KRAS G12S

刚刚在美国圣地亚哥举行的2024年第115届美国癌症研究协会年会（AACR），汇聚了全球癌症研究领域的顶级专家以及研究结构和企业，共同探讨癌症早期创新研究与进展。KRAS G12C共价抑制剂及其耐药性问，口服选择性KRAS G12D（on）抑制剂的开发……KRAS靶点在癌症治疗中越来越被重视和布局。 就这个话题，侃侃来解读一篇本周一JMC刚发表的文章“Targeting KRAS Diversity: Covalent Modulation of G12X and Beyond in Cancer Therapy"。主要解读以下几点： ※ KRASG12X突变与癌症 ※ 不同突变亚型的共价抑制剂设计 ※ G12X以外突变的展望 KRAS蛋白是一种小型膜结合GTP蛋白水解酶，因Kristen首次在大鼠肉瘤中发现病毒癌基因而得名，属于RAS超级蛋白家族，同宗的还有HRAS、NRAS。三类RAS蛋白的基因都容易突变，其中KRAS突变最为频繁，约占85%，并且比其他基因突变更容易导致肿瘤的发生！ 在人类癌症中KRAS基因突变主要出现在约86%的胰腺导管腺癌、约41%的结直肠癌、和约32%的肺腺癌（大多为非小细胞肺癌）中，其他癌症还有未分化子宫内膜癌、侵袭性导管乳腺癌、胃腺癌、以及食管腺癌/胃食管结癌中等，频率相对较低。（Nat. Rev. Drug Dis. 2020, 19(8), 533；Cancer Dis. 2022, 12(4), 924）。 在细胞内，KRAS蛋白好比一个“开关”，在失活和激活状态之间转变：当KRAS与鸟苷二磷酸（GDP）结合时，失活没有酶活性；当其与鸟苷三磷酸（GTP）结合时，激活具有活性，激活下游信号通路。 野生型KRAS在失活与激活状态之间的转换受上游两类因子的调节。一类是鸟嘌呤核苷酸交换因子（GEF），这类蛋白催化KRAS与GTP的结合，从而促进KRAS的激活，其中包括SOS蛋白；另一类是GTP酶激活蛋白（GAP），这类蛋白能够促进与KRAS结合的GTP水解成为GDP，从而抑制KRAS的活性。 当KRAS发生基因突变后，会破坏GAP活性，使KRAS一直保持与GTP结合，将KRAS锁定在活跃状态，并持续激活下游信号通路，导致细胞增殖、迁移，最终促成癌症发生！ 在KRAS的基因突变中，主要发生在第12号、第13号、第61号、第146号等Hotspots上密码子对应的氨基酸残基上：G12（80%）、G13（~15%）、Q61（<5%)、和A146（4%-5%）。其中，最普遍的突变发生在G12上单个氨基酸的取代，主要包括G12D、G12V、G12C、G12A、G12S、G12R，将野生的甘氨酸取代分别获得突变后天门冬氨酸（D）、缬氨酸（V)、半胱氨酸（C）、丙氨酸（A)、丝氨酸（S）、精氨酸（R），其中具有亲核性反应活性，可以用来设计共价抑制剂有半胱氨酸、天门冬氨酸、丝氨酸、精氨酸。 靶向KRAS的药物发现非常具有挑战性，因为①其表面缺少明显的药物可结合口袋，而且②KRAS与底物GDP或GTP结合力非常强，结合亲和系数在PicoMolar级（pM皮摩尔浓度级别），对竞争性抑制剂的亲和力要求很高！ 因此，长时间以来KRAS一直被视为“不可成药”靶点的代表。直到2013年，Shoakt实验室通过与KRASG12C突变获得的半胱氨酸结合，首次发现了与SWIIP不可逆结合的化合物，证明了KRAS是可以靶向成药的，揭开了KRAS致癌基因突变靶向治疗的大幕，也拉开了SWIIP结合的共价抑制剂的治疗研发序幕，目前已有两款针对KRASG12C突变治疗非小细胞肺癌的共价药物上市：Sotorasib(AMG510, 2021)和 Adagrasib(MRTX849, 2022)，以及一系列的共价抑制剂、变构调节剂、PPI调控剂等处于临床或临床前研究阶段。 对KRAS突变抑制剂的开发，长时间以来比较依赖于Cys12的共价识别，但其只是在非小细胞肺癌的基因突变比例较高（约42%），而在胰腺癌（2%）、直肠癌（8%)等癌症中并不是主要的突变形式，而对G12C以外的靶向突变体的研究更加具有挑战，直到最近才得以实现。 最近研究表明，SWIIP具有KRAS抑制剂结合的优先“特权”，并且提供了直接进入并作用Hotspot位置12突变残基的机会。KRASG12C共价抑制剂开发成功的经验，可以用于参考，设计靶向其他突变的共价抑制剂。 