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TIS2024第四届自免疾病细胞疗法与干细胞疗法论坛重磅来袭，点击图片查看重磅嘉宾，合作详询：王晨 180 1628 8769 （扫码立即报名获取TIS2024免费票） 本报告对外泌体的结构、分类、工程化技术、纳米递送系统的演变、商业应用、工业制备与质量控制分析、产业链上下游分析、产业驱动因素、市场容量、挑战与问题、代表公司等多方面进行了系统分析，为创业投资和产业发展提供了有力研究基础。 作    者  |  郭允乐、贾心语、王哲 编    辑  |  郭维、胡旭海、杨贺 邮   箱  |  vdcapital@vdcapital.net 刊    号  |  Vol.107 2013年，三位“外泌体“领域的科学家荣获“诺贝尔奖”，这也让“外泌体”这个名词进入大众视角，这是一种30-150nm的纳米级的脂质结构，自身对抗衰、修复、抑制炎症、美容等都具有非常显著的功效，并且它的穿透性极强、吸收更佳、无免疫原性，是一种非常优质的“活性物质递送系统”。 图1. 2013年诺贝尔生理或医学奖-外泌体 目   录 [向上滑动阅览]                  1. 外泌体概述                   1.1 递送系统的演变                   1.2 外泌体结构与形成                   1.3 天然外泌体                   1.4 工程化外泌体                   1.5 外泌体的功能应用              2. 外泌体的商业应用                   2.1 天然外泌体疗法                   2.2 工程化外泌体递送                   2.3 外泌体偶联药物                   2.4 医疗美容与护肤品                   2.5 体外诊断/早期筛查              3. 外泌体的工业制备与质控              4. 外泌体产业链分析              5. 产业驱动因素与挑战              6. 外泌体产业市场分析              7. 国内外代表性公司 Vol.1 外 泌 体 行 业 概 述  1.1  递送系统的演变 随着治疗方式从“小分子”扩展到包括“核酸”、“多肽”、“蛋白质”、“抗体”、“核酸”、“活细胞”，活性物质的递送和吸收能力成为了新的挑战。 图2. 治疗方式的演变 现代药物递送技术始于1952年，诞生了Spansule (缓释胶囊)技术，到20世纪80年代，口服和透皮制剂为小分子药物提供了长达24小时的治疗持续时间，并主导了药物递送领域和市场；1989年，基于Lupron Depot (PLGA聚合物)的批准为长效注射剂和植入剂打开了大门，并出现递送各种小分子、多肽、蛋白质的系统的百花争艳；1990年第一个Adagen (PEG化蛋白)的问世标志着聚乙二醇化药物的新纪元，在过去的30年里已开发约20种聚乙二醇化蛋白药物，该技术从1995年的Doxil (PEG化脂质体)批准开始在纳米制剂中应用，在2018年批准了siRNA药物如Onpattro (PEG化LNP)、2021年批准了mRNA药物如Comiranty (PEG化LNP)；2000年，美国政府推出了“国家纳米技术倡议”(NNI) ，被称为“纳米医学”，Mylotarg (ADC)、Doxil (PEG化脂质体)、Abraxane (白蛋白-紫杉醇复合物)成为纳米医学的典型代表；药物-聚合物复合物和偶联物中的ADC至今备受关注，2009年第一个抗体-药物偶联物Mylotarg (ADC)获批；2018年Onpattro (LNP)的获批打开了LNP递送系统的广泛应用，众多创业公司进入该领域，但还需要进一步的发展，如“内体逃逸”以实现胞质溶胶等；2017年首个眼科AAV基因递送药物Luxturna (AAV)上市，AAV等病毒递送系统进入了爆发期；2021年，exoIL-12(Exosome, 外泌体）率先进入人体临床试验，标志着外泌体递送系统进入了产业化的征途，虽然该产品由于某些原因暂停，但后起之秀ExoFlo™(Exosome, 外泌体)外泌体药物已处于临床III期，外泌体作为活性物质的递送系统将开启纳米医学和细胞与基因治疗的新篇章。 图3. 递送系统的演变 外泌体递送系统不同于传统递送系统，包含天然外泌体和工程化外泌体： 天然外泌体内部包裹了多种调节蛋白、microRNA和mRNA等天然活性物质，具有优异的治疗和美容效果，作为细胞治疗的“无细胞疗法”的重要手段。1）在医美护肤领域：ExoCoBio的干细胞外泌体已经于2018年上市销售，是世界首创将源于干细胞培养液的外泌体（ASC-EXOSOME™）成分冷冻干燥制成的产品，以具卓越的肌肤再生及抗炎效果为主要产品特征；国内“天津外泌体科技”的Y3系列美容产品已经获得欧洲的CE认证，可在欧盟进行大规模销售。2）在治疗药物领域：干细胞天然外泌体药物ExoFlo™中发现了多种蛋白和核酸物质，可替代干细胞治疗，处于美国III期临床试验；CAR-T细胞来源的EVs表达高水平的穿孔素和颗粒酶B以及CAR，有效地杀伤实体肿瘤。 表1 外泌体药物ExoFlo™中发现的调节蛋白 工程化外泌体是通过“基因工程”或“化学工程”对外泌体进行工程化改造以实现活性物质的靶向递送，可广泛递送小分子、多肽、蛋白、抗体、核酸等活性物质，具有增强的载药效率、靶向性、抵抗机体清除率等特点。工程化外泌体领域目前没有产品获批，作为药物治疗处于临床II期阶段，2023年3月，工程化外泌体代表企业Codiak由于产品开发失利而宣告破产保护，该领域开发具有一定挑战性。 1.2  外泌体结构及形成 外泌体(Exosome)是几乎所有细胞均可释放的、直径约30-150 nm的细胞外囊泡(Extracellular vesicle, EV)，由细胞内多泡体(multivesicular body，MVB) 与细胞膜融合后，释放到细胞外基质中。 EV可分为Exosome (外泌体, 30-150 nm)、Ectosome (核外颗粒体, 100-1000 nm)、Apoptotic bodies(凋亡小体, 50-5000 nm)三大类。Exosome由胞吐作用(exocytosis)释放，Ectosome由质膜向外出芽(Outward budding)而分泌，Apoptotic bodies在凋亡后期由程序性死亡细胞释放（图4）。 图4. 细胞外囊泡亚型示意图 (Int. J. Mol. Sci. 2016, 17, 170) 在经典分泌途径中，带有蛋白质货物如胞外蛋白的囊泡在高尔基体（GOLGI）中分拣和包装，将其货物运输到质膜（PM），通过与质膜融合，膜蛋白和分泌蛋白都被有效地运输到它们预定的目的地（图5）。 各种类型的货物，如蛋白质、RNA等，也可以通过质膜向外出芽形成脱落的囊泡（核外颗粒体, Ectosome）方式运输到细胞外空间。货物通过细胞内吞作用（受体介导和自由摄取）摄取，形成初级内体（EE）。在初级内体（EE）中，货物要么被回收到质膜（PM），要么被封闭在多泡体（MVBs）的腔内囊泡（ILV，外泌体前体）中（图5）。 外泌体（Exosome）的形成始于初级内体（EE）的膜向内出芽，随后形成多泡体（MVBs）。在胞吐途径①中，多泡体（MVBs）与质膜（PM）融合，将其内容物（外泌体，Exosomes）释放到细胞外空间，外泌体货物运送到受体细胞可以通过直接与受体细胞膜融合（Membrane fusion），胞饮作用/吞噬作用（Pino- or phagocytosis），或配体-受体结合（Receptor binding）等各种机制发生；在降解途径②中，多泡体（MVBs）被运送到溶酶体（LS）进行酶辅助降解。这一途径对于抑制激活的生长因子受体的信号传导尤为重要（图5）。 图5. 不同类型EV形成通路 Extracellular protein-胞外蛋白；Receptor-受体；Cargo-货物: 蛋白、RNA等；Regular protein export/secretion-调控蛋白运输/分泌；Intraluminal vesicle (ILVs)-腔内小囊泡；Exosome-外泌体；Shed vesicle/Ectosome-核外颗粒体；PM-质膜；ER-内质网；EE-初级内体；LE-次级内体；LS-溶酶体；MVB-多泡体；GOLGI-高尔基体；NUCLEUS-细胞核；Exocytic pathway-胞吐途径；Degradative pathway-降解途径；(Int. J. Mol. Sci. 2016, 17, 170) 在外泌体的生成过程中，有几种蛋白密切参与，包括Rab GTPases、ESCRT蛋白，以及被用作外泌体标记的CD9、CD81、CD63、flotilin、TSG101、神经酰胺和Alix等。不同来源的细胞生成外泌体的速率、大小、组分(货物)均有异质性。外泌体腔内组分主要由mRNA、miRNA、gDNA片段、以及无数不同的蛋白质组成，这些组分类型取决于细胞的起源（图6）。 图6. 外泌体的组分和鉴定 外泌体作为细胞间物质交流和信号传递的途径，不同细胞间通过分泌携带有不同组分的外泌体实现通讯，这些分泌的外泌体被受体细胞吸收，通过释放内含物实现物质和信号的交流（图5）。 1.3  天然外泌体 使用不同细胞来源产生的“天然外泌体”已经在医美领域实现商业化，同步也正在进行多项药物临床试验，最快已处于临床III期试验，显示出不错的安全性和有效性。布局天然外泌体的代表企业包括ExoCoBio、天津外泌体科技、佰傲医学、Direct Biologics等，这些企业将是外泌体行业最先商业化的企业。 