HIV-1 Vpu

摘要：慢病毒载体（LVs）是将感兴趣的基因传递到哺乳动物细胞的强大工具，目前常用于细胞和基因治疗领域，用于治疗单基因疾病和如嵌合抗原T细胞（CAR-T）疗法等的过继疗法。本文全面回顾了LV生产中采用的各个生物加工操作。我们强调了包膜蛋白在载体设计中的作用以及它们对慢病毒载体生物加工的影响。对这些操作现状的概述提供了生物加工发现和改进的机会，重点强调了在开发和临床生产期间对LV进行最佳和可扩展处理的考虑因素。描述了LV产生的上游培养，并对不同的转染方法以及悬浮和贴壁生产细胞培养的各种生物反应器进行了比较。检查了LV的纯化，评估了小规模和大规模生产要求的不同下游工艺操作序列。对于可扩展操作，重点是层析纯化的发展，以及对切向流过滤应用的深入检查。还介绍了载体定量和特性分析的摘要。最后，讨论了LV生产的整个生物加工评估，以从不同工艺选项的潜在相互作用的更广泛理解中受益。本文旨在帮助从健壮和可扩展的过程中实现高质量、高浓度的慢病毒载体。 1.引言 慢病毒载体（LV）通常用于细胞和基因疗法中，用于将感兴趣的转基因转移到受体细胞中以获得治疗效益。作为载体，它们能够转导分裂和非分裂细胞，如神经元、造血干细胞和免疫系统细胞，特别是T细胞，传递高达11千碱基（kb）大小的转基因。LV是治疗单基因疾病和需要基因传递的过继细胞疗法试验的主要载体兴趣点，占英国体外先进治疗药品（ATMP）的57%。在美国、中国、欧盟和加拿大有100多项正在进行的临床试验正在使用慢病毒载体，用于体外细胞修饰或体内疗法。总体而言，由于其在临床试验中的普及和最近CAR-T疗法Kymriah和Yescarta的市场批准，预计到2026年LV生产市场将增长至8亿美元。随着对慢病毒载体疗法的持续兴趣，对高效的LV生物加工的需求也在增长。在扩大规模和生产过程中的问题可能会推迟慢病毒载体在临床和商业用途中的采用。当今遇到的一些生物加工挑战包括在上游生产中无法产生足够的滴度，以及在下游处理过程中普遍的低回收率，导致许多公司无法提供足够的能力以满足大规模需求。尽管目前存在开发适量载体的问题，但病毒载体及其生物加工的应用是一项有价值的企业。考虑到只需要改变转基因就可以转向另一个产品，通用生产过程的兴起是可能的。这可以是包装细胞系的形式，其中细胞恒定地表达载体组分和所选的包膜蛋白，等待合适的转移卡带进行稳定或瞬时表达。对于已建立的平台，生产者细胞系可能是有价值的，其中细胞恒定地表达与载体生成相关的所有组分。从理论上讲，这些细胞系具有有利的商业属性，因为它们不需要所需的质粒DNA和转染步骤。一旦设计了优化的上游和下游，开发一个平台以快速交换和验证转基因的可行性很高。加强和连续的处理，如在重组蛋白生产中看到的那样，可能有助于成本效益高的载体生产。 2.慢病毒载体的生物加工 慢病毒载体因其生理和物理化学特性而独特。LV通常基于HIV-1，并共享其许多特性，如80-120纳米直径的球形形状，衣壳核心和功能性酶，以及来自宿主细胞膜的包膜。LV颗粒的固有复杂性和敏感性在加工过程中带来了挑战，例如颗粒热稳定性（例如，在37°C下半衰期在7-8小时范围内），对冻融周期的敏感性，需要快速处理，盐，pH，剪切和缓冲液渗透压。在这里，由于未包装的载体或酶功能丧失或包膜蛋白损坏/缺失导致转导能力的丧失，是有缺陷的颗粒可以与功能性载体共纯化，这在减少过程能力方面是有问题的。此外，生产细胞类型及其在生产期间的活性已涉及载体稳定性，因此必须保持细胞健康以获得高产量。从野生型病毒发展慢病毒载体需要评估病毒基因组并选择病毒组分以确保安全和有效的基因转移。HIV基因组组织成转元素，编码功能性、结构性和辅助性蛋白，如Gag多肽、包膜蛋白和功能性酶，而非编码顺式元素如长末端重复序列（LTR）协助将病毒RNA基因组转录和包装成病毒颗粒，并指示逆转录和整合到受体细胞的区域。因此，慢病毒载体的最初发展已经看到了HIV-1的顺式和反式作用元素的分离到单独的质粒上，除了HIV-1包膜，它被伪型化为替代包膜蛋白，如小鼠白血病病毒（MLV）的全嗜性包膜蛋白或VSV-G在第三个质粒上。随后的几代人通过去除不必要的病毒序列，如辅助蛋白vif、vpr、vpu和nef，以提高滴度和安全性。在现代第三代包装系统中，tat被移除，一个组成型启动子取代了转移质粒5' LTR中的U3，以允许在没有Tat的情况下进行转录，以提高生物安全性。为了进一步保持安全性并维持载体滴度，rev在另一个质粒上提供。因此，当前的做法特点是3-4个质粒，其中包含感兴趣转基因的自我灭活转移质粒，由HIV-1 LTRs和rev反应元件所环绕。这与包含基本转元素Gag-P的包装质粒共同转染，第三个包含包膜蛋白的包膜质粒，以及第四个如果不在其他地方包含的话，用于HIV-1 rev。LV处理的要求因应用而异，但高滴度和纯度是最重要的。大多数载体生产中的杂质将是残留DNA、转染试剂、宿主细胞蛋白和培养基成分（见表1）。对于细胞疗法，最终产品是转导的细胞，因此载体的纯度配置文件比体内疗法的纯度配置文件不那么严格，因为产品质量保证/质量控制（QA/QC）要求在细胞阶段。对于体内疗法，要求将与载体本身有关。因此，对于体内疗法过程，关键质量属性将侧重于质量和浓度，而体外则侧重于质量和产量。 2.1.伪型包膜蛋白 慢病毒（LV）通常进行伪型化，即将载体的包膜蛋白替换为另一种病毒的包膜蛋白（见表2），实际上是用来自其他病毒的蛋白质包裹病毒颗粒，这些蛋白质为载体提供了不同的特性，影响其嗜性以及预期的细胞靶标，也可能影响生物加工过程中的成功。当转导细胞时，包膜蛋白必须与受体细胞表面的受体接触并结合。包膜蛋白的选择、其在载体表面的频率以及受体的可用性对于有效转导至关重要，同时限制了非靶目标的相互作用。在LV生物加工中，包膜蛋白必须在生产细胞中适当表达并整合到载体中。由于这些蛋白质属于载体表面，它们直接与大量介质相互作用，因此受到加工过程中应用的物理化学条件的影响，如剪切力、盐浓度和pH值。因此，包膜蛋白的选择对于载体设计很重要，不仅影响载体的功能和预期靶标，还影响载体在加工过程中的初始表达、对生产细胞的影响以及在下游加工过程中的单元操作的影响。许多病毒包膜蛋白可以伪型到LV颗粒上。然而，最常用的伪型包膜蛋白，并且被广泛认为是黄金标准，是来自印第安纳囊泡性口炎病毒的VSV-G糖蛋白。这种蛋白质通常被使用，部分原因是其广泛的嗜性，与大多数细胞类型中普遍存在的低密度脂蛋白受体（LDL-R）相互作用。然而，从载体设计的角度来看，VSV-G的缺点是表现出细胞毒性，导致在高表达时LV生产细胞系中的细胞不稳定，并限制了其在瞬时转染方式中的应用。尽管已经展示了VSV-G的稳定表达，但可能是由于载体超感染或表达减少导致结果不佳。尽管如中所述，VSV-G的诱导性启动子可能避免由组成型表达引起的细胞毒性，但这在加工过程中可能会由于诱导剂的添加或去除而出现问题（见第3.2节）。VSV-G LV通常应用于体外疗法，因为它们会被人血清中的补体灭活。在体内，对VSV-G的额外免疫反应是显而易见的，这可以通过适应性免疫反应抑制随后的LV给药。此外，尽管LDL-R普遍存在，但临床上有价值的静止淋巴细胞对CAR-T疗法的受体表达特别低，因此转导效率低下，除非事先激活。然而，由于VSV-G提供的高功能性滴度，其应用广泛，是常用的包膜蛋白。 包膜蛋白受到需要在下游加工中考虑的物理化学条件的影响。带有VSV-G包膜的LV已观察到在pH偏离pH 7时灭活，并且在用1M NaCl处理时，1小时内失去50%的功能滴度。对载体加工的影响在超速离心中尤为明显，其中带有包膜蛋白VSV-G的LV在超速离心中的表现优于带有流感包膜蛋白的LV或HIV-1包膜蛋白超过VSV-G，并且似乎对剪切有抵抗力。在加工过程中需要考虑包膜蛋白的稳健性，并解释载体包膜稳定性的差异。 已经研究并应用了其他包膜蛋白进行LV伪型化。来自与VSV相同的囊泡病毒科的糖蛋白Cocal-G与VSV-G共享71.5%的氨基酸序列，因此具有类似的特性。通过Cocal-G包膜的LV的转导已被可溶性LDL-R抑制，类似于VSV-G，因此可能通过相同的LDL-R或类似受体感染。与VSV-G不同，Cocal-G不会被人血清灭活，并且可以恒定表达，允许在载体生产细胞系中稳定表达的潜力，尽管这会导致超感染和细胞不稳定。已经检查了其他囊泡病毒科糖蛋白用于稳定生产细胞系的生成，如来自PIRY、Chandipura和VSV-New Jersey的那些，它们显示出105到106 TU/mL的滴度，在浓缩和冻融过程中稳健。此外，已经应用了病毒包膜蛋白RD114进行载体生产。来自猫内源性逆转录病毒的RD114包膜显示出较少的细胞毒性，不会被补体灭活，并允许在稳定生产细胞系中使用。这些包膜蛋白能够转导CD34+细胞，并在超速离心中显示出稳健性，50-70%的产量与100-200倍的浓缩。RD114已经进一步修改，通过在HIV基质/衣壳蛋白裂解位点的R肽裂解位点插入HIV基质/衣壳裂解序列，从而产生了RDPro包膜蛋白，与RD114相比，在瞬时生产中显示出更高数量级的滴度。这些RD114衍生的包膜蛋白进一步防止了超感染的作用，即产生的载体被阻止转导它起源的细胞系，并已在CAR-T疗法的淋巴细胞转导和CD34+前体细胞中找到应用。其他包膜，如仙台，需要胰蛋白酶处理来通过蛋白裂解激活包膜，尽管需要考虑在加工过程中补充额外的单元操作。此外，激活的仙台包膜在超速离心中表现较差，与未裂解包膜的50%恢复率相比，恢复率降至20%。 随着病毒载体的伪型化，理论上，任何在细胞表面表达的病毒组分都可以使用。然而，这些方法依赖于病毒蛋白，这可能会引起安全方面的担忧，并在筛选上增加开发成本。已经应用的一种方法是“即插即用”包膜蛋白，通过二硫键将细胞靶向蛋白共价键合到它们的表面，或者通过生物素化的靶向配体。这样的工作可能会改善载体的可能靶向机制，尽管这可能需要在加工过程中增加额外的单元操作以完全结合靶向组分。 3.慢病毒载体的上游生物加工 上游加工的重点是在批量生产LV的同时，允许有效的下游纯化。有几个重要因素需要管理，这些因素取决于生产模式，无论是通过质粒对细胞进行瞬时转染，还是使用稳定或可诱导的生产细胞系。一个基本因素是细胞的可扩展性扩展、它们的活性以及达到最佳LV生成的合适细胞密度。因此，细胞系的类型，无论是贴壁还是悬浮，用于扩展的生物反应器、具有适当补充的细胞培养基类型以及适用的瞬时转染方法，都是需要考虑的重要因素。 3.1.LV生产的细胞系 需要一个合适的细胞系来以高滴度生产LV颗粒。通常，选择的细胞系是人胚肾细胞293（HEK-293），特别是衍生的293T系。HEK-293T具有SV40 T抗原，这与抑制p53和阻止细胞内先天免疫反应的激活有关，已被证明可以提高LV的滴度。这种后继细胞系比其前身显示出几个优点，特别是更短的倍增时间、更高的转染效率和更高的载体滴度以及适应悬浮培养。培养密集的细胞群体对于高载体滴度非常有益，因为从理论上讲，每个细胞都是LV的产生单元。然而，这需要在整体流程上进行一定程度的优化，因为高细胞密度与较低的细胞活性相关，这将在加工过程中需要去除更多的污染物。这个缺点可能会抵消更多细胞数量带来的滴度优势。 3.2.瞬时、稳定和诱导生产 LV生产的主导模式是瞬时转染细胞，使用各种质粒表达和包装LV。最初开发这种方法是为了最小化复制能力载体的风险，这种方法已经经历了代际发展，以提高产量和安全性。质粒与化学转染剂共转染，通常给出的滴度在非纯化的范围内为10^6到10^7 TU/mL，尽管更大的转基因会给出较低的滴度。尽管如此，用残留的质粒DNA和转染试剂污染饲料是一个问题，需要去除这些。由于转染剂的细胞毒性问题，通常需要在转染后进行培养基交换，这需要额外的设备用于泵和罐混合质粒DNA、转染试剂和培养基，此外还增加了整体培养基消耗。此外，许多因素可以影响转染效率，包括质粒浓度、试剂：DNA比例、细胞密度、孵化时间、混合方案、温度和pH，其中一些在扩大规模时具有挑战性。因此，载体滴度的批次间变异性明显。临床级质粒和转染试剂的成本为生产运行增加了大量费用，通常至少使用每百万细胞1µg质粒DNA。有多种转染试剂可用于LV生产，选择哪一种将极大地影响生产运行的处理步骤和货物成本。磷酸钙（CaPi）是一种经济的转染试剂，通常在实验室或小规模使用，涉及在混合氯化钙和DNA与HEPES缓冲盐水时形成细小的磷酸钙和DNA沉淀物。沉淀物沉降并被细胞内吞。然而，这种方法由于混合两个缓冲液以产生一致的沉淀物而难以扩大规模；需要优化的变量，如组分浓度、温度和聚集时间。由于pH的微小变化，该过程进一步复杂化，这会对转染效率产生负面影响。此外，CaPi转染可能会在没有血清或白蛋白保护作用的细胞培养中引起细胞毒性。阳离子脂质体，如脂质体，也已被使用。它们形成包裹DNA的脂质体，通过与DNA的负电荷复合。脂质体与细胞膜融合，释放其内容物进行表达。尽管能够转染许多细胞类型，但脂质体具有细胞毒性，可以降低活性，因此在应用后需要进行培养基交换，因此通常只在开发规模使用。聚乙烯亚胺（PEI）更适合可扩展的转染，通过形成细胞内吞的与DNA的多聚体，提供了一个高效且成本效益的选择。多聚体的形成和降解是时间的函数，因此有一个最佳的使用窗口。尽管如此，PEI被认为比CaPi更简单，不需要严格控制以获得最佳的转染效果，同时使用的质粒DNA也更少。重组杆状病毒也被用作转染试剂来转移病毒组分，尽管这可能会导致在下游加工（DSP）中分离杆状病毒和慢病毒载体的更大成本。无论采用何种方法，载体生产通常在转染后48小时内达到峰值，从72小时开始下降，为收获提供了有限的时间窗口。理想情况下，载体群体的质量应该是相似的，尽管由于每个细胞规模上的转染效率不同及其对活性的影响，载体群体通常是异质的。瞬时转染的替代方案可以在稳定生产或包装细胞系中找到（见表3）。在这些细胞系中，病毒组分在细胞内恒定表达，不需要额外的质粒和转染试剂，除了包装外，只需要转移质粒。这简化了上游培养，并避免了来自残留质粒的额外成本和污染物负荷。此外，稳定细胞系生产者可能会产生更高质量的颗粒，由于生产的克隆来源，允许产生近乎同源的颗粒。此外，这种收获往往更清洁，可能由于存在的基于包膜的囊泡较少，以及缺乏质粒和转染试剂负荷。这样的稳定细胞系有潜力提供成本效益、可扩展和可复制的载体运行，每批之间的变异性较小，因为每个细胞将保持一致的生产能力。 高性能的稳定生产者通过基因组标记、筛选活性位点并用慢病毒组分替换而创建。例如WinPac和LentiPro26这样的细胞系已经被开发出来，它们提供了每天每毫升10^6 TU的滴度范围，前者利用逆转录病毒标记和重组酶介导的盒交换来高表达Gag-Pol，后者应用了活性较低的突变病毒蛋白酶来维持细胞活性并提高滴度。这些稳定的生产细胞系可能很难开发，需要分离和评估单个克隆的组分表达，这些需要在筛选抗生素中培养以维持滴度。 为了简化这一过程，已经开发了努力，例如使用细菌人工染色体，它将所有载体组分结合在一个单一的构建上，或者开发高通量筛选方法，例如将编码部分GFP片段的单个分离生产细胞与表达互补GFP片段的细胞共同培养，并监测GFP的重组以识别高产者。然而，关键地，稳定生产细胞提供的滴度低于瞬时引导方法，因此它们的采用是个问题。这特别是由于病毒蛋白表达可能对细胞产生的细胞毒性效应，例如蛋白酶，它与裂解促凋亡蛋白有关，以及包膜蛋白选择的限制。例如，VSV-G，一种高效的包膜蛋白，很难恒定表达。潜在的细胞毒性转基因也对长期在稳定生产者中表达是个问题。这个问题已经通过一种细菌色氨酸RNA结合衰减蛋白得到了解决，它通过结合在核糖体启动位点的上游来阻断转基因表达，限制了它在生产细胞系中的表达。 通常，生产或包装细胞的最大挑战是在维持高滴度的同时管理细胞毒性或细胞静止效应。虽然这可以通过可诱导系统来减轻，并且已经用LV实现了，但这些方法目前并不完全实用。Tet-on诱导将需要添加四环素，这必须在稍后去除，而tet-off诱导可能需要延长培养时间以达到表达高峰，并且还需要完全更换培养基，这可能是不经济的。在所有可诱导的情况下，也存在“泄漏”表达的风险，即LV的非控制生产是可能的。 尽管如此，随着进一步的开发，稳定生产者的应用将在LV生产中大有裨益。这些改进可以以高通量自动化克隆分离和评估的形式，以及改进的盒设计、包膜选择和细胞系开发。优化LV生产的可能策略是上调抗凋亡基因，下调细胞内感知，并优化蛋白质和脂质生成途径，以有效生产载体。 3.3.用于生产慢病毒载体的上游培养 为了生产高滴度的LV，需要大量的细胞。有各种解决方案来扩展生产细胞的数量（见表4），追求不同规模的贴壁或悬浮细胞。在开发过程中，需要小批量大小的灵活性，通常由贴壁培养主导，主要是因为HEK-293T天生是贴壁的，提供的高细胞密度和易于接触。这通常由培养瓶、培养皿和瓶子来满足。随着规模扩大，需要更大和更一致的批量大小，生产转移到搅拌罐、摇摆波和固定床生物反应器中，多层培养瓶跨越中间规模。就有效的货物成本生产而言，最近的一项研究表明，一次性搅拌罐在悬浮培养可用时最具成本效益，否则固定床比贴壁培养瓶提供更大的节省。许多上游培养容器也已经过渡到一次性使用。这些不仅有助于减少变更时间，还有助于通过减少设备的清洁和灭菌阶段来帮助验证。 3.3.1.贴壁培养 在开发阶段，贴壁培养是理想的，但在规模上受到限制。这里，要么用多个培养瓶进行扩展，要么垂直扩展到多层培养瓶。这些培养瓶提供了一系列的表面积供细胞附着和生长，1-40层CellSTACKS（Corning，636-25,440平方厘米）和1-40层细胞工厂（Nunc，632-25,280平方厘米）通常被使用。此外，HYPERflasks（1720平方厘米）和HYPERStacks（6000-18,000平方厘米）（两者都是Corning）提供了气体透过的塑料用于O2和CO2的大规模转移，因此不需要像生产载体那样大的头空间。