MYH9

【导读】 化疗耐药是胰腺导管腺癌(PDAC)治疗中的一大挑战。PDAC的一线化疗方案包括基于吉西他滨的方案，如AG方案，氟尿嘧啶基方案，如FOLFIRINOX方案(5-氟尿嘧啶5-FU，奥沙利铂，伊立替康)以及针对BRCA突变患者的铂类基方案。人们已经做了大量研究来探索吉西他滨基和铂类基方案耐药的机制，但在FOLFIRINOX方案耐药的机制方面却鲜有研究。 10月21日，上海交通大学研究团队在期刊《Cell Death&Disease》上发表了研究论文，题为“Oncogenic GALNT5 confers FOLFIRINOX resistance via activating the MYH9/ NOTCH/ DDR axis in pancreatic ductal adenocarcinoma”，本研究中，研究人员将GALNT5确定为FOLFIRINOX方案耐药的重要调节因子和潜在的治疗靶点。通过克隆形成试验和流式细胞术，研究人员探究了GALNT5在PDAC细胞增殖和凋亡中的作用。通过RNA-seq和GSEA（基因集富集分析），研究人员揭示了潜在的机制。通过蛋白质免疫印迹实验、实时PCR和免疫荧光，验证了相关途径。研究人员建立了小鼠原位异种移植PDAC模型，以在体内研究GALNT5的功能。GALNT5在PDAC组织中高度表达，并预测PDAC患者的预后不良。PDAC细胞中GALNT5的上调通过抑制DNA损伤，赋予了PDAC对FOLFIRINOX的耐药性。此外，GALNT5与MYH9相互作用，参与NOTCH通路的激活，从而阻碍FOI引起的DNA损伤。在体内验证了GALNT5促进FOLFIRINOX耐药的功能。在这项研究中，研究人员发现在PDAC中异常高表达的GALNT5通过与MYH9相互作用，参与激活NOTCH通路，从而抑制DDR，达到对FOLFIRINOX耐药的目的，并导致不良预后。 研究人员发现GALNT5可能是对FOLFIRINOX化疗产生耐药性的PDAC患者的一个潜在治疗靶点。 https://www.nature.com/articles/s41419-024-07110-w#Abs1 背景信息 01 胰腺癌是恶性程度最高的肿瘤之一，在中国恶性肿瘤发病率中排名第8位，是全球第7大癌症致死原因，预计在未来20年中，胰腺导管腺癌将成为第二大癌症致死原因。胰腺癌的传统治疗方法主要包括手术切除、化疗和放疗。对于可切除的胰腺癌，手术是首选的治疗方案。然而，胰腺癌病例往往在早期就伴有淋巴结转移或远处器官转移，当时仅有不到20%的患者有机会接受手术治疗。对于边界可切除（BR）和局部晚期（LA）胰腺癌，通过化疗等手段将其转化为可切除的胰腺癌，以争取手术治疗是目标。对于无法通过手术切除的胰腺癌，目前主要的治疗方法是化疗和放疗。目前，胰腺癌的一线化疗方案主要包括以吉西他滨为基础的方案，如AG（白蛋白紫杉醇和吉西他滨），以及以氟尿嘧啶为基础的方案，如FOLFIRINOX（5-氟尿嘧啶、奥沙利铂和伊立替康）。 自2003年以来，FOLFIRINOX方案首次在晚期胰腺癌患者中进行临床研究。随着大量研究结果的出现，近年来NCCN指南已将FOLFIRINOX方案推荐为局部晚期和转移性胰腺癌的标准一线化疗方案。ASCO 2018年报告的修改后的FOLFIRINOX与吉西他滨辅助化疗在胰腺癌切除术后的对比研究结果，进一步将这种三药联合化疗方案扩展至术后辅助化疗。新NCCN指南进一步将FOLFIRINOX方案推荐为体能状况良好的患者的一线辅助化疗选择。化疗干预有效地改善了胰腺癌手术的预后和患者的生存率。此外，许多研究报告称，在进行胰腺癌切除的患者中，FOLFIRINOX方案的生存期显著长于吉西他滨，但它必须面对频繁出现的药物耐药问题。目前正在加强对吉西他滨耐药机制的研究，但对于其他一线化疗方案如FOLFIRINOX的耐药机制的研究却很少。 GALNT5在体内化学耐药中的作用的验证 02 为了研究GALNT5在体内对FOI抵抗的作用，研究人员采用KPC1199细胞建立小鼠原位异种移植PDAC模型。KPC1199细胞来源于KPC小鼠模型，该模型含有K-rasLSL.G12D/+；和Trp53R172H/+，因此恢复了PDAC的常见基因突变。通过生物荧光成像来评估体内治疗组与对照组肿瘤体积的变化差异。研究人员测量了总荧光强度，发现在sh-GALNT5组中，荧光强度降低更多，这表明GALNT5的敲低使PDAC细胞对FOI更敏感。此外，研究人员取出异位移植肿瘤并对其进行分析，发现在FOI治疗组中，sh-GALNT5组的肿瘤生长抑制效果比sh-Ctrl组更强。小鼠PDX胰腺癌模型的体积和重量分析也得到了与原位异位移植模型相同的结果。研究人员进一步对PDX模型样本进行了HE染色和组织化学染色，结果显示：在未处理组中，PDX组织的分化程度最低。单独使用FOI治疗或GALNT5敲低均可改善PDX组织的分化程度，同时进行FOI治疗和GALNT5敲低的FOI-ShGALNT5组分化程度最高。PDX组织中P-ATM（Ser1981）染色反映的DNA损伤趋势与HE染色一致。PDX肿瘤的生长趋势也与NICD、Ki67和CK19的组织化学染色变化一致。这些结果表明，GALNT5敲低和FOI治疗对抑制胰腺癌的生长和分化有协同作用，提示GALNT5敲低可增强胰腺癌细胞对FOLFIRINOX化疗的敏感性。 体外实验表明，GALNT5高表达会增强胰腺癌细胞对FOLFIRINOX化疗的敏感性 GALNT5-MYH9-NICD相互作用在体内对化疗耐药的验证 03 为了在体内验证GALNT5-MYH9-NICD轴的相互作用，研究人员使用了与上述实验相同的小鼠KPC1199细胞异位移植肿瘤模型和小鼠胰腺癌PXD模型，所有模型每周接受一次FOI治疗以恢复临床给药状态。结果表明，在FOI治疗的背景下，与对照组相比，过表达GALNT5后肿瘤明显增大，而持续敲低MYH9后肿瘤生长明显受到抑制。这一趋势在注射小鼠VPA后逆转。研究人员在小鼠体内成像结果、异位移植肿瘤体重统计数据和PXD模型的肿瘤体积和重量统计数据（第35天）中也发现了同样的趋势。对PXD模型进行取样后进行了HE染色和免疫组织化学染色，观察到：在OV-Vector组中，接受FOI治疗后分化程度最佳，而GALNT5在肿瘤内的过表达导致PDX组织的分化程度显著降低，而MYH9在肿瘤内的下调又使PDX组织的分化程度再次增加。最后，VPA的腹腔注射使分化趋势得以恢复。PDX组织中P-ATM（Ser1981）染色反映的DNA损伤趋势与HE染色反映的趋势一致。PDX肿瘤的生长趋势（通过NICD、Ki67和CK19的组织化学染色变化反映）也与上述结果一致。结合之前的体外实验结果，研究人员推测GALNT5通过与MYH9结合并在体内抑制NOTCH信号通路，从而赋予胰腺癌细胞对FOLFIRINOX化疗的耐药性。 【参考资料】 https://www.nature.com/articles/s41419-024-07110-w#Abs1 【关于投稿】 转化医学网（360zhyx.com）是转化医学核心门户，旨在推动基础研究、临床诊疗和产业的发展，核心内容涵盖组学、检验、免疫、肿瘤、心血管、糖尿病等。如您有最新的研究内容发表，欢迎联系我们进行免费报道（公众号菜单栏-在线客服联系），我们的理念：内容创造价值，转化铸就未来！ 转化医学网（360zhyx.com）发布的文章旨在介绍前沿医学研究进展，不能作为治疗方案使用；如需获得健康指导，请至正规医院就诊。 热门推荐活动 点击免费报名 🕓 线上｜10月22日 ▶ 代谢组学在精准医学方向的研究应用线上高峰论坛 🕓 上海｜11月15日-16日 ▶ 2024第一届中国类器官转化医学大会 🕓 上海｜11月21日-24日 ▶ 第七届上海国际肿瘤内科学论坛 🕓 全国｜2024年12月-2025年03月 ▶ 中国转化医学产业大会 点击对应文字 查看详情

