EpCAM x CD44

摘要：癌细胞对化疗药物的耐药性大大降低了癌症患者的治疗效果，化疗引起的毒副作用也严重影响了患者的生活质量。茶中主要活性成分表没食子儿茶素-3-没食子酸酯（EGCG）与顺铂、5-FU、多柔比星和紫杉醇的联合使用，增强了它们对肿瘤的增敏效果，并对抗了癌细胞的耐药性。这些效应似乎通过多种机制介导，包括对抗癌症干细胞介导的药物耐药性、增强药物敏感性、诱导细胞周期停滞和凋亡，以及阻断血管生成。此外，EGCG可以通过其抗炎和抗氧化作用，抑制化疗引起的一系列不良反应，如胃肠功能紊乱、肾毒性和心脏毒性，从而改善患者的生活质量。然而，EGCG的生物利用度低、脱靶效应以及与某些化疗药物的反应性限制了其临床应用。EGCG和化疗药物的纳米改性不仅增强了抗肿瘤活性，还延长了荷瘤小鼠的生存时间，并具有低毒性的优势。因此，本综述旨在讨论EGCG与化疗药物联合治疗癌症的现状和挑战。总体而言，EGCG是一个有前景的化疗辅助剂。 1.引言 恶性肿瘤的发病率和死亡率持续上升，已成为对人类生命健康的主要威胁。恶性肿瘤的治疗方法主要包括手术、放疗和化疗，其中化疗在恶性肿瘤治疗中发挥着关键作用。然而，肿瘤细胞常常产生耐药性，使得通过化疗彻底杀死所有肿瘤细胞变得困难，限制了治愈率。目前，现有的癌症化疗药物不仅价格昂贵，还会改变多个信号通路组分的表达水平，从而不可避免地带来不同程度的副作用。这些副作用的产生与化疗药物的剂量和个体对药物的敏感性有关。化疗药物在抑制或杀死肿瘤细胞的同时，也对其正常组织造成一定的损伤。化疗的常见副作用包括胃肠功能紊乱、心脏毒性、神经病变、血管毒性等。这些副作用严重影响了肿瘤治疗效果和患者的生活质量。一些植物化学物质被报道具有化疗增敏作用，并能减少化疗引起的毒性副作用的发展。表儿茶素没食子酸酯（EGCG）就是其中之一。 EGCG是绿茶中最重要的活性成分之一，约占儿茶素化合物的50-60%。EGCG清除自由基，减少氧化损伤，对正常细胞和组织无毒性，但对肿瘤预防和治疗有积极作用。此外，EGCG还被报道能够对抗癌细胞干细胞的耐药性，增强化疗药物的敏感性，从而减少药物用量，缓解胃肠道功能紊乱和肾毒性等副作用，并降低肿瘤引起的恶病质发生率和发展。 尽管EGCG在癌症预防和治疗方面显示出了强大的优势，但其疗效与一线化疗药物相比仍有一定差距，作为单一抗癌药物开发的可能性有限。然而，当EGCG作为辅助化疗药物用于治疗肿瘤时，它们表现出强烈的化疗增敏作用，并减轻化疗副作用（图1），因此有望作为化疗辅助药物使用。本文综述了EGCG与化疗药物联合增强抗癌效果的现状和挑战，并为包含EGCG的组合策略在肿瘤治疗中的发展提供了参考。 图1. EGCG 在辅助化疗中的优势 2.增强化疗效果  单独的EGCG具有强大的抗癌活性，当与化疗药物（5-氟尿嘧啶、塞来昔布、顺铂、多柔比星、他莫昔芬）联合使用时，其协同治疗效果得到放大。这些作用机制包括减少癌细胞干细胞的药物抗性、增强化疗药物敏感性、诱导细胞周期停滞和凋亡、抑制血管生成，以及诱导抗炎和促氧化效应（图2）。我们将在下面简要阐述这些机制。 图2. EGCG与化疗药物联合作用增强抗肿瘤效果的机制 2.1. 减少癌细胞干细胞的药物抗性 在肿瘤组织的细胞群中，癌细胞干细胞（CSCs）数量较少，但在肿瘤抗性和复发过程中起着重要作用。CSCs通过不对称分裂维持自我更新和多向分化潜能，导致肿瘤细胞继续增殖，并促进肿瘤异质性和多样性的形成。因此，靶向CSCs是预防癌症和克服药物抗性的重要策略。在针对CSCs的研究中，发现EGCG对CSCs药物抗性有积极影响。EGCG单独使用时已显示出对CSCs生长和干性的强烈抑制作用。当EGCG与其他化疗药物联合对抗CSCs时，联合的肿瘤抑制效果比单一作用效果更显著（图2）。这些效应主要是EGCG通过减少CSCs的干性和降低细胞内流出泵活性来降低CSCs对化疗药物的抗性。 集落和球状体形成能力被用作实验指标，以测试CSCs的干性能力。低浓度的EGCG（5μM）未能抑制胰腺导管腺癌的集落和球状体形成，但当与PDE3A抑制剂曲前列醇联合使用时，它降低了FOXO3和CD44蛋白水平，并上调了cGMP表达，导致CSCs形成集落和球状体的能力显著降低。肿瘤抗性通常由增加的细胞内药物流出介导，由膜转运蛋白介导。作为最大的细胞内转运蛋白基因家族，ABC超家族已被报道参与肿瘤的多药耐药性。EGCG可以通过抑制CSC膜上的转运蛋白（ABCC2和ABCG2等）的活性和表达，增加CSCs中的药物浓度，减少药物从细胞中泵出的量，并增强抗癌药物对CSCs的杀伤效果（图2）。在头颈癌、胆管癌和鼻咽癌等癌症的CSCs中发现了这一点。在胶质瘤CSCs中，尽管EGCG对ABCG2表达没有影响，但EGCG下调了另一种膜转运蛋白P-糖蛋白（P-gp），减少了肿瘤细胞的球状体形成和迁移能力，最终增强了化疗药物替莫唑胺对CSCs的杀伤。 除了影响膜转运蛋白的表达外，EGCG还可以通过调节miRNAs的表达来保护CSCs。5-氟尿嘧啶（5-FU）处理的药物耐药性结直肠癌细胞比亲本细胞具有更强的球状体形成能力。低剂量EGCG与5-FU联合使用抑制了多个自我更新驱动途径，包括Notch和Bmi1、Ezh2和Suz12，通过上调关键肿瘤抑制miRNAs（miR-34a、miR-145和miR-200c）的表达，从而增强了耐药性结直肠癌细胞的凋亡并抑制了球状体形成。在动物实验中，EGCG与5-FU或顺铂的联合使用也可以减少小鼠中各种CSCs的肿瘤体积和重量，如结直肠癌、头颈癌和鼻咽癌。 2.2. 提高药物敏感性 EGCG与化疗药物的结合可以显著降低化疗药物的IC50值（表1），同时减少药物剂量也能显著增强效果。三氧化二砷（ATO）是治疗急性早幼粒细胞白血病（APL）的有效化疗药物，长期使用可能导致严重的副作用和癌细胞耐药性。EGCG与ATO的结合有效降低了抑制APL HL-60细胞和U937细胞所需的ATO浓度。EGCG增强了三苯氧胺和顺铂在胶质瘤细胞中的增敏效果，并抑制了端粒酶的表达。它还可以通过抑制核酸修复酶ERCC1/XPF的活性，增强各种癌细胞对顺铂的敏感性。EGCG和吉西他滨的结合增强了胆管癌细胞对吉西他滨的敏感性，促进了凋亡，并显著抑制了移植肿瘤的生长。 EGCG可以通过多种途径增强化疗药物的增敏效果，包括促进药物摄取相关蛋白的表达和抑制药物在细胞内的翻译或流出（图2）。铜转运蛋白1（CTR1）是一种跨膜溶质载体转运蛋白，之前已被证明可以增加顺铂的细胞摄取和敏感性。EGCG在卵巢和肺癌细胞中上调了CTR1的转录和翻译水平，并抑制了癌细胞中顺铂介导的CTR1降解。羰基还原酶1（CBR1）将抗肿瘤药物柔红霉素和阿霉素转化为柔红霉素醇（DNROL）和阿霉素醇（DOXOL），这些新产生的醇代谢产物不仅具有低抗肿瘤活性，还会引起心脏毒性和心肌细胞损伤。EGCG还直接结合肝脏中的CBR1，增加癌细胞中柔红霉素的积累，增强抗肿瘤活性，同时减少DNROL诱导的心脏毒性（图3）。EGCG和萝卜硫素的联合治疗通过时间和剂量依赖性地降低细胞活性并增强顺铂诱导的凋亡和G2/M期阻滞，增强了顺铂在顺铂敏感和顺铂耐药卵巢癌细胞中的疗效。 图3. EGCG 提高癌细胞对多柔比星的化疗敏感性。EGCG 通过抑制 CBR1 和 P-gp 的活性，减少柔红霉素和多柔比星的转化和外排，从而增强抗肿瘤活性并降低心脏毒性。 EGCG可以抑制结直肠癌和肺癌中多药耐药蛋白1（MRP1/MDR1）的活性，并抑制化疗药物从癌细胞中的流出，从而促进细胞内积累。EGCG下调MDR1及其蛋白产物P-gp，减少肝癌细胞中多柔比星（DOX）的流出泵活性（图3）。DOX和EGCG的结合使口腔癌细胞中的DOX浓度增加了51%，并与单独使用DOX相比，增加了肿瘤细胞的凋亡率。进一步研究表明，EGCG通过协同抑制MEK/ERK和PI3K/Akt信号通路，抑制DOX诱导的P-gp过度表达。在EGCG-三苯氧胺联合测定中，P-gp和乳腺癌耐药蛋白显著受到抑制，增强了乳腺癌细胞对三苯氧胺的敏感性。 2.3. 诱导细胞周期停滞 EGCG和顺铂的联合治疗通过降低多种细胞周期相关基因（cyclin A2、cyclin B1、cyclin D1和cyclin E1）的mRNA表达水平，并增加细胞周期抑制因子p21和DR5的表达（图2），诱导细胞在G1期停滞，并增强胆道癌和非小细胞肺癌（NSCLC）中的凋亡。EGCG衍生物不仅可以增强EGCG的稳定性和生物利用度，还可以促进NSCLC细胞的凋亡，并在与顺铂联合使用时抑制小鼠肿瘤的生长。 EGCG和DOX的结合抑制了肿瘤中磷酸化NF-κB和MDM2的表达，并上调了p53，从而显著抑制了膀胱癌细胞（T24和SW780）的增殖，增强了DOX对癌细胞的凋亡诱导效果，并降低了膀胱癌细胞的迁移能力。EGCG和曲司他丁A的结合通过上调p16表达促进淋巴瘤细胞在G1期停滞，从而减少细胞增殖。与vorinostat单独使用相比，EGCG的联合治疗上调了p21、p27、caspases（3、7和9）和Bax，并抑制了cdk2、cdk4、cyclin A、NF-κB和Bcl2的活性，从而显著降低了黑色素瘤细胞的增殖并促进了它们的凋亡。 2.4. 诱导凋亡 EGCG和顺铂的结合抑制了头颈鳞状细胞癌的形成并增强了细胞凋亡。EGCG减轻了化疗药物吉非替尼诱导的CYP1A1/CYB1B1、EGFR、cyclin D1、p-Akt（Ser473）和survivin在转录和翻译水平上的表达增加，并增强了p-p53（Ser15）的表达（图2），从而增强了吉非替尼对苯并[a]芘诱导肺癌的治疗效果。EGCG还降低了EGFR的磷酸化水平，抑制了乳腺癌细胞中的AKT信号，并增强了雷洛昔芬诱导的癌细胞凋亡。此外，EGCG与三苯氧胺在小鼠中的结合通过抑制mTOR和EGFR的表达，减少了肿瘤体积71%和肿瘤重量80%。EGCG和博来霉素的结合显著促进了Mia Paca-2胰腺癌细胞的凋亡。EGCG和丁酸钠的结合也在结肠癌细胞中诱导了细胞周期停滞、凋亡和DNA损伤。 EGCG与紫杉醇（例如，紫杉醇和多西他赛）的结合上调了p53和caspase-3，增加了前列腺癌细胞的凋亡率，并使肿瘤携带小鼠的无病生存率提高到90%。