖方面的机制相似，都是通过影响脂肪细胞的代谢来实现，但它们在信号传导的起点和具体作用机制有所不同。ALK7 表达于脂肪组织的脂肪细胞，是一个重要的调节脂质代谢的分子，通过抑制其功能，可以改善肥胖相关病症。目前的研究主要集中在动物模型上，未来可能会有更多关于 ALK7 siRNA 在人类疾病治疗中的应用探索。ALK7 siRNA 在临床前研究中的发现表明，沉默 ALK7 表达能够有效减轻肥胖、改善代谢指标，并可能通过调节脂肪代谢机制发挥作用。这些结果为 ALK7 作为治疗肥胖和相关代谢疾病的靶点提供了有力的支持，为后续的临床研究奠定了基础。 INHBE 与 ALK7 的相互作用为肥胖的治疗提供了新的靶点和研究方向。未来的研究将继续探索这两者在肥胖及其相关代谢疾病中的具体作用机制，以便开发更有效的治疗策略。 7 影像学小蛮腰 鼎泰 KBI 非人灵长类 肥胖动物模型和药效学平台 众所周知，肥胖动物模型种类繁多，其中非人类灵长类动物（NHP）模型展示了与人类肥胖相似的疾病特征。这些模型在结构（解剖）和功能（生理）上与人类肥胖患者基本一致，且 NHP 肥胖与类似于人类代谢综合征的代谢变化密切相关，如腹内脂肪增加、胰岛素抵抗、葡萄糖耐受性受损，以及血清甘油三酯和胆固醇升高。此外，NHP 模型还具备便于血液连续采样、临床观察、组织取材（如肝、肾穿刺）、内窥镜检查、腹腔镜活检和影像学评估等优势，这些特性使其在相关肥胖疾病药效学研究中表现出色。 自 2006 年成立以来，鼎泰集团旗下子公司昆明科灵（下称“鼎泰 KBI”）始终专注于代谢性疾病等领域的前沿研究。凭借丰富的NHP疾病动物资源，结合经验丰富的技术团队和先进的设施设备，鼎泰 KBI 成功建立了全球知名的 NHP 肥胖、糖尿病及其相关并发症等代谢性疾病模型和研究平台。该研究平台已经通过多个国际知名药企的审计，并与其建立了长期稳固的合作关系。 在代谢项目方面，鼎泰 KBI 积累了丰富的经验，涵盖多种药物类型和多个靶点。这些项目的广泛性和多样性反映了 鼎泰 KBI 在代谢性疾病领域深厚的专业知识和技术能力，为多个 INHBE-siRNA 的相关研究提供了可靠、稳定的体内脂肪含量变化评估服务。 随着研发理念的不断演进，传统的检测指标（如摄食量、体重变化）已无法满足药效学和作用机制评价的需求。相对而言，腰围（WC）、腰臀比（WHR）和体重指数（BMI）则成为更具临床转化意义的终点指标。为应对这一研发趋势，KBI 布局了相关影像学平台，通过 iDEXA、MRI、PET-CT 等不同影像设备，结合专业的分析软件和技术团队，对非人类灵长类动物的身体成分进行数据采集和分析。这为研发者提供了快捷、高效的减肥药效评价手段，使药物研发人员不仅能够从外表观察到“小蛮腰”，更能借助影像设备深入分析药物用于代谢性疾病治疗的内在机制。 从“常规”到“升级”，从“表面”到“内在”，鼎泰 KBI 正基于自身模型和影像学优势，全方位帮助药物研发者深入理解产品，做出更加精准的开发决策，是助力寡核苷酸用于代谢性疾病转化研究的“小蛮腰”。 KBI内脏脂肪和瘦体重的影像学技术： iDEXA 测定身体组分和分布：iDEXA 通过双能X射线吸收技术，能够快速、精确地测量整体和局部的脂肪组织、肌肉组织、全身组分、体脂率等指标 iDEXA 扫描进行身体组分分析已经在减肥类相关 NHP 研究中广泛使用。由于 iDEXA 扫描的结果是二维图像，不能区分腹部皮下脂肪、内脏脂肪，以及肝脏脂肪含量，在实验结果的评估和解读上存在一定的局限性。 图35. iDEXA 技术 MRI：MRI 扫描可评估特定药物治疗对腹部皮下脂肪和内脏脂肪，以及肝脏脂肪含量的影响，进而揭示其与疾病发展之间的关联。相比 iDEXA，MRI 的图像是三维图像，对于动物身体局部进行扫描后，对扫描结果数据的可视化、处理和分析，能够更加清晰地帮助研究团队进行影像结果诊断。 图36. 鼎泰资源 KBI 非人灵长类药效学 MRI 技术展示 参考资料： [1] Ankit Gilani, Lisa Stoll, Edwin A. 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本次大会的主题为“砥砺深耕·笃行致远”，热情邀请全国相关领域专家、学者、科研骨干、企业代表与会交流。 诺和诺德的Wegovy和礼来的Zepbound分别于2021年和2023年获得批准，预计未来10年，GLP-1市场规模将超过1000亿美元。GLP-1至少在未来几年内仍将是减重药物的主要类型，并在该领域占据主导地位。过去几年，几家拥有GLP-1资产的初创公司相继上市，也有一些新公司正在采取不同的方法。 GlobalData的制药分析师Costanza Alciati表示，GLP-1在可预计的将来依然会主导减重市场，但“进入该领域的新选手已经在寻找下一个可能彻底改变该领域的药物类别”。 不过，同样来自GlobalData的高级分析师Sara Reci预计，到2031年底，采取替代策略的公司只能在美国、法国、德国、意大利、西班牙、英国和日本这七大主要市场占据非常小的一部分市场规模，大约只有6.3%。 