根据世界卫生组织(WHO)的数据，每年有数百万人受到流感的影响。流感是由流感病毒引起的疾病。为了预防这种情况，季节性流感疫苗被广泛认为是预防流感最有效的方法。迄今为止，没有一款“通用”的疫苗可以在世界各地有效地预防所有季节性或大流行性流感病毒类型。由于流感病毒改变了其遗传结构，它可能会出现新的免疫原性（抗原漂移），也可能出现新的病毒亚型（抗原漂移）引起流行病。因此，需要每年重新接种疫苗或开发新的亚型病毒疫苗。目前，三种类型的传统流感疫苗（灭活疫苗、减毒活疫苗和重组疫苗）在不同的国家得到批准，它们基于鸡胚或细胞培养生产。目前，正在努力开发新的流感疫苗，以获得更广泛和更长时间的保护。从这个意义上说，这些候选疫苗被称为“通用流感疫苗”。在本文中，我们首先介绍了流感的短暂历史，病毒的形态和感染，我们描述了流感病毒在人类中引起的疾病。随后，我们详细解释了现有流感疫苗的生产方法、基于细胞培养的生产中使用的生物反应器的类型、传统和新疫苗类型以及更好疫苗的开发策略。 1. 引言 流行性感冒，或通俗地称为流感，是一种传染性很强的呼吸道疾病。自古以来，流感就通过影响动物和人类引起了许多大流行病和流行病。根据迄今为止最古老的记录，希波克拉底在公元前412年首次描述了一种类似流感的疾病。当回顾更近的历史时，可以看到，可以确定的最古老的流感大流行于1890-1891年间首次发生在俄罗斯。当时间来到1918年，发生了世界上发生的最严重的流感大流“西班牙流感大流行”，因为它首先出现在西班牙，并从那里蔓延到全世界。据估计，这场大流行病在1918-1919年间导致近1亿人死亡，总共影响了5亿人。由于1918年西班牙流感大流行，自那以后科学界对流感的认识提高了，对生产预防流感疫苗的研究也逐年加快（图1）。 图1. 根据PubMed的数据在1918-2021年间通过“流感疫苗”关键词搜索的流感疫苗出版物数量 流感分为大流行和流行性（或季节性）。与新冠肺炎疫情类似，大流感疫情也是突发性的，对世界产生了巨大影响。另一方面，每年季节性流感爆发定期影响许多人。大流感爆发是由于出现新的流感病毒亚型而发生的。由于人们以前没有遇到过这些新病毒，群体对它们没有强烈的免疫反应。 另一方面，季节性流感每年都会出现，免疫原性变化很小。因此，由于人们对季节性流感病毒预先存在免疫力，季节性流感的影响不像流行病那样具有破坏性。引起季节性流感的病毒被称为“循环流感制剂”。这里的“循环”一词表示引起季节性流感的相关病毒在人类中继续传播。 来自WHO的数据显示，全球每年有300-500万人因季节性流感疫情住院，29万65万人死于流感。此外，当考虑到季节性流感病例时，据说全世界每年有5-10%的成年人和大约20-30%的儿童被感染。除此之外，住院期间的医疗费用和生病期间的无法工作，都会造成很大的经济损失。统计研究结果估计，美国每年季节性流感造成的经济损失在63亿至2530万美元之间。同时，由于流感病例发生在家畜（尤其是家禽）中，受感染的动物可以被扑杀。因此，大量宰杀这些动物也会在经济和食物供应方面造成问题。 2. 病毒结构形态 迄今为止发现的所有病毒都根据其病毒结构和遗传学进行了分类。流感病毒属于正粘病毒科。目前已鉴定的流感病毒有4种。这些是Alpha (A)，Beta (B)，Gamma (C)，和Delta (D)流感病毒。流感病毒的这种区别是基于两种主要结构蛋白的抗原性差异而做出的。这些是核蛋白(NP)和基质蛋白1(M1)，它们都属于糖蛋白。甲型和乙型流感病毒覆盖了全球所有季节性流感病例。然而，临床病毒鉴定研究表明，仅在全球范围内，甲型流感病毒就导致了大多数季节性流感病例。此外，为调查迄今发生的流感大流行而进行的鉴定测试表明，A型流感病毒是所有这些大流行的原因。此外，乙型流感病毒约占季节性流感病例总数的15%-30%。 图2. 流感病毒结构 甲型流感病毒通过表面糖蛋白血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)的抗原特性进行细分。到目前为止，已描述了18个HA亚型和11个NA亚型。然而，在引起季节性流感的人类流感病毒和历史上引起流行病的人类流感病毒中，只观察到三种HA(H1、H2和H3)和两种NA(N1和N2)亚型。根据历史进展，WHO确定了在人类中传播的甲型流感病毒亚型为H1N1、H2N2和H3N2。这些也被称为人类流感病毒。其中，H2N2不再循环，自1968年以来就没有出现过。根据目前的数据，目前只有H1N1（类似于导致2009年大流行的病毒）和H3N2病毒在传播。为此，抗病毒药物和疫苗开发研究只针对这些病毒类型进行。 乙型流感病毒不像甲型流感病毒那样分为亚型。他们只是分为两个谱系（“Yamagata”和“Victoria”）。此外，乙型流感病毒不会像甲型流感病毒那样引起流行病。因为它们的变异率比甲型流感病毒低得多，而且即使变异，抗原特性仍与甲型流感病毒的原系相似。这样，即使乙型流感病毒是通过变异新形成的，在社会上（尤其是在成年和老年个体中）对这种乙型流感病毒产生预先存在的免疫反应的可能性也相当高。因此，人群中对乙型流感病毒的这种预先存在的免疫反应提供了大量的保护。这使得乙型流感病毒引起大流行的概率非常低。根据到目前为止的一般假设，乙型流感病毒不会引起大流行，因为没有一种新的乙型流感病毒是由于突变而“突然”出现的。正因如此，全球也只有两种乙型流感病毒株多年来一直在人类中引起感染。这些菌株是Yamagata和Victoria Like菌株。除此之外，已经证明C型流感病毒只能感染人、狗、牛和猪。然而，这种感染在人类中非常轻微，不需要住院或特殊治疗。到目前为止还没有发现D型流感病毒会感染人类。由这种病毒类型引起的感染也只见于猪和牛。由于这个原因，整个科学界只致力于预防和治疗由甲型和乙型流感病毒在人类中引起的流感。 流感病毒是具有病毒包膜的单链RNA病毒。流感病毒的一般结构可分为衣壳和病毒包膜。衣壳基本由M1组成。在这种衣壳内有非结构蛋白2(NS2，也称为核出口蛋白，NEP)和非结构蛋白1(NS1)，以及分段的单链RNA分子（图2)，这是流感病毒的遗传物质。在病毒表面，形成包膜的双层脂质层上有病毒蛋白结构，这是流感病毒类型所特有的。 甲型流感病毒和乙型流感病毒都含有8个单链RNA分子，由NP包裹，并与单链RNA依赖的RNA聚合酶(RDRP)组成复合物。所有这些统称为病毒核糖核蛋白结构。在这些病毒体的双层脂膜层（病毒包膜）上，有糖蛋白HA、NA和基质蛋白2(M2)蛋白（一种作为离子通道的跨膜蛋白，对乙型流感病毒来说，这种蛋白是BM2)。与这些蛋白质不同的是，最近发现的NB蛋白被认为是乙型流感病毒特有的离子通道。然而，对于这两种流感病毒，在形成病毒包膜的双层膜层中，HA是最丰富的病毒蛋白，其次是NA（图2）。这些蛋白质结构在病毒上被视为10-14纳米长的突出的尖刺。尤其是哈的形状更像刺，在哈的旁边，纳被描绘成一个有盖的蘑菇。平均直径为120纳米(NM)的流感病毒在病毒表面含有约300-400个HAs和40-50个NAs。除此之外，流感病毒还存在3种不同的形态。它们是(i)丝状，(ii)椭圆形（也称为杆状）和(iii)球形。虽然关于流感病毒为什么具有不同的形态有不同的理论，但这其中的确切原因还没有完全理解。 