BRDT

BET家族成员BRD4是肿瘤发生发展的重要调控因子。在急性髓系白血病中，异常激活的BRD4定位超乙酰化启动子位点，招募P-TEFb等中介因子，促进MYC、BCL-2等原癌基因的表达，致使癌症进展。第一代Pan BET抑制剂由于剂量依赖毒性，临床推进受限。第二代BET BD2抑制剂通过提升BD2选择性获得了更高的安全性，目前已进入临床用于治疗急性髓系白血病和骨髓纤维瘤。然而，目前所有已报道的BET BD2抑制剂对BRD4同家族每成员BRD2、BRD3和BRDT的BD2结构域不具备选择性。由于抑制BRDT可能引发潜在的生殖毒性；而BRD3被报道在癌细胞中具有独特的抗增殖功能。因此，进一步提升BRD4 BD2亚型选择性是明确疗效，开发下一代BET抑制剂非常有前景的研究方向。近期，中国科学院广州生物医药与健康研究院的许永团队通过理性设计和系统性结构优化，开发了首个BRD4 BD2选择性小分子抑制剂。相关工作以“Discovery of the First BRD4 Second Bromodomain (BD2)-Selective Inhibitors.”为题发表在美国化学会药物化学核心期刊Journal of Medicinal Chemistry上（J Med Chem 2024, ASAP, https://doi.org/10.1021/acs.jmedchem.4c02516）。 作者以课题组前期报道的BET BD2抑制剂XY153为先导分子（J Med Chem 2022, 65, 7, 5760–5799），采用基于结构的药物设计策略进行优化改造。在前期研究中，作者发现在BC通道区域引入空间位阻基团占据由Pro434和His437形成的BD2独有的疏水区域时，能初步提升化合物的BRD4 BD2选择性。基于此，作者推测BET蛋白的BC通道区域是提高BRD4 BD2亚型选择性的关键位点。根据共晶结构模式分析，作者在化合物XY153伸向BC通道的咪唑环2位和4位引入了不同大小的疏水位阻基团来优化分子结构（图1A）。开发获得了首个成药性良好、高结合活性、高选择性的BRD4 BD2选择性小分子抑制剂16o (XY221)。TR-FRET实验中，化合物16o对BRD4 BD2的结合活性为5.8 nM，相对其他BET BD2的选择性为9~32倍（图1BC）。BLI实验进一步验证了化合物16o优异的BRD4 BD2活性及选择性，选择性倍数达66~142倍（图1D）。TSA实验则证明了化合物16o在溴结构域家族蛋白中的优异选择性（图1E）。  图1：(A) 化合物XY153的共晶结合模式分析；(B) 化合物的结构优化过程；(C) TR-FRET实验验证化合物16o和16j的BRD4 BD2选择性；(D) BLI实验确证化合物16o的BRD4 BD2选择性；(E) TSA实验评估代表性化合物14d、16o和17c在溴结构域家族中的选择性 为了探究化合物选择性的结构基础，作者进行了共晶实验获得了化合物16j与BRD4 BD2的共晶结构（图2AB）。共晶结合模式分析表明，化合物16j大致保留了与XY153类似的结合模式，呋喃吡啶酮母核骨架占据KAc区域，与Asn433形成氢键作用，与Tyr390形成水介导的氢键作用。叔醇取代基伸向ZA通道，与Asp381形成氢键作用。咪唑环伸向BC通道，与Asn433形成氢键作用，与His437形成水介导的氢键作用。咪唑环2-位上的大位阻金刚烷基团占据Pro434和His437形成的疏水区域。咪唑环4-位上的小位阻乙基指向Leu385，并且由于乙基的空间位阻效应，分子内的4-氟-2,6-二甲基苯基发生了偏转（图2C），从而由于BD2/BD1的“Val439/Ile146”差异进一步提高了BD2选择性。但是，与已报道的BRD4 BD2多肽选择性抑制剂情况类似，16j-BRD4 BD2和XY153-BRD2 BD2口袋附近的氨基酸残基并没有观察到明显的差异（图2C），无法具体解释化合物16j的BRD4 BD2选择性缘由。作者推测化合物BRD4 BD2选择性的提升可能是由于四个BET BD2结构域与化合物结合的动态构象稳定性差异导致的。化合物16o与BRD4 BD1的共晶结构（图2CD）则揭示了16o在BC通道区域截然不同的结合模式，由于4-甲氧基甲基的引入，咪唑环发生了显著翻转（图2E），从而提升了BET BD2选择性。  