TNF-α x VEGF x IGF-2R

降低PD-L1表达被认为是调节PD-1/PD-L1通路的一种有效的策略，引起了持续的研究兴趣。本文将重点分析能够降低PD-L1表达的分子，并根据是否直接与PD-L1结合将其分为降解剂和下调剂。此外，它还深入探讨了 PD-L1 降解剂以及基于 PD-L1 的联合疗法和多靶点药物开发的合理设计策略和挑战。1. 背景介绍近几十年来，免疫疗法的发展引发了癌症治疗的新革命，其中包括利用免疫系统识别和攻击癌细胞的免疫检查点抑制剂（ICIs）和过继细胞移植（ACT）。细胞死亡蛋白-1（PD-1）/程序性细胞死亡配体1（PD-L1）疗法作为最具代表性的ICIs之一脱颖而出，自1992年发现以来得到了迅速发展（图1）。PD-1、也称为 CD279，是一种 I 型跨膜蛋白，主要表达于各种免疫细胞，包括 B 细胞、T 细胞、自然杀伤细胞(NK)、树突状细胞 (DC) 和肿瘤浸润淋巴细胞 (TIL)。（CD274或B7−H1）是另一种I型跨膜蛋白，作为PD-1的结合配体，主要表达于肿瘤细胞（如肺、肝、结肠、卵巢癌、乳腺癌、食管癌、黑色素瘤等）、B细胞、T细胞、DC、肥大细胞、巨噬细胞和非造血健康组织细胞。在肿瘤微环境中，PD-1与PD-L1相互作用导致PD-L1下调T 细胞功能和抗肿瘤免疫抑制；最终，肿瘤细胞实现免疫逃逸，避免被T细胞杀死。阻断 PD-1/PD-L1 的相互作用将诱导肿瘤中新鲜且未耗尽的替代 T 细胞的富集，从而改善抗肿瘤免疫反应（图 2），成为一种有前途的肿瘤治疗策略。图1. 靶向PD-1/PDL1研发关键进展时间表图2. 肿瘤免疫阻断疗法机制简图迄今为止，多种针对PD-1/PD-L1相互作用的单克隆抗体药物（例如pembrolizumab、dostarlimab、nivolumab、durvalumab、atezolizumab、avelumab等）已被批准用于治疗全谱系肿瘤，并表现出显著的临床疗效。然而，抗体药物的某些固有缺陷，如免疫相关不良事件、药代动力学（PK）特性差、肿瘤组织渗透性差、生产成本高等阻碍了其更广泛的临床应用。针对PD-1/PD-L1的小分子抑制剂自从百时美施贵宝（BMS）公司公开了联芳甲基芳基醚支架作为小分子PD-1/PD-L1抑制剂以来，这种相互作用有望克服抗体药物的上述缺点，并得到了广泛的探索（图3）。2015年共晶结构分析表明小分子PD-1/PD-L1抑制剂不与PD-1结合，而是与PD-L1胞外结构域结合，诱导PD-L1二聚化，形成PD-L1复合物二聚体/抑制剂来阻碍PD-1和PD-L1之间的相互作用。与抗体药物不同，迄今为止还没有小分子PD-1/PD-L1抑制剂上市。迫切需要更多的临床前和临床研究来推进小分子PD-1/PD-L1抑制剂的开发。此外，目前的小分子PD-1/PD-L1抑制剂基于联苯核心支架，普遍表现出较低的口服生物利用度，可能与这些分子的高疏水性有关。同时，PD-1/PD-L1蛋白-蛋白相互作用的平坦、疏水性和延伸的结合界面也增加了开发小分子抑制剂的难度。而且PD-L1的胞质区域参与促进肿瘤细胞增殖的细胞内信号传导，这表明仅通过抑制剂调节PD-1/PD-L1相互作用可能不足以达到预期的抗肿瘤功效。因此，许多研究小组已经试图寻找干扰 PD-1/PD-L1 轴的替代策略，其中减少 PD-L1 表达的降解剂和下调剂引起了持续的研究兴趣，因为它们是“事件驱动的”（例如降解剂），因此可以克服传统抑制剂“占据驱动”的缺点（高剂量、非催化作用、毒性、耐药性等）。在此，我们重点关注PD-L1降解剂和下调剂的药物化学视角，旨在为针对 PD-1/PDL1 轴的药物开发提供鼓舞人心的见解。图3. 代表性的PD-1/PDL1阻断小分子抑制剂2 与 PD-L1 结合的降解剂2.1.通过泛素-蛋白酶体系统降解PD-L1的药物。PD-L1 降解剂最初与 PD-L1 结合，随后通过泛素蛋白酶体系统或溶酶体途径诱导 PD-L1 降解。通过泛素-蛋白酶体系统降解 PD-L1的药物。蛋白水解靶向嵌合体 (PROTAC) 已成为药物发现中的一种新型治疗策略，它通过劫持活细胞中的泛素蛋白酶体系统来诱导致病性靶蛋白的降解。PROTAC 是由三个部分组成的异双功能分子：结合蛋白质的配体感兴趣的，另一个招募E3泛素连接酶的配体，以及连接两个配体的连接子。最近，开发了基于PROTAC的PD-L1降解剂配体和E3 连接酶配体（CRBN、VHL、cIAP 和 MDM2）的四个系列。其中，将 BMS-37 与沙利度胺（CRBN 配体）偶联的化合物 BMS-37-C3（14，图 4）被认为是最有效的 PROTAC 分子，对 PD-L1 表现出显著的降解活性在B16-F10和A375细胞中。此外，在T细胞和A375细胞共培养模型中，BMS-37-C3增强了T细胞对A375细胞的杀伤能力。一般认为，基于CRBN的PROTAC主要降解细胞内蛋白质，因为CRBN存在于细胞质中；因此，BMS-37-C3 诱导细胞表面 PD-L1 降解的确切机制仍有待阐明。图4. BMS-37-C3化学结构和设计策略另一方面，基于抗体的PROTACs（AbTACs）通过招募膜结合E3连接酶RNF43成功地通过溶酶体途径实现了细胞表面PD-L1的降解，表明利用膜结合E3连接酶设计PROTACs可能是一种有效的策略用于降解细胞表面的 PD-L1。在发现BMS-37-C3之前，有报道一种新的PROTAC分子（21a，15），也基于BMS-37和沙利度胺的结构（图5），有效地诱导PD-L1在多个肿瘤细胞中降解。此外，静脉注射化合物21a对皮下接种MC-38细胞的C57BL/6小鼠具有抗肿瘤作用。随后对肿瘤组织的免疫组化分析表明，21a诱导PD-L1降解，改善CD8+ T细胞对肿瘤组织的侵袭。图5. PROTAC化合物21a的化学结构和设计策略此外，还有基于碳点 (CD，carbon-dot，新型的零维荧光纳米材料，尺寸通常小于10 nm，其核含有sp2杂化的碳原子，表面可能有氨基、醚基、羰基、羟基和羧基等官能团。它具有生物相容性好、荧光量子产率高、化学稳定性高、极少光漂白和眨眼现象等特性) 的PROTAC (CDTAC（carbon-dot (CD)-based PROTACs），18)，可通过泛素蛋白酶体系统降解膜蛋白。与传统的基于小分子的PROTAC相比，CDTAC是基于纳米材料的降解剂，可以通过内吞作用被肿瘤细胞摄取。PD-L1 靶向 CDTAC 是通过将BMS-1166（一种 PD-L1 配体）和沙利度胺与 CD 上的氨基结合而获得的（图 6），在B16-F10 和 CT26 细胞内体外和体内有效诱导PDL1 降解。CDTAC通过内吞作用转运至溶酶体，然后释放至细胞质。在细胞质内，CDTAC 通过泛素-蛋白酶体系统有效诱导 PD-L1 降解。此外，CDTACs可以激活干扰素基因刺激剂（STING）通路，从而促进树突状细胞（DC）的生长成熟和 T 细胞启动。图6. 靶向PD-L1 降解CDTACs设计策略和合成路线BMS-1166（图 3）是一种直接与 PD-L1 结合的 PD-1/PD-L1 抑制剂。BMS-1166影响PD-L1糖基化并抑制PD-L1从内质网（ER）转运至高尔基体，导致泛素化和蛋白酶体降解PD-L1。这些结果表明，BMS-1166 与 PD-L1 的结合可能会破坏 PDL1 的翻译后加工，激发研究人员探索其他 PD-1/PDL1 抑制剂是否具有通过类似或不同机制降解 PD-L1 的能力。2.2.通过溶酶体途径降解PD-L1的药物。多种化合物对PD-1/PD-L1的相互作用表现出显著的抑制活性，其中只有化合物P22（21，图7）将BMS-1198与泊马来酰胺结合，弱诱导PD-L1降解，而BMS-1198和泊马来酰胺不影响PD-L1的水平。用MG132（蛋白酶体抑制剂）和Bafilomycin（溶酶体抑制剂）处理表明，P22通过溶酶体依赖途径诱导PD-L1的降解是通过溶酶体依赖的途径，这与依赖于泛素-蛋白酶体系统的典型CRBN-based PROTAC分子不同。此外，在Hep3B/OS-8/hPD-L1和CD3+ T细胞共培养模型中，P22剂量依赖性地促进了IFN-γ的分泌。图7. PD-L1 降解PROTAC化合物P22的设计策略和合成路线综上所述，需要进一步研究经典PROTACs诱导PD-L1降解的机制。此外，在上述研究中，除AbTACs和CDTACs外，还需要高剂量的化合物（>2.5 μM）来观察PD-L1的大量降解。因此，必须开发出更有效的能够诱导PD-L1降解的PROTACs。利用膜结合的E3连接酶设计PROTACs，如AbTACs，可能是通过溶酶体途径降解细胞表面PD-L1的有效策略。