EGCG与5-FU的结合可以通过抑制葡萄糖调节蛋白78（GRP78）的表达来阻断5-FU的流出，激活NF-κB信号，增强miR-155-5p的表达水平，并进一步抑制靶基因MRP1的表达。5-FU的积累导致caspase-3和PARP激活，Bcl-2降低和Bad增加，最终导致结肠癌细胞的凋亡。EGCG和阿霉素的结合也下调了bcl-2并增加了bax和caspase-3的表达，从而促进了食管癌细胞的凋亡。EGCG结合GRP78并将其从活性单体转化为非活性二聚体和寡聚体，干扰了抗凋亡GRP78-caspase-7复合体的形成，导致依托泊苷、紫杉醇和长春新碱诱导的癌细胞凋亡增加。EGCG和ATO的结合显著诱导了HL-60细胞的线粒体依赖性凋亡，凋亡细胞占总死亡细胞的70%以上。 NS-398和化疗药物塞来昔布都是环氧化酶-2（COX-2）抑制剂，EGCG和NS-398的联合治疗促进了前列腺癌细胞（LNCaP、PC-3和CWR22Rnu1）中Bax、pro-caspase-6和pro-caspase-9以及裂解的PARP的表达，并降低了前列腺特异性抗原和IGF-I水平，从而诱导凋亡并抑制小鼠肿瘤的生长。单独的EGCG或塞来昔布都没有诱导PC-9肺癌细胞中DNA损伤基因GADD153的表达，而联合治疗通过ERK信号通路上调了GADD153，从而促进了肺癌细胞的凋亡。 肝源性生长因子（HDGF）是一种分泌的肝素结合生长因子，调节肿瘤侵袭和转移，并促进血管生成。EGCG和顺铂的结合可以破坏线粒体膜电位，并通过下调HDGF上调caspase-3和caspase-9，从而诱导NSCLC细胞凋亡（图2）。EGCG还通过下调Axl和Tyro 3的表达抑制顺铂耐药肺癌细胞的增殖。此外，EGCG可以通过抑制hsa-miR-98-5p的表达并进一步上调p53，增强顺铂对NSCLC细胞的治疗效果。 2.5. 抑制血管生成 EGCG显著抑制了semaxanib诱导的内皮素过度表达，并抑制了肿瘤血管生成，为解决对抗VEGF疗法的抗性提供了新策略。EGCG治疗导致微血管密度、微血管周细胞覆盖指数和胶原IV表达降低；血管灌注和通透性的短暂增加；间质液压力和缺氧降低。在顺铂诱导的血管正常化期间共同给予顺铂，显著降低了在肿瘤组织中诱导效果所需的顺铂药物浓度（1.8 μg/g组织对比0.8 μg/g组织，P < 0.01），并抑制了移植肺肿瘤的生长。使用聚乙二醇（PEG）偶联的EGCG（PEG-EGCG）作为载体制备的载药胶束纳米复合物（SU-MNC），也能特异性地抑制VEGF诱导的内皮细胞增殖。 2.6. 抗炎和促氧化效应 EGCG与塞来昔布联合使用，降低了胰岛癌细胞（Colo357）中IL-6、IL-8、VEGF和MMP-2的表达，并减弱了塞来昔布诱导的COX-2表达增加，减少了细胞炎症水平。这种组合在偶氮甲烷加硫酸葡聚糖钠诱导的结肠癌发生模型中也显示出类似的抗炎效应。核因子E2相关因子2（Nrf2）是一个重要的细胞保护性转录因子，在抗氧化和解毒过程中发挥关键作用。激活Nrf2-Keap1通路诱导相II酶的表达，并通过ARE信号通路阻止癌症发展。EGCG和顺铂的组合通过上调Nrf2/HO-1表达增强了凋亡，从而抑制了宫颈癌和乳腺癌的发展。此外，EGCG和顺铂的组合可以促进各种卵巢癌细胞系中H2O2的表达，加剧氧化应激以放大顺铂的毒性，从而抑制卵巢癌细胞的生长。 3.减少化疗副作用  长期化疗药物的使用除了药物抗性外，还可能导致某些有毒副作用（如胃肠疾病、心脏毒性、肾毒性、耳毒性、神经毒性等），从而限制了药物的有效性和治疗效果。EGCG不仅作为出色的辅助化疗增强剂，而且在减少化疗药物用量和增强抗肿瘤治疗效果的同时，减轻了化疗药物引起的有毒副作用。 3.1. 胃肠疾病 化疗引起恶心、呕吐、食欲减退等副作用，主要是由于药物或辐射对胃肠道细胞的损伤，导致胃肠道粘膜炎症。EGCG通过减少氧化损伤，改善了小鼠中伊立替康引起的胃肠副作用。接受同期放疗的不可切除III期NSCLC患者经常发生食管炎，这可能导致治疗中断并影响肿瘤治疗。在一项包括24名AJCC IIIA（6名）和IIIB（18名）期患者的研究中，化疗（顺铂和依托泊苷）与放疗（中位剂量64 Gy）同时进行。经过EGCG治疗（平均治疗持续时间34.8天，建议EGCG浓度440 μmol/L），在24名患者中有22名观察到食管炎显著回归至0/1级。 3.2.心脏毒性 阿霉素诱导的活性氧物种产生是心肌病的主要原因，也是限制其临床使用的主要副作用[68,69]。EGCG可以通过靶向结合抑制CBR1活性，进一步减少DOX的乙醇代谢产物DOXOL的产生，并减少DOXOL在心肌细胞中的损伤。EGCG还通过清除活性氧（ROS）和增强心肌细胞中Ca2+瞬态的幅度来减轻DOX诱导的心脏毒性。EGCG和DOX的联合给药显著抑制了肿瘤生长，同时减少了心肌Ca2+超载和乳酸脱氢酶释放，减轻了心肌细胞凋亡，从而降低了DOX的心脏毒性。与DOX和EGCG共载的多离子复合胶束增强了联合药物的稳定性，胶束核心中的EGCG除了抑制P-gp表达和逆转癌细胞的多药耐药性外，还保护心肌细胞免受DOX介导的心脏毒性。 3.3.肾毒性 顺铂诱导的肾毒性与肾脏中氧化应激和炎症细胞因子的增加有关。Nrf2和HO-1表达水平降低，顺铂处理的大鼠中NF-κB和4-羟基壬醛水平显著增加。EGCG逆转了这些顺铂介导的变化，并增强了肾脏抗氧化酶（过氧化氢酶、超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶）和谷胱甘肽的活性，从而减少肾脏氧化应激和炎症反应，并改善顺铂诱导的肾毒性。另一方面，EGCG减轻了顺铂诱导的线粒体氧化/硝化应激、线粒体电子传递链活性和线粒体抗氧化防御酶活性的线粒体损伤，并减少了肾小管细胞中线粒体ROS的产生，而PAS染色显示EGCG改善了顺铂诱导的肾脏结构损伤，如小管扩张、小管形成、颗粒空泡变性和小管细胞坏死。EGCG和CoQ10的多剂量组合也通过改善肾脏氧化/硝化状态、炎症和凋亡减轻了顺铂介导的肾毒性的发展。 3.4.耳毒性 除了肾毒性外，耳毒性是限制顺铂在临床实践中进一步使用的另一种有毒副作用。顺铂的耳毒性基于对耳蜗外毛细胞、螺旋神经节和血管纹的损害，包括不仅由药物本身引起的内外部环境的变化，还包括其激活caspase途径引起的凋亡。在大鼠中口服EGCG减轻了顺铂诱导的听力损失，减少了耳蜗基底区外毛细胞的丢失，并减少了氧化应激和凋亡标志物。它还保护了与内毛细胞相关的血管纹和螺旋韧带中的Na+/K+腺苷三磷酸酶（ATPase）α1的丢失以及与丝带突触相关的。体外研究发现，顺铂通过ROS/MAPK途径激活STAT1，降低磷酸化STAT3水平并减少p-STAT3/p-STAT1水平，从而诱导耳蜗炎症和凋亡。相比之下，EGCG通过抑制STAT1表达和保护p-STAT3，增加p-STAT3/p-STAT1比例，并调节bcl-2等促生存因子的表达，促进耳蜗细胞存活。 3.5.神经毒性 神经毒性通常与使用基于铂的药物、长春碱和紫杉醇类药物有关。EGCG对大鼠顺铂诱导的神经毒性的保护机制包括下调炎症因子TNF-α和IL-6的表达以减少大脑皮层的炎症负荷；激活抗氧化Nrf2/HO-1通路以减少NF-κB表达；下调与凋亡相关的蛋白Bax和caspase-3并增加抗凋亡因子Bcl-2的表达以减少大脑皮层的凋亡；最后，上调脑源性神经营养因子和乙酰胆碱酯酶并抑制乙酰胆碱表达以保护大脑皮层免受顺铂诱导的神经化学紊乱。 3.6.肺纤维化 博来霉素是一种诱导DNA损伤的化疗药物，长期使用可能导致肺纤维化的发展。EGCG显著下调了博来霉素诱导的炎症因子NF-κB、TNF-α和IL-1β的表达水平，增加了抗氧化调节因子Nrf2的表达，并促进了体内氧化还原动态平衡，同时减少羟脯氨酸和胶原蛋白的合成和积累，从而改善了博来霉素诱导的肺纤维化。另一方面，EGCG还促进了博来霉素诱导的糖结合物恢复正常水平，并增加了基质降解溶酶体酶的活性。电子显微镜的超微结构观察还发现EGCG促进了肺泡II型细胞的空泡化和核收缩，并减少了胶原蛋白沉积。 4.辅助化疗的限制  尽管EGCG已经显示出与化疗药物的强烈辅助作用，增强了化疗效果，但EGCG和某些化疗药物也存在一定的拮抗作用，降低了化疗效果。硼替佐米是一种用于治疗多发性骨髓瘤的临床蛋白酶体抑制剂。由于硼替佐米的硼酸成分可以与EGCG的儿茶酚反应形成环状硼酸酯（图4），EGCG与硼酸基抗癌药物如硼替佐米的组合可能导致药物失活。由于它们的共同特征，任何含有儿茶酚或间苯二酚结构的化合物都不应与硼酸基药物同时服用。在EGCG与舒尼替尼联合使用的研究中，口服EGCG也被发现降低了舒尼替尼的生物利用度。EGCG还被报道通过减少丁酸诱导的癌细胞分化，降低了丁酸对结肠癌细胞的治疗效果。因此，需要进一步研究EGCG与不同化疗药物之间的相互作用，并确定临床上合适的组合治疗策略。 图4. 硼替佐米与 EGCG 的相互作用。A). 硼替佐米和 EGCG 的化学结构。B). 硼替佐米与 EGCG 的结合模式。C). 在酸性条件下，硼替佐米、EGCG 和 Fe3+ 纳米材料可以重新释放。 EGCG的口服生物利用度低也是限制其进一步应用的原因之一。大多数细胞实验中使用的EGCG浓度为10-100 μM，而口服3克脱咖啡因绿茶后的最大血药浓度(Cmax)为0.7 μM，增加剂量至4.5克并未显著增加Cmax值，表明存在饱和现象。在大多数研究中，EGCG只有在动物或人类胃消化后达到20-100 μM或更高浓度时才有效。例如，在前列腺癌患者的临床试验中，患者在手术前3-6周服用EGCG（800毫克/天），结果显示组织中无法检测到EGCG的存在。因此，如果要在临床试验中观察到体外实验的结果，就需要考虑儿茶素的生物利用度。这是因为EGCG在口服给药能达到的低生理浓度下的生理效应将非常有限。特别重要的是提高EGCG的稳定性和生物利用度。 5.纳米改性增强化疗效果  近年来，微囊化和纳米囊化技术作为提高EGCG稳定性和生物利用度的技术手段受到了广泛关注[87]。