图2：(A) 化合物16j与BRD4 BD2的共晶结构（8ZMQ）；(B) 化合物16j与BRD4 BD2的静电势表面图；(C) 化合物16j-BRD4 BD2与XY153-BRD2 BD2的晶体叠合图；(D) 化合物16o与BRD4 BD1的共晶结构（8ZM8）；(E) 化合物16o与BRD4 BD2的静电势表面图；(F) 化合物16o-BRD4 BD1与XY153-BRD4 BD1的晶体叠合图。 在细胞增殖抑制实验中（图3AB），16o对急性髓系白血病细胞增殖抑制活性较好（IC50 = 0.5 μM），同时对人正常肝上皮细胞的安全性更高（IC50 = 47.7 μM）。抗急性髓系白血病机制研究表明，16o能有效下调凋亡相关蛋白PARP、BCL-2、MCL-1；下调致癌基因MYC及其下游基因p21、ODC1；抑制AKT和AMPK的磷酸化；同时能选择性下调BRD4蛋白水平的表达（图3C）。在mRNA水平，化合物16o能有效下调MYC、p21、BCL-2的转录，对BRD4则没有明显的影响（图3D）。 图3：(A) 部分化合物抗急性髓系白血病MV4-11的增值抑制活性；(B) 化合物16o在多种癌细胞系中增值抑制活性；(C) 化合物10 (ABBV-744)、12 (XY153)、14d和16o在蛋白水平上的调控机制；(D) 化合物16o在mRNA水平上的转录调控。 鉴于化合物16o优异的BRD4 BD2选择性和活性，作者进一步评估了其成药性性质。先前的研究中，化合物12 (XY153)在人肝微粒体中的代谢稳定性不佳（T1/2 = 15 min），表现出种属代谢稳定性差异。令人兴奋的是，化合物16o在人和大鼠肝微粒体中均表现出优异的体外代谢稳定性，T1/2值均大于120 min（图4A）。在PK实验中，化合物16o表现出良好的药代动力学特性，口服生物利用度达13.1%（图4B）。本研究表明，化合物16o（XY221）作为首个BRD4 BD2抑制剂，有望作为小分子探针推动BRD4 BD2相关表观遗传学研究，并为本领域新一代BRD4 BD2选择性抑制剂的研发提供指引。  图4：(A) 化合物16o的体外肝微粒体稳定性实验；(B) 化合物10 (ABBV-744)、12 (XY153)和16o (XY221)的大鼠药代动力学性质。 许永课题组博士后李俊骅、博士后胡清清和硕士生朱润为本论文的共同第一作者，许永研究员、吴锡山副研究员和赵临襄教授为通讯作者。该项目得到国家重点研发计划、国家自然科学基金青年基金、广东省“一带一路”联合实验室基金、呼吸疾病全国重点实验室自主项目、中国科学院青年创新促进会、广州健康院自主部署项目、中国博士后科学基金面上项目、广东省博士后专项基金和广州市基础与应用基础研究青年“启航”项目的支持。  原文链接：Junhua Li#, QingQing Hu#, Run Zhu#, Ruibo Dong, Hui Shen, Jiankang Hu, Cheng Zhang, Xiaohan Zhang, Tingting Xu, Qiuping Xiang, Yan Zhang, Bin Lin, Linxiang Zhao,* Xishan Wu,*.Yong Xu*. Discovery of the First BRD4 Second Bromodomain (BD2)-Selective Inhibitors. J Med Chem 2024, ASAP. https://doi.org/10.1021/acs.jmedchem.4c02516. 声明：发表/转载本文仅仅是出于传播信息的需要，并不意味着代表本公众号观点或证实其内容的真实性。据此内容作出的任何判断，后果自负。若有侵权，告知必删！ 长按关注本公众号  粉丝群/投稿/授权/广告等 请联系公众号助手 觉得本文好看，请点这里↓