3. 流感病毒感染 流感病毒会感染人体呼吸道的细胞。然而，人的呼吸道有一个高粘性的黏膜层，它有一个连续的流动来捕获空气中传播的微生物，防止潜在的感染。因此，流感病毒必须首先克服这种黏膜屏障，才能引起感染。在进化过程中，流感病毒形成了一种HA和NABASED机制，穿透这层粘液，感染这层粘液下的上皮细胞。根据这一机制，最初吸入的流感病毒与HA粘附在粘液表面含有唾液酸(SA)的粘液链上。接下来，连接位点的SA被NA切割，病毒连接到下一个SA延伸部分。就这样，病毒以滚动状的运动从粘蛋白链向上皮组织移动。当病毒到达细胞时，它会找到合适的受体，使病毒能够以类似的运动进入细胞，并与细胞结合。在这种结合之后，病毒被带进细胞。HA和NA在病毒上的平衡对于病毒的成功感染也是非常重要的。 人呼吸系统上部的上皮细胞表面主要存在着与α-2,3区半乳糖链结合的SA分子受体(α-2,3gal，简称SAα2,3gal)。流感病毒通过粘液层后，通过识别这些受体基序或模式，特异性地与细胞结合进入细胞。人类流感病毒通常识别α-2,3Gal模式，并与这些受体结合。因此，流感病毒主要感染上呼吸道的细胞。因此，感染通常局限于上呼吸道。然而，在人呼吸道的某些类型的细胞中，也表达大量的α-2,6gal基序和α-2,3gal。与α-2,3gal模式不同的是，SA在α2,6区与半乳糖链结合。特别是下呼吸道的肺泡上皮细胞就是这些细胞类型之一。因此，甲型流感病毒中的其它亚型，如禽流感病毒，主要在鸟类中传播，也可以通过识别该α-2，6gal基序感染人类。正因如此，人呼吸系统下部细胞具有α-2,6gal基序这一事实，是禽流感病毒引起人感染的主要原因。从迄今记录的病例来看，禽流感病毒（尤其是H5N1和H7N9)通常在人类中引起更严重的疾病，而且它们的致死率远高于人类流感病毒。 3.1. 抗原移位和抗原漂移 流感病毒是不断变化的病毒，有两个基本机制使病毒的抗原结构发生变化分别为：抗原漂移和抗原移位机制。抗原漂移（图3A)主要是由于病毒的快速进化和RDRP中缺乏校对（纠正复制过程中出现的不正确碱基配对）机制引起的。因此，点突变是由于RDRP的错误和持续进化过程的帮助而发生的，以更好地适应病毒感染的宿主有机体。这些点突变导致氨基酸序列的改变，尤其是在HA和NA表面糖蛋白中。当这些点突变累积发生在特定的基因区域时，病毒蛋白相应的抗原性状就会发生剧烈变化。同时，通过抗原漂移的变化率随着每个感染-复制周期而持续增加，在这个过程中发生得非常频繁。在这种情况下，如果新出现的突变病毒的表面糖蛋白在小点突变后形成，与突变前的第一种形式抗原性相似，一些先前形成的抗体也可以提供对这种新病毒的保护。这被称为“交叉保护”。然而，由于抗原漂移机制，当病毒表面抗原编码基因（如HA和NA编码病毒基因片段）的同一区域发生多个点突变时，表面糖蛋白抗原性的变化率可能相当高。这样，变异流感病毒在其病毒亚型方面保持不变，但其表面抗原在免疫学上与其原始抗原形式不同。因此，抗原性截然不同的新突变病毒可以从免疫系统中逃逸并引起感染，因为机体中现有抗体对这种新病毒株的特异性下降。因此，每年不断有季节性流感病例出现。 流感基因组的分段结构使得不同亚型流感病毒之间更容易进行遗传物质的交换。这个过程被称为抗原转移（图3b)，病毒的变化在这里发生在一个步骤中。因此，这种机制允许病毒进行不可预测的进化飞跃。 相反，这种情况是由于不同亚型的病毒同时感染单个有机体，在感染期间复制的病毒基因组在它们之间随机重配而发生的。这种交换也被称为“重配”，以这种方式形成的病毒被称为“重配病毒”。在这一机制中，猪扮演着“病毒混合罐”的角色，因为人类流感病毒识别并结合的α-2，3GAL和禽流感病毒识别并结合的α-2，6GAL在它们的细胞表面上几乎相同数量。这个定义也可以部分适用于人类。然而，由于α-2，6gal细胞表面基序只在人类某些类型的细胞上发现，这种情况在人体内发生的概率比在猪体内低得多。抗原转移机制使一些通常不感染人类或不在人与人之间传播的流感病毒有可能对人类产生感染。这样做的结果是，新的病毒亚型可以用这种机制形成。此外，由于它们是以前从未在人类中传播的新病毒，人们对它们预先存在免疫力的可能性相当低。因此，这些新病毒可以在公共卫生领域产生巨大的社会影响，就像流行病的定义一样，由于它们可以发生全球性的流感大流行。 图3. (a)抗原漂移：病毒抗原结构在免疫原性方面的改变。(B)抗原转移：由于两种不同病毒的基因片段发生改变，形成具有两种病毒特征的单一新病毒亚型。 3.2. 人类流感病毒感染引起的疾病 流感通常在流感病毒进入人体后潜伏期为1-2天，症状通常是全身性的，包括发烧，寒战，头痛，肌肉剧烈疼痛，虚弱和食欲不振，这些症状还伴有干咳、流鼻涕、咽痛等症状。尤其是在检查时，如果患者有干咳伴发热，同时考虑到当前的季节，疾病的诊断变得更加容易。此外，在发病时，患者可能会出现眼睛发炎、流泪或眼睛发红，以及畏光。在后期，最突出的症状为干咳和乏力。发病后一两周，患者几乎完全恢复到原来的状态。 然而，流感会在人类中引起更严重的并发症。这些并发症可分为肺部并发症和非肺部并发症，前者主要影响肺部，后者影响身体其他器官系统 肺源性肺炎可分为病毒源性肺炎（或原发性肺炎）和细菌源性肺炎（或继发性肺炎）。病毒性肺炎是由于流感病毒滞留在下呼吸道而发生的，尤其是在禽流感病例中。另一方面，细菌性肺炎的发生主要是由于与流感病毒斗争时免疫系统减弱，病原体在肺部生长所致。因此，免疫系统较弱的个体在患流感时极易继发肺炎。 非肺部并发症主要影响肌肉、心脏和神经系统。与成人相比，这些并发症在儿童中更常见。对于肌肉系统，流感很少会导致肌炎和横纹肌溶解。虽然流感的并发症在肌肉系统中很少发生，但它对心脏影响很大。流感的心脏并发症包括心肌炎、心包炎，并可使患者原有的心脏问题恶化。流感还与神经系统并发症有关，包括Reyes综合征、脑脊髓炎、横贯性脊髓炎、格林-巴利综合征、无菌性脑膜炎和脑炎。 4. 人体对流感感染的免疫反应 任何病原体一进入细胞，人体免疫系统就开始与之对抗。人体也会产生这种对流感病毒的免疫反应。免疫反应表现为内在（或先天免疫）和随后的适应性免疫，这两者不能完全分开，因为它们在细胞和分子水平上高度联系合作地刺激免疫系统。 4.1. 先天免疫 先天性免疫是人类在进化过程中对各种病原体（细菌、病毒、真菌等）产生的免疫反应。由于这个原因，人体免疫系统也产生了对抗流感病毒的自然反应。另外，另一种自然防御机制是呼吸系统中的黏液层，它阻止病毒到达细胞进行感染。因此，作为一种呼吸道病毒，流感病毒必须首先穿透粘液层，然后到达并感染那里的细胞。这种感染，尤其是在肺上皮开始，随着时间的推移，也会发生在肺部的巨噬细胞和树突状细胞中。然而，由于这些细胞类型的特殊性，在这些细胞中发生的病毒感染是有限的，这要归功于它们增强的内部防御机制（如细胞内一氧化氮释放）。干扰素刺激是通过激活模式识别受体和Toll样受体(TLR)来实现的，这些受体在这些细胞中尤其丰富。虽然这些受体大多是巨噬细胞和树突状细胞等免疫细胞特异的，但所有这些细胞内受体结构也存在于人肺上皮细胞中。因此，免疫系统通过各种细胞因子被刺激，而无需等待病毒到达免疫细胞。 此外，树突状细胞在刺激固有免疫和适应性免疫以及在病毒感染的免疫反应中起着非常重要的作用。这些细胞通过吞噬（与MHC-II）或直接感染（与MHC-I）在感染部位的结果，开始在其表面呈现流感病毒抗原。这样，提呈抗原的树突状细胞随循环进入淋巴结，刺激B和T淋巴细胞，将使适应性免疫得以实现。 4.2. 