这些系统的扩展或扩展在高表面积时变得越来越笨重和难以处理，需要更大的培养箱空间和运输考虑，通常需要额外的设备来协助。随着扩展，手动处理增加，开放操作的污染风险增加，特别是当批次经常汇集进行下游处理时。此外，转染阶段倍增，增加了变量载体生产的机会，并增加了技术人员的工作复杂性。培养瓶和滚瓶中的贴壁培养不允许培养管理，本质上是批量模式，没有内联能力来监测和控制溶解氧、pH值、废物产品和营养补充。 对于贴壁细胞的另一种培养方法是微载体，已经应用于HEK-293和HEK-293T的逆转录病毒载体和LV。这些微载体可以是多孔的或固体的，允许细胞在内部或表面生长。然而，微载体已经与结块和细胞脱落有关。此外，微载体内部可能会发生微环境，其中外表面细胞限制了营养物质和氧气的大规模转移，同时限制了有毒代谢产物、CO2和病毒颗粒的释放，导致LV滴度低。 为了扩展目的，来自贴壁细胞的LV生产通常转移到固定床生物反应器中。作为基于培养瓶或瓶子培养的替代方案，细胞在由高度多孔微纤维载体组成的3D基质上扩展，提供了经济体积下的大量表面积。这种反应器已经应用于逆转录病毒和腺病毒载体。商业化的固定床生物反应器的例子是Pall的iCELLis或Univercells的Scale-X生物反应器，分别提供0.53-500和2.4-600平方米的表面积。这样的生物反应器允许对生产载体的培养参数进行内联监测和控制。内联监测提供了对生物加工环境的更深入了解，并提高了离线的应用程序在硅模型的未来优化中。 此外，Scale-X流程可以作为Univercells的Nevaline的一部分进行加强，提供切向流过滤（TFF）的内联浓缩和模块化下游处理选项，如澄清和色谱。iCELLis已用于在固定灌注速率或针对特定葡萄糖目标的灌注系统中生产瞬时LV，最终在灌注模式下（总体积5.5升）的4平方米填充床上实现超过10^10 TU的滴度。尽管这项工作表明仍需要优化，因为固定床反应器受到细胞分布不良的影响，可能不会最佳地扩展，也不会在更大的压缩下允许有效的转染，最终每平方厘米的生产力低于贴壁培养瓶。在细胞分布更均匀的Scale-X生物反应器中也产生了类似的滴度。iCellis Nano中LV的LV与在cGMP条件下使用10层细胞工厂生产的LV的并排比较也证明了类似的转导效率。尽管如此，这项研究中的iCellis Nano的单一运行相当于30个三重培养瓶，展示了上游规模选项的影响。 3.3.2 悬浮培养 悬浮培养通常应用于各种重组蛋白的生产，因为它们易于规模化、对培养参数的控制以及工业上的广泛熟悉。对于LV生产，HEK-293T培养可以适应悬浮培养，并用于传统的搅拌罐生物反应器和摇袋。悬浮培养为规模化提供了解决方案，最小化了手工处理，允许灌注培养、自动化、内联监测和控制，以及转染试剂的简化应用。然而，必须使细胞适应悬浮培养才能在这些生物反应器中使用。这可能很难完成，而不损失生产力，滴度在10^6 TU/mL范围内及以下。直到最近才有滴度通过在悬浮介质中逐渐适应达到10^8 TU/mL。通常，细胞密度远低于贴壁培养，因此在这些方法中载体自然会被稀释。此外，还需要额外考虑初始澄清，以去除悬浮的细胞。 搅拌罐生物反应器为LV生产提供了最简单的规模化方法。这些单元可以结合开发规模的生产，如在Ambr生物反应器中用于HEK-293T生长优化，到10L Biostat的更大规模，后者的生物反应器据报道可以扩展到10,000 L。此外，Pall Allegro报告了1.1×10^10 TU/L的滴度。搅拌罐生物反应器的规模化遵循典型的规模化参数，如跟随kLa体积传质系数、功率体积（P/V）比率和叶尖速度。由于哺乳动物细胞通常比细菌细胞需要更少的kLa，因此规模化参数倾向于P/V和叶尖速度，以防止对生产者细胞造成剪切损伤。尽管在规模化方面，瞬时转染生产策略的限制是明显的，其中可能需要更换培养基，这在悬浮细胞中更加困难。 摇动生物反应器为生产者细胞的扩展提供了一种方法，使用一次性充气的可处置袋，在平台上轻轻摇动细胞和培养基以促进混合，规模为10-200 L。该方法提供了高气体传质，同时由于缺乏搅拌器，为细胞提供了低剪切环境。这种生物反应器已被用于在临床规模上从稳定生产细胞系生产载体，尽管这次运行在这个例子中使用了Fibra-Cel盘作为生长基质，尽管悬浮细胞在专利文件中有所记录。 3.3.3 灌注培养 灌注培养的选择可以去除细胞废物，因为它们在发展过程中产生，并维持生产细胞的营养水平。载体在培养容器内的停留时间也减少了，这意味着由于时间敏感的损失，存在的非功能性载体较少，从而提高了产量。这种灌注方法在批量运行中允许高达15倍的改进，每升高达10^11累积TU，在固定床反应器中取得了更好的成功。此外，由于载体对温度敏感，灌注可以将载体带到一个较凉爽的环境中，远离对细胞不稳定的较温暖的培养温度。尽管灌注培养需要根据设定的灌注速率消耗大量的培养基，这可能会增加成本，但一些单克隆抗体（mAb）过程表明与补料批次方法相比，有潜在的成本节省。灌注培养理论上可以集成到任何下游流程中，如色谱，用于连续纯化和加强流程。 3.3.4 细胞培养基和补充剂 培养基的选择直接关系到生产者细胞的扩展和活性，以及下游加工的成功，因为培养基负责载体的稳定性，并形成了要处理的初始载体含料。 有一种趋势是去除LV生产的血清。许多LV生产策略使用血清来协助最佳细胞生长和载体本身的稳定性，这似乎从高蛋白溶液中受益，很可能是由于与白蛋白和脂质相关的稳定。补充白蛋白显示了在DSP加工中载体的稳定。然而，大多数使用的血清都是牛源性的，因此牛相关疾病传播和全球短缺的威胁是令人担忧的。虽然重组人白蛋白可能作为替代品，但这将增加生产成本。此外，高蛋白质负荷给下游流程增加了压力，必须去除大部分血清污染物。这样的压力导致了无血清培养基在细胞培养中的使用，并且现在在LV生产中已经很好地建立，产生的滴度与含血清培养基相当；HyCell TransFX、FreeStyle 293和SFM4TransFx-293只是一些商业上可用的培养基的例子。这种无血清表达载体通常涉及在培养中顺序减少血清，直到细胞适应低或零血清浓度。否则，一个常见的上游策略是在含血清的培养基中扩展细胞，然后在载体收获前换成无血清的替代品。 细胞培养的补充与LV滴度的提高有关。添加丁酸钠与提高重组蛋白生产有关，通过抑制组蛋白去乙酰化酶，导致转录因子功能改善，从而增加来自病毒LTRs的RNA副本并提高LV滴度。额外补充胆固醇和脂质与提高滴度有关，很可能是由于稳定了病毒出芽的细胞表面脂质筏。然而，一项使用仙台F/HN包膜蛋白和不同培养基类型的研究发现，额外的补充并没有显著提高产量，但仍然建议较小的累积效应可能是有益的。由于细胞培养基中咖啡因的存在，在转染后产量有所提高，尽管这样的结果尚未复制。此外，有报道称，在收获前将pH降至6可将滴度增加三倍。在这个实验中，使用了VSV-G包膜蛋白，而在pH 6下其感染力可能降低，因此可能减少了超感染的影响。研究还表明，高细胞培养基渗透压与提高逆转录病毒稳定性有关，因为病毒膜中胆固醇与磷脂比率降低，导致稳定性提高。 4.慢病毒载体的下游处理  慢病毒载体（LV）的下游生物加工关注于最大化载体的回收并最小化可能对产品功效或安全性产生负面影响的成分，同时保持经济可行性。虽然最终产品概况取决于载体是体内还是体外应用，以及最终的转导单位数量取决于验证的治疗剂量，但总的来说，生物加工操作必须减少杂质的数量，同时保持病毒效力以确保最终用户的安全。这些杂质可能包括残留DNA（来自宿主细胞和质粒）、宿主细胞蛋白、血清、蛋白多糖以及与过程相关的杂质，如核酸酶和可浸出物。 LVs的完整下游处理由许多单独的单元操作组成，旨在实现载体材料的纯化、浓缩和稳定性。简而言之，一个典型的过程包括连续的纯化步骤，包括去除细胞及其碎片，然后是载体的富集以及去除宿主细胞或血清蛋白、核酸和脂质。载体产品可能在交换到适合稳定性的配方缓冲液之前进一步浓缩，然后最终在储存或应用之前进行无菌过滤（请见第6节对整个生物加工评估）。 4.1. 载体过滤：初始澄清 澄清和无菌过滤过程旨在去除细胞和细胞碎片等大颗粒杂质。澄清通常在过程的早期进行，因此在处理高负载的细胞和细胞碎片以及稀释的LV浓度时，而无菌过滤发生在生物加工的后期阶段，处理较低浓度的细胞或细胞碎片和较高浓度的LV颗粒。用于澄清的初始下游阶段通常是微滤和/或离心。细胞和大部分颗粒可以通过低速离心沉淀并去除。或者，可以使用声波过滤器在收获期间使用声波捕获悬浮细胞并返回到生物反应器。两者都随后通过膜或深度过滤器进行微滤。初始的离心作用是作为预过滤步骤，以防止过滤器过早堵塞。在大规模生产运行中，需要考虑离心机的容量，因为容量考虑。连续离心机的应用，如在单克隆抗体和重组蛋白加工中普遍的盘式堆叠离心机，在LV生产中尚未看到，因为低容量处理（升到几百升）和这些过程的典型批次模式需要与离心机的高资本成本与过滤选项相平衡。 过滤技术在初始澄清中占主导地位，一次性系统提供了简化的清洁和验证。使用级联过滤器，即用逐渐精细的过滤器过滤料液，可以防止最终过滤器过早堵塞，这可能导致由于载体排除和通量减少而导致滴度损失和处理时间延长。过滤器的选择影响澄清步骤的效率。对于膜过滤器，料液通过具有特定孔径的平坦或褶皱的惰性聚合物片，根据膜的绝对保留等级进行穿孔。深度过滤器是一类具有海绵状质地的过滤器，其中颗粒在通常由聚合物、粘合剂和过滤助剂（如硅藻土）组成的整个过滤器床上被保留。对于一些深度过滤器，介质带有电荷，用于电静力保留宿主细胞蛋白和DNA，硅藻土显示出改善的料液容量，尽管在高浓度下它可以降低LV滴度。在一些小规模研究中，使用包括基于纤维素和合成介质（如聚丙烯酸纤维与硅过滤器助剂）的多个深度过滤器介质，已经显示出90%的浑浊度降低，同时保持高恢复非包膜载体，如基于猴腺病毒的载体。在LV应用中，没有过滤器助剂如硅藻土的深度过滤器恢复了>95%的滴度，同时在50 L规模上减少了>85%的HCP。通常，大多数保留等级在微滤范围内从10到0.2 µm以级联方式应用，要么只应用膜，要么应用深度过滤器和膜的序列进行更细的过滤。在直径80-120 nm的LV可以通过小保留等级的过滤器，尽管典型的终点0.22 µm确实看到滴度损失。表5中列出了一些用于澄清的可用过滤器的例子。 载体的性能取决于过滤器的保留等级、料液的质量和该规模预期的负载挑战。在高度污染的过滤器中，高跨膜压力可能导致杂质潜在地转移到滤液中，可能是由于过滤器表面细胞或片段的破裂。澄清受到上游生产的影响，悬浮培养需要去除整个细胞，而贴壁培养可能由细胞片段组成。此外，用于LV生产的瞬时转染产生与稳定生产细胞系不同的宿主细胞蛋白谱，并且可以根据使用的包膜蛋白而不同。在所有情况下，由于吸附到过滤器或被过滤器排除的组分，以及过滤系统保持体积中的损失，预计会有一定程度的LV损失。对于许多澄清过程，冲洗过滤器与缓冲液后处理是理想的，以摆脱任何吸附的载体，以改善恢复并清除死体积。 虽然通常应用于浓缩和透析（见第4.6节），切向流膜微滤也可以应用于澄清。由于切向料液流动，膜表面积累的任何蛋糕层都被去除，维持通量，与传统的死端过滤模式相反。最近，一种新的过滤器介质，Repligen的2-5 µm深度过滤器在切向流过滤中使用，以在收获时分离悬浮细胞和LV，报告的LV产量为90%。这种方法可以将悬浮细胞与LV收获物分离，允许回收生产细胞以进行持续培养和顺序收获的机会。 4.2 载体过滤：无菌过滤 无菌过滤通常是下游过程的最后一步，在这一步骤中，经过纯化、浓缩和配方的病毒载体通过一个精细的过滤器，以去除任何偶然的微生物，如细菌或真菌，同时保持LV滴度。在使用0.22 µm注射器膜过滤器进行无菌过滤期间，报告了30-50%的滴度损失。这部分是由于配方不足或纯化不良导致过度聚集和载体损失。由于载体回收率低和偶然微生物存在的风险，无菌过滤可以早期在封闭系统中进行，或者完全可以取消，尽管这将受到监管机构的密切审查。 4.3 非色谱纯化 LV的纯化寻求利用载体和其他介质组分之间的差异，即大小、密度、电荷或对固定相的特异性。这可以通过多种方法实现，常见的单元操作是超速离心和色谱（见第4.5节）。超速离心是一种纯化和浓缩载体的单元操作，通常在载体生产的研究和开发阶段应用。这种技术也广泛用于通过在大g力下沉淀病毒颗粒来纯化逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒。由于载体的体积比溶液中的游离蛋白大，载体最初被沉淀，蛋白质留在上清液中。或者，使用梯度（通常使用蔗糖、菲可尔或碘克沙醇分层逐渐更密集的层），载体可能出现在特定的带或沉淀物中，而介质污染物在前面的层中，尽管与载体密度相似的囊泡或杂质可能会与载体共同沉淀，除了抑制蛋白多糖。然而，通过蔗糖梯度生产的载体在小鼠中显示出较少的免疫原性效应，可能是由于血清污染较少。载体颗粒可以重新悬浮，并重新旋转以获得更大的纯化，多达四轮提供相对清洁的材料。此外，一些包膜蛋白可能在操作期间受到剪切力的负面影响，VSV-G特别耐剪切。此外，颗粒本身可能受到梯度渗透压的损害。此外，任何梯度成分可能需要在顺序过程中去除。高速离心机（10,000×g）也可以用于纯化，尽管这可能需要延长旋转时间，有报道称使用蔗糖旋转时间长达4小时。然而，用于载体纯化的离心可能耗时、规模受限（与超速离心机的容量相关，除非追求规模扩展）和劳动密集型。因此，它的应用通常限于研究、开发或早期临床试验阶段。 LV可以通过向含有载体的介质中添加辅料来沉淀，这可以用于浓缩目的。已经使用了聚乙二醇（PEG）、聚-L-赖氨酸、软骨素C硫酸盐和鱼精蛋白硫酸盐的混合物和磷酸钙等沉淀剂。在大多数情况下，载体与材料一起孵化，然后通过离心沉淀，重新悬浮和解聚沉淀物，然后进行进一步的处理，如TFF或透析。作用模式是由于溶剂可用性降低导致溶解度降低，从而引起载体沉淀或由于电荷导致聚集。然而，使用沉淀剂可能需要额外的处理来去除它们，以及延长时间来完全沉淀载体颗粒，并与多达16小时的孵化常见的沉淀物一起沉淀。此外，重新悬浮和解聚沉淀物可能是有问题的，当使用磷酸钙时需要EDTA处理。尽管如此，在这个单元操作中报告了50%到100%的功能恢复。 4.4 核酸减少 核酸杂质来自转染的质粒DNA或生产细胞系的宿主细胞DNA。在处理过程中需要减少核酸，以提高纯度并防止对受体细胞或患者的任何有害影响，残留DNA的限制被设定为长度<200 bp，每剂<10 ng。这可以通过在过程中的某个时候添加核酸酶，如苯酰核酸酶来完成。通常，核酸酶直接添加到生物反应器中的LV培养物中，在收获前或收获后不久，或在澄清后。然而，由于这些阶段的体积较大，需要更多的酶单位才能有效，这会产生成本。另一种选择是生产者或辅助细胞分泌核酸酶，如Oxford Biomedica开发的SecNuc，其中与载体组分共转染编码核酸酶的质粒，或生产细胞与表达核酸酶的细胞共培养。否则，核酸酶可以在浓缩步骤后添加，以降低酶的需求。无论何时添加酶，它们必须在下游进一步去除，并且必须考虑高核酸负担的影响，如在色谱中的共洗脱和/或降低的结合能力，以及核酸复合物的形成。此外，必须考虑载体所在的缓冲液的组成，以实现最佳消化，因为一些核酸酶需要镁离子、升高的温度和特定的pH范围才能有效，以及所需的孵化时间，这可能会导致载体灭活。核酸也可以通过仔细选择离子交换或混合模式流穿色谱（见第4.5节），或使用稳定生产细胞（第3.2节）和全介质替代在上游（第3.3节）的TFF来减少。 4.5 色谱纯化 色谱是一种单元操作，通过其与固定相和流动相的相互作用来分离混合物的组分。它是一种可扩展的解决方案，用于纯化和浓缩颗粒，并且与离心相比相对较快，并且易于自动化，以实现一致和可靠的结果。它在纯化许多生物来源的材料方面有广泛的应用，如单克隆抗体、重组蛋白、工业酶和核酸。通常，用于解决饲料的相互作用是尺寸排除色谱（SEC）中的组分大小，离子交换（IEX）中的电荷，以及疏水性和对固定相或流动相的亲和力。这可以以捕获和洗脱模式运行，或以流穿模式进行抛光和改进。对于LV的纯化，可以应用多种类型的色谱，观察到不同的恢复率（见表6）。 色谱的固定相开发主要集中在小分子的纯化上。这导致了多孔珠基固定相的广泛应用，以最大化表面积，实现高动态结合能力。由于组分的尺寸较小，质量传递以扩散为主。这对于病毒颗粒来说是有问题的；由于它们的尺寸，珠孔太小，因此它们的内部表面积无法接触，从而降低了结合能力和载体捕获的性能。此外，由于基于扩散的质量传递，固定相的流速往往较慢，降低了产量，这可能导致由于过程时间增加而导致滴度损失更大。鉴于这些限制，已经开发了依赖于对较大颗粒的对流质量传递的新固定相（见图1）。这样的相允许更大的流速和产量，同时保持可用的表面积以结合能力。最简单的是大孔固定相，如单体，其中许多通道形成一个海绵状结构供料液流过。单体的特点是它们的大表面积与体积比，并且已经成功地纯化了多种类型的病毒，包括具有不同包膜的LV。或者，膜固定相也提供对流质量传递。这些遵循典型的平坦或编织片，可能堆叠在一起以增加容量，具有供料液流过的孔，并允许捕获载体。最近开发的是纳米纤维旋转固定相，它提供阴离子交换色谱（AEX），并实现了约90%的LV恢复，由Puridify开发，现在由Cytiva（前身为GE Healthcare Life Sciences）拥有。这些相由薄的电纺线定义，移动相可以流过，保留在纤维本身上。这种纳米纤维在LV和腺病毒的结合和洗脱中已经显示出实用性，尽管商业容量目前集中在mAb市场上。一些混合模式色谱应用也已经开发出来。虽然AEX已被证明是纯化载体的有用工具，但最终洗脱中仍存在一些杂质，特别是DNA和蛋白多糖。