EGCG与化疗药物结合，通过纳米材料包封的组合药物的缓慢释放和靶向研究已经相当深入（表2）。EGCG与化疗药物的纳米改性不仅发挥其自身的抗肿瘤效应，减轻化疗的有毒副作用，还通过引入纳米材料增强了组合物的稳定性，减缓释放，并增强了药物动力学参数。它还具有低毒性、肿瘤靶向和定位成像能力的优势（图5）。其中，EGCG与DOX的组合是研究最深入的儿茶素相关二元组合策略。 图5. 包裹化疗药物和 EGCG 的纳米材料的多重有益效应 5.1.聚合物纳米粒子 通过抗乳腺癌药物赫赛汀与EGCG和PEG的自组装形成的胶束纳米复合物Herceptin-MNC，在肿瘤中的积累比游离赫赛汀多2.3倍，赫赛汀-MNC的血液半衰期比后者高29倍，而赫赛汀-MNC在肝脏、肾脏和肺部的积累速率比游离赫赛汀低1倍，表明基于EGCG的组合疗法比单一化疗药物具有更好的抗癌效果。使用PEG偶联的EGCG（PEG-EGCG）作为载体形成SU-MNCs，与口服/静脉注射舒尼替尼相比，在人类肾细胞癌异种移植小鼠中产生了更强的抗癌效果（更强的抗血管生成、诱导凋亡和抑制肿瘤增殖效果）和更低的毒性（图5）。DOX和EGCG之间的高效相互作用在PEG-EGCG胶束纳米复合物中实现了DOX的88%药物载荷，提高了DOX的循环稳定性和肿瘤靶向性，同时减少了DOX剂量依赖性副作用。 海藻酸具有对P选择素的强亲和力，诱导凋亡并抑制癌细胞增殖；透明质酸（HA）通过范德华力和氢键与癌细胞膜表面糖蛋白CD44结合。d-α-生育酚PEG琥珀酸酯（TPGS）通过阻断ATP结合位点并防止P-gp ATPase水解ATP来抑制ATPase活性。使用上述三种组分装载EGCG和DOX的纳米药物靶向胃癌治疗，比EGCG/DOX组合疗法显示出更好的抗肿瘤效果。装载EGCG/DOX的NPs的IC50为200/4 mg/L，是EGCG/DOX组合溶液（400/8 mg/L）的一半，纳米药物中DOX的细胞摄取率为60.42% ± 1.56%，远大于裸药中Dox的摄取率（28.62% ± 0.97%）。然而，将EGCG和多西他赛封装在TPGS偶联的透明质酸和海藻酸基纳米粒子中，纳米粒子通过靶向识别CD44和P选择素配体内化进入前列腺癌细胞，诱导G2/M期细胞周期停滞。进一步研究表明，纳米粒子比EGCG和多西他赛的组合显著更多地抑制肿瘤生长（53%对比31%），并且对非靶向器官无毒性。由HA-EGCG/顺铂偶联制成的胶束纳米复合物，其中HA暴露在表面，有效地传递到过度表达CD44的癌细胞，增加了纳米复合物在卵巢癌中的积累并延长了血液循环时间。通过铂纳米粒子和EGCG的pH可逆硼酸酯反应制备的基于酚的肿瘤渗透纳米框架（EGPt-NF），不仅诱导肿瘤细胞的免疫原性死亡和缓解肿瘤缺氧，还有效促进了树突细胞的成熟并下调癌细胞中的PD-L1，从而显著抑制了小鼠肿瘤的生长和转移。 光热疗法在控制药物释放、减少多药耐药和提高疗效方面具有很高的应用潜力，是抗癌治疗的有希望的策略。由叶酸（FA）、多巴胺（DPA）、DOX和EGCG开发的双重药物输送系统DOX-EGCG/DPA-FA NPs，在近红外光（NIR）组中DOX的细胞摄取率是游离DOX组和无NIR照射的对照组的三到六倍。DOX-EGCG/DPA-FA NPs通过抑制肿瘤生长和血管生成，增强乳腺癌细胞中的凋亡和坏死，提高了60%的乳腺癌小鼠存活70天以上，从而提高了治疗效果。由氧化铁、靛青绿和葡萄糖氧化酶合成的磁性光热剂（ICGOx@IO）装载了DOX和EGCG，最终开发了纳米药物ICGOx@IO-Dox-EGCG-PPP，结合化学-光热-饥饿疗法几乎消除了小鼠的肿瘤，并显著减少了Dox诱导的心脏毒性。 5.2.金属纳米粒子 甲氨蝶呤（MTX）和DOX与含有EGCG的花状金纳米簇通过半胱氨酸桥结合，形成了有效的药物输送系统（Au-Cys-MTX/DOX NCs），纳米复合物在体外和体内都显示出良好的抗肿瘤活性，因为MTX的引入为纳米药物提供了良好的靶向。由EGCG、铁离子和DOX自组装而成的纳米粒子与单独的DOX相比，肿瘤体积减少了66%，转移结节减少了73.7%，表明药物输送系统显著抑制了肿瘤的生长和转移，而铁离子作为磁共振成像（MRI）的优秀对比剂，为药物输送系统的准确定位提供了潜力。 使用Fe3+与多酚的配位将DOX和EGCG自组装成FDEP NPs，增加了药物在血液中的循环时间和其在肿瘤内的积累。FDEP NPs的循环半衰期是单独DOX的36倍以上。FDEP30 NPs对小鼠肿瘤形成的肿瘤生长抑制率为74.38%，显著高于DOX + EGCG（44.13%）。末端脱氧核糖核酸转移酶dUTP缺口末端标记（TUNEL）对肿瘤切片的染色显示，FDEP30 NPs和DOX + EGCG的凋亡/坏死率分别为45.06%和27.9%。有趣的是，FDEP NPs在显著降低CBR1活性、减轻DOXOL产生和随后的心脏毒性的同时，抑制了肿瘤生长并促进了凋亡。 包括DOX、EGCG、Fe3+和HA的自组装纳米反应器，可以穿透血脑屏障靶向胶质母细胞瘤并抑制肿瘤生长，从而延长了携带肿瘤的小鼠的生存时间。尽管以前的研究报告称EGCG可以与硼替佐米复合以抵消后者的抗肿瘤效应，但最近的研究显示这种拮抗效应可以通过纳米技术逆转。由EGCG、硼替佐米和Fe3+组成的纳米药物可以促进纳米粒子在肿瘤部位的释放，由于肿瘤微环境的弱酸性，具有低毒性和肿瘤定位功能，并最终显著抑制了MDA-MB-231细胞携带肿瘤的小鼠的肿瘤生长（图4）。 由EGCG与5-羟基多巴胺修饰的顺铂(IV)前药(Pt–OH)、含多酚链段的嵌段共聚物(PEG-b-PPOH)复合制备的有机纳米治疗药物(PTCG NPs)，设计用于使纳米粒子聚乙二醇化，从而延长纳米粒子的循环时间，抑制蛋白吸附，并增强所获纳米药物在肿瘤中的积累（图5）。由于Fe3+与多酚基团之间的强配位作用，PTCG NPs中Pt–OH和EGCG的载药比例可以精确调节至治疗水平，从而实现协同效应。此外，纳米粒子可以掺杂钆离子(Gd3+)，借助MRI功能监测纳米药物的递送和释放行为，赋予纳米药物诊断能力。在低pH环境下，活性药物通过亚胺连接键的断裂和Pt–OH激活为顺铂，在HepG2细胞内化后有效释放。生成的顺铂通过级联反应提高细胞内H2O2水平，由Fe3+催化产生有毒的活性氧(ROS)，从而通过化学动力疗法增强疗效。 5.3.其他类型的纳米粒子 通过将生物相容性的介孔硅纳米粒子与天然多酚涂层结合，并装载抗肿瘤药物DOX，开发的给药系统MSN-Dox@EGCg-Apt，旨在在酸性环境或细胞内GSH的刺激下向肿瘤病灶释放药物；该系统允许实时荧光追踪，对正常细胞无毒，即使在500 μg/mL的高浓度下也不影响CEM、Ramos和K562细胞的活性。在PLGA-酪蛋白核壳中包裹紫杉醇与EGCG的纳米药物表现出比游离紫杉醇更长的循环时间、更好的可用性，并且没有器官毒性。该纳米药物降低了紫杉醇诱导的P-gp表达，增加了对紫杉醇耐药的MDA-MB-231细胞的紫杉醇敏感性，诱导凋亡，抑制NF-κB激活，并下调与血管生成、肿瘤转移和存活相关的关键基因。多酚胶体球(CSs)是由EGCG在水溶液中分子凝聚自组装而成，但在有机溶剂中分解并在水溶液中重新组装。重新组装的CSs/DOX的最大包封率和载药率达到90%和44%，该纳米药物可以逆转肿瘤细胞的耐药性，增强对乳腺癌的治疗效果。重要的是，单次生产运行产生了37.3克多酚CSs，为重组纳米药物的规模化应用奠定了基础。基于EGCG和熊果酸的纳米载体系统可以靶向EpCAM释放至肝细胞癌，可以增加CD4+和CD8+ T细胞的激活及其在肿瘤组织中的免疫浸润，从而产生显著的协同抗肿瘤治疗效果。 总之，EGCG和化疗药物的纳米化可以显著增强抗肿瘤治疗的效果，但在考虑EGCG和化疗药物的纳米组装时，需要精心设计纳米药物的形状、大小和靶向策略。形状和大小是纳米粒子的重要参数，球形颗粒最为常见。直径大于5 μm的颗粒在静脉注射后会引起肺部毛细血管栓塞。直径大于0.2 μm的颗粒不能通过过滤方法进行灭菌。网状内皮系统更快地清除大颗粒，并且不能通过血管外渗逃离血管系统。直径小于5 nm的颗粒可以被肾脏过滤迅速清除。纳米药物的靶向策略包括主动靶向和被动靶向。被动靶向在很大程度上依赖于肿瘤生物学(血管和渗漏性)和药物载体属性(循环时间、孔隙性和大小)。而主动靶向依赖于配体-受体结合，这提高了对目标部位的选择性积累。例如，可以向纳米粒子中添加HA或FA，以增强纳米药物的靶向，利用肿瘤细胞中CD44和叶酸受体的高表达。此外，向纳米粒子中添加金属离子(Fe3+, Gd3+)可以使纳米药物的递送和释放通过MRI检测。尽管基于EGCG和化疗药物的纳米药物很有前景，但目前还缺乏体内安全性研究，大多数现有研究集中在细胞和小鼠实验上。这些实验结果是否能够在临床环境中复制还有待进一步探索。纳米材料的质量稳定性和储存条件也需要进一步研究。 6.结论和未来展望  体外和体内实验表明，EGCG可以与多种化疗药物（如5-FU、顺铂、多柔比星、紫杉醇和他莫昔芬）联合使用，增强抗肿瘤治疗效果。这些作用机制包括减少CSCs的药物抗性、增强药物敏感性、诱导细胞周期停滞和凋亡、减少细胞自噬调节、阻断血管生成以抑制癌细胞侵袭和转移、抑制炎症和调节氧化应激。此外，EGCG可以减少化疗药物引起的胃肠疾病、心脏毒性、肾毒性、耳毒性、神经毒性和肺纤维化的发生率。但需要注意的是，EGCG可以与某些化疗药物（硼替佐米和舒尼替尼）结合，降低化疗效果。尽管EGCG可以通过多种方式增强化疗药物的治疗效应，但目前对EGCG的作用机制和进一步的药物学优化研究还不足。此外，由于基本上没有研究报告EGCG和化疗药物在临床治疗中一起使用，EGCG辅助化疗的概念应该在可能性/展望和临床验证方面得到更多关注。同时，考虑到EGCG的生物利用度低，我们探索了将纳米技术应用于EGCG化疗药物策略以增强化疗效果的可能性。共载EGCG和化疗药物的纳米粒子增强了药物的药代动力学和循环时间，增加了肿瘤细胞中药物的浓度，显著抑制了肿瘤的生长和转移，对非靶向器官表现出低毒性，并最终显著延长了小鼠的生存时间。总之，EGCG是化疗的良好辅助剂；利用纳米技术双重载药EGCG和化疗药物进行靶向肿瘤治疗，提高了EGCG的临床应用价值，突出了EGCG治疗策略作为有前景的研究方向。

