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撰文丨王聪 编辑丨王多鱼 排版丨水成文 肺炎是一种主要由病毒和细菌感染引起的常见疾病，每年有近2亿人患病，数百万人死亡。尤其是呼吸道病毒可通过气溶胶和飞沫传染，极易造成集群感染，对人类健康和社会稳定构成严重威胁。呼吸道病毒通过内吞作用进入细胞，在内质体中积聚并激活NADPH氧化酶2（Nox2）产生大量活性氧（ROS），导致大量促炎细胞因子的产生，进而诱发急性呼吸窘迫综合征、严重心肌损伤和呼吸衰竭。 目前，临床上主要用激素和免疫调剂来缓解临床症状，但这些治疗方法往往会带来较大的毒副作用。因此，亟需开发靶向性好、安全性高的病毒性肺炎治疗策略。 2024年11月26日，天津医科大学/天津大学郑斌教授与清华大学程功教授团队合作，在 Nature Materials 期刊发表了题为：Inhalable nanocatalytic therapeutics for viral pneumonia 的研究论文。 该研究开发了一种可降解且生物相容性好的铈基单宁酸（CeTA）纳米酶，并将其与一种自组装肽结合，创建了一种鼻腔吸入的纳米酶催化疗法（CeTA-GGGKLVFF-tk-PEG，简称 CeTA-K1tkP），用于治疗病毒性肺炎。 在这项最新研究中，研究团队开发的鼻腔吸入制剂作用机制涉及在活性氧（ROS）水平较高的炎症区域，CeTA-K1tkP上的硫酮键发生裂解，导致亲水性PEG脱落，多肽发生β折叠并形成纤维结构，大量靶向聚集至炎症部位。同时，这些结构中的CeTA纳米酶具有SOD、CAT多种类酶功能，能高效清除ROS并缓解炎症。 研究团队建立了甲型流感病毒（H1N1）和仙台病毒（SeV）诱导的小鼠肺炎模型，并进行了纳米酶吸入治疗。在病毒感染后，小鼠气管壁厚度明显增加，肺泡结构被破坏，肺泡壁毛细血管扩张，肺周围炎性细胞浸润明显增加。在纳米酶CeTA-K1tkP治疗后，过度氧化的环境显著改善，肺部炎症得到缓解。在由甲型流感病毒（H1N1）诱导的病毒性肺炎模型中，CeTA-K1tkP在炎症组织中发生响应性聚集，使纳米酶有效地分解ROS，并促进巨噬细胞极化为抑炎的M2型。ITC和分子对接实验结果表明，CeTA-K1tkP能分别与甲型流感病毒的血凝素（HA）蛋白以及仙台病毒（SeV）的血凝素-神经氨酸酶（HN）蛋白结合，具有一定的病毒广谱中和作用，有效降低感染小鼠的肺部病毒载量。因此，CeTA-K1tkP纳米平台为治疗以肺炎为代表的各种深部炎症提供了一种新的方案。 示意图：可吸入纳米催化疗法作用机制 智能响应纳米技术一直是改善炎症治疗和靶向给药的研究重点。基于多肽的生物自组装，该研究中开发的自组装的纳米酶炎症反应平台（CeTA-K1tkP），能在ROS大量产生的病理区域发生响应聚集，从而增强催化活性和清除超氧自由基的能力。CeTA-K1tkP平台对炎症性疾病具有广谱治疗的潜力，可通过多种方式给药对COVID-19、败血症、肠炎和关节炎等疾病表现出较好的应用前景。此外，这种基于炎症响应性多肽的可吸入纳米酶还可以替换成其他具有治疗作用的药物，如干扰素、抗生素、激素、中药成分等，优化治疗药物的给药靶向性，有效消除其潜在的毒副作用。总之，可吸入的炎症触发自组装纳米酶递送策略为治疗以肺炎为代表的各种深度炎症提供了一种前景广阔的范例。 天津医科大学/天津大学郑斌教授，清华大学基础医学院程功教授和天津中医药大学杨龙教授为论文共同通讯作者。天津大学博士生彭文畅、深圳湾实验室太万博研究员以及天津大学李博文博士为共同第一作者。该工作得到了国家自然科学基金、国家重点研发计划、天津市自然科学基金重点项目、中国老龄事业发展基金会、深圳湾实验室科研启动基金、深圳市“三名工程”、西南联合研究生院科技项目、新基石科学基金和腾讯基金科学探索奖的支持。 论文链接： https://www.nature.com/articles/s41563-024-02041-5 设置星标，不错过精彩推文 开放转载 欢迎转发到朋友圈和微信群  微信加群  为促进前沿研究的传播和交流，我们组建了多个专业交流群，长按下方二维码，即可添加小编微信进群，由于申请人数较多，添加微信时请备注：学校/专业/姓名，如果是PI/教授，还请注明。 点在看，传递你的品味

摘要：腮腺炎病毒（MuV）是一种高度传染性的副粘病毒，在全球大多数地区流行，并继续在高度免疫的人群中引起爆发。即使在麻疹、腮腺炎和风疹疫苗接种率高的国家，腮腺炎的爆发也归因于免疫力下降和Jeryl Lynn疫苗株（A型）与流行野生型病毒之间的抗原差异。为了获得亚单位疫苗，我们使用基于结构的设计方法，工程化腮腺炎融合（F）糖蛋白，使其在预融合构象（Pre-F）中稳定，以及由Pre-F与腮腺炎血凝素神经氨酸酶（HN）组成的嵌合免疫原；在小鼠中，Pre-F抗原和嵌合抗原均能引发对A型、G型和H型腮腺炎的强大交叉反应性斑块减少中和滴度。腮腺炎Pre-F的晶体结构在2.16 Å分辨率下验证了稳定策略，同时工程化了F的后融合形式作为对照。从小鼠中分离出针对腮腺炎Pre-F和HN的单克隆抗体；14个Pre-F特异性抗体中有7个，15个HN特异性抗体中有9个能够中和G型MuV，效力范围不同。此外，14个Pre-F特异性抗体中有7个能够中和A型腮腺炎。对Pre-F特异性抗体的结构和结合分析揭示了它们与四个不同的中和抗原位点的结合，而对HN特异性抗体的结合分析揭示了它们与五个不同的中和抗原位点的结合。总体而言，Pre-F和嵌合Pre-F/HN免疫原是有前景的候选物，可以增强MMR诱导的腮腺炎免疫力，或作为下一代疫苗。 重要性：腮腺炎通常是一种儿童疾病，可能会导致严重的医疗后果，包括腮腺炎、睾丸炎、脑膜炎、脑炎和耳聋。自2006年以来，在美国高度接种疫苗的人群中，腮腺炎病例出现了复苏，超过18,000人受到影响。促成因素可能包括免疫力下降以及疫苗与流行野生型毒株之间的抗原差异，这可能限制了抗体的有效性。F和HN糖蛋白的结构工程导致了预融合稳定的F和嵌合免疫原的鉴定，这些免疫原在小鼠中引发了针对多种腮腺炎病毒的高滴度中和抗体，与人类接种MMR疫苗后通常观察到的滴度相比。这些Pre-F和Pre-F/HN嵌合糖蛋白是有前景的腮腺炎初免系列或加强疫苗候选物。 在20世纪60年代末含有腮腺炎成分的疫苗引入之前，腮腺炎引起的广泛发病率特征为发热、腮腺炎，较少见的有睾丸炎、脑膜炎、脑炎和耳聋。腮腺炎的减毒活疫苗和随后的麻疹、腮腺炎和风疹联合疫苗（MMR）显著降低了全球腮腺炎的发病率。两剂MMR疫苗对预防腮腺炎疾病的有效性约为88%。然而，自2006年以来，在世界范围内高度接种疫苗的人群中腮腺炎病例数量有所回升，在美国有超过18,000个受影响个体。这一现象的原因尚未完全明了，但可能的因素包括免疫力下降、抗体反应的变异性以及疫苗与流行野生型毒株之间的抗原差异。近年来，与美国和欧洲爆发相关的主要腮腺炎基因型为G型。腮腺炎爆发研究表明，1:8的阈值滴度能够区分病例和非病例，1:16的中和抗体水平与2017年军事人员中腮腺炎爆发期间对临床腮腺炎疾病的保护相关。虽然中和抗体被认为是腮腺炎免疫的生物标志物，但迄今为止，尚未正式定义保护的免疫学相关性。 腮腺炎减毒活病毒疫苗是在55多年前通过在异种细胞和组织中反复传代而减毒开发的。然而，抗原特性和工程的最新进展允许更精确的疫苗设计方法，特别是对于肺炎病毒和副粘病毒的I类融合糖蛋白，如最近推出的呼吸道合胞病毒（RSV）的重组蛋白预融合稳定F疫苗。在这里，我们报告了腮腺炎G型Pre-F糖蛋白三聚体的设计和2.16 Å分辨率的晶体结构，以及与腮腺炎G型HN头部结构域融合的嵌合腮腺炎Pre-F三聚体（Pre-F/HN）的工程化。我们通过测量小鼠血清的中和活性和克隆小鼠单克隆抗体来评估这些设计作为免疫原。我们使用负染色电子显微镜（NS-EM）和竞争结合研究结构映射了疫苗诱导的抗体与预融合腮腺炎F糖蛋白三聚体的结合，并鉴定了四个不同的中和位点，这些位点不同程度地中和腮腺炎G型和A型。通过将斑块减少中和试验（PRNT）结果与竞争结合研究相结合，我们将疫苗诱导的HN特异性抗体映射到五个不同的中和位点，这些位点对腮腺炎G型和A型都有效。这些通过基于结构的设计开发的免疫原有潜力成为预防腮腺炎感染并发症的临床候选物。 结果 设计一种含有二硫键和膜近端卷曲螺旋稳定的糖蛋白，以提高可溶性前融合腮腺炎F三聚体的产量。由副黏病毒前F糖蛋白引发的中和效价比后F对应物更有效；因此，我们旨在开发一种前融合稳定的腮腺炎F糖蛋白三聚体。我们从NS-EM观察到，仅在C末端卷曲螺旋上具有GCN4三聚化基序的纯化天然腮腺炎F糖蛋白主要呈现后融合构象。我们利用前融合型副流感病毒5型（PIV5）F糖蛋白的晶体结构（PDB ID 4GIP, 4WSG）构建了一个腮腺炎F蛋白的同源模型，由三个交织的单体形成DI、DII、DIII和HRB结构域的四级组装。通过创建一个二硫键替换和C末端卷曲螺旋-GCN4连接位置的矩阵，同时将切割位点残基101-103突变为三个甘氨酸残基（Gly3），我们评估了蛋白表达水平和采用前融合或后融合构象的蛋白比例，使用NS-EM（SI附录，图S1 A和B）。虽然五种二硫键、切割位点突变和GCN4连接位置的组合产生了100%前融合三聚体，但只有一种组合导致了高产蛋白表达（V206C-A223C与476-GCN4和101KRF-101GGG）在Expi293细胞中约为4.8 mg/L（SI附录，图S1A）。这种设计的NS-EM 2D平均值（SI附录，图S1 B，顶部插图）与未稳定的476-GCN4腮腺炎后F糖蛋白三聚体（SI附录，图S1 B，底部插图）形成对比，与之前对副黏病毒F蛋白构象的观察一致。我们专注于表达量最高的前F设计，并进行了进一步的表征和免疫研究，以评估其作为疫苗候选物的潜力。 腮腺炎前F糖蛋白三聚体的晶体结构在2.16 Å分辨率下揭示了稳定的二硫键设计和多态性残基的位置。通过尺寸排除色谱法对腮腺炎前F进行分析，显示出单一峰值（SI附录，图S1C），在存在kifunensine和每个原聚体6个潜在N-糖基化位点（PNGS）被酶解糖基化（Pre-F-Δglycan，SI附录，图S1C）时，可以结晶。X射线结构在2.16 Å分辨率下（图1 A和B和SI附录，表S1和图S1 D-F）揭示了与PIV5和其他副黏病毒前F三聚体相似的整体架构。然而，腮腺炎前融合F三聚体的顶端采用了一个“封闭帽”结构，由N177-S184环组成，通过T178、Q179和N181之间的侧链相互作用形成，这在其他副黏病毒前F结构中未观察到（SI附录，图S1E）。六个糖基化位点N73、N182、N352、N427、N433和N457的剩余N-乙酰葡萄糖胺部分在电子密度图中可见，并构建了Man5糖基化模型（SI附录，图S1F）。V206C-A223C二硫键在电子密度中清晰定义，Cα-Cα原子距离为4.8 Å，而在同源后融合PIV3 F三聚体结构[PDB ID 1ZTM]中，Cα-Cα原子相隔5.8 Å。DI-DIII结构域包围了一个大的含水腔室，体积约为17,000 ų，原聚体埋藏了6,500 Ų的界面，与在PIV5、PIV3、尼帕、麻疹和朗亚前F结构中观察到的相似。 图 1. 基于结构设计的二硫键稳定的麻疹病毒前融合F三聚体。(A) 2.16 Å分辨率的前融合麻疹病毒F三聚体晶体结构，单体以白色、浅橙色、绿色和黑色显示，其中残基发生大于5 Å的构象变化以转变为后融合构象。GCN4三聚体化基序以红色虚线显示，连接到F残基476。放大的插图突出显示突变残基（红色），以稳定三聚体前融合F结构。(B) 单个前融合麻疹病毒三聚体单体，显示D1-D3亚区域和每个单体的六个N-糖基化位点（黄色）。(C) 基于后融合PIV3 F的后融合麻疹病毒三聚体模型，根据(A)着色，相对于(A)中的前融合三聚体顺时针旋转90°，也与麻疹病毒后融合F 6螺旋束晶体结构2FYZ（品红色）对齐。(D) 后融合麻疹病毒三聚体的一个单体与麻疹病毒后融合6螺旋束的一个单体（品红色）对齐。(E) 麻疹病毒基因型A-L融合糖蛋白序列的系统发育分析。(F) 麻疹病毒前融合F上的基因型变异结构图，显示A-J基因型变异和(G)基因型G与A[Jeryl Lynn (JL)]的比较，显示残基差异（红色）和糖基差异（青色）。 尽管腮腺炎F和HN在基因型之间的序列相似性相对较高（图1E和SI附录，图S1 G和H），我们将多态性变异映射到腮腺炎前F和HN的结构上（图1 F和G和SI附录，图S1 H和I）。将变异映射到所有基因型的前F上，特别是基因型G和Jeryl Lynn（基因型A）之间，大部分暴露于抗体识别的蛋白质表面是保守的（图1 F和G），而许多可变氨基酸位于前融合三聚体核心的含水腔室中。相比之下，腮腺炎HN二聚体结构揭示大多数多态性氨基酸暴露于溶剂中，包括Jeryl Lynn和基因型G HNs在N464位置的糖基变异（SI附录，图S1 H和I）。HN上溶剂暴露的多态性残基的主导地位与前F相比可能表明，接种Jeryl Lynn疫苗的人对基因型G腮腺炎感染的抵抗力可能更多地受到HN变异的影响。 腮腺炎前F和前F/HN嵌合抗原在小鼠中引发高滴度中和抗体。我们评估了腮腺炎前F引发中和抗体的能力，与其他腮腺炎免疫原相比。