1983年，Pan和Johnstone在研究网织红细胞成熟到红细胞过程的研究里，在体外培养的绵羊红细胞培养液上清液中发现了一种从网织红细胞释放的囊泡，含有网织红细胞来源的脂质、蛋白质和酶，后来命名为“外泌体”。1996年，Raposo等发现B淋巴细胞分泌的外泌体携带MHC-Ⅱ类分子、共刺激因子和黏附因子。2007年，Lotvall和Valadi发现细胞之间可以通过外泌体中的RNA来交换遗传物质。2013年，诺贝尔生理或医学奖授予从事细胞内囊泡(外泌体)运输调控机制研究的3位科学家——James E. Rothman、Randy W. Schekman和Thomas C. Südhof，由此将外泌体研究推向了前所未有的新高潮。 图7. 细胞分泌外泌体图示 几乎所有类型的细胞，都可以产生并释放外泌体。根据不同生物来源分类，外泌体分为动物细胞外泌体、植物外泌体、微生物外泌体。 1.3.1 动物细胞外泌体 天然外泌体 哺乳动物细胞外泌体由几乎所有类型的“健康细胞”和“病理细胞”分泌，存在于不同的体液中，例如血浆、尿液、乳汁、唾液、羊膜、细支气管肺泡、滑膜以及腹水等。在循环外泌体中，80-90%来自血小板、淋巴细胞、树突状细胞、其他免疫细胞，通过循环系统到达其他细胞与组织产生远程调控作用。正是基于此，外泌体天然具有活性物质的递送功能(天然递送系统)和作为疾病的特异性生物标记物(诊断标志物)。 图8. 哺乳动物细胞外泌体 目前可通过GMP大规模生产获得动物细胞外泌体的主要包括：牛奶外泌体、人心脏祖细胞外泌体、骨髓间充质干细胞外泌体、脂肪干细胞外泌体、树突状细胞外泌体、HEK293细胞外泌体。 图9. 处于临床的外泌体种类和GMP生产 （Tzu Chi Medical Journal 2020, 32, 113-120） 1.3.2 植物外泌体 天然外泌体 植物外泌体（plant exosome）的形成区域通常始于反式高尔基体或者早期内体，随后形成多囊泡内体（MVEs）或者多泡体（MVBS），并选择性地将mRNA、miRNA、其他非编码RNA等多种RNA、脂质、DNA等结合进囊泡中，最终植物外泌体与质膜结合将内含物释放。植物外泌体体积小、组织穿透性强，在不同的酸碱度和温度下都能维持较好的理化稳定性，成为经皮递送、靶向给药、基因传递等递送理想载体。 目前，公开报道的植物外泌体研究包括葡萄外泌体、生姜外泌体、芦荟外泌体、人参外泌体、金银花外泌体、甘草外泌体、红景天外泌体、西兰花外泌体、葡萄柚外泌体、小麦外泌体、大蒜外泌体、蒲公英外泌体、洋葱外泌体等。研究发现，植物外泌体蕴含了植物中90%的活性成分，是植物有效成分浓缩的精华中的精华。1kg植物仅能提取1μg植物外泌体，而其活性却远高于1kg植物提取物。 图10. 植物外泌体或衍生的PELNV的生物功能 （Molecular Therapy. 2021, 29, 13-31） 植物外泌体含有较为丰富的miRNA，为一类长度约为22个核苷酸的内源单链非编码RNA，来自药用植物外泌体的miRNA可能作为新的生物活性成分与哺乳动物系统相互作用，外泌体作为中药活性成分的应用将越来越广泛。 1.3.3 微生物外泌体 天然外泌体 微生物外泌体的研究主要集中在细菌胞外囊泡(BEVs) ，其发现可追溯到20世纪60年代。BEVs类型多种多样，根据产生方式不同包括：革兰氏阴性细菌来源的外膜囊泡(outer membrane vesicles，OMVs)、古菌和革兰氏阳性细菌来源的细胞质膜囊泡(cytoplasmic membrane vesicles，CMVs)、外-内膜囊泡(outer-inner membrane vesicles，OIMVs)、破裂性外膜囊泡(explosive outer membrane vesicles，EOMVs)。 图11. 不同的途径导致形成不同的膜囊泡类型 （Nat Rev Microbiol . 2019, 17(1):13-24.） BEVs直径范围为20-400 nm，影响多种生物过程，包括毒力因子的运输、DNA转移、噬菌体的拦截、抗生素和真核宿主防御因子、细胞解毒、细胞代谢物输出、细胞间通讯等。 BEVs与哺乳动物宿主细胞的相互作用多集中在肠道微生物菌群。肠道菌群积极促进肠道和远端器官的基本功能（相关阅读: 肠道微生态药物的发展和投资趋势）。在肠道生态系统中，微生物群与宿主之间的双向通讯不涉及直接的细胞接触。越来越多的证据表明，细菌分泌的BEVs通过向宿主细胞运输和传递调节宿主信号通路和细胞过程的效应分子来介导菌群功能，肠道微生物群释放的BEVs可能对健康和疾病有很大的影响。BEVs可能作为预防肠道感染或炎症和免疫相关疾病的治疗、营养策略，使用分离的BEVs将可能克服在免疫缺陷个体中使用活益生菌的潜在风险。肠道微生物群组成和多样性的失衡与包括癌症、神经、代谢和免疫紊乱在内的多种疾病有关，在患者和健康人群的血液和尿液样本中发现了肠道微生物群来源的BEVs，其特征与肠道微生物组高度相关，这为诊断提供了新的策略。 1.4  工程化外泌体 为了拓展其作为纳米递送系统的可能性，科学家通过生物工程、化学工程策略来设计并装载“工程化外泌体”，开发出了基于工程化外泌体的“纳米递送系统”。生物工程 (Biological Engineering)通过膜结合蛋白的遗传融合引入靶向基序，如多肽、蛋白、ASO等，代表企业有Codiak、Evox、唯思尔康、恩泽康泰等。化学工程 (Chemical Engineering)指通过“脂类化学反应”或“膜结合蛋白化学反应”或“脂质-脂质相互作用”安装不同的片段，如抗体、蛋白、适配体、小分子、聚合物等，代表企业有天津外泌体科技等。 图12. 工程化外泌体的表面修饰方式  根据外泌体纯化前还是纯化后进行装载分为三种装载方式： 内源装载 (Endogenous loading)：对来源细胞进行生物工程改造，使其分泌工程化外泌体，也称Pre production； 外源装载 (Exogenous loading)：先分离纯化好高纯度外泌体，进行负载改造，也称Post production； Per production：在外泌体形成过程中，利用物理方法破坏-再造质膜而封装活性物质，挤压出细胞膜过程中装载上目标分子的“类EVs样囊泡”； 图13. 工程化外泌体的装载方式 （Advanced Drug Delivery Reviews. 2021, 178: 113972.）  1.4.1 内源装载 工程化外泌体 内源装载 (Endogenous loading) 是在分泌外泌体的细胞上做基因工程改造，让其产生携带目标分子的外泌体。例如，构建融合表达特定蛋白和外泌体膜蛋白的质粒，通过转染等方式，让该融合蛋白在外泌体来源细胞中大量表达，这些细胞分泌的外泌体就会携目标融合蛋白。RNA、蛋白质、核酸、各种小分子，都可以采用内源装载。不过，与外源装载相比，内源装载的实验难度更大、周期更长。 图14. 内源装载方式 (Crit Rev Biotechnol. 2020, 40(6): 804-820.) 1.4.2 外源装载 工程化外泌体 外源装载 (Exogenous  loading) 的常用方法有孵育、超声透化、电穿孔、脂质体融合、化学偶联(点击化学)。 孵育是让待装载的分子与外泌体在一定条件下充分接触，依靠外泌体膜本身的疏水性被动完成装载。孵育法操作简单，不会破坏外泌体膜的完整性，主要适用于疏水小分子，装载效率受药物浓度影响，所需时间较长。 电穿孔是通过外加电场，在外泌体膜上形成临时的亲水性孔道，增加外泌体膜的通透性，使小分子物质能够穿过孔道进入外泌体内部。主要适用于装载亲水分子，过量投入外泌体有助于提高回收率。但会引起外泌体聚集，破坏外泌体膜的稳定性，也可能导致核酸药物本身聚集导致假阳性结果。 超声是利用探针超声仪对外泌体进行超声处理，使外泌体膜变形，产生瞬态小孔，增加膜的通透性，从而小分子物质扩散到外泌体中。主要用于装载亲水分子，装载后有些小分子物质也会附着于外泌体膜外侧。装载效率高于电穿孔和孵育，但对外泌体膜的损伤较大，可能导致外泌体破裂且实验重复性较差。 脂质体融合外泌体是实现活性物质直接装载的一种有希望的替代方法。为了控制和改变外泌体纳米载体的生物功能，京都大学Katsura通过用冻融技术融合脂质体和外泌体的质膜从而得到杂交的外泌体。特定遗传修饰细胞分泌的外泌体与各种脂质体融合，是非常有效的膜工程方法。如Lipofectamine含有脂质亚基，可在水环境中形成脂质体并捕获核酸，带正电的脂质体表面与带负电的外泌体质膜融合，随后释放核酸完成杂交外泌体的装载。也有研究单位利用穿膜肽（CPP）转染核酸药物到外泌体中，快速简便且高效。维渡纵横认为，脂质体融合外泌体技术与LNP的四组分原理有着异曲同工之妙，为mRNA和siRNA药物的发展提供了更广阔的空间。 图15. 脂质体融合外泌体 (Sci Rep. 2016, 25: 21933.) 化学偶联外泌体是最具商业化潜力的新兴技术，通过“脂类化学反应”或“膜蛋白化学反应”安装多种功能性分子，如多肽、抗体、蛋白、脂质、适配体、小分子、聚合物，在外泌体上进行可控、可调节的多功能化改造。化学偶联技术可控制功能化分子在外泌体上的“装载数量”与“装载位点”，实现多种功能化分子的“多元装载”，用于靶向递送、药物示踪等。值得注意的是，外泌体偶联药物(EDC)的高效Payload装载，突破了抗体偶联药物(ADC)载药率低、安全性有限的瓶颈。根据维渡纵横统计，天津外泌体科技有限公司(简称“天津外泌体科技”)可能是国内唯一掌握该技术商业化的公司，根据已发表文章显示其药物装载率达92.3%、溶解性提高71.4倍、半衰期提高36.2倍、药峰浓度提高3倍、 口服相对生物利用度提升2.6倍；装载Herceptin抗体的外泌体呈现靶向效果相比对照组提升174.5倍。 