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听力损失即听觉系统异常引起的听功能障碍，是最常见的感觉障碍性疾病。然而，遗传性耳聋临床尚无有效治疗药物，探究新的疗法是耳聋治疗领域的研究重点，基因治疗为遗传性耳聋提供了根治的可能。近期，由中国细胞生物学学会细胞与基因治疗分会主办的第四届中国细胞与基因治疗大会在天津隆重举行。本次大会上，梅斯医学特邀来自复旦大学附属眼耳鼻喉科医院王天奇博士分享耳聋基因治疗现状及取得大重磅成果。 梅斯医学：近年来，基因疗法的快速发展给耳聋儿童带来了重获听力的希望。临床上关于耳聋基因治疗研究现状如何？目前已知导致遗传性耳聋的主要基因有哪些？ 王天奇博士：基因治疗是指将正常功能的基因或有治疗作用的基因通过一定方式导入靶细胞内，以纠正、替代基因缺陷或者异常，实现治疗疾病的方法。近年来，随着基因疗法的快速发展，耳聋基因治疗为耳聋患者带来了新希望。据世界卫生组织(WHO) 统计，全球患有致残性听力损失的人数约为 4.66 亿人，占世界总人口的 5%，其中成年人 4.32 亿人、儿童 3400 万人。全球约 1/500 的新生儿患有听力损失，约 2600 万先天性耳聋患者；我国每年新增约 3 万例新生聋儿，其中约 60% 与遗传因素有关。耳聋可以由多种原因引起，但大致上可以归结为两大类：环境因素和遗传因素。值得注意的是，在所有先天性耳聋案例中，遗传因素导致的病例占据了相当大的比例。由于遗传性耳聋的原因相对清晰，因此在基因治疗领域有着广阔的前景。 耳聋基因治疗正是我们团队目前关注的重点之一，也是有望实现耳聋治疗重大突破的关键方向。至今为止，科学家已经识别出超过200种与听力损失相关的基因。在临床前动物模型中，针对 VGLUT3、GJB2、GJB6、KCNQ1、PJVK、TMC1、OTOF、STRC、SYNE4、MYO6、KCNQ4、PCDH15、ATP2B2 等致聋基因，研发了有效的基因治疗策略。 梅斯医学：从开始研究耳聋基因治疗到现在，您的团队是否取得了阶段性成果？在研究过程中，经历了哪些关键的突破点？ 王天奇博士：针对OTOF基因突变导致的耳聋患者，基因治疗提供了一种潜在的革命性治疗方法。2022年，我们的研究小组成功开发出一种针对OTOF基因缺陷的创新基因疗法。同年12月，该疗法首次应用于人体，并于次年的10月份发布了初步临床试验结果，耐受性和安全性好，且成功纠正患儿听力。这一成就标志着世界上首例遗传性耳聋基因治疗取得了实质性的进展。自那时起，全球范围内的多个研究机构纷纷加入到了耳聋基因治疗的研究行列当中。当前阶段，中国、欧洲以及美国共有四家企业正在开展相关临床试验。这些研究均显示出积极的疗效反馈，并且到目前为止没有观察到显著的副作用出现。 OTOF基因编码一种名为otoferlin的蛋白质，这种蛋白质在内耳毛细胞中发挥着关键作用，特别是在声音信号向听觉神经传递的过程中。当OTOF基因发生突变时，会导致otoferlin蛋白的功能障碍或缺失，从而引发严重的听力损失。然而，在针对OTOF基因进行基因治疗的技术难点主要在于该基因较大，其全长约为6kb。我们采用的基因疗法是使用腺相关病毒（AAV）载体进行基因置换。然而，AAV载体的有效载荷只有约4.7kb，这超出了单个AAV载体的递送上限。为了解决这个问题，我们采用了双AAV递送策略。具体来说，我们将OTOF基因一分为二，分别用两个AAV载体递送，然后在细胞内重组形成有功能的蛋白质。这种方法在全球范围内是首次利用双AAV载体实现遗传性疾病基因治疗并产生疗效的策略。 在整个药物研发过程中，我们还面临了许多其他困难。例如，如何确定将OTOF基因分成两部分的具体位点，以及如何确保这两个部分在细胞内正确重组并发挥功能。此外，还需要评估双AAV载体在体内的临床安全性和有效性。为了推进OTOF基因疗法进入临床阶段，我们还研发了一种给药装置，通过外耳道将基因治疗药物递送到耳蜗内耳。这包括整个手术路径的设计、药物给药方式的优化，以及临床前筛选和临床试验中的有效性和安全性指标的制定。 梅斯医学：未来，耳聋基因治疗还有哪些待解决的重要问题？您关注的热点方向有哪些？ 王天奇博士：遗传因素导致的耳聋仅占总耳聋病例的大约10%或更少，大多数耳聋情况实际上是由后天因素引发的。对于这类后天性耳聋患者，目前临床上缺乏有效的药物治疗方法，主要依赖助听器或人工耳蜗来改善听力状况。尽管这些设备能够在一定程度上帮助恢复听力，但它们的普及率并不高，部分原因在于长期使用可能会给佩戴者带来不便。 在遗传性耳聋领域，已知与该疾病相关的基因超过200种。然而，在这众多候选基因中，只有OTOF基因的治疗方案已经在临床试验中显示出了一定的疗效。相比之下，针对其他一些较为常见的致病基因（如GJB2、SLC26A4/Pendred综合征相关基因以及TMC1）的研究则仍处于较初级阶段，距离实现临床应用尚需时日。 此外，从基础研究到最终产品上市的过程充满了挑战。不仅需要解决科学和技术上的难题，还要克服监管审批、生产工艺优化及市场推广等一系列问题。因此，将实验室里的发现转化为真正能够惠及广大患者的医疗产品，是一条漫长而复杂的道路。在此过程中，持续不断地探索和创新将是推动这一领域向前发展的关键。 来源 | 梅斯医学官网 编辑 | Swagpp ● 深思！规培生从三甲学了腹腔镜手术，回到基层没法做！只会腹腔镜不会开腹，是误入歧途？腹腔镜已成主流，卫生院不开展，到底能做啥？ ● 睡了等于没睡！川大华西最新：碎片化睡眠损害代谢和认知能力，但补充这个东西能逆转 ● 重磅！在三明医改深刻变革下，选择大医院还是基层医院？当地医生爆料基层工资可超三甲，不拖欠！江浙沪城市社区医院必将越来越吃香！ 版权说明：梅斯医学（MedSci）是国内领先的医学科研与学术服务平台，致力于医疗质量的改进，为临床实践提供智慧、精准的决策支持，让医生与患者受益。欢迎个人转发至朋友圈，谢绝媒体或机构未经授权以任何形式转载至其他平台。 点击下方「阅读原文」 立刻下载梅斯医学APP！