KRAS抑制剂需要有较高的亲和力参与竞争，KRASG12C抑制剂的成功开发提供了SWIIP强结合力的骨架结构。因此，以SWIIP作为设计的起点，进一步修饰和改造可以于不同的G12X突变获得的氨基酸残基直接作用（主要指共价作用）的片段；同时，通过形成这些特异性的相互作用，而不影响正常野性KRAS蛋白的功能。如上图，是近些时间发现的针对G12X不同亚型突变的获得氨基酸残基特异性共价弹头。 KRASG12D是最频繁的KRAS突变亚型，在人类各种癌症中，约39%胰腺导管腺癌、36%结直肠癌、17%非小细胞肺癌病例来自KRASG12D型基因突变。但是，G12D型突变缺少G12C突变的共价作用锚点（Cys12)，要想将G12C突变体共价抑制剂转化成G12D型突变体的可逆抑制剂，具有一定的挑战性。 要获得KRASG12D型突变体可逆性抑制元件，需要克服两大障碍：①一种完全可逆的抑制剂需要更高的亲和力和选择性来替代缺失的共价键；这里选择Adagrasib作为起始模板，因为它相比于其他KRASG12C抑制剂，具有更高的可逆亲和力和额外的相互作用，即其氰基中N与Gly10中的羰基形成相互作用，增强了亲和力。②2位的N-甲基吡咯烷元件与Glu62侧链形成相互作用。 结合以上共晶结构发现的问题，研究人员通过替换骨架、修饰骨架2、4、7位取代基，发现了针对野生KRAS具有更高亲和力的可逆抑制分子MTYX1133。其与KRASG12D突变体的共晶结构提供了有价值的信息，降低解离常数低至皮摩尔级别（~0.2 pM）。 从结构上看，2位取代基的修饰与Glu62形成潜在的离子相互作用；7位萘环取代占据了由Val9、Met72、Phe78、 Ile100、和Val103形成的疏水口袋；萘环上的炔烃元件进一步和与Gly10、Val8、Thr58配位的水分子相互作用；此外，设计的刚性双环胺与突变获得的Asp12形成了盐桥作用。这些设计，提高了分子相对于野性KRAS的选择性（500倍）。目前MRTX1133在临床1/2期研究中。 鉴于共价抑制剂相对于非共价抑制剂的优势，以及靶向KRASG12C不可逆共价抑制剂的成功，开发共价靶向KRASG12D的抑制剂非常具有吸引力。然而，G12D突变获得的天门冬氨酸侧链相比于G12C突变获得的半胱氨酸，是一个比较弱的亲核侧链，用来开发共价弹头，相当具有挑战性！ 鉴于MRTX1133对KRASG12D强有力的亲和力，广州暨南大学以其位模板，在和与G12D突变而获得的Asp12形成盐桥的元件上安装上环氧乙烷和氮杂环丙烷作为共价弹头，通过优化，最终获得可“一石二鸟”的共价抑制分子YK-8S，更能够同时共价作用于KRASG12C、和KRASG12D。注意，作用位点不同，而且对应其他亚型如G12R、G13D、Q61R、Q61K以及野生型KRAS并不起作用（或很弱）。 加利福尼亚大学以同样的策略，利用β-环丙酯作为共价弹头，同样发现了KRASG12D的共价抑制剂，如上图（R)-7。 KRASG12R型突变主要在胰腺癌患者中观察到，约占17%；在其他人类癌症如结直肠癌、非小细胞肺癌等也有少数发现，约占1%。假设共价结合G12R突变获得的精氨酸残基可能有利于与该突变体的结合效力和选择性，参考KRASG12D共价抑制剂的开发，需要探索靶向精氨酸残基的共价弹头。然而，精氨酸残基也是一种比较弱的亲核性官能团。 同样是加利福尼亚大学，2022年，利用α,β-二羰基酰胺类元件作为靶向精氨酸残基的共价弹头，获得了化合物3，能把选择性靶向KRASG12R,而对其他亚型和野生型KRAS不起作用。 KRASG12S型突变在6%的结直肠癌、和5%的非小细胞肺癌患者中被观察到，这是另一个值得关注的Hotspot。 还是加利福尼亚大学团队，2022年，利用β-环丙酯元件作为亲电弹头，设计合成并优化获得了选择性靶向KRASG12S的共价抑制剂G12Si-5。 在KRAS的致癌突变中，靶向半胱氨酸以外突变体是主要的，但是靶向非半胱氨酸残基的方法确面临着更大的限制。 这些限制除了非共价弹头的反应性以外，还有来自其他弹头药物代谢稳定性和药代动力学性质的问题。 而且，目前针对其他突变亚型，如KRASG12V、KRASG13X、以及KRASQ61X等还没有相应配体确认报道。这些亟待解决的问题，还需要从更多的策略发展出发来解决。 比如泛RAS抑制剂的方法，开发小分子、多肽、分子胶等。 比如靶向嵌合体的蛋白质分解的方法（PRATACs)，开发linker连接E3连接酶识别元件和KRAS不同亚型突变体抑制剂，尤其是开发连接可逆共价抑制剂。 内容来源于网络，如有侵权，请联系删除。