适应性免疫 首先，先天免疫与流感病毒作战，流感病毒进入体内。然后，这个系统通过特殊的受体刺激许多级联。先天性免疫之后，适应性免疫反应被诱导为更特异性的反应。这其中一个最大的原因是自然免疫不能完全预防感染。适应性免疫分为两个途径分别为：通过T淋巴细胞产生的细胞免疫和通过B淋巴细胞分泌的抗体产生的体液免疫。 4.2.1. 细胞免疫 由于抗原提呈细胞的刺激，T淋巴细胞的产生受到免疫系统对抗相关感染的刺激。T淋巴细胞(CD4+和CD8+)在细胞水平上构成免疫的基础。这些T细胞只能在主要组织相容性复合物(MHC)上以短肽片段的形式呈现给它们时识别病毒抗原。因此，抗原提呈细胞必须将相关的流感抗原提呈给T细胞并激活它们。研究表明，当流感病毒感染时，T细胞（尤其是细胞毒T细胞，TC)对病毒内源性蛋白（如NP和M1)产生特异性反应，这些蛋白是流感病毒中较为保守的抗原结构。因此，TC细胞对病毒内源性蛋白的免疫应答比对病毒中更可变的HA和NA蛋白的免疫应答提供了更广谱的保护。 因为，在大多数亚型流感病毒中，病毒内源性蛋白的抗原结构比HA和NA更保守。当流感病毒感染的细胞在MHC-I上显示这些蛋白时，已经观察到TC迅速识别它们。经此识别后，与感染细胞结合的TC细胞分泌穿孔素和颗粒酶。这两种成分共同导致感染细胞凋亡。另一方面，T CD4+细胞（或一般称为T辅助细胞）提供了多功能的免疫应答。它们参与刺激吞噬巨噬细胞、激活TC细胞和细胞因子的表达以限制感染，同时促进B细胞激活以促进体液免疫。然而，T CD4+细胞只能通过抗原提呈细胞识别感染。当这些细胞在它们的MHC-II上显示病毒抗原时，T CD4+细胞与它们结合，并刺激不同的免疫反应，这是上文提到的。 4.2.2. 体液免疫 体液免疫是以B细胞为基础的。这些B细胞能产生对流感病毒不同抗原部位高度特异性的抗体。免疫优势的机制决定了B细胞产生的抗体主要针对病毒的哪个抗原区域。总之，免疫优势机制可以解释为流感病毒上的抗原区域中，人体免疫系统更偏好哪个区域形成抗体。因此，B细胞大多偏好HA的头部区域产生HA特异性抗体。因此，在流感感染后，会产生大量的抗体，这些抗体是针对HA头部区域的。然后分别是NA的头区、M2的外层区（外域，M2E)和HA的茎区。虽然人体内也会产生针对其他抗原区域的抗体，但已有研究表明，人体产生的针对流感病毒的总抗体中，大部分是针对HA头区域的特异性抗体。此外，还观察到针对病毒内部蛋白如NP和M1的抗体反应。然而，这些抗体反应的水平相当低。因为这些只有当受感染的细胞处于病毒复制周期时才可用。在这个周期中，当细胞机制合成一种新病毒时，在病毒组装的短时间内，这些蛋白质结构通过MHC-I呈现在细胞表面。 因此，对它们特异的抗体可以结合这些蛋白。 除了所有这些之外，疫苗的目标是诱导适应性和内在免疫反应都参与的免疫反应。它们可以显示出对相关疾病的长期保护活性，特别是由于在细胞和体液方面良好诱导的适应性免疫反应。在这方面，传统的和新的候选疫苗，试图通过模仿这些在体内发生的整个感染过程来引发良好的免疫反应。 5.2.4 流感病毒的内源蛋白 流感病毒的内源蛋白通常比其表面蛋白更为保守，因此在通用流感疫苗的研究路线中作为潜在的抗原靶点。然而，这些内源蛋白往往不出现在病毒表面，所以免疫系统无法轻易接触它们。另外，如前所述，这些内源蛋白可直接由流感感染的细胞表面MHC-I复合体递呈。尤其是，NP蛋白和M1蛋白可诱导强T细胞反应。因此，尤其是NP蛋白和M1蛋白或两者的组合可较强地刺激细胞免疫，也使得它们成为研制常见流感疫苗优秀的抗原靶点。 5.2.5 以HA为靶点的研究路线 根据显性免疫机制的原理，HA蛋白是流感疫苗开发研究中最为理想的抗原靶点，但是由于该蛋白复杂的结构，尤其是HA蛋白头部结构域抗原变异之快加大了研制疫苗的难度。因此也常常引发与抗体产生错配的现象。由于HA头部结构域不断变异，以HA为靶点设计的疫苗开发研究中不再以该结构域作为研究靶点，不同的研究路线尝试以HA蛋白的其他抗原结构域作为靶点设计疫苗的开发。通用流感疫苗开发研究中也包含这些研究路线。 5.2.5.1 嵌合血凝素（Chimeric hemagglutinins，cHA） 该研究路线目的是通过连续接种疫苗，以此来提高针对比HA头部结构域更保守的HA茎结构域抗体的含量。该研究路线中，HA其他亚型如H5、H6或H7（称为异头部结构域）这些在人类流感传播中不常出现的结构域取缔H1或H3亚型的顶部结构域成为疫苗研究的靶点。这类结构域称为cHA。在这过程中，通过不断改变头部结构域来获得不同的cHA。该研究路线的目的是利用免疫系统趋势来持续扩大已有的免疫记忆反应。当每次流感病毒的头部结构域更新，机体设法产生针对该结构域的新抗体时，就能分泌针对茎结构域的特异性抗体激发快速免疫反应。因此，在每次接种疫苗后，针对茎结构域的特异性抗体滴度有所提高。此外，免疫系统也会试图建立针对这些异头部结构域的免疫反应。所以，这条研究路线不仅可产生针对异HA亚型的免疫反应，有研究表明，利用H5和H7研制的疫苗还可以提供对抗禽类流感病毒的免疫保护。 5.2.5.2 嵌血凝素（Mosaic hemagglutinins，mHA） 这条研究路线与cHA的方法非常相似。主要区别在于该路线中每一个流感周期中只有抗原表位发生改变，而非整个HA的头部结构域发生改变。异型HA中的抗原表位代替人类流感病毒传播的头部结构域抗原表位作为研制疫苗的靶点。这种抗原表位称为mHA。与cHA同理，该研究路线的目标是通过连续疫苗接种来提高针对HA茎结构域的抗体响应。 5.2.5.3 计算优化HA的广泛反应性抗原（COBRA） COBRA是另一个基于HA的疫苗研发策略。该研究路线是想通过筛选出所有流感病毒的HA的一致序列，来设计出新的通用HA蛋白。根据这一研究路线，如果个体接种了含有通用HA蛋白的基于COBRA技术的流感疫苗，那么免疫系统也因此产生相应的通用抗体。由此认为这些通用抗体能产生针对所有流感病毒HA亚型的免疫保护。此外，在一些研究中通过计算机模拟已表明该路线的可行性。 5.2.5.4 无头部结构域的HA 另一条可选择的研究路线是完全剔除HA的头部结构域。在这一背景下，高度保守的HA茎结构域变为可见并可与免疫系统接触。然而，没有了头部结构域，这些结构变得不稳定且容易错误折叠，这种错误折叠会形成不同的结构域，而这些结构域实际并不存在于HA的茎结构域中。这就引起没有必要的抗体产生。在一些研究中指出，这种无头HA结构可以通过不同方法来增加其稳定性。已经有研究报道利用这些无头HA来研制疫苗并成功产生针对茎结构域的特异性抗体。 5.3 新型候选流感疫苗 虽然目前的流感疫苗可提供良好的免疫保护力，但因为一些问题，流感疫苗的开发研究从未停止。出现的问题分别是：每年更新流感疫苗的需求，有些流感疫苗的低保护力，当前生产体系的缺陷，安全问题，无法产生有效的强细胞免疫反应，以及仅能提供较短的免疫保护期。疫苗研发主要着重于的减少疫苗生产成本和周期，可同时有效激发体液免疫和细胞免疫并能持续较长时间，以及鉴别一些流感病毒的保守抗原结构域。为了研制符合上述要求的更好的流感疫苗，目前已经出现了不同研发策略，各种不同的研究已经在进行中，也由此研制出了很多不同的新型候选疫苗。有些候选疫苗已经在实验室阶段获得较大成功，有些疫苗已经进入临床试验（表2）。除了这些新型疫苗，研究流感疫苗的理想是研发通用的流感疫苗。通用流感疫苗是为了结束根据每年要求的毒株不同生产疫苗的情况，并且能通过一针接种产生抵抗所有不同流感血清型或亚型的免疫力。 表2. 