除了研究具有新分子靶点的产品外，业界还在寻找GLP-1给药的替代途径、延长治疗间隔时间等其他策略。“第一代减重产品是是GLP-1注射剂，接下来可能是不同的产品组合和不同的剂量。”Morningstar股票策略总监Damien Conover说道。 BMO Capital Markets董事总经理兼高级研究分析师Evan Seigerman也指出，规模较小的公司远远落后于诺和诺德、礼来等先行者，如果这些小公司现在还没有进入临床II期，那么很难在2028年或2029年之前获得监管批准。“他们需要进行大型III期试验来评估疗效和安全性。小公司正在考虑下一步该做什么，表现优秀的公司会被收购”。 以下是过去六年中进入减重领域的5家初创公司，以及它们正在采取的策略。 1 Metsera Metsera创立于2022年，专注于开发治疗减重和代谢性疾病的新一代药物。目前该公司处于临床阶段的管线包括口服和注射用肠促胰岛素、非肠促胰岛素和相关联合疗法，这些疗法具有成为BIC疗法的潜力。 今年4月，这家处在临床阶段的公司获得了2.9亿美元融资，由ARCH Venture Partners领投。Metsera的注射和口服产品管线，来自该公司专有的超过20000个肠道激素肽和肽/抗体偶联物库。 Metsera目前正在开发的产品，包括处于I期试验的GLP-1受体激动剂注射剂，该公司表示其疗效持续时间在同类产品中处于领先地位。管线中还有一种针对作用持续时间而设计的胰岛淀粉样肽/降钙素双重受体激动剂（DACRA），将与GLP-1受体激动剂联合使用，以及一款可与DACRA结合的单分子GGG（靶向GLP-1、GIP、胰高血糖素）疗法。 2 35Pharma 35Pharma成立于2021年，是一家临床阶段的私营生物制药公司，专注于设计和开发用于治疗肺动脉高压、减重和心脏代谢疾病的TGF-β产品。 目前，该公司正在开发一种多特异性受体胞外域配体诱捕器HS135，旨在中和激活素和GDF。35Pharma称，这种激活素和GDF是经过临床验证的心肺和代谢疾病驱动因子。在获得令人鼓舞的临床前研究结果后，加拿大卫生部于1月批准了该项目的I期临床试验。 这项临床试验将在绝经后的健康女性中研究HS135的安全性、药代动力学，以及皮下给药后与激活素和GDF生物学相关的生物标志物的变化。 3 ProFound Therapeutics ProFound Therapeutics正在利用之前未被发现的人类蛋白质开发针对多种疾病的治疗方法。Flagship在2022年投资了7500万美元，推进该公司的ProFoundry技术平台，并支持生成创新疗法的研发管线。 该公司基于对转译组的研究，构建了名为ProFoundry的图谱，这一数据库包含上万种此前未被发现的新蛋白，并且描述了它们的功能，以及在人类健康和疾病中的作用。这些新蛋白分子和靶点包括疾病的全新遗传驱动因子，免疫调节子，肿瘤学靶点等等。 上个月，ProFound和辉瑞宣布合作研究一款治疗肥胖症的潜在FIC疗法。这一合作是Flagship和辉瑞在2023年达成的70亿美元合作的一部分。 4 Metaphore Biotechnologies 和Profound一样，Metaphore也由Flagship投资推出，去年最初的投资是5000万美元。Metaphore的MIMiC平台使用了仿生学和机器学习，利用其所谓的功能性分子模拟的变革性治疗潜力。 5月，Metaphore与诺和诺德宣布合作，研发包括减重管理在内的新疗法。根据协议条款，诺和诺德可能会支付高达6亿美元的前期、开发和商业里程碑付款，以及授权产品年净销售额的分层版税，由Metaphore和Pioneering Medicine共享。诺和诺德还将报销研发成本，并参与Metaphore未来的融资。 此次合作将利用Metaphore的MIMiC平台，设计针对GLP-1受体和相关生物学多靶点疗法，目标是开发长效，无需频繁给药的药物。Metaphore将与Pioneering Medicines和诺和诺德合作，通过基础研究和临床前开发来推进项目，之后诺和诺德可以将项目推进到临床研究。 5 EraCal Therapeutics EraCal Therapeutics于2018年9月从苏黎世大学和哈佛大学分离出来，是一家专注于开发治疗减重新策略的公司。 2022年1月，该公司与诺和诺德建立了一项研究合作，旨在发现可以调节食物摄入和其他代谢表型的新药物靶点。今年早些时候，两家公司签署合作授权协议，专注于开发和商业化一种口服的小分子减重治疗药物。根据最新合作，诺和诺德获得EraCal口服小分子资产的所有独家开发和商业化权利。作为回报，EraCal将获得2.55亿美元的前期、开发和商业里程碑付款，以及药物上市后的销售分成。 该小分子发现于EraCal的平台技术，是一种食欲抑制剂，靶向一种控制外周肝-脑信号传导的未公开蛋白。该候选药物也与GLP-1靶向药物作用，但不与任何目前已知的减重药物靶点结合，如5HT2C或GLP-1受体激动剂。 参考文献： 5 Startups Looking to Compete in the Obesity Space；biosapce 更多优质内容，欢迎关注↓↓↓