因此，已经开发了一些混合模式固定相，如CaptoCore。这些结合了尺寸排除和AEX色谱，在负模式容量下纯化载体。在这种方法中，载体被排除在带有AEX配体的内部核心之外。因此，载体流过柱子，而带负电的DNA或其他较小的蛋白质被捕获和去除。这可以作为载体和病毒的抛光步骤或污染物减少步骤。 图1. 用于慢病毒载体纯化的色谱树脂的说明性示例，从左到右展示了对流质量传递的增加。 4.5.1 阴离子交换色谱 LV在中性pH下表面具有净负电荷，由于外部包膜的组成和它们的整体等电点，因此使用季铵盐（QA）或二乙氨基乙基（DEAE）配体的AEX色谱是捕获和洗脱它们的可行选择。对于逆转录或慢病毒载体，洗脱往往是分步进行的，首先通过顺序增加盐浓度洗脱松散结合的组分以提高纯度，然后最终高盐缓冲液洗脱载体。McNally使用0.3 M NaCl的初始洗脱，然后上升到1.3 M进行载体洗脱，整个过程中保持pH为8的Mustang Q AEX。对于像DEAE这样的弱配体，这个配置文件可以类似于pH 8和NaCl浓度为0.1和0.65 M。分步洗脱对载体特别有效，因为它们的大小大和表面成分可变，允许在固定相上的多个位点进行相互作用，并且因此与单个料液组分相比保留得更多。然而，这确实需要更大的盐浓度或pH变化来洗脱，这需要立即稀释以保持稳定性，由于渗透效应或包膜降解。因此，色谱的浓缩方面被减弱，必须考虑增加的缓冲液消耗用于稀释。此外，LV的瞬时生产可能导致载体的异质种群，导致不同的洗脱种群，这可能归因于外部包膜的不同组成。无包膜蛋白载体显示比包膜阳性载体更低的等电点，具有不同的zeta电位，这可能会影响色谱纯化的效率，可能是由于与色谱固定相配体的多种相互作用。此外，已经证明，用NaCl预处理载体装载材料可以令人满意地抑制大量蛋白质与AEX材料结合，提高纯度。 4.5.2 亲和色谱 亲和色谱通过其对固定相配体的特异性来解决混合物的组分。这是一种可行的技术，可以允许在不使用高盐浓度洗脱的情况下实现载体的高纯度和浓缩，例如在离子交换中，从而在下游处理过程中保持载体滴度。由于捕获基于亲和力，理想情况下只有载体被保留和洗脱，残留的DNA和蛋白质在柱内保持未结合状态。以前，LV包膜上表达过组氨酸标签以帮助其纯化，但产量很低，为46.7%，大多数可能仍然附着在柱子上。同样，可以在载体表面表达生物素，允许其通过固定化的链霉亲和素捕获，并在添加生物素后洗脱，允许载体浓度提高4500倍以上。这已经通过在CD8α茎上添加生物素模拟物进一步开发，尽管在小规模上产量高（60%），但在扩大规模时下降到20%。此外，已经应用了一种类似的方法，将低亲和力神经生长因子受体（LNGFR）被动地结合到载体表面，因此可以通过固定在磁珠上的抗LNGFR抗体捕获，回收率超过85%，尽管没有从抗体珠上释放，并且只有通过将细胞与载体结合珠混合才能实现转导恢复。在载体包膜的外表面应用亲和标签也可能会引起一些监管方面的担忧，如果来自非哺乳动物来源，尽管这可能对于体外疗法来说可以最小化，因为在载体阶段的要求不那么严格。此外，观察到逆转录病毒载体与可溶性肝素混合时受到抑制，从而导致肝素亲和色谱在LV纯化中的应用，肝素和相关的肝素硫酸盐捕获LV，产量高达53-61%的载体。 4.5.3 尺寸排除色谱 尺寸排除色谱（SEC）是一种基于尺寸通过填充多孔珠的流动材料来解决饲料组分的方法。由于它们与较小颗粒相比的较大尺寸，LV可以被高度纯化，感染性恢复超过70%，纯度超过90%，尽管高分子量污染物和DNA可能仍然存在。此外，SEC的应用是将载体缓冲液交换到配方缓冲液中，或者在离子交换后去除盐分。然而，由于线性流速降低，该步骤的整体产量较低。此外，SEC在进料体积较低时最有效，大约是床层柱的15%，以保持有效的分离，因此需要事先浓缩。由于感兴趣的产品在洗脱过程中被稀释，可能需要额外的浓缩轮次。最终，SEC可以作为抛光步骤，在先前阶段大部分污染物被去除后使用。 4.5.4 立体排阻色谱 与聚乙二醇的结合导致了立体排阻色谱的使用。该方法基于粒径大小选择性，可以作为病毒的一种快速替代SEC的方法。这种方法遵循与PEG沉淀类似的机制，不同之处在于存在一个亲水的固定相，供大颗粒凝聚。在洗涤柱子时，洗脱缓冲液中PEG浓度的降低会基于尺寸选择释放结合的载体。虽然该方法已应用于流感病毒，但LV的恢复率报告为60%。 4.6 切向流过滤的浓缩和缓冲液交换 切向流过滤（TFF）是一种单元操作，通常以超滤/透析（UF/DF）模式运行，允许在LV处理过程中体积减少和缓冲液交换，同时去除低分子量杂质，同时保留载体颗粒。它以不同的格式（表7）使用不同的参数（表8）。在这里，切向超滤允许体积减少以将载体浓缩至适当的滴度，并简化下游处理，减少体积进料。缓冲液交换（透析）通常跟在浓缩步骤之后，以优化更换缓冲液的消耗效率。载体可以交换到的缓冲液的选择对于维持载体的稳定性至关重要，无论是在冷冻-解冻过程中（见第4.7节），还是在交换到最佳的色谱结合缓冲液中，或者有效地转导受体细胞。除了TFF之外，这可以通过多轮离心和在所选缓冲液中重新悬浮或SEC方法来实现。然而，TFF提供了更大的自主性和减少的手工处理，同时保持高载体浓度。一些TFF系统使用中空纤维单元，而其他系统使用卡带，由不同的膜组成，如基于纤维素的（例如，混合纤维素酯）和聚醚砜（PES）。两种格式都是可扩展的，适用于载体浓缩和缓冲液交换的解决方案。两者都提供高表面积与体积比，尽管平板卡带可以比中空纤维提供更高的通量，尽管由于它们的迂回流路和湍流促进的屏幕，对载体颗粒的剪切率更高。使用TFF的膜允许盐、缓冲液和小分子物种根据它们的保留等级（通常以kDa表示）跨膜传递。TFF中澄清的效率与料液和每个单独组分的保留系数有关。一些研究小组已经将TFF作为色谱的替代品，作为澄清和纯化步骤，达到高达97%的恢复率，或者与超速离心结合使用，允许高达1800倍的浓缩。因此，TFF可以应用于多个实例，例如在色谱之后去除洗脱缓冲液中过量的盐，将缓冲液交换到配方缓冲液中，到色谱捕获的优化结合缓冲液中，或者在SEC之前的浓缩。此外，如果载体的生产要强化，可以使用串联过滤，使用中空纤维膜在连续减小表面积的中空纤维中浓缩产品，或者应用单次通过切向流过滤，其中没有循环回路，料液沿着长的迂回膜路径流动。尽管，截至撰写本文时，尚未发表LV的应用，单次通过TFF已在mAbs和重组蛋白生产中得到采用。随着过程的成熟，这些单元操作的实施是可能的，特别是与基于灌注的生物反应器和稳定生产细胞系相结合，允许最佳的连续生产。尽管如此，TFF的参数需要根据料液进行优化，因为流速和膜类型可能导致剪切损伤和载体损失。此外，跨膜压力、料液流速和料液组成对通量的影响由于污染可能导致处理时间延长，并需要更大的膜，这涉及到更大的保持体积。载体也可能吸附或被困在膜的表面，特别是如果孔径与载体大小相近，尽管更大的孔径提供更好的杂质去除和通量性能。因此，通常使用100-750 kDa范围内的膜，其中更大的孔径有利于通量，以牺牲载体吸附为代价，而较低的截止速度减慢通量以保持载体。运行后冲洗可以帮助释放吸附的载体，优化取决于该阶段的料液。此外，向料液中添加添加剂，如蔗糖或类似的粘度增强剂，可能保护载体免受剪切。 4.7 配方 LV的缓冲液配方对于在整个处理过程中以及最终应用中维持载体的转导能力是必要的。最终的配方将根据其应用而变化。例如，体内疗法可能需要更严格的配方，如使用注射用水以确保安全，与体外应用或在处理过程中临时冷冻的载体相比。对于许多体外疗法，通常将载体配方到细胞培养的细胞培养基中；这简化了过程，不需要考虑LV配方对细胞生长的影响。然而，这并不意味着LV的最佳配方，因为培养基组分可能无法充分稳定载体，或者可能允许载体聚集或吸附到容器上。这在冷冻过程中特别成问题，如果载体需要长途运输或存放一段时间，尽管细胞培养基中的蛋白质和糖的存在在这里可能有益。通常，缓冲液辅料作为载体配方的防腐剂。这些可以包括重组蛋白，如人血清白蛋白，因为一些蛋白质已被证明可以稳定载体，以及如蔗糖或海藻糖等糖，它们可以作为冷冻保护剂和渗透压调节剂。应该使用缓冲液种类来在各种温度下维持稳定的pH值（理想情况下是生理的），因此基于它们有效的缓冲范围和对温度的pH漂移抵抗力，已经使用了像HEPES和组氨酸这样的种类，与常见的缓冲液如TRIS不同，TRIS会看到pH漂移。尽管如此，已经在TRIS或磷酸盐缓冲液（PBS）中使用蔗糖或海藻糖进行冻干的LV长期储存中取得了成功。后者证明了载体在37°C下冻干至少四周的稳定性。一些NaCl可能有助于稳定性，添加氯化镁也可以防止聚集。另一个考虑因素是缓冲液对处理单元操作的影响，例如，常见缓冲系统中的负磷酸根离子与AEX色谱树脂中的带正电荷的配体发生相互作用。Kumru等人研究了多种辅料对LV物理稳定性的影响，通过观察粒径、形态和zeta电位，他们指出，当在37°C的玻璃中过夜孵化时，氨基酸脯氨酸和赖氨酸以及糖的甘露糖和乳糖可以最小化载体损失。导致吸附损失到玻璃上的辅料是盐（例如，氯化钙）、还原剂、螯合剂和阳离子肽。这些在冷冻-解冻周期中也被发现对LV有负面影响，而糖、多元醇和环糊精以及某些氨基酸如亮氨酸则有所帮助。然而，在这个实验中，只检查了物理稳定性，没有检查转导能力。 5.载体特性和质量控制  对于人体试验的应用，LV批次在放行前应进行广泛的表征和QC测试。为了保持安全性，产品必须保持在预先确定的规格范围内，这些规格由适当验证的、精确且可重复的检测协议支持。一个典型的LV批次将需要纯度、身份、安全性和效力的规格，并且这些必须在批次之间保持合理的一致性，如监管机构所要求的，随着潜在治疗从动物研究到商业发布的过程，严格性不断发展。所需的检测可以是大多数重组过程所典型的和预期的，但也可以扩展到载体和转基因特定的检测。例如，残留DNA可以通过Picogreen或定量聚合酶链反应（qPCR）进行检测，而宿主细胞蛋白可以通过酶联免疫吸附测定（ELISA）、SDS-PAGE或任何形式的总蛋白定量，如Bradford、Lowry或双缩脲酸比色法，以及标准的支原体和内毒素检测进行分析。过程中的添加剂，如核酸酶，可以通过ELISA进行滴定，也可以通过qPCR检测HEK-293T细胞中的SV40 T抗原（抗原的qPCR可以作为宿主细胞DNA杂质的信号）。由于载体颗粒本身的性质，包含核酸、脂质和蛋白质，以及区分功能性滴度和总颗粒数，载体特定的检测更为复杂。验证定量方法是LV开发过程和商业供应QA/QC的关键。由于各种工业或学术团体中可用的转基因、包膜蛋白和受体细胞的多样性，以及不同团体之间的滴度差异很大，这取决于操作者，因此达成方法学的共识是有问题的。尽管如此，在表征生产运行的有效性时，载体定量是必不可少的，并且作为监管批准的关键质量属性的要求。LV的定量可以广泛地分为定量载体的各个部分，这些部分在一定程度上有交叉，这些分组可以列为功能性、载体RNA定量、载体蛋白、载体酶活性和物理计数颗粒。对于功能性，选择的定量方法是转导已知数量的细胞并检查转基因表达。这种方法通常需要在各种稀释度下对感兴趣的载体进行滴定，并将载体溶液与已知数量的细胞混合。可以添加聚布雷恩以增强转导，通过最小化包膜蛋白和受体之间的静电排斥。在允许细胞扩张并稀释出任何短暂的转基因表达一段时间后，通常通过染色抗体或亲和染料检查细胞表达，除非使用标记基因（通常是GFP），并用流式细胞术进行分析。通过知道转导细胞的百分比、添加的载体溶液体积和细胞数量，可以确定转导单位。然而，这并不考虑可能在高感染度下出现的多重整合，因此必须进行滴定。此外，由于短暂转基因表达导致滴度过高的风险是显而易见的，因此建议在转导和细胞读取之间有适当的时间长度，以稀释出非整合的转基因，更好地反映长期细胞培养治疗。此外，总体积、细胞密度、细胞受体的可用性和搅动可能会影响结果，因此不同团体之间的滴度很难直接比较。理想情况下，转导的细胞应该是与目标受体细胞相同的类型，尽管通常使用HEK-293T。此外，在FACS分析期间的门控策略、染色的转基因数量和染色的质量需要考虑。此外，转导抑制物的存在，如非功能性载体、游离漂浮的包膜蛋白和蛋白多糖，可能会导致滴度被低报，以及载体从未接触到细胞或可用受体的机会。 可以通过整合测定非染色方案的功能滴度，其中提取转导细胞基因组DNA（gDNA），并通过qPCR定量前病毒，并与管家基因进行比较。这个测定可以是感兴趣的转基因特有的，尽管如果载体转基因和标准之间的序列共享，世界卫生组织（WHO）已经制定了一个标准，用于跨团体比较。qPCR可以定量多个整合，尽管这不是转基因功能性的指标。此外，质量取决于gDNA的分离和缺乏来自质粒、宿主细胞和短暂形式的DNA污染，因此需要扩增时间或/和核酸酶以最小化假阳性。考虑到测定仍基于转导效率，实际应用是在转导的细胞中，转基因难以染色或用于转导细胞gDNA的遗留采样。 核酸定量涉及载体RNA的定量。这种方法需要破坏载体，分离载体RNA，其逆转录为互补DNA，然后进行定量。值得注意的是，这种方法不定量载体功能，因此其应用在一定程度上是有限的。存在质粒DNA夸大结果的风险，这需要通过非逆转录对照或DNase处理进行校正。此外，非功能性但包装的载体可能会导致过度报告。它依赖于RNA提取的效率及其稳定性，尽管这可以通过添加RNA标准来控制。然而，其有效性对于过程开发目的可能是有问题的，因为样品中qPCR或逆转录酶的不同抑制剂可能会影响结果，例如色谱洗脱中的高盐。qPCR可以进一步扩展为数字滴液qPCR（ddqPCR），其中通过水-油乳液滴在高稀释下分离单个qPCR反应。通过计算阳性滴液的数量，可以按照泊松分布计算模板浓度，而无需标准曲线。这种技术已经与LV一起使用，即使模板非常稀少也可以提供结果，并可用于计算受体细胞中的载体副本数。 p24 ELISA测定是一种定量样品中p24 HIV衣壳蛋白质量的方法，可以作为常规商业试剂盒购买。基于抗体的测定可以在一天内提供蛋白质的定量，而功能性感染性需要2-3天。在测定中，载体通过洗涤剂破坏，然后在板上孵化，蛋白质通过电荷结合到塑料上或p24被预先固定的抗体捕获。另外孵化一次抗体并洗去，然后添加酶联二抗体。洗去后，结合的酶允许通过吸光度或荧光测量底物的变化，这直接对应于p24的数量。这种方法已被广泛采用，结果通常报告为p24质量与转导单位（P:I比率）的比率。这将颗粒质量与功能联系起来，因此作为载体质量的衡量，甚至允许团体通过估计每pg p24的1x10^4个LV颗粒来假设LV数量。然而，p24试剂盒依赖于它们抗体的特异性，在某些情况下会过度报告，因为包括未处理的p24形式，如GAG、载体片段和灭活或未成熟的病毒。 测量载体酶活性可以提供病毒蛋白的替代定量测定。在基于qPCR的产品增强逆转录测定（PERT）中，载体进行滴定并用洗涤剂裂解，然后与标准RNA模板混合。设置热循环器，进行逆转录的初始孵化时间，然后温度升高导致酶失活。然后运行qPCR以定量RNA模板转换为DNA的数量，与已知的HIV-1重组逆转录酶对照进行比较。由于它依赖于逆转录酶的活性，测定将对逆转录酶的抑制剂敏感，可能需要通过通常在qPCR主混合物中提供的惰性蛋白进行稳定。这可能在处理样品中看起来有问题，这些样品可能具有不同范围的稳定剂或抑制剂。然而，该方法是快速的，提供结果在2小时内，因此可以提供高吞吐量定量，一天内多个样品。与p24测定相比，该测定也可以更具成本效益，因为缺乏特定的抗体和使用常见的qPCR混合物。 另一种技术是物理颗粒计数。动态光散射（DLS）是一种方法，通过量化光束被颗粒中断时散射的光量，并使用样品的已知粘度，通过斯托克斯-爱因斯坦方程计算颗粒的水动力直径。结果可以在30分钟内获得，并估计平均粒径、多分散性和粒径分布的计算。尽管这也只确定物理颗粒数量而不是功能性，但DLS数据的质量随着多分散性的增加而逐渐不可靠，增加的颗粒数量导致散射错误，这会影响感兴趣的颗粒。这对于可能具有相当高多分散性的工艺混合物来说是有问题的，此外还有必须为DLS准确性表征的不同粘度。除非提供干净的样品，否则该方法主要用于混合物中的平均粒径和确定样品是否聚集。 尽管DLS技术已经通过多角度动态光散射得到改进，这增加了光散射的检测角度数量，并在高多分散性下提供了更稳健的结果，但颗粒浓度的准确性可能在名义值的50%以内变化。 基于与DLS相似原理的替代方法可以在纳米颗粒跟踪分析方法中找到。在这里，通过显微镜录制视频片段，并通过跟踪算法量化小颗粒的布朗运动。尽管无法区分LV与其他类似大小的颗粒，但一些新型号允许染色和跟踪特定荧光的颗粒，因此允许量化特定物种。同样，可调电阻脉冲传感检测通过小孔的颗粒大小和数量，并已与LV一起使用。 其他基于物理颗粒的定量可以通过在电子显微镜中计数颗粒来完成，使用负染色，现代系统，例如Vironova的台式MiniTem，提供自动化的电子显微镜和分析。此外，标记的LV的荧光可以与共焦显微镜中的荧光珠进行比较。这两种方法完成都非常耗时，并且不适用于大量样品。最近增加的一种方法，利用高性能液相色谱（HPLC）与AEX树脂，可以洗脱载体带，基于它们的荧光，估计每毫升范围内10^8到10^10个载体颗粒的数量。 这种方法已用于区分DNA和载体，并且与ELISA和ddPCR相当，允许在6.5分钟内应用来自过程不同方面的各种样品。尽管这种方法只量化载体颗粒，并不显示功能单位，但这种快速和高通量分析考虑对于过程开发具有很大的价值。 6.LV生产的整个生物过程评估  图2展示了生产慢病毒载体的不同过程选项。有些过程选项仅适用于小规模或需要少量剂量的应用程序（超速离心、SEC和篮式离心），而大多数是可扩展的（例如，过滤选项、色谱等）。操作的最终顺序取决于LV产品的规模、用于LV生成的技术、LV滴度以及所需的产品和杂质概况。