此外，代谢稳定性影响靶向PD-L1的小分子抑制剂和PROTACs的发展；因此，它也可能是这些杂交化合物（即PD-L1 PROTACs）的严重障碍。更重要的是，细胞外的PD-L1，如存在于外泌体中或作为自由溶性蛋白的PDL1，也在抑制抗肿瘤免疫反应中发挥重要作用，而目前的PROTACs不能靶向细胞外蛋白。与典型的 PROTAC 不同，溶酶体靶向嵌合体 (LYTAC) 最初由 Bertozzi 及其同事开发，用于通过溶酶体途径降解细胞外和膜相关蛋白。LYTAC也是由三个部分组成的异双功能分子：结合感兴趣蛋白质的小分子或抗体，结合细胞表面溶酶体靶向的另一种配体受体（LTR）和连接两个配体的接头。为了响应 LYTAC，目标蛋白与 LYTAC 和LTR 形成三元复合物，随后经历内吞作用和溶酶体降解（图 8）。基于上述原理和机制，PD-L1抗体与阳离子非依赖性甘露糖6-磷酸受体（CI-M6PR；也称为胰岛素样生长因子2受体，IGF2R）的糖多肽配体偶联，该受体是一种典型的胰岛素样生长因子2受体（IGF2R）。细胞表面 LTR，导致MDA-MB-231 和 HDLM-2 细胞系中通过溶酶体途径的细胞表面 PD-L1 表达水平显着降低。除了PD-L1之外，载脂蛋白E4 CD71和表皮生长因子受体（EGFR）也被相应的LYTAC降解。为了开发更有效和可药物化的PD-L1 LYTAC，需要大量的研究工作。首先，可以设计靶蛋白和细胞表面LTR的小分子配体并将其应用于PD-L1 LYTAC，例如Spiegel及其同事诱导α二硝基苯酚（DNP）抗体和巨噬细胞迁移抑制因子降解的工作（ MIF）与小分子 LYTAC。其次，除了CI-M6PR之外，还应该探索更多类型的细胞表面LTR，例如肝脏特异性脱唾液酸糖蛋白受体（ASGPR）、分拣蛋白和转铁蛋白受体。此外，Jiang和同事设计了信号介导的溶酶体靶向嵌合体（ SignalTAC）根据 CI-M6PR 的溶酶体分选信号降解 PD-L1这也可能为 LYTAC 的开发提供鼓舞人心的结果。第三，LYTACs的PK、药效学（PD）和安全性需要进一步研究。图8. 靶向PD-L1的LYTACs设计策略基于 LYTAC 技术，Liu 及其同事最近开发了基于 DNA 适配体的共价 LYTAC，其一侧靶向 CI-M6PR，另一侧允许生物正交共价缀合增强与 PD-L1 的特异性结合（图 9）。与非共价对应物相比，共价 LYTAC 表现出显着且更有效的 PD-L1 降解效力。除了阻断 PD-1/PD-L1 相互作用外，共价 LYTAC 还通过降解 PD-L1 引起肿瘤细胞的免疫原性凋亡。此外，体内研究表明，与PD-L1抗体相比，共价LYTAC具有更强的抗肿瘤功效和更少的炎症损伤。基于适配体的药物是一种新兴技术，具有非免疫原性、特异性高、生产成本低等优点，但较差的PK特性可能阻碍其进一步发展。图9. 靶向PD-L1的共价LYTACs设计策略与 LYTAC 类似，Fang 及其同事开发了一种整合素促进溶酶体降解 (IFLD) 策略，以整合素和溶酶体依赖性方式降解细胞外和膜相关蛋白。IFLD分子也是由靶蛋白配体、整联蛋白配体和接头组成的异双功能分子。响应 IFLD 分子，靶蛋白与 IFLD 分子和整合素形成三元复合物，然后经历内吞作用和溶酶体降解（图10）。通过将 BMS-8 作为PD-L1 配体和 cRGD（一种环肽）作为 αβ 整联蛋白配体与不同的连接体结合，获得了三个靶向 PD-L1 的 IFLD 分子 (23−25)。其中，BMS-L1-RGD (23) 在 MDAMB-231 细胞中以整合素和溶酶体依赖性方式显示出最有效的针对 PD-L1 的降解活性。使用 B16F10 肿瘤异种移植物 C57BL/6J 小鼠模型的体内研究表明，BMS-L1-RGD 显著抑制肿瘤生长并诱导 PD-L1 降解。此外，PK特性可能是基于肽的IFLD分子的绊脚石，开发和应用有效的整合素小分子配体将是提高IFLD分子成药性的替代且有前景的策略。图10. 靶向PD-L1的IFLD设计策略利用内源性细胞因子介导的同源受体内化来实现靶蛋白的溶酶体递送，开发了细胞因子受体靶向嵌合体 (KineTAC)，它可以通过溶酶体途径诱导细胞表面和细胞外蛋白的降解（图 11）。KineTAC 是双特异性抗体，由用于结合其同源细胞因子受体的细胞因子臂和用于靶蛋白的靶结合臂组成。基于结合诱饵受体 CXCR7 的趋化因子 CXCL12，融合 PD-L1 抗体的 KineTAC 可有效诱导 MDA-MB231 细胞中的 PD-L1 降解。此外，人表皮生长因子受体 2 (HER2)、表皮生长因子受体 (EGFR)、含 CUB 结构域的蛋白 1 (CDCP1)、肿瘤相关钙信号转导器 2 (TROP2)、PD1、肿瘤坏死因子-α (TNF) -α）和血管内皮生长因子（VEGF）也被各自的 KineTAC 成功降解。这意味着设计结合细胞因子受体（例如 CXCR7）和感兴趣的蛋白质的小分子嵌合体可能是诱导细胞降解的替代策略-表面和细胞外蛋白。图11. 靶向PD-L1的KineTAC设计策略为了取代 CI-M6PR 的糖多肽配体，最近设计了基于 IGF2 的肽作为 CI-M6PR 的配体，然后将其与 PD-L1 抗体融合以获得基于肽/蛋白质的 LYTAC（图 12）。这些LYTAC可以与PD-L1和CI-M6PR结合，从而诱导PD-L1降解并增强外周血单核细胞（PBMC）对肿瘤细胞的细胞毒性。图12. 靶向PD-L1的KineTAC基于IGF2肽段的LYTACs设计策略一般来说，上面提到的大多数分子（14、15、18、21和23−25）都是基于PD-1/ PD-L1小分子抑制剂的杂化化合物。典型的PD-1/PD-L1抑制剂（以BMS202为例）药效团可分为核心组、连接子、芳基和尾基（图13）。从这些杂化化合物的结构角度来看，它们通过各种连接物与PD-1/PD-L1抑制剂尾基团中的另一个分子偶联。实际上，PD-1/PD-L1抑制剂通过诱导PD-L1形成对称二聚体与PDL1结合；因此，根据我们对PD-1/PD-L1抑制剂57−61的研究经验，我们推测核心组可能是另一个与不同分子偶联的位点（图13），这可能产生值得进一步研究的新的杂化化合物。图13. BMS202与PD-L1结合模式和潜在的重要药效团基于小分子可能能够抑制PD-1/PD-L1相互作用并诱导PD-L1降解的假设，通过虚拟筛选和研究报道了一系列小分子PD-1/PD-L1抑制剂。广泛的结构-活性关系研究。其中，化合物Jiang-17（30，图14A）在PD-L1-GFP质粒转染的293 T细胞中诱导PD-L1内化到细胞质中，并通过溶酶体依赖性促进MDA-MB-231细胞中的PD-L1降解。此外，在PBMC和MDA-MB-231细胞共培养模型中，Jiang-17还有效抑制PD-1/PD-L1相互作用并激活PBMC的抗肿瘤免疫。晶体结构分析表明Jiang-17诱导PD-L1二聚化并形成PD-L1二聚体/Jiang-17复合物。体内研究表明，Jiang-17 抑制了接种 CT26 细胞和 B16−F10 细胞的 BALB/c 小鼠的肿瘤生长。图14. Jiang-17的设计策略和化学结构通过在体外使用均相时间分辨荧光 (HTRF) 测定筛选小分子文库，发现了一种有效的 PD-1/PD-L1 抑制剂，命名为 ARB-272572（31，图 14B）。进一步的研究表明，ARB-272572诱导 PD-L1 二聚化并随后内化到细胞质中，导致细胞表面PD-L1 水平降低。在接种MC38细胞的人源化PD-1/PD-L1小鼠中，ARB-272572表现出显著的抗肿瘤作用，并降低了细胞表面PD-L1的表达水平。此外，ARB-272572 改善了乙型肝炎病毒 (HBV) 特异性免疫反应。除了与 PD-L1 胞外区域结合的配体外，Xu 及其同事还发现 HIP1R 充当PD-L1 的内源性配体，它可以与 PD-L1 的胞内区域结合，并与 PD-L1 结合，然后以溶酶体依赖性方式促进 PD-L1 降解。此外，他们设计的嵌合肽（PD-LYSO，32）也成功实现了溶酶体依赖性PD-L1降解（图15）。这一发现意味着PD-L1的胞内区域也可以被靶向，为PD-L1的胞内区域提供了新的策略。有可能可以设计肽、肽模拟物和小分子来结合PD-L1的胞内区域，从而阻碍PD-L1的免疫抑制功能。图15. 嵌合肽PD-LYSO 降解PD-L1的作用机制3. 不与PD-L1结合的下调调节器作为一种膜蛋白，成熟的PD-L1需要经历复杂的过程，包括转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰（如磷酸化、泛素化、甲基化、糖基化和棕榈酰化）、运输等，受多种蛋白质和因子的调节。