进入临床试验的新型候选流感疫苗 HA：血凝素；NA：神经酰胺酶；NP：核蛋白；NPA：甲型流感病毒核蛋白；NPB：乙型流感病毒核蛋白；M1：基质蛋白1；M2：基质蛋白2；M2e：基质蛋白2 胞外域；PB1和PB2：病毒RNA聚合酶组分（聚合酶1和聚合酶2）；Sf9：黑夜蛾昆虫细胞；WHO：世界卫生组织 5.3.1 VLP VLP含有与病毒相似的形态结构但缺少病毒基因组。因此它们不能引起感染或重组等问题。另外，由于它们具有完整病毒的形态结构，免疫系统可将其识别为病毒。有研究指出，只含有病毒外壳组分（HA、NA和M2）的VLP具有强免疫原性。与其他重组产品相似，VLP的获得可通过构建含有组装成VLP的结构蛋白的表达载体转染至细胞中，并通过细胞表达蛋白。 5.3.2 基于核酸平台疫苗 核酸平台基本包括DNA和RNA疫苗。在这技术平台上，对编码目的流感疫苗抗原区的序列进行测序，转化合成为DNA或RNA序列，形成疫苗。尤其是对于RNA疫苗来说，只有mRNA用于这个目的。因为mRNA是细胞内蛋白表达机制中的基础分子，所以mRNA是最适合的分子形式，引发表达机制产生具有诱导免疫系统能力的抗原蛋白。在这一背景下，疫苗中含有编码目标抗原蛋白的mRNA进入人体后，这些mRNA进入人体细胞中并表达目标病毒抗原蛋白。随后，免疫系统受到合成的病毒抗原蛋白激活。含有DNA（以质粒的形式存在）的核酸疫苗也具有相似的机制，唯一的区别是DNA进入细胞后再合成携带有病毒抗原蛋白基因的mRNA。另外，用于疫苗生产用的DNA或mRNA分子的生产迅速，它们不依赖于细胞培养或鸡胚的生产，而是通过特殊的核酸测序和扩增设备/技术来获得。对于快速疫苗研制，尤其是发生重大的流行病时，这种生产系统具有最大的优势。 5.3.3 病毒载体疫苗 病毒载体疫苗是一种通过在另一种对人类病原性的病毒中表达目的病毒的抗原性组分的疫苗。这一领域已有一些喜人的研究成果。其中一些是利用改良的痘病毒安卡拉株（MVA）并在其中合成HA、M1和NP等流感病毒蛋白。而在另一个研究中，他们利用腺病毒表达病毒表面的HA抗原。这两项研究都对利用病毒载体作为疫苗的潜力进行评估，发现两种病毒载体疫苗均对流感病毒具有高免疫力。这是因为这些载体疫苗同时激活体液免疫和细胞免疫，模拟人体自然感染过程。此外，大多数的病毒载体缺少在哺乳细胞中复制的能力，因此它们的使用是安全的。然而，针对病毒载体本身所产生的免疫力可能会引起一些问题。因为当这些载体进入体内，免疫系统迅速识别载体病毒具有抗原性的部位而忽略了在病毒载体上表达的流感病毒抗原。导致免疫系统引发大多数仅针对载体病毒本身抗原部位的免疫反应，而非针对流感病毒抗原的免疫反应。 5.3.4. 基于蛋白或多肽平台的疫苗 蛋白或多肽疫苗中主要利用具有重要抗原性的多肽或蛋白结构。尤其是利用一些蛋白的保守区，嵌合蛋白如cHA和一些非折叠的全长蛋白。这些蛋白或多肽结构通过化学合成或通过宿主生物合成。当宿主生物用于生产这些蛋白或多肽时，在这过程中重组技术尤为重要。因此这些疫苗也称为重组蛋白疫苗。特别是，有研究指出，融合表达合成的NP和M1蛋白加入佐剂免疫或者通过嵌合在纳米颗粒或VLP表面或内部来运输至体内，能产生良好的免疫应答，诱导CD8细胞毒性T细胞参与该免疫反应中。 5.3.5. 基于纳米颗粒平台的疫苗 纳米颗粒疫苗技术与VLP平台相似，但是它不是通过组装病毒蛋白结构，而是利用不同的纳米级组分（如金、银和壳聚糖等）。另外，不同于VLP技术，大部分的纳米颗粒本身不能触发免疫反应，纳米颗粒实际上作为一个载体，并且加强抗原性病毒蛋白的免疫原性。这些纳米颗粒疫苗的生产主要用这些病毒靶蛋白（如HA、NA、NP、M2等）作为原材料。然后这些蛋白吸附于纳米颗粒表面或嵌合于颗粒内。通过表面结合方法，形成类病毒结构，含有病毒蛋白的纳米颗粒进入细胞内并模拟病毒感染过程。 5.4. 市售流感疫苗的生产方法 对抗包括流感病毒在内的病毒的最有效方法是疫苗，可以在疾病发生前直接预防疾病。此外，考虑到抗病毒药物治疗、住院和医护人员服务费的成本，疫苗是对抗流感的最便宜的方法。 由于这个原因，疫苗生产是一个多年来一直并继续被强调的领域。 传统的流感疫苗被设计成只包含当前循环的病毒类型。因此，就病毒含量而言，基本上产生了两种不同的疫苗配方。这些是三价和四价疫苗。三价疫苗是为预防H1N1、H3N2甲型流感亚型和乙型流感维多利亚谱系而设计的。除了三价疫苗之外，四价疫苗组合物中只添加了乙型流感Yamagata谱系。过去许多流感疫苗是作为三联疫苗生产的。然而，由于四价疫苗提供了更广泛的保护范围，近年来，大多数流感疫苗都是以四价形式生产的。 在今天生产的所有流感疫苗中，流感病毒的靶向抗原部分是HA。因为，根据免疫优势机制，免疫系统对HA头部区域的反应比病毒的其他抗原部位最强。然而，虽然HA的头部区域是免疫系统的一个很好的靶点，但这个区域的抗原变化非常快。所以，这种情况使得每年准备疫苗成为必要。同时，大多数常规疫苗并不是只含有HA。许多市售疫苗也含有大量的NA和流感病毒的不同抗原区域。然而，在确定疫苗制剂的适当剂量时，仍在根据疫苗中HA的数量进行计算。 病毒的主要抗原部位是HA，其次是NA。这些是糖基化的蛋白质。宿主细胞中的翻译后机制对于这些蛋白质通过糖基化过程获得功能非常重要。因此，这种情况使得流感病毒具有种特异性，它们只能感染发达的真核脊椎动物。另一方面，由于病毒的寄生性，无法自行繁殖。因此，它们需要能够感染的活的有机体或细胞。由于这个原因，在所有的生产中，必须选择合适的宿主有机体或细胞。因此，病毒可以感染或适当表达其抗原结构的免疫原性。在这种情况下，目前生产的所有常规疫苗基本上都使用了3种生产方法。它们是：（1）在无特定病原体(SPF)胚胎卵中生产（简而言之，基于卵），(2)基于细胞培养的生产，(3)在重组表达平台上生产（图6）。所有这些生产平台都是从能够执行HA和NA所需的翻译后修饰并允许流感病毒感染的细胞中选择的。 以鸡蛋为基础的生产用于流感疫苗已有近70年的历史。在这种方法中，由于用于疫苗生产的病毒是人类流感病毒，它们一般需要在鸡蛋中进行适应性生产。因为，人类病毒习惯于人类哺乳动物细胞。特别是，H3N2病毒在鸡蛋中繁殖很少。由于用于鸡胚生产的SPF鸡蛋含有属于鸟类物种的细胞，必须创建一种新的接种菌株来有效地感染病毒。由于这个原因，鸡蛋同时被世卫组织选定的候选疫苗病毒和在鸡蛋中表现出良好复制的流感毒株（这被称为高产毒株）感染。这种共感染过程的目的是创造与候选疫苗病毒抗原相似的新病毒，同时它们能够在鸡蛋中大量繁殖。一株在鸡蛋中复制效率很高的高产病毒A/Puerto Rico/8/1934(H1N1)（简称PR8)被长期用于这种混合感染。 这种共同感染过程的结果是，许多新的病毒出现。然而，在这些病毒中，必须选择一种特殊的2+6重配病毒。“2+6重配病毒”的表达意味着这种特殊病毒必须具有来自候选疫苗病毒的HA和NA基因片段，以及来自高产毒株的其余6个基因片段。这种特殊的重配病毒是经过精心筛选选出的。这种被选中的病毒被称为“接种毒株”。接种菌株确定后，进行实际生产。为了这种生产，许多SPF蛋感染了接种菌株。这一过程始于将接种菌株接种到SPF卵的尿囊液中。病毒在这里大量复制。 然后，为了获得在这里产生的病毒，收集所有感染了接种菌株的鸡蛋的尿囊液。之后，根据要生产的疫苗类型（无活性或减毒）执行其他分离/纯化工艺和制剂工艺（图6）。所有这些过程都是对疫苗中包括的所有病毒类型和亚型单独执行的。最后，所有产生的病毒都按照疫苗确定的配方进行组合。此外，几乎所有流感疫苗都含有等量的所有病毒类型和亚型。 图6. 流感疫苗生产方法流程图。