CB6F1小鼠（每组10只）在0、3和10周接种polyI:C佐剂的腮腺炎糖蛋白（图2A）。除了腮腺炎前F和后F，我们还测试了单体HN和由腮腺炎前F与基因型G HN可溶性头部连接的嵌合免疫原（前F/HN）（SI附录，表S2），这种设计在我们之前与尼帕疫苗候选物的工作中显示引发了针对两种表面糖蛋白的抗体。这种前F/HN设计从Expi293细胞中产量约为0.3 mg/L，在尺寸排除色谱法上单分散，显示出预期的组装从NS-EM（图2B和SI附录，图S1C）。尽管图2B显示了前F/HN设计的代表性二维类平均值，但在EM下观察到HN头部与前F部分相对于GCN4基序的多种不同排列，这是由于在GCN4基序和HN头部之间使用的柔性连接。 图 2. 后融合F、前融合F和Pre-F/HN麻疹疫苗设计的免疫原性。(A) 在CB6F1/J小鼠中进行三次免疫接种，每次剂量为10微克，使用Poly I:C佐剂，在0、3和10周进行，分别在2、5、12和16周采血，使用BLI和空斑减少中和(PRNT)试验进行评估。(B) 麻疹Pre-F/HN设计的负染色表征，显示Pre-F三聚体、GCN4三聚体化域和三个HN球形头域的结构。使用(C)麻疹前融合F探针或(D)HN球形头域探针对免疫小鼠进行Octet生物干扰仪结合滴定。(E) 对于后融合F免疫原（左侧，开放圆圈）、前融合F免疫原（中间，实心圆圈）和前融合F/HN免疫原（右侧，上半部分填充圆圈）的小鼠，在0、3和10周进行三次免疫接种后的麻疹PRNT滴度（箭头显示），以及基因型G病毒（橙色）、Jeryl Lynn基因型A病毒（绿色）和基因型H病毒（蓝色）的PRN滴度。 使用生物层干涉测量（BLI），在接种含腮腺炎前F免疫原的小鼠血清中检测到对前F的抗体反应（前F或前F/HN），与接种后F免疫的小鼠血清相比，结合水平略低，尽管与接种前F免疫的小鼠血清相比没有统计学差异（图2C）。重组HN单体只与HN免疫小鼠血清结合，然而，单体HN免疫小鼠显示很少的结合（同样在三剂后基因型G几何平均PRNT ID60值为1:119），而接种前F/HN免疫的小鼠血清显示大量的HN结合，表明HN的多价性驱动了强大的体液反应（图2D）。 为了评估中和抗体的引发，我们测量了接种腮腺炎后F、前F和前F/HN的小鼠的基因型G PRNT（图2E）。每次免疫后都观察到中和活性的增加，然而，第三次免疫与第二次相比，中和效价的增加很小（图2E）。在接种后F免疫后观察到中和抗体，然而，前F引发的中和比后F高出3.5倍和2.5倍，分别在第二次（几何平均抑制剂量(ID60值)分别为141和499）和第三次免疫（几何平均ID60值）分别为322和789，分别针对基因型G腮腺炎病毒（MuV）。在第三次免疫后，前F/HN嵌合蛋白引发的中和效价比后F高出12倍，比前F高出5倍，几何平均ID60值为3,926针对基因型G病毒（图2E）。前F/HN嵌合体引发的中和活性高于单独的前F（比较两剂后前F和前F/HN，在未配对t检验中，P值<0.0001；图2E）。 我们进一步评估了针对基因型A（Jeryl Lynn）和基因型H病毒的PRNT，以表征工程免疫原引发的交叉中和抗体。对于后F和前F，我们观察到对Jeryl Lynn病毒引发的中和水平高于对基因型G病毒，而对于前F/HN嵌合体，则观察到等效的PRNT。在第16周，前F和前F/HN组的血清显示出对基因型H病毒的强大PRNT，证实这些重组免疫原可以引发能够交叉中和腮腺炎三种不同基因型的抗体（图2E）。我们评估了在第三剂后6个月内对基因型A、G和H MuVs的中和活性的持久性，并发现虽然效价自然下降，但ID60在三个月后稳定。接种前F的小鼠在6个月后对基因型G、Jeryl Lynn和基因型H病毒的几何平均PRNT分别约为100、800和3200（SI附录，图S2A）。相比之下，接种前F/HN的小鼠血清的ID60 PRNT在第三剂后6个月对基因型G、Jeryl Lynn和基因型H病毒分别稳定在大约750、900和4300（SI附录，图S2B）。总体而言，腮腺炎前F/HN产生的中和效价高于单独的F，证明嵌合设计策略能够引发对腮腺炎两种表面抗原的反应，并从单一多肽免疫原引发强大的中和活性。 疫苗引发的单克隆抗体分析揭示了多样的前F和HN反应。在图2A中描述的初次免疫系列（第0、3、10周）之后，CB6F1/J小鼠在第18周用腮腺炎前F或腮腺炎前F/HN进行加强免疫。初次免疫系列和加强免疫之间的时间允许抗体反应的成熟和亲和力增加。我们生成了生物素化的前F和单体HN探针，用于单B细胞排序和测序。使用已建立的抗体小组筛选分离的脾细胞，以识别特定于包括的腮腺炎前融合F偶联探针或腮腺炎HN偶联探针的B细胞，通过荧光激活细胞排序（FACS）单细胞指数排序到96孔板中（SI附录，图S3 A-F）。对排序的B细胞的B细胞受体进行测序，以获得配对的重链和轻链序列（SI附录，表S3）。从接种前F和前F/HN的小鼠中分别获得了63个前F特异性和47个HN特异性配对的重链和轻链序列（图3 A和C）。鉴定、表达并测试了32个独特的前F特异性克隆型和21个独特的HN特异性克隆型，以进行抗原结合。选择了14种基因多样的F和15种HN单克隆抗体（SI附录，表S4和S5）进行生产，并测试了对基因型G腮腺炎的中和活性（图3 D和E）。在29种测试效力的mAbs中，有9/14 F和9/15 HN导向的mAbs的IC50值范围从0.05 µg/mL到160 µg/mL，针对基因型G或基因型A，其中两种HN特异性抗体显示出最高的效力约为0.05 μg/mL（图3 D和E）。 图 3. 麻疹前融合F特异性单克隆抗体的小鼠来源特征以及与负染色电子显微镜(mAb-preF复合物)结构的抗体表位交叉竞争结合。(A) 使用前融合F探针对前融合F免疫小鼠的B细胞进行排序，通过配对抗体重链和轻链测序鉴定出63个独特的小鼠克隆型。这些克隆型的频率在饼图中显示。合成、表达并评估了32个F特异性小鼠MuV单克隆抗体对Pre-F蛋白的结合能力。(B) 对表达的单克隆抗体进行前融合和后融合F蛋白的ELISA结合。星号表示通过PRNT证实具有中和作用的抗体。(C) 使用HN探针对前融合F/HN免疫小鼠的B细胞进行排序，鉴定出47个独特的小鼠克隆型。这些克隆型的频率在饼图中显示。合成、表达并评估了21个HN特异性小鼠MuV单克隆抗体对Pre-F或HN蛋白的结合能力。(D) 小鼠源麻疹前融合F特异性单克隆抗体的特征。(上图) 对前-F结合能力最强的14种mAb进行PRNT评估，确定对基因型G和基因型A(JL)病毒的IC50中和效力。(下图) 14种针对preF的抗体中有9种能够中和基因型G病毒或基因型A病毒(Jeryl Lynn)，效力范围从0.24 μg/mL到160 μg/mL。(E) 小鼠源麻疹HN特异性单克隆抗体的特征。(上图) 对HN结合能力最强的mAb进行PRNT评估，确定对基因型G和基因型A(JL)病毒的IC50中和效力。(下图) 15种针对HN的抗体中有9种能够中和基因型G病毒，范围不等，15种针对HN的抗体中有7种能够中和基因型A病毒，范围不等。 竞争BLI被用来将前F特异性抗体分成针对腮腺炎前F上不同重叠或不重叠表位的组（图4A）。根据竞争模式，发现四组前F抗体彼此竞争，而一种抗体没有显示出明确的竞争模式。NS-EM分析Fab-前F复合物揭示了多样的抗体-抗原结合模式（图4B），从顶端结合物（B2和C2）到更角的结合物（B4、E6、C4、H4、F1、E2）和两个侧向结合物（H5和F3）。NS-EM结果证实了竞争结合数据，例如，抗体B2和C2在前F结构的顶端结合相似，它们竞争；而抗体F3和H5显示出类似的结合模式，并具有可比的竞争概况（图4 A和B）。这种EM分析和竞争数据之间的对应关系适用于所有鉴定的抗体，包括B6，它结合在茎的下部，不与其他抗体竞争。值得注意的是，所有14种前F抗体被选为详细表征，除了茎结合抗体B6外，都结合在前F三聚体的膜远端表位，预计这些表位将经历构象变化以转变为后F（图1 A-D）。针对膜远端表位的强效中和抗体也类似地观察到其他病毒融合糖蛋白，如RSV F（31）和PIV3 F。抗体竞争和结构及中和分析允许定义四个不同的腮腺炎中和F特异性表位（腮腺炎F抗原位点1至4）在腮腺炎前F的膜远端区域（图4 A和B）。 图 4. (A) 抗体竞争表格显示了使用Octet干涉测量技术，将结合型单克隆抗体（列）与饱和有竞争抗体（行）的固定化preF结合的百分比抑制情况。抗体根据竞争组别排列，星号表示哪些抗体具有中和作用。(B) 负染色电子显微镜下的前融合麻疹F与被分为竞争组的单克隆抗体结合，具有中和作用的抗体以星号显示。在前融合麻疹F糖蛋白三聚体的膜远端区域识别出四个不同的中和表位（抗原位点1至4）。非中和抗体（除了B6，它结合分子的C末端卷曲螺旋）似乎与中和抗体以类似的方式结合前融合麻疹F。右下角面板显示了未结合的前融合F三聚体以供参考。抗原位点1至4根据mAb结合角度相对于F三聚体轴的相对位置进行排序。(C) 抗体竞争表格显示了使用Octet干涉测量技术，将结合型单克隆抗体（列）与饱和有竞争抗体（行）的固定化HN结合的百分比抑制情况。抗体根据竞争组别排列，星号表示哪些抗体具有中和作用。 基于竞争结合模式，鉴定了五个不同的HN特异性中和抗体位点（图4C）。与前F特异性中和抗体不同，HN中和抗体的结合位点重叠有限。有趣的是，四种非中和抗体（D9、A12、G11、H11）聚集并相互竞争，暗示腮腺炎HN上有一个免疫优势的非中和表位，这可能在未来的工程努力中被掩盖，以集中免疫反应到中和表位。 我们使用BLI评估了14种前F抗体对18种不同基因型的腮腺炎前F蛋白的交叉反应性结合，这些蛋白使用V206C-A223C和101KRF-101GGG突变以及476-GCN4的添加稳定在其前融合构象中（图5A）。我们观察到9种前F特异性抗体对所有测试的前F基因型都有交叉反应性（与前F的结合阈值>1.45）。一些抗体对特定菌株的结合减少或消失，例如，抗体G2不结合Albany基因型A菌株F，这可以通过建模映射到单个残基变化，T91（其他测试菌株中的丙氨酸）并在残基N89引入N-糖基化位点（图5 B和C）。这可能取消了G2的结合，鉴于其独特的抗体竞争概况，G2表位可以映射到包含残基89-91的区域。 图 5. 交叉反应性分析显示Pre-F特异性小鼠单克隆抗体广泛交叉特异性识别多种基因型F Pre-F蛋白三聚体。(A) BLI结合显示疫苗诱导的单克隆抗体对一系列来自基因型A至L的前融合稳定F抗原具有广泛的交叉识别能力。偶尔，一些菌株对抗体结合有抵抗力，但频率较低。(B) 来自不同菌株的F糖蛋白序列比对，突出显示奥尔巴尼基因型A中的独特残基。(C) 奥尔巴尼基因型A中独特残基的结构映射，揭示了添加到Pre-F上的糖基化影响了抗体G2。(D) 来自不同菌株的F糖蛋白序列比对，突出显示弗吉尼亚基因型H。(E) 将弗吉尼亚基因型H菌株的独特残基映射到前融合F三聚体晶体结构上，揭示了B4抗体结合的前融合F位点2区域存在多个残基差异。 抗体B4显示出对Virginia基因型H菌株前F的结合丧失，与其它测试菌株相比，该菌株有多个独特的氨基酸变化（图5 D和E）。比较EM分析中B4 Fab相对于前F三聚体的结合位置，S70、A239和A243这些残基群可能在抗体结合足迹内（图4B）。然而，与B4竞争抗原位点2的抗体E6和H3不受Virginia基因型H菌株前F的变化影响，表明这些抗体对位点的结合有微妙的差异。 讨论 人类接种麻疹、腮腺炎和风疹（MMR）疫苗后，Jeryl Lynn株腮腺炎的几何平均滴度（GMT）免疫中和试验（PRNT）约为220，基因型G腮腺炎为35。通过免疫重组融合前稳定化的腮腺炎F糖蛋白免疫原在小鼠中诱导的交叉反应性高PRNT表明，Pre-F比Post-F更有效地诱导中和滴度，这一点在呼吸道合胞病毒（RSV）、尼帕病毒（Nipah）和副流感病毒（PIV）1-4中已有先前的证明。我们证明了Pre-F/HN嵌合体比单独的Pre-F诱导更高的中和活性，这与尼帕病毒的类似抗原设计一致。尽管Pre-F/HN抗原从平衡的Pre-F和HN特异性血清抗体滴度中诱导出，但激发出一组遗传多样性的F和HN单克隆抗体，其中Pre-F特异性抗体在不同的表位和接触角度与糖蛋白三聚体结合。竞争映射使得在融合前三聚体的膜远端部分定义了四个离散的中和抗原位点，在HN蛋白中定义了五个离散的中和抗原位点。值得注意的是，尽管3号和4号位点的中和单克隆抗体（C5和F3）分别结合Pre-F三聚体的膜远端区域，这些都是Pre-F特异性的，而1号位点的中和单克隆抗体（B2和C2）结合Pre-F的顶端，但对Post-F也是双特异性的。腮腺炎融合前F三聚体的顶端采用封闭帽结构，接近明显的B2和C2单克隆抗体结合位点，因此，这些单克隆抗体的表位可能包括或依赖于顶端的原聚体间相互作用。需要进一步的工作来理解抗原位点特异性、结构以及糖基化和基因型变异对中和的影响，类似于对RSV的Pre-F蛋白所做的工作。 腮腺炎Post-F诱导相对较高的中和滴度，这是一些副黏病毒（如PIV-2和PIV-4）观察到的现象，但不是PIV-3、PIV-1或尼帕病毒Post-F；因此，可能腮腺炎Pre-F和Post-F上都保留了中和敏感表位。