图16. 外泌体化学偶联技术 1.5  外泌体的功能 不同的细胞通过分泌携带不同组分的外泌体实现细胞间通讯，这些外泌体被受体细胞吸收，通过物质交换或释放内含物实现物质和信号的交流。 外泌体与受体细胞的信息交流可能通过以下四种途径实现：1）外泌体表面膜蛋白被目的细胞表面受体识别，激活靶细胞；2）外泌体在蛋白酶作用下产生的表面膜蛋白碎片作为目的细胞表面受体的配体；3）外泌体脂膜与目的细胞膜融合，将蛋白质和 RNA等内容物释放进去；4）目的细胞通过胞吞的形式摄入外泌体。 经由以上几种途径，外泌体将其携带的生物信息运输到靶细胞或经体液运输而被远端组织细胞摄取，进而影响目的细胞的基本功能和基因表达，这些外泌体参与了一系列生理和病理过程，如繁殖和发育、抗原呈递、免疫调节、组织愈合、感染、代谢和心血管疾病、神经退行性疾病、癌症发生发展等。 Vol.2 外泌体的商业应用  外泌体在美容抗衰、药物治疗、递送载体、体外诊断和科研试剂方面有着广阔的应用前景，其中美容护肤抗衰产品已率先实现了商业化。本章将详细阐述：天然外泌体疗法、工程化外泌体递送、外泌体偶联药物(工程化外泌体)、医疗美容与护肤、体外诊断早筛的商业化应用。 2.1  天然外泌体疗法 干细胞由于其旁分泌机制发挥治疗作用成为再生应用中最流行的外泌体细胞源。间充质干细胞、胚胎诱导的多能干细胞、组织特异性干细胞、初级前体和成熟细胞等分泌的外泌体都有案例成功应用于再生治疗中。同时，科学家也发现免疫细胞来源和肿瘤细胞来源的外泌体可用于肿瘤免疫治疗和开发肿瘤疫苗。 表2. 天然外泌体疗法全球临床进展 2.1.1 肺部感染和ARDS治疗 天然外泌体疗法 2021年3月，美国FDA批准Direct Biologics公司的干细胞外泌体药物ExoFlo™的IND申请，顺利进入临床I/II期试验。它是从人骨髓间充质干细胞中分离出来的细胞外囊泡型生物产品——外泌体，首发适应症为治疗中度至重度新型冠状病毒感染和急性呼吸窘迫综合征(ARDS)。根据Direct Biologics公司披露，ExoFlo™的II期临床没有出现不良事件(AE)和重大不良事件(SAE)；ExoFlo-15ml组的死亡率具有统计学意义上的降低，与安慰剂组相比，在18-65岁的呼吸衰竭患者中，绝对和相对风险分别降低了30.8%和61.6%；在18-65岁的ARDS患者中，死亡的绝对风险和相对风险分别降低了41.9%和57.7%。2022年7月，ExoFlo™进入临床III期试验，2023年1月，ExoFlo™完成了400例患者的临床III期临床入组，是美国FDA首次批准应用干细胞外泌体用于疾病治疗的重大里程碑。ExoFlo™除了新冠感染治疗和ARDS适应症外，其他适应症包括克罗恩病、肠易激综合征、溃疡性结肠炎、器官移植排斥、下腰痛，处于临床I期试验阶段。 Direct Biologics公司认为ExoFlo™的成功源自公司的cGMP放大工艺和无菌工艺获得了超纯无菌外泌体；每毫升可提供超过100亿个外泌体带来了优异的功效；完美的质量控制使每一瓶外泌体都具有质量一致性。 图17. ExoFlo产品 西比曼的haMPC-Exos用于肺部感染处于IIT研究，入组了60例志愿者，正在瑞金医院开展（NCT04544215）。 肺损伤相关实验研究表明，干细胞外泌体具有积极的治疗作用。Vitti Labs的外泌体药物EV-Pure用于治疗肺纤维化和女性生殖障碍/原发性卵巢功能不全适应症已经于2022年10月进入临床I期（NCT05387239）。 2.1.2 心血管疾病治疗 天然外泌体疗法 干细胞外泌体的心脏保护机制已成为研究热点，越来越多的研究证实，干细胞外泌体具有与干细胞相似的心脏保护功能，能显著提高心肌细胞的存活率、抗心肌细胞损伤、促进新生血管形成、改善心脏功能、抗炎、抗心肌细胞凋亡、促进心肌细胞再生。外泌体具有较好的稳定性，较少引起受体细胞的突变以及免疫排斥反应，有望成为治疗心血管疾病的有效方法。 间充质干细胞外泌体在治疗心血管疾病如心肌梗死和心力衰竭方面具有巨大的潜力。《Stem Cells journals》发表了相关综述，讨论了间充质干细胞外泌体促血管生成、增强其生物活性改善心脏组织修复的方法。2022年4月，由Tehran University of Medical Sciences发起的Mitochondria and MSC-derived exosomes用于治疗心肌梗塞的临床试验正式开展，入组了20例志愿者来评估疗效（NCT05669144）。 间充质干细胞外泌体在缺血性心脏病中具有很好的疗效。发表在《BioMed Res》杂志的研究发现，间充质干细胞外泌体的注入抑制了缺血性心脏病疾病模型大鼠的心脏的纤维化和炎症反应，并且明显改善了心脏的功能。2021年9月，伊斯法罕医科大学的最新临床研究（NCT03384433）通过5例患者探索了携带miR-124的间充质干细胞外泌体对缺血性心脏病的临床治疗作用。 2.1.3 肝肾损伤治疗 天然外泌体疗法 肝脏疾病相关实验研究表明，干细胞外泌体具有保护和治疗作用，Du等研究证明干细胞外泌体通过激活SPhks和s1p信号通路保护肝脏免受肝缺血/再灌注损伤，促进细胞增殖；Li等研究发现干细胞外泌体可以通过抑制肝细胞上皮间充质细胞的转移和胶原蛋白的生成来改善肝纤维化。 肾损伤相关实验研究表明，外泌体中携带的miRNA和蛋白能够减轻肾缺血/再灌注损伤，减少细胞凋亡，促进细胞增殖，从而修复肾损伤。2022年4月，ILIAS Biologics公司的外泌体药物ILB-202进入了临床I期，靶向NF-κB用于治疗急性肾损伤。 图18. ILB-202机制 2.1.4 眼科治疗 天然外泌体疗法 外泌体可在泪液、房水、玻璃体液、血液等眼部体液中稳定存在，在调节眼部细胞迁移、增生、凋亡、免疫反应、血管生成等方面发挥重要作用，与角膜损伤、糖尿病视网膜病变、年龄相关性白内障、青光眼、年龄相关性黄斑变性、葡萄膜黑色素瘤等眼病关系密切。 Erciyes University的治疗产品Wharton jelly derived mesenchymal stem cell exosomes处于II/III期临床（NCT05413148），用于治疗视网膜色素变性。该研究于2022年8月开始，入组135例志愿者。 原生生物的间充质干细胞外泌体PSC-MSC-Exo处于IIT研究，用于治疗干眼症。中山大学脐带来源间充质干细胞来源的外泌体也处于IIT研究用于治疗干眼症。 2.1.5 肿瘤治疗 天然外泌体疗法 肿瘤细胞来源的外泌体通常包含一些肿瘤抗原，可以使抗原递呈细胞激活，故而外泌体可用于肿瘤疫苗的开发，且一些研究发现此类肿瘤疫苗具有很好的可行性和安全性。医药魔方数据显示，复旦张江的Chimeric exosomal tumor vaccine（嵌合外泌体肿瘤疫苗）目前处于临床I期研究，用于治疗膀胱癌。 图19. 外泌体在肿瘤免疫中的功能 免疫细胞来源的外泌体能够介导和调节机体对肿瘤的免疫反应，外泌体在肿瘤免疫治疗方面的潜力受到广泛关注。树枝状细胞（DC）产生的外泌体包含大量的MHC-多肽复合物和免疫刺激相关的分子，能够激活相关的T细胞，介导体内抗肿瘤应答，在多个临床试验中表现出良好的抗肿瘤疗效。CAR-T细胞来源的EVs表达高水平的穿孔素和颗粒酶B以及CAR，诱导表达其同源抗原的肿瘤细胞死亡，EV由于体积小，能够跨越生物屏障，可以有效地穿透实体肿瘤，该文章CAR-T-Derived Extracellular Vesicles: A Promising Development of CAR-T Anti-Tumor Therapy发表于《Cancer》(Cancers 2023, 15(4), 1052)。 图20.  T淋巴细胞衍生的细胞外囊泡参与免疫反应 2.1.6 软骨损伤治疗 天然外泌体疗法 骨关节炎是临床常见病，以关节软骨损伤、软骨下骨硬化、滑膜炎症等为特征。近年来大量研究表明，干细胞外泌体具有抗炎、免疫调节、促进组织修复和再生等作用，是治疗骨关节炎和软骨损伤的新疗法，不同干细胞来源的外泌体对骨关节炎均能起到保护和治疗的作用。SF-MSC-EX用于治疗软骨损伤处于临床II期试验阶段（ NCT05261360），该试验于2022年3月开展，入组受试者30例。Cells for Cells的CelliStem OA-sEV处于临床I期，用于治疗膝骨关节炎。四川大学华西医院的Autologous AdMSC-Exo治疗骨关节炎已开展IIT研究。 2.1.7 其他治疗 天然外泌体疗法 干细胞外泌体可以用于治疗脑卒中、糖尿病、卵巢早衰、克罗恩病、肠易激、皮肤相关疾病、移植物抗宿主病、伤口愈合等疾病。 2.2  工程化外泌体递送 外泌体的作用不断被发掘，广泛作为药物、医美护肤、疫苗的递送载体。外泌体载体作为“新型纳米递送系统”，综合了细胞药物递送和纳米技术的优势，一经发现就备受学术界和工业界关注。 外泌体作为递送载体具有诸多优势：a. 具有天然的靶向能力，通过工程化修饰，可靶向到特定的组织和器官，解决传统递送系统难以解决的靶向问题；b. 无免疫原性，包裹的核酸药物不易降解，降低药物全身暴露毒性；c. 外泌体是纳米级的，并携带细胞表面分子，具有克服生物屏障的能力；d. 可跨越血脑屏障，实现颅内药物递送；e. 奶源外泌体可将易降解药物制成口服制剂；f. 外泌体更容易储存；g. 作为天然纳米颗粒可降低安全风险（相关阅读：纳米递送系统行业研究报告）。 科学家通过内源装载或外源装载的技术手段（1.4 工程化外泌体），构建工程化外泌体，装载递送蛋白类、核酸类、多肽类分子实现创新药和疫苗（1类新药）、装载小分子化学药或中药有效成分实现老药新用（2类新药/505b2），提高患者用药效率、降低用药频率、联合用药提升治疗效果、减少全身暴露的副作用，是全球给予厚望的下一代革命性纳米递送载体。