KRAS是人体内最常见的致癌突变基因，每年造成全球超过300万的新增患者负担。FDA近期批准的药物sotorasib与adagrasib作为突破性疗法，通过共价结合KRAS-G12C突变蛋白的12位半胱氨酸，将其锁定在信号失能状态，实现抑制肿瘤增殖。G12D突变是人类肿瘤中最常见的KRAS突变，尤其在胰腺癌中普遍存在。然而，由于缺乏靶向天冬氨酸的共价弹头，靶向KRAS-G12D的共价抑制剂开发仍然面临挑战。近日，加州大学旧金山分校的研究人员发现了一类基于β-丙内酯的共价亲电弹头，与MRTX1133的化学骨架结合后，能够与KRAS-G12D形成稳定的共价络合物，并展现出对KRAS-G12D驱动的癌细胞增殖和小鼠异种移植肿瘤生长的高度选择性抑制效果。由于羧基侧链的低亲核性，天冬氨酸是公认最难以亲核反应进行共价修饰的氨基酸之一。KRAS-G12D共价抑制剂开发的关键挑战在于设计一种能够在生理pH条件下与天冬氨酸羧基侧链高效结合的共价弹头，同时保证该弹头在水溶液中的稳定性，且不会与谷胱甘肽（GSH）等具有高亲核性的内源物质发生反应。为了寻找合适的共价弹头，研究人员探索了一系列三元和四元杂环共价基团，这些基团是反应活性很强的应变释放亲电试剂（strain-release electrophiles），已有报道能够与羧基发生烷基化或酰基化反应。共价修饰速率实验结果显示，基于β-丙内酯的四元杂环弹头可在多个位点（包括Asp12）以剂量依赖的方式高效共价修饰KRAS-G12D蛋白。而氮丙环和环氧乙烷类弹头则展现了中等程度的KRAS-G12D共价交联效率（40%-60%）。在成功发现靶向Asp12的潜在共价弹头后，研究团队将此弹头与MRTX1133的化学骨架结合，得到了外消旋体化合物G12Di-1。全蛋白质组质谱分析显示，G12Di-1能够与KRAS-G12D·GDP形式的蛋白发生快速的共价偶联反应（半衰期=99s），而对KRAS野生型、KRAS-G12S、KRAS-G13D以及另一种酸性氨基酸突变蛋白KRAS-G12E均未显示出共价反应性。值得注意的是，G12Di-1对GTP结合状态下的KRAS-G12D蛋白同样展现出一定的共价反应性，这一发现与先前报道的KRAS突变体抑制剂存在显著的区别。鉴于上述发现，研究人员进一步探究了这种共价修饰是否会影响KRAS在活性状态下与效应蛋白（如Raf）的相互作用。TR-FRET分析结果表明，G12Di-1能够以剂量依赖地抑制Raf-Ras结合域（Raf-RBD）和KRAS-G12D之间的相互作用，而对KRAS野生型与Raf的结合无显著影响。此外，生物膜干涉实验进一步证实，与KRAS-G12D·GppNHp相比，KRAS-G12D·GppNHp·G12Di-1复合物与Raf-RBD的结合能力显著降低。这样的共价修饰特性对G12D突变体可能尤为有利，因为该突变型的GTP水解酶活性受到严重影响，导致大多数KRAS-G12D分子持续处于GTP结合的激活状态。为了深入探究G12Di-1与KRAS蛋白的共价相互作用机制，研究团队对KRAS-G12D·GDP与G12Di-1的复合物晶体结构进行了解析。结果显示，G12Di-1的分子结合构象与MRTX1133及AMG510类似，其中G12Di-1的β-丙内酯环打开，通过其β-碳原子与Asp12发生烷基化反应，从而实现共价交联。有趣的是，绝大多数G12Di-1分子以S型构象与KRAS-G12D结合，这引导研究者们推测，这一现象很有可能来源于R型构象的β-丙内酯弹头在结合Asp12时发生的SN2构型翻转。因此，研究团队通过手性拆分G12Di-1，获得了(R)-G12Di-2和(S)-G12Di-2两种对映异构体，并对它们与KRAS-G12D的反应性进行了评估。实验结果表明，(R)-G12Di-2对KRAS-G12D·GDP的共价反应性明显更强，这进一步证实了研究人员的假设。尽管(R)-G12Di-2作为KRAS-G12D的有效共价配体显示出良好的活性，其β-丙内酯共价弹头的高反应性却导致其在生理条件下的水溶液中稳定性较低，这限制了其在细胞实验中的应用。