迄今为止，据报道，多种分子不是通过与PD-L1结合而是通过影响上述过程来下调PD-L1的表达水平，从而表现出抗肿瘤免疫作用。接下来，我们简要总结这些分子和它们下调 PD-L1 的机制（图 16）。图16. 间接调控PD-L1水平的小分子汇总3.1 影响PD-L1的转录信号转导和转录激活因子（STAT）信号通路在调控基因转录和生物学过程中起着重要作用，包括STAT1/2/3/4/5A/5B/6。2017年，Sun及其同事发现PD-L1的过表达与头颈部鳞状细胞癌患者中磷酸化的STAT3水平显著相关。用STAT3抑制剂S3I- 201处理CAL27和FaDu细胞，可抑制STAT3的磷酸化，导致PD-L1的表达降低。组蛋白脱乙酰酶（HDAC）是一种表观遗传蛋白，在调节组蛋白和非组蛋白底物乙酰化水平的动态平衡中发挥着关键作用。越来越多的证据表明 HDAC 参与调节免疫相关通路和 PD-L1 的表达水平。2016年，Villagra及其同事发现HDAC6通过调节STAT3的激活来调节PD-L1的表达。HDAC6 和磷酸化 STAT3 被招募到 PD-L1 的启动子上，从而激活 PD-L1 基因转录。通过选择性HDAC6抑制剂（Tubastatin A和Nexturastat A）抑制HDAC6或敲低HDAC6均能阻断STAT3的磷酸化，并进一步降低黑色素瘤细胞中PD-L1的表达。由 BRD2、BRD3、BRD4 和 BRDT 组成的溴结构域和额外末端结构域 (BET) 蛋白属于含溴结构域蛋白家族在识别和结合乙酰化组蛋白和其他非组蛋白底物以促进基因转录方面发挥着关键作用。近年来多项研究表明PD-L1基因（CD274）是BRD4介导的基因转录的直接靶点，BET抑制剂JQ1处理可降低PD-L1在转录和蛋白水平的表达，并降低PD-L1的表达。降低IFNγ诱导的PD-L1表达，从而提高抗肿瘤免疫效果。c-MYC是一种在多种肿瘤中过度表达的原癌基因，参与肿瘤的发生和发展。2019年，Ma及其同事发现非小细胞肺癌患者中PD-L1表达与c-MYC表达呈正相关，这些PD-L1和c-MYC双阳性表达的患者预后较差。随后在食管鳞状细胞癌患者中证明了类似的结果。此外，c-MYC抑制剂10058-F4降低了KY-S140细胞中PD-L1的表达。机制研究表明，c-MYC 直接与 PD-L1 启动子结合，导致 PD-L1 表达增加。3.2.影响PD-L1的翻译后修饰。二甲双胍是治疗2型糖尿病（T2D）的经典口服药物，近年来被发现具有抗肿瘤作用。2018年，Huang及其同事证明二甲双胍降低了多种肿瘤细胞中PD-L1的表达水平。进一步的机制研究表明，二甲双胍诱导激活的 AMP 激活蛋白激酶 (AMPK) 直接磷酸化 PD-L1 的 Ser195。PD-L1 Ser195 磷酸化诱导 PD-L1 异常糖基化，从而抑制内质化PD-L1 的微网 (ER) 易位至高尔基体，导致 PD-L1 内质网积聚，最终导致 PD-L1 泛素蛋白酶体依赖性 ER 相关蛋白降解 (ERAD)。3.3.影响PD-L1的运输。受到天然药物抗肿瘤功效的启发，Deng及其同事在2020年通过筛选发现小檗碱（BBR）下调非小细胞肺癌（NSCLC）细胞中PD-L1的表达水平系列中药化学单体。机制研究表明，BBR 通过在 Glu76 处直接结合组成型CSN5 并抑制其去泛素化活性，诱导泛素蛋白酶体依赖性 PD-L1 降解。此前，有报道称 CSN5 可以直接去泛素化 PD-L1，从而稳定 PD-L1。4. 联合抑制策略如上所述，PD-L1下调剂通过降低PD-L1表达来促进抗肿瘤免疫作用；将这些下调剂与其他免疫疗法结合起来，产生协同增强的抗肿瘤功效是可能的。多项研究表明，相应的联合疗法表现出协同抗肿瘤活性。然而，药物间相互作用、药代动力学特性和安全性是联合疗法开发的挑战。此外，同时针对多个肿瘤相关信号因子的多靶点药物将成为提高抗肿瘤效果的替代策略。研究人员可能会受到这些PD-L1下调剂的机制和结构的启发，开发出更有效的抗肿瘤药物。基于PD1/PD-L1抑制剂和HDAC抑制剂的经验，提供了双PD-L1/HDAC抑制剂的设计策略，作为开发多靶点抑制剂的模板。首先，分析两类抑制剂与相应蛋白质的结合模式。HDAC抑制剂（以Nexturastat A为例）药效团可分为锌结合基团（ZBG）、表面识别帽（SRC）和连接基团（图17），其中ZBG对于通过ZBG之间的螯合相互作用实现HDAC抑制活性是不可或缺的和HDAC的催化Zn离子；连接子将ZBG与SRC连接并占据HDAC结合口袋中的疏水隧道；SRC与HDAC表面的氨基酸残基相互作用，表现出多种结构；因此，将 PD-1/PD-L1 抑制剂药效团纳入该部分可能会导致 PD-1/PD-L1 和 HDAC 的双重抑制。结合图13中的分析，PD-1/PD-L1抑制剂中有两个位点可以尝试引入HDAC抑制剂药效团（图17）；最终，通过研究合适的连接体可以获得PD-L1/HDAC双重抑制剂。与单靶点药物相比，多靶点化合物可以同时靶向多个肿瘤相关信号因子，从而可能提高抗肿瘤效果。与联合疗法相比，多靶点化合物是单组分药物，可以克服联合疗法中不可预测的药物间相互作用、药代动力学特性和安全性的缺点。图17. 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近年来，蛋白水解靶向嵌合体(PROteolysis TArgeting Chimeras, PROTAC)技术已成为利用细胞自身破坏机制去除特定疾病相关蛋白的最有前途的方法之一[1]。除了PROTAC之外，许多不同的靶向蛋白质降解(Targeted Protein Degradation, TPD)策略正在涌现，涉及小分子类的TPD还包括分子胶(Molecular glue)[2]、自噬靶向嵌合体(Autophagy-Targeting Chimera, AUTEC)[3]、自噬体系连化合物(Autophagosome Tethering Compound, ATTEC)[4]、自噬靶向嵌合体(AUTOphagy TArgeting Chimera, AUTOTAC)[5]等。该类化合物多是一种双功能小分子，其结构中含有两部分，一部分包含E3招募配体，用于激活泛素化级联通路；另一部分则是含有靶向目的蛋白(POI)的弹头，二者利用合适的Linker进行组装。进入体内后形成POI-PROTAC-E3三元复合物，诱导POI泛素化并随后通过UPS降解。在许多情况下，其相对较大的分子量(通常> 1000 Da)可能会导致口服生物利用度、溶解度和/或体内药代动力学特性受损(不符合里宾斯基五规则)[6]；此外，某些细胞内蛋白对该类分子具有抗性，因为它们可能不是蛋白酶体清除的底物[7]。针对上述遇到的问题以及PROTAC的“元素”组成，抗体以高选择性和亲和力与任何免疫原性靶点结合(原则上)及其商业化的成功(off-the-shelf)，已被广泛应用到基于溶酶体的降解策略中，该策略被广泛地称为“基于抗体的靶蛋白降解技术（AbTAC）”。根据其组成的不同，该类分子包括基于抗体的PROTAC (AbTAC/PROTAB)[8, 9]、溶酶体靶向嵌合体(Lysosome-Targeting Chimera, LYTAC)[10]、GlueBody靶向嵌合体(GlueBody Targeting Chimera, GlueTAC)[11]、细胞因子受体靶向嵌合体(cytokine receptor-targeting chimeras, KineTACs)[12]和信号介导的溶酶体靶向嵌合体(Signal-mediated lysosome-targeting chimeras, SignalTACs)[13]。这些技术不仅极大地扩展了TPD的范围，而且为抗体药物的发现提供了新的见解。在这里，作者简要总结了抗体介导的靶蛋白降解技术（AbTAC）的最新进展，希望为对此领域感兴趣的研究人员提供参考。  01  信号介导的溶酶体靶向嵌合体（SignalTAC）膜蛋白降解技术依赖于特定的细胞表面溶酶体靶向受体来发挥功效，但这些内化受体的表达随组织和细胞类型的不同而变化，从而对其进一步应用造成了重大限制。溶酶体靶向受体的内吞作用是一个由受体胞质域内信号介导的复杂过程。大多数信号是基于双亮氨酸或基于酪氨酸的肽基序，这些基序被网格蛋白外壳的成分识别，以确保通过网格蛋白介导的内吞作用将蛋白质准确转运到溶酶体中。其中，低密度脂蛋白受体(LDLR)中基于酪氨酸的溶酶体分选基序NPXY (Asn-Pro-X-Tyr，其中X代表任何氨基酸)可用于诱导网格蛋白介导的抗EGFR纳米抗体的内吞作用和溶酶体运输(图1A)[14]。