摘要：随着人类多能干细胞（hPSCs）特定谱系分化技术的进步，下游细胞分离已成为生产hPSC衍生产品的关键步骤。由于分化过程通常导致异质细胞群的形成，需要进行细胞分离，以富集所需的细胞群或去除不需要的细胞群。本文总结了hPSC衍生细胞分离过程的最新进展，包括标准的分离技术，如磁激活细胞分选，以及基于粘附强度和代谢通量等新型分离策略。特别讨论了下游生物加工流程和不同细胞谱系表面标记的识别。尽管大规模hPSC衍生细胞的下游生物加工仍面临挑战，但应实施合理的质量设计方法，以增强对过程与产品之间关系的理解，并确保所产生细胞的安全性。 1.引言 人类多能干细胞（hPSCs）因其独特的自我更新能力和分化成几乎所有类型细胞的能力，为多种体细胞组织提供了替代细胞来源。hPSC衍生物已在几个I期临床试验中进行了测试，以评估它们作为治疗产品的潜在用途，并且还用于药物发现和疾病建模。最初，hPSC衍生细胞的开发和制造集中在优化分化效率上，即上游生物加工，从而改进了分化协议，允许以高效率和纯度生产特定谱系的细胞。例如，使用基于胚胎体（EB）的协议或通过双重抑制SMAD（小母体抗背足蛋白）信号的单层协议，可以从hPSCs中以70-90%的纯度生成少突胶质细胞前体（OPCs）和神经前体细胞（NPCs），以及使用生长因子或小分子引导的协议可以生产30-90%纯度的心肌细胞。这些高效分化协议的开发显示了上游生物加工在生产hPSC衍生细胞方面的巨大进展。然而，下游生物加工（即细胞分离），作为完成hPSC衍生产品的关键步骤和瓶颈，需要进一步研究。 由于当前从hPSCs分化的过程通常会产生包括残留未分化细胞在内的混合细胞类型，因此需要进行下游生物加工，以选择性纯化所需的细胞群或去除不需要的细胞群（图1A）。例如，最终的干细胞产品不含未分化细胞或不需要的谱系的前体细胞对于减少移植后畸胎瘤形成的风险至关重要。在这里，我们回顾了hPSC衍生物的新兴下游生物加工，包括hPSC扩增和分化后的细胞分离的最新进展。我们提供了识别新型谱系特异性表面标记的例子，这些标记可以用于分离hPSC衍生细胞。此外，我们还讨论了hPSC下游生物加工的方法和实际流程，以及生产神经和心脏细胞面临的特定挑战。 图1 hPSC衍生产品的下游生物加工。(A) 富集和耗竭策略以分离hPSC衍生细胞。(i) 富集：收集所需细胞（适用于低分化效率）。(ii) 耗竭：去除不需要的细胞（适用于高分化效率）。(B) 下游处理的主要步骤。(1) 细胞收获；(2) 离心以去除收获酶；(3) 保持等待所有细胞被收获；(4) 耗竭以去除不需要的细胞；(5) 离心以去除耗竭缓冲液；以及 (6) 填充和完成将细胞转移到冷冻保护缓冲液中进行冷冻保存。如果每个步骤在理想情况下的产量为90%，则这些步骤后的总产量预计为59%。(C) 聚集对大规模细胞标记的影响。(i) 单细胞悬浮液允许用磁性珠进行细胞标记。(ii) 如果发生聚集，目标细胞无法均匀标记，聚集体中未标记的细胞被去除，从而降低了产量。(iii) 具有高聚集倾向的细胞保持在配制的缓冲液中作为单细胞悬浮液，以提高处理效率。本图包含了Servier Medical Art (smart.servier.com)的图像。 2.纯化hPSC衍生产品的技术 在分化过程中，hPSCs及其衍生物在细胞密度、表面标记的表达、代谢需求和粘附强度方面具有阶段特异性。基于这些和其他特征，已经评估了不同类型的干细胞衍生细胞的分离过程，包括基于密度的分离和荧光激活细胞分选（FACS）以及基于特定表面标记的磁激活细胞分选（MACS）等标准分离技术。随着对hPSC属性的更好理解，也开发了基于差异粘附到培养容器的细胞分离和基于不同代谢活性的选择性去除细胞等新型分离策略。 2.1.基于密度的分离 在分化培养中可能会产生具有不同细胞密度的混合细胞类型，可以根据它们的密度进行分离。一个例子是使用Percoll梯度离心来富集hPSC衍生的心肌细胞。从分化培养中收获的细胞被加载到Percoll的两层上，然后进行离心。大多数心肌细胞将出现在Percoll的下层，而非心肌细胞将在其他分数中。从含有大约50%心肌细胞的起始分化培养中可以获得高达95%纯度的心肌细胞。然而，这种方法分辨率低，不适合大规模分离。 2.2.基于细胞生物物理特性的分离 在未分化的hPSCs、部分重编程细胞、体细胞和hPSC衍生的分化细胞之间观察到显著的生物物理特性差异。例如，粘附特性、质膜刚度和光学特性在hPSCs的不同发育阶段表现出不同。这些特性的变化可以作为选择特定承诺群体的目标。 hPSC衍生的心肌细胞显示出来自肌球蛋白杆状体的特定二次谐波信号，这使得它们能够从异质的分化细胞群体中分离出来。或者，从重新培养的分化hESC聚集体中衍生的神经嵴细胞会自发地从主要细胞团中分离出来，这使得它们可以通过形状选择和手动挑选进行隔离。 另一方面，从小鼠诱导多能干细胞（miPSCs）衍生的扩增色素细胞被证明比非色素细胞更具粘附性。这种特性使得它们可以通过调节暴露时间和酶解离的类型来进行纯化：非色素菌落可以通过5分钟的Accutase处理和吹打来回收，而剩余的粘附色素细胞可以用胰蛋白酶二次回收。类似地，在细胞解离前用ROCK（Rho相关蛋白激酶）抑制剂（Y-27632）进行介质补充，可以去除粘附性较低的细胞，从而富集内皮祖细胞。此外，发现退出多能性会增加细胞膜刚度。这些膜流动性和脂质组成的改变可以与分化阶段联系起来。基于这一原理，可以根据膜流动性条件下它们的粘附特性进行细胞分离，以选择各种分化细胞。 人类诱导多能干细胞（hiPSC）菌落可以在4分钟内通过85-125 dynes/cm2的剪切应力在流体流动应用下脱落，而分化细胞由于粘附强度更高而保持附着。这种方法可以从异质重编程培养物和分化的后代中分离出完全重编程的iPSC菌落，纯度超过95%。然而，这种方法尚未评估用于特定谱系分化的细胞。 由于细胞/粘附表面相互作用在分化过程中受到调节，这导致了新型生物材料的开发，用于特定分化表型的细胞隔离。在未分化阶段，iPSC菌落可以从热敏聚合物（PNIPAAm（聚（N-异丙基丙烯酰胺）））在低温（即22°C）下选择性脱落，而承诺的细胞仍然附着在表面。这种方法可以实现未分化干细胞群体的非侵入性富集。类似地，hiPSCs承诺用于心脏谱系，种植在与层粘连蛋白-521涂层的聚（N-异丙基丙烯酰胺）上，其临界溶液温度在8°C，促进心肌细胞的特定脱落。 此外，研究发现，通过高速激光照射光响应聚合物的特定区域（即聚[（甲基丙烯酸甲酯）-共（分散黄7丙烯酸酯）]层）可以消除承诺的细胞。或者，不同亚型的层粘连蛋白促进各种分化细胞类型的不同粘附强度。例如，LN211/332/511E8促进非上皮细胞的粘附，而LN332/511E8则有利于上皮细胞的附着和增殖。细胞与不同层粘连蛋白亚型结合的特异性使角膜上皮细胞能够从异质分化的细胞中纯化。 2.3.基于代谢活性的选择性细胞去除 基于心肌细胞和非心肌细胞在葡萄糖和乳酸代谢上的显著生化差异，可以从hPSC分化培养中获得高纯度（高达99%）的心肌细胞。未分化的hPSCs和主要依赖糖酵解的非心脏细胞在葡萄糖耗尽和乳酸丰富的条件下无法生存，而心肌细胞可以通过使用乳酸作为替代能源而存活。因此，在补充乳酸的葡萄糖耗尽培养基中，心肌细胞更倾向于存活并因此被富集。同样，使用葡萄糖耗尽并补充脂肪酸和3,3′,5-三碘-L-甲状腺素（即促进脂肪酸氧化和线粒体生物发生的分子）的培养基，已报道了心肌细胞的选择和成熟。视网膜上皮细胞（RPE）被发现表达高水平的脂蛋白受体内化AcLDL（乙酰化低密度脂蛋白）。基于这一原理，使用Dil偶联的AcLDL对分化的RPE群体进行特异性标记和富集。另一个例子是靛青绿（ICG）被肝细胞特异性内化。通过修改ICG的荧光发射特性，设计了一种肝细胞纯化剂（HPA，λem = 562 nm），用于标记和体外分选来自hPSCs的纯化肝细胞。 2.4.负选择 与正细胞选择相反，其他方法已经开发出来，通过特异性诱导不需要的细胞类型的凋亡来去除它们，从而提高所需表型的回收率。例如，将PSCs转染与合成微小RNA（miRNA）开关（即在没有目标miRNA的情况下减少相关蛋白的翻译水平），miR-Bim（Bcl-2相互作用的细胞死亡介质）开关，诱导未分化细胞的选择性凋亡，同时保持分化的心肌细胞。或者，凝集素rBC2LCN-PE23被发现能够特异性结合并内化到未分化的干细胞，并诱导它们的凋亡。这种化合物被发现可以有效地降低畸胎瘤形成的风险。 2.5.通过FACS分离 FACS设备可以检测用荧光素偶联抗体标记的细胞的荧光信号。基于标记特征和目标标记（通常是表面抗原），FACS允许将单个细胞根据多个表面标记进行高选择性地排序和分离成不同群体（例如SSEA（阶段特异性胚胎抗原）-4阳性或SSEA-4阴性）。FACS的一个优点是它允许基于多个表面标记进行连续和多参数分离，尽管细胞活性可能会受到排序程序的影响。然而，FACS的通量有限，每秒可排序5×103到7×104个细胞。因此，FACS更适合研究用途的小规模细胞分离。 2.6.通过MACS分离 MACS是一种类似于FACS的技术，但使用带有针对特定细胞表面抗原的抗体的磁性颗粒。在磁场中，磁性标记的细胞将在柱中保留，未标记的细胞将流出。例如，通过针对心肌细胞相关表面标记VCAM1（血管细胞粘附分子1）的MACS，从hPSC分化培养中富集心肌细胞至95%。然而，尽管MACS是一种吸引人的方法，可以从细胞混合物中选择性地去除不需要的细胞，但它也有其局限性。例如，一项建模研究表明，为了从分化和未分化细胞的池中清除SSEA-1阳性的未分化干细胞，需要不切实际数量的重复MACS。然而，磁性珠的亲和力也可以通过新型表面修饰来提高，以提高排序效率。MACS的一个优点是，由于成本较低和商业化的自动化、封闭系统的可用性，它比FACS更适合大规模处理。MACS珠的替代品，SpheriTECH，通过简单的亲和结合在大珠上排序细胞，无需纯化标签，就能纯化来自hiPSCs的光感受器前体细胞。 2.7.使用微流控技术分离 微流控技术最近被证明是hPSC培养、表征和筛选的高效工具。