截至目前有5个工程化外泌体药物进入临床试验，1个处于IIT研究（表3）。 表3. 工程化外泌体全球临床进展 2.2.1 装载蛋白 工程化外泌体递送 CovenD24（也称EXO-CD24）由OBCTCD24 Ltd和Elpen Pharmaceutical Co. Inc.联合研制，用于抗新冠肺炎，共计开展了一个临床I期试验和4个临床II期试验（NCT04969172、EudraCT2021-002184-22、EudraCT2021-004259-17、NCT04902183、NCT04747574），先后共入组了526例志愿者，取得积极成果，超过90%的参与试验的新冠重症患者在5天内治愈出院。CovenD24是一种以外泌体为载体、内含CD24蛋白的药物，CD24主要通过与特定细胞受体结合，能够抑制免疫反应及细胞因子释放，抵抗COVID-19。但目前CD24这一靶点尚无新药获批，默沙东以4.25亿美元预付款收购的CD24-Fc融合蛋白药物（MK-7110）终止了新冠肺炎的临床III期试验，实体瘤适应症正在开展临床I/II期试验。所以CovenD24选择CD24或具有较大研发风险。 图21. CD24/Siglec-10信号通路 CD24与巨噬细胞上的Siglec-10互相作用，可抑制巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬，敲除CD24或Siglec-10，将促进巨噬细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。CD24被认为是一种新型肿瘤免疫靶点，与明星分子CD47一样，也是一种肿瘤细胞“别吃我”信号蛋白。 exoIL-12™和exoSTING™由Codiak BioSciences研发，是基于该公司工程化外泌体技术平台engEx™ PLATFORM开发的两款产品，也是全球最先进入临床的工程化外泌体递送药物。该平台使用PTGFRN和BASP1作为支架蛋白，将靶向配体或治疗分子安装到外泌体的表面PTGFRN蛋白上或腔内BASP1蛋白上，达到运输至靶组织靶细胞和治疗疾病的作用。 图22. engEx™ PLATFORM外泌体递送平台 exoIL-12™是一种外泌体治疗候选药物，通过外泌体支架蛋白PTGRFN在表面展示完全活性形式的IL-12。回溯历史，白介素类产品通过激活T细胞和NK细胞具有强大的抗肿瘤免疫反应，但由于无法在局部持续保留、全身暴露引起严重不良事件，导致多个临床试验失败，特别是在刚刚过去的2022年，所以Codiak在外泌体全新领域再叠加风险极高的IL-12或将带来较大的研发风险。 小贴士 白介素临床失败案例 2009年11月，罗氏的重组IL-12（Ro24-7472）宣告II期临床试验失败； 2022年3月，BMS与Nektar合作开发的IL-2受体激动剂NKTR-214联合Opdivo治疗黑色素瘤的III期临床试验宣告失败； 2022年8月，Moderna停止开发靶向IL-2的治疗自身免疫性疾病的mRNA药物mRNA6231； 2022年8月，Codiak宣布暂停推进exoIL-12™的II期临床试验，具体原因未披露； 2022年9月，红细胞治疗先驱Rubius首发的两个产品RTX-224（IL12/4-1BBL）、RTX-240（IL15/4-1BBL）也是触碰了白介素的魔咒宣告I期临床试验失败并破产清算； 2022年10月，赛诺菲宣布终止偏向性IL2疗法SAR444245的II期临床试验； 2022年11月，IL-2/IL-15激动剂NL-201宣布临床I期失败，Neoleukin公司裁员70%； 2023年1月，默克转让IL-12类似物M9241给PDS Biotechnology。该分子于2011年进入临床I期，至今已开发12年，仍处于临床II期试验，可见白介素类产品开发的难度之大； 2023年2月，阿斯利康放弃IL-12产品MEDI9253的推进。 exoIL-12™适应症为皮肤T细胞淋巴瘤（CTCL），给药途径为瘤内注射。2020年12月，Codiak公布临床Ⅰ期试验达到了主要终点，55例健康志愿者中显示出良好的安全性和耐受性，没有局部或系统治疗相关的不良事件，也没有检测到IL-12的全身性暴露。2022年6月，Codiak公布CTCL试验部分，2例患者均得到治疗，每位患者在多个肿瘤病变处接受了20余次exoIL-12注射(6.0 μg)，治疗时间大于6个月，未观察到3级及以上治疗相关不良事件。患者001表现出部分缓解，疾病负担减少61%，注射和未注射的所有皮肤病变CAILS评分的改善范围为20-80%，治疗医生认为不需要再注射。患者002注射了20次，疾病负担降低了43%，注射和未注射的所有病变的CAILS评分均有30-50%的改善。披露数据结果的同时宣布将于2023年第一季度启动II期试验，但2022年8月公司突然公告暂停exoIL-12™的临床II期，具体原因未披露。 图23. exoIL-12™的结构 exoSTING™是将STING激动剂纳入外泌体腔内，同时在外泌体表面表达高水平的PTGFRN蛋白，以促进肿瘤抗原提呈细胞的特异性摄取。该产品依然通过瘤内注射方式治疗头颈部鳞状细胞癌、三阴性乳腺癌、甲状腺间变性癌、皮肤鳞状细胞癌，2022年9月完成27例志愿者参与的临床I/II期试验。在所有剂量队列中，exoSTING耐受性良好，未观察到三级或更高级别的剂量限制毒性或治疗紧急不良事件，但在3例患者中观察到与治疗相关的不良事件(TRSAE)——2例二级细胞因子释放综合征、1例一级发热。在注射肿瘤和远端非注射肿瘤中观察到抗肿瘤活性的迹象。数据支持将exoSTING推进到II期临床，特别是在早期疾病中，与免疫治疗结合可能疗效增强。公司计划2023年第一季度启动临床II期试验，但2022年8月公司突然公告暂停exoSTING™项目。 图24. exoSTING™的结构 2.2.2 装载核酸 工程化外泌体递送 exoASO™-STAT6是在外泌体表面装载了针对STAT6转录因子的反义寡核苷酸(ASO)，同时在外泌体表面表达高水平的PTGFRN蛋白以促进选择性靶向M2极化肿瘤相关巨噬细胞的摄取。该产品适应症为晚期肝细胞癌(HCC)、胃癌转移至肝脏、结直肠癌转移至肝脏，给药方式为静脉注射，处于临床I期阶段，入组30例志愿者，暂无临床数据披露。 图25. exoASO™-STAT6的结构 2.2.3 装载小分子 工程化外泌体递送 将小分子药物装载于外泌体有利于提高药物的稳定性、溶解度、生物利用度、靶向性等, 增强药物的有效性和安全性。小分子既可以装载在外泌体内部，也可以装载在外泌体表面，但需要筛选一些适合装载的小分子，方法有共孵育、挤压、超声、反复冻融、微流控、供体细胞共培养和再分泌以及下文提到的外泌体偶联药物。 目前已经有研究团队研究了外泌体装载紫杉醇、阿霉素、紫草素、青蒿琥酯等分子，表现出优异的效果，为后续新药的开发奠定了坚实基础。 图26. 牛奶外泌体-阿霉素的内部装载 （Journal of Extracellular Vesicle, 2021, 10 (13): e12163） 2.2.4 口服给药 工程化外泌体递送 牛奶是外泌体的可扩展来源，含有来自多种细胞来源的丰富外泌体，已经证明牛奶外泌体(MEs)是进化上保守的细胞外囊泡(EV)，具有良好的稳定性和低免疫原性，显示出优异的跨物种耐受性。牛奶外泌体可以在胃中的强酸性条件和肠道中的降解条件下存活，保持结构的完整性，从而在局部或运输到循环系统后发挥作用。牛奶外泌体穿越胃肠道屏障的能力使其成为一种有前途的口服给药工具，已被广泛接受为运输多种生物分子和化疗药物的有前途的口服药物载体。 2023年3月11日，天津外泌体科技（Tingo Exosomes Technology Co., Ltd）开发出mRNA-牛奶外泌体新型口服递送系统，相关研究成果于发表于《Vaccines》。牛奶外泌体能够保护mRNA免受消化道酶和pH值变化等因素影响，基于这些特性，天津外泌体科技研发团队开发出高效mRNA-牛奶外泌体新型口服疫苗，初步实现SARS-CoV-2 RBD mRNA的口服递送。 图27. mRNA-牛奶外泌体新型口服疫苗 （Vaccines 2023, 11(3), 673） 2.3  外泌体偶联药物 2021年7月26日，Nature子刊Nature Biomedical Engineering在线刊发了中科院魏炜教授团队联合首都医科大学陶勇教授团队和昆士兰大学余迪教授团队共同署名文章，开发出外泌体偶联VEGF单抗，利用Treg来源的外泌体(rEXS)为载体，通过基质金属蛋白酶(MMP)敏感肽段(cL)连接VEGF抗体(aV)，创建了rEXS-cL-aV体系。当玻璃体腔注射后，利用rEXS向炎症部位的趋化性，携带aV富集于眼底新生血管病灶，随后利用病灶部位高表达的MMP酶解敏感肽段cL并释放aV，在小鼠模型中证明其潜在成药性，疗效显著优于VEGF单抗，具备强大的市场潜力。 图28. 外泌体偶联VEGF单抗 (Nat Biomed Eng. 2021, 5(9): 968-982) 天津外泌体科技自主研发的“EXC外泌体生物靶向药物递送平台” (Exosome-Xenobiotic Conjugation) 已经实现Her2抗体负载的外泌体靶向递送，外泌体对Her2抗体的负载阳性率高达76%，抗体负载后的外泌体在37℃与4℃下被Her2阳性细胞摄取率分别高于对照组阴性细胞6.3倍与174.5 倍(相关阅读：天津外泌体实现外泌体外源装载靶向递送)。除了偶联抗体，天津外泌体科技使用小分子青蒿琥酯作为模型药物，实现了超过90%的装载率和包封率，每个外泌体可装载超过7×10E5个青蒿琥酯分子，实现了毫克级药物装载。