腮腺炎融合前特异性中和单克隆抗体的NS-EM，这些抗体结合Pre-F的膜远端区域，表明相当一部分中和表位存在于腮腺炎F糖蛋白融合过程中发生构象变化的结构域中。 比较接种Pre-F小鼠与接种Pre-F/HN小鼠的反应，HN组分诱导更好的中和活性（Pre-F与Pre-F HN PRNT分别为499和2,604，P值<0.0001，未配对t检验）。包含Pre-F组分与HN扩大了免疫反应，并呈现了更多的抗原位点多样性。值得注意的是，尽管大多数Pre-F抗原位点具有中和和非中和定向的单克隆抗体，HN抗原位点的抗体倾向于根据抗原位点是中和或非中和的。我们的发现与先前对另一种副黏病毒尼帕病毒的工作大致一致。尼帕病毒Pre-F/G嵌合体在mRNA和蛋白质平台上与单独的G相比，展示了优越的尼帕病毒特异性Tfh和其他效应T细胞的诱导能力，并增加了T细胞反应的广度和频率。当与两个糖蛋白的中和抗体活性结合时，嵌合体与每个单独的抗原相比具有优势。虽然我们没有评估我们的MuV设计中的抗原特异性T细胞反应，我们不能排除Pre-F在增强对HN组分的T细胞反应和扩大整体中和抗体反应中可能的作用。T细胞的作用将在未来的研究报告中评估。 由于在接种两次MMR疫苗的个体中发生了腮腺炎暴发，因此需要对当前的腮腺炎疫苗进行创新，以减少疾病发病率和减轻公共卫生资源的负担。免疫实践咨询委员会（ACIP）建议在腮腺炎暴发环境中有感染腮腺炎风险的个体接种第三剂腮腺炎疫苗，与接种两剂MMR的个体相比，接种第三剂MMR的个体感染腮腺炎的风险降低了78%。然而，第三剂的反应可能受到先前免疫的抑制，中和滴度的增加非常有限且短暂。本文描述的亚单位蛋白疫苗候选物可能提供了一种在腮腺炎暴发环境中替代MMR接种的疫苗方式。 为了保护免受多种病毒血清型的侵害，已经需要多价疫苗，例如，黄病毒疫苗（登革热病毒血清型1至4）、流感疫苗和HPV疫苗。包含腮腺炎病毒粒子上两个关键中和抗体靶标的Pre-F/HN嵌合体能够激发对腮腺炎基因型A、G和H的强大交叉基因型中和反应，因此可能是大多数或所有流通的全球腮腺炎毒株的疫苗候选物。将基于结构的方法与遗传传递和佐剂技术的进步结合起来，可能提供一种有效的腮腺炎疫苗，可以提高接受者的免疫滴度并保护免受反复腮腺炎暴发的侵害。这些免疫原产生的抗体反应是否能够提供对疾病的保护，仍然是一个重要的问题，因为腮腺炎感染的保护相关因素仍然不清楚，T细胞免疫的作用也不清楚，尽管中和抗体滴度似乎与保护相关。需要进一步的临床前和临床测试来确定这里描述的疫苗候选物对腮腺炎消除工作的贡献潜力，无论是作为增强剂还是下一代人类腮腺炎疫苗的主要类别。 材料和方法 基于PIV5 F融合前结构（4GIP和4WSG）和PIV3 F融合后（1ZTM）结构设计了预融合稳定腮腺炎F突变体，并通过负染色电子显微镜（EM）评估了设计。使用带有His6-strepTagII标签的Expi293细胞表达蛋白，并通过尺寸排除色谱纯化蛋白。CB6F1/J小鼠被免疫以评估腮腺炎糖蛋白免疫原佐剂Poly I:C诱导中和抗体的能力。如前所述，通过FACS排序和重链与轻链的退化引物扩增分离小鼠抗体。进行了腮腺炎基因型A、G和H的PRNT测定，以确定血清和单克隆抗体的效力。更详细的信息在SI附录，材料和方法中提供。 数据、材料和软件可用性。腮腺炎Pre-F蛋白的原子坐标已存入蛋白质数据库（PDB），登录号为9DRQ。所有其他研究数据包含在文章和/或SI附录中。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

摘要:佐剂是添加到疫苗中以增强产生的免疫反应的材料，是疫苗的重要组成部分，但很多时候被忽视。虽然疫苗总是包含一个抗原来告诉身体要接种什么，但同样重要的是，佐剂提供了如何产生一个完整的反应的重要因素。佐剂领域的发展一直很慢，20世纪30年代首次在获得许可的疫苗中使用佐剂，并且在接下来的80年里一直是获得许可的疫苗中唯一的佐剂。然而，随着疫苗成为抵御新的和复杂病原体的前沿，设计有效疫苗时考虑所有组成部分是很重要的。在这里，我们总结了获得许可的疫苗中佐剂的使用情况，以及临床试验中新型佐剂的使用情况，特别关注所使用的材料及其对免疫反应的影响。我们讨论了五大类佐剂材料：铝盐、纳米颗粒、病毒载体、TLR激动剂和乳液。对于每一类，我们深入探讨了当前的临床试验空间，这些材料对疫苗接种的影响，以及它们可以改进的一些方式。佐剂为改善疫苗反应和稳定性提供了一个激动人心的机会，这篇综述将有助于了解这一领域的当前进展。 转化影响声明：在COVID-19大流行之后，针对传染病的疫苗成为了焦点。虽然抗原一直是疫苗设计的重点关注对象，但佐剂是增强疫苗免疫反应的重要工具，大部分尚未得到充分开发。本文广泛回顾了佐剂的历史、当前疫苗佐剂领域以及临床试验中佐剂的进展。特别强调了佐剂的材料格局及其作用机制。展望未来，尽管新型疫苗佐剂领域具有令人兴奋的新技术和材料，但仍需要更多的东西来满足新的和复杂病原体的保护需求。 1.引言 疫苗接种是对抗传染病的重要公共卫生策略。疫苗通过使用抗原训练免疫系统，从而让身体产生针对特定抗原的抗体和/或特定抗原的T细胞的免疫反应。抗原和佐剂是疫苗的两个基本组成部分。抗原向免疫系统传达“要对抗什么”，而佐剂则增强免疫反应的强度。佐剂还可以提供额外的好处，包括减少所需抗原剂量，这提供了成本和依从性的好处。 自1926年Alexander T. Glenny发现铝盐（alum）作为佐剂以来，佐剂在疫苗中一直很常见。它被用于20世纪30年代美国食品药品监督管理局（FDA）批准的白喉和破伤风疫苗中。从那时起，alum就被添加到许多疫苗中以增强免疫反应。然而，尽管研究不多，直到2009年才有除了alum之外的其他佐剂被用于许可的疫苗中。由于佐剂材料的缺乏，许多疫苗设计时使用了减毒活病毒（例如，麻疹、腮腺炎和风疹疫苗以及水痘疫苗），以利用它们固有的佐剂特性；但它们对免疫受损个体构成风险。此外，许多疫苗使用了无佐剂的灭活（杀死）病原体（例如，季节性流感和脊髓灰质炎疫苗），这些疫苗单独使用可能难以实现效果。由于这些困难，以及20世纪80年代出现的重组蛋白抗原，其免疫原性低于减毒活病毒和全杀死抗原，佐剂创新的重要性变得更加明显。自2010年代以来，随着几种大流行病（如埃博拉、寨卡和COVID-19）的出现，FDA许可的疫苗中添加了几种佐剂材料，许多其他佐剂也在临床研究中，佐剂创新呈上升趋势。在这里，我们提供了针对传染病疫苗接种的当前临床佐剂景观的概述。我们重点介绍了FDA许可疫苗中的12种佐剂，并讨论了300多项疫苗佐剂的临床试验。本综述中的佐剂被广泛定义为与抗原分开的成分，它产生免疫反应，这允许评估脂质纳米颗粒和病毒载体等抗原载体，尽管它们不被CDC认定为佐剂。本综述的主要目的是向读者提供当前疫苗佐剂的临床景观，这可能指导未来开发更安全、更有效的佐剂的努力。 2.许可疫苗中的佐剂 自2010年代以来，许可疫苗中使用的佐剂迅速发展，在此之前，铝盐是唯一被许可疫苗中的佐剂。随着我们对免疫学和疫苗学的了解不断发展，更多具有不同作用机制（MOA）的材料被开发出来。到目前为止，FDA许可的疫苗中已经使用了12种佐剂（表1）。在这里，我们回顾这些产品并强调它们的适应症。 2.1.铝盐 自20世纪30年代以来，各种形式的铝盐一直占据着佐剂领域的主导地位。它最初是在Glenny用铝钾硫酸盐纯化白喉类毒素时偶然发现的，发现含有铝盐沉淀物的疫苗导致了更强的抗体反应。目前有四种类型的铝盐用于疫苗——氢氧化铝（AH）、磷酸铝（AP）、硫酸铝钾（alum）和无定形羟基磷酸硫酸铝（AAHS），其中AH和AP在许可疫苗中使用最多。AH是通过将铝溶液与氢氧化钠混合制备的，形成结晶铝羟氧化物。结晶度影响其吸收能力，由小晶体组成的AH具有更大的表面积和更强的吸收能力。AP是化学上无定形的羟基磷酸铝，是通过将铝盐溶液与三钠磷酸盐溶液混合或通过将铝盐与磷酸盐溶液混合并用氢氧化钠沉淀来配制的。与AH不同，AP是非结晶的，其吸收能力通常由缓冲条件和起始材料的组成决定。除了结晶度，还存在粒径和形状的变化。AH以长形颗粒的形式存在，平均计算尺寸为4.5×2.2×10纳米，而AP是大约50纳米的片状颗粒。尽管它们具有不同的物理化学特性，但由于它们在临床上验证的效力和安全性，含铝佐剂已被用于许多疫苗中，以特别增强体液反应，并继续在活跃的临床试验中使用（表1和图1b）。 2.2.AS04 AS04在2009年获得FDA批准，并由葛兰素史克（GSK）开发，用于HPV疫苗Cervarix。这种佐剂仍然使用氢氧化铝作为关键成分之一，但它还添加了一种Toll样受体（TLR）4激动剂，单磷酸脂A（MPL），被吸收到铝颗粒上。MPL是脂多糖（LPS）的一种纯化和解毒衍生物。LPS由许多革兰氏阴性细菌产生，并存在于它们的外膜上，使它们能够被免疫系统识别。脂质A是LPS的主要毒力因子，使其成为操纵成激动剂的理想选择。对于AS04，MPL衍生自Salmonella minnesota R595菌株的LPS。在临床前开发中，发现200纳米的颗粒大小是理想的，每剂含有50微克的MPL和500微克的氢氧化铝。添加MPL被证明能够产生比仅含铝的疫苗更强大、更持久的免疫反应（尤其是细胞免疫反应）。这在很大程度上是由于MPL能够通过激活抗原呈递细胞（APCs）和增加炎症细胞因子来诱导早期免疫反应。 2.3.AS03 AS03由GSK开发，用于H1N1疫苗，并在2013年获得许可使用；然而，这种疫苗目前在美国储备中，且AS03不在当前接受的任何疫苗中。这是第一种在许可疫苗中使用的不含铝的佐剂，属于油包水乳液新型佐剂。AS03包含角鲨烯（21.38 mg/ml）、Tween 80（9.72 mg/ml）和（D,L）-α-生育酚（23.72 mg/ml），配制在磷酸盐缓冲液（PBS）中。AS03的粒径约为150 nm，这被认为有助于抗原呈递细胞（APCs）的摄取。与铝盐相比，AS03诱导更强的抗原特异性抗体和T细胞反应，以及更高水平的细胞因子和免疫细胞募集到引流淋巴结。在配方方面，（D,L）-α-生育酚增强了AS03诱导的免疫反应的幅度，这将在本综述后面讨论。 2.4.MF59 MF59用于季节性流感疫苗（Fluad和Fluad Quadrivalent），在1997年获得欧洲许可后，于2015年获得FDA许可。目前，MF59佐剂的季节性流感疫苗仅用于65岁及以上的人群，以补偿他们减弱的免疫反应。这种佐剂由诺华公司开发，也是一种类似于AS03的油包水乳液。MF59由角鲨烯（4.3%）和两种表面活性剂，Tween 80（0.5%）和Span 85（0.5%），在柠檬酸缓冲液中组成，粒径约为160 nm。MF59可以通过在注射部位产生免疫能力环境来增强细胞和体液免疫反应，并且依赖于配方中的所有三个组分协同工作以产生最强大的免疫反应。 2.5.外膜囊泡 OMVs并不被传统定义为佐剂，因为它具有载体能力；然而，它们固有的佐剂特性在它们添加到配方中很重要。OMVs源自革兰氏阴性细菌的外膜，形成约25-250 nm的球形囊泡，展示许多细菌抗原和蛋白，可以作为TLR激动剂。这项技术仅被许可用于一种脑膜炎球菌B群疫苗，Bexsero，由诺华公司开发，然后被GSK在2015年美国批准前收购。各种革兰氏阴性细菌自然产生OMVs以应对压力，但也可以通过用于Bexsero的洗涤剂提取法获得。在Bexsero的情况下，OMV与重组蛋白抗原一起传递，并提供自身的固有抗原成分，主要的是PorA，因为它源自N. meningitidis细菌。OMVs的一个主要优势是它们同时表达的细菌抗原和自然存在于它们上的强效TLRs，这使得OMVs成为先天免疫反应的强大驱动力。Bexsero还与氢氧化铝配方，以增加佐剂效果。 2.6.AS01B AS01B是另一种组合佐剂，由皂苷QS-21和TLR4激动剂MPL的脂质体配方组成，大约100 nm大小。这种佐剂用于2017年FDA许可的带状疱疹疫苗（Shringrix），以及WHO预认证的RTS,S疟疾疫苗。虽然MPL之前在AS04佐剂系统中使用过，但这是首次在许可疫苗中使用QS-21——一种从南美树木Quillaja saponaria Molina树皮中提取的皂苷分子。QS-21特别被发现可以调节先天免疫系统，从而增强抗原特异性抗体反应和CD8 T细胞。以脂质体配方的QS-21仍然被用来传递许多TLR激动剂，将在本综述的TLR激动剂部分进一步讨论。当一起配方时，MPL和QS-21协同工作以增强对抗原的免疫反应。 2.7.CpG基序（1018和7909） 未甲基化的CpG基序，CpG 1018和CpG 7909，是两种TLR9激动剂，用于之前许可的疫苗中。CpG 1018首次在2017年用于许可的乙肝疫苗Heplisav-B中；CpG 7909则在2023年7月用于许可的炭疽疫苗Cyfendus中。CpG基序由中心未甲基化的CG二核苷酸和侧翼区域组成，源自合成的寡脱氧核苷酸（ODN），模仿细菌DNA。细菌DNA代表一种强大的病原体相关分子模式（PAMP），激活先天免疫系统。在感染期间，细菌DNA中高比例存在的未甲基化CpG基序与免疫细胞上的TLR9相互作用，触发保护性免疫反应。