作者｜小鱼  摘要： 诸多研究正在将与自免相关的炎症靶点和PROTAC两者相结合，比较热门的靶点是HDAC VI、IRAK3/4、PCAF、GCN5、JAK/STAT、RIPK2、STING、MIF、IKZF，针对这些靶点设计开发用于自免治疗的PROTACs，在临床前阶段显示出良好的体外效力。 引言： 炎症可以是自身免疫性疾病的一个触发因素，也可以是其结果。例如，类风湿性关节炎（RA）和系统性红斑狼疮（SLE）等自身免疫性疾病的发病机制中，炎症反应是关键的组成部分。此外，炎症性细胞因子如IL-1β、TNF-α和IL-6等在自身免疫性疾病的发展中起着重要作用。 图1 炎症信号通路 PROTAC（Proteolysis Targeting Chimeras，蛋白降解靶向嵌合体）是一种创新的蛋白质降解技术，其结构由三部分组成：一端是与目标蛋白（POI）结合的配体，另一端是与特定的E3泛素连接酶结合的配体，中间通过一个Linker（连接子）相连。这种设计使得PROTAC分子能够同时结合目标蛋白和E3泛素连接酶，从而促进目标蛋白的泛素化，并通过泛素-蛋白酶体途径（UPS）实现目标蛋白的选择性降解。 图2 PROTAC结构及作用机制 通过设计特定的PROTAC分子，可以诱导与自身免疫性疾病相关的靶蛋白降解，从而为治疗这些疾病提供新的策略。在设计和评估PROTAC分子时，研究人员会关注其诱导靶蛋白降解的能力，这通常通过DC50（半最大降解浓度）和Dmax来量化。DC50是指能够导致目标蛋白降解50%的PROTAC浓度，而Dmax则表示在饱和浓度下PROTAC能实现的最大降解水平。现将HDAC VI、IRAK3/4、PCAF、GCN5、JAK/STAT、RIPK2、STING、MIF、IKZF靶点的临床前PROTACs开发情况介绍如下： 1 HDAC VI（组蛋白去乙酰化酶6）组蛋白去乙酰化酶（HDAC）是一类重要的酶，它们通过去除组蛋白上的乙酰基团来调控基因的表达。HDAC的功能异常与多种疾病的发生发展有关，尤其是癌症。阻断HDAC可导致细胞死亡和抗炎活性。用于癌症治疗的强效HDAC抑制剂，TSA（Trichostatin A）、SAHA（Suberoylanilide Hydroxamic Acid）等，可以减少诱导关节炎大鼠的肿胀、血管形成和骨侵蚀。 HDAC VI是目前与自身免疫性疾病关联最大的HDAC家族成员，负责炎症的调节，阻断HDAC VI可治疗类风湿性关节炎，以改善滑膜炎症。以下是针对HDAC V1靶点的PROTAC开发情况： Compound2：Cao等人引入了“点击”化学的概念，合成了由不同连接子长度组成的PROTAC分子。其中化合物2的体外研究显示，DC50为108.9 nM，能够显著降解HDAC VI，以及减少 IL-1β（白细胞介素-1β）的释放和p20（caspase-1的中间体片段）的产生；体内研究表明，化合物2降低IL-1β水平，而不影响TNF- α（肿瘤坏死因子-α）水平。 Compound3：Yang等人合成的PROTAC分子，以来那度胺作为配体与CRBN（E3连接酶配体）结合，DC50为1.9 nM，显著降解HDAC VI。  图3 靶向HDAC VI的PROTACs 2 IRAK3/4（IL-1受体相关激酶） IRAK（Interleukin-1 receptor-associated kinase）是与IL-1R和Toll样受体（TLR）信号传导相关的一类丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶。IRAK家族成员通过激活下游的信号转导分子如NF-κB和MAPK途径，在调节炎症反应和免疫反应中起着关键作用。其中IRAK-4尤其重要，因为它是固有免疫系统中IL-1家族和TLR家族信号通路交汇的关键节点，参与全身炎症反应的调控。IRAK4蛋白涉及类风湿关节炎和化脓性汗腺炎（HS），是目前治疗免疫疾病的深入研究课题。由于IRAK1和IRAK4的ATP结合位点之间的高度相似性，IRAK4的选择性抑制剂或可治疗系统性红斑狼疮。 Compound5、6：Kargbo等认为，PROTAC可以克服IRAK4蛋白的催化结构域高度保守的限制，开发的化合物5、6可有效降解IRAK4，IC50和DC50值低于30 nM。 Compound7、8：Nunes等人使用异喹啉弹头（IRAK4抑制剂）和各种E3配体，如VHL（VonHippel-Lindau）、CRBN或IAP（凋亡抑制剂蛋白）。其中，含有氟基团的化合物7的DC50为259 nM。进一步细化结构，化合物8采用螺旋环嘧啶连接子，比柔性的线性碳链更具刚性和极性，DC50为151 nM。 Compound9：Chen等人研究发现，采用更短长度连接子的PROTACs并没有观察到IRAK4的显著降解，而含有PEG（聚乙二醇）连接子的化合物9可以有效地降低IRAK4的水平。 Compound10：Zhang等人，将环丙基作为连接子偶联位点，化合物10抑制了IL-6的产生；接着改变连接子，合成一系列PROTACs，其中化合物10b和10d的DC50值为190 nM和405 nM。 Compound11、12：Degorce等人在研究IRAK4蛋白时，偶然发现IRAK3抑制剂治疗自免疾病的功效。POI配体采用吡咯三嗪的顺式异构体，E3连接酶配体采用VHL或CRBN。研究表明，含有PEG连接子的CRBN比VHL具有更好的降解能力，且在采用CRBN的情况下，连接子的长度与降解效果成正比。