关注并星标CPHI制药在线 近日，中国国家药监局药品审评中心（CDE）官网公示，晶锐医药1类新药JRD-018片获批临床，拟开发治疗晚期恶性肿瘤。 JRD-018是一款可入脑的BET抑制剂，今年4月已经获美国FDA批准开展1期临床研究。晶锐医药拟开启1期临床试验并将针对晚期实体瘤患者进行招募，继而扩展到血液瘤、脑转移或原发性脑瘤，旨在探索JRD-018在患者中的安全性、耐受性、药代动力学以及初步抗肿瘤活性。 体内药效研究结果表明，JRD-018单独使用在脑胶质瘤模型、小细胞肺癌模型、非小细胞肺癌模型、髓性单核细胞白血病模型以及乳腺癌模型中均表现出良好的抗肿瘤活性。在临床前动物模型研究中，JRD-018已显示出良好的对脑转移或原发性脑瘤、恶性脑肿瘤的抑制效果。 表观遗传学靶点之BET 溴结构域和超末端结构域（bromodomain and extra terminal domain，BET）属于溴结构域蛋白家族，BET蛋白家族包含四个异构体BRD2、BRD3、BRD4、BRDT，它们的结构相似，在N端有2个串联的溴结构域（BD1和BD2）以及一个超末端结构域（ET）。BD1和BD2识别并结合乙酰化赖氨酸残基，与染色质重塑和基因转录的调控过程相关；ET结构域与多种转录因子相互作用。BET蛋白家族通过溴结构域与乙酰化的染色质结合，从而实现在表观遗传学水平上对基因表达进行调控。 BET蛋白家族在人体内表达广泛，与多种实体瘤和恶性血液性肿瘤、炎症、肥胖、肺纤维化等多种疾病的发生和发展密切相关。如原癌基因Myc在超过一半的肿瘤中过表达，BET抑制剂通过竞争性结合阻止BRD4与染色质结合，进而抑制Myc的转录，从而实现抑制肿瘤的目的。 BET抑制剂是一类新型抗癌药，这类药物在治疗血液癌症如白血病和淋巴瘤方面具有良好的前景。BET抑制剂能够通过阻断BET蛋白的功能从而抑制肿瘤生长。研发BET蛋白选择性抑制剂是目前的新方向。目前，一系列BET抑制剂正在临床试验中检验它们治疗包括白血病、淋巴瘤、脑瘤和骨髓瘤在内的多种癌症的疗效。 BET抑制剂：诺华高调购入，加思科、正大天晴加速推进 BET被认为是抗肿瘤药物研发潜力靶点。目前，全球药企针对该靶点已开发出多款药物，详见下表。在研BET抑制剂大多为小分子化学药，此外还包括蛋白水解靶向嵌合体（PROTACs）。适应症上，BET抑制剂主要被开发用于实体瘤和血液性肿瘤，其中部分还被开发用于治疗炎症性疾病如白癜风等。全球至今还尚无BET抑制剂获批，进度最快的就是MorphoSys的Pelabresib，是首个三期临床试验取得成功的BET抑制剂。MorphoSys围绕该药物布局了骨髓纤维化、恶性外周神经鞘瘤、多发性骨髓瘤等多项适应症。 Pelabrisib是由MorphoSys AG公司研制的first-in-class BET抑制剂，近期Pelabrisib治疗骨髓纤维化III期达到了主要研究终点SVR35（脾脏缩小超过35%），从214例患者的临床数据来看， Pelabrisib与JAK抑制剂芦可替尼联用24周，有65.9%的患者脾脏缩小超过35%，而对照组（芦可替尼与安慰剂）仅有35.2%的患者达到SVR35，实验组的疗效比对照组高30.4%。今年年初，诺华以29亿美元收购MorphoSys AG从而拥有了pelabresib这款BET抑制剂。诺华将基于III期MANIFEST-2研究的积极数据在今年下半年向FDA和EMA提交pelabresib联合芦可替尼治疗骨髓纤维化的上市申请。 ZEN-3694是一种领先的差异化BET抑制剂，被开发联合免疫检查点抑制剂、PARP抑制剂、MEK抑制剂、CDK4/6抑制剂、HDAC抑制剂治疗多种肿瘤。ZEN-3694可以降低BRCA1/2和RAD51等蛋白的DNA修复活性，以提高肿瘤细胞对PARP抑制的敏感性，当前用以治疗转移性去势抵抗性前列腺癌II期临床正在开展中。2019年8月，Zenith Epigenetics 与恒翼生物就该药签订超7800万美元的许可协议，授权恒翼生物获得ZEN-3694在中国（包括中国香港、中国台湾和中国澳门地区）的权益。 JAB-8263是加科思自主研发、具有全球知识产权的小分子BET抑制剂，临床前研究显示其对多种实体瘤和血液瘤均能发挥抗肿瘤作用。从公开数据来看，JAB-8263是同类临床项目中活性最强的BET抑制剂，有望在极低剂量下有效抑制多种肿瘤生长，和Pelabrisib相比具有巨大的差异化优势。目前，加科思正在中美两地开展JAB-8263的多中心、开放性I/IIa期临床研究，适应症涉及白血病及实体瘤。 