通过合成复制细菌DNA和分离特定触发特定免疫反应的合成未甲基化CpG基序，CpG 1018和7909是具有特定TLR9激活能力的佐剂，导致特别偏向细胞介导的或Th1反应的保护性反应。CpG基序通常与铝佐剂（例如，在含有CpG 7909的FDA许可的炭疽疫苗中）结合使用，因为这两种佐剂的结合导致强大的细胞和体液免疫。 2.8.rVSV 西非埃博拉病毒流行（2013-2016）导致了第一种许可的病毒载体疫苗。Vesicular Stomatitis Virus (VSV)是一种基于病毒载体的佐剂，用于默克公司的埃博拉疫苗ERVEBO（也称为V920, rVSVΔG-ZEBOV-GP或rVSV-ZEBOV），该疫苗于2015年获得FDA许可。ERVEBO是一种具有复制能力的、减毒的重组水泡性口炎病毒（rVSV）载体，其糖蛋白基因被ZEBOV替代。VSV糖蛋白G允许附着和进入宿主细胞，这被ZEBOV糖蛋白模仿以产生ZEBOV抗原特异性免疫反应。与其他许可的佐剂系统相比，rVSV是独特的，因为它编码抗原在载体表面表达，而不是被混合或绑定。然而，由此产生的免疫反应仍然由rVSV载体决定，与抗原无关，表明这项技术本身就是一种强大的免疫调节剂。具体来说，疫苗引发与VSV类似的感染，导致针对病毒蛋白的特定细胞和抗体反应，因此保护人们免受未来的暴露。疫苗在超过5000名接种者及其未接种的接触者中实现了100%的疫苗效力。 2.9.脂质纳米颗粒 两种基于脂质纳米颗粒的疫苗已由Pfizer-BioNTech和Moderna获得FDA许可。Pfizer-BioNTech COVID-19疫苗中的脂质纳米颗粒，现在称为Comirnaty（BNT162b2），是美国第一种COVID-19疫苗，于2021年8月获得FDA许可。BNT162b2在43,548名参与者中显示出95%的效力预防COVID-19。疫苗的抗原是修饰的核苷酸RNA（modRNA），编码SARS-CoV-19病毒的刺突蛋白，由四种脂质配制的脂质纳米颗粒保护：一种离子化脂质（（（4-羟丁基）吖啶二基）双（己烷-6,1-二基）双（2-己基癸酸酯）），一种聚乙二醇化脂质（2-[（聚乙二醇）-2000]-N,N-十四烷基乙酰胺），以及两种结构脂质（1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱（DSPC）和胆固醇）。疫苗在接种后显示出强烈的抗原特异性抗体反应、CD8+和CD4+ T细胞反应，以及免疫细胞产生的IFNγ。另一种脂质纳米颗粒用于Moderna的SPIKEVAX COVID-19疫苗，也称为mRNA-1273，该疫苗于2020年12月获得FDA紧急使用授权，随后于2022年1月获得许可。与Pfizer-BioNTech的疫苗类似，Moderna的SPIKEVAX在30,420名参与者中显示出94.1%的效力。尽管它有类似的局部和全身反应，如头痛、发烧和疲劳，但没有安全问题。疫苗包含一个由脂质纳米颗粒包裹的信使核糖核酸（mRNA）抗原，由四种脂质组成：SM-102、聚乙二醇（PEG）2000二硬脂酰甘油（DMG）、胆固醇和1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱（DSPC）。与BNT162b2类似，mRNA-1273诱导CD4 T滤泡辅助、CD8+和Th1反应。 2.10.Matrix-M Novavax生产的COVID-19疫苗NVX-CoV2373含有纳米颗粒佐剂Matrix-M，该佐剂于2022年10月获得FDA的紧急批准。后来暂停，并在包括SARS-CoV-2 Omicron变体的刺突蛋白的更新疫苗中重新授权紧急使用。目前，它已于2023年10月由FDA重新授权紧急使用。Matrix-M佐剂是一种40 nm基于皂苷的纳米颗粒佐剂，由来自Quillaja saponaria树皮的两种纯化组分混合，与胆固醇和磷脂结合。疫苗与SARS-CoV2刺突蛋白三聚体抗原配制成27.2 nm的纳米颗粒，并与Matrix-M佐剂结合，制成NVX-CoV2372疫苗。结合使用时，该疫苗已显示出诱导强烈的Th1型和T滤泡辅助细胞（Tfh）反应，促进中和抗体的产生，以及CD4+ T细胞和CD8+ T细胞反应。该疫苗已被证明是安全的，副作用轻微至中等，如注射部位疼痛、头痛和疲劳。 3.当前临床试验 在这一部分，我们提供了截至2023年6月当前新疫苗佐剂临床试验的概况。我们在clinicaltrials.gov数据库上使用关键词“vaccine”和“communicable diseases”以及“recruiting, not yet recruiting, active, not recruiting, or enrolling by invitation”的状态进行了搜索。我们还指定了研究类型为“Interventional Studies”。返回的条目（总共641个）然后手动筛选，排除已经获得FDA许可或WHO预认证的疫苗，并且正在寻求扩展到不同人群/剂量计划的使用。排除后，总共识别出523项试验。在这个集合中，对不同的疫苗配方进行了分析，以识别佐剂成分。当多个试验中疫苗配方一致时，即使用了相同的抗原和佐剂组合，这些试验被归为一类。相反，当一个试验通过使用多个佐剂和/或抗原评估多种疫苗配方时，该试验根据疫苗配方的数量被多次计数。这导致了389种独特的疫苗配方正在评估中。 在识别的活跃疫苗临床试验中使用了多种佐剂（图1）。然而，23%的识别试验的疫苗配方中没有包含佐剂（图1a）。大约50%的这些不含佐剂的配方使用减毒活病毒作为抗原，这种抗原具有固有的高免疫原性。然而，这些类型的疫苗可能对免疫受损者有增加的安全问题。在其他50%不含佐剂的疫苗试验中，大多数使用灭活病原体作为抗原。使用灭活病原体可以提高疫苗的安全性，但可能会降低免疫原性，因为病原体不能复制或进入免疫细胞以促进强大的免疫反应。此外，没有佐剂，这些疫苗配方完全依赖于身体识别灭活抗原为危险并产生免疫反应。年度季节性流感疫苗使用灭活的流感病毒作为抗原，没有佐剂。这些疫苗通常效果有限。例如，在2007-2008年流感季节，流感疫苗Fluzone的保护率据报道仅为68%，强调了增加佐剂以提高疫苗免疫原性的必要性。 图1 展示了当前临床试验空间中许可疫苗的佐剂情况。(a) 根据佐剂许可状态评估的临床试验中独特疫苗配方的分类，其中独特的疫苗配方由试验空间中不同的佐剂和抗原组合定义。每个部分显示了独特疫苗配方的数量及其在整个试验中的百分比。(b) 显示了包含许可疫苗佐剂的临床试验数量，作为该佐剂在独特疫苗配方中使用的次数，以及在重复疫苗配方中使用该佐剂的试验数量。 一些识别的疫苗试验没有指定使用的佐剂，我们将这些试验在图1a中归类为“未知”。此外，对于确实包含佐剂的疫苗配方——之前在许可疫苗中使用过或新颖的——我们根据不同的佐剂类别进一步对它们进行分类（图2）。在接下来的讨论中，我们将逐步了解这些佐剂类别，讨论它们各自的机制，并概述每个类别的临床试验概况。 图2 展示了按佐剂类别划分的临床试验数量。这既包括包含独特疫苗配方的试验，也包括包含重复配方的试验。 3.1.铝盐 铝盐在识别的临床试验中继续占据主导地位，代表目前正在评估的疫苗配方中使用最广泛的佐剂（图2）。这些配方中的许多，88%，将铝盐作为配方中唯一的佐剂。然而，10%的配方包括TLR激动剂作为组合。类似于在AS04中看到的，添加TLR激动剂可以增强免疫反应，特别是细胞免疫，这是基于铝的佐剂单独难以实现的。将在本综述后面更深入地讨论TLR激动剂重点试验。在当前的临床试验景观中，使用铝佐剂的疫苗正在用于保护多种传染病，包括COVID-19、HIV、霍乱、百日咳等。 尽管铝盐作为佐剂的使用历史悠久，但其促进免疫反应的作用机制尚未完全阐明。在发现之后，Glenny等人提出了佐剂的作用机制——库效应，建议抗原库的创建可能导致持续和缓慢的抗原释放。这个机制多年来被该领域广泛接受，但最近这一观点因观察到在注射后2小时移除注射部位的铝库并不影响抗原特异性免疫反应而受到挑战。这与早期的研究形成鲜明对比，早期的研究表明，在注射后4天内移除库影响了免疫反应，但在注射后7天移除时则没有影响。总体而言，库的形成和库的持续时间如何影响整体佐剂效果仍然不清楚。除了库效应，还探索了铝的其他免疫调节特性，以描绘更完整的机制图景。具体来说，已经显示铝佐剂在注射部位诱导大量坏死，导致DAMPs（如DNA和尿酸）的释放。这些DAMPs促进免疫细胞的渗透和激活，最终与下游免疫反应相连。在渗透到现场的免疫细胞中，树突状细胞被确定为铝机制中的关键细胞。树突状细胞不仅增强了从注射部位到引流淋巴结的抗原运输，而且对铝的反应激活并增加了通过单核细胞分化为树突状细胞的细胞数量。虽然铝难以启动细胞免疫反应，但它通过激活补体级联反应是强大的体液免疫反应调节剂。 即使没有完全的机制理解，铝佐剂仍然在许可疫苗或那些在活跃的临床试验中广泛使用（图2）。铝佐剂在所有许可疫苗的佐剂中拥有最长的安全记录，过去80年一直是值得信赖的添加剂。虽然需要新材料来扩大佐剂空间，但铝佐剂在临床研究中继续占据主导地位。 3.2.纳米颗粒 纳米颗粒是识别试验中另一种广泛使用的疫苗佐剂（图2）。纳米颗粒可以由多种材料配方制成，其物理和化学属性如大小、形状、表面结构、物理化学性质、溶解度以及疏水性/亲水性可以调节。这激发了纳米颗粒佐剂在疫苗开发中的使用，特别是在COVID-19大流行期间。虽然许多纳米颗粒仅被视为抗原载体，但根据其材料和物理化学属性，纳米颗粒可以作为佐剂增强免疫反应。 纳米颗粒作为疫苗中的候选物质具有吸引力，因为它们具有可调节性。使用的抗原可以是封装在颗粒内的核酸，也可以是配方在颗粒表面的肽和蛋白质。佐剂成分也可以来自构建颗粒所用的材料，如Matrix M的情况，或者来自结合在表面的配体，如TLR激动剂，包括可能对抗原的多方面免疫反应。一些纳米颗粒还允许定时释放，通过使用金材料，这可以通过频繁暴露增强免疫反应。在当前的临床试验景观中，有75种独特的疫苗配方使用基于纳米颗粒的佐剂，总共有98项试验，包括Matrix-M、金纳米颗粒、脂质纳米颗粒以及其他脂质载体的变化（图3a）。其中，三种纳米颗粒已在许可疫苗中使用，包括Pfizer-BioNTech和Moderna设计的脂质纳米颗粒以及牛津大学设计的Matrix-M。自COVID-19大流行以来，纳米颗粒在临床疫苗中取得了很大进展，并继续作为识别活跃临床试验中的第二大佐剂组，在独特的疫苗配方中占18.2%，在总试验中占16.4%（图2）。 图3 展示了临床中纳米颗粒佐剂的情况。(a) 根据纳米颗粒类型：脂质纳米颗粒、Matrix-M、白桦脂醇纳米颗粒（NP）、金纳米颗粒（GNP）、纳米结构脂质载体（NLC）和脂质无机纳米颗粒（LION），在临床试验空间中包含纳米颗粒佐剂的独特疫苗配方的构成。提供了独特疫苗配方的数量以及相应的整体空间百分比。(b) 根据负责临床试验的主体，包含脂质纳米颗粒的临床试验数量。这由包含独特疫苗配方的试验数量和包含重复配方的试验数量共同定义。 3.2.1.脂质纳米颗粒 脂质纳米颗粒（LNPs）是由可电离脂质、辅助脂质、胆固醇和聚乙二醇化脂质的不同比例制成的球形囊泡。通过在这些角色中使用不同的材料并改变它们的比例，许多公司已经生产了自己的LNPs用于疫苗接种（图3b）。这四种脂质的组成包裹了核酸和蛋白质作为针对目标疾病的抗原。在生理pH下，可电离脂质具有中性电荷，减少毒性并促进mRNA的摄取。当与细胞质相互作用时，可电离脂质的正电荷诱导mRNA释放到宿主细胞中。LNPs在识别的活跃临床试验中占纳米颗粒基佐剂的最大组（图3a），有55种独特的疫苗配方跨越67项试验，用于针对COVID-19、HIV、带状疱疹、尼帕病毒等多种疾病的疫苗接种（图3b）。如前所述，已有两项脂质纳米颗粒疫苗获得许可：Moderna的SPIKEVAX COVID-19疫苗和Pfizer-BioTech的Comirnaty COVID-19疫苗。在最近的一项研究中，发现LNPs可以诱导强烈的体液反应，如T滤泡辅助（Tfh）细胞、记忆B细胞和浆细胞。 Pfizer-BioNTech和Moderna疫苗都展示了类似的机制。疫苗包含编码SARS-CoV-2病毒刺突糖蛋白的修饰核苷mRNA，一旦进入宿主细胞质，就被放置在LNP中以保持稳定性和保护。然而，LNP不仅仅是抗原载体系统，而是具有自己的佐剂能力。BNT162b2（NCT05541861）和mRNA-1273（NCT05383560）LNPs以及临床试验中使用的其他LNPs，都包含类似的四个关键成分——可电离脂质、胆固醇、聚乙二醇化脂质和1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱（DSPC），这些脂质的确切组成和比例都有专利差异。在这两种情况下，可电离脂质被认为是产生佐剂反应的原因。当增加LNP配方中可电离脂质的摩尔比例时，发现促炎细胞因子如IL-6的诱导随之增加。此外，可电离脂质直接影响疫苗产生的体液反应。当LNPs与抗原蛋白共注射时，无论是否包含封装的IVT-mRNA，都能产生抗原特异性抗体。