微流控技术也可用于异质分化细胞群体的分离。例如，已制造微流控滚动柱用于选择性分离SSEA-1阳性细胞。滚动柱芯片的边界涂有抗体，降低了SSEA-1阳性细胞的滚动速度，而承诺的细胞则流出通道。因此，SSEA-1阳性细胞在通道内停留的时间更长，从而可以从分化细胞中分离出来。通过在微流控芯片底部覆盖有抗Tra（肿瘤相关抗原）-1-60抗体的脊状图案，也进行了类似的操作，从hiPSCs衍生的心肌细胞中消除未分化细胞。 3.表面标记识别用于分离hPSC衍生细胞 由于FACS和MACS依赖于表面标记的检测，因此识别不同谱系在hPSC分化过程中不同阶段的特异性表面标记非常重要。我们讨论了关于未分化细胞和三个胚层衍生物（包括神经细胞、心肌细胞和胰腺前体）表面标记的研究示例（表1）。 3.1.未分化细胞的表面标记 表面标记如Tra-1-60、Tra-1-81和SSEA-4已被用于识别和去除未分化的hPSCs（小鼠胚胎干细胞，mESCs使用SSEA-1）。例如，FACS和MACS可以从其他细胞中分离出SSEA-4和Tra-1-81标记的hESCs（人类胚胎干细胞），针对SSEA-5、CD（分化群）9和CD90的FACS，这些是多能干细胞的标记，可以从未完全分化的hESC培养物中去除具有畸胎瘤形成潜力的细胞。波达卡林样蛋白-1也在未分化细胞中高度表达，识别波达卡林样蛋白-1的细胞毒性抗体已被用于选择性杀死未分化的hESCs。此外，表面蛋白的特定糖基化可以区分多能细胞和非多能细胞；因此，具有独特结合能力的凝集素已被用于去除hPSCs。 需要注意的是，畸胎瘤也可能起源于仍具有干细胞特征且未完全分化的前体细胞；因此，这些前体细胞也需要从干细胞衍生产品中去除。无论如何，对于安全的细胞治疗来说，确定去除标准和检测未分化干细胞或前体的检测方法的灵敏度至关重要。 3.2.神经分化的表面标记 当前的hPSCs神经分化方法在发育阶段和谱系规范方面导致细胞异质性。CD133、A2B5、CD29、CD146、NCAM（神经细胞黏附分子）（或CD56）和CD271被报道为神经前体细胞（NPCs）的表面标记，CD24和NCAM是神经元的表面标记。通过FACS靶向CD24或NCAM可以分离分化的神经元。NPCs、神经元和胶质细胞的分离也可以通过标记组合实现（例如CD184+/CD271−/CD44−/CD24+用于NPCs；CD271−/CD133+用于神经元），不同的组合可以用来描绘NPCs：CD184+/CD326−、CD133+/CD45−/CD34−，CD133、CD15和GCTM-2的表达，以及CD24、CD15和CD29的表达。最近，使用CORIN（一种地板板标记）来分离人类iPSC衍生的多巴胺能前体。使用LMX1AEGFP（LIM同源框转录因子1-A）报告细胞系，已鉴定出可以从hESCs衍生的多巴胺能神经元中选择性富集的新膜标记，如多唾液酸化的胚胎形式的神经细胞黏附分子（PSA-NCAM）和接触蛋白2（CNTN2）。其他研究已经鉴定出新的表面标记，用于正向富集中脑多巴胺能神经元，如LRTM1（富含亮氨酸重复和跨膜域1）、CORIN和CD166，或在LMX1+ FOXA2（叉头框A2）+细胞分选后去除不需要的细胞（CXCR4，C-X-C基序趋化因子受体4）的标记。 报道的少突胶质细胞前体的表面标记包括NG2（神经/胶质抗原2）、PDGFRα（血小板衍生生长因子受体α）和DLX2（远端缺乏同源框2）或PDGFRα/CD140。然而，由于细胞表型的异质性很大，因此很难仅基于单一标记分离少突胶质细胞。 3.3.心肌细胞分化的表面标记 已经鉴定了心脏前体细胞和成熟心肌细胞的标记。KDR（激酶插入域受体）low/C-KITneg心脏前体细胞表达高水平的心脏转录因子，并且在进一步分化后可以产生>50%的心肌细胞。同样，KDR+/PDGFRα+心脏前体细胞可以分化成>80%的心肌细胞。此外，也已经鉴定出心肌细胞特异性表面标记，包括信号调节蛋白α（SIRPA）、VCAM1和活化的白细胞细胞粘附分子（ALCAM）。从起始培养物中基于SIRPA的选择，这些培养物约有40-50%的心肌肌钙蛋白T阳性（cTnT+），90-98%的细胞对cTnT+呈阳性。通过MACS基于VCAM1的选择可以富集cTnT+细胞高达95%。与这些正向选择方法相比，对于心肌细胞分化效率高（80-90%）的培养物，可能考虑去除不需要的细胞群体。同样，可以使用VCAM1偶联的磁性Dyna珠子或整合素（α1、α5和α6）和N-钙粘蛋白纯化心肌细胞至90%以上纯度。 3.4.内胚层、肝脏、肾脏和胰腺细胞分化的表面标记 hPSC衍生的胰腺细胞是异质性的。CD142被鉴定为胰腺内胚层（PE）细胞的标记，这些细胞能够产生具有葡萄糖反应性的胰岛素分泌细胞，而CD200和CD318是内分泌细胞的标记。因此，靶向如CD142这样的标记可以富集PE细胞，这也被证明可以降低畸胎瘤形成的概率（从46%降低到0%）。GLUT2（葡萄糖转运蛋白2），与PDX-1（胰腺和十二指肠同源盒1）共表达，以及与PDX-1+细胞相关的CD24，也已被评估用于富集来自hPSCs的胰腺前体细胞。此外，在一项针对SOX17以分离hESC衍生内胚层细胞的研究中，已鉴定出表面标记CXCR4、CD49e、CD141和CD238。尽管CD133被报道为小鼠胰腺前体的标记，但它在人类中的表达可能比胰腺PDX-1阳性细胞更广泛。更成熟的内胚层细胞，如源自PSCs的肝细胞，也可以通过特定的膜标记（例如SLC10A1（溶质载体家族10成员1）、CLRN3（Clarin 3）或AADAC（芳基乙酰胺脱乙酰酶）），或ASGR1（即Asialoglycoprotein受体1）进行分离。通过一组膜标记，如CD9−/CD140a+/CD140b+/CD271+细胞，还可以分离出OSR（Odd-Skipped Related Transcription Factor）1+/SIX2（SIX同源框2）+肾脏前体细胞。类似地，通过选择性耗尽CD200+细胞可以选择性地分离角膜上皮细胞。 然而，仍然存在问题，即通过不同标记集识别的细胞群体是否是不同阶段的相同细胞，还是沿着相似发育轨迹的不同细胞。对于生产目的，需要对分离的群体进行全面表征，并证明其对目标应用具有一致的属性。 3.5.用于分离hPSC衍生细胞的非表面标记 除了表达在细胞膜上之外，特定于特定细胞的标记也可以用于分离这些细胞。例如，可以通过分子信标（MBs）检测活细胞中的mRNA，它们是带有荧光团的茎-环（发夹）寡核苷酸探针，另一端带有猝灭剂。针对Oct-4（八聚体结合转录因子4）或Sox2（性别决定区Y盒2）的MBs可以从分化细胞中分离未分化的PSCs；针对心肌细胞标记肌球蛋白重链β（MYH7）的MBs可以富集来自小鼠和人类胚胎干细胞的心肌细胞；针对NPPA（心钠素A型）mRNA的MB，已知与早期工作型心肌细胞相关，可以从心肌细胞分化培养中富集工作型心肌细胞。对于使用MBs进行细胞分离，精心设计并广泛验证针对所需基因的MB探针至关重要。 3.6.敲入报告细胞系 基因组编辑技术（例如CRISPR/Cas9（簇状规律间隔短回文重复/CRISPR相关蛋白9）、TALEN（转录激活因子样效应核酸酶）等）的应用使得构建新型细胞系成为可能，这些细胞系在特定标记表达时发出荧光或通过诱导抗生素抗性而具有特定表型，从而实现纯化。例如，CRISPR/Cas9编辑hiPSCs已实现双报告TBX5（T-Box转录因子5）Clover2和NKX2-5（NK2同源框5）TagRFP细胞的生成，用于纯化心脏细胞亚型，如来自第一心脏领域、心外膜、第二心脏领域和内皮细胞系的细胞。或者，NKX2-5eGFP/w和MLC（肌球蛋白调节轻链）2vmCherry/w报告细胞已被生成以分离心室样细胞。基因组编辑（TALEN）也被用来在肌球蛋白轻链2（MYL2）位点引入选择标记（新霉素）或GFP，用于识别和选择心室心肌细胞。同样，引入在心脏特异性α-肌球蛋白重链（即α-MHC，MYH6）启动子控制下的Zeocin抗性基因已被用于在心肌梗死小鼠模型中纯化iPSC衍生的心肌细胞（iPSC-CMs）。 类似的策略也被用于识别和选择肌源性衍生物。例如，CRISPR/Cas9介导的同源重组方法已被用于选择MYF5（肌源因子5）GFP肌肉前体。构建双报告PAX7（配对盒7）tdTomato和MYF5EGFP使得能够纯化肌肉干细胞（卫星细胞），而诱导PAX7表达系统促进了均匀的骨骼肌源性前体细胞群体的生成。报告细胞也已生成用于纯化神经衍生物。例如，引入驱动mCherry表达的人类囊泡GABA（γ-氨基丁酸）转运蛋白（hVGAT）启动子已实现GABA能神经元的分离，而中脑多巴胺能神经元可以使用酪氨酸羟化酶（TH）RFP构建进行选择。然而，鉴于hPSC衍生物的治疗应用，这些方法可能因基因组修改而增加肿瘤形成的风险。 4.hPSC衍生细胞下游生物加工的工作流程 hPSC衍生细胞生产的下游生物加工涉及多个步骤，这些步骤将累积减少每个步骤的产量（图1B显示了使用MACS耗竭的示例）。主要步骤包括：(1) 细胞收获：将细胞从大量培养容器的粘附表面分离；(2) 离心或浓缩和培养基交换：去除收获酶并洗涤细胞；(3) 保持：收集的细胞在缓冲液中保持，等待所有细胞被收获和离心；(4) 耗竭：去除不需要的杂质细胞；(5) 离心：去除耗竭缓冲液，并在冷冻保护缓冲液中重悬；(6) 细胞配方用于冷冻保存：将细胞转移到冷冻管中并准备冷冻保存。由于这些众多步骤，如果每个步骤的产量为90%（理想情况），最终产量将是50-60%，如果每个步骤的产量为80%（良好情况），最终产量将是30-35%。因此，由于下游加工，可能会损失超过一半的细胞，这通常发生在细胞扩增和分化数月后的一个工作日。 因此，了解每个步骤的操作参数绝对是必要的，以最小化细胞损失的同时保持功能活性细胞。 4.1.细胞收获 从大量容器中收获细胞的关键组成部分是收获酶和洗涤体积。酶的高浓度或不适当的解离溶液或持续时间可能会降低细胞活性和/或无法去除表面上的所有细胞。对于分化培养，胰蛋白酶一直是常用的酶，但其浓度和孵化时间需要针对特定细胞类型进行优化。