TQB3617是正大天晴自主研发的一款具有全新化学结构的BET抑制剂，能够通过抑制BET蛋白功能减少c-Myc、NF-κB、Aurora B和BCL-2等致癌基因的异常表达，进而发挥抗肿瘤作用。临床前研究结果显示，TQB3617对BET家族的BRD2、BRD3、BRD4、BRDT蛋白均具有较强的抑制活性。TQB3617用于晚期恶性肿瘤的I期临床试验显示，2例骨髓纤维化患者在治疗第12周结束时，脾 脏体积较基线分别缩小13%和30%，展现出潜在的抗骨髓纤维化疗效。在28例接受疗效评估的淋巴瘤中，总缓解率（ORR）为39.3%（11/28），其中4例CR，7例PR。 Trotabresib（CC-90010）是一种新型、口服、可逆性、小分子BET抑制剂，可穿透高级别胶质瘤患者的脑肿瘤组织，临床前研究显示其可增强替莫唑胺（TMZ）的抗肿瘤作用。已公布的1b/2期开放标签、剂量探索研究结果显示：在长期随访中，新诊断胶质母细胞瘤（GBM）患者接受Trotabresib+TMZ辅助治疗或Trotabresib+TMZ+RT（放疗）同步治疗耐受性良好，未出现新的不良反应。 结语 整体来看，BET是进展相对较慢的一个表观遗传学药物靶点。BET蛋白家族在人体内表达广泛，与多种实体瘤和恶性血液性肿瘤、炎症、肥胖、肺纤维化等多种疾病的发生和发展密切相关，是非常有潜力的药物靶点，全球首个BET抑制剂pelabresib III期临床试验的成功宣告了该靶点的成效性，目前全球围绕BET靶点研发火热，值得一提的是，随着科学技术的发展，BET抑制剂的研发不再局限于小分子化药，已有多家企业、机构研发出BET靶向PROTACs。目前国内药企也积极布局BET靶点，而布局方式除了自主研发，还从外部企业引进，如恒翼生物。期待在药企的不懈努力下，BET靶点可以早日迎来重大突破。 参考来源 1.Raajit Rampal, Sebastian Grosicki, Dominik Chraniuk et al.Updated safety and efficacy data from the phase 3 MANIFEST-2 study of pelabresib in combination with ruxolitinib for JAK inhibitor treatment-na?ve patients with myelofibrosis.?JCO?42,?6502-6502(2024).DOI:10.1200/JCO.2024.42.16_suppl.6502 2.2024 ASCO. Abstract?#6502: Updated safety and efficacy data from the phase 3 MANIFEST-2 study of pelabresib in combination with ruxolitinib for JAK inhibitor treatment-na?ve patients with myelofibrosis. END 来源：CPHI制药在线 声明：本文仅代表作者观点，并不代表制药在线立场。本网站内容仅出于传递更多信息之目的。如需转载，请务必注明文章来源和作者。 投稿邮箱：Kelly.Xiao@imsinoexpo.com ▼更多制药资讯，请关注CPHI制药在线▼ 点击阅读原文，进入智药研习社~

引言 基因的表达依赖于转录激活因子和转录辅助因子的参与，这一过程为通过调控基因表达来治疗疾病提供了有前途的策略。在这些辅助因子中，一种具有bromodomain（BD）与extraterminal （ET）结构域（BET）的家族蛋白质起到了关键作用，包括BRD2、BRD3、BRD4和BRDT。这类蛋白可以通过bromodomain（BD1和BD2）特异性地识别染色质的乙酰化标记从而调控基因表达，因此被视为基因表观调控的重要分子。 BET蛋白的BD结构域在基因调控中发挥着两个重要作用。首先，它们通过与乙酰化组蛋白的结合，帮助将BET蛋白招募到基因的增强子和启动子区域，促进基因的激活。其次，BD结构域还通过一种特殊的组蛋白伴侣活性，促进基因的转录延长过程。此外，BET蛋白的ET结构域，能与多种转录调控因子结合，进而进一步影响基因的表达。在这些蛋白中，BRD4因其支持癌基因MYC的转录表达而备受关注。