为了克服这一挑战，研究人员在β-丙内酯环的α碳原子上引入取代基，以降低水解反应发生的可能。结果显示，通过异丙基取代得到的G12Di-4，虽然它的共价反应速率在空间位阻的影响下有所下降，但其在PBS溶液中的稳定性显著提高。为了进一步提高G12Di-4对KRAS-G12D的亲和力，研究小组继续对其结构进行优化，通过整合MRTX1133的完整化学结构，得到了G12Di-6。该分子在亲和力和共价反应速率方面均获得了显著提升，更值得注意的是，G12Di-6是第一个展示出对KRAS蛋白在GTP结合状态下选择性优于GDP结合状态的共价分子，这一特性与MRTX1133存在显著的区别。细胞水平的Western Blot实验也进一步验证了G12Di-6能够在细胞内高效共价结合KRAS-G12D蛋白，并显著抑制下游ERK的磷酸化水平。基于共价标记动力学的构效关系研究表明，左侧萘环3号位的羟基取代是引起G12Di-6对GTP结合状态下的KRAS-G12D高选择性的关键因素，这与该羟基和KRAS蛋白的Asp69侧链形成的氢键密切相关。然而，G12Di-6在抑制多种癌细胞系增殖的实验测试中，并未表现出显著的KRAS突变特异性。经过研究发现，由于异丙基单取代的β-丙内酯结构在真核生物的蛋白酶体抑制剂中较为常见（如belactosin C），G12Di-6因与癌细胞内蛋白酶体的高效结合而发生脱靶效应。为了解决这一问题，研究团队在丙内酯结构的β-碳原子上再次引入了甲基取代，从而得到了新的化合物G12Di-7。这一改进不仅有效阻止了G12Di-6与蛋白酶体的脱靶结合，而且进一步提高了化合物的稳定性。更为重要的是，G12Di-7不仅展现了与GDP及GTP结合状态下的KRAS-G12D蛋白的高效共价结合能力，还表现出对KRAS-G12D突变型细胞的高度选择性。此外，G12Di-7在KRAS-G12D基因转化的小鼠BA/F3癌细胞模型中同样表现出显著的浓度依赖性抑制效果。无论是在传统的2D单层细胞培养，还是更为复杂的3D细胞培养模型中，G12Di-7均展现出了对KRAS-G12D突变驱动的癌细胞株（SW1990、AsPC-1和AGS）生长的显著抑制作用。而对非KRAS-G12D突变驱动的癌细胞株则均无明显影响，且在10μM浓度下未表现出明显的毒性，强调了其高选择性和安全性。接着，研究人员通过在小鼠体内模型中评估G12Di-7对KRAS-G12D转化细胞系衍生的异种移植瘤组织的抗肿瘤活性，进一步评估G12Di-7的体内有效性。结果显示，G12Di-7通过静脉滴注给药的方式，剂量依赖性地抑制了SW1990异种移植瘤的生长。与此同时，在治疗期间两组小鼠的体重增加情况相似，表明了G12Di-7治疗方案未引起明显的分子系统性毒性。综上，通过将改良后的β-丙内酯衍生物共价弹头与MRTX1133的化学骨架结合，研究人员成功设计了首个针对KRAS-G12D的共价抑制剂。这类分子能够有效地共价修饰GDP和GTP结合状态下KRAS-G12D的12位突变天冬氨酸，且具有出色的KRAS-G12D突变型细胞选择性和体内肿瘤抑制效果，为KRAS-G12D突变驱动的癌症治疗提供了一种新的策略。参考文献Zheng Q, Zhang Z, Guiley KZ, Shokat KM. Strain-release alkylation of Asp12 enables mutant selective targeting of K-Ras-G12D. Nat Chem Biol. Published online March 5, 2024. doi:10.1038/s41589-024-01565-w声明：发表/转载本文仅仅是出于传播信息的需要，并不意味着代表本公众号观点或证实其内容的真实性。据此内容作出的任何判断，后果自负。若有侵权，告知必删！长按关注本公众号   粉丝群/投稿/授权/广告等请联系公众号助手 觉得本文好看，请点这里↓