使用作为高渗溶液配制的柠檬酸钠的新非酶传代方法已被用于分离hPSCs的多细胞聚集体。对于生物加工，希望减少收获体积，这需要在低体积和由于洗涤不足导致的细胞损失之间取得平衡。通过将温度从37°C改变到4°C，使用热响应水凝胶释放hPSCs的新进展已经实现。 4.2.离心 离心过程中的参数包括速度、时间、细胞悬浮液体积和细胞浓度。已经观察到不同细胞收集的沉降变化，这触发了多次离心。收获酶、淬灭缓冲液和等待时间都可能有助于沉降性能。对于大量容器，需要开发大规模离心过程（例如使用袋子）以减少离心步骤的时间。 4.3.保持缓冲液和保持温度 当容器数量高（>100 T- flasks）且处理时间长（长达6-8小时）时，保持过程变得重要。为了将所有细胞一起用于后续处理，首先收获的细胞必须在缓冲液中等待，直到收获步骤完成。因此，需要评估保持缓冲液和保持温度（37°C、25°C或4°C）以维持细胞活性。在制定保持缓冲液时，应考虑细胞聚集。尽管收获的细胞处于单细胞悬浮状态，但细胞可能在保持期间自组装成聚集体。聚集的程度取决于细胞类型、细胞浓度和保持时间。聚集体的形成将影响后续步骤中细胞标记和分离的效率，显著降低细胞产量。 4.4.耗竭缓冲液配方和体积 当细胞群体中有高比例的所需细胞时，耗竭被用来去除少量的杂质细胞。这个过程可以通过MACS针对不需要的细胞表面上的标记来完成。耗竭缓冲液的要求与保持缓冲液相似：维持细胞活性和防止细胞聚集。聚集的细胞不允许与抗体偶联珠均匀标记和容易的细胞-珠分离（图1C）。因此，需要仔细制定耗竭缓冲液。耗竭的细胞浓度和体积影响耗竭规模。首选高细胞浓度（>107细胞/mL）和低体积（<100 mL），同时需要最小化细胞损失。由于可以使用多个标记进行耗竭，因此可能需要重复此步骤以去除不同的细胞群体。 4.5.冷冻保存配方 冷冻保存缓冲液和体积是该步骤的重要参数。一般来说，冷冻保存缓冲液取决于感兴趣的分化细胞类型，冷冻保存的细胞浓度取决于预期的应用。对于移植研究，可能需要高浓度的细胞（每管107-108个细胞），以最小化解冻过程的时间和达到所需细胞剂量的管数。 5.hPSC衍生产品下游加工的挑战 5.1.hPSC衍生神经前体细胞下游加工的挑战 使用MACS已经实现了从PSCs衍生的神经元的大规模纯化，产量高达105-106个神经元（纯度超过90%）。然而，这些特定谱系的下游加工仍然存在特定挑战。在神经前体细胞的情况下，收获的细胞密度相对较低（约每平方厘米1×106个细胞），这可能需要从大量容器中收获细胞。如果能够达到更高的收获密度，那么为了获得所需数量的细胞（每次生产约109个细胞，下游加工体积为50-100 mL），所需的容器数量将显著减少。通过增加播种密度和/或增强细胞增殖来增加收获密度。然而，根据培养系统和细胞表型对密度变化的敏感性，播种密度可能会影响自分泌和旁分泌因子的分泌，这些因子已被证明影响hPSC的自我更新和分化。为了增强细胞增殖，可以考虑改变生长培养基（含有生长因子）和通常涂有层粘连蛋白、Matrigel和纤维连接蛋白等基质蛋白的基质。然而，对培养基和基质所做的任何改变都需要仔细比较。 5.2.hPSC衍生心肌细胞下游加工的挑战 对于心肌细胞来说，下游生物加工的负担比神经前体细胞更为严重。治疗应用所需的细胞数量对心肌细胞来说更高（每次生产约1010个细胞），比神经前体细胞（每次生产约109个）多。在心肌细胞的下游生物加工的所有步骤中，可能需要比神经前体细胞多10倍的浓缩细胞制备或多10倍的悬浮液体积。使用代谢选择方法已经实现了从人类PSCs衍生的心肌细胞的大规模纯化，纯度达到99%，产量高达2×109个功能细胞。心肌细胞也比神经前体细胞更容易形成聚集体，因此耗竭步骤的产量可能会降低。为了有效地用磁性珠标记细胞并分离不同的群体，心肌细胞需要在下游生物加工过程中保持为单细胞悬浮液。因此，需要制定保持缓冲液和耗竭缓冲液（例如抗聚集剂、生物聚合物）以防止细胞聚集（图1C）。鉴于治疗用途所需的数量，hPSC衍生心肌细胞的下游加工规模可能很大。因此，将需要扩大下游生物加工过程中不同步骤的规模（例如大规模离心）。或者，为收获hPSC衍生心肌细胞设计的自动化过程将是有益的。 6.结论和展望 在实现了hPSCs的高效分化后，下游生物加工已成为生产hPSC衍生细胞治疗产品的瓶颈。识别所需谱系的特定标记和去除未分化细胞的策略对于生产安全的细胞治疗至关重要。理想情况下，高细胞纯度，去除不需要的细胞类型将减少下游生物加工的负担。需要开发严格的质量控制系统和高灵敏度的检测方法，以确保细胞分离后产品的一致性。能够预测体内效应的体外检测是可取的，以减少临床前研究的数量。应用质量由设计（QbD）策略来理解过程和产品，更好地控制过程，以生产一致和安全细胞产品应该可能实现hPSCs的潜力。 为促进抗体行业的交流与创新，2024年10月16-17日第七届金秋十月抗体产业发展大会如约而至。会议旨在为研究人员提供一个互动交流的平台，有助于推动抗体产业的进一步发展。 会议内容 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摘要：随着人类多能干细胞（hPSCs）特定谱系分化技术的进步，下游细胞分离已成为生产hPSC衍生产品的关键步骤。由于分化过程通常导致异质细胞群的形成，需要进行细胞分离，以富集所需的细胞群或去除不需要的细胞群。本文总结了hPSC衍生细胞分离过程的最新进展，包括标准的分离技术，如磁激活细胞分选，以及基于粘附强度和代谢通量等新型分离策略。特别讨论了下游生物加工流程和不同细胞谱系表面标记的识别。尽管大规模hPSC衍生细胞的下游生物加工仍面临挑战，但应实施合理的质量设计方法，以增强对过程与产品之间关系的理解，并确保所产生细胞的安全性。 1.引言 人类多能干细胞（hPSCs）因其独特的自我更新能力和分化成几乎所有类型细胞的能力，为多种体细胞组织提供了替代细胞来源。hPSC衍生物已在几个I期临床试验中进行了测试，以评估它们作为治疗产品的潜在用途，并且还用于药物发现和疾病建模。最初，hPSC衍生细胞的开发和制造集中在优化分化效率上，即上游生物加工，从而改进了分化协议，允许以高效率和纯度生产特定谱系的细胞。例如，使用基于胚胎体（EB）的协议或通过双重抑制SMAD（小母体抗背足蛋白）信号的单层协议，可以从hPSCs中以70-90%的纯度生成少突胶质细胞前体（OPCs）和神经前体细胞（NPCs），以及使用生长因子或小分子引导的协议可以生产30-90%纯度的心肌细胞。这些高效分化协议的开发显示了上游生物加工在生产hPSC衍生细胞方面的巨大进展。然而，下游生物加工（即细胞分离），作为完成hPSC衍生产品的关键步骤和瓶颈，需要进一步研究。 由于当前从hPSCs分化的过程通常会产生包括残留未分化细胞在内的混合细胞类型，因此需要进行下游生物加工，以选择性纯化所需的细胞群或去除不需要的细胞群（图1A）。例如，最终的干细胞产品不含未分化细胞或不需要的谱系的前体细胞对于减少移植后畸胎瘤形成的风险至关重要。在这里，我们回顾了hPSC衍生物的新兴下游生物加工，包括hPSC扩增和分化后的细胞分离的最新进展。我们提供了识别新型谱系特异性表面标记的例子，这些标记可以用于分离hPSC衍生细胞。此外，我们还讨论了hPSC下游生物加工的方法和实际流程，以及生产神经和心脏细胞面临的特定挑战。 图1 hPSC衍生产品的下游生物加工。(A) 富集和耗竭策略以分离hPSC衍生细胞。(i) 富集：收集所需细胞（适用于低分化效率）。(ii) 耗竭：去除不需要的细胞（适用于高分化效率）。(B) 下游处理的主要步骤。(1) 细胞收获；(2) 离心以去除收获酶；(3) 保持等待所有细胞被收获；(4) 耗竭以去除不需要的细胞；(5) 离心以去除耗竭缓冲液；以及 (6) 填充和完成将细胞转移到冷冻保护缓冲液中进行冷冻保存。如果每个步骤在理想情况下的产量为90%，则这些步骤后的总产量预计为59%。(C) 聚集对大规模细胞标记的影响。(i) 单细胞悬浮液允许用磁性珠进行细胞标记。(ii) 如果发生聚集，目标细胞无法均匀标记，聚集体中未标记的细胞被去除，从而降低了产量。(iii) 具有高聚集倾向的细胞保持在配制的缓冲液中作为单细胞悬浮液，以提高处理效率。本图包含了Servier Medical Art (smart.servier.com)的图像。 2.纯化hPSC衍生产品的技术 在分化过程中，hPSCs及其衍生物在细胞密度、表面标记的表达、代谢需求和粘附强度方面具有阶段特异性。基于这些和其他特征，已经评估了不同类型的干细胞衍生细胞的分离过程，包括基于密度的分离和荧光激活细胞分选（FACS）以及基于特定表面标记的磁激活细胞分选（MACS）等标准分离技术。随着对hPSC属性的更好理解，也开发了基于差异粘附到培养容器的细胞分离和基于不同代谢活性的选择性去除细胞等新型分离策略。 2.1.基于密度的分离 在分化培养中可能会产生具有不同细胞密度的混合细胞类型，可以根据它们的密度进行分离。一个例子是使用Percoll梯度离心来富集hPSC衍生的心肌细胞。从分化培养中收获的细胞被加载到Percoll的两层上，然后进行离心。大多数心肌细胞将出现在Percoll的下层，而非心肌细胞将在其他分数中。从含有大约50%心肌细胞的起始分化培养中可以获得高达95%纯度的心肌细胞。然而，这种方法分辨率低，不适合大规模分离。 2.2.基于细胞生物物理特性的分离 在未分化的hPSCs、部分重编程细胞、体细胞和hPSC衍生的分化细胞之间观察到显著的生物物理特性差异。例如，粘附特性、质膜刚度和光学特性在hPSCs的不同发育阶段表现出不同。这些特性的变化可以作为选择特定承诺群体的目标。 hPSC衍生的心肌细胞显示出来自肌球蛋白杆状体的特定二次谐波信号，这使得它们能够从异质的分化细胞群体中分离出来。或者，从重新培养的分化hESC聚集体中衍生的神经嵴细胞会自发地从主要细胞团中分离出来，这使得它们可以通过形状选择和手动挑选进行隔离。 另一方面，从小鼠诱导多能干细胞（miPSCs）衍生的扩增色素细胞被证明比非色素细胞更具粘附性。