大家长期认为它通过结合乙酰化组蛋白，招募正性转录延长因子（P-TEFb），促进癌基因的持续表达。 BET抑制剂（BETi）通过与BD结构域竞争性结合，阻断BET蛋白与染色质的相互作用，进而抑制癌基因的转录。这类抑制剂在多种癌症中显示出很强的抗肿瘤活性，尤其是抑制像MYC这样的致癌基因。然而，临床试验表明，对于雌激素受体阳性（ER+）乳腺癌患者，BET抑制剂并未显示出显著疗效。雌激素受体（ER）通过激活癌基因（如MYC和CCND1）的转录，促进肿瘤生长，因此对ER+乳腺癌患者而言，ER扮演了关键角色。尽管近年医学界在ER+乳腺癌治疗方面取得了一些进展，但治疗耐药性仍然是一个重大挑战，尤其是对于高风险患者，他们往往面临有限的治疗选择和较差的预后。而对于这些患者，BET抑制剂一度被寄予厚望。 2024年9月9日，洛克菲勒大学Robert G. Roeder博士 (Arnold and Mabel Beckman Professor) 和张思聪博士（research associate）在Nature Structural & Molecular Biology上发表了文章Resistance of estrogen receptor function to BET bromodomain inhibition is mediated by transcriptional coactivator cooperativity。该研究揭示了一个重要机制：在ER+乳腺癌中，尽管BET抑制剂能够抑制一些基因的表达，但MYC等关键癌基因的转录却依然活跃。这并非是由于乳腺癌细胞对BET抑制剂的演化适应，而是因为他们有一种与生俱来的转录机制——BRD4可以通过不依赖于BD结构域的机制，与其他转录辅助因子相互作用，继续激活这些癌基因。这一发现解释了BET抑制剂在ER+乳腺癌患者中疗效有限的原因。 研究人员首先仔细比较了使用BET抑制剂与去除BET蛋白后对转录的影响，并发现MYC等基因的转录依赖于BET蛋白而非BD结构域的功能。由于目前对哪一个BET蛋白参与ER介导的转录调控尚有争议，研究人员比较了所有BET蛋白的功能。研究人员发现，只有BRD4可以通过不依赖于BD结构域激活MYC与其他癌基因的转录。将BRD4从细胞中去除后，BET抑制剂的抗癌作用显著增强。通过生化手段，发现BRD4能够与Mediator蛋白复合物结合，这个复合物在基因转录过程中发挥着至关重要的调控作用并与ER直接结合。当利用细胞编辑的手段干扰Mediator的功能时，BRD4在基因增强子上的结合显著下降。由于BRD4与Mediator的结合不依赖于BD，研究人员发现了一种新的BRD4的招募途径。 此外，通过研究人员发明的一种专门分析RNA聚合酶II（Pol II）及其相关因子作用的方法——mass spectrometry with DTME crosslinking (MSDC)，发现了BET蛋白通过促进Pol II与转录延长因子（如SPT5、SPT6，PAF1复合物）相互作用，促进基因的转录延长过程。而且这些延长因子的与BET蛋白的作用也不依赖于BD结构域。不过，BET蛋白并并不参与招募P-TEFb。相反，BET蛋白被去除后，P-TEFb在一些基因区域的结合甚至有所增加。因此，我们阐明了BET蛋白如何在不依赖于BD的情况下促进转录延长。 该研究发现对理解ER驱动的基因调控机制具有重要意义。这不仅有助于揭示BET蛋白在癌症中的复杂作用机制，尤其是其在没有BD结构域参与下的关键功能，也为未来开发新型抗癌疗法提供了新的方向。通过更深入地研究这些机制，我们有望克服现有内分泌疗法的抗药性，改善包括乳腺癌在内的多种癌症的治疗效果。 参考文献 https://www.nature.com/articles/s41594-024-01384-6 责编|探索君 排版|探索君 文章来源|“BioArt” End 往期精选 围观 一文读透细胞死亡(Cell Death) | 24年Cell重磅综述（长文收藏版） 热文 Cell | 是什么决定了细胞的大小？ 热文 Nature | 2024年值得关注的七项技术 热文 Nature | 自身免疫性疾病能被治愈吗？科学家们终于看到了希望 热文 CRISPR技术进化史 | 24年Cell综述