化合物11和12选择性降解IRAK3，DC50分别为0.052 μM和0.002 μM，Dmax分别为74%和98%。 Compound13：Rowley等人也做出了类似的努力，他们研究了IRAK3蛋白来控制树突状细胞介导的IL-12。采用克唑替尼作为POI配体，VHL作为E3连接酶配体，反式环己酰胺作为连接子，化合物13能够有效降解IRAK3，DC50为94 nM和 Dmax为95%。用化合物13处理树突状细胞后，无论LPS（脂多糖）存不存在，IRAK3均被降解，同时在LPS刺激下，IL-12p水平显著升高。 图4 靶向IRAK3/4的PROTACs 3 PCAF和GCN5（p300/cbp相关因子和组蛋白乙酰转移酶） PCAF和GCN5是密切相关的表观遗传蛋白，在多种细胞通路中调节免疫功能。阻断PCAF和GCN5治疗自身免疫性疾病的机制是通过，减少H3K18、H3K9乙酰化， 抑制NF-κB，IFN-β，TBK1过表达，调节炎症免疫信号。 Compound14：Bassi等人采用PCAF和GCN5的活性抑制剂GSK 4027作为POI配体，采用CRBN作为E3连接酶配体，化合物14能够有效降解PCAF和GCN5，DC50分别为1.5 nM，3 nM。在10 min内，浓度为30 nM的化合物14能使蛋白降解80%。  图5 靶向PCAF/GCN5的PROTACs 4 JAK/STAT（Janus激酶信号转导因子/转录激活因子） JAK/STAT通路是一种重要的细胞内信号传导途径，细胞因子与JAK受体结合，启动STAT转磷酸化，导致增殖和分化等活性的基因表达，引发多种疾病，如类风湿性关节炎（RA）、阿尔茨海默病（AD）、炎症性肠病（IBD）和多发性硬化症（MS）。JAK抑制剂，如Tofacitinib、Ruxolitinib、Baricitinib等，通过调节T细胞活化和自然杀伤（NK）细胞活性，改善类风湿性关节炎。 尽管JAK/STAT靶点已经发现了几十年，但其开发仍存在挑战，如药物半衰期短、血栓栓塞等副作用以及JAK/STAT通路和非典型信号转导之间的串扰。PROTACs可能是破局之选。 Compound21-26：Shah等人，以嘧啶和喹恶啉核作为POI配体。其中，喹恶啉基序的细胞渗透性优于嘧啶基序，且对JAK2具有更高的选择性，已证明6个PROTACs具有降解JAK1和JAK2的作用。 Compound28-30：Kargbo等人发现化合物28的EC50为0.0002 μM，进一步设计了含有Ruxolitinib、Baricitinib（强效JAK抑制剂）的化学物29和30，EC50分别为0.00054 μM和0.0039 μM。 图6 靶向JAK/STAT的PROTACs 5 RIPK2（受体相互作用蛋白激酶2） RIPK2是一种在细胞内信号传导中起关键作用的激酶，参与调节细胞的固有免疫、适应性免疫以及凋亡过程。RIPK2的过度激活和功能失调可导致多种炎症性疾病、自身免疫疾病、癌症以及神经系统疾病。到目前为止，由于泛抑制作用，还没有可用于临床的RIPK2抑制剂。 Compound32-34：Mares等人开发了化合物32，pDC50（DC50的负对数）为9.4± 0.2，但溶解度较差。进一步，通过添加非亲脂性基团来提高溶解度，合成化合物33，pDC50为7.9。进一步，为了解决大剂量依赖性，所合成的化合物34，效力增加了10倍，pIC50为8.0。 Compound35：Bondeson等人开发的化合物35，DC50为1.4 nM，Dmax为95%。 图7 靶向RIPK2的PROTACs 6 STING（人体干扰素基因刺激因子） STING是一种在固有免疫反应中起关键作用的信号转导分子，被来自病原体和宿主细胞质DNA激活后，激活促炎介质，如细胞因子和IFNs的释放来对抗细菌感染。 Compound45-50：Liu等设计了PROTACs来靶向STING途径治疗各种自身免疫疾病，如系统性红斑狼疮。POI配体为C-170 STING抑制剂，E3连接酶配体为为CRBN，合成连接子长度不同的化合物45-50。其中，化合物47显示出最令人满意的结果，DC50值为3.2 μM。在小鼠肾脏组织中的体内研究表明，化合物47可以以剂量依赖的方式降低IFNβ、IL-6和CXCL-10的水平。  图8 靶向STING的PROTACs 7 MIF（巨噬细胞迁移抑制因子） 虽然MIF以其抗癌潜力而闻名，但它也与免疫反应有关。 Compound51-56：在Xiao等人开发的，以7-羟基香豆素和7-羟基-3,4-二氢苯并恶嗪-2-1核为POI配体，以CRBN为E3连接酶配体的化合物51-56中，化合物54表现最优，在2 μM时，与MIF的Ki值为71%，MIF在A549细胞中降解率为71%。 图9 靶向MIF的PROTACs 8 IKZF（Ikaros锌指转录因子） IKZF对免疫调节活性至关重要，其基因的多态性可导致系统性红斑狼疮。 Compound57、58：化合物57和58与CRBN-DDB1（DNA损伤结合蛋白-1）复合物属于强结合，KD值小于10 μM。 图10 靶向IKZF的PROTACs   小结   PROTACs在探索自身免疫性疾病等靶点方面具有良好的体外效力。在理想情况下，研究人员希望获得高Dmax值（例如大于90%的降解效率）和低DC50值，这意味着PROTAC分子在较低浓度下就能实现高效的蛋白降解，预示着更好的治疗效果和更低的副作用。通过优化PROTAC分子的设计，包括选择合适的靶蛋白（POI）配体、E3连接酶配体和连接子（linker），提高了PROTAC分子的疗效和选择性，有望成功将PROTACs带入自免治疗的临床阶段。 