在这方面，需要应用某些操作的实际点（例如，浓缩、透析、DNA消化等）将取决于这些因素。例如，应用苯酰核酸酶或类似产品进行DNA消化可能在LV生成步骤的任何地方进行，作为澄清步骤的一部分，或在色谱之前或之后。 图2. 慢病毒载体生产的生物过程选项。(1) 一些研究表明，在之前使用不同孔径大小的膜过滤或包含低速离心的序列。过滤过程的序列将根据规模、细胞密度以及产品和杂质概况来决定是否采用。(2) 这些是在临床前和临床研究中使用的操作策略的例子。(3) Benzonase 可以在下游过程中的多个步骤中添加。 在他们的综述论文中，McCarron等人提供了扩大慢病毒载体生产的挑战概述。这些在表9中简要总结。在LV生产中，生物过程理解在解决低恢复率和载体功能性丧失方面最相关。这始于对最终产品应用的理解，这定义了操作的最终规模，以及产品和过程规格。此外，确定影响过程选项性能的相关参数将对这些选项及其操作的最佳选择很重要。筛选研究可以提供关键的生物过程信息，例如TFF操作中的跨膜压力水平或横流速率，AEX色谱中的柱流速率，或TFF操作中正确的分子量截止（MWCO）或膜材料。确定在未配方LV产品的过程开发中使用冷冻-解冻材料的影响也很重要（例如），而不是使用新鲜材料，因为这一步可能对过程性能有巨大的影响，而不是作为生物过程操作本身的结果。 定义LV生产生物过程序列中的步骤需要进行整体生物过程分析，因为不同操作之间存在相互作用。例如，浓缩和缓冲液交换（TFF）后跟阴离子交换（AEX）色谱产生了一种LV产品，当用于转导时，与仅使用TFF步骤相比，尽管总体产量较低，但对细胞没有毒性。另一个例子是，TFF操作，无论是单独使用还是与超速离心结合使用，都产生了一个功能滴度更高的LV产品，当这个步骤被移除时，这种产品是看不到的。最后，DNA消化在过程序列中的位置或TFF步骤的位置可以用来改善随后的AEX色谱。 对病毒载体细胞和基因疗法的日益关注推动了生物加工的界限。对于更大规模的LV生产，需要研究过程剪切的作用，因为大规模生产意味着使用更大的泵或以更高的流速运行泵，因此，可能产生更高的剪切率。此外，更高的生产力要求也意味着增加通量要求以缩短TFF操作时间。这对LV生产有几种影响：较短的时间可能对LV稳定性有利，而增加的通量可能意味着需要以更高的横流速率或更高的跨膜压力运行；这两者都可能导致暴露于高过程剪切。病毒载体通常被认为是脆弱的，因此对剪切敏感。例如，Valkama等人提到，增加的循环流速，绕过柱子，导致感染性LV损失20%。然而，我们实验室的早期分析发现，一些伪型LV即使在暴露于非常高的过程剪切后也能有很高的恢复率，使用超规模缩小（USD）（未发表数据）。这表明过程剪切可能对不同的慢病毒载体有不同的影响，生物过程操作的设计（例如，TFF）应该考虑到这些，以提高生产力并满足大规模制造的要求。我们之前展示了使用超规模缩小设备预测大规模TFF操作生产单克隆抗体。这种大规模设备与用于LV TFF加工的设备类型相似。超规模缩小方法也已用于评估其他单元操作。USD由于进行分析所需的材料量少，因此能够进行整体生物过程评估。最后，作为LV生产的整体生物过程分析的一部分，结合过程经济分析将是有益的，因为它可以证明生物过程选择的经济可行性。 7.结论  我们回顾了慢病毒载体生物加工的基本单元操作、整体生物过程选择和当前发展的其他方面。由于细胞和基因治疗的治疗益处被认识到并转化为临床应用，对LV的需求在可预见的未来将保持高涨，新应用正在被探索（例如，作为病毒疫苗载体）。尽管目前全球LV的制造能力很低，LV生物加工需要优化，但显然正在努力提高产量和恢复率。这些发展将导致更广泛地实施基因转移剂以改善治疗结果。对慢病毒载体的生物过程要求的基本理解是确保LV产品从临床开发转化为患者使用的关键。TFF和AEX色谱是可扩展LV生物加工的首选单元操作的领跑者，微滤也是如此。根据我们对这些操作的了解，溶液环境（即，缓冲液、添加剂、辅料等）以及固相材料（例如，膜、树脂或纤维）将在不同伪型LV的处理过程中有重要贡献。确定关键操作参数和过程条件将是过程开发中必不可少的活动，以及整体生物过程评估。这应该能够获得高LV浓度和产量，同时在LV产品中最小化杂质。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

摘要：慢病毒载体在基因修饰细胞疗法的兴起中发挥了关键作用，特别是T细胞疗法。Tisagenlecleucel（Kymriah）、Axicabtagene ciloleucel（Yescarta）以及最近上市的Bexucabtagene autoleucel（Tecartus）是现在商业化分发的T细胞疗法的例子，它们在成功获得EMA和FDA批准用于治疗血液癌症后，已经上市。这三种疗法都依赖于逆转录病毒载体将治疗性嵌合抗原受体（CAR）转导到T淋巴细胞中。尽管这些创新代表了充满希望的新治疗途径，但在使它们成为医疗护理中随时可用的工具方面仍存在重大障碍。本文回顾了慢病毒（LV）载体和T细胞治疗的生物学原理以及生物加工。还讨论了临床和工程的成功、不足和未来的机会。开发符合良好生产规范（GMP）的仪器、技术和协议将在LV工程化T细胞疗法的发展中发挥重要作用。 1.引言 病毒是由蛋白质外壳保护的核酸组成的传染性生物。这些微生物不能自我复制，而是依赖于它们感染的细胞，通过劫持宿主的复制机制来产生更多自己的副本。病毒通常与疾病相关，但遗传工程师重新利用了它们的生物学特性，利用它们自然的能力来修改或补充宿主细胞的遗传密码，生产出一类称为病毒载体的新的基因传递工具。伽马逆转录病毒（GRV）和慢病毒（LV）载体来源于逆转录病毒科的包膜RNA病毒，由于它们能够将遗传物质整合到宿主细胞基因组中并稳定表达外源基因，因此它们在研究和临床中得到了广泛应用，特别适合转导高度复制的细胞，如免疫细胞。嵌合抗原受体（CAR）T细胞疗法是迄今为止最成功的免疫疗法类型，也是唯一上市的基于T细胞的疗法。为了生产CAR T细胞，T淋巴细胞被遗传修饰以表达CAR受体，赋予它们识别和摧毁癌细胞的能力。CAR T细胞疗法在治疗血液癌症方面显示出了有希望的结果，特别是CD19阳性B细胞恶性肿瘤，三种产品Tisagenlecleucel（Kymriah）、Axicabtagene ciloleucel（Yescarta）和最近上市的Bexucabtagene Autoleucel（Tecartus）获得了市场授权。这些疗法的载体和细胞元素的生物加工很少同时考虑，也不一定由同一制造商生产。生物技术和制药行业越来越多地参与T细胞工程疗法和赞助临床测试，证明了这一治疗领域的快速发展。在这篇综述中，我们将介绍用于基因修饰T细胞疗法的LV载体的基本生物学原理和生物加工，以及最近的临床和工程进展。 2.慢病毒载体 2.1.生物学原理 逆转录病毒载体的两个主要类别是GRV和LV载体。两者之间的主要区别在于GRV载体只能感染分裂的细胞，而LV载体也可以感染静止的细胞。慢病毒载体已经在多种临床前应用中用于治疗遗传性疾病，如B型血友病和黄斑变性，通过体内传递。慢病毒载体也用于体外转导细胞以用于治疗应用，最先进的临床应用是CAR T细胞疗法。本综述将重点讨论LV载体在T细胞疗法开发和制造中的使用和应用。慢病毒载体来源于逆转录病毒科的病毒，最常见的是人类免疫缺陷病毒1型（HIV-1），并已用于研究和治疗应用。还开发了使用不同来源病毒的变体LV，如猴免疫缺陷病毒（SIV）、猫免疫缺陷病毒（FIV）或马传染性贫血病毒（EIAV）。LV是通过依赖逆转录病毒将其遗传物质整合到宿主细胞基因组中的自然能力，有效修饰真核细胞的手段。LV可以被修改以携带高达10 kb的基因，并稳定转导感兴趣的基因，通常被称为“表达盒”。LV基因组编码三个结构基因，在野生型病毒和工程载体中发挥相同功能。这三个基因是群特异性抗原（gag）、聚合酶（pol）和包膜（env）。gag基因编码病毒的结构蛋白，包括基质蛋白、衣壳蛋白和核衣壳蛋白。这些蛋白是蛋白质骨架的一部分，作为病毒RNA基因组的保护层。pol序列编码病毒复制周期所必需的酶功能。这包括蛋白酶，它将HIV未成熟蛋白切割成成熟的功能性蛋白；逆转录酶（RT），将病毒基因组单链RNA（ssRNA）逆转录成双链DNA（dsDNA）；整合酶，它切割宿主基因组DNA以整合病毒dsDNA。env序列编码包膜蛋白，负责HIV细胞进入和通过与目标受体的相互作用来确定嗜性。包膜蛋白复合体是由env编码的两种蛋白gp120和gp41形成的异二聚体。Gp120和gp41通过从包膜膜突出的域与它们的靶标受体CD4、CCR5和CXCR4相互作用。此外，HIV基因组编码调节元件Tat和Rev和辅助蛋白Nef、Vpr、Vif和Vpu。虽然调节元件对HIV复制是必需的，但辅助蛋白增强病毒复制，并与体内的致病性相关。最后，HIV基因组编码参与如核输出、包装和基因表达等功能的基本序列。Rev-Response Element（RRE）与Rev相互作用，允许在病毒复制期间未剪接和单剪接HIV RNA的核输出。HIV DNA基因组由两个在病毒RNA逆转录过程中产生的长末端重复（LTR）序列所包围，对病毒基因组整合到宿主细胞DNA和病毒基因组表达至关重要。LV是通过将逆转录病毒基因组的组件组合成重组质粒DNA（pDNA）而开发的。然后可以将pDNA转染到生产细胞系中。为了增加可以包装到载体中的遗传有效载荷，抑制复制，并限制致病性，同时保留功能，对LV基因组进行了修改。第一代LV与野生型病毒基因组最为相似。为了限制创建复制能力慢病毒（RCLs）的风险，病毒基因被装载到三个单独的质粒上。该系统由包含结构gag基因和调节蛋白的包装质粒组成——包含gp160或其他替代病毒包膜的糖蛋白的包膜质粒，以修改嗜性（例如，VSV-G）——以及包含两个HIV LTRs的转移质粒。包装和env质粒不包含LTR序列和ψ包装序列，而是被巨细胞病毒（CMV）启动子所取代，以进一步防止RCLs的形成。第二代LV生产系统从包装质粒中去除了辅助蛋白Nef、Vpr、Vif和Vpu，因为这些与疾病进展、致病性和通过人类社区的传播相关，但对病毒功能如逆转录、整合或成熟不是必需的。第三代也是最新的LV生产系统修改了转移质粒的5' HIV LTR序列，并用强大的病毒启动子（如CMV或Rous肉瘤病毒（RSV）启动子）替换，允许从系统中去除tat，并进一步防止RCLs的形成。最后，Rev元素从包装质粒中移除，并装载到一个新的调节质粒上，形成了一个四质粒系统，增加了对RCL形成的安全性。所有三代LV载体及其相应的质粒系统已在图1中总结。 图1. 三代LV质粒系统。每一代LV载体都展示了其生产所需的质粒构建以及每个质粒所携带的基因。 2.2.LV生物加工 LV载体生物加工可以分为两个主要阶段，即上游加工（USP）和下游加工（DSP）。病毒载体的USP指的是病毒颗粒产生的步骤。这是通过将DNA转移到包装细胞中实现的，这些细胞被用作载体工厂。在工艺开发阶段，这通常是在2D细胞培养中完成的，并扩大到生物反应器生产，用于临床和商业生产。所使用的细胞是永生化细胞系，最受欢迎的是人胚肾细胞系HEK293T。HEK293T是一种贴壁细胞系，这在扩大规模时涉及挑战，因为大多数大规模生物反应器都适用于悬浮细胞培养。一些替代方案，如固定床生物反应器，已被提出作为有效扩大规模的解决方案。或者，为了解决这个问题，也尝试开发HEK293T细胞的悬浮变体。病毒载体生物加工从扩增生产细胞系开始，例如HEK293T细胞。然后，细胞被质粒DNA（pDNA）转染以转移LV颗粒生产所需的基因。随着它们的成熟，LV载体从生产细胞膜上出芽并释放到细胞培养基中。因此，与腺相关病毒（AAV）载体等其他非包膜载体不同，不需要细胞裂解步骤来释放颗粒。生产出的载体的DSP在收获生产细胞培养上清后开始。这种产品高度异质，包含大量的工艺和产品相关杂质。澄清步骤是为了去除聚集体和细胞碎片等大杂质，可以通过过滤或离心实现。为了在后期去除污染的核酸，这一步可能包括核酸酶消化。捕获步骤旨在保留和浓缩LV颗粒，并进一步去除工艺和产品相关杂质。可能添加中间纯化步骤以交换LV缓冲液、浓缩产品或去除特定杂质。然后是抛光步骤，以去除剩余的杂质，这些杂质通常由于与LV载体的物理性质相似而最难从最终产品中分离。捕获和抛光步骤可以通过多种下游加工技术的组合来实现，可能包括超离心、超滤/透析（UF/DF）、切向流过滤（TFF）、液相色谱或无菌过滤。最后一步或填充完成步骤包括LV载体的最终配方，可能包括缓冲液交换、无菌过滤、冷冻保存或添加辅料。大规模LV生物加工的一个例子在图2中展示。 图2. 用于GMP级LV载体生产的端到端上游和下游生物加工示例。这个图描述了Oxford Biomedica（英国牛津）为其GMP级慢病毒载体生产而申请专利的生物加工过程，该过程使用了他们悬浮适应的、无血清的HEK293T生产细胞系。这个过程包括一个依赖于丁酸钠的可诱导质粒系统。每批产品都单独冷冻保存和储存，直到生产出足够的材料，然后合并、过滤和浓缩以进行最终配方。 3.基因修饰T细胞疗法  3.1.生物学原理  T淋巴细胞在免疫中的一个作用是检测和摧毁被有害病原体感染的细胞。在感染期间，T细胞可以在呈递特定传染病原的免疫原部分，称为抗原时，检测到外来病原体。这种激活是通过T细胞受体（TCR）介导的，由CD3受体和CD4或CD8共受体组成。CD4共受体由辅助T细胞在与抗原呈递细胞相互作用时使用，以激活它们的细胞因子释放功能，这促进了其他免疫细胞的招募和激活，而CD8共受体由细胞毒性T细胞用来激活它们的细胞杀伤功能。其他共受体，包括OX40、CD28和4-1BB，增强了细胞功能，如增殖、细胞因子产生和细胞存活。一旦激活，T细胞将开始快速分裂，产生促炎因子并激活其细胞毒性功能以摧毁感染细胞。当感染解决后，由克隆扩展产生的激活T细胞群将变得筋疲力尽、衰老，并最终经历凋亡。这个过程只留下一小部分持久的记忆细胞，能够检测到相同的抗原并经历快速的克隆扩展，随后分化以产生强大和特定的适应性免疫反应。 在胸腺中的成熟过程中，识别自身肽段的T细胞被移除，以防止自身免疫反应。癌症细胞中存在的遗传和表观遗传修饰导致细胞功能如代谢、增殖、DNA修复、凋亡、运动和附着的失调。免疫系统有能力检测到这些因素中的一些，并利用其杀伤功能来根除癌细胞。肿瘤微环境（TME）的修饰也可以是免疫系统的潜在靶标，因为TME的特征与健康周围组织明显不同。被吸引到TME并渗入肿瘤的淋巴细胞被称为肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）。这些免疫细胞的存在与癌症患者的更好预后和缓解机会相关，它们已在临床上用于自体细胞治疗。然而，癌细胞源自受损或突变的健康细胞，因此对免疫系统来说可能很难检测。 嵌合抗原受体或CAR是一种能够结合目标抗原的工程TCR。CAR可以被引入T淋巴细胞中，以产生具有检测特定抗原能力的CAR T细胞。CAR由人类IgG抗体的单链可变片段（scFv）组成。已经开发了三代CAR：第一代是与CD3信号结合的scFv片段，以促进CAR T细胞的细胞毒性活性。第二代还包含一个CD28信号，以促进目标结合后的细胞增殖和细胞因子产生。第三代CAR增加了4-1BB和OX40区域，以促进细胞存活并延长CAR T细胞体内的持久性。最近开发了第四代，并包含特定的细胞因子信号，使CAR T细胞对TME的免疫抑制效应产生抗性，并进一步提高它们体内的寿命。 3.2.T细胞疗法生物加工 两种主要的方法已经从T细胞过继疗法中出现，依赖于两种不同的来源材料。异体方法依赖于来自“通用”来源的细胞，采取一种一刀切的策略。自体方法依赖于直接从患者体内获取的细胞，用于个性化医疗类型的治疗。所有商业上可用的T细胞过继疗法都依赖于自体原则，因为异体方法由于HLA分型和干细胞技术的早期发展而被证明难以开发。 对于大多数商业上可用或在临床开发中的CAR T细胞疗法来说，细胞是通过白细胞分离术或白细胞分离术从患者的外周血单个核细胞(PBMCs)中分离出来的。这种材料包含大量免疫细胞，包括B细胞、巨噬细胞、单核细胞、NK细胞和T细胞。第一个制造步骤是从PBMCs中分离出T细胞亚群，这可以通过磁性珠选择或选择性扩增来完成。磁性选择是指将磁性珠与抗体结合，这些抗体与目标T细胞群体结合，当通过磁性柱时可以分离出来。对于CAR T细胞的开发，可以使用抗CD3或抗CD4和抗CD8抗体的组合来选择T淋巴细胞。选择后，细胞通常在培养基中休息数小时。然后可以使用含有CAR盒的病毒载体转导细胞。这一步允许将CAR基因引入细胞，以产生完全功能的CAR T细胞。病毒转导的替代方法是转染。T细胞可以通过化学转染，使用聚乙烯亚胺(PEI)等转染化学试剂，或通过电穿孔，使用电流在细胞膜上形成孔隙，使pDNA进入细胞来进行转染。这些方法需要大量的pDNA，因为它们是在扩增阶段的末端进行的，涉及更多的细胞数量，因此在治疗应用中使用有限。 在生产用于治疗应用的CAR T细胞时，可以通过四种主要类型的遗传物质转移来实现基因传递：将基因稳定整合到宿主T细胞基因组DNA中；非整合的瞬时转移，转基因DNA作为环状体存在；病毒载体介导的转导；和非病毒转导。为了达到治疗患者所需的细胞治疗剂量，细胞在培养中被保留并允许扩增。为了刺激T细胞扩增，使用与单克隆抗体结合的珠子激活细胞，这些抗体针对CD3和CD28 T细胞受体。激活后的细胞可以在生物反应器中培养，这提供了在封闭系统中扩增细胞的可能性，中等规模，并在整个过程中进行采样和监测，以控制产品质量。 CAR T细胞疗法的开发面临一些挑战，包括细胞扩增不良、体内寿命短以及治疗患者的重大副作用。获得足够的目标T细胞以提供功能性治疗是主要挑战之一。