该公司利用EXC平台设计并制备了首个EDC (Exosome-Drug Conjugation) 模板药物，外泌体表面化学偶联抗体和小分子，突破ADC药物载药率低、安全性有限的瓶颈。 图29. EDC相对ADC的潜在优势 2.4  医疗美容与护肤 “外泌体/细胞外囊泡”携带原细胞分泌的蛋白质、活性因子等高生物活性物质，激活细胞再生功能，渗入皮肤后释放囊泡包裹的营养物质，持续滋养，调整细胞微环境，增强细胞活力，进而促进细胞迁移，促进胶原蛋白及弹性修复损伤、细胞再生，恢复皮肤年轻态，在医疗美容与护肤品领域的应用非常有潜力。 韩国ExoCoBio（ASCE+™、EXOMAGE™ 和 CELLTWEET™）、佰傲医学（芙媄逸、绽媄娅、秘零）、远想生物（凝光E.R.T）、三禾医疗（奥永丽）、捍马医疗（奥本源）、天津外泌体科技（牛奶外泌体原料+Y3）、娇韵诗（光芒小瓷瓶）等公司的产品已陆续实现商业化落地。 图30 ExoCoBio外泌体美容护肤品的机制 2.4.1 皮肤修复 医疗美容与护肤品 2019年，ExoCoBio在Stem Cell Research and Therapy上发表了一篇科学论文，证明干细胞来源的外泌体可以显著改善“特应性皮炎”，抑制多种炎症靶点，促进伤口愈合，在世界上属首次系统化的报道。研究表明，干细胞具有旁分泌的特性，能够修复损伤组织、促进细胞生长及调节免疫反应，其分泌的外泌体作为细胞分泌的关键一环，可以通过大部分毛细血管到达远处损伤部位，并且可以与现有已知活性药物进行组合，增强疗效，促进炎症消除和伤口愈合。 “ASCE plus-SRLV”是世界首创将源于干细胞培养液的外泌体（ASC-EXOSOME™）成分冷冻干燥制成的产品，以具卓越的“肌肤再生”及“抗炎”效果为主要产品特征。产品组成为含有冷冻干燥的外泌体及多种有效成分的粉末安瓶及液态安瓶，使用时将两种安瓶混合后使用。ASCE plus外泌体可以减少55%的炎性细胞因子，促进7倍的胶原蛋白合成，以及增加3倍的弹性蛋白合成，达到皮肤修复再生、延缓衰老、改善痘肌、炎症等作用，从而全方面改善皮肤问题。2021年6月，ExoCoBio公司与biobijou公司合作进入中国市场。 图31. 美容产品ASCE+ 2021年3月，梅奥诊所开展了一项《A Phase I Open-Label Trial to Determine the Safety of PEP on a Skin Graft Donor Site Wound》研究，入组了37例受试者，确定一种被称为PEP（一种源自美国人的聚集血小板的血液制剂）的生物制剂在有皮肤移植供体伤口的人中的安全性（NCT04664738）。 2.4.2 延缓衰老 医疗美容与护肤品 2019年，美国约翰霍普金斯大学科研团队研究发现，高度纯化的诱导多能干细胞来源的外泌体（iPSCS-EXO）用于培养活性氧（ROS）水平升高的衰老间充质干细胞时， 衰老间充质干细胞的ROS水平降低，衰老表型减轻。因此，来自人类干细胞的外泌体可以缓解干细胞在培养中的老化（Stem Cells. 2019, 37(6):779-790.）。 2020年7月7日，英国伦敦玛丽皇后大学Ana O’Loghlen 团队在《Cell Metabolism》（IF=21.567）发表了“Small Extracellular Vesicles Have GST Activity and Ameliorate Senescence-Related Tissue Damage”。研究指出，年轻细胞分泌的细胞外囊泡（sEV）可以通过减少氧化损伤来改善老年个体细胞的衰老，揭示了外泌体通过自身GST活性调节GSH/GSSG而影响细胞和器官的ROS积累，从而调控衰老表型。近期，该研究在《Nature Reviews Molecular Cell Biology》杂志（IF=55.47）上进行了Highlight推荐（Cell Metab . 2020, 32(1): 71-86.）。 2022年，Science Advances杂志上发表一篇文章，用来自年轻动物的脂肪间充质干细胞(ADSC)的小细胞外囊泡(sEV)治疗老年动物，发现通常随着衰老而改变的几个参数有所改善，例如运动协调性、握力、抗疲劳性、毛皮再生、肾功能、虚弱（Sci Adv. 2022, 8(42): eabq2226）。 图32. 外泌体的抗皮肤衰老作用 2.4.3 敏感肌修复 医疗美容与护肤品 据中山大学附属第三医院皮肤科副主任郑跃介绍，该院皮肤科从 2020年10月开始到2021年7月完成了一项临床试验，招募了44例不同类型皮肤敏感的患者，用涂抹式的外泌体舒缓修复敏感性皮肤。临床研究初步显示，外泌体对皮肤屏障有较好的修复作用，它对敏感性皮肤，特别是有红斑或者是有红区炎症的敏感性皮肤有较好的治疗效果，也就是反映了外泌体的抗炎作用。郑跃表示，临床试验结果认为，外泌体作为皮肤修复的手段之一，可以单独使用或根据皮肤状态和需求联合功效性护肤品、玻尿酸、光电等其他医美手段一同使用。 中山大学附属第三医院皮肤科主任赖维认为：外泌体免疫原性低，还含有抗炎成分等，除了修复敏感肌，还有抗衰老和皮肤美容的功能，可以满足敏感肌和衰老肌肤的修复、抗炎、舒缓及皮肤活力再生。 在科罗拉多州丹佛市举行的2022年美国皮肤外科学会（ASDS）上，梅奥诊所的Saranya Wyles 医学博士团队公布一项外泌体美容研究，招募了56名患者，平均年龄为 54岁，将外泌体产品应用于患者面部，6周后，面部发红的状况得到改善、血红蛋白过程改善 92%、不同年龄组的脉管系统也有所改善。特别是40多岁、50多岁和60多岁的患者，在发红和皮肤老化方面得到了持续改善。 2.4.4 美白淡斑 医疗美容与护肤品 娇韵诗参与的一项发表在Nature子刊上的研究发现：角质细胞释放的外泌体可以调节黑色素细胞的色素沉着，这种外泌体会携带有能力调节色素沉着的微小RNA与黑色素细胞进行交流。基于这项研究，娇韵诗发现了能够通过抑制外泌体中包含的信息来发挥美白淡斑效果的光滑金虎尾果提取物。目前，光滑金虎尾果提取物已在娇韵诗护肤品中使用，即娇韵诗旗下的美白产品光芒小瓷瓶的主打美白成分之一（Nature Communications. 2015, 24(6), 7506)。 2.4.5 生发 医疗美容与护肤品 法国化妆品原料商Silab与法国国家健康与医学研究院INSERM合作的研究发现，成纤维细胞外泌体在毛发生长中具有关键作用：真皮与毛囊之间的外泌体通讯是毛发生长的一条值得关注的生物学通路，来自成纤维细胞的外泌体能促进Norrin（一种能激活参与毛发生长的β-连环蛋白通路的配体）的分泌。Silab据此推出了一款能够作用于“真皮和毛囊之间的外泌体通讯系统”的天然生发成分HAIRGENYL®酵母提取物。 2022年4月，韩国外泌体生物技术公司ExoCobio推出ASCE plus-HRLV，这是世界上首个基于外泌体的防脱生发产品。 图33. ASCE plus防脱和抗皮肤衰老/抗炎作用 （Cells. 2020, 9(5): 1157.） 2.5  体外诊断/早期筛查 外泌体可在多种体液（例如血液、尿液、唾液、脑脊髓液）中检测到，其结构较为稳定、内容物丰富，携带大量特异性细胞因子、功能性mRNA、生长因子、脂类物质等参与细胞间物质运输和信息传递，与多种疾病的发生和发展过程密切相关。特定的蛋白质、核酸、信号分子、脂质等可反映细胞水平的异常，可被用作疾病诊断的无创或微创生物标志物。作为新兴体外诊断技术，在肿瘤肿瘤及其他多种慢性疾病的筛查和诊断等领域应用前景巨大。 2.5.1 肿瘤 体外诊断与早期筛查 外泌体已成为继循环肿瘤细胞（CTC）、循环肿瘤DNA（ctDNA）后液体活检领域研究的热点。相较于CTC、ctDNA两种检测方式，外泌体检测具有样本形式丰富、内含物更稳定两大优势，更易得到理想的检测浓度。 图34. 外泌体应用于肿瘤早筛的检测流程 2.5.2 中枢神经系统 体外诊断与早期筛查 外泌体作为一种由细胞分泌的、能够通过全身循环和局部扩散作用介导细胞间信息交流的载体，对CNS疾病的发生发展和传播以及治疗都有着重要的作用。外泌体源性miRNA能通过血脑屏障，稳定且不易被降解，敏感性高，有望成为CNS疾病早期诊断指标；但是，需要提高脑脊液或血液样本外泌体的获取效率和分离纯化，减少外泌体在提取过程中的分解。此外，外泌体在CNS疾病的发生、发展以及参与疾病的机制等尚需进一步研究。 2.5.3 感染疾病 体外诊断与早期筛查 外泌体参与细胞间信号传递、凝血、炎症和细胞内稳态等多种生物学过程影响感染性疾病的发生发展。越来越多的研究表明外泌体与感染性疾病的关联性，外泌体可能被用作感染性疾病的生物标志物，具有预防感染的可能性，多项研究表明外泌体可作为细菌感染、病毒感染（HIV、肝炎病毒、呼吸道病毒）及其它感染性疾病诊断标记物，揭示外泌体能够为感染性疾病的诊断、治疗及预防提供新思路。 2.5.4 心血管疾病 体外诊断与早期筛查 心血管疾病诊断的生物标志物主要是对已知心肌蛋白的靶向分析，肌酸激酶同工酶、肌红蛋白及肌钙蛋白等生物标志物目前已广泛应用于临床。肌钙蛋白是急性心肌梗死诊断的金标准，但对其他心血管疾病的诊断缺乏特异性。外泌体的成分和生物学内容物对细胞激活和损伤具有特异性，它们具有作为心血管疾病诊断和预后生物标志物的潜力。由于有些外泌体是在特定的应激条件或损伤条件下形成，因此循环系统中的外泌体逐渐被认定是心血管疾病的生物标志物的候选者。近年来研究发现外泌体miRNAs参与心血管疾病的生理和病理机制及外泌体miRNAs的临床应用已成为心血管疾病诊断研究的前沿和热点外泌体miRNAs作为急性心肌梗死、慢性心力衰竭和冠状动脉疾病等心血管疾病新的诊断性生物标志物有很好的研究前景。 