具体的设计有考虑到：①优化连接子长度以稳定三元配合物；②添加非亲脂性基团以增加溶解度；③POI配体只留下结合部位，其余修改为连接子，减少额外的毒性；④借助BioPROTACs和杂交PROTACs的研究进展，找到缺乏配体结合位点的POI的解决方案；⑤通过口服/静脉注射纳米制剂，持续递送药物，延长半衰期。 参考资料： https://doi.org/10.1039/D4MD00142G 10.12日，深圳；BiG第二届自免研讨会 8:50-8:55 领导致辞 8:55-9:00 联合主办方致辞 涂   欢：深圳医学科学院副院长、深圳湾实验室副主任 9:00-9:30 临床视角，创新药开发自免，如何选择适应症？ 徐沪济：海军军医大学长征医院大内科主任兼风湿科主任/清华大学医学院教授 9:30-10:00 药厂视角，自免布局和BD策略 10:00-10:30 MNC视角，AZ在肿瘤+自免的布局和开发策略 章   宇： 阿斯利康产品管线和项目管理副总裁 10:30-11:30 Panel：自免创新药如何立项？MNC&biotech的布局策略，BD合作背后的故事？ 肖昌春：赛诺菲中国研究负责人、赛诺菲研究院负责人 徐亚南：武田制药全球外部创新合作部中国区负责人 靳照宇：明济生物董事长兼CEO 朱向阳：华奥泰生物总经理 周潇薇：松禾资本董事总经理（主持） 11:30-12:30 Panel：从肿瘤转战自免，创新疗法（CAR-T/CAR- NK/双抗/ADC/PROTAC等）如何选择适应症，不同modality各自开发优势及挑战，在哪里？未来有哪些新靶标值得关注？ 范晓虎：湾岛细胞创始人/CEO 王立群：星奕昂生物创始人、董事长兼CEO 花海清：映恩生物研发副总裁 冯    焱：领泰生物创始人/CEO 张   雷：深圳湾实验室特聘研究员 卢宏韬：科望医药联合创始人/CSO、BiG总干事（主持） 12:30-14:00 午餐&参观&自由交流 ● 深圳医学科学院（SMART）、卫光生命科学园、湾有引力 14:00  论坛闭幕 报名入口  PS：免费席位有限，均为审核制 观众门票：0元 含12日自免会议&午餐；限biotech/Pharma、临床、院校科学家、投资机构代表 共建Biomedical创新生态圈！ 如何加入BiG会员？ ▼

内耳基因治疗的不断发展为遗传性耳聋的治疗提供了新的希望，并为其他遗传性疾病的治疗提供了新的借鉴。 超过全球人口的5%，即4.66亿人患有致残性听力障碍（中度以上听力障碍），其中3400万是儿童。中国致残性听力障碍患者约7000万，每年新生3万聋儿，其中60%是由遗传因素也就是基因缺陷引起。尽管目前已有150多种耳聋基因得到鉴定，但临床上尚无可以治疗的药物。随着生物医药技术的革新和发展，基因治疗目前被认为是根治遗传疾病最有前景的策略。基因治疗（gene therapy）是一种通过操纵目的基因来实现疾病治疗的技术，主要包括基因替代（gene replacement）、基因抑制（gene suppression）和基因编辑（gene editing）等策略。 近日，复旦大学附属眼耳鼻喉科医院舒易来教授团队在美国细胞与基因治疗学会会刊 Molecular Therapy上发表了题为：Advances in gene therapy hold promise for treating hereditary hearing loss 的综述论文。 该论文系统、全面论述了遗传性耳聋的分类及细胞学机制，并重点阐述了三种主要的基因治疗策略在遗传性耳聋临床前试验中的成功应用及现有临床试验进展，最后讨论了遗传性耳聋基因治疗的现有挑战和未来应用前景。 Molecular Therapy是国际上基因和细胞治疗领域顶级期刊，该杂志国际审稿人对于该论文给予了高度评价，认为“本文主要通讯作者舒易来医生作为具有强大科学背景的临床医生，在耳聋基因治疗领域做出了多项重要的原创性贡献”，同时评价“本文对临床转化的总结和观点会引起读者兴趣、富有意义”。（＂The senior authors have been active in the field for a number of years and haveauthored several important original articles…Written by clinicians with a strong scientific background, the translational aspects of the research are highlighted and an overview of recently approved clinical trials is presented together …Overall, I believe that the article is of interest to the readers of Molecular Therapy …＂）. 就遗传性耳聋而言，鉴于内耳是一个相对封闭且充满液体（内淋巴液和外淋巴液）的腔室，理论上，基因治疗药物（如病毒、核苷酸、核蛋白复合体等）通过局部给药后可随淋巴液扩散至众多内耳靶细胞而相对不易大量外泄，因此内耳比较适合开展基因治疗。 随着基因操控工具的不断迭代更新，尤其是CRISPR-Cas9系统的出现和不断优化，近年来遗传性耳聋的基因治疗取得了令人瞩目的进展。在临床前研究中，超过40项研究利用基因治疗策略成功纠正了20余个致聋基因相关动物模型的听力。值得一提的是，全球已有三项遗传性耳聋的基因治疗临床试验被批准，其中包括复旦大学附属眼耳鼻喉科医院的舒易来教授团队主导的项目，该项目率先完成了全球首例OTOF遗传性耳聋患者的体内给药，该领域我国学者走在了国际最前沿。 