1）蛋基疫苗生产（蓝线）；2）以细胞培养为基础的疫苗生产（紫线）；3）重组疫苗生产（绿线） WHO：世界卫生组织，SPF：特异性无致病性，HA：血凝素。 尽管使用鸡蛋生产疫苗是有效的，且应用时间较长，但这一方法存在以下缺点：(i)需连续使用无特定病原体（SPF）鸡蛋（每剂疫苗至少需要1-2个鸡蛋），(ii)对鸡蛋过敏的个体（对疫苗过敏），(iii)禽流感大流行中怀疑鸡蛋是否清洁，(iv)清洁鸡蛋供应困难。尽管如此，使用鸡蛋生产流感疫苗仍然是全球最常用的方法，主要原因是企业已经建立并满足GMP标准，不想改变这种生产模式。企业与SPF鸡蛋供应商达成的协议，也可能导致企业继续沿用现有的生产模式。另一方面，为避免基于鸡蛋的流感疫苗生产平台的劣势，全球制造商和研究人员也在探索其他生产平台，其中最适用的是基于细胞培养的疫苗生产。全球第一款基于细胞培养的流感疫苗由诺华生产，商品名为Optaflu®，最早于2007年被欧洲药品管理局（EMA）获批上市；2012年被美国食品药品管理局（FDA）获批上市，商品名为Flucelvax®，目前其生产权属于Seqirus公司。 为获得高产量生产，基于细胞培养的疫苗生产需建立接种菌株，或直接以世界卫生组织筛选的候选疫苗病毒进行生产。基于细胞培养的疫苗生产过程中，通常直接将病毒加入培养基，将接种过病毒的细胞进行培养，一段时间后病毒达到足够多的数量，结束生产，然后根据疫苗制剂和类型选择合适的下游工艺。在流感疫苗生产中，最常用的细胞系是犬肾细胞系（MDCK）。近期研究表明，人细胞系如人胚胎视网膜细胞系（PER.C6）和人胚胎肾细胞系（HEK-293）也可用于流感病毒的生产。由于细胞培养系统在生物反应器中进行，需要更少的人力，环境更为可控且无菌，因此相比基于鸡蛋的疫苗生产在质量标准方面具有优势，尤其是细胞培养系统大幅减少了生产面积，因此是首先方案。一项研究表明，为生产一定量的疫苗，细胞培养系统需1,000 L的搅拌釜生物反应器（STR）或12,000个摇瓶，而鸡蛋生产系统需30,800个鸡蛋。 重组表达系统是一种新的疫苗生产方法，Flu Blok®于2013年获FDA批准上市，是最早且唯一获批的一款重组流感疫苗。Flu Blok®的生产基于昆虫细胞系Sf9（绿腹夜蛾细胞衍生细胞系），将携带HA基因的杆状病毒转染Sf9细胞，将重组细胞株在生物反应器中培养，然后纯化得到HA（图6）。虽然重组产品的生产通常选择大肠杆菌等更容易和更廉价的表达平台，但流感病毒的生产需要真核表达平台，以合成具有正确抗原结构的病毒蛋白。 5.5 流感疫苗生产用细胞培养生物反应器的类型和案例研究 使用鸡胚生产疫苗存在严重的问题，例如筛选SPF鸡蛋的困难、工艺繁琐，以及易感人群的过敏反应。另一方面，由于在生物反应器中进行，细胞培养系统比鸡蛋生产系统在质量标准化方面具体优势，人力需求更低，可提供更可控的无菌环境。同时节省生产时间和生产成本，这也是疫苗生产的关键指标。对于传统的基于细胞培养的流感疫苗生产及其他基于细胞培养的疫苗生产研究，使用不同类型的生物反应器，包括STR、波浪式生物反应器、轨道振荡生物反应器、一次性生物反应器，一次性反应器已发展为一种创新的(后接下页) 表3 基于小规模生物反应器生产不同流感病毒的文献回顾 STR：搅拌罐式生物反应器；ATF：交替切向流，TFF：切向流过滤；MDCK：犬肾细胞；Vero：非洲绿猴肾上皮细胞；AGE1.CR.pIX：改良鸭视网膜细胞；MDCK.SUS2：用于悬浮生长的改良MDCK细胞；PBG.PK2.1：猪肾细胞；CAP：人羊膜细胞；DuckCelt-T17：鸭胚胎细胞来源；HEK-293：人胚肽肾细胞；PER.C6：人胚胎视网膜细胞；TCID50: 50%组织细胞感染剂量；PFU：噬菌斑形成单位。 5.5.1. STR（Stirred tank bioreactor搅拌罐式生物反应器） MDCK(Madin-Darby canine kidney cells)细胞是S.H.MADIN于1958年9月建成，来源于马丁·达比犬肾细胞，该肾脏细胞原代培养时其形态类Chemical book<化学书名称>似于成纤维细胞，经过胰蛋白酶和EDTA混合消化液的连续6次消化法纯化而上皮样细胞，每次纯化间隔时间为7D；Vero细胞系是从非洲绿猴的肾脏上皮细胞中分离培养出来的。这个细胞系由日本千叶大学的Yasumura 和 Kawakita于1962年3月27日扩增出来。该细胞系取“Verda Reno”（世界语意为‘绿色的肾脏’）的简写而命名为“Vero”。非洲绿猴肾细胞(Vero细胞）是非洲绿猴肾细胞，是一种异倍体细胞，经猕猴肾细胞培养衍化后产生的，和著名的Hela赫尔细胞系、犬肾细胞(MDCK细胞)一样是常用的细胞系)。 细胞培养操作在具有明确流体动力学参数的各种STR中进行；这些生物反应器也可用于工业规模。在该系统中，应用了各种研究和修改，可以保持低剪切力并提高氧转移速率，以在大范围内保持最佳培养条件。如果我们看看STR为生产流感疫苗而进行的研究；在Genzel等人的一项研究中，对T形烧瓶、圆筒瓶和不同实验室规模的生物反应器（搅拌罐和波浪的生物反应器）中粘附的MDCK和Vero细胞产生流感病毒进行了直接比较。通过用MDCK和Vero细胞感染A/Wisconsin/67/2005 HGR（H3N2）病毒株，以分批模式和5L STR进行生产。作为这种生产的结果，MDCK细胞显示10000个病毒粒子/细胞，Vero细胞显示4976个病毒粒子-细胞病毒生产效率。结果表明，MDCK细胞比Vero细胞更能生产流感病毒。MDCK。使用工作体积为1L的微载体系统培养的SUS2悬浮细胞感染流感毒株B/Malaysia/2506/2004，在生产结束时建立了2.75 log HA单位/100μL滴度的高病毒浓度。在本研究中，发现MDCK细胞系是流感病毒产生的优秀模型细胞系。 Gränicher等人进行了研究，以确定源自永生猪肾细胞的PBG.PK2.1细胞系是否可以成为700 mL工作体积生产流感疫苗的新候选细胞系，使用各种生产模式（分批、补料、灌注）和a/PR/8/34病毒株。获得的结果达到了3.93 log HA单位/100μL的最大HA滴度，细胞存活率为95%。他们在分批、补料和灌注系统中分别以5375个病毒粒子/细胞、5006个病毒粒子／细胞和3929个病毒粒子的浓度产生了病毒。对表达的病毒HA抗原的糖基化模式与MDCK和Vero细胞系中产生的糖基性模式进行了比较，发现存在显著差异。最终，他们证明PBG.PK2.1细胞可能是开发下一代流感病毒疫苗的一个好选择。在另一项有希望的研究中，一种源自人羊膜细胞的新开发的CAP细胞系在STR中用a/PR/8/34（CAP适应型）病毒株在1L工作体积和批量生产模式下培养，以其在流感病毒生产中的潜力。获得的结果导致HA滴度高达3.2 log HA单位/100μ。他们表明，CAP细胞可以为几种流感毒株产生高病毒产量，并且可以提供符合工业标准的特征良好的人类细胞系，作为流感病毒疫苗生产的替代品。 另一项研究是通过比较流感疫苗生产中粘附和悬浮适应性MDCK细胞的生产效率进行的。在此背景下，粘附的MDCK细胞适应悬浮培养，并将其生产效率与MDCK进行比较。SUS2细胞系。生产研究采用1L工作体积和分批模式STR进行。结果是MDCK。SUS2悬浮细胞和MDCK粘附细胞显示出相似的HA滴度，分别为2.94和3.15 log HA单位/100μL，TCID50分别为1×109和2.37×109病毒粒子/mL。 