因此，中山大学蔡晓青教授课题组基于上述研究提出了具有溶酶体分选信号的膜蛋白结合物可以形成信号介导的溶酶体靶向嵌合体(Signal-mediated lysosome-targeting chimeras, SignalTAC)，用于靶向膜蛋白的降解(图1B)[13]。SignalTAC与膜蛋白结合内化后，膜蛋白将在酸化的内体区室中与SignalTAC解离，并进入溶酶体进行降解。图1 溶酶体分选基序NPXY介导的靶蛋白降解(A)和SignalTAC作用机制(B)非阳离子依赖型甘露糖-6-磷酸受体(Cation-independent mannose-6-phosphate receptor, CI-M6PR)是一种单跨膜糖蛋白，可介导细胞外配体的内吞作用和新合成的溶酶体酶的细胞内分选，其功效不依赖于任何溶酶体穿梭受体。因此，利用CI-M6PR固有的溶酶体分选信号来开发SignalTAC平台技术。CI-M6PR的内吞作用和分选由其羧基末端的基于双亮氨酸的信号引导(该信号由一簇酸性氨基酸和随后的双亮氨酸组成)，基于上述信息作者构建了一系列基于IgG/Nb的SignalTAC，其中CI-M6PR分选信号通过重链、轻链或两条链融合到IgG抗体的C末端(图2A)，其中Nb1与母本5F7相比细胞荧光显著增强(图2B)；此外，基于Trastuzumab (Tz)改造的含有RRRRK序列的SignalTAC (Ab6)表现出最高的内化能力(图2C)。构效关系研究表明，基于双亮氨酸的基序DEDLL (Asp7−Ile11)对其作用的发挥至关重要(图2D)；同时，对其序列进行截短处理发现P1的13个残基可协同作用促进Nb1的内化(图2E)。 图2. SignalTAC的构建及其构效关系研究利用IgG型SignalTACs对HER2+细胞系(SKBR3、BT474和SKOV3)进行处理，结果表明SignalTACs Ab1−Ab6在三种细胞系中均产生降解作用(图3A)；同时对Ab6的降解作用进行进一步研究，结果表明其浓度在100 nM时处理SKBR3细胞48小时后产生最大的靶蛋白降解效果(图3B)。降解机制研究表明，网格蛋白介导的内吞作用是SignalTAC促进降解机制的关键途径，但仍需要进一步的研究工作来详细了解SignalTAC诱导降解的分子机制。除对靶蛋白HER2产生降解外，SignalTAC还可以下调HER2下游信号(PI3K/AKT/mTOR)的传导，进而促进细胞凋亡并抑制HER2驱动的癌细胞的增殖(图3C)。图3. SignalTAC降解作用的评估基于上述SignalTAC在体外试验中的良好效果，作者在SKOV3小鼠异种移植模型中探究Ab6的抗癌作用，其处理组可显著抑制肿瘤生长，而Tz处理组仅能减缓肿瘤生长(图4A)；Western结果表明肿瘤组织中HER2蛋白大量减少(图4B)；qPCR分析证实Ab6处理组明显高于对照组和Tz处理组的HER2降解水平(图4C)，这些结果表明Ab6的治疗效果优于抗体的自身抑制效果。除了HER2靶点外，作者基于特异性靶向靶蛋白的抗体构建一系列的SignalTACs，可以降解多种发病机制相关的膜蛋白，包括EGFR、PD-L1、CD20和CD71 (图4D)。图4. SignalTAC体内实验结果(A/B/C)及其应用范围的拓展(D)SignalTAC的可调节特征提供了一种简单而通用的策略，以分子精度降解具有挑战性的膜蛋白，并且可能代表具有广泛研究和治疗应用的强大平台。希望通过进一步的优化和验证，SignalTAC技术能够应用于更广泛的降解靶点，并改善活性和治疗效果。  02  细胞因子受体靶向嵌合体（KineTAC）由于溶酶体递送靶向降解嵌合体的局限性-模块化程度低、开发难度大、实用性差和组织靶向性受限，UCSF James A. Wells教授团队开发了新型细胞因子受体靶向嵌合体 (Cytokine receptor-targeting chimeras, KineTACs)。KineTAC是完全基因编码的双特异性抗体，由结合其同源细胞因子受体的细胞因子臂和与靶蛋白结合的结合臂组成(图5)；KineTAC类双特异性抗体的构建不会因轻-重链错配问题而变得复杂，这种轻-重链错配问题是双特异性抗体的常见问题；此外，KineTAC平台只需要设计一个靶蛋白的抗原结合臂即可，天然细胞因子可以招募相关的降解受体。 图5. KineTAC的构建及其作用机制为了验证上述KineTAC平台设计理念，作者构建了针对不同靶蛋白(PD-L1、HER2、PD-1、EGFR、CDCP1和TROP2)的KineTAC双特异性抗体，其中人CXCL12趋化因子N端融合到双特异性抗体Fc结构域形成细胞因子结合臂；抗原结合臂包含抗原结合片段(Fab)抗体序列，与Fc融合，与正常抗体一致(图5)。这六种KineTACs的最大降解效率(Dmax)分别为~70%、51%、84%、82%、93%和51% (图6)，这些结果证明KineTAC平台能够降解多种细胞表面蛋白，具有良好的技术通用性。图6. KineTAC技术的普适性研究随后，作者评估KineTAC在受体信号传导、结合亲和力和结合表位等方面对靶蛋白降解的影响。CXCL12除了结合再循环受体CXCR7之外，还结合信号传导受体CXCR4，从而导致下游信号传导，导致受体内化和降解；实验结果表明CXCL12的拮抗变体(ΔKP、ΔKPVS和R8E)保留降解PD-L1的能力，其程度与CXCL12野生型(CXCL12WT)相似，因此说明CXCL12通过CXCR4的信号传导对于KineTAC的降解并不关键(图7A)。同时，对靶向PD-L1的Atezolizumab互补决定区域进行破坏性丙氨酸突变，测试其的亲和力对PD-L1降解效率的影响，结果发现PD-L1的降解与Kd (R2=0.638)成反比，与koff (R2=0.804)呈负相关，但与kon(R2=0.036)无关；由于这些突变的影响几乎全部影响koff，这表明对于稳定降解而言，在靶蛋白上较长的停留时间比在CXCR7上较高的停留时间更重要(图7B)。此外，为了研究靶蛋白上的结合表位如何影响降解效率，作者构建了具有不同HER2和EGFR靶向抗体的KineTAC，结果表明KineTAC介导的降解对靶蛋白上的结合表位具有很强的依赖性。最后，作者验证了KineTAC双臂朝向问题对降解效果的影响，平行方向比串联方向更有利于降解(SI)。图7. KineTAC在受体信号传导、结合亲和力和结合表位等方面对靶蛋白降解的影响作者对KineTAC可以诱导靶蛋白的降解机制进行深入研究，确定KineTAC的降解途径(溶酶体/蛋白酶体催化降解)。经巴弗洛霉素(Bafilomycin，溶酶体抑制剂)预处理可减少PD-L1的降解，而MG132 (蛋白酶体抑制剂)处理不影响PD-L1的降解，这表明KineTAC通过将靶蛋白递送至溶酶体来介导降解(图8A)；基于前述研究，CXCL12的两种受体中的CXCR7是负责KineTAC介导的降解的主要受体(图7A/8B)，同时也证明使用替代细胞因子(例如CXCL11和vMIPII)也可降解靶蛋白(图8B)。与传统抗体疗法相比，KineTAC介导的降解可提供功能优势，传统抗体疗法只结合并抑制但不降解(图8C)；体内药代动力学实验表明KineTAC注射后在血浆中保留长达10天，半衰期为8.7天，与报道的小鼠IgG半衰期相当(图8D)。图8. KineTAC的作用机制、应用范围及其药代动力学特性研究在证明了KineTAC介导细胞表面蛋白质降解的能力后，作者将注意力转移到KineTAC能否也可以应用于可溶性细胞外蛋白质的降解，对其应用范围进行扩展(图9A)。以VEGF为例，KineTACs成功介导细胞内对细胞外VEGF的摄取并递送至溶酶体(图9B)，KineTAC介导的VEGF摄取呈现时间依赖性，且摄取水平取决于KineTAC:配体比率(图9C)；除HeLa细胞系外，CXCL12-Beva也可促进其他细胞系(包括乳腺癌和肺癌系)摄取VEGF的能力(图9D)。此外，与VEGF摄取实验一致，TNF-α摄取也取决于KineTAC：配体比率(SI)。因此，KineTACs可以强有力地介导可溶性靶蛋白的细胞内摄取，大大扩展了KineTAC介导的靶向降解的目标范围。图9. KineTAC对可溶性蛋白VEGF降解效率的研究除更换KineTAC与靶抗原结合的Fab臂外，作者尝试选择其他的细胞因子受体来介导靶蛋白的清除。将白介素-2 (IL-2)引入到KineTAC中验证其降解效果，其Dmax可达86.7%，这表明其他细胞因子也可以进行KineTAC的构建，从而进一步扩大了细胞选择性靶向蛋白质降解的范围。