然而，在LNPs缺乏可电离脂质的情况下注射抗原蛋白时，无法产生抗原特异性抗体。这表明可电离脂质在抗原生成和先天免疫信号传导中都起着至关重要的作用，尽管负责免疫激活的确切机制仍然不完全清楚。配方中的聚乙二醇化脂质保护纳米颗粒免受吞噬作用，允许长时间循环。最后，辅助脂质、胆固醇和DSPC通过稳定抗原封装和增强膜刚性来增强纳米颗粒的稳定性，从而提高整体效果和生物分布。一旦宿主细胞被感染，mRNA被翻译成SARS-CoV-2刺突蛋白，在宿主细胞上表达。虽然这两种疫苗类似，但它们具有不同的储存能力。Pfizer的BNT162b2需要在-60°C至-80°C下储存，可以储存6个月，而Moderna的mRNA-1273疫苗可以在2°C至8°C下储存，长达30天。 3.2.2.Matrix-M Matrix-M是一种40 nm的球形基于皂苷的纳米颗粒，由Quillaja saponaria树皮中的两种纯化组分Fraction-A和Fraction-C混合，与胆固醇和磷脂配方。有两种皂苷组分，Matrix-A和Matrix-C，组合成Matrix-M。在临床上，Matrix-M纳米颗粒在纳米颗粒类别中占独特疫苗配方的20.3%，占总试验的25%（图3a），目前用于针对包括Epstein-Barr病毒感染、疟疾和COVID-19在内的多种疾病的疫苗接种。在最近一项测试Matrix-M在没有抗原的情况下的小鼠免疫刺激性的研究中，发现佐剂将淋巴结和脾脏中的免疫细胞数量增加了3倍，并诱导了强烈的Th1反应。在注射部位，Matrix-M增强了先天免疫细胞如中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、自然杀伤细胞和树突状细胞的渗透，并促进了促炎细胞因子的释放。这种细胞因子的释放启动了更多先天免疫细胞的涌入，引发了一系列局部免疫反应，在随后的24-48小时内展开。Matrix-M和抗原也一起流向淋巴结，导致B细胞激活和增殖增加，以及T细胞的激活和极化。B细胞进一步增殖和分化为记忆B细胞和浆细胞，产生高亲和力抗体，通过疫苗针对的目标感染威胁提供保护。基于皂苷的佐剂一直被认为是有利的，并已用于动物疫苗以及在许可疫苗中使用的AS01b佐剂中的脂质体配方QS-21。如前所述，Matrix-M是Matrix-A和Matrix-C皂苷组分的组合，而QS-21包含Matrix-C。由于其不稳定性，QS-21与胆固醇一起在像AS01B这样的脂质体基佐剂中配方。 3.2.3.基于白桦脂醇的球形纳米颗粒 基于白桦脂醇的球形纳米颗粒大小为100-180 nm。白桦脂醇是由桦树皮产生的五环卢帕烷型萜类化合物配方而成，已显示出具有抗真菌、抗病毒和抗致癌作用。目前在临床景观中，基于白桦脂醇的纳米颗粒出现在一项名为Betuvax-CoV-2（NCT05270954）的COVID-19疫苗试验中。Betuvax-CoV-2包含基于白桦脂醇的球形纳米颗粒表面的重组RBD-SD1-Fc融合蛋白，该配方旨在模拟SARS-CoV-2病毒以类似方式触发免疫系统。在BetuvaxcoV02的最新研究中，它被证明是安全且可耐受的，并且对疫苗接种有轻微反应。已显示出特异性IgG抗体滴度以及对抗原的强烈CD4+和CD8+ T细胞反应。白桦脂醇的免疫调节机制有限，但已证明白桦脂醇可以增强人外周血淋巴细胞的增殖，以及增强巨噬细胞中的抗炎和促炎活性。由于白桦脂醇是一种常见自然资源的提取物，该化合物的丰富性和低细胞毒性使其作为疫苗佐剂更受欢迎。 3.2.4.金纳米颗粒 金纳米颗粒（GNP）在疫苗中特定用于增加抗原稳定性、抗原在淋巴结中的积累以及抗原呈递细胞的有效抗原摄取。在当前的临床研究景观中，有一项试验使用了金纳米颗粒，具体是用于COVID-19的生物制剂PepGNP-COVID-19，这是一种经皮COVID-19疫苗（NCT05633446）。虽然尚不清楚这种精确配方如何结合COVID-19抗原，但GNP可以通过多种方式与抗原结合，如通过硫醇和胺链接的化学缀合、吸附和封装。GNP的大小对于免疫反应至关重要。比较20 nm和40 nm的球形GNP时，较大的球形GNP被发现更有效地产生IL-6和IL-12等细胞因子。GNP的形状也很重要。当骨髓源性树突状细胞用杆状GNP处理时，发现两种特定的促炎细胞因子IL-1b和IL-18的产生增强。相比之下，像临床疫苗中看到的立方体和球形GNP导致不同促炎细胞因子如肿瘤坏死因子α（TNFa）、IL-6、IL-17和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的水平升高。 3.2.5.纳米结构脂质载体 纳米结构脂质载体（NLC）被称为第二代脂质纳米颗粒，有可能克服以前脂质纳米颗粒的限制。它们由一个由液态和固态脂质组成的脂质基质核心组成，形成结晶结构，由脂质和表面活性剂壳层包围，与具有固态脂质核心的LNP相反。具体来说，NLCs由于其不完美的晶体结构，表现出更高的药物载荷能力，通过避免脂质结晶来防止药物驱逐，并增加药物溶解度和控制释放。目前，有一项活跃的试验中使用了NLC，其中自放大RNA（saRNA）抗原结合在NLC的外部。这种鼻内疫苗AAHI-SC2是由Access to Advanced Health Institutes（AAHI）开发的，用于保护COVID-19（NCT05370040）。这种疫苗中使用的NLC大约为125 nm，核心由固态脂质三酰甘油和液态脂质（角鲨烯）组成，壳层由表面活性剂和阳离子脂质1,2-二油酰-3-三甲基铵丙烷（DOTAP）组成，这有助于复合RNA。该平台是全球分发的绝佳候选物，因为它允许在冷藏状态下作为液体长期稳定，同时至少保持一年颗粒大小和浓度。疫苗可以很容易地从其液体形式配方，通过将疫苗RNA与NLC混合以创建NLC/RNA复合物，该复合物通过与阳离子脂质DOTAP的静电相互作用形成。此外，整个复合物可以很容易地冻干，并在室温下储存8个月或冷藏近两年。这种热稳定性是以前LNP配方所未见的，并且可以显著改善疫苗的分发。AAHI-SC2疫苗被证明可以产生高血清特异性IgG和SARS-CoV-2武汉株特异性中和抗体。在小鼠中比较肌肉内主剂和鼻内增强剂时，发现IFNγ分泌T细胞显著增加，具有强烈的Th1偏向反应和微不足道的Th2和Th17反应。此外，鼻内途径有强大的呼吸道粘膜免疫反应，具有SARS-CoV-2反应性的肺驻留记忆和肺归巢T细胞群体。异质给药方法，肌肉内主剂和鼻内增强途径，显示出使用这种佐剂最大化强大的粘膜和系统免疫的潜力。 3.2.6.脂质无机纳米颗粒 脂质无机纳米颗粒（LION）是52 nm颗粒，旨在增强治疗剂的稳定性、传递和免疫原性。在当前的临床试验中，LION在两项独特的疫苗配方中使用，共进行了三项针对COVID-19疫苗接种的试验。在这两种配方中，LION与自复制mRNA（repRNA）结合，编码SARS-CoV-2的刺突蛋白，结合在LION的外部，形成了在韩国由Quartis开发的疫苗QTP104（NCT05876364）和在美国和巴西由HDT Bio开发的疫苗HDT-301（NCT05132907，NCT05542693）。LION由含有15 nm超顺磁性氧化铁（SPIO）纳米颗粒的角鲨烯乳液核心组成，以增强稳定性，并由表面活性剂和阳离子脂质DOTAP包围。基于角鲨烯的佐剂在本综述中已多次提及，而SPIO纳米颗粒在MRI对比和铁替代疗法中有着临床历史。一旦LION配方完成，它就与RNA结合，形成LION复合物。RNA的复合类似于NLCs中的情况，阳离子脂质DOTAP与嵌入的RNA分子形成静电连接。LION的优点是它可以在室温下稳定至少3个月，使其成为全球分发的绝佳候选物。对repRNACoV2S进行的持续研究表明，可以诱导SARS-CoV-2刺突蛋白的抗原特异性T细胞和抗体反应。此外，疫苗诱导了强烈的Th1偏向免疫反应，疫苗诱导了抗刺突蛋白IgG抗体和强烈的T细胞反应，更高剂量增强了Th1反应。在小鼠中进行的单次肌肉内免疫接种在14天后实现了100%的血清转换以及强烈的抗原特异性IgG反应。免疫接种还在年轻和老年小鼠之间进行了比较，所有年龄的小鼠都有强烈的脾T细胞反应，最老的17个月龄组的T细胞反应各异。非人灵长类动物如猕猴与小鼠的结果一致，并表明长期抗原特异性记忆T细胞反应。 3.3.病毒载体 病毒载体是被修改的病毒，普遍用于将目标基因传递给宿主细胞。在疫苗接种中，它们主要被识别为抗原载体，传递DNA抗原和蛋白抗原给免疫细胞。然而，病毒载体也具有佐剂能力，因为它们可以模仿由病毒引起的自然感染。通常，自然感染是通过病毒通过表面受体附着到宿主细胞上发生的。病毒的存在通过识别载体上的病原体结构或PAMPs以及与模式识别受体（PRR）的相互作用，有效地触发先天免疫反应。虽然载体诱导类似病毒的感染，但病毒载体被修改为非致病性和复制缺陷，以避免进一步的病毒特异性感染。虽然病毒载体是有效的佐剂，但它们也有一些缺点。主要的是，很难调节启动的先天反应，有时载体可能引起过于强烈的先天反应，导致细胞毒性、对重复剂量的免疫以及强烈的炎症反应，这些可能会降低效果甚至被身体清除。 在临床上使用的载体来自几个病毒家族，包括副黏液病毒、腺病毒科和正黏液病毒科。在每个家族中，有几种不同的病毒载体通过基因编辑进行了修改，以避免预先存在的免疫，同时减少毒性和免疫原性。如前所述，有一种病毒载体佐剂，即rVSV，已被用于默克公司的许可rVSV-ZEBOV扎伊尔埃博拉疫苗中。还有两种病毒载体获得了WHO和FDA的临时紧急批准。阿斯利康COVID-19疫苗中的ChAdOx1载体在2021年2月获得了WHO的紧急批准，但此后该批准已被撤销。此外，詹森COVID-19疫苗中使用的Ad26载体在2021年2月获得了FDA的紧急批准，但由于与疫苗接种相关的潜在血凝块风险，这一批准已被撤销。在当前的临床景观中，有27种病毒载体佐剂分布在八个病毒家族中。在临床试验中的佐剂中，15.8%的总试验和13.6%的独特疫苗配方使用了病毒载体，使其成为临床试验疫苗景观中第三大佐剂组。 3.3.1.弹状病毒 rVSV是临床试验中正在测试的唯一弹状病毒家族的病毒载体。rVSV是一种活的、减毒的重组水泡性口炎（印第安纳）病毒（VSV）。目前，该载体正在评估针对尼帕病毒、拉沙病毒和埃博拉苏丹病毒病（ESVD）的疫苗中的四种独特疫苗配方。VSV是一种11 kb非分段、单链、负义RNA病毒，由11,000-12,000个核苷酸组成，编码五个基因：N、P、M、G和L。该病毒主要感染昆虫、马、牛和猪，因此避免了人类的预先存在的免疫，并增加了VSV病毒载体疫苗的有效性。VSV的糖蛋白G是一种III类病毒融合蛋白，允许细胞附着和膜融合并使感染成为可能。在许可的rVSV ZEBOV疫苗中，VSV-EBOV，EBOV糖蛋白（GP）被整合到VSV载体中，其中G开放阅读框架被故意移除。这种修改允许复制rVSV显示弹状病毒的形态，同时在其表面表达EBOV GP。与其他病毒载体一样，rVSV产生与宿主的Toll样受体（TLRs）和模式识别受体相互作用的信号。这种相互作用触发先天免疫反应，从而增强适应性免疫反应。VSV病毒载体已被证明是一个有希望的平台，因为它的血清价、高复制性和接种个体中的低至温和症状。然而，虽然在产生所需抗原的免疫反应方面有效，但许可的疫苗也在超过三分之一的受试者中证明了对载体本身VSV的细胞毒性T细胞和抗体反应；这可以直接影响VSV-EBOV的复制能力。尽管如此，由于对免疫反应的积极影响和高制造性，这种载体继续被探索用于各种疫苗：rVSV可以通过转染表达感兴趣基因的哺乳动物细胞或HEK293T来高滴度生产。 3.3.2.腺病毒 腺病毒是非包膜双链DNA二十面体形状的病毒，在病毒载体空间中占主导地位，包括人类和黑猩猩腺病毒载体。在腺病毒科家族中，Mastadenovirus属由感染人类和非人灵长类动物（如牛、犬和黑猩猩等灵长类动物）的血清型组成。血清型进一步分为A-G种。在当前的临床试验空间中，人类腺病毒载体代表最大的病毒载体家族，有17种独特的疫苗配方跨越33项试验，研究多种COVID-19疫苗，以及HIV、狂犬病、霍乱等（图4a）。在56种人类腺病毒血清型中，野生型血清型引起轻度至中度的呼吸道或胃肠道疾病症状。这些多样化的菌株通常源于病毒复制过程中发生的自然基因变异。数字命名有助于科学家对这些变体进行分类和研究，每个数字代表人类腺病毒大家族中一个独特的基因组和血清型身份。在临床试验景观中，Ad5是最常用的病毒载体，包括针对COVID-19和诺如病毒的10种独特疫苗配方。在COVID-19大流行期间，Ad5病毒载体已被用作COVID-19疫苗平台，临床试验中正在测试几种载体修改的COVID-19疫苗。在最近的一项研究中，发现不同剂量并没有显著增加抗体产生水平，这表明腺病毒载体的限制。Ad5病毒载体被证明可以产生特异性抗体和长期T细胞反应，但证明了高血清流行率，因为52%的参与者有高预先存在的免疫。Ad5载体被证明是有效和安全的，但由于其高血清流行率，许多其他衍生物已经从稀有人类腺病毒物种和非人灵长类动物中创造出来，这些物种今天出现在临床试验空间中，如用于COVID-19疫苗Ad26.COV2.S的Ad26。 