这种特性使得它们可以通过调节暴露时间和酶解离的类型来进行纯化：非色素菌落可以通过5分钟的Accutase处理和吹打来回收，而剩余的粘附色素细胞可以用胰蛋白酶二次回收。类似地，在细胞解离前用ROCK（Rho相关蛋白激酶）抑制剂（Y-27632）进行介质补充，可以去除粘附性较低的细胞，从而富集内皮祖细胞。此外，发现退出多能性会增加细胞膜刚度。这些膜流动性和脂质组成的改变可以与分化阶段联系起来。基于这一原理，可以根据膜流动性条件下它们的粘附特性进行细胞分离，以选择各种分化细胞。 人类诱导多能干细胞（hiPSC）菌落可以在4分钟内通过85-125 dynes/cm2的剪切应力在流体流动应用下脱落，而分化细胞由于粘附强度更高而保持附着。这种方法可以从异质重编程培养物和分化的后代中分离出完全重编程的iPSC菌落，纯度超过95%。然而，这种方法尚未评估用于特定谱系分化的细胞。 由于细胞/粘附表面相互作用在分化过程中受到调节，这导致了新型生物材料的开发，用于特定分化表型的细胞隔离。在未分化阶段，iPSC菌落可以从热敏聚合物（PNIPAAm（聚（N-异丙基丙烯酰胺）））在低温（即22°C）下选择性脱落，而承诺的细胞仍然附着在表面。这种方法可以实现未分化干细胞群体的非侵入性富集。类似地，hiPSCs承诺用于心脏谱系，种植在与层粘连蛋白-521涂层的聚（N-异丙基丙烯酰胺）上，其临界溶液温度在8°C，促进心肌细胞的特定脱落。 此外，研究发现，通过高速激光照射光响应聚合物的特定区域（即聚[（甲基丙烯酸甲酯）-共（分散黄7丙烯酸酯）]层）可以消除承诺的细胞。或者，不同亚型的层粘连蛋白促进各种分化细胞类型的不同粘附强度。例如，LN211/332/511E8促进非上皮细胞的粘附，而LN332/511E8则有利于上皮细胞的附着和增殖。细胞与不同层粘连蛋白亚型结合的特异性使角膜上皮细胞能够从异质分化的细胞中纯化。 2.3.基于代谢活性的选择性细胞去除 基于心肌细胞和非心肌细胞在葡萄糖和乳酸代谢上的显著生化差异，可以从hPSC分化培养中获得高纯度（高达99%）的心肌细胞。未分化的hPSCs和主要依赖糖酵解的非心脏细胞在葡萄糖耗尽和乳酸丰富的条件下无法生存，而心肌细胞可以通过使用乳酸作为替代能源而存活。因此，在补充乳酸的葡萄糖耗尽培养基中，心肌细胞更倾向于存活并因此被富集。同样，使用葡萄糖耗尽并补充脂肪酸和3,3′,5-三碘-L-甲状腺素（即促进脂肪酸氧化和线粒体生物发生的分子）的培养基，已报道了心肌细胞的选择和成熟。视网膜上皮细胞（RPE）被发现表达高水平的脂蛋白受体内化AcLDL（乙酰化低密度脂蛋白）。基于这一原理，使用Dil偶联的AcLDL对分化的RPE群体进行特异性标记和富集。另一个例子是靛青绿（ICG）被肝细胞特异性内化。通过修改ICG的荧光发射特性，设计了一种肝细胞纯化剂（HPA，λem = 562 nm），用于标记和体外分选来自hPSCs的纯化肝细胞。 2.4.负选择 与正细胞选择相反，其他方法已经开发出来，通过特异性诱导不需要的细胞类型的凋亡来去除它们，从而提高所需表型的回收率。例如，将PSCs转染与合成微小RNA（miRNA）开关（即在没有目标miRNA的情况下减少相关蛋白的翻译水平），miR-Bim（Bcl-2相互作用的细胞死亡介质）开关，诱导未分化细胞的选择性凋亡，同时保持分化的心肌细胞。或者，凝集素rBC2LCN-PE23被发现能够特异性结合并内化到未分化的干细胞，并诱导它们的凋亡。这种化合物被发现可以有效地降低畸胎瘤形成的风险。 2.5.通过FACS分离 FACS设备可以检测用荧光素偶联抗体标记的细胞的荧光信号。基于标记特征和目标标记（通常是表面抗原），FACS允许将单个细胞根据多个表面标记进行高选择性地排序和分离成不同群体（例如SSEA（阶段特异性胚胎抗原）-4阳性或SSEA-4阴性）。FACS的一个优点是它允许基于多个表面标记进行连续和多参数分离，尽管细胞活性可能会受到排序程序的影响。然而，FACS的通量有限，每秒可排序5×103到7×104个细胞。因此，FACS更适合研究用途的小规模细胞分离。 2.6.通过MACS分离 MACS是一种类似于FACS的技术，但使用带有针对特定细胞表面抗原的抗体的磁性颗粒。在磁场中，磁性标记的细胞将在柱中保留，未标记的细胞将流出。例如，通过针对心肌细胞相关表面标记VCAM1（血管细胞粘附分子1）的MACS，从hPSC分化培养中富集心肌细胞至95%。然而，尽管MACS是一种吸引人的方法，可以从细胞混合物中选择性地去除不需要的细胞，但它也有其局限性。例如，一项建模研究表明，为了从分化和未分化细胞的池中清除SSEA-1阳性的未分化干细胞，需要不切实际数量的重复MACS。然而，磁性珠的亲和力也可以通过新型表面修饰来提高，以提高排序效率。MACS的一个优点是，由于成本较低和商业化的自动化、封闭系统的可用性，它比FACS更适合大规模处理。MACS珠的替代品，SpheriTECH，通过简单的亲和结合在大珠上排序细胞，无需纯化标签，就能纯化来自hiPSCs的光感受器前体细胞。 2.7.使用微流控技术分离 微流控技术最近被证明是hPSC培养、表征和筛选的高效工具。微流控技术也可用于异质分化细胞群体的分离。例如，已制造微流控滚动柱用于选择性分离SSEA-1阳性细胞。滚动柱芯片的边界涂有抗体，降低了SSEA-1阳性细胞的滚动速度，而承诺的细胞则流出通道。因此，SSEA-1阳性细胞在通道内停留的时间更长，从而可以从分化细胞中分离出来。通过在微流控芯片底部覆盖有抗Tra（肿瘤相关抗原）-1-60抗体的脊状图案，也进行了类似的操作，从hiPSCs衍生的心肌细胞中消除未分化细胞。 3.表面标记识别用于分离hPSC衍生细胞 由于FACS和MACS依赖于表面标记的检测，因此识别不同谱系在hPSC分化过程中不同阶段的特异性表面标记非常重要。我们讨论了关于未分化细胞和三个胚层衍生物（包括神经细胞、心肌细胞和胰腺前体）表面标记的研究示例（表1）。 3.1.未分化细胞的表面标记 表面标记如Tra-1-60、Tra-1-81和SSEA-4已被用于识别和去除未分化的hPSCs（小鼠胚胎干细胞，mESCs使用SSEA-1）。例如，FACS和MACS可以从其他细胞中分离出SSEA-4和Tra-1-81标记的hESCs（人类胚胎干细胞），针对SSEA-5、CD（分化群）9和CD90的FACS，这些是多能干细胞的标记，可以从未完全分化的hESC培养物中去除具有畸胎瘤形成潜力的细胞。波达卡林样蛋白-1也在未分化细胞中高度表达，识别波达卡林样蛋白-1的细胞毒性抗体已被用于选择性杀死未分化的hESCs。此外，表面蛋白的特定糖基化可以区分多能细胞和非多能细胞；因此，具有独特结合能力的凝集素已被用于去除hPSCs。 需要注意的是，畸胎瘤也可能起源于仍具有干细胞特征且未完全分化的前体细胞；因此，这些前体细胞也需要从干细胞衍生产品中去除。无论如何，对于安全的细胞治疗来说，确定去除标准和检测未分化干细胞或前体的检测方法的灵敏度至关重要。 3.2.神经分化的表面标记 当前的hPSCs神经分化方法在发育阶段和谱系规范方面导致细胞异质性。CD133、A2B5、CD29、CD146、NCAM（神经细胞黏附分子）（或CD56）和CD271被报道为神经前体细胞（NPCs）的表面标记，CD24和NCAM是神经元的表面标记。通过FACS靶向CD24或NCAM可以分离分化的神经元。NPCs、神经元和胶质细胞的分离也可以通过标记组合实现（例如CD184+/CD271−/CD44−/CD24+用于NPCs；CD271−/CD133+用于神经元），不同的组合可以用来描绘NPCs：CD184+/CD326−、CD133+/CD45−/CD34−，CD133、CD15和GCTM-2的表达，以及CD24、CD15和CD29的表达。最近，使用CORIN（一种地板板标记）来分离人类iPSC衍生的多巴胺能前体。使用LMX1AEGFP（LIM同源框转录因子1-A）报告细胞系，已鉴定出可以从hESCs衍生的多巴胺能神经元中选择性富集的新膜标记，如多唾液酸化的胚胎形式的神经细胞黏附分子（PSA-NCAM）和接触蛋白2（CNTN2）。其他研究已经鉴定出新的表面标记，用于正向富集中脑多巴胺能神经元，如LRTM1（富含亮氨酸重复和跨膜域1）、CORIN和CD166，或在LMX1+ FOXA2（叉头框A2）+细胞分选后去除不需要的细胞（CXCR4，C-X-C基序趋化因子受体4）的标记。 报道的少突胶质细胞前体的表面标记包括NG2（神经/胶质抗原2）、PDGFRα（血小板衍生生长因子受体α）和DLX2（远端缺乏同源框2）或PDGFRα/CD140。然而，由于细胞表型的异质性很大，因此很难仅基于单一标记分离少突胶质细胞。 3.3.心肌细胞分化的表面标记 已经鉴定了心脏前体细胞和成熟心肌细胞的标记。KDR（激酶插入域受体）low/C-KITneg心脏前体细胞表达高水平的心脏转录因子，并且在进一步分化后可以产生>50%的心肌细胞。同样，KDR+/PDGFRα+心脏前体细胞可以分化成>80%的心肌细胞。此外，也已经鉴定出心肌细胞特异性表面标记，包括信号调节蛋白α（SIRPA）、VCAM1和活化的白细胞细胞粘附分子（ALCAM）。从起始培养物中基于SIRPA的选择，这些培养物约有40-50%的心肌肌钙蛋白T阳性（cTnT+），90-98%的细胞对cTnT+呈阳性。通过MACS基于VCAM1的选择可以富集cTnT+细胞高达95%。与这些正向选择方法相比，对于心肌细胞分化效率高（80-90%）的培养物，可能考虑去除不需要的细胞群体。同样，可以使用VCAM1偶联的磁性Dyna珠子或整合素（α1、α5和α6）和N-钙粘蛋白纯化心肌细胞至90%以上纯度。 3.4.内胚层、肝脏、肾脏和胰腺细胞分化的表面标记 hPSC衍生的胰腺细胞是异质性的。CD142被鉴定为胰腺内胚层（PE）细胞的标记，这些细胞能够产生具有葡萄糖反应性的胰岛素分泌细胞，而CD200和CD318是内分泌细胞的标记。因此，靶向如CD142这样的标记可以富集PE细胞，这也被证明可以降低畸胎瘤形成的概率（从46%降低到0%）。