虽然KineTAC展示出很好的体外实验结果，但其体内实验并没有过多的研究，仅展示了其体内药代动力学研究，这是否与细胞因子在体内的作用强度有关(体外有效剂量是否会导致体内产生“细胞因子风暴”副作用)还需更多的动物实验去验证。希望KineTAC平台能够呈现更多的体内实验数据，对其针对治疗和研究应用的靶蛋白质发挥良好的降解作用。  03  基于抗体的靶蛋白降解技术（PROTABs）除了上述的KineTAC，James A. Wells教授团队于2021年开发了基于抗体的靶蛋白降解技术(antibody-based PROTACs, AbTAC)并将相关成果在JACS上发表(图10)[8]。利用完全重组的双特异性抗体AC-1，可招募膜结合E3连接酶RNF43来降解细胞表面蛋白PD-L1，Dmax达到63%。虽然该AbTAC代表了PROTAC领域的一种新类型(利用完全重组的生物分子靶向降解细胞表面蛋白)，但其业界影响力远不及Genentech的PROTAB。图10. AbTAC介导的靶蛋白降解研究Genentech开发的PROTAB平台技术所构建的双特异性抗体与James A. Wells教授团队开发的极为相似，一端靶向E3连接酶N端糖蛋白D表位，另一端与靶蛋白结合，发挥降解作用(图11A/B)。Genentech团队对其作用机制进行了探究，发现PROTAB可参与蛋白酶体和溶酶体两种途径的降解，MG132和Baf均可以影响靶蛋白的降解，不同于前述的几种TPD技术(图11C)；同时也拓展了PROTAB技术平台的应用范围，对不同的靶点均有降解效果，证明PROTAB对靶蛋白降解的可复制性；此外，还对PROTAB的组装形式进行优化，探究不同组装形式的蛋白降解效率(图D)。尽管PROTAB具有类似于PROTAC的Hook效应，但我们相信结合模块化的抗体工程技术能够加速其转化，为药物发展做出更多的贡献。图11. PROTAB技术的开发研究  04  溶酶体靶向嵌合体（LYTACs）溶酶体靶向嵌合体(LYTAC)使用IgG-聚糖生物缀合物来实现有效的靶蛋白清除，其需要对聚糖进行化学合成并进行体外共轭偶联，以实现有效的靶蛋白清除。其作用机制如图12A所示，靶蛋白配体部分与靶蛋白的胞外结构域结合，同时聚糖与细胞表面的溶酶体靶向受体(LTR)结合后形成三元复合物，经网格蛋白介导内吞进入细胞内，并经囊泡运送到内体中；随着内体酸化，三元复合物被继续转运至溶酶体中降解。同SignalTAC一样，作者选用CI-M6PR(其配体为M6P)为靶点，将M6Pn聚糖肽通过“点击”化学偶联到能特异性识别CI-M6PR的抗体上，得到具有特异性降解靶蛋白的LYTAC，针对膜蛋白EGFR和CD71表现出良好的降解作用(图12B/C)。基于上述方法构建LYTAC需要体外偶联反应，过程较为繁琐；引入的聚糖肽可能存在一定的免疫原性，导致其清除加快，降解效率下降，其应用价值还需进一步探索。 图12. LYTAC作用机制及其应用  05  GlueBody靶向嵌合体（GlueTAC）GlueTAC技术由北京大学陈鹏教授课题组开发，基于共价Nb的PROTAC技术。经过共价改造的单域抗体GlueBody (迫近反应性非天然氨基酸PrUAAs修饰)能与膜蛋白抗原如PD-L1通过距离迫近的偶联反应形成共价键，减少内吞降解过程中靶蛋白的解离和逃逸；同时，与共价单域抗体偶联的细胞穿膜肽(cell-penetrating peptides, CPPs)和溶酶体分选序列(lysosome-sorting sequence, LSS)在无需借助细胞表面特定蛋白质的情况下，有效促进复合物的内吞和溶酶体转运，最终实现了靶向溶酶体的膜蛋白降解(图13A)。图13. GlueTAC作用机制及其应用研究利用非小细胞肺癌细胞系H460评估经该方法构建的GlueTAC对靶蛋白的降解效果，Western blot显示GlueTAC诱导的PD-L1降解率(剩余11%)比NbTAC (剩余68%)高得多，证明了共价键对靶蛋白的降解具有重要作用；Atezolizumab、Nb-PD-L1和GlueBody表现出较低的降解率，表明单独的抗体或Nb的内化不足以降解靶蛋白，PD-L1有可能内吞后经循环重新回到细胞膜上(图13B)。对GlueTAC降解机制研究发现，Chloroquine/Bafilomycin处理可显著降低PD-L1的降解，但MG132处理则不然，表明降解过程依赖于内体-溶酶体途径(图13C)。体内实验表明，GlueBody和GlueTAC的处理均显著抑制肿瘤生长，而相同剂量的Atezolizumab处理仅适度地减缓肿瘤生长；对肿瘤进行解剖分析表明，经GlueTAC处理的肿瘤的平均重量低于经GlueBody处理的肿瘤(图13D)。从体内实验结果来看，GlueBody组依旧好于“T药”组且和GlueTAC组差异不大，这可能与其采用的距离迫近式生物偶联(Proximity enabled covalent binding)的反应效率有关，更换偶联方式可能有助于提高GlueTAC的抗肿瘤活性；将该种GlueBody更换为抗体可能会提高其抗癌活性，Fc与FcR结合产生的效应功能有助于抗癌作用的发挥。同时，该种方法也会导致一定的非特异性偶联，可能会导致非靶蛋白的降解而引发副作用。此外，PrUAA的引入可能会产生一定的免疫原性，导致GlueTAC代谢加快，在体内实验中掩盖其治疗效果。总体而言，GlueTAC技术为抗体药物的发展开辟了新的重要方向。  写在最后  过去二十年见证了TPD技术的诞生和繁荣(图14)，但TPD技术的发展仍面临许多挑战[15]。图14. 已有的TPD技术(不含SignalTAC)PROTAC类技术的发展仍然面临很多挑战：首当其冲的是其成药性的问题，经常存在细胞通透性差和口服利用度低的问题；其次，人类基因组编码超过600个E3泛素连接酶，其中只有少数(VHL、CRBN、IAP和MDM2)被用来降解靶蛋白，应用范围还需进一步扩展；再者，不得不说的毒性问题，PROTAC可能比小分子抑制剂产生更大的毒性，因为它们会降解整个靶蛋白质，而不是仅仅抑制它们，如何控制“降解度”是一个TPD技术领域亟待解决的问题。基于溶酶体开发的TPD技术极大地拓宽了PROTAC和分子胶的靶标范围，对这一领域的研究兴趣激增，但目前其仍处于起步阶段，溶酶体作为重要的细胞器，除了蛋白质降解之外还调节许多重要的生理功能，尚不清楚“劫持(hijack)”溶酶体降解途径是否会影响机体的生理功能；此外，靶蛋白降解后可能会导致级联信号通路的“负反馈调节”或旁路信号的过度激活会不会带来更加严重的副作用尚未有研究开展；同时，尚不清楚特定受体内化功能的过度激活是否会损害其原始生物学功能并导致获得性耐药。尽管存在这些挑战，TPD技术的发展将为生物医学研究提供强大的工具，而且为未来的药物开发带来巨大希望。 主要参考文献 1. Cao, C., et al., Chemistries of bifunctional PROTAC degraders. Chem Soc Rev, 2022. 51(16): p. 7066-7114.2. Asatsuma-Okumura, T., T. 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点击上方的 行舟Drug ▲ 添加关注药物递释系统用于肝纤维化的开发与思考来源《中南药学》2022 年 6 月 第20 卷 第 6 期作者许青，刘莉莎，杨磊，尹莉芳中国药科大学药学院药剂系国家药监局药物制剂及辅料研究与评价重点实验室摘要肝纤维化是由多种致病因素导致的一种进程性慢性疾病，低渗透性的病理环境及肝内非特异性的细胞摄取使得传统药物递送系统的疗效并不显著。本文分析了肝脏中四种主要的细胞在肝纤维化疾病进程中的作用，并按细胞类型对肝纤维化的主要治疗靶点的药物递送系统进行综述。相较于传统剂型，纳米药物在提高小分子化药及大分子药物生物利用度和靶向效率优势明显，为后续新靶点和新机制的药物开发提供参考。同时，本文思考了肝纤维化治疗的局限性，从生理和病理条件进行探讨，为改善纤维化药物递送系统的开发提供新的思路。关键词肝纤维化；治疗靶点；药物递送系统_正文_1肝纤维化概述肝纤维化是由多种病因学因素引起的一种进程性慢性疾病,包括酗酒､慢性病毒性肝炎､酒精性肝炎､非酒精性脂肪肝炎(NASH)､原发性胆汁性肝硬化､自身免疫性疾病与代谢疾病等[1-2]｡该疾病主要以细胞外基质(ECM)过度异常的沉积为特征,是肝脏对各种病因导致的慢性损伤的一种自我修复机制,肝纤维化最终会发展为肝硬化､肝癌等晚期肝病[3-4]｡截至目前,全球仍没有任何一款治疗肝纤维化的药物成功上市,因此该领域亟需新的有效的治疗药物｡