图4 展示了临床中病毒载体的情况。(a) 根据病毒家族，临床试验空间中包含病毒载体的独特疫苗配方的构成。提供了独特疫苗配方的数量以及相应的整体空间百分比。(b) 根据血清型，包含腺病毒载体的临床试验数量。这由包含独特疫苗配方的试验数量和包含重复配方的试验数量共同定义。 由于黑猩猩腺病毒（ChAd）在系统发育上与人类腺病毒相似，这两个腺病毒家族之间有许多相似的特征。ChAd在临床试验景观中的13种独特疫苗配方和27项总试验中被发现，构成了第二大病毒载体组。ChAd载体在各种传染病的试验中，包括HIV、COVID-19、狂犬病和埃博拉。在ChAd载体中，ChAdOx1在临床上最流行，有四种独特的疫苗配方和16项总试验（图4b）。ChAd病毒载体是起源于腺病毒科Mastadenovirus属的猴腺病毒；它们主要结构为非包膜双链DNA，能够感染人类和非人灵长类动物。最常用的猴腺病毒载体ChAdOx1源自黑猩猩腺病毒Y25，由牛津大学开发。这个载体是安全和高度可制造的，并且可以在2°C–8°C下储存，使其成为全球分发的理想选择。ChAdOx1还避免了人类腺病毒载体中发现的预先存在的免疫。在对单剂量ChadOX1 nCoV-19（AZD1222）进行的研究中，发现它诱导了强烈的Th1免疫反应、IgG1和IgG3抗体产生，以及CD8 T细胞、自然杀伤细胞和B细胞群体。像ChadOX1一样，许多其他载体，如ChAd155和ChAd36，显示出类似的免疫反应，具有强大的体液和细胞反应。总的来说，ChAd载体是有效的，并且适合全球分发，同时避免了人类腺病毒载体中发现的预先存在的免疫。 3.3.3.痘病毒科病毒 改良的安卡拉牛痘病毒（MVA）是痘病毒科家族中唯一的病毒载体，并且在临床上用于10种独特的疫苗配方和11项总试验，占病毒载体景观中独特疫苗配方的17.2%。痘病毒是双链DNA病毒，它们在宿主细胞的细胞质中复制，从而消除了病毒与宿主基因组的整合。通常已知感染人类和动物，痘病毒通常引起病变、皮疹和皮肤结节。MVA载体是天花病毒的高度减毒株，已证明在人类中安全，包括HIV感染者，同时是一个多功能平台，可以长期储存。冻干MVA疫苗被证明可以在37°C下储存长达2周，并且在冷藏时超过一年。MVA主要在临床试验中用于上呼吸道疾病，如COVID-19、呼吸道合胞病毒、中东呼吸综合征（MERS）和疟疾。它已被证明可以诱导大量抗原特异性CD8和CD4 T细胞反应和快速记忆分化。在最近的一项研究中，MVA-EBOV-GP的给药，一种针对埃博拉病毒（EBOV）糖蛋白（GP）的病毒载体疫苗，导致了病毒中和抗体的产生，而MVA-EBOV-NP，一种针对埃博拉核蛋白（NP）的病毒载体疫苗，触发了针对NP的细胞毒性CD8 T细胞的发展。两种疫苗都证明了在引发保护性免疫反应方面的同等效力。 3.3.4.副黏液病毒 目前临床试验中有来自副黏液病毒科的两种病毒载体正在接受测试：PIV5和新城疫病毒（NDV），代表了九项总试验中的五种独特疫苗配方（图4a）。副黏液病毒是大小为150-300 nm的包膜病毒。它们是单链RNA病毒，像痘病毒科家族一样在宿主细胞质中复制。病毒含有两种跨膜糖蛋白：三聚体融合（F）蛋白使膜融合，而血凝素-神经氨酸酶（HN）、血凝素（HA）或糖蛋白（G）使病毒附着。这些病毒以其感染脊椎动物而闻名，如腮腺炎病毒、麻疹病毒、呼吸道合胞病毒（RSV）和副流感病毒。两种病毒载体PIV5和NDV都含有相同的两种跨膜糖蛋白：血凝素-神经氨酸酶蛋白HN和融合蛋白F。这些载体目前正在进行针对COVID-19和合胞病毒等上呼吸道感染的试验。PIV5在哺乳动物中表现出低毒力，除了犬类上呼吸道感染外，并且由于可以在Vero细胞中生长至8×108 PFU/ml，因此具有很高的可制造性。在最近一项针对PIV5 RSV疫苗的鼻内研究中，大约50%的参与者在基线时对PIV5中和抗体呈血清阳性，但显示出对RSV F蛋白的强烈细胞免疫反应；因此，先前接触这种病毒载体并不会抑制反应。类似地，NDV可以低成本大规模生产，因为它是一种禽病毒，可以在受精鸡蛋中生长。NDV在人类中没有预先存在的免疫，但已知在禽类中具有传染性和危险性。过去，NDV已被用作癌症治疗的安全候选物，并通过在肿瘤细胞中诱导I型和III型抗病毒干扰素以及非癌症细胞中的III型而显示出溶瘤优势。 3.3.5.正黏液病毒科病毒 正黏液病毒科由球形病毒组成，包含分段的单链负链RNA。这个家族最显著地包括流感病毒，它们在当前临床试验病毒载体空间中有代表。有两种独特的疫苗配方跨越两项试验，包含流感A病毒（图4a）的变种，特别是H1N1和H3N2，用于针对COVID-19的疫苗。流感病毒可以感染哺乳动物和鸟类，引起人类的轻度至重度呼吸道疾病，有四个亚型：A、B、C和D。亚型是基于蛋白质血凝素（H–H18）和神经氨酸酶（N1-N11），常见的亚型H1N1和H3N2是常见的在人类中传播的病毒。血凝素（HA）对病毒进入宿主至关重要，而神经氨酸酶（NA）有助于从感染细胞中释放新形成的病毒颗粒。正在评估的疫苗之一Corfluvec利用两种不同的减毒流感载体通过鼻内途径传递，重组H3N2载体用于初次免疫，基于2009年出现的H1N1病毒的重组H1N1pdm09载体用于增强（NCT05696067）。DelNS1-2019-nCoVRBD-OPT1也在临床评估中，用于针对COVID-19的保护；这种疫苗通过鼻内途径传递，利用流感A H1N1载体（A/California/4/2009, CA4）（NCT05200741）。虽然在两项试验中使用的载体都是弱化株，但预先存在的免疫原性对载体对疫苗的整体有效性和反应原性的影响尚不清楚，需要进一步阐明。 3.3.6.沙粒病毒科 沙粒病毒科由包膜单链病毒RNA组成。来自这个家族的皮钦德病毒（PICV）和淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒（LCMV）构成了两种独特的疫苗配方，与交替载体免疫策略结合，测试慢性乙型肝炎治疗疫苗（NCT05770895）。PICV是一种非致病性RNA病毒，源自Oryzomys albigularis，也称为米鼠。它在感染啮齿动物的地区的人类人群中显示出低血清流行率，这减轻了PICV载体疫苗中的预先存在的免疫。LCMV由双节段负链RNA组成，但与PICV不同，LCMV是一种致病性病毒，通过有毒啮齿动物引起多种神经系统疾病，如脑膜炎、脑炎和婴儿出生缺陷。为了安全，LCMVs经历了遗传突变，减弱了复制能力并减少了疫苗中的致病性。沙粒病毒科因其能够诱导强大和功能性的细胞毒性T细胞反应而在过去的免疫学研究中被利用；然而，这两种基因相关的载体在初次增强组合中的使用增强了这种反应并避免了载体中和抗体。 3.3.7.疱疹病毒科 疱疹病毒科由大型双链DNA基因组组成。人类巨细胞病毒（HCMV）是疱疹病毒科中唯一目前在临床试验中的病毒载体，用于针对HIV疫苗VIR-1388，由Vir Biotechnology开发（NCT05854381）。这种疫苗已经显示出使用弱化的CMV病毒含有HIV材料来产生针对慢性HIV感染的HIV特异性T细胞。HCMV在欧洲和美国的人群中显示出80%的流行率，在非洲和亚洲为100%。HCMV感染在健康个体中通常是无症状的，但可能对免疫系统受损的患者，包括婴儿和艾滋病患者，构成严重的健康风险。症状可能表现为CMV单核细胞增多症、发热、白细胞减少、肺炎和胃肠疾病；在艾滋病患者中，常常导致视网膜炎。然而，这种疫苗目前用于没有HIV的健康成年人，并且由于HCMV在大多数成年人中是无症状的，因此它是健康个体中作为病毒载体的良好候选物。此外，在对小鼠CMV（MCMV）的研究中，即使在血清阳性患者中，病毒也被证明可以诱导T细胞反应；虽然这种特性使其难以预防CMV，但可以作为载体使用。HCMV是一个特例，因为它产生高频率的病毒特异性CD4+ T细胞，具有一系列的细胞毒性和效应功能，以及在宿主一生中充当效应记忆细胞的CD8+ T细胞群体。这种现象被称为“记忆膨胀”，使其成为具有长期免疫潜力的有效病毒载体，特别是对于需要强大细胞反应的疾病，如HIV。在非人模型中，CMV载体疫苗还证明了能够被遗传改变并编程多样化的CD8+ T细胞，具有不同的表位目标。这允许CMV载体针对特定的CD8+ T细胞反应量身定制，以针对不同的疾病模型。 3.4.TLR激动剂 TLR是一种模式识别受体（PRR），是具有识别微生物的病原体相关分子模式（PAMPs）或受损组织的危险相关分子模式（DAMPs）的先天免疫受体。PRR最初由Charles Janeway在1989年提出，他假设它们作为先天和适应性免疫系统之间的联系。在这一预测之后，TLR4在1996年首次被发现，1998年发现LPS可以与该受体结合。从那时起，已经鉴定出具有独特先天免疫途径的其他TLR受体。TLR激动剂首次在2009年获得FDA许可的HPV疫苗中的AS04佐剂中使用。AS04含有TLR4激动剂MPL，也用于2017年许可使用的带状疱疹疫苗中的AS01b佐剂。在AS04和AS01b中，MPL被吸收到另一种免疫调节剂上，如铝或QS-21的脂质体配方。另外两种TLR激动剂（CpG 1018和CpG 7909）分别在2017年和2023年在临床许可疫苗中使用，每种都是未甲基化的CpG基序，作用于TLR9。 3.4.1.TLR3激动剂 TLR3激动剂是目前在临床中使用的一个小众材料群体，只有六种独特的疫苗配方在八项总试验中被评估（图5b）。在免疫细胞中，TLR3特别存在于髓样树突状细胞（mDCs）、巨噬细胞和肥大细胞上，主要定位在这些细胞的内质体中。配体结合后，TLR3与适配蛋白TRIF相关联，导致以I型干扰素（IFN）分泌增加为标志的抗病毒反应。TLR3在DCs上的激活非常重要，因为这启动了强大的IFN释放，并诱导了对适应性免疫重要的抗原特异性免疫反应。TLR3激活产生的强烈IFN反应和先天免疫级联反应，使这条途径对保护免受多种病毒如流感、RSV等的侵害变得重要。这种受体识别双链RNA（dsRNA），这是病毒复制的中间体，因此被临床中的TLR3激动剂所模仿。 图5 展示了临床中TLR激动剂的情况。(a) 根据TLR编号，包含TLR激动剂的临床试验数量。这由包含独特疫苗配方的试验数量和包含重复配方的试验数量共同定义。(b) 根据TLR激动剂类型以及进一步指定的激动剂，临床试验空间中包含TLR激动剂的独特疫苗配方的构成。提供了独特疫苗配方的数量以及相应的整体空间百分比。 在已识别的临床试验中，有三种TLR3激动剂每种都在两种独特的疫苗配方中被探索——Poly I:C、PIKA和dsRNA发夹——只有PIKA作为其配方中唯一的佐剂（图5b）。Polyinosinic:polycytidylic acid (Poly I:C)是一种合成的dsRNA类似物，是一种常见的TLR3激动剂，用于癌症和传染病应用。在临床中，Poly I:C目前用于三种试验中的两种不同的疫苗配方。它与QS-21和脂质分子结合，形成MA105，正在作为带状疱疹疫苗中的佐剂进行测试。此外，它与另外两个组分，宿主防御肽IDR-1002和阳离子聚合物佐剂聚磷氮烷（PCEP），结合形成TriAdj，正在研究用于新型COVID-19疫苗。另一种结合使用的TLR3激动剂是dsRNA发夹，它与Ad5病毒载体结合，用于Vaxart开发的口服诺如病毒（NCT05626803）和口服COVID-19（NCT05067933）疫苗。利用TLR3激动剂进行这种给药途径可以在肠道中产生更强大的先天免疫反应，因为TLR3可以在肠道上皮细胞中找到。在这个系统中，dsRNA发夹被纳入病毒载体，并与抗原编码在同一病毒载体上。在小鼠的流感模型评估中，dsRNA发夹在载体中的包含被证明可以增强对抗原的抗体反应。在已识别的试验中评估的最后一个TLR3激动剂是PIKA，这是一种由YS Biopharma开发的dsRNA稳定化学类似物，在用于狂犬病（NCT05667974）和COVID-19（NCT05463419）疫苗的两种配方中，PIKA与TLR3相互作用并启动与该受体相关的先天免疫途径。 3.4.2.TLR4激动剂TLR4激动剂是当前在活跃的临床试验中评估的最常见的TLR激动剂（图5a）。这可能是由于TLR4激动剂MPL在AS04和AS01B中的FDA批准历史。TLR4是一种跨膜蛋白，主要表达在髓样起源的免疫细胞上，包括单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞。它也存在于非免疫细胞上，如上皮细胞、神经元和中枢神经系统（CNS）细胞。TLR4最初是通过其能够感知LPS而被发现的，然而，它也能够结合由组织损伤产生的内源性分子，即DAMPs。重要的是，TLR4本身不能感知LPS。相反，TLR4必须与细胞表面的MD-2物理相关联才能对LPS做出反应，形成LPS/TLR4/MD-2复合物以启动细胞中的相应免疫途径。一旦启动，TLR4可以触发两个独立且竞争的途径：MyD88独立（TRIF依赖）和MyD88依赖途径。适配蛋白如MyD88与TLR4复合物的关联决定了随后的免疫反应。