GLUT2（葡萄糖转运蛋白2），与PDX-1（胰腺和十二指肠同源盒1）共表达，以及与PDX-1+细胞相关的CD24，也已被评估用于富集来自hPSCs的胰腺前体细胞。此外，在一项针对SOX17以分离hESC衍生内胚层细胞的研究中，已鉴定出表面标记CXCR4、CD49e、CD141和CD238。尽管CD133被报道为小鼠胰腺前体的标记，但它在人类中的表达可能比胰腺PDX-1阳性细胞更广泛。更成熟的内胚层细胞，如源自PSCs的肝细胞，也可以通过特定的膜标记（例如SLC10A1（溶质载体家族10成员1）、CLRN3（Clarin 3）或AADAC（芳基乙酰胺脱乙酰酶）），或ASGR1（即Asialoglycoprotein受体1）进行分离。通过一组膜标记，如CD9−/CD140a+/CD140b+/CD271+细胞，还可以分离出OSR（Odd-Skipped Related Transcription Factor）1+/SIX2（SIX同源框2）+肾脏前体细胞。类似地，通过选择性耗尽CD200+细胞可以选择性地分离角膜上皮细胞。 然而，仍然存在问题，即通过不同标记集识别的细胞群体是否是不同阶段的相同细胞，还是沿着相似发育轨迹的不同细胞。对于生产目的，需要对分离的群体进行全面表征，并证明其对目标应用具有一致的属性。 3.5.用于分离hPSC衍生细胞的非表面标记 除了表达在细胞膜上之外，特定于特定细胞的标记也可以用于分离这些细胞。例如，可以通过分子信标（MBs）检测活细胞中的mRNA，它们是带有荧光团的茎-环（发夹）寡核苷酸探针，另一端带有猝灭剂。针对Oct-4（八聚体结合转录因子4）或Sox2（性别决定区Y盒2）的MBs可以从分化细胞中分离未分化的PSCs；针对心肌细胞标记肌球蛋白重链β（MYH7）的MBs可以富集来自小鼠和人类胚胎干细胞的心肌细胞；针对NPPA（心钠素A型）mRNA的MB，已知与早期工作型心肌细胞相关，可以从心肌细胞分化培养中富集工作型心肌细胞。对于使用MBs进行细胞分离，精心设计并广泛验证针对所需基因的MB探针至关重要。 3.6.敲入报告细胞系 基因组编辑技术（例如CRISPR/Cas9（簇状规律间隔短回文重复/CRISPR相关蛋白9）、TALEN（转录激活因子样效应核酸酶）等）的应用使得构建新型细胞系成为可能，这些细胞系在特定标记表达时发出荧光或通过诱导抗生素抗性而具有特定表型，从而实现纯化。例如，CRISPR/Cas9编辑hiPSCs已实现双报告TBX5（T-Box转录因子5）Clover2和NKX2-5（NK2同源框5）TagRFP细胞的生成，用于纯化心脏细胞亚型，如来自第一心脏领域、心外膜、第二心脏领域和内皮细胞系的细胞。或者，NKX2-5eGFP/w和MLC（肌球蛋白调节轻链）2vmCherry/w报告细胞已被生成以分离心室样细胞。基因组编辑（TALEN）也被用来在肌球蛋白轻链2（MYL2）位点引入选择标记（新霉素）或GFP，用于识别和选择心室心肌细胞。同样，引入在心脏特异性α-肌球蛋白重链（即α-MHC，MYH6）启动子控制下的Zeocin抗性基因已被用于在心肌梗死小鼠模型中纯化iPSC衍生的心肌细胞（iPSC-CMs）。 类似的策略也被用于识别和选择肌源性衍生物。例如，CRISPR/Cas9介导的同源重组方法已被用于选择MYF5（肌源因子5）GFP肌肉前体。构建双报告PAX7（配对盒7）tdTomato和MYF5EGFP使得能够纯化肌肉干细胞（卫星细胞），而诱导PAX7表达系统促进了均匀的骨骼肌源性前体细胞群体的生成。报告细胞也已生成用于纯化神经衍生物。例如，引入驱动mCherry表达的人类囊泡GABA（γ-氨基丁酸）转运蛋白（hVGAT）启动子已实现GABA能神经元的分离，而中脑多巴胺能神经元可以使用酪氨酸羟化酶（TH）RFP构建进行选择。然而，鉴于hPSC衍生物的治疗应用，这些方法可能因基因组修改而增加肿瘤形成的风险。 4.hPSC衍生细胞下游生物加工的工作流程 hPSC衍生细胞生产的下游生物加工涉及多个步骤，这些步骤将累积减少每个步骤的产量（图1B显示了使用MACS耗竭的示例）。主要步骤包括：(1) 细胞收获：将细胞从大量培养容器的粘附表面分离；(2) 离心或浓缩和培养基交换：去除收获酶并洗涤细胞；(3) 保持：收集的细胞在缓冲液中保持，等待所有细胞被收获和离心；(4) 耗竭：去除不需要的杂质细胞；(5) 离心：去除耗竭缓冲液，并在冷冻保护缓冲液中重悬；(6) 细胞配方用于冷冻保存：将细胞转移到冷冻管中并准备冷冻保存。由于这些众多步骤，如果每个步骤的产量为90%（理想情况），最终产量将是50-60%，如果每个步骤的产量为80%（良好情况），最终产量将是30-35%。因此，由于下游加工，可能会损失超过一半的细胞，这通常发生在细胞扩增和分化数月后的一个工作日。 因此，了解每个步骤的操作参数绝对是必要的，以最小化细胞损失的同时保持功能活性细胞。 4.1.细胞收获 从大量容器中收获细胞的关键组成部分是收获酶和洗涤体积。酶的高浓度或不适当的解离溶液或持续时间可能会降低细胞活性和/或无法去除表面上的所有细胞。对于分化培养，胰蛋白酶一直是常用的酶，但其浓度和孵化时间需要针对特定细胞类型进行优化。使用作为高渗溶液配制的柠檬酸钠的新非酶传代方法已被用于分离hPSCs的多细胞聚集体。对于生物加工，希望减少收获体积，这需要在低体积和由于洗涤不足导致的细胞损失之间取得平衡。通过将温度从37°C改变到4°C，使用热响应水凝胶释放hPSCs的新进展已经实现。 4.2.离心 离心过程中的参数包括速度、时间、细胞悬浮液体积和细胞浓度。已经观察到不同细胞收集的沉降变化，这触发了多次离心。收获酶、淬灭缓冲液和等待时间都可能有助于沉降性能。对于大量容器，需要开发大规模离心过程（例如使用袋子）以减少离心步骤的时间。 4.3.保持缓冲液和保持温度 当容器数量高（>100 T- flasks）且处理时间长（长达6-8小时）时，保持过程变得重要。为了将所有细胞一起用于后续处理，首先收获的细胞必须在缓冲液中等待，直到收获步骤完成。因此，需要评估保持缓冲液和保持温度（37°C、25°C或4°C）以维持细胞活性。在制定保持缓冲液时，应考虑细胞聚集。尽管收获的细胞处于单细胞悬浮状态，但细胞可能在保持期间自组装成聚集体。聚集的程度取决于细胞类型、细胞浓度和保持时间。聚集体的形成将影响后续步骤中细胞标记和分离的效率，显著降低细胞产量。 4.4.耗竭缓冲液配方和体积 当细胞群体中有高比例的所需细胞时，耗竭被用来去除少量的杂质细胞。这个过程可以通过MACS针对不需要的细胞表面上的标记来完成。耗竭缓冲液的要求与保持缓冲液相似：维持细胞活性和防止细胞聚集。聚集的细胞不允许与抗体偶联珠均匀标记和容易的细胞-珠分离（图1C）。因此，需要仔细制定耗竭缓冲液。耗竭的细胞浓度和体积影响耗竭规模。首选高细胞浓度（>107细胞/mL）和低体积（<100 mL），同时需要最小化细胞损失。由于可以使用多个标记进行耗竭，因此可能需要重复此步骤以去除不同的细胞群体。 4.5.冷冻保存配方 冷冻保存缓冲液和体积是该步骤的重要参数。一般来说，冷冻保存缓冲液取决于感兴趣的分化细胞类型，冷冻保存的细胞浓度取决于预期的应用。对于移植研究，可能需要高浓度的细胞（每管107-108个细胞），以最小化解冻过程的时间和达到所需细胞剂量的管数。 5.hPSC衍生产品下游加工的挑战 5.1.hPSC衍生神经前体细胞下游加工的挑战 使用MACS已经实现了从PSCs衍生的神经元的大规模纯化，产量高达105-106个神经元（纯度超过90%）。然而，这些特定谱系的下游加工仍然存在特定挑战。在神经前体细胞的情况下，收获的细胞密度相对较低（约每平方厘米1×106个细胞），这可能需要从大量容器中收获细胞。如果能够达到更高的收获密度，那么为了获得所需数量的细胞（每次生产约109个细胞，下游加工体积为50-100 mL），所需的容器数量将显著减少。通过增加播种密度和/或增强细胞增殖来增加收获密度。然而，根据培养系统和细胞表型对密度变化的敏感性，播种密度可能会影响自分泌和旁分泌因子的分泌，这些因子已被证明影响hPSC的自我更新和分化。为了增强细胞增殖，可以考虑改变生长培养基（含有生长因子）和通常涂有层粘连蛋白、Matrigel和纤维连接蛋白等基质蛋白的基质。然而，对培养基和基质所做的任何改变都需要仔细比较。 5.2.hPSC衍生心肌细胞下游加工的挑战 对于心肌细胞来说，下游生物加工的负担比神经前体细胞更为严重。治疗应用所需的细胞数量对心肌细胞来说更高（每次生产约1010个细胞），比神经前体细胞（每次生产约109个）多。在心肌细胞的下游生物加工的所有步骤中，可能需要比神经前体细胞多10倍的浓缩细胞制备或多10倍的悬浮液体积。使用代谢选择方法已经实现了从人类PSCs衍生的心肌细胞的大规模纯化，纯度达到99%，产量高达2×109个功能细胞。心肌细胞也比神经前体细胞更容易形成聚集体，因此耗竭步骤的产量可能会降低。为了有效地用磁性珠标记细胞并分离不同的群体，心肌细胞需要在下游生物加工过程中保持为单细胞悬浮液。因此，需要制定保持缓冲液和耗竭缓冲液（例如抗聚集剂、生物聚合物）以防止细胞聚集（图1C）。鉴于治疗用途所需的数量，hPSC衍生心肌细胞的下游加工规模可能很大。因此，将需要扩大下游生物加工过程中不同步骤的规模（例如大规模离心）。或者，为收获hPSC衍生心肌细胞设计的自动化过程将是有益的。 6.结论和展望 在实现了hPSCs的高效分化后，下游生物加工已成为生产hPSC衍生细胞治疗产品的瓶颈。识别所需谱系的特定标记和去除未分化细胞的策略对于生产安全的细胞治疗至关重要。理想情况下，高细胞纯度，去除不需要的细胞类型将减少下游生物加工的负担。需要开发严格的质量控制系统和高灵敏度的检测方法，以确保细胞分离后产品的一致性。能够预测体内效应的体外检测是可取的，以减少临床前研究的数量。应用质量由设计（QbD）策略来理解过程和产品，更好地控制过程，以生产一致和安全细胞产品应该可能实现hPSCs的潜力。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 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