肝纤维化涉及多种细胞因子和肝脏细胞,肝实质细胞(HC)发生损伤和凋亡,同时免疫细胞会大量募集和浸润至损伤区域,释放多种炎性细胞因子和趋化因子,这些因子中大多对肝星状细胞(HSC)和成纤维细胞具有促炎或直接纤维化作用,共同参与疾病的形成[5-6]｡各类细胞在肝纤维化进程中的作用见图1｡图 1肝脏中的主要细胞类型在肝纤维化进程中的作用Fig 1Role of main cell types in the liver fibrosis1.1 肝星状细胞HSC 存在于肝血窦腔内(Disse 腔),占所有肝细胞的5% ~ 8%[7]｡HSC 在正常肝脏中处于静息态,α - 平滑肌动蛋白(α -SMA)的表达极低,主要承担存储和代谢脂肪,合成和分泌胶原及糖蛋白的功能,含有大量的维生素A 的脂滴,是体内维生素A 的储库｡HSC 是维持肝窦微环境稳态旁分泌､自分泌､近分泌和趋化因子的中心枢纽[8]｡在正常生理条件下,HSC 可以分泌胶原酶和基质金属蛋白酶,降解ECM,使ECM 处在一个动态平衡的状态｡然而在疾病状态下,HSC 的激活是一个广泛而复杂的调控过程｡其受到HC和非实质细胞相互作用,由邻近的窦状内皮细胞(LSEC)､库普弗细胞(KC)､内皮细胞和肝细胞以及血小板和白细胞的旁分泌刺激引发,HSC会进一步分化为成纤维细胞,快速增殖并大量形成胶原和其他ECM,驱动纤维化过程[9-10]｡这一调控过程对肝纤维化形成至关重要,影响肝脏的正常生理功能｡1.2 肝巨噬细胞巨噬细胞在抗原的处理和传递､机体免疫应答的调节､病原体的吞噬方面发挥着重要的防御作用,是肝脏固有免疫系统的重要组成成分[11]｡根据其起源可将肝脏内的巨噬细胞分为两类:一类是KC,作为肝脏中常驻巨噬细胞,存在于肝血窦内,KC 承担吞噬病原体､内毒素､生物碎片及抗原等,保护肝脏免受感染｡在肝脏发生炎症或组织损伤时,吞噬坏死的肝细胞,维持肝脏稳态[12-13]｡KC 可通过NOD 样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NLRP3)炎性小体､转化生长因子-β (TGF-β )和血小板衍生生长因子(PDGF)通路刺激HSC 活化从而促进肝纤维化｡此外,KC 会与肝滞留和血液循环中的其他免疫细胞比如NK 细胞､T 细胞和单核细胞等共同参与肝纤维化的形成,当肝脏受到严重损伤时,坏死肝细胞分泌的凋亡小体刺激KC 向M1 型转变,产生IL-6､TNF-α ､TGF-β 和IL-1β 等促炎因子及促纤维化因子｡另一类是单核细胞衍生的巨噬细胞(MoMF),利用趋化作用从骨髓单核细胞､脾脏单核细胞和腹腔巨噬细胞浸润至损伤的肝脏组织,通过释放促炎和促纤维化的细胞因子,参与肝纤维化的发生发展[12]｡其中,大部分的表型为Ly-6Chigh 单核巨噬细胞高度表达的趋化因子CCR2 通过CCR2 受体直接激活HSC 来促进肝纤维化进展[11]｡1.3 肝实质细胞HC 是肝脏中最丰富的细胞,占肝脏细胞总数的60% 以上,体积占整个肝组织的80% 以上｡HC 负责体内重要的代谢､内分泌以及分泌功能｡肝细胞富含粗面内质网､线粒体和高尔基体,而体内绝大多数细胞含量很少,使得肝脏合成蛋白质和脂质异常活跃,肝脏的修复能力很强｡慢性肝损伤后炎症反应引发持续性的HC 损伤,HC发生活化､变性､侵袭并产生一系列转录因子,产生的凋亡小体直接诱导HSC 活化和ECM 沉积,并伴随TGF-β 以及炎症因子的释放[14]｡损伤相关模式分子(DAMPs)由凋亡的HC 在细胞膜破裂后释放,间接激活静息状态下的HSC,促进其分泌ECM[15]｡此外,HC 凋亡后留下的细胞间隙将很快被ECM 和胶原占据,从而加速肝纤维化的发病进程｡因此,改善HC 损伤及凋亡是防治肝纤维化的有效治疗途径之一｡1.4 窦状内皮细胞LSEC 是肝脏中主要的非实质细胞,构成肝血窦的窦壁｡LSEC 缺乏隔膜和基底膜,使其成为人体内渗透性最强的内皮细胞,以便肝脏与血流进行物质交换,这一特征也与药物的肝脏高摄取及清除率相关｡除了构成肝窦屏障,LSEC 也具有过滤､内吞､抗原呈递和募集炎性细胞的功能,维持肝脏的免疫稳态并调控肝损伤期间的免疫反应[16]｡正常条件下,LSEC 可保护HSC 免受激活,甚至可以逆转激活的HSC｡当机体发生慢性肝损伤后,LSEC 发生毛细血管化,产生和释放可溶性因子,这一过程先于HSC 和巨噬细胞活化及肝纤维化的发生[17-18]｡LESC 产生的纤连蛋白可以影响HSC 表型,促进其活化｡内容由凡默谷小编查阅文献选取，排版与编辑为原创。如转载，请尊重劳动成果，注明来源于凡默谷公众号。2用于肝纤维化治疗的药物递送系统2.1 纳米药物的肝脏分布特征针对肝纤维化的纳米药物主要以静脉注射方式给药,直接进入血液循环｡30% ~ 99% 的未修饰的纳米粒在肝脏部位蓄积[19],有利于肝脏疾病的治疗｡纳米粒本身的性质,如粒径､表面电荷､表面修饰特性均会在制剂的体内生物分布发挥极为重要的作用,影响其安全性和有效性｡人和动物的肾脏布满10 nm 的细胞间隙, 以便分子通过尿液排出,如果尺寸大于10 nm 会引起其血液循环滞留时间延长｡在肝脏中,由于正常LSEC 孔隙为50 ~ 200 nm,因此粒径低于200nm 的纳米颗粒可以穿过肝血窦,从而有可能到达肝细胞或HSC,而更大尺寸的颗粒容易被KC吞噬[20]｡一般情况下,纳米粒易于在血液循环中被网状内皮系统(RES)清除,肝脏中的KC 也属于RES 的一部分,在纳米粒的体内消除中起着至关重要的作用,纳米粒尺寸大于100 nm 易在肝､肺和脾等组织中蓄积,加速清除效率｡聚乙二醇(PEG)修饰或其他亲水性表面的纳米颗粒可以降低其在RES 的非特异摄取,有利于在肝脏中的累积｡其次,纳米材料的表面电荷要在细胞内化能力和血清稳定性之间取得平衡,既需要具有适当的正电荷维持膜亲和力,又需要避免血液中各种蛋白的黏附,为便于纳米粒进入细胞,表面需要保持电中性｡2.2 肝纤维化药物递送系统类型临床上从未停止对肝纤维化药物开发的步伐,然而尚无针对肝纤维化的化药制剂批准上市｡Selonsertib在Ⅲ 期临床(NCT03053050､NCT03053063)未表现出纤维化明显改善,部分受试者因严重的不良反应而终止给药[21]｡Elafibranor 在治疗中重度非酒精性脂肪性肝炎(NASH)时,与安慰剂组无显著性差异(NCT02704403)[22]｡中药单体如黄芩苷､水飞蓟宾､白藜芦等在体外有明显的抗纤维化活性,然而水溶性差制约了其生物利用度,体内药效不尽如人意[23]｡为了达到更高的抗肝纤维化效果和较低的毒副作用,不断发展的药物递送技术为抗肝纤维化提供了新思路｡目前用于肝纤维化的新型药物递送系统包括脂质体､脂质纳米粒､胶束､无机纳米粒以及仿生载体制剂等(见表1)｡根据药物自身性质设计递送系统,改善药物的溶解性,实现药物缓释,提高生物利用度;通过改进纳米粒的处方和工艺以调整其表面性质,或修饰特定的靶向分子,实现肝脏相应靶点的精准调控与治疗｡2.3 用于不同肝脏细胞的药物递送系统有效的药物递送需要经历受体识别,入胞及胞内释药的级联过程｡除了优化纳米载体的粒径和电位等物理性质以提高药物在肝脏中的分布外,还可以将可识别肝细胞表面受体的靶向基团修饰在递送载体的表面,以提高药物的肝脏靶向能力,如维生素A 可以通过与视黄醇蛋白结合,作用于HSC 上的视黄醇受体,从而实现纤维化药物的HSC 靶向递送[36]｡CD44 在活化的HSC 中过表达,透明质酸(HA)是其特异性受体,聚乳酸(PLA)纳米粒经HA 修饰后靶向活化的HSC,释放活性成分姜黄素产生抗纤维化作用[37]｡通过甘露糖化修饰来靶向KC 细胞,递送抗炎药物,也是肝纤维化治疗的一种重要策略｡针对复杂的肝纤维化发病机制,需要研究者针对不同靶点进行药物筛选,实现精准的协同治疗｡2.3.1 抑制活化的肝星状细胞肝纤维化的主要病理特征是胶原和ECM 的过度表达,均由活化的HSC(aHSC)产生,因此,aHSC 是肝纤维化治疗的关键靶细胞｡TGF-β 由HSC 细胞产生,是肝纤维化的关键推动者,被认为是潜在的纤维化形成细胞因子｡TGF-β 1 被认为是aHSC 表达最多的一个亚型,当TGF-β 与TGF-βRⅡ结合时,TGF-βRⅠ发生活化,以Smad2/3 的磷酸化为主激活下游通路,最终促使HSC 的活化[38]｡目前很多研究都已发现miR 在HSC 活化时的表达发生显著变化,其中miR-142-3p 被证实随疾病进展而表达水平降低[39],其主要机制是通过靶向HSC 的TGF-βRⅠ,阻断TGF-β -Smad 通路,从而抑制HSC 的活化｡