MyD88依赖的反应导致如IL-6和TNF-a等促炎细胞因子的释放，而MyD88独立的反应导致I型IFN释放。 如前所述，在许可疫苗佐剂部分，MPL是来自Salmonella minnesota R595的LPS的非毒性衍生物，包含多个单磷酸脂A（六酰基、五酰基、四酰基和三酰基）的同系物，并与铝盐和QS-21结合使用，以前许可的佐剂系统中针对TLR4途径。脂质A是LPS的保守分子模式，是LPS免疫反应的主要诱导剂，使其成为作为佐剂使用的关键焦点。临床级MPL由GSK独家生产，用于他们的佐剂系统，而其他“通用”形式的单磷酸脂A也在临床中使用，并被指定为MPLA。在本综述中，MPL和MPLA将被称为MPL。MPL已被证明可以激活MyD88依赖和TRIF依赖途径，但偏向于TRIF依赖途径，这有助于其与LPS相比的低毒性和其整体佐剂效果。由于其天然衍生，MPL具有一些固有的异质性和制造难题，促使产生了一种纯合成的六酰基脂质A衍生物，葡萄糖基脂质A（GLA）。MPL和其他天然衍生的内毒素可能具有不同数量的链、附着位点和链内的碳原子；而GLA作为合成替代品，具有明确定义的链附着数量和碳原子长度。GLA产生与MPL类似的反应，但与LPS相比具有较低的内毒素性，偏向于通过TRIF依赖途径发出信号，并在小鼠树突状细胞中具有相似的剂量和时间依赖性反应。然而，它在人类单核细胞衍生的树突状细胞上显示出更强的刺激能力。另一种合成MPL，3D-PHAD，也在当前的临床试验空间中普遍存在，存在于ALF佐剂家族中的ALFQ和ALF43中。尽管GLA是六酰基MPL的合成结构类似物，3D-PHAD是源自细菌LPS的3-脱酰基单磷酸脂A的纯五酰基合成类似物，在临床前分析中显示出与GLA的等效性。 GLA、3D-PHAD和MPL在当前临床试验空间中占有显著地位，其中GLA在约17%含有TLR激动剂的疫苗配方中最为常见，3D-PHAD约占12%，MPL约占10%。这些激动剂通常与其他佐剂或载体结合配方，只有一种疫苗配方仅评估TLR激动剂MPL。当与其他材料结合使用时，这些TLR4激动剂通常与氢氧化铝（AS04）、QS-21脂质体（AS01b、AS01e、ALFQ）配方，或者在GLA的情况下与角鲨烯乳液（GLA-SE）配方。MPL、GLA和3D-PHAD正在活跃的临床试验中评估，用于保护免受寄生虫和细菌感染，如血吸虫病和麻风病，以及病毒感染，如HIV和COVID-19。 尽管MPL、GLA和3D-PHAD在TLR4临床试验空间中占主导地位，但目前还有两种TLR4激动剂正在评估中。第二代脂质佐剂（SLA）由开发GLA的同一家公司AAHI开发，其设计基于TLR4/MD-2复合体的结构知识，而不是MPL。SLA旨在通过从GLA的酰链末端移除碳原子来更好地适应MD-2，这允许与TLR4/MD-2复合体进行更紧凑的相互作用。这种紧凑的结合导致与GLA相比TRIF途径偏向的转变，导致Th1趋化因子和细胞因子的增加。SLA与角鲨烯乳液配方，并在一项针对带状疱疹保护的临床试验中使用。在活跃的临床试验中评估的最后一个TLR4激动剂是EcML，它存在于一种疫苗配方中，跨越两项针对COVID-19的试验。EcML是由Eubiologics通过工程大肠杆菌（E.coli）菌株生产的纯化MPL。它已被证明在小鼠中产生与MPL类似的免疫效应，同时减少了商业可获得MPL的制造时间和成本。目前正在评估的EcML配方与QS-21脂质体结合。 3.4.3.TLR7激动剂 TLR7激动剂在临床试验空间中是最少的TLR激动剂（图5a）。TLR7是一种内质体跨膜蛋白，主要存在于浆细胞样树突状细胞（pDCs）和B细胞上。它也存在于其他非免疫细胞类型上，如角质形成细胞和上皮细胞，但水平较低。TLR7感应富含鸟苷和尿苷的单链RNA（ssRNA）、ssRNA病毒，以及合成抗病毒核苷类似物。当结合时，TLR7通过MyD88胞质适配蛋白发出信号，通过与其他下游蛋白的关联和激活，导致炎症体激活和促炎细胞因子的释放，以促进先天免疫反应。 图6 展示了使用TLR激动剂的独特疫苗配方与其配方组合材料的构成。提供了独特疫苗配方的数量以及相应的整体空间百分比。 Imiquimod是一种合成的咪唑喹啉胺，咪唑喹啉类药物是一类小于400 Da的合成核苷类似物，是迄今为止唯一被FDA批准用于细胞内TLR的激动剂。尽管它尚未作为传染病疫苗中的佐剂被用于许可的疫苗，但它目前被批准用于基底细胞癌或生殖器疣的局部治疗。Imiquimod已被证明可以结合TLR7并局部诱导多种促炎细胞因子，导致Th1偏向的免疫反应。目前在疫苗临床试验空间中，Imiquimod被用作流感和疟疾保护的局部佐剂，这两种抗原都被注入真皮空间。另一种TLR7激动剂正在临床试验中评估，之前在其他空间中未经批准。苯并萘骈吡啶-磷酸盐是一种TLR7激动剂，被吸收到铝上，产生完整的佐剂AS37，由诺华开发，后来被GSK收购。苯并萘骈吡啶类药物是通过体外筛选优化的一类新型TLR7激动剂，然后通过体内评估以产生具有低系统暴露、增加局部先天免疫反应和长期T细胞和抗体反应的顶级候选药物。产生的TLR7激动剂通过磷酸盐化学修饰，允许吸附到铝上，从而增强注射部位的保留，并加强随后的免疫反应。在临床试验空间中，AS37正在用于针对金黄色葡萄球菌和乙型肝炎的疫苗接种。 3.4.4.TLR7/8激动剂 TLR7/8激动剂具有独特的能力，能够结合TLR7和TLR8，以促进更强大的先天免疫反应。TLR8与TLR7类似，位于内质体膜上；然而，它在髓样树突状细胞和单核细胞上的表达更多，而不是像TLR7那样在pDCs上。TLR8通过MyD88途径发出信号，但在诱导的细胞因子谱上与TLR7不同。虽然TLR7主要与产生IFNα相关，但TLR8与产生其他促炎细胞因子如TNFα和IL-12相关。因此，激活这两个受体的能力有利于在对佐剂的反应中诱导更完整的细胞因子。 目前有两种TLR7/8激动剂正在活跃的临床试验中评估（图5b）：咪唑喹啉镓（IMDG）和3M-052。如前所述，咪唑喹啉类药物是一类能够与TLR7和TLR8特异性相互作用的核苷类似物。Ocugen开发的针对COVID-19保护的疫苗正在进行一项试验，该疫苗与吸附在铝上的IMDG一起使用。IMDG是一种二聚体咪唑喹啉分子，通过C2位置链接，具有拮抗TLR7和TLR8的独特能力，通过诱导强烈的I型干扰素反应，导致Th1免疫反应。3M开发的另一种TLR7/8激动剂3M-052在临床试验空间中有很强的流行性。这种激动剂出现在五项临床试验中，每项试验评估针对HIV和COVID-19的独特疫苗配方。在这五项试验中，3M-052都被吸附到铝上，其中一项试验还评估了未吸附的激动剂单独使用。3M-052是一种合成的咪唑喹啉酮，结构类似于resiquimod，但有一个18-C脂肪酸链，增强了分子的疏水性，因此减少了系统的扩散，并在免疫接种部位和引流淋巴结中提高了生物利用度。通过激活TLR7/8途径，3M-052诱导促炎细胞因子的释放，并增强Th1免疫反应。 3.4.5.TLR9激动剂 TLR9感应未甲基化的CpG二核苷酸，这是微生物DNA的特征。含有CpG基序的合成寡核苷酸（ODN）可以模仿这种感应并作为TLR9激动剂。TLR9是一种内质体膜受体，主要在pDCs和B细胞上表达，并在其他免疫细胞亚群上表达，通过MyD88途径发出信号，以启动I型干扰素的释放，从而改善对抗原的先天免疫反应。此外，TLR9激动剂有助于将适应性反应偏向Th1，并促进B细胞的增殖。有四种不同的CpG ODN类别，它们在人类细胞中的激活能力不同。B类ODN在临床试验中被最广泛研究，包括两种CpG佐剂，CpG 1018和CpG 7909，这些佐剂被用于许可的疫苗。这些ODN包含1至5个CpG基序，嵌入在磷酸硫代（PS）骨架中，可以触发pDCs分化并产生TNFα，同时仍然刺激B细胞增殖并分泌IgM。A类ODN包含一个CpG基序，被回文序列包围，导致形成茎环结构。虽然这些ODN同样触发pDC成熟和IFNα的释放，但由于它们定位在早期内质体上，它们不影响B细胞。 由于其在许可疫苗中的历史，TLR9激动剂在TLR激动剂的临床试验空间中占有强势地位，仅次于TLR4激动剂：共有30项试验和18种独特的疫苗配方。目前正在活跃的临床试验中评估六种TLR9激动剂，其中B类ODNs主导该空间，以及以前使用的TLR9激动剂CpG 1018在所有TLR9激动剂中最普遍。CpG 1018出现在10种独特的疫苗配方中，占19项针对COVID-19、流感、HIV和瘟疫的疫苗试验。除了一项试验（NCT05506969）外，CpG 1018都被吸附到氢氧化铝上。这种吸附已被证明可以增强对抗原的免疫反应。CpG 7909，另一种以前使用的B类ODN，是第二普遍的TLR9激动剂，用于四种独特的疫苗配方和五项总试验中；这种激动剂只在一半的配方中被吸附到氢氧化铝上，其余的独立交付。另外两种B类ODN也在评估中，CpG 10104和CpG55.2，都用于一种独特的疫苗配方中，分别针对钩虫（NCT03172975）和COVID-19（NCT05279456）。虽然CpG 10104正在测试吸附到氢氧化铝上，CpG55.2是与一种新型多糖佐剂Advax配方的，这是δ-菊粉颗粒。CpG 2216是一种A类ODN，正在评估结核病疫苗GamTBvac（NCT04975737）中。CpG 2216与一种阳离子衍生的右旋糖酐，右旋糖酐DEAE一起交付，以形成完整的佐剂系统。 3.4.6.组合材料 正如许多评估TLR激动剂的试验中所看到的，这些TLR激动剂并非总是单独交付；相反，只有15%的疫苗配方仅使用TLR激动剂和抗原。相反，这些激动剂通常与另一种佐剂材料结合使用，以增强其在注射部位的传递和持久性，以及由此产生的免疫反应。最常用的组合材料是氢氧化铝，占40%的疫苗配方正在评估中，其中TLR激动剂被吸附到铝颗粒的表面。脂质体是第二常用的组合材料，用于23%含有TLR激动剂的疫苗配方中。这些配方中几乎全都使用了QS-21的脂质体配方，如在许可疫苗中使用的佐剂系统AS01B。如前所述，QS-21是从南美树Quillaja saponaria Molina的树皮中提取的一种皂苷分子。QS-21是一种重要的免疫调节材料，促进促炎环境并增强对抗原的整体免疫反应。将QS-21与胆固醇结合在脂质体配方中是一个重要步骤；游离的QS-21具有毒性并导致细胞坏死。然而，当与胆固醇不可逆地结合时，它失去了毒性，同时保持了佐剂效果。虽然QS-21脂质体配方在化学组成和物理特性上有所不同，但使用的基础材料是一致的：磷脂、胆固醇、QS-21和TLR激动剂。在临床试验空间中最常见的脂质体配方是与TLR4激动剂、MPLA衍生物或合成类似物结合使用的，MA105是唯一含有TLR3激动剂Poly I:C的脂质体配方。AS01系统和ALFQ是临床试验空间中最普遍的脂质体佐剂。AS01使用中性的二油酰磷脂酰胆碱（DOPC），与磷脂的33.7摩尔百分比的胆固醇，而ALFQ使用两种磷脂，中性的二酰磷脂酰胆碱（DMPC）和阴离子的二酰磷脂酰甘油（DMPG），与55摩尔百分比的胆固醇。这些化学差异导致两种脂质体的大小差异，AS01产生均质的100纳米颗粒，ALFQ导致脂质体的大小从50到30,000纳米不等。在临床试验中评估的不含QS-21的脂质体，ALF43，是ALF家族的成员，保持与ALFQ相同的磷脂组成，并添加3D-PHAD，但由43摩尔百分比的胆固醇组成。与氢氧化铝不同，脂质体，特别是QS-21的脂质体配方，目前只在与TLR激动剂结合时出现在临床试验空间中。 角鲨烯乳液是与TLR激动剂结合的第三常见的材料，在已识别的临床试验中。这些与GLA和SLA结合的稳定乳液将在下一节中讨论。如前一节所讨论的Ad5载体也用于传递dsRNA发夹，它作为TLR3激动剂。这种组合出现在两项独特的疫苗配方和三项试验中，是临床试验空间中唯一的病毒载体和TLR激动剂的组合。临床试验空间中也有新颖的组合材料。TriAdj是一种独特的组合，由宿主防御肽IDR-1002、阳离子聚合物佐剂聚磷氮烷（PCEP）和TLR3激动剂Poly I:C组成。虽然IDR-1002尚未显示出增强免疫细胞释放促炎细胞因子的能力，但它已在体外显示出是强效的诱导剂，对人类外周血单核细胞产生中性粒细胞趋化因子CXCL1和CXCL8以及单核细胞趋化因子CCL2和CCL7。这将有助于通过白细胞募集在注射部位创造一个免疫能力环境。另一方面，PCEP单独与小鼠抗原一起交付时，促进了IFNy和IL-4的产生，导致强大的抗原特异性Th1和Th2反应。另一种新颖的组合材料，右旋糖酐DEAE，用于针对结核病的GamTBvac疫苗（NCT04975737）。右旋糖酐是一种天然多糖，是药物和抗原传递中最研究的α-葡聚糖之一；它已被证明可以增强细胞和体液反应，尽管确切机制尚不清楚。在GamTBvac中，阳离子右旋糖酐衍生物，右旋糖酐-DEAE，被CpG 2216（TLR9激动剂）包围，形成完整的佐剂系统，而抗原与右旋糖酐结合域融合，并在右旋糖酐上非共价固定。与右旋糖酐类似，右旋糖酐-DEAE的机制尚不清楚，但已显示出这种多组分佐剂允许抗原缓慢释放，刺激TLR9，并激活吞噬作用，所有这些都导致Th1免疫反应。