本研究在红细胞DNA CNV的基础上发现了明显的良性和恶性小结节的差异，首次证实了基于红细胞的新型液体活检技术的重要意义，为未来癌症诊断研究提供了新的方向。 哺乳动物红细胞（RBC）是一类没有细胞核或线粒体的细胞，是氧气、二氧化碳和细胞代谢副产物的运输载体[1]。在哺乳动物红细胞成熟过程中，红系前体细胞在线粒体的辅助下将细胞核排出细胞外，产生无核网织红细胞，网织红细胞成熟后被释放到血液循环中，通过清除线粒体和其他细胞器进一步成熟为红细胞[2-3]。 有文献报道，某些存在脾脏功能缺陷的患者循环红细胞中存在含有DNA的包涵体，这种包涵体被称为Howell-Jolly小体（HJBs），HJBs的形成是红系发育异常过程的结果，大多数HJBs含有着丝粒区DNA，只有少数HJBs的DNA来自常染色质[4-5]。但成熟红细胞是否含有DNA及DNA的种类尚不明确。 近日，南京大学医学院的陈奇涵及中国药科大学生命科学与技术学院梁宏伟团队在Advanced Science上发表了重要研究成果。 他们发现，人类成熟红细胞中含有的长片段DNA在健康人群和肺癌患者间存在显著差异，这也是首次发现基于红细胞的新型液体活检技术可用于早期肺癌筛查和恶性肿瘤诊断[6]。 文章首页截图 既往研究表明，红细胞不仅可以通过自身表面的Toll样受体9（TLR9）与细胞游离mtDNA和致病DNA结合，调节机体免疫功能，还能在肿瘤进展和转移中发挥重要作用[7-8]。 鉴于此，研究团队猜想，红细胞中或许含有来源于肿瘤细胞的物质。 于是，研究团队首先对成熟红细胞中是否含有DNA这一问题进行了研究。从健康供者的新鲜全血中分离出红细胞后，研究团队通过镜下观察和流式细胞术检测了红细胞的纯度，并确认得到的样本中无单核细胞、T细胞掺杂。 接着，研究团队使用4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）对红细胞中的DNA进行染色后发现，红细胞中不仅存在DNA，且DNA充满了整个红细胞内部。当研究团队使用原子力显微镜（AFM）观察红细胞中的DNA时发现，在红细胞DNA中存在多个中位长度为数千bps的DNA片段，且这一现象为成熟红细胞特有。 红细胞DNA的性质和特征 随后，研究团队利用二代测序获得了这些DNA信息，结果发现，超过98.72%的DNA片段来源于人类基因组，且这些DNA片段覆盖了核基因组（平均90.02%）和线粒体基因组（100%）的大部分区域。 研究团队还发现，DNA在红细胞之间分布不均匀，此外，DNA片段在每条染色体上的分布存在一些较明显的缺失。 接着，研究团队进一步探索了不同健康状态下（健康人群、肺部有良性结节的以及有恶性肿瘤的患者）红细胞内DNA的表达情况。 研究共收集了20份新鲜血液样本，其中健康献血者3例，肺良性小结节患者6例，肺癌患者11例。结果发现，健康献血者的红细胞DNA在全基因组中分布非常均匀，而大多数良性结节或癌症患者的红细胞DNA拷贝数存在明显差异，且在多个样品中均观察到多个区域存在缺失。 大多数良性结节或癌症患者的红细胞DNA拷贝数存在明显差异 由于红细胞DNA拷贝数变异（CNV）在不同组别样本中显示出明显差异，研究团队进一步探索了红细胞DNA是否可以被用来筛查肺癌患者。 基于20个样本共筛选出4202个组间CNV差异显著的区域，进行聚类后明显形成了三个组。其中18个样本均在聚类后被准确分组，也就是说，红细胞DNA可以有效区分健康人群、良性结节和肺癌患者。 根据上述实验结果，研究团队认为，在癌症发展的早期，红细胞与癌细胞之间可能发生分子交换（DNA/RNA/蛋白质/其他）。 为了验证这一假设，研究团队将健康人群的红细胞和肺癌细胞系（A549: KRAS G12S突变、H1975: EGFR L858R、T790M突变）进行了体外共培养实验，共分为三组：无癌细胞组、直接接触组和transwell组，并在不同时间点收集分离红细胞，检测EGFR L858R、T790M和KRAS G12S的潜在突变位点。 令人惊讶的是，直接接触组在共培养30s时即能检测到10%的EGFR突变，共培养2-12h后这一比例增加至70%。也就是说，在短暂的直接接触之后，红细胞即获得了对应细胞系的突变DNA片段，而非直接接触组则没有发现这种DNA片段转移。 体外实验中肺癌细胞系DNA通过直接接触转移至红细胞 为了进一步探究这一现象的生理意义，研究团队开展了一项小规模的临床研究，进一步验证癌细胞与红细胞之间的物质交换。研究共分析了26例肺癌患者的组织和红细胞样本，其中21例患者被诊断为I期肺癌，IA期4例，IA2期8例，IA3期3例，IB期6例。 以组织基因突变情况为参考，研究团队对红细胞中提取的DNA进行二代测序，然后尝试在早期的肺癌患者中检测三个最常见的突变位点，最后手术之后的肿瘤组织进行比较。 