当Broermann 等[40] 用磷酸二酯酶5 抑制剂处理四氯化碳(CCl4)诱导的模型大鼠时,大鼠纤维化程度得到改善,血浆外泌体中的miR-142-3p 表达升高,这主要是由于miR 通常由细胞外泌体囊泡装载和传递,调节受体细胞的功能｡目前,已有课题组利用胞外囊泡手段将miR-142-3p 用于乳腺癌[41] 和特发性肺纤维化[42] 的研究,该指标在肝纤维化中作为疾病进展的诊断监测与治疗靶点的作用也不容小觑,但尚未开发针对肝纤维化的miR-142-3p 药物递送系统｡此外,aHSC 的甘露糖-6- 磷酸/ 胰岛素样生长因子受体(M6P/IGF-ⅡR)在肝纤维化发展过程中表达上调,正常肝脏中的静息态HSC 仅表达少量的M6P/IGF-ⅡR｡相关文献显示,TGF-β 结构中有2 个糖基化位点是甘露糖-6- 磷酸,使TGF-β能与M6P/IGF-ⅡR 结合[43],激活HSC,从而促进纤维形成｡通过合成M6P 修饰的人血清白蛋白,细胞摄取实验证明M6P 取代度愈高,肝脏蓄积量愈高,可实现对肝脏HSC 的靶向｡将18β - 甘草次酸与M6P26-HSA 共价结合,制备纳米制剂,其在胆管结扎的纤维化大鼠模型中,迅速在肝脏蓄积,显著减轻了纤维化程度[44-45]｡18β - 甘草次酸可通过抑制游离脂肪酸诱导的脂肪毒性发挥作用,同时TGF-β 能识别M6P/IGF-ⅡR 产生促纤维化作用,以M6P/IGF-ⅡR 为受体的药物递送载体可以竞争性抑制TGF-β 与M6P/IGF-ⅡR 的结合,本身也具有一定的抗纤维化作用｡由于配体M6P 带有负电荷,可能会与KC 或LSEC 表面的清道夫受体结合而消弱对HSC 的靶向性,需要寻找针对M6P/IGF-ⅡR 靶点的新思路和新策略｡PDGF 作为受体酪氨酸激酶家族的一员,是肝纤维化中参与HSC 的活化与增殖的最关键因素之一｡PDGF 家族存在四个亚型,其中二聚体PDGF-BB 是促进HSC 活化的最强推动剂｡在HSC 发生激活后PDGFR-β 表达显著上调, 当PDGF-BB 与HSC 上的PDGFR-β 结合后,诱导细胞质结构域内酪氨酸残基的自磷酸化,导致受体相关蛋白的募集和激活,促使HSC 的激活｡伊马替尼作为一种强效的酪氨酸激酶抑制剂,对PDGFR-β 半数抑制浓度仅为100 nmol·L- 1,El-Mezayen 等[46] 制备了载有伊马替尼的维生素A 修饰的脂质体,其中维生素A 用于靶向HSC,伊马替尼发挥TGF-β 和PDGF 双重抑制作用｡另一种酪氨酸激酶抑制剂——尼洛替尼,不仅对TGF-β及PDGFR-β 起到双重抑制作用,还具有一定的抗炎活性, 给药剂量分别为5 mg·kg- 1 和10mg·kg- 1,可显著改善大鼠模型中的纤维化指标[47]｡Fan 等[48] 设计了一个胶原酶和视黄醇修饰的胶束系统来递送尼洛替尼,一方面降解胶原以实现药物的ECM 穿透能力,另一方面由于视黄醇对HSC 有着天然的靶向性,可实现药物的HSC靶向递送,该纳米递药系统在小鼠肝纤维化模型中展现出良好的抗纤维化活性｡尽管PDGFR-β在aHSC 的表达随疾病进展而逐渐上调,进展到晚期肝硬化时该受体在肾脏中会过表达,因此采用PDGFR-β 的靶向策略需考虑肝纤维化的病程阶段,设计合适的递送系统｡PI3K/AKT/mTOR 作为PDGFR 的一条典型的下游通路,也是肝纤维化的重要治疗靶点之一(见图2)｡PDGFR-β 将刺激信号分子转导至细胞内,激活PI3K 信号,促使AKT 进一步激活,抑制TSC1/TSC2,促进mTOR 复合物的形成[49]｡其中,mTOR1 促进血管内皮生长因子(VEGF)的表达,推动HSC 的激活[50],mTOR2可调控AKT｡两者在不同的生理病理条件下比例发生改变,发挥双向调控作用｡Ji 等[51] 设计了一种cRGDfK 修饰的PEG-PLGA 纳米粒共递送Germacrone 和 miR-29b,其中cRGDfK 靶向HSC表面的整合素受体 α v β 3,小分子药物和基因药物联合应用后,对aHSC 产生显著的细胞毒性,改善了CCl4 诱导的小鼠肝纤维化症状｡Ren 等[52]利用HA 天然靶向aHSC 的CD44 受体的特性,共同递送LY294002 和Oridonin, 经PI3K/AKT通路发挥抗炎和抗氧化的功效,从而改善纤维化程度｡HSC 另外一个靶点是细胞核中的过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR),这是执行转录控制的核激素受体,与肝纤维化有关｡HSC 从静息状态转化至成纤维细胞时,PPARγ 表达降低｡PPARγ 可以抑制TGF-β 1 和PDGFRβ 诱导的HSC激活[53],具有明确的抗纤维化作用｡罗格列酮增加PPARγ 表达,从而抑制HSC 激活｡在CCl4 刺激的大鼠慢性肝损伤模型中,基于M6P-HSA 的罗格列酮的递送增加了药物的肝脏积聚,抑制了HSC 的激活并减轻了纤维化[54]｡替米沙坦具有PPARγ 激动和AT1R 阻断双重作用,将其制备成纳米乳制剂,提高了肝纤维化的治疗效果[55]｡2.3.2 调控肝巨噬细胞在肝纤维化疾病中,驻留的KC 在损伤因素的刺激下发生激活,促使肝脏产生局部的炎症反应,并通过招募外周的MoMF,共同加剧了肝脏的纤维化程度｡巨噬细胞为纤维化治疗的重要靶细胞,本文从抗炎､抗氧化以及细胞极化相关治疗靶点的纳米制剂对其进行阐释｡ ① 抗炎:肝脏受到损伤时,KC 通过损伤相关分子模式(DAMPs)和病原体相关分子模式(PAMPs) 而发生激活｡主要是Toll 样受体(TLR)损伤信号[56],产生炎症小体,分泌炎症因子和趋化因子,并进一步加剧肝损伤和纤维化程度｡TLR 介导的肝脏炎症反应主要通过两条途径实施:TLR-TIRAP/MyD88-NF-κB 和TRIF/TRAMIRF-NF-κB(见图3)[57-58]｡Younis 等[59] 研究发现牛磺酸可以通过TLR4/NF-κB 信号转导的调节,产生抗纤维化作用｡Eritoran 作为一种TLR4 拮抗剂,当作用于纤维化小鼠时,显著下调了MyD88 和NF-κ B p65 的表达,缓解了小鼠的肝脏炎症及纤维化程度[60]｡ ② 抗氧化:当肝脏受到损伤时,巨噬细胞会释放大量的活性氧(ROS),诱导HSC 转型和HC 凋亡,从而加速纤维化进程,因此应用抗氧化剂可以抑制肝纤维化的发展｡据报道MoMF 释放的NOX2 所产生的ROS 会加重肝纤维化进程｡Maeda 等[61] 制备了一种甘露糖修饰的多巯基化人血清白蛋白纳米制剂(SH-Man-HSA),甘露糖修饰可使其靶向巨噬细胞的相关受体,多巯基化可以产生抗氧化作用,在小鼠肝纤维化模型中,SH-Man-HSA 明显改善了小鼠的纤维化症状,降低了氧化应激水平｡Shin 等[62] 采用 8- 羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)NOX 抑制剂,显著改善了模型大鼠的肝纤维化程度,并且证明了该药物可以抑制HSC 中NOX1 和NOX2 的表达｡肝脏中多种细胞均表达NOX,该抑制剂可以作用于多个细胞,抑制ROS 的生成以治疗疾病｡可以通过特定修饰,用纳米载体递送外源性的8-OHdG,实现对巨噬细胞的精准靶向｡此外,部分氧化还原型纳米粒也具有抗氧化和降低肝脏中氧化应激的作用,比如CeO2 纳米粒具有抗氧化和清除自由基的能力,利用其在KC 中的蓄积效应,显著降低NF-κ B 的表达,发挥抗炎活性,改善CCl4 诱导的急性肝损伤程度[63]｡氧化应激和炎症存在紧密联系,两者相互诱导并加重肝纤维化的恶性循环,如何发现高效抗氧化应激治疗肝纤维化的药物,需要明确相关通路的复杂联系及调节机制等｡ ③ 细胞极化:肝脏中未成熟的巨噬细胞可极化为M1 型(促炎型)和M2 型(抗炎型),其中Notch 通路可通过促进巨噬细胞向M1 表型和抑制其向M2 型转化,从而促进肝纤维化[64-65]｡当用γ - 分泌酶抑制剂(GSI)抑制 γ - 分泌酶对Notch 受体的加工,Notch1 的表达下调[66]｡γ - 分泌酶是一种膜内蛋白水解酶,参与Notch 蛋白的切割和水解,使其进入细胞内,实现信号的转导｡当采用γ - 分泌酶抑制剂后,Notch 信号被阻断,导致TNF-α ､IL-6 和IL-10 等炎症因子表达降低,抑制巨噬细胞转型｡例如,DAPT 是一种小分子GSI 药物,当按50 mg·kg- 1 的剂量连续给药4 周后,大鼠的肝纤维化得到一定程度的缓解[67],其机制可能是DAPT 通过阻断Notch 途径抑制了aHSC,降低了HC 的凋亡｡然而,Notch受体有四个亚型,并且在多种细胞内广泛表达,GSI 的Notch 抑制作用范围较广,可能存在较大的毒副作用,针对特定细胞中具体亚型的Notch受体的靶向纳米制剂尤为重要｡