用于临床前药物开发的材料通常来自健康捐赠者，而临床使用的材料来自接受过包括化疗、放疗、免疫疗法或所有这些组合的严酷治疗方案的晚期癌症患者。因此，临床使用的材料质量较差，变异性较高。最后，从处于危急状态的患者中采样免疫细胞将对他们的健康和生存机会产生重大影响。因此，有效的细胞扩增技术对于将CAR T细胞疗法从“实验室到床边”至关重要。 尽管取得了很大成功，但CAR T细胞疗法已被证明存在重大安全挑战。这是因为CAR T细胞可能触发称为细胞因子释放综合征(CRS)或“细胞因子风暴”的免疫反应级联反应。CRS是由T细胞的组成性过度激活引起的，导致大量促炎因子的释放，激活更多免疫细胞进入正反馈循环。CRS症状包括高烧、癫痫发作、器官衰竭、低血压和全身性炎症反应，可能导致死亡。 4.LV载体技术在T细胞工程中的应用  4.1.引言  LV载体是体外研究和开发的成熟技术，最近它们在临床应用中越来越受欢迎。事实上，LV临床应用的安全性和有效性已经为许多临床试验所证明，一些产品已经获得市场授权。图3描述了生产商业上可用的自体疗法所用的制造过程。然而，需要解决CRS、神经毒性和总体成本等挑战，以使T细胞过继疗法成为一种广泛可及的治疗。开发符合良好生产规范(GMP)的仪器、技术和技术对于LV工程化T细胞疗法的开发至关重要。在本节中，我们将介绍LV载体技术在T细胞工程中的一些应用。以下讨论了目前可用的CAR T细胞疗法、旨在将LV应用整合到T细胞工程中的技术、基于LV的T细胞疗法开发研究和开发工具、使用LV修饰的供体T细胞的异体方法以及CAR T细胞疗法的替代品。 图3. 病毒载体和自体CAR T细胞疗法生物加工。 病毒载体生物加工始于生产细胞系的扩增，例如HEK293T细胞。然后，细胞通过质粒DNA (pDNA) 载体进行转染。转染后，从细胞上清中收获产生的病毒颗粒。澄清步骤是为了去除大的杂质，如聚集体和细胞碎片；这一步骤可能包括核酸酶消化步骤。捕获步骤旨在保留慢病毒(LV)颗粒并进一步去除杂质。抛光步骤去除与LV载体物理性质相似的杂质。填充-完成步骤包括LV载体的最终配方。 自体CAR T细胞生物加工从通过白细胞分离术或白细胞分离术从患者中分离外周血单个核细胞(PBMCs)开始。为了从PBMCs中分离T淋巴细胞，可以引入使用抗体偶联磁性珠的富集步骤。使用抗CD3/CD28抗体偶联珠激活T细胞。激活后，使用慢病毒载体转导细胞，CAR治疗基因整合到目标T细胞基因组中，以产生完全功能的CAR T细胞。然后，在培养中扩增激活的T细胞，以达到治疗输注所需的细胞数量。然后收获细胞材料，并在-120°C下进行冷冻保存。然后将材料运回诊所，通过静脉输注给患者。 4.2.商业上可用的基因修饰T细胞疗法 在获得市场授权的三种CAR T细胞疗法中，brexucabtagene autoleucel (Tecartus, Kite Pharma Inc., Los Angeles, CA, USA) 和 axicabtagene ciloleucel (Yescarta, Kite Pharma Inc.) 都使用GRV载体进行转导，而 tisagenlecleucel (Kymriah®, Novartis International AG, Basel Switzerland) 使用慢病毒载体进行转导。Brexucabtagene autoleucel 和 axicabtagene ciloleucel 都使用相同的病毒载体在MSCV启动子的控制下转导转基因有效载荷。Tisagenlecleucel 使用独特的LV载体，并且转基因在EF-1a启动子的控制下。尽管目前正在对其他采用T细胞疗法的基因转移技术进行临床评估，但还没有获得市场授权，这表明逆转录病毒载体作为细胞治疗应用的基因转移工具的重要性。所有EMA和FDA批准的疗法已在表1中列出。当前的自体CAR T细胞疗法协议已建立，并在图3中展示。这种自体方法代表了商业产品的可行选择，但需要进一步改进以满足全球需求。由于成本和生产能力，目前商业上可用的LV工程化T细胞疗法仅被视为对常规化疗、放疗和免疫治疗无反应或复发的患者第二、第三或第四线治疗选择。必须同时考虑改进生产LV载体和T细胞工程所需的生物工艺和技术，以改善患者获取。为解决流程瓶颈、增强功能性和提高LV工程化T细胞疗法的安全性，已提出最近进展。 细胞和基因治疗所涉及的物流包括患者材料的采购、生产、运输、调理和药品的储存，被视为使细胞和基因治疗成为一种可行治疗解决方案的主要瓶颈之一。目前在美国进行的22天生物工艺对包括欧盟在内的其他市场构成了重大挑战，因为在收到治疗之前，患者需要两次跨越大西洋运输他们的细胞，这突显了当前自体T细胞疗法方法所面临的物流问题。为缓解这一问题，诺华公司正在增加在法国和瑞士的生产能力。 欧洲药品管理局(EMA)优先药品计划(PRIME)和美国联邦食品药品监督管理局(FDA)突破性疗法认定已开发出来，以促进在临床前研究中显示出对当前护理标准有显著改进的药品的市场批准。这三种疗法都从这种加速评估中受益，因为这些疗法对B细胞恶性肿瘤显示出高疗效，并满足了未满足的临床需求。 Tisagenlecleucel在2018年获得了FDA和EMA的批准，用于治疗套细胞淋巴瘤(MCL)。T淋巴细胞通过慢病毒载体进行修饰，以转导抗CD19 CAR，然后修饰后的细胞再输回患者体内。第二阶段的临床研究仍在进行中(ELIANA, NCT02435849)，结果已公布，并计划在2022年11月完成。第三阶段(BELINDA, NCT03570892)目前正在进行，但由于成功的加速批准状态，tisagenlecleucel可以在完成之前商业化。来自抗CD19 CAR T细胞方法的令人鼓舞的结果导致增加了努力以标准化实验开发协议并预测临床要求。 4.3.限制、安全性和有效性 尽管CAR T细胞疗法在治疗血液癌症方面取得了初步的临床成功，但安全性问题和提高实体肿瘤的疗效仍然是需要解决的障碍。除了将慢病毒基因分离到单独的质粒DNA构建中以避免RCL生成外，还对慢病毒载体进行了几项修改以提高安全性。一种减轻CAR T细胞输注后不良反应发展的解决方案是包含含有“自杀基因”的转基因。“自杀基因”允许通过添加一种特定化学试剂来选择性杀死CAR T细胞，这种试剂对未修饰的细胞本身无毒。这项技术已进展到临床前和临床阶段。例如，针对多发性骨髓瘤(MM)的抗SLAMF7疗法包含了一个二聚化结构域与caspase-9结构域自杀基因的融合，以减轻非靶向激活的风险，因为SLAMF7在包括NK细胞在内的健康白细胞上表达。作者已在体外和体内显示出疗效，并且通过添加二聚化剂AP1903 (利米杜西)可以消除修饰的细胞。 CAR T细胞制造的另一个相关风险是其他细胞类型与转基因的转导。单个白血病B细胞的转导导致了接受抗CD19 CAR T细胞疗法tisagenlecleucel (Kymriah)治疗的患者中耐药转基因克隆的发展。这导致了在制造过程中由于CAR治疗基因的顺式整合而掩盖了目标CD19表位。尽管这是一个罕见的事件（当时治疗的369名患者中有1名），但使用具有广泛嗜性的整合载体可能代表一个严重的安全问题。用于这种疗法的载体使用了VSV-G包膜蛋白进行假型化，这赋予了载体广泛的嗜性。建议工程化更具体的嵌合包膜蛋白作为一种解决这个问题的方法。基于麻疹包膜的嵌合蛋白能够靶向仅在T细胞上存在的CD3受体。在人源化小鼠模型中的体内数据显示了这种载体的特异性，甚至允许体内基因传递以产生功能性CAR T细胞转导。尽管需要更多的工作，但这种方法可以解决体外转导期间潜在的非靶向转导问题。 已经报道了开发不表达CD19抗原的耐药淋巴瘤B细胞，导致CAR T细胞治疗患者复发的情况。为了解决耐药癌症的发展，提出了转基因工程。已经在体外测试了将两到三个CAR构建体引入每个工程细胞，并正在进行临床研究，以防止对CAR疗法产生耐药性的出现，取得了令人鼓舞的结果。 CAR表达水平被证明影响临床结果。仔细选择和设计驱动CAR基因表达的启动子，可以提高CAR表达。CAR转基因的不同组成部分，如跨膜和铰链结构域，也显示出影响CAR表达。优化嵌合受体内细胞和外细胞结构域设计的努力正在进行中。 尽管在治疗血液癌症方面取得了初步成功，CAR T细胞疗法在治疗实体肿瘤方面遇到了障碍，并且成功率有限。实体肿瘤的物理特性以及肿瘤微环境(TME)限制了CAR T细胞有效接触和杀死癌细胞的能力。经常引用的障碍包括细胞穿透肿瘤床的困难、肿瘤内恶劣的生理条件以及癌细胞产生的免疫抑制调节蛋白。这些障碍在血液癌症中不存在，因为它们不形成实体肿瘤癌症类型中看到的大肿瘤床，从而解释了抗CD19 CAR疗法所遇到的成功。最后，为了解决遇到的局限性和安全问题，已经提出了LV和RV载体的替代品。电穿孔就是这样一种替代品，它包括通过细胞传递电流引入pDNA。电流暂时在细胞中生成孔隙，并将带负电荷的mRNA通过细胞悬浮液并进入细胞。由于这种基因转移技术的非整合性质，可以提高安全性，因为随着mRNA的降解和通过细胞分裂的稀释，转基因的表达将逐渐减少。 尽管这些技术提供了安全优势，但长期疗效仍需要在人类试验中得到证明。 4.4.开发基于LV的CAR T细胞疗法研究工具 除了作为将CAR转基因转移到T细胞中的有效和安全工具外，LV载体还被用于开发体内和体外模型。开发体外和体内模型的一个重要部分是开发表达CAR T细胞疗法靶向的肿瘤相关抗原(TAA)的靶细胞。由于患者材料是稀缺资源，并且在伦理上不能在每个研究和开发研究中使用，因此永生化细胞系已成为测试CAR T细胞在临床前研究中性能的流行癌症模型。LV载体已被用于快速修改永生化细胞系，以获得稳定的靶TAA表达，并使用修饰的细胞开发体外杀伤测定，这对于证明疗法的效力和特异性至关重要。然后可以将相同的靶细胞系重新利用并移植，以在体内产生肿瘤模型，以研究疗法的安全性和有效性。小鼠模型在CAR T细胞疗法的体内测试中发挥了重要作用，并用于测试治疗效果和安全性的不同方面。小鼠模型可以分为四类：同系免疫能力，人类异种移植，免疫能力转基因和人源化转基因。所有这些模型都注入了人类或小鼠癌细胞系，以测试CAR T细胞，并且对于理解肿瘤发展和全身对疗法的免疫反应至关重要。提供证据表明在临床前阶段开发的疗法既安全又有效，也是进入人体临床阶段的先决条件。 4.5.开发整合LV的T细胞生物工艺仪器 自体CAR T细胞疗法已被证明是有效的；然而，仍有许多挑战需要解决。生物反应器制造商一直在设计符合GMP生产要求的平台，包括在封闭系统中进行特定适应性改造，以适应T细胞生物加工，例如德国哥廷根Sartorius的ambr 250，美国马萨诸塞州剑桥Aastrom Biosciences的Replicell™系统，瑞士巴塞尔Lonza的Cocoon，以及美国科罗拉多州Lakewood Terumo BCT的Quantum细胞扩增系统。这些系统中最受欢迎的是德国Bergisch Gladbach Miltenyi的CliniMACS Prodigy生物反应器平台。它是一种一次性、完全封闭且符合GMP的T细胞工程解决方案。这个生物反应器有一个培养室，包括一个用于介质交换和配方的离心机，并且可以在较低级别的洁净室环境中操作。该平台包括病毒载体应用线，允许T细胞疗法制造商将LV转导完全整合到生产过程中。它适合自体方法，因为规模仅适应于每个仪器生产单一剂量。尽管这种解决方案不允许规模化生产，但它代表了有希望的规模化解决方案，并且可以用于分散模型，其中剂量更接近或在临床现场生产。这项技术已在I期临床试验现场使用，研究了一种针对非霍奇金B细胞淋巴瘤的双重抗CD19抗CD20 CAR T细胞疗法。14天的生产过程完全整合了使用LV载体转导抗CD19/CD20 CAR基因。在治疗的8名患者中，所有治疗剂量都通过了释放标准，超过了输注所需的细胞数量，并成功给药。这些技术可以提供提高产品质量和生产灵活性的解决方案，并且还可以降低生产成本、物流复杂性和产品变异性。 4.6.使用LV载体的CAR T细胞异体方法 自体CAR T细胞疗法已被证明是当前治疗应用的有效策略。起始细胞材料直接来自患者，减少了与移植物抗宿主病(GvHD)相关的风险。此外，材料的自体性质不会导致产生抗HLA供体特异性抗体(DSAs)，这可能限制了整个器官移植和异体T细胞的剂量数量和体内持久性。尽管自体T细胞疗法已被证明更容易开发，但主要限制使这种方法难以扩大规模，以减少生产时间和成本。起始材料的变异性加上低细胞扩增潜力使得在自体T细胞扩增期间难以实现治疗剂量。这是由于从接受多条治疗线的患者中获取的材料的性质，这些患者在接受细胞疗法之前已经符合条件。此外，材料的自体性质意味着每个剂量都特定于每个患者，这排除了任何大规模生产选项，只留下了定制的规模化选项。由于所有这些限制，人们越来越关注一种一刀切模型中的异体方法。在这种情况下，材料将来自通用来源，如基因修饰的供体T细胞、脐带血(UCB)、胎盘、永生化细胞系或诱导多能干细胞(iPSC)衍生的T细胞，为大规模生产打开了可能性。目前，只有基因修饰的供体T细胞和永生化细胞系方法已经进展到临床阶段，因为干细胞衍生的方法仍需要进一步的临床前优化。 2015年，在伦敦大奥蒙德街医院对两名儿童进行了首次异体CAR T细胞疗法的概念验证人体测试。该技术结合了使用抗CD52血清疗法的淋巴细胞清除，然后在CAR T细胞输注之前使用UCART19技术。使用慢病毒载体引入抗CD19 CAR治疗基因，并使用转录激活因子样效应核酸酶（TALEN），这是一种基因编辑工具，用于敲除供体T细胞中的CD52和TCR基因，以避免淋巴细胞清除和避免GvHD。该研究结果显示，在异体CAR T细胞输注后，两名患者在输注后28天实现了分子缓解。UCART19由Cellectis独家授权给Servier，Servier赞助了两项I期临床试验，分别于2016年开始，2020年完成。共有7名儿童和14名成人患有B细胞急性淋巴细胞性白血病。两项试验的发表结果显示，最常见的副作用是CRS（91%）和神经毒性（38%），导致两例治疗相关死亡。总体存活率为55%，无进展生存率为27%。在UCART190初步成功的基础上，Cellectis、Allogene和Servier开始研究使用TCR和CD52 KO CAR T细胞以及抗CD52重组抗体治疗复发或难治性大B细胞淋巴瘤或滤泡性淋巴瘤。异体CAR T细胞（ALLO-501）的给药是在患者自己的免疫细胞使用氟达拉滨、环磷酰胺和重组抗CD52抗体（ALLO-647）进行淋巴细胞清除后进行的。这项技术目前正在22名患者（NCT03939026）的I期、单臂、开放标签试验中进行研究。2020年在美国临床肿瘤学会上提出的初步数据显示，ALLO-501和ALLO-647在19名患者中有12名（63%）产生了客观反应率（ORR），其中37%的有反应患者完全反应（CR）。 尽管异体T细胞供体方法显示出有希望的结果，但仍然需要更多的步骤来敲除或抵消可能引起GvHD的免疫原性T细胞生物学特征。将LV载体技术整合到最先进的异体CAR T细胞疗法生物工艺中，进一步证明了这种方法在T细胞工程中基因转移的相关性。如果正在进行的临床试验获得市场批准，对临床级LV载体的需求和全球供应的压力将进一步增加。这突显了改进工艺和技术以增加T细胞工程LV载体的生产和质量的必要性。 4.7.稳定生产慢病毒载体以满足载体需求增长 为了满足全球需求，已投入努力改进当前的LV生物加工协议，并开发技术以增加生产。大型制药公司一直在投资研究和开发旨在解决瓶颈的技术。一个主要限制是使用HEK293T细胞系生产的LV载体的规模。尽管这种HEK293T粘附细胞与质粒DNA LV系统的瞬时转染可以实现高滴度，但这种细胞系的粘附性质代表了传统规模扩大解决方案（如搅拌罐生物反应器生产）的障碍。近年来，人们尝试解决这种生产方法提出的几个瓶颈。已建议使用专用包装细胞系稳定生产LV载体，作为减少瞬时生产模型中需要大量GMP级质粒DNA的成本的潜在解决方案。在稳定包装细胞系（PCL）中，LV生产所需的病毒基因被稳定地转导到PCL基因组中。可以选择高滴度产生克隆进行载体生产。这种方法已经显示出一些令人鼓舞的结果，尽管与瞬时转染相比滴度仍然较低是一个主要障碍。除了稳定的PCL外，还建议开发HEK 293T细胞的悬浮变体作为替代方案。最近，Chen等人（2020年）在他们的细胞系中结合了悬浮和稳定方面，使用单一稳定转染构建体产生与瞬时转染系统相当的LV滴度。这项技术在搅拌罐生物反应器中进行了测试，提供了扩大生产的潜力；CAR T细胞疗法被引用为潜在应用之一。这项技术最初由意大利米兰的Telethon基因治疗研究所（TIGET）和美国旧金山的Cell Genesys开发，并在罕见疾病战略联盟下转让给GlaxoSmithKline，并获得了专利（专利号PCT/EP2016/078336），概述了未来商业化的潜力。 4.8.针对CAR T细胞疗法应用的专用慢病毒技术 除了提高LV载体的全球生产能力外，为CAR T细胞应用开发专用LV颗粒还可以改善疗法生物加工和生物功能。当使用LV载体进行基因传递时，激活T细胞对于实现高效率的转导至关重要。T细胞的激活还利用了免疫细胞在对抗原反应时自然克隆扩增的能力。T淋巴细胞的这种生物学特性被用来从通过白细胞分离术获得的初始样本中产生足够数量的细胞以治疗患者。这个过程通常使用与抗CD3和抗CD28抗体结合的磁性或聚合物珠子进行，如表2所示。LentiSTIM和RetroSTIM技术（专利号PCT/GB2016/050537）已经开发出来，结合了CAR T细胞的转导和激活。在LV载体从生产细胞出芽时，一些细胞蛋白被携带在病毒包膜上[144]。