2.5.5 呼吸系统疾病 体外诊断与早期筛查 外泌体miRNA在呼吸系统疾病的疾病标志物研究中有着广泛的应用，外泌体miRNA在特发性肺纤维化、慢阻肺、肺结核及哮喘等呼吸系统疾病的发病机制中具有重要意义，且它们具有非免疫原性和快速提取的特点，因此，外泌体miRNA有希望作为肺部疾病的一种新的诊断和治疗的生物标志物。 Vol.3 外泌体的生产与质控  外泌体行业已经到了大规模产业化的前夕，规模化生产和质量控制成为非常重要的一环。 3.1  生产工艺 产量低、回收率或纯度低、靶向特异性差，使得外泌体的大规模生产仍是阻碍其发展的主要瓶颈之一。实验室阶段的外泌体生产具有一定的局限性，一些开放性操作拓展至放大生产时会导致一系列挑战，因此需要一些创新性的技术来衔接，以支持更大规模的生产需求。 图35. 外泌体实工业化生产 外泌体的生产流程包括：外泌体的获取(生产)、分离、纯化、制剂。如果是外源装载外泌体还需要经过工程化后再纯化，再制备成相应制剂。 3.1.1 外泌体的生产 外泌体的生产工艺 来源于干细胞和293细胞等动物细胞外泌体的收获需要先进行大规模细胞培养，以生产获得含有外泌体的原料。牛奶外泌体的收获不需要细胞培养，直接从新鲜牛奶中即可获取，是一个高效、大量获取外泌体的来源，最容易产业化。植物外泌体需对植物进行提取获得外泌体原料。 干细胞外泌体的获取 干细胞是一种“贴壁依赖细胞”，具有贴壁依赖性，在二维表面上如T型方瓶、烧瓶、多层细胞工厂等培养系统已经相当成熟，但不足以满足未来商业化可行性的需要。贴壁细胞培养平台扩大生产的技术要素主要集中在最大化培养表面积上， Cytiva推荐基于3D微载体贴壁悬浮培养的工艺。微载体（Microcarrier）培养系统是贴壁培养和悬浮培养相结合的一种操作单元，具有比表面积大、允许环境参数监控、方便取样、易于放大、可在无蛋白水解酶的作用下实现细胞迁移等优点，既解决了2D贴附培养技术中的空间问题和在线监控问题，又解决了悬浮的均质问题。 图36. 干细胞3D微载体培养生产外泌体 来自马萨诸塞大学医学院的研究人员开发了一种稳健可放大的符合GMPs的间充质干细胞生产外泌体的方案，即生物反应器中基于3D微载体进行贴壁依赖性细胞培养并结合切向流过滤（Tangential Flow Filtration，TFF），使外泌体的产量提高了140倍，在治疗性siRNA转移至原代神经元的能力上具有7倍的活性。 在搅拌式生物反应器（SR）中使用微载体悬浮培养，可明显增加"贴壁依赖细胞"的培养效率及外泌体产量，适用于中试和大规模生产，但保持细胞和外泌体的表型不发生改变方面也存在挑战。当细胞从静态平面培养转移到动态3D环境时，搅拌和通气引起的剪切应力可能导致细胞及外泌体表型改变。有报道称，在转速为180 rpm生物反应器中培养T淋巴细胞引起IL-2受体下调，细胞扩增减少。剪切应力可诱导间充质干细胞p38丝裂原活化蛋白激酶和细胞外信号相关激酶的机械转导途径，导致成骨分化，进而改变外泌体表型。此外，限制高剪切动态系统中的细胞死亡以最大限度减少凋亡小体杂质至关重要（动物细胞来源外泌体生产中的细胞培养工艺. Cytiva思拓凡, 2022）。 HEK293细胞外泌体的获取 HEK293细胞是一种悬浮适应细胞，在病毒载体（如LV、AAV）的生产中被广泛使用，其无血清悬浮培养工艺已相对比较成熟。搅拌式生物反应器（SR）尤其适合悬浮适应细胞的外泌体生产，与其他悬浮适应的细胞系相比，HEK293细胞具有明显的结团倾向，通过使用抗结团剂纠正细胞的结团现象，可使细胞生长得到明显改善，单位体积外泌体产量提高8倍。 牛奶外泌体的获取 牛奶外泌体需从新鲜牛奶中提取制备，采用超速离心法(UC)或多种化学前处理方法去除乳蛋白，切向流超滤技术(TFF)进一步去除残留的乳蛋白，实现牛奶外泌体样品的初纯与浓缩。 植物外泌体的获取 植物外泌体与其他外泌体的提取方式类似，可适用如超速离心法、免疫亲和捕获法等传统分离方法；但由于植物细胞存在细胞壁和机械组织，必要时也可以考虑纤维素酶解等辅助手段。例如浆果类植物，如番茄、荸荠等富含水分，仅需通过传统的机械粉碎结合已有的外泌体提取技术即可实现对外泌体的有效提取。而对于非浆果类植物，如人参、田七等块茎类药用植物，外泌体直接提取较为困难，需采用酶解等样品前处理手段。 3.1.2 外泌体的分离纯化 外泌体的生产工艺 外泌体分布在极其复杂的体系中，单一方法很难获得高纯度的外泌体，需要利用外泌体的不同物理化学和生化特性进行多方法的联合，这使得高产量的外泌体分离纯化非常具有挑战性。对于外泌体的分离纯化，可以通过确定的程序，超速离心法、超滤法、免疫亲和层析、基于电荷中和的聚合物沉淀法、尺寸排阻色谱、微流体技术、切向流过滤来完成产品的分离纯化（Theranostics 2020; 10(8):3684-3707）。 超速离心法 超速离心法可分为“密度梯度离心法”和“差异超速离心法”两大类，该方法是公认的外泌体分离金标准方法。超速离心法需要昂贵的设备和训练有素的技术人员，特别是对于梯度超速离心。同时，分离的外泌体的结构和生物学功能可能会受到长时间的超离心力的影响，不利于下游应用（例如样品中的高水平蛋白质聚集体和脂蛋白污染不利于外泌体的功能研究和药物开发），超滤和尺寸排阻色谱法可以弥补此类问题。 超滤法 超滤可以使用具有不同分子量截止值（MWCO）的超细纳米过滤膜从样品中分离细胞外囊泡，并通过大小区分外泌体和核外颗粒体。与超速离心方法相比，大大缩短了处理时间并不需要特殊设备。重要的是，通过轻松调整滤光片大小，超滤允许研究人员对具有定义粒径的细胞外囊泡（包括外泌体）的特定亚群进行分类。该方法包括串联配置的微滤器和顺序超滤两种。 图37. A.微滤器；B. 顺序超滤 运行模式包括直流过滤（DFF）或切向流过滤（TFF）。 图38. 切向流过滤示意图 DFF对于采用离心式装置的较小流量（最多30mL）处理过程效果较好，但DFF技术会受到膜堵塞问题的不良影响。为了减少胶质层的形成，可使用浮动式搅拌棒配置（搅拌槽）或通过生成一个受控的层流，在膜片的上游侧生成交叉流。搅拌棒运行可改善超滤效果，但在获得最佳性能方面仍有局限性。因为搅拌速度和时序水平取决于棒体摆动范围，而此范围会随着摆动半径的改变而变化。 切向流过滤（TFF）是一种应用于生物分子分离和纯化的快速有效的方法。该方法可用于各生物领域，例如免疫学、蛋白质化学、分子生物学、生物化学和微生物学。TFF可用于对容量从10mL到数千升的样品溶液进行浓缩和脱盐处理。此方法可用于分馏大小不一的生物分子、获取细胞上清液，以及对发酵培养基和细胞裂解物进行澄清处理。 图39. 切向流过滤设备 由于效率高、设备成本低、操作快速、便携性良好、可达到中等纯度等优点，超滤越来越受欢迎。但在过滤过程中，其剪切应力会引起的潜在劣化；并且可能由于堵塞和膜捕获而造成原料的损失。 尺寸排阻色谱法 尺寸排阻色谱法（SEC）能够以最小的结构损伤分离外泌体，不会影响囊泡结构和完整性，能够保存分离外泌体的天然生物活性。在过去的50年中，各种细小的多孔材料，如葡聚糖聚合物（Sephadex）、琼脂糖（Sepharose）、聚丙烯酰胺（Sephacryl或BioGel）等被运用到SEC的优化中。 图40. SEC尺寸排阻色谱法示意图 该方法易于扩展和自动化，用于高通量外泌体制备。但设备成本相对较高，需要额外的外泌体富集方法。 高度亲水的聚合物与外泌体周围的水分子相互作用，产生疏水性微环境，导致外泌体沉淀。现有的基于聚合物的外泌体沉淀方法通常采用分子量为6000至20000 Da的PEG。该法易于使用、设备需求低、样品量兼容性高、效率高、可分离蛋白质聚集体、其他细胞外囊泡、聚合物污染物的污染物。但所需的处理时间较长，需要复杂的清理步骤，会影响下游分析和定量的结果。 免疫亲和力捕获法 免疫亲和力捕获法是识别外泌体特异性标志物的抗体（固定在固体表面上）和外泌体的流体一起孵育富集外泌体，通过额外的洗脱步骤收集外泌体。外泌体标志物如Rab5、CD81、CD63、CD9、CD82、膜联蛋白和Alix等跨膜蛋白已被广泛用于商业化选择性外泌体分离。该方法具有较高的捕获效率和灵敏度，而且还可容纳较大的起始样品量；此外，该方法可以通过检测分离的外泌体上的疾病特异性标志物如EpCAM，CD133，EGFR直接转化为诊断平台（外泌体纯化工艺挑战盘点. 医麦客, 2022）。 图41. 免疫亲和力捕获法示意图 该方法相关的非中性pH和非生理洗脱缓冲液可能会不可逆地影响所收集的外泌体的生物学功能，寻找对外泌体损伤更低的洗脱液，另外该法产量较低、抗体基成本较高的问题，化学抗体或许是下一步的改进方向。 微流体技术 微流体技术可分为“基于免疫亲和力的微流体分离技术”、“基于尺寸的微流体分离技术”以及“非接触式微流体”。微流体技术结合了外泌体分离和分析，将含外泌体的流体添加到介质中后，根据细胞外囊泡的物理和生化特性，分离外泌体，可以从少量体液中快速分离外泌体，并进行实时外泌体表征分析以进行原位诊断。该方法高效方便，但只适合小样本分离。 3.2  质量控制 作为新型生物制品，目前没有专门针对外泌体质量控制的法规和指导原则。但外泌体是细胞产物，其质量控制与指导原则可参照细胞产品相关原则。针对细胞治疗和细胞相关产品，FDA于2016年发布了“Content and Review of Chemistry, Manufacturing, and Control (CMC) Information for Human Somatic Cell Therapy Investigational New Drug Applications (INDs)”，该指导原则就细胞库、生产过程中添加的各物料等在生物安全性、产品质量稳定性进行详细指导。此外，ICH发布的Q5A(R1)、Q5A(R2) EWG对细胞产品中外源病毒检测提供了指导意见。国家药品监督管理局于2017年发布了《细胞治疗产品研究与评价技术指导原则》及相关问题解读，该指导原则对细胞治疗及其相应产品在使用血清及其它物料、细胞库等存在风险进行评估指导。