悬浮DuckCelt-T17细胞系（由Transgene公司开发的一种新的禽细胞系，由具有鸭端粒酶逆转录酶组成性表达的原代胚胎鸭细胞生产）通过与a/California/07/2009（H1N1）病毒株在400 mL工作体积中培养并批量生产，获得了5.7×109病毒粒/mL的病毒滴度。根据研究结果，DuckCelt-T17细胞系表明，流感病毒，特别是禽病毒株的工业生产是一种合适的替代模型。HEK293SF细胞最近被用于有效地制造流感病毒，提供了有记录以来最高的HA和传染性病毒颗粒滴度。在一项研究中，用批培养模式评估了灌注培养模式，以提高高细胞密度下的病毒滴度。从这个意义上讲，用A/PR/8/34（H1N1）病毒株在3L工作体积中培养的HEK-293细胞在分批模式下达到5.3×1010 TCID50单位/mL的滴度，在灌流模式下达到3.3×1011 TCID50单元/mL。根据这些发现，HEK293 SF细胞是高通量流感病毒产生的良好平台。 在Wu等人的另一项研究中，比较了间歇模式下STR系统和灌流模式下ATF/STR系统中A/PR/8/34（H1N1）感染的MDCK细胞的生产效率，在ATF/STR系统中获得了11690个病毒粒子/细胞的病毒滴度。此外，在Coronel等人进行的一项研究中，AGE1.CR.pIX细胞用于生产甲型流感病毒。为此，使用带有倾斜沉降器的STR系统，该系统以灌流模式运行。本研究的结果是获得3474个病毒粒子/细胞。此外，还有其他利用STR高效生产流感病毒的有前景的研究。在这些研究中，不同的细胞系和不同的流感病毒（包括禽流感病毒）用于病毒生产。 5.5.2.波浪生物反应器 在过去几年中，用于培养和培养基制备的一次性生物处理系统在动物细胞生物处理工程方面取得了迅速的进展。波浪生物反应器的最大工作容积为500升，在各种应用中都有很高的需求，从植物细胞到感染杆状病毒的昆虫细胞。当在一次性细胞培养袋中进行培养时，这允许更快的反应器准备，同时消除了生物反应器系统的投资支出。为了混合培养物，可以以不同的角度和速度摇动微载体上带有悬浮细胞或粘附细胞的细胞袋。顶空通风提供氧气输送。对于不同的制造工艺，不同的细胞袋现在有不同的尺寸和材料（例如，分批、补料分批、灌注等）。这些柔性袋中的传感器需要使用特定的细胞袋，这些细胞袋现在可供使用，允许更简单的pH和pO2控制以及灌注培养。如果我们看一下用波浪生物反应器进行的研究，在Genzel等人的一项研究中，MDCK和Vero细胞在分批模式和无血清培养基中，在2L的工作体积中感染a/PR/8/34（H1N1）病毒株。MDCK细胞的病毒滴度为33255个病毒粒子/细胞，Vero细胞为3990个病毒粒子／细胞。将这些结果与STR中的产量进行比较，发现了3倍的滴度差异，尤其是在MDCK细胞中。波浪生物反应器中的A/PR/8/34感染诱导了活力的快速下降和HA的早期增加，在细胞感染后48小时，该菌株的最大HA值为2.90。将波浪生物反应器与STR进行比较，结果表明波浪生物反应每个细胞产生7000个病毒颗粒，而STR每个细胞产生5000个病毒颗粒。考虑到这些结果，可以看出波浪生物反应器是流感疫苗生产中的一个重要的模型生物反应器。 5.5.3.轨道振动生物反应器（摇床） 灌流培养比允许高细胞浓度（107-108个细胞/mL）和体积输出的其他生长系统更有效和适应性更强。此外，在灌流培养中，可以通过降低产品异质性或限制生长抑制剂和代谢废物的积累来提高产品质量。旋转过滤器、切向流过滤（TFF）或替代切向流过滤器（ATF）用于病毒疫苗生产的实验室规模生物反应器的大多数灌流研究。在为此目的进行的一项研究中，在3种不同的生物反应器系统中培养了感染a/PR/8/34（H1N1）的AGE1.CR.pIX细胞，并研究了这些系统对效率的影响。在获得的结果中；虽然在轨道振动生物反应器中以分批模式获得1286个病毒粒子/细胞，但在具有ATF和TFF的轨道振动生物生物反应器（摇床）系统中，以灌流模式分别获得3059个病毒粒子／细胞和3487个病毒粒子/m细胞的病毒滴度。 5.5.4.一次性固定床生物反应器 一次性生物反应器的初始成本更低，操作更容易，周转时间更短，清洁验证需求更少。台湾Cesco生物工程公司最近创造了两种新型生物反应器：Belloc ell（实验室规模）和TideCell002（工业规模）。Belloc ell生物反应器已成功地用于培养哺乳动物细胞，以获得HDV（乙型肝炎病毒）样颗粒、日本脑炎病毒和昆虫细胞，以合成杆状病毒。当我们研究这些研究时，生物反应器在研究中表现出了高效的特性，它提供了收集具有以下特征的细胞和组分的能力，例如，由于其表面积大，生物量高，移动环境液体而不会因低剪切应力而产生气泡，并且在生产前可以随时使用和消毒。 一项研究使用了在MDCK和Vero细胞中培养的H5N1分支II和H7N9候选疫苗病毒。BelloCellA®固定床生物反应器中的MDCK细胞；获得了RG6（源自A/ Anhui /01/2005（H5N1））、RG30（源自A/ Hubei /1/2010（H5N2））、RG268（源自A/ Anhui /01/2013（H7N9））和H5N1分支II（源自A/Anhui/01/2005的RG6M13C4（H5N1））病毒株，其滴度分别为1519 TCID50单位病毒粒子/细胞、2 TCID50单元病毒粒子/电池、4 TCID50单价病毒粒子/电路和12 TCID50单病毒粒子/芯片。在BelloCellP®固定床生物反应器中，将MDCK细胞感染H5N1分支II（RG6M13C4，来源于A/Anhui/01/2005（H5N1））病毒株，并获得33 TCID50单位病毒/细胞病毒滴度。在TideCell002®固定床生物反应器中，MDCK细胞被RG268（源自A/ Anhui /01/2013（H7N9））和RG6（源自A/ Anhui /01/2005（H5N1））感染，分别获得51和16个TCID50单位病毒/细胞滴度。BelloCell是一种新型生物反应器，具有高细胞密度和生产病毒的能力。BelloCell可以很容易地扩展到TideCell系统的大小，同时保持相同的操作条件。这种创新的生物反应器在流感病毒的产生中对粘附细胞起到了很好的作用，这项研究表明了一次性生物反应器如何快速高效地产生疫苗。 5.5.5.高通量反应器 长期以来，HFBR被认为能够产生高浓度的单克隆抗体和重组蛋白。HFBR最近刚刚作为一种新的一次性平台出现，用于生产高滴度甲型流感病毒。许多中空纤维毛细管将生物反应器分隔在这些生物反应器的毛细管内和毛细管外空间中。细胞经常在毛细血管外培养，在那里它们可以达到极高的细胞浓度。在一项研究中，研究MDCK细胞和MDCK细胞的病毒产生活性。在HFBR中以再循环模式对SUS2细胞进行比较，根据获得的结果，SUS2细胞产生19138个病毒粒子/细胞滴度，而MDCK则提供8110个病毒粒子/细胞病毒滴度。允许悬浮培养物在该系统中生长，表明它们是最有效的。 6.结论 流感是一种高度传染性的呼吸道疾病，流感病例全年持续。特别是，季节性流感病例通常在10月至3月下旬或4月初达到最高点。世界各地的许多人一生中至少患过一次流感。此外，许多人在几周内完全从流感中康复。然而，尤其是在老年人、幼儿、孕妇和慢性病患者中，风险很大。在这些人中，流感感染可能导致住院甚至死亡。世界各地的科学研究表明，接种疫苗是预防流感最有效的策略。因此，建议高危人群应该接种季节性流感疫苗。 目前生产的所有流感疫苗的靶向抗原性病毒部分是HA（hem-agglutination，红血球凝聚）。