这种LentiSTIM颗粒是在表达抗CD3和抗CD28膜结合有丝分裂原的细胞系中产生的，随后在LV包膜从生产细胞膜出芽时出现在LV包膜上。同样的方法也被用来在LV包膜上表达生物素基团，以改善下游纯化。这项技术通过减少所需的试剂和工艺步骤以及提高载体纯度，简化了CAR T细胞的生产。 4.9.使用慢病毒技术替代CAR T细胞疗法的方法 TCR T细胞疗法是针对恶性肿瘤的CAR转导T细胞的替代品。这种疗法不是依赖于嵌合抗原受体，而是依赖于修改过的T细胞受体。T细胞被设计为表达具有特定亲和力针对目标抗原的TCR，这种疗法的生产过程与CAR T细胞疗法相同。TCR T细胞的主要优势是，工程化受体使用与未修饰T细胞相同的激活和免疫途径，从而降低了CRS和神经毒性的风险。Adaptimmune Therapeutics, PLC是特定肽增强亲和力受体（SPEAR）技术的拥有者，目前正在赞助或授权几项临床试验，用于治疗实体瘤癌症。SPEAR T细胞包含优化的TCR，并使用编码TCR转基因的慢病毒载体进行生产。首个完成的II期试验是由GlaxoSmithKline赞助的“重定向自体T细胞治疗晚期骨髓瘤”试验（NCT01352286），在第42天有20/25名患者（80%）达到客观反应率（ORR），1年后有11/25名患者（44%）。SPEAR T细胞也在Adaptimmune赞助的II期SPEARAD 1（NCT04044768）和2（NCT04408898）试验中进行临床测试，研究ADP-A2M4疗法治疗滑膜肉瘤、黏液性脂肪肉瘤和头颈癌。重新定向用于通用细胞因子介导杀伤或TRUCKs是另一种替代CAR的受体类型。有时被称为第四代CAR T细胞，TRUCKs已经开发出来，通过细胞因子释放改善CAR T细胞在实体瘤中的效力。当CAR与其目标抗原结合时，基因修饰的T细胞会释放特定的细胞因子，从而抵消肿瘤微环境（TME）的免疫抑制作用。TRUCKs目前正在进行临床研究，并可以提供改善实体瘤中CAR活性的答案。例如，针对转移性结直肠癌的抗EGFR-IL12-CART目前正在进行测试（NCT03542799）。已经开发了特定的慢病毒技术，使用单一慢病毒构建体转导所有生产完全功能的TRUCK所需的元素，进一步提高了这类基于T细胞的免疫疗法的吸引力。 除了嵌合抗原受体的替代品外，还考虑了新的T细胞亚群作为新的潜在治疗细胞。在新的候选细胞中，γδ T细胞、自然杀伤T（NKT）和调节性T（Treg）细胞被建议作为细胞过继治疗和慢病毒技术的有前景的替代细胞类型。γδ T细胞占CD3+ T细胞群体的1-10%。它们是一种高度保守的免疫细胞类型，已经显示出对过继T细胞治疗应用的吸引力。这些包括它们强大的移植物抗肿瘤（GVT）活性以及与异体移植的低GVHD潜力。一项追踪108名癌症患者在接受HSCT后长达3个月的免疫剖面的研究显示，高水平的γδ T细胞与显著更高的总生存率和无复发生存率相关。已经发布和开发了使用慢病毒载体培养和转导γδ T细胞的协议和专利，以包括未来生产的适应性，如无血清培养基培养。一些研究已经进展到I期测试，例如IN8BIO Inc.技术NC200临床试验研究使用慢病毒修饰的γδ T细胞靶向成人胶质母细胞瘤（GBM）。不变自然杀伤T细胞或iNKT细胞也被认为是CAR T细胞治疗的有前景的T细胞亚群。与γδ T细胞一样，它们是T细胞的罕见亚群，占循环PBMCs的不到1%。它们在免疫调节中发挥重要作用，并且已经显示出强大的抗肿瘤活性。iNKT的一个显著优势是能够在不引起GVHD的情况下移植它们，使它们成为“现成”应用的强有力候选者。iNKT细胞已在多项临床试验中使用，包括针对神经母细胞瘤等实体瘤的疗法。使用GRV载体将抗GD2 CAR构建体转导到iNKT细胞中，以靶向神经母细胞瘤。临床前数据对显示体内有效性且无显著毒性，这导致了临床阶段的进展。正在进行的I期临床研究调查CAR iNKTs称为GINAKIT细胞（NCT03294954）与抗体疗法联合治疗复发或难治性高危神经母细胞瘤在1至21岁患者中的有效性。iNKTs也在针对血液癌症的测试中，例如，针对复发、难治、高危B细胞肿瘤的抗CD19 CAR-iNKT疗法目前正在I期试验中（NCT04814004）。 调节性T细胞或Tregs是CD4阳性T细胞的一个亚群，其主要作用是控制免疫反应。与执行促炎功能不同，Tregs对其他免疫细胞类型具有抑制作用，控制对外国病原体的免疫反应并预防自身免疫疾病。Tregs已被建议用于新的有前景的治疗应用，并扩展了过继T细胞治疗的范围，超越了肿瘤学。由于它们自然抑制免疫反应的能力，这些细胞特别适合治疗自身免疫疾病和预防移植物受者的GvHD。首个人体Treg临床试验测试Sangamo CAR Treg产品TX200-KT02已获批准进行I/IIa期（2019-001730-34）。Tregs使用慢病毒载体转导，以表达针对受体的HLA A*2的CAR受体，并预防患有终末期肾病（ESRD）患者的免疫介导的同种异体移植排斥反应。 5.结论  慢病毒载体在基因修饰T细胞治疗的发展中发挥了重要作用。这些逆转录病毒载体代表了一种安全有效的基因转移工具，已经应用于CAR-T细胞疗法近期进展到市场所需的许多开发步骤。慢病毒载体不仅直接应用于CAR治疗基因的转移，还用于开发体外和体内测试所需的靶细胞。慢病毒载体在T细胞治疗发展中的重要性不仅体现在它们整合到T细胞治疗协议中，还体现在用于其制造的仪器设计中。疗法通过后期临床试验的进展和监管机构设立的快速通道计划的准入，以及生物技术和制药行业的积极参与，预示着T细胞治疗在肿瘤治疗武器库中的未来重要性。尽管已经提出了基因转移的替代品，但慢病毒和γ-逆转录病毒载体目前是基因修饰T细胞治疗制造最先进的方法。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

摘要：早期的基因治疗研究对于遗传性疾病的治愈抱有巨大希望，但各种基因毒性事件的发生导致临床试验暂停，对进展采取了更加谨慎的态度。遗传工程技术的最新进展重新点燃了人们的兴趣，导致2017年首个针对遗传突变的基因治疗产品获得批准。基因治疗（GT）可以在体内或体外进行。体外基因治疗方法具有优势，因为它允许在患者使用前对基因修饰细胞进行表征，并选择所需的特性。在此过程中还可以使用自体细胞，这消除了免疫排斥的可能性。本综述重点介绍了体外基因治疗的各个阶段、当前研究进展，这些进展提高了这一过程的效率和安全性，以及对人类免疫缺陷病毒（HIV）基因治疗研究的全面总结，其中大多数采用了体外方法。 1.引言 人类基因组的成功测序加深了我们对遗传性疾病和导致慢性及暂时性疾病状况的病理过程的理解。目前有超过5000种基因治疗产品正在针对各种遗传性、慢性和传染性疾病进行试验（https://clinicaltrials.gov/, 访问日期为2023年10月30日）。在开发基因治疗候选药物时，考虑一种有效的递送方法很重要，这将允许感兴趣的基因进行准确处理，在特定作用部位有足够表达，并持续预期的治疗效果，随后降解递送载体而不引起任何不良影响。由于存在引起严重不良反应的潜在危险，如肿瘤形成甚至基因修饰的生殖系传递，开发基因治疗产品（GTP）的过程非常严格，比其他治疗剂需要更长的时间。补充表S1总结了不同监管机构迄今为止批准的基因和细胞产品。最近发表了一篇综述，讨论了其中一些产品的发展。递送感兴趣基因的方法有两种：体内和体外（图1）。体内方法涉及将遗传物质直接递送到患者体内，可以是裸露的基因或封装在颗粒中。另一方面，体外方法涉及从患者或正常供体分离感兴趣的细胞，对它们进行遗传修饰，在某些情况下进行扩增，然后将它们给患者。因此，患者没有直接接触到转移载体。选择，即确保修饰的细胞相对于自然发生的缺陷细胞更优先植入患者体内，可以在给患者施用感兴趣基因之前或之后进行。最近发表了一些综述，强调了基因治疗在各个领域的应用：使用造血干/祖细胞（HSPCs）治疗造血障碍、遗传性皮肤病、神经系统疾病或中枢神经系统遗传性疾病和骨科疾病等。 图1. 体外递送感兴趣基因。使用Biorender.com创建。2.HIV基因治疗的治愈方法 由于存在对当前治疗有抵抗力的潜伏病毒库，因此获得HIV的治愈一直具有挑战性。这些病毒在转录上是不活跃的，但很大一部分具有复制能力。抗逆转录病毒治疗(ART)可能在潜伏病毒藏身的组织中吸收相对较差，如肠相关淋巴组织(GALT)和中枢神经系统(CNS)，这可能有助于这些部位病毒的持续存在。在停止ART后的几周到几个月内观察到病毒反弹。治愈的另一个挑战是HIV对免疫系统的影响：对HIV的体液反应差，中和抗体的产生不足，这通常在感染几个月后才会发生。此外，也有重建HIV特异性CD4+ T细胞的相对失败，这反过来又导致CD8+细胞毒性T细胞功能的降低。 因此，可以合理假设有效的治愈将旨在使潜伏病毒失活或移除，并重建免疫系统。基因修饰的细胞也应该能够抵抗持续的感染，治疗本身不应该引起严重的不良事件。为了重建或增强免疫系统的功能，已经在B细胞和T细胞的遗传工程方面取得了几项进展，包括嵌合抗原受体T(CAR-T)细胞治疗。图2提供了HIV治愈策略的总结。 国际艾滋病学会的多方利益相关者协商就HIV治愈目标产品的最低标准达成一致。临床疗效定义如下：维持病毒载量低于传播阈值(<200 HIV RNA拷贝/mL)，在研究的20%或更多人群中有效，平均每年复发率低于10%，缓解期超过2年，并且严重不良事件的可能性极小，如果有的话，即研究人群的不到1%。可能的治愈也可能需要结合不同的方法。 图2. HIV治愈策略。CRISPR—成簇规则间隔短回文重复序列；ZFN—锌指核酸酶；TALEN—转录激活因子样效应子核酸酶。使用Biorender创建。 为了实现对HIV的可能治愈，已经采用了四种策略。 第一种方法是干细胞移植，到目前为止已经治愈了六名患者：柏林患者、伦敦患者、纽约患者、“希望之城患者”、杜塞尔多夫患者和日内瓦患者。这些患者接受了造血干细胞移植以治疗恶性肿瘤。除了日内瓦患者外，所有患者都接受了与人类白细胞抗原（HLA）匹配的供体的干细胞移植，这些供体对于CCR5等位基因中的32个碱基对缺失（CCR5∆32）是纯合子。由于治疗的侵袭性、成本、发病率和死亡率，以及缺乏具有CCR5∆32的匹配无关供体，这种方法无法扩大到更广泛的人群，因此作为一种普遍适用的方法是不可行的。 第二种方法旨在从细胞库中移除所有活性潜伏病毒，实现无需ART即可检测到的血浆载量，因此提供一种无菌治愈。这种策略被称为“休克和杀死”方法，并已在早期阶段试验中进行了广泛研究。尽管目前这种治愈方法的形式并未采用基因治疗，但它已被包括在本综述中，以涵盖所有当前的HIV治愈方法。“休克和杀死”旨在使用潜伏期逆转剂激活潜伏病毒库中的病毒，这些逆转剂激活病毒转录，通过使用并行的ART阻止新细胞的感染，然后通过诱导凋亡、CD8+介导的溶解或通过体液免疫反应来根除感染的细胞。嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）细胞也可以被用来增强杀死感染细胞。 第三种策略旨在通过基因编辑根除整合病毒，使用基于核酸酶的工具或工程重组酶。基于核酸酶的工具包括CRISPR（成簇规则间隔短回文重复序列）、TALEN（转录激活因子样效应子核酸酶）和ZFN（锌指核酸酶）。也可以使用这些基于核酸酶的工具针对CCR5，使CD4+细胞对感染产生抵抗力，以及使用短干扰或短发夹RNA（siRNA或shRNA）沉默CCR5。基因编辑也可以通过工程重组酶进行，特别是针对HIV特异性长末端重复序列（LTR）的重组酶酶（TRE）重组酶。这是一种工程形式的Cre重组酶，针对5′LTR内的34个碱基对区域（称为loxLTR），从而在表达这种酶的感染细胞中去除整合的前病毒DNA。 第四种策略是“阻断和锁定”方法，旨在实现功能性治愈，即在不根除潜伏病毒的情况下保持其处于非活动状态，使血浆病毒载量保持在可检测水平以下。这是通过使用潜伏期促进剂永久沉默或编辑潜伏病毒库来实现的，这些潜伏期促进剂通过病毒启动子的抑制性表观遗传修饰“阻断”病毒转录并“锁定”病毒处于潜伏状态。 大多数HIV基因治疗研究使用体外方法。本综述将重点介绍体外基因治疗的各个阶段，并提供当前采用体外或体内基因治疗方法的HIV临床试验的总结。 3.体外基因治疗  在体外基因治疗研究中需要考虑的一个重要因素是将被修改以纠正特定疾病状况或遗传疾病的细胞来源。这些细胞可以是自体的，从患者自身获得，或同种异体的，从匹配的供体获得。自体来源是有利的，因为没有移植物抗宿主病的危险；然而，这可能不适合老年患者或严重疾病状况（例如，HIV，因为细胞可能是新感染的来源）。由于其自我更新和分化成几个谱系的能力，同种异体干细胞来源最近引起了更大的兴趣，尽管它们的使用存在局限性，如排斥、移植物抗宿主病和长期免疫缺陷。在临床前基因治疗研究中，可以从出生组织中获得干细胞，例如脐带血和胎盘。也可以从胚胎组织中获得干细胞，尽管这引发了伦理问题，或从诱导多能干细胞中获得。在临床研究中，可以根据患者的疾病状况从个体患者中获得细胞，或从与患者组织免疫兼容的供体中获得，或从其他细胞来源中获得，这些来源的细胞不太可能引发免疫反应，如由于缺乏或低表达HLA类I和II抗原而具有低免疫原性的胎盘细胞。体外基因治疗的过程包括获得这些感兴趣的细胞，对它们进行修改，并将它们给患者。为了确保修改后的细胞的有效和优先植入，使用各种调节和选择方法。 3.1.造血干细胞的来源 造血干细胞在单基因疾病和免疫系统疾病的基因治疗中很有用。造血干细胞（HSCs）和造血祖细胞（HPCs）负责产生成人血细胞，并以特定标记为特征（图3）。CD34抗原，一种细胞表面粘附跨膜糖蛋白分子，长期以来一直被用作HSCs的标记，以及其他功能，如增强细胞增殖、阻止分化、改善HSCs和HPCs的迁移以及促进淋巴细胞在淋巴组织中与血管内皮的粘附。这些细胞能够分化成各种谱系的功能性血细胞，并且具有自我更新的能力；即，它们可以在不分化的情况下产生女儿HSCs（图1）。 图3. 造血干细胞发展的层级结构。NK-自然杀伤细胞；DC-树突细胞。使用BioRender.com创建。3.1.1.骨髓来源的造血干细胞 基因治疗应用中常用的造血干细胞(HSCs)来源包括骨髓、脐带血、外周血，以及最近的胎盘。在骨髓中，成骨细胞影响造血的平衡。原始人类成骨细胞对骨髓来源的CD34+ HSCs的存活至关重要，因为成骨细胞恒定地表达粒细胞集落刺激因子(G-CSF)。同样，HSCs调节成骨细胞分泌IL-6、巨噬细胞炎症蛋白-1α和其他因素，以创造有利于造血的环境。基质衍生因子-1(SDF-1)及其受体C-X-C趋化因子受体4(CXCR4)是建立骨髓的重要决定因素。Tie2，一种受体酪氨酸激酶，也被发现在维持成年骨髓中的HSCs方面不可或缺。CD34抗原具有多个磷酸化位点，其中有两处是蛋白激酶C的位点，一处是酪氨酸磷酸化位点。 Panch等人的文章总结了从骨髓、外周血和脐带血中采集HSCs的方法。简而言之，从骨髓中采集HSCs通常在全身麻醉下进行，大约每公斤体重收集20 mL，且不超过1.5 L的骨髓抽吸液，从髂后或髂前缘收集。在进行该程序之前，可能会从患者身上采集血液，以便在抽吸过程中失去的血液可以重新注入。 3.1.2.外周血来源的造血干细胞 从外周血采集造血干细胞的过程需要几天时间。早期动员方案使用了细胞毒性药物，如环磷酰胺、伊达比星、依托泊苷、铂类和表柔比星；然而，这些药物的使用现在仅限于接受移植治疗恶性肿瘤的患者。目前，在移植患者中，粒细胞集落刺激因子（G-CSF）用于将CD34+细胞动员到外周血中，剂量为5-10 mg/kg/天，持续5至7天，目标是通过白细胞去除术采集至少2×106 CD34+细胞/kg体重。在G-CSF给药期间，血液中HSCs的浓度在3天后增加，大约在第5或6天达到峰值，然后在7天后开始下降。G-CSF的剂量由外周白细胞计数决定，外周CD34+计数是HSCs产量的良好预测指标。产量还取决于年龄、性别、基础条件和G-CSF剂量。G-CSF治疗并非没有挑战，患者可能会经历包括骨痛、头痛、疲劳、肌痛在内的副作用，以及在高风险个体中可能出现心肌梗塞和脑缺血。为了增强G-CSF的动员效果，可以使用AMD3100（Plerixafor，一种可逆的CXCR4拮抗剂）。CXCR4是基质衍生因子1（SDF-1）的受体，具有包括使HSC长期维持静止状态在内的多种功能。Plerixafor以240 µg/kg的剂量给药，在白细胞去除术前4至6小时，发现它可以改善CD34+细胞的采集，尤其是与G-CSF联合使用时。其他HSC动员剂目前正在开发中。 3.1.3.脐带血来源的造血干细胞 从脐带采集细胞涉及切断的脐带静脉穿刺，将血液排入含有抗凝剂的无菌袋中。通常，在过程中收集大约80至160 mL的脐带血（UCB）。CD34+细胞的产量范围为2至7×106/mL UCB，可能受到出生顺序（第一胎>第二胎>第三胎等）、出生体重甚至早期夹闭的影响。这种相对较低的产量限制了它们的应用。 3.1.4.胎盘来源的造血干细胞 人类胎盘最近作为干细胞来源而受到欢迎，因为胎盘干细胞抗原性低，没有伦理限制，并且是多能的。人类胎盘是生殖过程中首先发育的器官，有两个组成部分，胎儿部分（羊膜和绒毛膜）和母体部分（蜕膜）。从受精后6-7天出现到足月的胎盘发育已被详细描述。胎盘的作用是为发育中的胎儿提供营养物质并排除废物，具有各种分泌和免疫调节作用。它可以被划分为以下四个区域：羊膜上皮、羊膜间充质、绒毛间充质和绒毛滋养外胚层。胎盘有多种类型的干细胞，可以分化为造血和间充质组织（脂肪生成、软骨生成、成骨、肝脏、胰腺、肌肉、血管生成和神经生成），表达各种细胞标记，包括OCT4、SOX2和c-KIT等，这些标记也存在于胚胎干细胞中。