外泌体作为细胞代谢过程中的产物，产品的质量与宿主细胞的质量息息相关，诸多文献对外泌体GMP级生产流程进行优化和质量监控，主要包括上游细胞安全生产检测和下游外泌体生产检测。 图42. GMP生产外泌体流程及质量监控图 3.2.1 细胞安全生产 外泌体的质量控制 2022年10月31日，国家药监局核查中心官网正式发布备受关注的《细胞治疗产品生产质量管理指南（试行）》，指导药品上市许可持有人规范开展细胞治疗产品的生产和质量管理，保证产品质量，同时，这也为细胞治疗药物研发企业提供了更清晰的研发、生产和发展路径。细胞制备应满足《中华人民共和国药典》、《药品生产质量管理规范》、《药品注册管理办法》、《药品生产监督管理办法》、《药品生产质量管理规范》及其附录、《药品注册核查管理规定》、《药品不良反应报告和监测管理办法》、《药品召回管理办法》、《药品说明书和标签管理规定》、《药品生产企业现场检查风险评定原则》、《医疗废物管理条例》、《病原微生物实验室生物安全管理条例》。 对细胞安全生产的基本要求：有细胞采集、加工、检定、保存和临床应用全过程的标准操作程序(SOP)和完整的质量管理记录；整个过程必须遵循细胞产品质量控制标准(QC)，并拥有与其配套的检测设备和检测方法；细胞库的细胞必须保证可溯源；按照批准的细胞产品质量控制标准对每批次细胞产品进行严格检测，包括细菌、真菌、支原体和内毒素。 3.2.2 外泌体生产检测 外泌体的质量控制 外泌体生产纯化过程中涉及到的关键设备、仪器、耗材及试剂，包括超速离心机、纯化仪、填料、移液管、离心管等，都应由符合GMP要求；同时应定期检查耗材的储存及有效期是否符合要求，保证所用原料、试剂与耗材的安全有效；最终产品质量严格遵循《细胞治疗产品研究与评价技术指导原则》对其进行相应检测。 图43. 外泌体质量控制项目 目前亟需对不同分离方法在外泌体回收效率、纯度、蛋白标志物、装载药物量等方面进行评价，制定统一的流程和标准。科学家使用NanoFCM对不同样品外泌体用不同纯化方法纯化进行了研究，NanoFCM可在单颗粒水平对外泌体的颗粒浓度、大小、纯度、蛋白等进行表征，研究纯化方法对外泌体的影响，优化外泌体的纯化过程，有望为建立标准有效的外泌体分离和质控方法提供表征手段。 Vol.4 外泌体产业链分析  外泌体产业处于起步阶段，尚未形成完善的产业链格局。产业链上游为原材料、设备、服务供应商；中游为外泌体治疗药物、医美产品、诊断试剂供应商；下游为流通和应用终端。 图44. 外泌体行业产业链分布 4.1  产业链上游 产业链上游主要为1）细胞培养、奶源供应、植物原材料、微生物原材料等，通过培养、提取、分离纯化获得外泌体原料的相关企业；2）过程中相关的制造设备、试剂、耗材，以及提供外泌体CRO与CDMO服务的相关企业；3）外泌体检测检测领域的上游供应商还包括提供抗原、抗体等试剂原料及设备部件的相关企业。 目前国内主要制造设备、试剂和耗材仍以进口为主，跨国企业仍处于垄断地位。对于大规模外泌体原料的供应商和CDMO服务商，国内主要以天津外泌体科技（牛奶外泌体、干细胞外泌体、293细胞外泌体）、思珞赛等企业为代表；外泌体CRO服务主要以恩泽康泰、天津外泌体科技、思珞赛、宇玫博生物等为代表。 4.2  产业链中游 产业链中游为利用上游供应商提供的原材料、设备、耗材、试剂进行外泌体相关治疗、美容、诊断等产品的研发、生产、销售。目前外泌体领域处于起步阶段，全球约50余家从事外泌体相关产品开发的公司。 目前，国内外只有医美和护肤品上市销售，国外以韩国ExoCobio为代表，国内以佰傲医学、天津外泌体科技等公司为代表。 新药研发、诊断试剂均处于临床研究和临床前研究阶段，国外以ExoFlo、Codiak、Aegle、Exopharm、OBCTCD24、ILIAS、Evox、Exosome等为代表；国内以唯思尔康、纽兰生物、汇芯生物、安龄生物、亿微生物等为代表。 4.3  产业链下游 产业链下游为流通与终端机构。终端主要包括治疗药物面向的医疗机构、医美产品面向的医美机构、诊断产品面向的三方医检机构和医疗机构，以及护肤品面向的经销商（包括电商平台）和个人消费者。 Vol.5 产业驱动因素与挑战  5.1  产业驱动因素 5.1.1 基础研究突破 外泌体产业驱动因素 随着细胞外囊泡(EVs)运输调控机制研究的清晰，以及“精准外泌体”概念的提出，全球外泌体研发持续升温，有关外泌体载药、外泌体疗法、诊断和早筛等方向的研究成果陆续发表在Science、Nature等各大顶级期刊上，论文发表数量呈近爆炸式增长，近年平均每年外泌体相关论文都在3000篇以上，2019年为3279篇，2020年为4295篇，2021年5074篇，2022年为5204篇；国内2020年度国家自然科学基金申请项目的评审结果中，外泌体相关课题中标达到2000余项。外泌体已成为生命科学和基础医学研究的一大热点，为外泌体的应用与产业化探索奠定了坚实的基础。 图45. 外泌体学术研究成果发表情况 5.1.2 跨国药企布局 外泌体产业驱动因素 外泌体产业的商业运用引起了大型跨国药企的注意，新兴的生物技术公司与大型跨国药企产业化合作的态势逐渐明朗。以礼来、武田、爵士制药为代表的大型跨国药企已经分别与拥有外泌体创新技术平台的公司达成多项高额合作，接连签署数笔10亿美元级大额合作开发协议，共同开发外泌体靶向疗法。 爵士制药：2019年1月，爵士制药与Codiak达成了以外泌体载药为核心的血液系统恶性肿瘤和实体肿瘤的新药研发合作。爵士制药同意向Codiak支付5600万美元的研究经费，并为合作的五个新药项目支付高达2000万美元的临床前开发里程碑付款，若项目实现约定里程碑，则每一个靶标再支付2亿美元款项。在I/II期临床试验结束后，爵士制药将负责后续的临床试验、新药申请以及商业化推广。 礼来制药：2020年6月9日，礼来公司与Evox达成一项12亿美元的合作协议，利用其技术平台开发递送RNA干扰药物和反义寡核苷酸药物(ASO)的工程化外泌体，治疗中枢神经系统疾病。 武田制药：2020年3月，武田也与Evox公司达成一项8.82亿美元的合作，利用外泌体递送蛋白质及mRNA核酸药物，治疗包括C型尼曼-皮克病在内的罕见病。Evox将负责推进临床前研究并进行临床试验的申请。 5.1.3 应用价值驱动 外泌体产业驱动因素 外泌体本身可以做为药物、美容护肤产品的活性成分，又可以做为小分子、蛋白、核酸等活性物质的纳米递送系统，还可以被用于诊断和早筛的无创或微创生物标志物，应用前景非常广阔。开启了纳米医学产业、细胞与基因治疗产业、医美与护肤产业和体外诊断产业的新篇章。 5.1.4 政策驱动 外泌体产业驱动因素 2022年5月10日，国家发改委印发《“十四五”生物经济发展规划》，“外泌体治疗”首次进入国家经济发展规划，在《生物经济创新能力提升工程》专栏关于“关键共性生物技术创新平台建设”中提到：围绕加快创新药上市审批、强化上市后监管，建设药品监管科学研究基地，建设抗体药物、融合蛋白药物、生物仿制药、干细胞和细胞免疫治疗产品、基因治疗产品、外泌体治疗产品、中药等质量及安全性评价技术平台。 5.1.5 商业化驱动 外泌体产业驱动因素 随着细胞与基因治疗产业的不断发展和成熟，外泌体产业的上游商业化技术不断完善，为外泌体产业奠定了商业化基础。 图46. 微载体大规模细胞培养生物反应器 外泌体领域率先在医美和护肤品方面获得突破，产品全球销售，打开了产业化的大门；多种外泌体药物和外泌体诊断试剂也处于人体临床试验阶段，最快已处于III期临床，在安全性和有效性方面获得了一致认可。 5.2  问题与挑战 2023年，张琪、于湄、刘磊、田卫东等在《中国组织工程研究》发表了“工程化外泌体研究现状与临床转化的挑战”， 阐述了外泌体产业面临的一些问题和挑战（中国组织工程研究，2023，27(19):3052-3060）。 5.2.1 亲本细胞选择与培养 外泌体产业问题与挑战 目前，对于外泌体生产的最佳技术暂时还未达成共识。 亲本细胞的选择构成了外泌体生产的首要关键步骤，不同的细胞生产的外泌体生物学特性有差异，研发人员需要根据外泌体的活性和组织归巢特性以及潜在的免疫原性和致癌性来选择亲本细胞。 培养过程中的微小变化可能会改变外泌体的生物学特性。即使来源于相同的亲本细胞，由于培养条件的变化，比如亲本细胞的代数、培养方式、培养基等变化，最后得到的外泌体也有可能不同，这也是外泌体生产过程需要考虑的关键问题。从生产过程安全性的角度来看，最好使用封闭式系统，但这比开放式系统更难监控。牛奶来源的外泌体是获得大量生物相容性外泌体的有效替代来源，从复合牛奶中大规模获取外泌体更加适合工业化生产。 5.2.2 分离纯化工艺 外泌体产业问题与挑战 外泌体的分离纯化也是一个不容忽视的关键程序。不同的分离提纯方法得到的外泌体产量差距悬殊，外泌体亚群也有所不同，这为质量控制带来了挑战。目前亟需对不同分离纯化方法在外泌体回收效率、纯度、蛋白标志物、装载药物量等方面进行评价，制定统一的流程和标准。 5.2.3 成分表征 外泌体产业问题与挑战 外泌体的表征集中在测量颗粒大小和数量，以及检测特定的表面蛋白和货物。透射电子显微镜成像是表征外泌体结构和大小的标准方法。此外，扫描电子显微镜和动态光散射可以对外泌体进行表征。合格的体外表征与量化可以预测载药外泌体系统的预期治疗潜力，但是至今仍然缺乏外泌体量化以及分子和物理特征描述的金标准，寻找开发外泌体最佳表征与量化方式是目前研究中不可忽视的一部分。由于外泌体的大小和复杂性，现有技术可能会限制工程化外泌体产品的物理化学、免疫化学或功能的细节表征，有限的产品表征能力也对工程化外泌体产品的机制理解有一定影响。 5.2.4 质量控制 外泌体产业问题与挑战 外泌体这种复杂程度的物质和构造只能由活细胞产生，面临一定程度的内在生物变异而导致产物的异质性，异质性既受细胞内的生物加工影响，也受制造工艺的影响。