最后一个新颖的组合材料也是一种天然多糖，菊粉，被配方成颗粒并与TLR9激动剂CpG55.2结合，用于针对COVID-19的佐剂系统（NCT05279456）。作为一种植物衍生的多糖，天然形式的菊粉没有免疫调节活性；然而，当结晶成颗粒形成δ-菊粉时，它具有强大的佐剂活性。δ-菊粉在40°C以上的温度下才溶解，这意味着它在体内保持稳定，可能增强其免疫学能力。重要的是，它还显示出启动人类补体系统，导致抗体反应，以及结合到单核细胞并增强它们的趋化因子产生。这些组合材料在佐剂系统中各自发挥作用，与TLR激动剂协同作用，并增强整体免疫反应。 3.5.乳液佐剂 乳液佐剂自2013年AS03在许可的H1N1疫苗中使用以来，一直在FDA许可的疫苗中使用，随后在2015年的流感疫苗中使用MF59。AS03和MF59都是基于角鲨烯的水包油乳液，AS03还包括(D,L)-α-生育酚（维生素E）以增加额外的免疫激活。在当前的临床试验景观中，大约9%的试验和大约8%正在评估的独特疫苗配方包含乳液佐剂。目前正在活跃的试验中评估12种独特的乳液佐剂，其中两种（AS03和MF59）已经用于许可的疫苗中。水包油（O/W）乳液是临床试验中最主要测试的乳液佐剂形式，也是许可疫苗空间中的形式，12种独特乳液佐剂中有11种是水包油乳液。另一种正在评估的乳液是油包水（W/O）乳液。这两种乳液之间的主要区别在于它们的连续相和分散相。O/W乳液具有水的连续相，油相分散其中，而W/O乳液则相反。在这两种类型的乳液中实现乳液的稳定性都很困难，但由于水滴的高流动性，W/O乳液的稳定性更低。此外，由于油的高浓度，W/O乳液的毒性和局部反应原性是一个更大的问题，导致在临床中评估的W/O乳液较少。 3.5.1.油包水乳液 Montanide ISA-51是目前唯一在临床试验中测试的W/O乳液，与肽配方结合，用于针对COVID-19的保护。这种乳液由矿物油和来自曼尼德单油酸酯家族的表面活性剂组成。W/O佐剂将留在注射部位并创建一个库，以缓慢释放抗原，这有助于整体免疫反应。此外，这种W/O库诱导炎症，并导致免疫细胞的募集以摄取抗原。虽然这些佐剂在增强对抗原的免疫反应方面非常有效，但它们可能带来严重的局部和系统性不良反应，这也是过去相关临床试验终止的原因。特别是，当以前在HIV疫苗中评估时，Montanide ISA-51的注射随后是注射部位的局部肿胀以及头痛、恶心和发烧等系统性反应。最令人关注的是，在多名患者中注射部位形成了无菌脓肿，这被认为是由佐剂诱导的炎症引起的。佐剂可以长时间留在注射部位，免疫细胞清除疫苗需要数月时间。由于这一点，以及油中产品持续激活TLRs引发的炎症级联反应，这种佐剂可能导致严重的炎症反应，对患者产生负面影响。 3.5.2.水包油乳液 对于O/W乳液，角鲨烯是临床试验中这些佐剂中使用的主要材料。事实上，在活跃试验中的11种独特的O/W乳液中，除了一种之外，都包含角鲨烯在它们的配方中。角鲨烯是一种从植物和鲨鱼肝油等几个关键来源天然衍生的三萜。在许多配方中，角鲨烯被用来稳定配方，促进抗原的溶解，并改变抗原的释放。它也是一种生物相容材料，与许多W/O乳液中使用的矿物油相比，它表现出较少的持续毒性。然而，过度捕捞减少了鲨鱼的数量并增强了对它们的保护，未来几年需要更可持续的资源。 MF59类似物 许可的角鲨烯乳液佐剂MF59目前正在七项临床试验中评估流感和COVID-19疫苗。当前临床试验空间中使用与MF59相同成分的另外三种佐剂（表2），其中SCT-VA02B在三项针对COVID-19的独特疫苗配方中使用相同的配方。SWE用略微改变的组成配方乳液，因此可以自由进行技术转让，以装备发展中国家的疫苗制造商；其组成有角鲨烯占3.9%，两种表面活性剂均为0.47%，目前正在评估COVID-19疫苗。SQBA佐剂呈现出与SWE类似的配方，也正在评估COVID-19疫苗。尽管配方有轻微变化，但这些角鲨烯乳液利用相同的免疫激活和反应有效地发挥作用作为佐剂。它们通过肌肉细胞释放ATP和细胞因子诱导，导致炎症细胞涌入注射部位，摄取抗原并将其带到引流淋巴结进行处理，从而在注射部位创造短暂和局部的免疫能力环境。MF59还显示出在淋巴结诱导RIPK3依赖性坏死凋亡，随后是凋亡，这与其诱导CD8+ T细胞反应和抗体反应的能力有关。已经研究了MF59中每个单独组分在加强免疫反应中的影响。单独的组分并不像整个配方那样有效。事实上，角鲨烯、Tween 80和柠檬酸缓冲液单独交付时没有免疫刺激性效果。Span 85在肌肉中确实有刺激性效果，但没有导致抗体或T细胞的产生，而MF59配方实现了这一点。 AS03类似物 AS03是另一种基于角鲨烯的乳液，通过包含DL-α-生育酚和去除Span 85，所有这些都在PBS缓冲液中配方，略有不同的组成。目前正在临床评估的两种其他佐剂包含AS03的不同变体（表2），其中BFA03代表相同组分的类似配方，以及用较少DL-α-生育酚（10 mg/ml）和饱和衍生物角鲨烷（30 mg/ml）配方的角鲨烷基乳液。AS03目前正在11项试验中的五项独特疫苗配方中评估，用于针对COVID-19和乙型肝炎的保护，BFA03（NCT05398848）和角鲨烷基乳液（NCT05726084）每种都用于针对COVID-19的保护。添加DL-α-生育酚（合成形式的维生素E）区分了这些配方及其产生的免疫反应，与MF59类似。与角鲨烯类似，DL-α-生育酚是一种可生物降解的聚异戊二烯。与不包含DL-α-生育酚的AS03配方相比，其中使用了等量的角鲨烯作为替代品，不含DL-α-生育酚的配方在肌肉中细胞因子释放的增加更早，与完整的配方相比，后者在注射后24小时调节了更多的促炎细胞因子。此外，当从配方中省略DL-α-生育酚时，观察到引流淋巴结中粒细胞浸润和单核细胞抗原装载的减少。这些配方依赖的先天免疫反应的变化导致在没有DL-α-生育酚的情况下接种疫苗时抗体反应减少了3.5至6倍。总的来说，AS03及其目前在临床中的类似物受益于DL-α-生育酚的添加。与MF59直接比较针对H5N1株的保护时，两种佐剂都能诱导广泛的同源和异源亚型抗体反应；然而，AS03实现了比MF59更高的抗体滴度和广度，突出了DL-α-生育酚在配方中的潜在益处。 GLA-SE 和 SLA-SE GLA-SE 和 SLA-SE 都使用了相同的角鲨烯乳液，称为稳定乳液（SE），它允许分别吸收 TLR 激动剂 GLA 和 SLA。这些乳液由 AAHI 开发，该公司也开发了 TLR 激动剂。这些乳液最初是首先基于配方的稳定性，其次是基于由此产生的适应性免疫反应而设计的。所得到的乳液由磷酸铵缓冲液中的水相与表面活性剂poloxamer 188（0.9 mg/ml）和甘油（22.5 mg/ml）混合乳化，以及包含DMPC（19 mg/ml）和 GLA 或 SLA（0.25 mg/ml）的10%油相在角鲨烯油中。这种75-90 nm大小的颗粒被发现在小鼠中诱导依赖于配方的免疫反应。具体来说，在评估 GLA-SE、单独的 SE 和水溶液配方中的 GLA（GLA-AF）时，与其它配方相比，GLA-SE 显示出产生强大的抗原特异性 Th1 反应，增加抗原特异性 Th1 CD4 细胞和抗体同种型转换到 IgG2c 亚类。这种对先天和适应性反应的增强主要归因于 GLA-SE 启动 IFNy 产生和激活炎症体——一种病原体识别途径——的能力，与单独的 SE 或 GLA-AF 相比。在当前的临床试验空间中，SLA-SE 正在一项针对带状疱疹保护的试验中使用，而 GLA-SE 与 MF59 一样在该领域中占据主导地位，出现在九项试验中的七种独特的疫苗配方中，使其成为在活跃的临床试验中研究最多的乳液配方，尚未在 FDA 许可的疫苗中使用。 LiteVax LiteVax 是一种新型角鲨烯乳液配方，与 MF59 和 AS03 保持相似，其中角鲨烯是主要成分，浓度为 80 mg/ml，表面活性剂 Tween 80 为 40 mg/ml。目前，LiteVax 正在作为已许可的季节性流感疫苗的佐剂在临床中使用。LiteVax 与 AS03 和 MF59 不同之处在于引入了另一种免疫调节成分，麦芽糖 40-单硫酸酯 1,2,3,6,20,30,60-十七烷酸酯（CMS），浓度为 40 mg/ml，与其他成分在 PBS 中配方。CMS 是碳水化合物脂肪酸硫酸酯（CFASE）的单硫酸盐衍生物。CFASE 佐剂之前在癌症疫苗和如流感等传染病的佐剂中进行了探索；然而，其毒性和副作用，如局部反应原性和体温升高，导致探索 CFASE 的改良。CMS 比 CFASE 反应原性低，同时保持免疫学益处，并且在针对流感的疫苗接种中能够产生比 MF59 类似物高 10-20 倍的抗体滴度。尽管完整的 LiteVax 配方被发现在体外轻微调节树突状细胞激活，但单独的 CMS 被发现在上调成熟共刺激标志物方面比完整配方更有效。这表明 CMS 对 LiteVax 的免疫调节活性的重要性，以及 CMS 增强乳液佐剂免疫反应的潜力。 Ne01（20% 纳米乳液） Ne01 是活跃的临床研究中唯一不包含角鲨烯的 O/W 乳液配方。它专门设计为粘膜佐剂，目前正在评估作为鼻内 H5N1 疫苗。这种乳液（400 nm 大小）最初在密歇根大学发明，现在由 BlueWillow Biologics 开发。它通过在水中乳化十六烷基氯化吡啶（CPC, 1%）、Tween 80（5%）和乙醇（8%），与大豆油（64%）混合制造，并且在室温下与抗原结合保持稳定和免疫原性长达 6 个月，在 40°C 下保持 3 个月。这种佐剂已经在雪貂中显示出产生强烈的细胞和体液反应，并有效地保护它们免受 H5N1 的致命挑战。虽然这种佐剂的确切机制仍在阐明中，但它已经显示出通过产生 IL-6 和 IL-17 产生 Th17 反应，也通过产生 IFNy 产生 Th1 反应。此外，已经显示 Ne01 导致抗原摄取和随后的上皮细胞凋亡，然后被树突状细胞吞噬，导致抗原摄取和 APC 成熟的间接途径。 3.6.以前许可的减毒活疫苗 减毒活疫苗由于使用活体、减毒的病毒，具有固有的佐剂特性。在针对疟疾保护的临床试验中，卡介苗（BCG）——减毒结核病（TB）疫苗——和黄热病疫苗YF-17D（也称为Stamaril）被皮内注射，与抗原一起用作佐剂。卡介苗由Calmette和Guerin开发，自1921年首次用于人类以来，至今仍是唯一许可的TB疫苗。它由导致牛结核病的分枝杆菌的减毒株组成，已被证明除了结核病外，还能对其他分枝杆菌感染如麻风病和Buruli溃疡提供保护。卡介苗在注射部位广泛诱导促炎反应，导致免疫细胞浸润和IFNy释放增加。卡介苗表达的各种蛋白质作为TLR激动剂，可以刺激免疫细胞。最终，这些先天反应导致强烈的体液和细胞适应性免疫反应。 黄热病疫苗Stamaril或YF-17D由Sanofi开发，于1987年获得WHO预认证，但在美国仍被视为研究性产品，未获得许可。它使用黄热病病毒的减毒17D-204株；重要的是，黄热病病毒疫苗的17D系列被认为是迄今为止生产最有效和最安全的减毒活疫苗之一。该疫苗通过多种TLR激动剂激活几种树突状细胞亚群，导致促炎细胞因子的产生，并导致强大的体液和细胞适应性免疫反应。 4.结论 佐剂是疫苗的重要组成部分，不仅可以增强整体免疫反应，还可以增强疫苗稳定性。当用于针对传染病的疫苗时，应用能够使疫苗在没有有效冷藏的情况下运输到各个地区的材料，或通过减少所需疫苗剂量和/或频率来降低疫苗成本，这一点至关重要。然而，尽管佐剂有潜力改善疫苗接种，但在铝盐获得批准后的近80年里，第二个获得FDA批准的佐剂才出现。尽管自2010年代以来，许可疫苗中使用了更多的佐剂，但铝盐继续主导佐剂领域，并且仍然是临床试验空间中最常用的佐剂。然而，就像单一抗原不能期望对所有病原体提供保护一样，单一佐剂也不能。正如在COVID-19大流行期间所经历的那样，新的或复杂的病毒和病原体需要在佐剂空间以及抗原方面的设计意图。这种完整的疫苗设计对于引发广泛和长期的保护至关重要。虽然超过一半针对传染病疫苗的活跃临床试验没有使用佐剂或使用了以前许可疫苗中的佐剂，但36%的试验正在研究尚未在许可疫苗空间中使用的新型佐剂。这些佐剂基于各种材料，如纳米颗粒、病毒载体、TLR激动剂和乳液，单独使用或与其他免疫调节材料结合使用。 展望未来，应评估更多材料作为疫苗接种中的佐剂，并应对多种抗原和疾病评估其免疫调节效果。在临床试验空间中，佐剂创新和探索方面存在明显差距。我们不能继续依赖我们已经拥有的材料来满足即将到来的大流行病的需求，也不能期望一个免疫原性差的抗原能引发足够强烈的免疫反应。通过对免疫调节化合物的更强大的物质理解，我们可以准备制定涉及合理设计的抗原以及佐剂的有效疫苗。佐剂的安全性在为公众接种疫苗时也极为重要，可能是许多在临床试验中评估的疫苗不使用佐剂或涉及以前许可疫苗中的佐剂的主要原因，这些疫苗具有经过验证的安全性。然而，通过有意识地设计安全性和免疫原性兼顾的佐剂，我们最终可以制定出更有效的疫苗，而不会牺牲患者的安全性。虽然疫苗一直是公共卫生的一部分，但佐剂领域相对处于起步阶段，看到未来我们将欢迎哪些新材料进入该领域将是令人兴奋的。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。