1.遗传性耳聋的分类 根据除听觉系统外是否有其它器官的临床症状，遗传性耳聋可分为综合征型听力障碍（syndromic hearing loss，SHL）和非综合征型听力障碍（non-syndromic hearing loss，NSHL）。 1.1.非综合征型遗传性耳聋 约70%的遗传性耳聋患者为非综合征型。NSHL最常见的遗传方式是常染色体隐性遗传（75%-80%），其次是常染色体显性遗传（20%），X染色体连锁遗传（＜2%）和线粒体遗传（＜1%）。迄今为止，已有120多个基因被报道与NSHL相关。其中GJB2是最常见的致病基因（21.6%），其次是STRC（16.1%）、SLC26A4（6.6%）和TECTA（5.2%）。 1）常染色体隐性NSHL（ARNSHL）通常是语前聋，常表现为所有频率的重度到极重度耳聋。到目前为止，已有78个基因突变被报道与ADNSHL相关，包括GJB2、STRC、SLC26A4、GJB6、TMC1、OTOF、CDH23、MYO6和SYNE4等。 2）常染色体显性NSHL（ADNSHL）通常是语后聋，其耳聋程度比ARNSHL轻。已有51个耳聋基因被报道，常包括编码电压门控钾离子通道的KCNQ4基因、编码α-tectorin的TECTA基因、WFS1基因和COCH基因的突变。有趣的是，某些ADNSHL在不同频率下有不同程度的听力损失，例如，KCNQ4基因突变通常导致高频听力损失，而WFS1基因突变患者则导致低频听力损失。 3）X染色体连锁和线粒体非综合征型耳聋NSHL相对少见。5个基因（POU3F4、PRPS1、SMPX、AIFM1和COL4A6）与X连锁NSHL相关，其中转录因子POU3F4的突变是最常见的致聋原因。线粒体12S核糖体核糖核酸（rRNA）的A1555G突变和C1494T突变是线粒体遗传模式，不同于直接引起的听力损失，这两个线粒体基因的突变会导致患者对氨基糖苷类抗生素非常敏感，从而在给予治疗剂量的药物时会发生听力损失。 1.2.综合征型听力损失 SHL常伴有其它系统的临床表现，包括眼睛、心脏、肾脏、神经系统、皮肤、骨骼等，占遗传性耳聋的30%。SHL中以Pendred综合征、Usher综合征（USH）和Waardenburg综合征（WS）最为著名；而USH、Pendred综合征和Jervell and Lange-Nielsen综合征（JLNS）已在临床前动物模型研究中成功获得内耳基因治疗。 1）Usher综合征以感音神经性耳聋、视网膜色素变性和前庭功能障碍等为主要临床特征。在40种影响视力的听力损失中，高达50%是由Usher综合征引起，每10万人有3.5 ~ 6.2人患病。目前，USH有两种分类方式，包括临床异质性和遗传异质性分类。就临床异质性而言，根据发病年龄、表型严重程度和前庭功能是否受影响，USH可细分为三种临床分类：USH1、USH2和USH3。就遗传异质性而言，每种亚型的USH可归因于多个基因突变——USH1（MYO7A、USH1C、CDH23、PCDH15、USH1G和CIB2）、USH2（USH2A、ADGRV1和WHRN）和USH3（CLRN1）。这些基因编码的蛋白质在内耳耳蜗和前庭以及视网膜的光感受器细胞中表达，因此解释了为什么USH会同时影响听觉和视觉系统。 2）Pendred综合征也称为耳聋-甲状腺综合征，是最常见的常染色体隐性SHL之一，患病率约为7.5/100,000。患该综合征的病人不仅表现于导水管扩张，而且还可表现出前庭功能障碍以及甲状腺肿。目前，已确定Pendred的致病基因有：SLC26A4、FOXI1和KCNJ10。大约一半以上的病例与SLC26A4突变相关。SLC26A4基因编码pendrin蛋白，是一种多功能阴离子交换蛋白，主要表达于内耳和甲状腺，对耳蜗内淋巴和甲状腺细胞的离子稳态至关重要。 3）Jervell and Lange-Nielsen综合征（JLNS）表现为心律失常和感音神经性耳聋，患病率为1.6-6 / 1,000,000。该类患者心律失常的主要表现为QT间期延长。目前认为JLNS与两个耳聋基因（KCNQ1和KCNE1）突变有关，它们分别导致JLSN1和JLSN2，其中KCNQ1突变较为常见（约占90%）。这两个致病基因编码的离子通道蛋白对心脏和耳蜗的功能至关重要。 4）Waardenburg综合征（WS）是一种听觉-色素性疾病，常表现于常染色体显性遗传，患病率为1/42,000。研究发现，常导致该疾病的基因主要包括EDN3、EDNRB、MITF、PAX3、SNAI2和SOX10等。鉴于这些基因对黑素细胞的形成和发育至关重要，因此，除听力损失外，WS以头发、皮肤和眼睛色素沉着丧失为特征。对此，根据突变基因所伴随的症状，将WS分为4种亚型。其中，1型和2型较常见，3型和4型较罕见。 2.遗传性耳聋的细胞学机制 哺乳动物的耳蜗由不同类型的细胞组成，这些细胞因其独特的基因表达模式而具有不同的功能。根据基因在耳蜗不同组织或细胞中的表达分布，耳聋基因大致分为三大类（图1）： 1) 在听觉毛细胞（HCs）中表达的基因； 2) 在支持细胞（SCs）中表达的基因； 3) 在血管纹（SV）中表达的基因等。 已有的研究显示，这三类致病基因是内耳基因治疗的常见靶点。当然，也有部分耳聋基因表达于耳蜗其它部位，如螺旋神经节神经元（SGN）、内外沟细胞、盖膜和Reissner膜等。通常，这些致病基因的表达部位为病毒载体的选择和治疗窗口的评估以及基因治疗系统的设计提供了有力的指导。 图1：遗传性耳聋常见致病基因 (诊断率≥1%) 的主要表达部位 2.1.毛细胞耳聋基因 超过一半的耳聋基因在耳蜗毛细胞中表达，因此毛细胞更受到基因治疗的关注。