多年来，这种抗原一直是常规疫苗生产的目标。因此，在常规疫苗中，生产仍基于HA。疫苗生产是通过使用基于鸡蛋的、基于细胞培养的和重组表达方法进行的。基于卵（鸡蛋）的方法生产的疫苗有主要缺点，包括很难找到SPF卵（鸡蛋），以及易感人群可能出现不良过敏反应。与基于鸡蛋的生产相比，基于细胞培养的方法可以提供。由于生产是在具有更可控环境的生物反应器中进行的，因此生产更标准。此外，在基于细胞培养的方法中，疫苗生产需要更少的劳动力和处理时间。因此，使用这种方法可以减少疫苗生产时间和总体成本。使用基于细胞培养的生产生物反应器，流感疫苗生产中最常用的生物反应器类型为STR、Wave、摇床、一次性固定床和HFBRs。 获得许可并可在商业上获得的流感疫苗类型包括灭活疫苗、减毒活疫苗和重组疫苗。这些是通过适当的生产工艺生产的，如上所述，根据其类型。尽管目前的流感疫苗提供了良好的免疫力，但它们也有缺点。这些都是每年病毒毒株更新的必要性、由于抗原错配导致的低保护性、仅针对某些病毒亚型的保护性、常规生产系统的缺陷、难以开发足够的适应性细胞免疫反应以及短期保护性。因此，正在大力开发更好的流感疫苗。为此，正在实施和制定不同的战略，重点是提高保护的效力和持续时间。在这方面，各种研究尝试了非常不同的方法。虽然这些研究包括在目前生产的疫苗中添加佐剂等更传统的方法，但也在尝试新的策略。这些新策略主要是病毒表面抗原（NA、M2和HA）和病毒内在抗原（NP和M1）靶向方法。尽管HA是诱导免疫反应的最理想靶点，但这种抗原结构不断变化的性质使这种情况复杂化。因此，在基于HA的研究中，试图通过聚焦HA的保守区域来诱导免疫系统。由于这些不同的策略，新的候选疫苗已经问世。这些新的候选疫苗是VLP、基于核酸的疫苗、病毒载体疫苗、基于肽或蛋白质的疫苗以及基于纳米颗粒的疫苗。尽管其中大多数仍处于实验阶段，但其临床前结果非常有希望。然而，这些新的候选疫苗中的一些已经开始临床试验，真正接近商业阶段的很少。 基本上，目前所有的方法都有一个共同点，这就是开发一种疫苗，可以提供广泛和持久的保护，防止流感病毒感染。因此，创建一种长期预防季节性、人畜共患（如禽流感病毒）和大流行性流感病毒感染的通用流感病毒疫苗是所有这些努力的目标。 原文来源：Influenza Vaccine: An Engineering Vision from Virological Importance to Production 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

导读：鼻咽癌（NPC）是一种发生在鼻咽部的恶性肿瘤，表现出地理分布特征，最高发病率出现在中国南方和东南亚地区。10月24日，中山大学研究学者在期刊《Cell Death & Disease》上在线发表题为“DNAJA4 suppresses epithelial-mesenchymal transition and metastasis in nasopharyngeal carcinoma via PSMD2-mediated MYH9 degradation”的研究论文，研究结果表明，DNAJA4通过与PSMD2相互作用，促进MYH9蛋白通过泛素-蛋白酶体途径的降解。体外实验表明，DNAJA4强烈抑制了鼻咽癌细胞的迁移、侵袭和上皮-间质转化（EMT），而MYH9的过表达可以挽救这种抑制作用。在体内实验中，DNAJA4也强烈抑制了鼻咽癌细胞的腹股沟淋巴结转移和肺转移。我们的研究揭示了DNAJA4-PSMD2-MYH9轴在调控鼻咽癌细胞侵袭和转移中的新机制，并为鼻咽癌提供了新的潜在靶点。https://www.nature.com/articles/s41419-023-06225-w研究背景 01 鼻咽癌（NPC）是一种发生在鼻咽部的恶性肿瘤，表现出地理分布特征，最高发病率出现在中国南方和东南亚地区。这种独特的地理分布归因于遗传和环境因素的双重作用。由于鼻咽癌（NPC）具有独特的解剖位置和高放射敏感性，放疗是治疗NPC患者的主要方法。将化疗与放疗联合应用已经极大地提高了NPC患者的生存率；然而，远处转移仍然是治疗失败的主要原因。因此，探索鼻咽癌（NPC）转移的调控机制对于开发新的治疗策略至关重要。热休克蛋白（HSPs）是一类在高温、感染或缺氧条件下被广泛表达和产生的热应激蛋白，它们可以增强细胞对各种刺激的应急反应能力。此外，热休克蛋白在调控癌细胞的存活、侵袭性和扩散方面发挥着重要作用，从而促进肿瘤的发生和进展。DNAJA4（DNAJ热休克蛋白家族成员A4）是HSP40/DNAJ家族的一员，参与多种生物过程。例如，DNAJA4可以在角质形成细胞HaCaT中对高温刺激作出反应时调控F-actin及相关通路蛋白的表达。DNAJA4缺乏促进了TNF-α和IL-1B的转录，从而激活NF-κB信号通路，在高温刺激期间抑制角质形成细胞的增殖和存活。然而，DNAJA4在鼻咽癌中的功能和机制尚不清楚。研究发现 02 在研究中，我们揭示了DNAJA4的启动子在NPC组织和细胞中发生了高甲基化，并且其表达水平下调。DNAJA4的过表达在体外显著抑制了鼻咽癌（NPC）细胞的迁移、侵袭和上皮间质转化（EMT），并且在体内显著抑制了腹股沟淋巴结转移和肺转移的定植。然而，它并不影响NPC细胞的存活能力和增殖能力。从机制上讲，DNAJA4通过招募PSMD2，促进MYH9蛋白通过泛素-蛋白酶体途径降解。此外，在鼻咽癌（NPC）细胞中过表达MYH9可以逆转DNAJA4对NPC细胞迁移、侵袭和上皮间质转化（EMT）的抑制作用。临床上，DNAJA4水平低下预示着NPC患者预后不良和远处转移的概率增加。综上所述，DNAJA4在NPC的侵袭和转移中起着关键作用，而DNAJA4-PSMD2-MYH9轴可能包含着NPC治疗的潜在靶点。DNAJA4在体内抑制鼻咽癌细胞侵袭和转移 03 为了确定DNAJA4是否促进鼻咽癌细胞的转移，我们建立了腹股沟淋巴结转移和肺部转移结节模型。结果显示，DNAJA4过表达组的腹股沟淋巴结大小和体积均比对照组小。足底肿瘤的H&E染色显示，DNAJA4过表达组的肿瘤侵袭性较小，不像对照组那样侵入皮肤或肌肉。腹股沟淋巴结中泛细胞角蛋白的IHC染色结果也表明，DNAJA4过表达组的转移灶数量明显少于对照组。此外，肺组织的H&E染色显示，DNAJA4过表达组肺表面和切片上的结节数量和大小均比对照组少。IHC实验结果显示，DNAJA4过表达肿瘤中MYH9表达下调，而PSMD2表达没有明显变化。这些转移模型的观察结果验证了DNAJA4在体内抑制鼻咽癌细胞转移的作用。研究结果 04 综上所述，研究结果表明，DNAJA4通过与PSMD2相互作用，促进MYH9蛋白通过泛素-蛋白酶体途径的降解。体外实验表明，DNAJA4强烈抑制了鼻咽癌细胞的迁移、侵袭和上皮-间质转化（EMT），而MYH9的过表达可以挽救这种抑制作用。在体内实验中，DNAJA4也强烈抑制了鼻咽癌细胞的腹股沟淋巴结转移和肺转移。我们的研究揭示了DNAJA4-PSMD2-MYH9轴在调控鼻咽癌细胞侵袭和转移中的新机制，并为鼻咽癌提供了新的潜在靶点。近期直播推荐参考资料：https://www.nature.com/articles/s41419-023-06225-w识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入生物制品微信群！请注明：姓名+研究方向！版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。