胎盘HSCs缺乏或表达非常低的HLA类I抗原（HLA-A、HLA-B、HLA-C）和没有HLA类II抗原（HLA-DP、HLA-DQ、HLA-DR），这使它们适用于再生医学以及自体和同种异体移植。与骨髓细胞相比，这些细胞的免疫排斥机会较低，对凋亡有抵抗力，具有增强的细胞增殖和伤口愈合特性，并抑制如TGFβ等促纤维化因子。人类胎盘HSCs是胎儿来源（非母体），并且是CD34+和CD45-dim。用AMD3100（Plerixafor）以300 ug/L的浓度灌注人类胎盘，结果在灌注液中采集到的HSCs数量增加了六倍以上，这些细胞具有集落形成特性，缺乏内皮标记。间充质基质细胞是骨髓造血环境的重要组成部分，与HSCs共培养已被发现可以增强HSCs的增殖，特别是原始的CD34+和CD38-。 已使用脐带血和胎盘来源干细胞的混合物进行造血干细胞移植。已开发出各种协议来分离羊膜上皮细胞、间充质基质细胞和造血干细胞。所有协议都必须克服的一个主要障碍是生产大量具有所需细胞群高度纯度的细胞。 3.2.造血干细胞的分离、纯化和富集 为了确保基因校正细胞的优先植入，重要的是要富集具有构建体的细胞群，并对其进行纯化，以避免在培养过程中使用的蛋白质或其他分子的污染。已使用几种方法来富集HSCs。目前最常见的柱分离技术是德国科隆Milteny Biotech的磁激活细胞分选（MACS®）微珠分离技术（https://www.miltenyibiotec.com/ 于2023年6月4日访问）。在这种封闭系统技术中，微珠（超顺磁性氧化铁纳米颗粒）与CD34抗体偶联，用于磁性标记表达CD34+的细胞。将无菌细胞悬浮液装入MACS®（铁磁性）分离柱中，该柱放置在MACS®分离器的磁场中。在正选择技术中，标记的细胞被保留在柱中，而其他细胞则流过。然后可以从柱中洗脱CD34+细胞，一旦它被从由分离器产生的磁场中移除，就可以用于任何下游应用。也有用于分离CD133+细胞群和CD34+和CD38−细胞的微珠。Baldwin及其同事使用免疫磁珠富集CD34+细胞，然后用荧光激活细胞分选（FACS）对其进行分馏，以富集CD34+和CD38−细胞；另一方面，Radtke及其同事使用FACS分离CD34+、CD90+和CD45RA−细胞，发现这组细胞在表型上是HSC基因治疗的最明确目标，因为这些细胞推动了短期和长期的多谱系植入。他们使用GMP（良好生产规范）级流分选协议来分离这些细胞。这大大增加了所需的复杂性、成本和专业知识。在其他体外研究中，Kays及其同事使用MACS对细胞进行排序，这些细胞除了表达CD34+外，还表达CD105，即转化生长因子-β（TGF-β）受体复合体的组成部分，发现这些细胞富集了具有高植入和重聚能力的早期HSCs，即使在慢病毒转导后也是如此。Laje及其同事用信号淋巴细胞激活分子（SLAM）家族受体分子富集了注定要进行慢病毒转导的HSCs，发现这些细胞被有效转导并且与非转导细胞相比是稳定的。 研究表明，培养造血干细胞(HSCs)超过48小时会降低它们长期植入的能力，建议培养时间不应超过36小时，24小时是一个安全的时间段。Chen及其同事的一项研究发现，使用细胞因子（SCF、TPO和Flt3L）进行体外培养会导致线粒体氧化应激，从而导致丧失干细胞特性，并且CD34+/CD133+中的粘附GPCR G1阳性（ADGRG1+）群体可以在体外培养期间的氧化应激下富集功能性HSCs。 还努力减少培养过程中可能的污染源。重组人血清白蛋白（HSA），是从酵母中产生并用作GMP级组织培养基的组分，可能是其他不直接与白蛋白相互作用的蛋白质甚至色素和小分子的污染源。Wilkinson及其同事最近使用体外和体内小鼠模型发现，聚乙烯醇（PVA）可以作为HSA在培养小鼠和人类HSCs中的替代品，因为它支持HSCs的存活和生长，同时保持表型HSCs特征。PVA培养基中分泌因子的浓度较低，衰老相关基因表达较少，尽管PVA用于人类基因治疗的效果还有待评估。 3.3.使用感兴趣基因修饰造血干细胞 在考虑适当的载体进行基因传递时，需要检查要转导的细胞的特性和载体的特性；是否需要短暂或稳定表达基因修饰；以及在传递到组织时可能导致的“脱靶”效应。这些脱靶效应可能包括宿主-免疫反应和载体本身引起的免疫反应。用感兴趣基因修饰目标细胞可能面临各种挑战。例如，腺相关病毒载体由于阻碍核输入、解壳和第二链合成，因此不能有效转导HSCs。用VSV-G包膜伪装的慢病毒载体具有广泛的细胞嗜性，尽管由于缺乏或表达不足的LDLR受体（它通过该受体进入细胞），原始人类静息T细胞和CD34+细胞不能有效转导。另一方面，T细胞的激活提高了转导效率。在体内使用病毒载体进行基因治疗的情况下，对病毒的预先存在的免疫力可能导致基因修饰细胞数量的减少，这反过来又会限制体内重新填充的速率。转导和重新给药基因修饰细胞之间的时间间隔也至关重要，特别是对于可能分化并限制返回目标部位的干细胞。 为了保护它们的基因组结构，真核细胞具有防御机制，导致外来可移动元素或逆转录病毒的沉默，因此存在诱导沉默机制的可能性，这可能由于缺乏表达而使治疗基因失效。 4.通过病毒载体进行HIV基因治疗传递  用于体外基因传递的最常见病毒载体是慢病毒载体，因为它能够转导分裂和不分裂的细胞。最初，γ-逆转录病毒载体被用于基因传递；然而，它们靠近原癌基因整合并引起插入性突变的潜力变得明显。从那时起，已经多次尝试使病毒载体更安全、更有效地进行基因传递。选择病毒载体由要转导的细胞类型、病毒载体特性、感兴趣基因（转基因）的大小和期望的效果决定。下表1总结了不同病毒载体的载货量（插入大小）。 4.1.在HIV基因治疗中使用γ-逆转录病毒载体：并发症和提高安全性的方法 γ-逆转录病毒载体是最早用于有效基因治疗的病毒载体之一。这些载体以依赖细胞周期的方式转导活跃分裂的细胞，因此不转导静止的细胞。逆转录病毒最初是首选的载体，因为它们的使用导致转基因稳定地整合到宿主基因组中。然而，这一好处受到大约10%的患者观察到的一系列基因毒性事件的限制，表现为各种形式的白血病。例如小鼠白血病病毒，γ-逆转录病毒更倾向于靠近强增强子区域、转录起始位点、CpG岛和DNase-I高敏位点整合，并可能在靠近原癌基因时引起插入性突变。这些安全问题导致这些临床试验的暂停，因此，已经尝试提高它们的安全档案。现在已知，在逆转录病毒生命周期中，前整合复合体（PIC）与各种宿主转录因子相互作用，特别是溴结构域和外部末端家族蛋白（BET蛋白）和整合酶，导致整合到宿主基因组中。BET蛋白通过将病毒PIC系在宿主染色质上发挥作用，因此，开发不依赖BET的载体可以改变它们的整合档案。事实上，几个小组已经在细胞系和小鼠模型中证明了这种方法的有效性。另一种方法可能是修改整合酶，使其远离靠近原癌基因的整合。与慢病毒载体相比，创建自失活的RV载体的尝试不太成功，因为它们仍然保留着激活癌基因的能力。 4.2.慢病毒载体用于稳定基因表达：挑战和减轻这些挑战的策略 慢病毒是一类逆转录病毒，除了结构基因env、pol和gag外，还有辅助基因，如vpr、vpu、nef和vif，以及调节基因，如tat和rev。最著名的慢病毒是人类免疫缺陷病毒（HIV）。 工程化的慢病毒被认为是适合基因转移的，因为它们可以稳定地转导分裂和不分裂的细胞。与其他逆转录病毒的不同之处在于，大多数逆转录病毒的PIC需要核膜的破裂（在有丝分裂期间），以便允许进入细胞核，而慢病毒PIC通过核孔蛋白和importins的主动运输进入细胞核。PIC是病毒cDNA的组装，一些来自逆转录复合体的病毒蛋白和宿主细胞蛋白。逆转录后病毒DNA的整合是由整合酶和PIC介导的。一项研究发现，PIC更倾向于靶向靠近核孔的开放染色质区域，排除核内部区域和核纤层的周边区域。核周边的转录活跃基因与核孔复合体（NPC）相关，这影响了HIV-1基因表达。慢病毒更倾向于与积极转录的基因整合，整合模式得到目标细胞转录程序的支持。宿主细胞蛋白，晶状体上皮衍生生长因子（LEDGF/p75）直接与病毒整合酶相互作用，没有它，整合酶无法进入细胞核。现在已知LEDGF/p75将整合酶连接到染色质上。 4.2.1.慢病毒载体的演变 自从作为基因治疗载体被发现以来，慢病毒载体(LVs)经历了几次修改（见图4）。第一代LVs包括转基因构建、包膜构建和一个包含gag、pol和所有调节和辅助基因的包装构建。从HIV env改为VSV-G env或任何其他合适的病毒包膜（称为伪型化），允许有效转导多种细胞，尽管VSV-G导致静息淋巴细胞和HSCs的转导效率低下。第二代LVs包括转基因构建、表达VSV-G的包膜构建，以及包含gag、pol和调节基因tat和rev的包装构建。移除了所有辅助基因。第三代LVs在转基因构建中的病毒启动子中进行了修改，其中U3区域通过删除-418至-18的序列部分进行了修改，仅留下18 bp（移除了400 bp），因此创建了自失活(SIN)载体。因此，5′LTR具有18 bp U3、R和U5区域和一个PolyA尾。这使得载体仍然能够携带转基因盒，同时保持转录不活跃。U3被删除的部分被异源启动子替换，通常是巨细胞病毒（CMV）启动子或细胞启动子，如延伸因子1α（EF1α）。3′ LTR、U3区域也被删除，以防止在转染293T细胞过程中通过同源重组与5′LTR重组成完整病毒。载体构建还包含非编码域cPPT（中央多嘌呤区），这提高了RNA被包装进衣壳的效率，以及WPRE（Woodchuck肝炎病毒转录后调控元件），这增强了转基因的转录后处理。包装构建被分割成gag-pol构建和rev构建，删除了tat，因为它的转录激活环已从5′LTR中移除。因此，第三代系统由四个质粒构建组成，如图4所示。三个单独的包装构建降低了在质粒扩增和病毒载体生产过程中形成复制能力慢病毒的重组机会，并减少了启动子干扰相关问题的机会。第三代慢病毒构建通过修改携带转基因的质粒进一步重新设计，可以被认为是第四代慢病毒载体。在这个系统中，称为LTR1或PBS1（引物结合位点1），5′LTR已被移除，RNA信号（PBS-Y-RRE）被放置在3′LTR的下游。因此，这些信号在载体生产过程中存在，但在逆转录过程中丢失，并且不与转导的转基因一起复制，从而进一步提高了安全性。 图4. 慢病毒载体生成的进步。第一代构建包括转基因构建、伪型包膜（通常是VSV-G）和包含gag、pol和所有调节及辅助基因的包装构建。第二代载体与第一代载体类似，只是去除了辅助基因。第三代载体是自失活慢病毒载体，在U3区域有400 bp的缺失。第四代慢病毒载体去除了5' LTR，并将RNA信号(PBS-Y-RRE)放置在3' LTR的下游。RRE：Rev反应元件；PM：细胞来源或其他启动子；cPPT：中央多嘌呤区；VSV-G：泡状口炎病毒G型；WPRE：Woodchuck肝炎病毒转录后调控元件；Y：包装信号。Ch5'：嵌合5' LTR；PAS：引物激活信号。 4.2.2.优化慢病毒转导 有效的慢病毒转导人类细胞可能受到人类细胞产生的限制因子的限制，这些限制因子限制了慢病毒感染，如三部分基序蛋白5α(TRIM5α)、tetherin和载脂蛋白B信使RNA编辑酶催化多肽样3(APOBEC3)。其中一个被证明导致慢病毒基因传递到静息记忆T细胞效率低下的因素是限制因子SAMHD1（含α motif和组氨酸-天冬氨酸(HD)结构域蛋白1）。SAMHD1是一种细胞脱氧核苷酸三磷酸水解酶，阻止逆转录。HIV-2编码的vpx基因被发现可以抵消SAMHD1的限制能力。事实上，一项研究发现vpx在他们测试的所有条件下都增加了基因治疗传递，但当基因治疗针对逆转录前的步骤时效果最大。 优化体外培养条件是提高基因转移速率的有用方法。使用Polybrene、鱼精蛋白硫酸盐、Retronectin、热带增敏受体增强子、如Lenti-X accelerator的磁珠、Vectofusin-1、LentiBOOST和Staurosporine等试剂已被发现可以增强转导过程。使用胎牛血清(FBS)在用慢病毒载体转导CD34细胞时并不令人满意，因为它导致祖细胞的转导增加，但HSCs的转导减少。此外，由于对其异种成分产生抗体，存在免疫风险的担忧。已经开发了各种无血清培养基，适用于不同类型干细胞的转导，例如，加拿大温哥华干细胞技术公司的StemSpan无血清扩增培养基(SFEM)。将敲除血清替代品(KSR)培养基添加到StemSpan培养基中，已被发现可以提高原代CD34+细胞和外周血单个核细胞(PBMCs)的转导效率。 4.2.3.慢病毒载体沉默 像γ-逆转录病毒载体一样，尽管程度较轻，慢病毒载体也容易受到转基因沉默和转基因效率变异的影响，这是由于转基因与宿主基因组（染色体位置效应）中其直接基因组邻域的相互作用。一些宿主和载体特征被假设可以引起这种效应，包括DNA甲基化和组蛋白修饰，包括由多梳家族蛋白介导的修饰。可以隔离转基因免受沉默的策略包括使用更强的增强子启动子、脚手架/基质附着区域(S/MARS)，这些可以保护增强子免受DNA甲基化，和染色质域隔离子，这些可以抑制抑制性位置效应。 4.2.4.减少插入性突变的策略 已经尝试了各种方法来减少插入性突变的机会。一种策略是将整合导向远离原癌基因的“安全基因组港湾位点”。Schenkwein等人使用I-PpoI，一种来自黏菌Physarum polycephalum的二聚体18-20 KDa同源性内切核酸酶，将整合导向一个高度保守的位点，28S核糖体RNA。这是通过识别该区域的15 bp位点来实现的。另一种策略是通过改变整合酶核心结构域(D64、D116和E152)的催化三联体来生产非整合慢病毒载体。虽然消除了插入性突变的风险，但这些载体只能用于瞬时基因表达。基因表达也低于整合慢病毒载体。修改LEDGF/p75的功能，其功能是指导慢病毒整合，可以允许整合到更安全的区域或更随机的整合，从而减少靠近原癌基因的整合机会。 4.3.腺相关病毒载体(AAVs)：限制其使用的挑战 重组腺相关病毒是在临床应用中首选的载体，当需要短暂表达转基因（根据感染细胞的周转时间，从几个月到几年不等）时。这些载体不含病毒DNA，而是基于蛋白质的纳米颗粒，被设计为穿越细胞膜并将DNA送入细胞核。这些载体非常稳定，能够承受操作过程中出现的物理或化学挑战。病毒基因组也容易操纵，并且具有良好的安全档案。AAVs可以携带高达4.5 kb的转基因盒。然而，AAVs的主要挑战是它们在自然界中广泛存在，因此抗AAV免疫很高，12种已知血清型的中和抗体的流行率在某些人群中从20%到100%不等。这些载体的给药也可能引发治疗后的体液反应。正在应用各种策略来克服衣壳免疫、补体固定和AAV基因组感知。一种策略是通过合理设计、随机突变和衣壳重组来工程化衣壳，以防止衣壳中和。另一种策略是免疫抑制，即阻断涉及B细胞激活的经典途径，从而抑制体液反应，尽管体外基因治疗的体液反应可能有限。为了减少AAV基因组感知，可以通过耗尽载体基因组中的CpG二核苷酸来阻止TLR信号传导。腺相关载体可以用来转导多种细胞，包括间充质基质细胞、神经细胞等，尽管它们不适合造血细胞。 许多研究小组正在研究使用AAVs将广泛中和抗体送入骨骼肌，以提供针对HIV的持久效果，无论是作为预防还是治疗，或两者兼有。最近一篇综述文章分析了它们在HIV感染中的使用，以及当前挑战和可以采用的策略来克服其有效性的障碍。 4.4.体外细胞选择和扩增 根据转导的细胞类型、载体类型、感染倍增性(MOI)和使用的转导技术，转导的细胞数量通常低于理论上的预期。因此，转导过程不是100%有效。然而，有几种方法可以最大化转导效率。除了第4.2.2节中提供的例子外，使用高MOI可以产生更高的载体拷贝数(VCN)，尽管这增加了异常剪接事件的风险。通过色谱法纯化载体颗粒也可以增加转导效率。转导后，选择携带转基因的细胞并扩增这些细胞以增强它们在体内的植入是有益的。这可以通过细胞表面标记或设计载体表达抗生素抗性基因来实现，然后在应用适当的抗生素时，将允许优先选择携带转基因的细胞。 转导HSC的扩增目标是在保留“干细胞特性”的同时增加数量。通常支持分化为成熟谱系的传统培养基导致自我更新能力的丧失。体外基因治疗的体液反应可能有限。为了限制污染的可能性，最好使用无血清培养基进行HSC扩增。Tajer等人最近的文章总结了添加到培养基中以增强扩增的因素。已经使用了几种细胞因子和生长因子，包括SCF、FLt3配体、TPO（血小板生成素）、IL-3和IL-6，尽管由于IL-3刺激祖细胞的扩增而不是HSCs，它并不包括在某些培养基中。还发现其他化合物也很有用。这些包括前列腺素E2 (PGE2)，它通过改善HSCs的归巢和自我更新能力来增强HSCs的植入，和Stem Regenin 1 (SR1)，一种芳香烃受体拮抗剂，用于扩增人类和小鼠CD34+，尽管它也被发现更有利于多能祖细胞而不是长期重聚干细胞。这与UM171形成对比，UM171是一种嘧啶哌啶衍生物，它支持干细胞的扩增而不是多能祖细胞。因此，它们可以组合使用，以促进两种谱系的扩增。其他使用小鼠模型的研究表明，可以调节调节干细胞归巢和分化的信号通路。这些包括Notch信号通路、Homeobox基因、Wnt等。锌指转录因子Sall4的过表达导致HSCs（CD34+细胞）在体外和小鼠模型中迅速有效扩增（增加50倍）。 5.基因修饰造血干细胞的给药：增强基因修饰细胞的优先植入  HSC输注后造血重建的第一阶段（最多6个月）是由于承诺的祖细胞（短期HSCs），它们具有有限的自我更新能力。大约6个月后，CD34+克隆减少，第一波克隆重建耗尽，长期HSC逐渐接管重建，它们能够自我更新，其效果甚至在基因治疗后3年仍然存在。