耳蜗内有两种类型的毛细胞：对声音做出反应的单排内毛细胞（inner hair cells，IHCs）和放大声音的三排外毛细胞（outer hair cells，OHCs）。在HCs的顶端表面有一束用于机械电转导的静纤毛；在HCs的基底有负责将神经递质释放到SGN的带状突触。常见主要表达于内外毛细胞的基因包括MYO15A、MYO7A、USH2A、CDH23、MYO6、TMC1、PCDH15等。然而，另外一些基因则主要表达于IHCs或OHCs。例如，对带状突触的神经传递至关重要的OTOF和对传入突触的谷氨酸释放至关重要的VGLUT3主要在IHCs中表达，而对毛束凝聚至关重要的STRC、对钾离子稳态至关重要的KCNQ4和对细胞核定位至关重要的SYNE4基因主要在OHCs中表达。 2.2.支持细胞耳聋基因 具有支持功能的SCs对维持HCs的结构完整和功能正常具有重要意义。GJB2、GJB3和GJB6主要表达在SCs中，分别编码缝隙连接蛋白26、31和30。在NSHL病例中，GJB2和GJB6的变异占比大，而GJB3的突变较罕见。缝隙连接蛋白26和30是耳蜗中两个主要连接蛋白，在SCs中组装成缝隙连接，对于K+、Ca2+以及细胞信号和营养分子交换至关重要。 2.3.血管纹耳聋基因 血管纹位于耳蜗外侧壁，在维持内淋巴内高浓度K+的过程中起关键作用，而内淋巴内高浓度K+是HC发挥功能的先决条件。SV由三层细胞（边缘细胞、中间细胞和基底细胞）组成，通过离子通道将钾离子从外淋巴泵到内淋巴。因此，与离子通道（如KCNQ1、KCNE1和KCNJ10）或细胞层完整性所需的紧密连接分子（如CLDN11）相关的基因突变可导致听力障碍。 3.遗传性耳聋的基因治疗 根据遗传性疾病的遗传类型和致病机制，不同的致病机制的基因突变应选用合适的基因治疗策略（图2）。隐性遗传病主要是由两个等位基因的功能缺失（loss-of-function，LOF）引起；显性遗传病更为复杂，有三种主要的分子机制：1）单倍剂量不足（haploinsufficiency，LOF），指的是一个等位基因的功能缺失，但另一个等位基因不足以维持基因的功能；2）显性负（dominant-negative，DN）效应，即突变等位基因不仅无功能，而且干扰正常等位基因产物的功能；3）功能获得（gain of function，GOF），指的是致病性等位基因基因产物剂量或活性增加（图2B）。 不同的基因治疗策略有着不同的工作方式（图2A）。基因替代策略是通过递送正常基因以提供充足的有功能蛋白，适用于隐性遗传病和单倍剂量不足的显性遗传病（图2）。基因抑制策略是通过反义寡核苷酸（ASO）或RNA干扰（RNAi）技术在mRNA水平抑制突变基因表达，该方法可用于DN和GOF导致的显性遗传性疾病（图2）。基因编辑策略主要包括CRISPR/Cas9核酸酶非同源末端连接（NHEJ）修复方式介导的基因敲除（gene disruption）策略，通过敲除突变基因，可应用于DN和GOF导致的显性遗传性疾病；以及CRISPR/Cas9介导的同源重组修复（HDR）、碱基编辑器和先导编辑器介导的基因修复（gene correction）策略，可直接纠正基因突变位点，因此显性、隐性遗传性疾病均适用（图2）。 图2 单基因疾病的基因治疗策略。(A) 三种主要的基因治疗策略。(B)单基因疾病的发病机制及对应的基因治疗方法。 3.1.基因替代 基因替代治疗是最常见的基因疗法，已被广泛用于治疗隐性遗传性耳聋。自2012年在Vglut3敲除小鼠模型中报道了首例有效的遗传性耳聋基因替代治疗研究以来，大量遗传性耳聋的基因替代治疗研究相继涌现。其中研究较多的基因替代治疗靶点包括TMC1、USH相关基因、OTOF等。针对这些靶点，递送顺利与否也成了基因治疗成功的关键。 当前，尽管AAV是内耳基因替代治疗最常用的生物递送工具，但由于其有限的包装容量（～4.7 kb），很难实现大基因的递送。令学界欣喜的是，经过科学家们不懈的努力，终于开发出基于核酸重组或蛋白重组方法的双AAV递送策略，以解决较大耳聋基因的递送问题。其中也包括舒易来教授团队开发的蛋白水平重组技术，该团队采用AAV-PHP.eB成功地将OTOF基因约6 kb的cDNA分为两部分共同递送至Otof-/-小鼠内耳中，并重组成完整的OTOF蛋白，成功恢复了该小鼠模型的听力，回复到接近完全正常。 由于基因替代疗法具有效率高和操作易等特性，其在治疗遗传性耳聋方面取得了很大的成功。然而，该策略也存在一些局限。例如，由于此方法无法根据细胞的需要准确地调控基因的表达，因此可能存在基因过度表达或异位表达的风险。此外，由于单个AAV的负载能力有限，通过多个病毒载体介导的大外源基因递送仍具有挑战性。 3.2.基因抑制 基因抑制疗法可以在不干扰DNA的情况下在RNA水平进行调控从而改变基因的表达，主要包括两种技术：ASO和RNAi。 1）ASO是经过修饰的合成核酸序列，能通过结合互补的RNA序列上调/下调基因的表达，或改变蛋白质的异构体。ASO可作为基因抑制疗法的一种工具，通过降解靶mRNA或调节mRNA的选择性剪接来抑制突变基因的表达。ASO治疗策略主要被应用与USH1C基因的c.216G＞A突变，该突变导致了阿卡迪亚人群中全部的I型Usher综合征。USH1C c.216G＞A突变产生了一个隐式剪接位点，导致USH1C mRNA及其编码的harmonin蛋白被截短。因此，与基因替代策略相比，ASO是一种理想的阻断USH1C基因异常剪接位点的方法。然而，ASO目前仅被报道用于USH的体内治疗。舒易来团队最新研究发现ASO在体外耳聋患者细胞中，可有效纠正Slc26a4耳聋基因中国人最常见的c.919-2A>G突变的错误剪接。然而，ASO是否适用于其他类型的遗传性耳聋还需要进一步探索。 