结果共检测到EGFR 19del突变7例，EGFR L858R突变11例，KRAS G12A突变1例，与肿瘤组织对比后确定为真阳性结果，仅有1例突变率较低的患者（LC44，4% KRAS G12S）被判定为漏检。证明红细胞检测肿瘤来源DNA的灵敏度较高，且在早期肿瘤的筛查中优势显著。 肺结节的良恶性鉴别，尤其是小于1cm的肺结节，一直是困扰临床医生和患者的难题。在所有的新方法中，液体活检可以无创地为结节的病理诊断提供额外的信息。 本研究在红细胞DNA CNV的基础上发现了明显的良性和恶性小结节的差异，首次证实了基于红细胞的新型液体活检技术的重要意义，为未来癌症诊断研究提供了新的方向。 参考文献： [1] Dzierzak E, Philipsen S. Erythropoiesis: development and differentiation. Cold Spring Harb Perspect Med. 2013;3(4):a011601. Published 2013 Apr 1. doi:10.1101/cshperspect.a011601 [2] Liang R, Menon V, Qiu J, et al. Mitochondrial localization and moderated activity are key to murine erythroid enucleation. Blood Adv. 2021;5(10):2490-2504. doi:10.1182/bloodadvances.2021004259 [3] Chen M, Sandoval H, Wang J. Selective mitochondrial autophagy during erythroid maturation. Autophagy. 2008;4(7):926-928. doi:10.4161/auto.6716 [4] Sears DA, Udden MM. Howell-Jolly bodies: a brief historical review. Am J Med Sci. 2012;343(5):407-409. doi:10.1097/MAJ.0b013e31823020d1 [5] Felka T, Lemke J, Lemke C, Michel S, Liehr T, Claussen U. DNA degradation during maturation of erythrocytes - molecular cytogenetic characterization of Howell-Jolly bodies. Cytogenet Genome Res. 2007;119(1-2):2-8. doi:10.1159/000109611 [6] Liang N, Jiao Z, Zhang C, et al. Mature Red Blood Cells Contain Long DNA Fragments and Could Acquire DNA from Lung Cancer Tissue [published online ahead of print, 2023 Jan 4]. Adv Sci (Weinh). 2023;e2206361. doi:10.1002/advs.202206361 [7] Lam LKM, Murphy S, Kokkinaki D, et al. DNA binding to TLR9 expressed by red blood cells promotes innate immune activation and anemia. Sci Transl Med. 2021;13(616):eabj1008. doi:10.1126/scitranslmed.abj1008 [8] Helwa R, Heller A, Knappskog S, Bauer AS. Tumor cells interact with red blood cells via galectin-4 - a short report. Cell Oncol (Dordr). 2017;40(4):401-409. doi:10.1007/s13402-017-0317-9