因此，短期HSC在早期阶段活跃，而长期HSC在这一阶段进入静止状态，并在短期HSC耗尽时激活。 5.1.清空造血干细胞壁龛的调理方案 在用于造血障碍的自体基因治疗中，目标是用宿主细胞替代有特定遗传缺陷的细胞。在HIV基因治疗中，目标是用有抗性的细胞替代易感染的细胞，或能够对抗病毒的细胞。干细胞壁龛允许维持干细胞并调节其功能；HSC壁龛位于骨髓和脾脏的血管周围。清除用于转导HSCs吸收和消除未转导细胞的壁龛的过程，也称为调理，传统上一直使用化疗和放疗进行，这对目标器官没有特异性。进行调理是为了耗尽壁龛中的造血干和祖细胞，以减少同种异体移植的免疫排斥机会，在恶性疾病的病例中治疗任何恶性肿瘤。调理方案可以分为清髓性调理（MAC）、非清髓性调理（NMA）和减低强度调理（RIC）。清髓性方案由烷化剂组成，有或没有全身照射（TBI），导致全血细胞减少症和1-3周内造血耗尽，不允许自体血液学恢复。因此，为了生存，需要干细胞支持。MAC方案与毒性有关，有时甚至死亡，特别是如果植入出现问题。毒性迹象包括器官衰竭、粘膜炎、骨髓抑制、继发性恶性肿瘤、肌肉骨骼疾病和心脏、肺、生殖和内分泌异常。接受MAC治疗的人群的长期死亡率也高于普通人群。 由于这些不希望的副作用，开发了较低强度的方案。较低的强度意味着可逆的骨髓毒性，与MAC诱导的不可逆骨髓毒性相比。这些方案是NMA和RIC。非清髓性方案引起最小的细胞减少症，不需要干细胞支持。另一方面，减量调理涉及将MAC方案的剂量至少减少30%，虽然它不会导致干细胞的消融，但仍然需要干细胞支持才能在临床上实用。这些调理方案的细节已经回顾过。尽管RIC毒性较小，但发现它对基因治疗的效率较低，因为它导致外周血细胞中基因标记较少，这可能是由于壁龛清除效率低下或对转基因的免疫耐受性诱导不充分。在基因治疗中，辐射或化疗药物的剂量由正在治疗的疾病状况和患者特征决定，包括年龄和性别。欧洲骨髓移植组（EMBT）风险评分是一个用于评估癌症患者移植风险的工具，也可以扩展到任何需要移植的患者。它基于五个因素：患者年龄、疾病阶段、诊断到移植的时间间隔、供体类型（就HLA分型而言）和供体-受体性别组合。通常，30岁以后使用MAC方案死亡率增加，50岁以后不推荐使用。如果供体和受体不是同一性别，也有更高的排斥风险。 5.2.基因修正造血干细胞的体内选择 为了改进携带转基因细胞的选择，在动物模型的体内研究中采用了体内化学选择技术。使用药物抗性基因进行体内选择转基因需要药物抗性基因在转导细胞中高度表达，在非转导HSCs中根本不表达或表达水平低；选择药物应该耗尽大多数非转导细胞，对非造血毒性很小，并且在非恶性条件下不具有遗传毒性。在动物模型中用于选择的基因，特别是在小鼠中，包括多药抗性基因(MDR1)、二氢叶酸还原酶(DHFR)、乙醛脱氢酶(ALDH)、胞嘧啶脱氨酶(CDD)、谷胱甘肽S-转移酶(GST)、甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶(MGMT)和次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HPRT)。 一项研究使用了O6-甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶(MGMT)的突变体，这是一种DNA烷基化修复酶。突变体MGMTP140K在非人灵长类动物中显示出稳定和有效的HSCs选择，尽管使用(Carmustine-BCNU，例如)的烷基化剂的致癌性质是一个缺点。另一项研究使用短发夹RNA(shRNA)敲除次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HPRT)，在这些小鼠模型暴露于6-硫鸟嘌呤(6 TG)时实现HSCs的选择。使用这种方法很有吸引力，因为它允许转导的HSCs自我更新、增殖和分化，该方法用于清除壁龛并使携带转基因的细胞优先植入。诱导药物抗性的shRNA仅长48 bp，用于化学选择的6 TG量低，尽管6 TG可能诱发白血性。该组使用MOI为1，在两轮连续病毒暴露后，未用生长因子预刺激以保持“干细胞特性”，实现了20-30%的慢病毒转导效率。 5.3.清除壁龛的最新发展 提高壁龛清除和促进转导细胞植入的最新发展是使用与能够清除壁龛的药物结合的单克隆抗体。这些方法允许针对性地清除HSC壁龛，因此减少了上述调理方案非特异性相关的副作用，并使携带转基因的细胞优先植入。例如，为了改进HSCs的选择，最初的小鼠研究使用了CD45-抗体药物偶联物(CD45-ADCs)，但很快意识到这些对HSCs并不特定，并导致淋巴细胞耗尽，因为CD45也存在于淋巴细胞和其他白细胞表面。使用CD117-抗体药物偶联物(CD117-ADC)，可以更具体地针对HSCs，在小鼠模型中使内源性HSCs耗尽超过99%。2019年报道这种技术效果的第一组使用链霉亲和素连接子将CD117与毒蛋白连接起来，并测试了其对NOD SCID Gamma(NSG)小鼠和非人灵长类动物的效果。另一组使用了抗人CD117 IgG1单克隆抗体偶联物AMG 191，发现其在非人灵长类动物中有效，目前正在进行1/2期临床试验。另一组将CD117+与鹅膏毒素(MGTA-117)偶联，发现其在患有急性髓细胞性白血病(AML)的小鼠模型中非常有效（耗尽了超过95%的HSPCs）。CD117在AML细胞中高度表达，这种方案被发现可以减少这些小鼠的肿瘤负担。 6.基于体外HIV基因治疗的临床试验  如前所述，HIV的基因治疗努力集中在使免疫系统更擅长履行其功能，或旨在沉默或编辑整合的原病毒，使其复制能力不足或使细胞对感染有抵抗力。已经进行了几项临床试验，旨在检查HIV基因和细胞治疗产品的效用和安全性。 6.1.基于细胞治疗的HIV临床试验 最早的细胞治疗研究之一创建了嵌合T细胞受体：CD4-Zeta基因修饰T细胞。这项早期临床研究（NCT01013415）的结果发现，尽管病毒库在各组之间没有差异，但在接受了基因修饰细胞的组中，HIV负担从基线有所下降，并且复发性病毒血症的患者趋势减少。AGT103-T是一种产品，可以恢复慢性HIV病患者的gag特异性CD4+ T细胞反应。最初的1期临床试验结果（NCT03215004）显示了一些有希望的结果。对参加研究的患者进行了白细胞去除术。一旦细胞被基因修饰并通过了质量控制测试，患者在基因治疗产品输注前一周用环磷酰胺进行了非清髓性调理，剂量为1 g/m2。AGT103-T修饰细胞以每公斤体重2到2100万细胞的剂量输注。即使在基因治疗产品输注后6个月，也可以观察到细胞的基因标记。没有记录到严重不良事件。 SB-728是一种锌指核酸酶(ZFN)介导的，CCR5修饰的，自体CD4+ T细胞产品。这项研究的各种版本发现，即使在重复剂量给药后，也没有发现严重不良事件。当使用环磷酰胺进行调理时，植入效果更好。其中一项研究发现，尽管病毒反弹有延迟，并且CD8+ T细胞反应改善了6个月以上，但对潜伏病毒库没有长期影响。另一项研究，NCT03617198，将CAR-T细胞治疗与ZFN CCR5修饰相结合，作为一种双重治疗方法，确保CD4+细胞对感染有抵抗力，并且同时能够检测和清除HIV感染的细胞。最后，NCT04648046使用了编码双特异性抗gp120 CAR分子的慢病毒载体(LVgp120duoCAR-T)来针对表达HIV gp-120的细胞。 6.2.基于通过逆转录病毒载体进行基因传递的临床试验 早期直接针对HIV的研究使用了逆转录病毒载体来传递抗HIV基因。在一项研究中，使用了同种基因T细胞（来自同卵双胞胎），使用逆转录病毒载体传递了细菌基因NeoR（NCT00001353）。这项研究的目的是证明，通过基因转导的同种基因细胞实际上可以通过成熟细胞的分裂，而不是前胸腺干细胞的分裂，持续数周至数月。在涉及双胞胎的一项研究中（NCT00001535），从血清阴性的双胞胎中获得了同种基因CD4+淋巴细胞，并用携带反义TAR或反义Tat/Rev RNA，反式优势Rev蛋白或两者结合的逆转录病毒载体转导。临床前研究表明，所有使用的抗HIV载体都抑制了HIV，反式优势Rev蛋白显示出更大的抑制作用。尚未发布临床试验的结果。涉及双胞胎的所有研究的长期随访（Gemini Study—NCT04799483）目前正在进行中。另一项使用逆转录病毒载体的研究，NCT00002221，从计划进行自体骨髓移植的非霍奇金淋巴瘤HIV阳性患者中获得了外周血CD34+细胞，并将这些细胞分成三个池。一个细胞池用含有两个核糖酶序列“L-TR/Tat-neo”的逆转录病毒载体转导，第二个池用对照载体‘LN’转导，第三个池保持未修饰细胞。然后将这些细胞重新输注回患者体内。尚未发布这项研究的结果。除了逆转录病毒载体观察到的插入性突变风险外，这项后续研究的成功也可能因携带治疗基因的细胞比例低而受到阻碍。 RevM10是HIV-1 Rev基因的优势负性突变体。使用逆转录病毒载体将这个基因转导入CD4+ T细胞，结果抑制了HIV复制，并持续了6个月。尚未发布在造血干细胞中研究RevM10的结果（NCT00003942）。逆转录病毒载体也用于传递MazF，一种Tat依赖性内切核酸酶基因，在1期研究中评估其安全性、耐受性和免疫原性。MazF源自大肠杆菌，选择性地切割mRNA中的ACA序列，这些序列在HIV中很常见。这项研究发现，单次静脉注射用MazF转导的自体CD4+ T细胞导致CD4+和CD8+细胞增加，这种效果至少持续了6个月。 核酸酶是催化RNA分子，可以针对任何具有NUX切割位点的RNA序列，其中N是任何核苷酸，X是A、C或U中的任何一个。在一项概念验证的1期研究中，Rz2，一种针对tat基因起始密码子附近GUA序列的核酸酶，通过逆转录病毒载体传递到同种基因外周血单个核细胞(PBMCs)中，这些细胞是从血清阴性双胞胎的基因修饰细胞中获得的，然后输注到血清阳性双胞胎体内。共有4名患者参加了这项研究，该研究表明基因标记细胞的持续存在，无论是短期（24周）还是长期（44个月），在此期间没有观察到严重副作用。在一项相关的2期基因治疗试验中，通过逆转录病毒载体将一种抗HIV核酸酶转导到自体CD34+细胞中，患者接受了tat–vpr–特异性抗HIV核酸酶（OZ1）或安慰剂。没有与OZ1相关的不良事件。尽管在主要终点（大约48周）时OZ1和安慰剂组之间的病毒载量没有统计学上的显著差异，但在40周时观察到了显著差异，并且直到100周，OZ1组的CD4+ T细胞高于安慰剂组。在长期随访研究中，NCT01177059，最初入组的68人中有18人完成了研究，其中7人有严重不良事件，包括各种类型的肿瘤（例如，基底细胞癌、霍奇金病、卡波西肉瘤、乳头状甲状腺癌、皮肤癌），这些最有可能是由逆转录病毒载体引起的。 6.3.基于慢病毒载体的HIV研究 在VRX496（Lexgenleucel-T）研究中，使用携带针对HIV包膜的抗HIV反义基因的基于HIV的慢病毒载体修饰自体T细胞。安全性和耐受性研究，NCT00295477，发现血液中的植入半衰期为5周。一些患者的基因标记细胞甚至在5年后还存在。这项研究表明，基因修饰细胞可以对HIV施加遗传压力。 另一项使用慢病毒载体传递抗HIV基因的研究结合了针对CCR5的短发夹RNA（shRNA），它阻止病毒进入，人/恒河猴嵌合TRIM5α，一种在进入细胞质时破坏病毒衣壳解壳的天然分子，因此抑制HIV感染，以及转录激活反应（TAR）诱饵，它通过结合病毒Tat并将其隔离，因此阻止其介导前病毒DNA的有效转录。这项临床试验的结果尚未发布。 在一组研究中，接受自体移植治疗淋巴瘤的患者被输注了用含有tat-rev shRNA、TAR诱饵和CCR5核糖酶（LV Rhiv7-shITAR-CCR5RZ）的慢病毒构建体修饰的CD34+造血干细胞。四名患者的早期结果表明，基因修饰细胞在输注后第11天植入，并且即使在24个月时，载体仍然存在，并且在病毒血症后选择基因修饰细胞。尚未发布各个研究的结果。 Cal-1是一种双重抗HIV基因转移慢病毒构建体，它传递一种沉默CCR5的shRNA（sh5），并在不同的启动子下，编码一种小肽抑制剂的序列，这种抑制剂可以防止HIV包膜与宿主CD4+细胞的融合（C46）。已在不同地点对Cal-1进行了几项研究。在NCT01734850中，对13名患者进行了Cal-1治疗，并评估了该治疗的安全性。Cal-1的临床前研究表明，该治疗有效且安全。在临床试验中，使用白消安调理来清除壁龛，以允许基因修饰细胞的植入。在两个接受白消安调理的治疗组中观察到严重和危及生命的不良事件，与单剂量白消安相比，双剂量白消安的副作用更严重。未接受调理的组没有严重不良事件。患者目前正在进行长期随访研究（NCT02390297）。与调理相关的毒性是成功传递基因治疗的常见挑战，因此开发更安全、更有效的方法来清除壁龛，以实现成功和稳定的植入是值得的。 这些临床研究表明，在实现足够植入的足够清除壁龛、使基因修饰细胞的生产和由于调理导致的骨髓毒性之间存在微妙的平衡。 为了帮助推进HIV治愈方法的临床前研究，例如使用si/shRNA的“阻断和锁定”方法的研究报告，解决这些挑战至关重要。这组临床前小鼠研究已经报告了通过si/shRNA成功沉默HIV，尤其是shPromA，它针对病毒启动子中的串联NF-KB转录因子位点，以诱导下游病毒基因表达的转录基因沉默和抑制性表观遗传修饰（见图2）。结合含有CCR5 shRNA的Cal-1载体，目前正在研究针对启动子的si/shRNA PromA，以开发针对宿主CCR5和病毒启动子靶标的组合HIV基因治疗。 7.基于体内传递的HIV基因治疗临床试验  采用体内方法治疗HIV的研究主要处于临床前阶段。体内方法涉及直接将基因治疗产品通过病毒载体（如腺病毒载体、腺相关病毒载体或非整合慢病毒载体）或非病毒方法（如纳米粒子）引入患者体内。体内方法可能无法提供持久的治愈，因为没有转基因与宿主遗传物质的稳定整合，并且需要优化特定细胞的传递，以减少脱靶效应的机会。通过重组酶或核酸酶系统的基因编辑，或使用RNA干扰或可能的CRISPR干扰的沉默机制，可以使用体内方法。 目前的临床试验包括使用leronlimab的研究，leronlimab是一种抗CCR5人源化IgG4抗体，通过与CCR5相同的附着位点（细胞外环2和N-末端结构域）结合，竞争性地抑制HIV env附着到CCR5。这种药物通过皮下给药，该组目前正在使用合成AAV载体进行传递。这项研究的几个版本—NCT00642707、NCT02175680、NCT02355184、NCT02483078、NCT02990858、NCT03902522、NCT02859961和NCT05271370—证明了产品的安全性和有效性，患者大多经历了轻微的副作用，并且在较高剂量的525 mg和700 mg时观察到效果。 CRISPR-Cas9技术用于HIV治愈 CRISPR及其CRISPR相关核酸酶9（Cas9）系统是一种基因编辑系统，通过导向RNA介导的基因组区域的双链断裂，然后通过非同源末端连接途径进行修复。最近发表了几篇描述HIV临床前研究的综述文章[222,223]。最近使用CRISPR-Cas9治疗HIV的临床试验是NCT03164135，该试验使用这项技术在进行异体干细胞移植治疗血液恶性肿瘤的患者中敲除HSCs中的CCR5基因。一名急性淋巴细胞性白血病患者的初步结果显示，完全供体嵌合体的缓解，并且敲除CCR5的供体细胞持续了19个月，没有基因编辑不良事件。然而，携带修改的淋巴细胞的百分比仅为5%，团队正在研究如何使过程更有效。另一种基于CRISPR-Cas9的HIV基因治疗产品是EBT-101（NCT05144386）。这种基因治疗作为单次静脉注射给药，并通过使用两个导向RNA靶向整合原病毒的三个位置的AAV传递。最近有三名患者参加了1期临床试验，该公司（Excision Bio Therapeutics, San Francisco, CA, USA）在2023年10月的欧洲基因和细胞治疗年会上提出的初步结果显示，没有剂量限制毒性或严重不良事件。 CRISPR-Cas 9可以用来靶向HIV-5′LTR，这是启动子区域，因此可以阻止潜伏病毒的复制或激活；CCR5或CXCR4区域，使细胞对感染有抵抗力；或促进HIV复制的限制因子，阻断它们的活性。虽然目前还没有CRISPR-Cas9基因治疗被批准作为HIV治愈方法，但FDA最近批准了第一种用于镰状细胞病的基于CRISPR-Cas9的细胞基因治疗方法，Casgevy（https://www.fda.gov/news-events/press-announcements/fda-approves-first-gene-therapies-treat-patients-sickle-cell-disease, 访问日期为2024年1月27日），突显了基因治疗的创新进步和CRISPR-Cas9作为HIV治愈方法的潜力。 8.结论  长期或永久表达抗HIV基因和修改CD4+和CD34+细胞以使它们对感染有抵抗力或允许破坏HIV生命周期是实现HIV治愈的重要策略。尽管联合抗逆转录病毒治疗的出现大大改善了患者的治疗结果和HIV感染者的生活质量，但治愈是可取的，特别是对于已经对当前方案产生耐药性的患者。至少提供功能性治愈的产品可能需要多重治疗剂与不同作用模式的组合，以最小化耐药性的机会，并且是长效的，或理想情况下需要单次给药。因此，至关重要的是要利用当前生物技术的进步来增强基因治疗方法，并使基因治疗产品更安全、更经济、更持久。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。