2）RNAi技术是指通过短干扰RNA（siRNA）和微小RNA（miRNA）中和靶向mRNA分子来抑制基因表达。siRNA以及miRNA已在动物模型中被分别应用于治疗GJB2 p.R75W以及TMC1 c.T1253A 突变引起的遗传性耳聋。除了这些传统的RNAi工具，CRISPR/Cas13 RNA编辑系统已成为一种具备更高特异性的新型RNA干扰工具。 最近，舒易来团队采用贝多芬小鼠（Tmc1基因突变小鼠）探索了Cas13d的潜在治疗作用。该团队发现CRISPR/Cas13系统在体内降低了70%的Tmc1突变mRNA，从而改善了小鼠的听觉功能。这项概念验证研究证明了RNA编辑工具治疗遗传性耳聋的安全性和有效性。然而，基于cas13的RNA编辑系统是否适用于成年小鼠遗传耳聋的治疗尚需要进一步研究。 基因抑制治疗策略在不导致永久DNA破坏的情况下沉默基因的表达，具有较大的应用前景。然而，该策略是否存在潜在的脱靶效应以及基因表达不完全/暂时阻断的潜在性仍有待探索。 3.3.基因编辑 基因编辑是通过碱基的添加、删除和替换目标位置改变DNA的序列。主要包括基因敲除和基因修复等策略。 1）基因敲除 2014年哈佛大学的著名基因编辑和听觉医学专家 David Liu、Zheng-Yi Chen、舒易来等合作，国际上首次报道CRISPR/Cas9在体内对内耳细胞成功进行了基因编辑（以SpCas9-gRNA核糖核蛋白复合体）。随后，David Liu 和 Zheng-Yi Chen 将SpCas9-gRNA技术应用于TMC1 Bth耳聋小鼠模型，改善了该小鼠的听觉功能。此后，基因敲除技术已被成功应用于MYO6、KCNQ4、PCDH15等基因的显性负效应突变。 针对Myo6 p.C442Y突变，舒易来团队开发了一个高效的靶向毛细胞的基因敲除治疗系统，将该系统注射到Myo6WT/ C442Y新生小鼠的内耳中可特异性敲除突变等位基因，从而改善突变小鼠的听力功能。然而，由于耳蜗组织中含有许多非靶向细胞，在体内很难准确评估基因敲除效率，而基因敲除效率是评估治疗效果和未来临床转化的关键因素之一。为了解决这一局限性，该团队以了Atoh1-GFP; Kcnq4 c.683G＞A杂交两种突变小鼠模型，成功标记耳聋模型中耳蜗毛细胞，用于精确检测毛细胞内的基因编辑效率。该团队研究发现分选出标记的阳性细胞的编辑效率可达34.1%，而通过检测整个耳蜗的编辑效率仅为1.45%，该研究表明准确检测毛细胞中的编辑效率方法的成功建立，并证明Cas9核酸酶可以在体内高效编辑毛细胞。 2）基因修复 鉴于大多数遗传性耳聋是由隐性遗传性突变引起，这些突变需要被修复，而不是被敲除。因此，基因修复工具（包括碱基编辑器、先导编辑器和Cas9核酸酶介导的HDR）可以精确纠正突变位点，是很有前景的治疗方法。由于HDR的编辑效率低，碱基插入或缺失副产物水平高，且通常仅在细胞分裂时活跃，因此利用该方法治疗遗传性耳聋的研究难度很大。有团队报道，以CRISPR/Cas9介导的HDR在小鼠受精卵中纠正了Cdh23ahl突变等位基因，挽救了其相关的年龄相关听力损失。随后，舒易来等团队采用了HDR的优化版—同源介导的末端连接（HMEJ）在体修复了Klhl18纯合隐性突变小鼠模型的听觉功能，听力维持时间至少6个月。 随着基因修复工具的推陈出新，新型的基因编辑工具如碱基编辑器以及先导编辑器能够在不断裂DNA的前提下对基因进行直接的修复。目前主要的碱基编辑器有:催化C→T（或G→A）转换的胞嘧啶碱基编辑器（CBEs）和介导A→G（或T→C）转换的腺嘌呤碱基编辑器(ABEs)。由于人类的大多数遗传病是由点突变引起的，DNA编辑器在遗传病的治疗中具有巨大的潜力。David Liu团队已成功将CBE应用于隐性Tmc1突变的Baringo小鼠模型，该系统可使内耳中C•G点突变逆转为野生型T•A，从而改善小鼠的听力功能，但是因为编辑效率低等原因，听力只维持了大约2周。 碱基编辑器的局限性之一是太大而无法被包到单个AAV中。最近，David Liu团队通过最小化ABE和AAV的组分，成功设计了一种单AAV ABE系统，当在小鼠眼眶后递送时，该系统在许多器官（如肝脏、心脏和肌肉）显示出较高的碱基编辑效率。此外，未来可以通过提高载体的递送效率和碱基编辑器的表达来进一步推进这一策略。 除了DNA编辑器，舒易来联合杨辉教授团队开发出了既不切割DNA，也不切割RNA的RNA碱基编辑器治疗策略，可在RNA水平进行碱基的精确校正。该研究团队研究了基于Cas13的RNA ABE在Myo6C442Y/+小鼠的治疗效果，研究结果表明该RNA编辑系统能够纠正突变的Myo6等位基因，并恢复小鼠听觉功能，证明了RNA碱基编辑器在治疗遗传性耳聋中的重要价值。 然而，碱基编辑器目前尚不能实现所有12种碱基改变类型。一种名为“先导编辑器”的新型基因编辑工具克服了这一障碍，该工具可以纠正12种点突变类型，同时也能实现DNA片段的插入或缺失。目前，先导编辑器已在成年小鼠视网膜中成功编辑了Dnmt1基因，但其是否适用于遗传性耳聋的治疗尚未报道，值得进一步研究。 在内耳基因治疗的研究中，基因校正工具仍被认为是一种极具前景的基因治疗选择，但仍需要进一步提高其编辑效率等。 4.遗传性耳聋基因治疗临床试验 针对遗传性耳聋的基因治疗，已有包括我国舒易来团队项目在内的3项针对OTOF基因突变治疗的临床试验正在进行中。另外两个项目由美国两家医药公司——Akouos和Decibel Therapeutics实施。 Akouos公司设计的AK-OTOF试验性新药申请（IND）是美国食品药品监督管理局（FDA）于2022年9月批准的第一份遗传性耳聋基因治疗新药申请。AK-OTOF是由泛启动子控制，由AAVAnc80载体负载的人耳畸蛋白cDNA的候选产品，目的是在内耳中表达有功能的耳畸蛋白。