二苯并氮杂䓬也是一种小分子GSI 药物,Richter 等[68] 将其包裹于PLGA 纳米粒(GSI NPs)用于缓解肥胖引起的肝纤维化,实验结果证明GSI NPs 不仅减少了小鼠肝脏葡萄糖的合成,改善了NASH 相关的纤维化和肝脏炎症,还显著降低了药物的胃肠道毒副作用｡2.3.3 抑制肝实质细胞凋亡肝细胞损伤及凋亡是引发肝纤维化恶化的根本原因,将药物高效递送至肝细胞发挥保肝护肝的功效是开发肝纤维化疗法尤为重要的研究领域｡脱唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)是一种在肝细胞高度表达的受体,可以与半乳糖或N- 乙酰半乳糖胺发生特异性结合｡将N- 乙酰半乳糖胺与寡核苷酸偶联后,可实现肝细胞靶向递送[69]｡Saraswathy 等[70] 开发了一种肝脏特异性诊断和治疗的探针,支链淀粉可以与ASGPR 特异性结合,将其修饰在超顺磁性氧化铁纳米颗粒(SPION)的表面,显示出优异的磁弛豫性,在磁共振(MRI)成像中展现出高对比度｡当与近红外染料Atto-700 结合,赋予材料双重成像能力｡该纳米制剂有望应用于肝纤维化的早期诊断以及后续磁热疗法,具备良好的临床应用价值｡清道夫受体B1(SR-B1)是一种高度糖基化的膜蛋白,在HC 中表达,介导由高密度脂蛋白(HDL)和低密度脂蛋白(LDL)相关的胆固醇的细胞摄取和转运,在脂质调控方面发挥重要作用[71]｡肥胖是一种脂质堆积的生理状态,脂质代谢受阻,会诱发NASH,使肝脏发生损伤,诱发肝纤维化｡Wang 等[72] 研究发现在遗传性肥胖小鼠中miR-24 过表达,抑制SR-B1 的作用,抑制HDL 对胆固醇的代谢和类固醇激素的合成,影响脂质代谢通路｡可通过纳米药物递送至肝脏,降低miR-24 表达,恢复脂质正常代谢途径,与抗纤维化药物共递送,发挥协同作用｡目前尚无该通路的纳米药物用于肝纤维化的治疗｡2.3.4 恢复LSEC 渗透性引起肝纤维化的各种损伤因素首先是作用于LSEC,导致LSEC 表型和功能变化,ECM 大量沉积继而形成肝窦毛细血管化,一方面严重阻碍了肝脏的物质交换从而降低了药物的递送效率,另一方面释放激活HSC 的信号,促进纤维化的发生发展｡因此,针对肝窦毛细血管化开发靶向LSEC 纳米制剂具有广泛的应用前景｡Yu 等[73] 开发了一种靶向LSEC 的辛伐他汀纳米粒,通过甘露糖修饰靶向LSEC 的甘露糖受体,刺激LSEC 中的KLF2-NO 信号传导将HSC 从活化转变为静止,缓解纤维化肝癌模型中的纤维化程度｡3肝纤维化治疗的局限性3.1 肝脏药物摄取低ECM 由成纤维细胞分泌,主要由胶原蛋白和非胶原糖蛋白构成,控制细胞的表型和功能｡在肝纤维化疾病中,HSC 被激活为成纤维细胞,分泌ECM,使其过量表达,在Disse 腔发生沉积｡致密的ECM 成为阻碍药物渗透的物理屏障,使药物无法到达响应的靶细胞而降低药效｡同时,ECM 过量表达,使得肝窦血管周围基质中的非致密胶原Ⅳ被致密的胶原Ⅰ和Ⅲ替换,影响基底膜的结构｡ LSEC 作为肝窦壁的组成细胞,在正常生理状态下,其带有窗孔结构,缺乏基底膜,使得肝血窦通透性高,便于进行物质交换｡当肝脏发生损伤时,Disse 间隙发生纤维化,异常表达的ECM 影响窗孔渗透性｡ 在纤维化疾病中, VEGFR 上调导致LSEC 发生毛细血管化､窗孔减少及组织渗透性逐渐降低,使得药物无法穿过ECM 屏障到达HSC 或KC 等靶细胞,显著降低了纳米药物的递送效率｡ECM 也是肿瘤细胞微环境的重要组分之一,其结构致密并具有刚性,可阻碍药物的穿透从而降低药物的有效摄取｡因此,可以考虑将针对肿瘤的治疗策略应用于肝纤维化的治疗中,针对ECM 的主要成分改善药物的渗透性｡早在2004 年,Eikenes 等[74] 已将胶原酶用于骨肉瘤的研究中,通过降解ECM,使肿瘤摄取药物增加了2 倍｡至于肝纤维化,目前已有报道利用胶原酶修饰递送载体以降解ECM 广泛分布的胶原,使得致密的ECM 出现孔道,便于纳米药物到达HSC 而发挥药效｡将抗纤维化药物联合赖氨酰氧化酶抑制剂､透明质酸酶､透明质酸合成酶抑制剂,均是提高药物跨越LSEC 或ECM递送屏障的策略｡3.2 非特异性细胞摄取递送效率低纳米制剂可以通过特定修饰突破细胞外基质屏障,共递送改善LSEC 毛细血管化,提高制剂渗透性｡然而,非特异性的细胞摄取也是降低纳米药物递送效率的一个重要因素｡肝脏中的细胞丰富,驻留的KC 对纳米粒产生较强的非特异性摄取,加速纳米粒的内吞和清除,使得药物到达靶细胞的药量降低,因此大部分的纳米制剂递送效率并不理想｡外泌体是一种包含核酸和蛋白的囊泡,可由多种细胞产生｡在正常和疾病状态下,细胞均可分泌外泌体,外泌体携载多种miRNA,并且随疾病进展其表达水平不同,比如前面提到的miR-142-3p,可将高表达特定miR 的外泌体应用于肝纤维化的新靶点或新疗法的开发｡再者,外泌体可以从机体内获取,具有良好的生物相容性,不同细胞来源决定了外泌体功能的差异,比如来源于NK 细胞的外泌体可抑制TGF-β 诱导的HSC的激活,显著改善了CCl4 诱导的肝纤维化[75]｡来源于间充质干细胞(MSC)的外泌体通过修复损伤的肝组织,表现出较好的治疗作用[76]｡与传统纳米制剂相比,这一类胞外囊泡除了具备良好的生物相容性,其归巢效应可产生更高效的靶向｡此外,HSC､LSEC 以及胆管细胞等非实质细胞也可分泌外泌体在细胞间传递生物信息｡其中,肝细胞来源的外泌体可以促进肝脏的修复和再生[77],对于治疗肝损伤有着重要意义｡要将外泌体用于临床转化,其大规模的工业化生产还存在挑战:首先,其对体内的作用机制和功能尚未完全阐释,不同来源的外泌体差异较大;其次,外泌体的分离和纯化技术仍有待提高;最后,如何确保批次间稳定性也是值得思考的问题｡3.3 早期诊断手段缺乏肝纤维化是由多种致病因素导致的肝脏病理损伤,若得不到及时的治疗,清除致病因素,不可避免会发展成肝硬化和肝癌,甚至危及生命｡肝脏在受损初期难以诊断,只有当肝纤维化或肝硬化程度相当严重时,才可通过一些影像学手段检查得以发现｡随着药物诊疗学的不断进步,肝纤维化的定量诊断目前也是肝病领域的研究热点,尤其是针对肝纤维化的早期诊断与分级对患者的治疗至关重要｡其中,开发高灵敏度､无创伤及强特异性的造影剂或小分子探针仍是肝纤维化诊断领域的主流方向,比如超顺磁性氧化铁纳米作为MRI 造影剂[62] 被广泛应用于诊断领域,可以采用特异性的靶头修饰进行不同肝脏细胞的标记,并联合具有治疗作用药物的进行共递送,构建多功能的诊疗药物递送系统｡再者,ECM大量分泌的胶原也是评价肝纤维化的重要指标之一,Pomper 等[78] 首次采用环状多肽EP-3533 修饰Gd 纳米粒,特异性靶向Ⅰ型胶原用于多种纤维化疾病的高效成像｡此外,近年来超声弹性成像的诊断效果接近病理诊断,优于血清标志物的检测,已成为目前肝纤维化诊断的常用方法之一｡有学者采用cRGD 修饰的PLGA 包裹的全氟辛基溴(PFOB)纳米粒,通过靶向整合素α v β 3受体可以显著区分肝纤维化区域与临近的正常肝组织[79]｡然而,上述手段均存在肝毒性以及对体内其他脏器组织损害的风险,制约其转化至临床应用｡4结论与展望肝纤维化是一个由多种致病机制相互作用､相互促进的极其复杂的病理过程｡从LSEC 毛细血管化到HSC 的活化,ECM 的沉积,巨噬细胞的炎症反应以及HC 的凋亡等病理过程,环环相扣,对其中的任何一个或多个关键过程进行有效干预都将对逆转肝纤维化起着积极的作用｡现有的纳米药物主要以HSC 为靶点,通过直接或间接手段抑制HSC 的激活通路或促进 aHSC 凋亡,从而改善肝纤维化的程度｡此外,通过纳米载体递送抗氧化及抗炎药物以降低巨噬细胞产生ROS的水平,调控招募炎症细胞浸润以及巨噬细胞极化也是重要的治疗策略｡为提高药物递送的效率和治疗效果可以从以下几个方向思考:① 优化纳米载体的理化性质以提高药物在肝脏的分布;②筛选多靶点的药物进行共递送治疗,通过协同机制缓解肝纤维化;③ 结合新型诊断技术,深入研究不同阶段肝纤维化对药物递送的影响,从而为开发新一代的药物递送载体以增强肝纤维化治疗效果提供参考｡参考文献详见《中南药学》2022 年 6 月 第20 卷 第 6 期文章信息源于公众号凡默谷，登载该文章目的为更广泛的传递行业信息，不代表赞同其观点或对其真实性负责。文章版权归原作者及原出处所有，文章内容仅供参考。本网拥有对此声明的最终解释权，若无意侵犯版权，请联系小编删除。学如逆水行舟，不进则退；心似平原走马，易放难收。行舟Drug每日更新 欢迎订阅+医药大数据|行业动态|政策解读