该团队临床前研究表明， AK-OTOF促进了otoferlin蛋白在小鼠和灵长类动物内毛细胞中的表达，并恢复了Otof-/-小鼠长达至少6个月的听力功能。该候选药物的安全性已被证实，其并未导致小鼠和灵长类动物的耳蜗功能以及全身组织病理学异常。Akouos正计划在儿童中开展I/II期临床试验，以评估其在人体中的安全性、耐受性和有效性，前两名儿童参与者年龄在7岁左右，随后招募的参与者年龄可能最小为2岁。 随后，Decibel Therapeutics公司开发的DB-OTO于2022年10月获得了FDA的批准，该公司预计将在2023年上半年启动I/II期临床试验。DB-OTO的人otoferlin cDNA由双AAV1载体携带，并由毛细胞选择性启动子控制。其在小鼠进行的临床前研究表明，DB-OTO给药可使Otof-/-小鼠的听觉功能持续改善至52周龄。在非人灵长类动物的临床前研究表明，局部耳蜗内注射后otoferlin在耳蜗基底膜全长表达。该公司的临床试验人群与Akouos大致相同，但其后续将招募包括两岁以下的儿童。 舒易来团队联合上海鼎新基因科技有限公司研发的基因治疗候选药物RRG-003是由AAV载体携带的人otoferlin cDNA。该团队通过圆窗给药纠正了Otof-/-小鼠的听力损伤，且持续时长达至少6个月。在临床试验中，该团队采用微创内耳给药。其纳入第一批患者年龄为3-10岁，第二批患者年龄将小于3岁的患者，该团队目前已完成全球首例遗传性耳聋患者的体内给药，目前正在进行安全性和听力改善评估。 5. 遗传性耳聋基因治疗面临的挑战 5.1.成年鼠的干预 由于人的内耳在出生时就已经发育成熟，相当于已经成年的小鼠耳蜗，因此研究基因治疗策略能否成功挽救具有成熟内耳的成年小鼠模型的听觉功能具有重要意义。然而，在成年小鼠模型中进行基因治疗存在一些挑战。首先，在不干扰内耳淋巴环境的情况下，成年小鼠的内耳递送尤为困难。新生小鼠的耳囊是软骨的，可以用玻璃微管直接穿透。相比之下，成年小鼠的耳囊是完全骨化的，因此很难在不影响听觉功能的情况下进行骨性覆盖物注射。其次，病毒载体在成年小鼠内耳细胞中的转导效率较低，尤其是在外毛细胞、支持细胞中。因此，有必要进一步探索或优化具有更高成年小鼠耳蜗细胞转导效率的载体。 5.2.治疗效果的持续时间 由于哺乳动物内耳中的许多细胞被认为是终末分化并且缺乏再生能力的，因此内耳基因疗法的治疗在理论上是持久的。然而，在动物模型实践中，基因治疗的持续时间变化很大，从几周到几个月或一年不等。基因治疗的持续时间可能与特定基因导致的病理生理以及研究中使用的动物模型有关。此外，随着时间推移，基因治疗的疗效降低可能是因为产生了针对病毒载体和外源性基因的中和抗体，或者是由于基因治疗系统编辑效率低而未被纠正的内耳细胞本身的功能进行性恶化所致。因此，内耳基因治疗能否获得更持久、更稳定的治疗效果仍需进一步研究。从这个角度而言，基因编辑可能是一个较好的选择，因为基因编辑是永久性的，但其编辑效率仍需进一步提高。 5.3.递送载体的特异性、安全性和容量 许多耳聋相关基因仅表达在内耳的特定细胞中，需要一定的环境才能发挥作用，这意味着AAV转导的特异性具有重要意义。限制基因治疗系统在非靶向细胞中表达的一种方法是将细胞特异性miRNA结合元件与载体盒结合，从而用特异性miRNA沉默细胞中的表达。在靶细胞中调节基因表达的另一种方法是利用细胞特异性启动子。与CMV或CAG等泛启动子不同，针对特异细胞具有特异性AAV有其优势。但此领域仍然需要探索，尤其是那些足够小的启动子，以便包装于AAV载体中，同时为治疗元件留出足够的空间，以提高AAV载体的特异性。 对于AAV的安全性。一方面需要考虑机体对其衣壳的潜在免疫应答，尽管AAV的免疫原性通常低于其他病毒载体，通过对AAV衣壳进行改造或降低抗AAV抗体水平，可以规避AAV的免疫效应。 如前文所述，通过在内耳应用双AAV系统，已部分解决了AAV载体的容量限制。尽管这些研究获得了较好的结果，但全长基因的表达水平仍有待提高。这个问题可能是由于同一细胞被不同载体转导的概率较低，以及不同部分限速了基因重组过程。 5.4临床前试验动物模型 在内耳研究中，小鼠模型因其基因组特征明确以及与人类内耳非常相似而成为最常见的实验动物。然而，为了将基因治疗策略推进到人类临床试验，有必要在更大的动物模型（如非人灵长类动物）中测试有效性或安全性。已有研究通过成功地向恒河猴的内耳注射生理盐水，而不破坏内耳功能。基于这项研究，研究人员已经证明了AAV9-PHP.B、AAV-S、Anc80L65和AAV1在非人灵长类动物耳蜗内的有效转导。 6.遗传性耳聋基因治疗未来前景和展望 基因治疗是一种极具前景的遗传性耳聋治疗方法，它可以提供传统医学无法实现的听觉精准治疗。为进一步推进遗传性耳聋基因治疗的临床转化，未来的研究可以从以下几个方面进一步进行推进： 1）优化现有基因治疗工具的疗效和特异性，尝试应用先导编辑器等新兴工具提高治疗效果，同时最大限度地减少脱靶效应； 2）优化载体，提高其转导效率和特定细胞亚群的特异靶向性； 3）优化给药路径和方法，尽可能提高微创技术和水平，方便基因治疗系统安全递送到内耳； 4)由于CRISPR/Cas9系统的gRNA无法进入哺乳动物线粒体，因此可以重新利用目前已不常用但有潜力的基因编辑工具，如锌指核酸酶（ZFN）和转录激活因子样效应物核酸酶（TALEN）来治疗线粒体耳聋基因突变； 5）加强耳聋基因检测以诊断遗传性耳聋患者的遗传学病因，为临床医生提供更多关于特定突变和临床表型对应的信息，这对于确定内耳基因传递的合适治疗窗口和制定个性化治疗方案至关重要。 综上，内耳基因治疗的不断发展为遗传性耳聋的治疗提供了新的希望，并为其他遗传性疾病的治疗提供了新的借鉴。