如培养条件(细胞传代、细胞密度、外泌体收获频率）会影响产物质量的各个方面，包括产量、外泌体组成、外泌体生物活性。 在外泌体生产过程中检测和评估产品质量的变化比在蛋白和抗体生产过程中更具挑战性。由于微小的变化可能对产品质量和活性产生相当大的影响，外泌体制造过程的稳定性比细胞和抗体生产过程的稳定性要低，但外泌体制造仍可以建立在这些工艺的基础上。外泌体的大小、成分、结构的复杂性是独一无二的，因此需要额外的程序对外泌体生产进行控制。这些过程可能包括测量大小和浓度、排除污染物、识别功能标记物和评估载药量以评估每一数量的外泌体的治疗活性等措施，以确保外泌体终产品满足先前确定的关键质量属性。 5.2.5 存储稳定性 外泌体产业问题与挑战 外泌体建议在-80℃下存储，其大小和数量在-80 ℃下保持不变，潜在问题是有可能造成一些生物活性的改变以及储存和运输的成本相对高昂。另有研究表明，在4℃下储存会对外泌体结构造成聚集和损坏。 科学家们提出了其他的替代方法。WU等提出将外泌体保存在GelMA水凝胶中可减少外泌体聚集，达到保存外泌体的目的。另一种较常见的保存方法是冷冻干燥，冻干的外泌体可以在室温下储存，且能够保持外泌体的囊泡大小和蛋白质含量、结构完整性、生物活性、运送药物分子的药代动力学等关键属性，效果可以与新鲜外泌体媲美。 5.2.6 产品安全性 外泌体产业问题与挑战 纳米药物可能会导致一些不良免疫反应发生，比如过敏反应、细胞因子释放综合征、生物活性的中和、与内源性蛋白对应物的交叉反应和非急性免疫反应等。因此，对工程化外泌体的安全性和有效性加以证明对研究人员来说是一项挑战。 目前，产品制造商被要求注明药物中所有能够引起药理、免疫或新陈代谢作用的物质，并且在最终配方中使用的非活性成分 ( 称为赋形剂 ) 也应予以申报。国际胞外囊泡协会声明，如果整个治疗效果可以归因于外泌体负载的药物，而不是载药外泌体系统中的外泌体，则外泌体可以被视为赋形剂。在这种情况下，仅需要外泌体的安全性描述，而不需要描述其作用方式或机制。如果安全和质量标准均充分达到要求，并且提供了可信的作用方式和机制，则可以允许进行人体临床试验。 同种异体外泌体、异种外泌体要转化为安全有效的临床治疗产品，需要通过持续监测来严格把控亲本细胞的选择、免疫学、致癌效应的评估以及病毒污染的风险等问题。监测方法的选择特别是灵敏度，是确定外泌体药物载体临床转化的关键挑战之一。目前，监管机构尚未发布关于如何测试外泌体的安全性和有效性的指导意见，因此需要对现有的测试方法进行改进或者寻找新方法对工程化外泌体的安全性和有效性进行证明。 5.2.7 工程化外泌体成药性 外泌体产业问题与挑战 天然外泌体已经在美容护肤领域上市销售，药物领域也进入临床III期，其商业价值和成药性确定性很高。 工程化外泌体主要是发挥其递送活性成分的优势，搭载“何种活性成分”直接影响药物的成败，Codiak的临床管线暂停对行业信心影响较大。Codiak作为工程化外泌体载药的标杆企业一直备受关注，先后解决了外泌体骨架蛋白筛选、内源装载技术、规模化生产等难题。2022年Codiak首发进入临床的两个药物管线分别为exoIL-12™和exoSTING™（详见章节2.2.1 装载蛋白），治疗方式为“瘤内注射”。2022年中公布了临床I期实验结果：exoIL-12™安全性良好，临床Ⅰ期试验均达到了主要终点，并且2例患者均得到治疗，表现出部分缓解。exoSTING™未观察到三级或更高级别的剂量限制毒性或治疗紧急不良事件，在3例患者中观察到二级细胞因子释放综合征和一级发热。结果均支持产品推向临床II期，但Codiak于2022年8月宣布暂停推进两个产品的II期临床，股价暴跌，2023年3月27日宣告申请破产保护，引来业界轩然大波，并引来“工程化外泌体作为纳米递送载药系统是否能顺利商业化”的大讨论。 维渡纵横推测，Codiak暂停两个产品的临床II期而导致申请破产保护，可能有以下几方面的原因考量： 破 产 保 护 可 能 原 因 首先，其装载的活性成分具有一定挑战：IL-12的人体临床试验多以失败告终，从2022年至今有8个产品宣告失败被放弃，并且创业公司Rubius因此破产清算，令人望而却步；STING激动剂可能在直接瘤内注射时有散开风险，对后续临床试验失败风险或有顾虑；出于风险考量暂停产品的II期临床开发。 其次，两个产品均为“瘤内注射”产品，或可能存在一定局限性。 再次，Codiak是由风险投资机构Flagship Pioneering推动成立的公司，Flagship同样也是Rubius的大股东。鉴于Rubius刚刚在白介素领域（IL-12和IL-15）的失利导致资金链断裂而破产，或建议Codiak及时止损，申请破产保护并寻求出售其资产，旨在实现股东价值最大化。Codiak首席执行官Douglas Williams博士表示，董事会和管理团队考虑到"财务需求"及"临床研究项目"匹配度后，决定申请破产保护。 虽然Codiak暂停了前两个管线的临床II期，但从目前取得的I期临床结果来看，验证了工程化外泌体递送所起到的作用，在安全性、靶向性、多重搭载上均实现了突破。Codiak本将重点推进exoASO™-STAT6治疗晚期肝细胞癌等临床急需适应证，并改进为“静脉注射”给药，但由于财务问题而寻求出售研发管线。 综上，我们认为，工程化外泌体作为递送系统的安全性是可控的，但是选择装载的活性分子和靶点关乎到整个药物开发的成败。在工程化外泌体产业的发展初期，建议创业公司可以利用工程化外泌体搭载一些成药性高或者已经成药的活性分子，以“创新”结合“守正”的思路降低整个药物研发的风险。 Vol.6 产业市场规模分析  据Grand View Research 2018年的研究报告指出，仅作为药物递送系统，外泌体药物市场规模预计在2030年将达22.8亿美元，目前全球包括罗氏、武田、礼来在内的多家巨头均在积极布局外泌体这一赛道。 商业调查机构Roots Analysis在2023年3月1日发布的《 2022-2040 年外泌体疗法市场报告》称，在新型平台和先进技术发展的推动下，以及相关企业在外泌体疗法研发方面的不懈努力，外泌体治疗市场预计将以41%的年增长率增长。由于未来几年许多外泌体治疗候选药物获得批准，预计数十亿美元的市场。 Vol.7 外泌体代表公司分析  2022年，维渡纵横对外泌体领域公司做了盘点，详见《2022年外泌体行业研究报告》(点击相关阅读：2022年外泌体行业研究报告)。本文将主要对几个具有代表性的重点公司作简要阐述。 7.1  ExoCoBio ExoCoBio成立于2017年1月，总部位于韩国首尔，开发基于干细胞来源外泌体的药妆。公司的融资总额已经达到了约5630万美元，资金来自于韩国的顶级投资者，包括Seven Tree Equity Partners、CSQUARED Global Asset Management、TS Investment Partners、K2 Investment、Intervest、KDB Capital、Atinum Investment、GU Equity Partners、QUANTUM Ventures Korea、Platinum technology Investment等。 ExoCoBio产品包括了ASCE+™、EXOMAGE™和CELLTWEET™，用于皮肤护理、调节皮肤免疫功能、头皮护理。ASCE+是ExoCoBio专利外泌体再生技术，通过5种生长因子、6种肽、19种氨基酸、4种不同类型的辅酶、维生素和矿物质、谷胱甘肽和多种其他活性成分，可实现营养供给和更强大的皮肤再生效果，更高能深度修复，修复创面，净疤除横，改善痤疮。 图47. ASCE+™产品 2021年6月ExoCoBio与LG化学签订用于抗衰老产品解决方案韩国国内共同销售的业务合作保证协议。 7.2  Direct Biologics Direct Biologics是一家拥有开创性细胞外囊泡 (EV) 平台技术的再生生物技术公司，总部位于美国德克萨斯州奥斯汀。在研产品包括ExoFlo和XoFlo两个系列。ExoFlo是利用间充质干细胞(MSC)分泌的外泌体起到组织再生和修复作用。Direct Biologics 是迄今为止第一家也是唯一一家获得FDA III期临床批准的的外泌体公司，批准产品为ExoFlo™，是一种从人类骨髓间充质干细胞中分离出来的细胞外信号产物，含有生长因子和外泌体。研究表明，BM-MSC来源的细胞外囊泡可以下调人类炎症并上调组织修复。 ExoFlo™ 正用于治疗与COVID-19相关的急性呼吸窘迫综合征(ARDS)，2022年4 月21日FDA批准该公司使用ExoFlo进行其III期临床试验。 2022年10月13日，上市的特殊目的收购公司 Good Works II Acquisition Corp. (Nasdaq: GWII)  和Direct Biologics宣布签署协议，在满足所有成交条件后，Direct Biologics 将成为一家上市公司。预计将于2023年上半年交易完成，合并后的公司命名为Direct Biologics, Inc.，将在纳斯达克资本市场交易。 图48. Direct Biologics研发管线 7.3  天津外泌体科技 天津外泌体科技孵化自九州通集团天九再生医学，2021年重组成立，以外泌体技术为核心，布局严肃医疗和消费医疗业务方向。 公司已构建四大外泌体技术平台：1）外泌体规模化制备平台，实现牛奶/293细胞/间充质干细胞外泌体规模化制备，单次处理500L以上规模，可大规模、高纯度制备外泌体，突破外泌体工业化应用的第一道瓶颈。2）首创外泌体表面修饰装载平台，特有的BioBIND®技术可将广泛的功能性物质外源装载到外泌体表面，并保证外泌体与活性物质的生物学活性。通过模块化装载，突破ADC药物载药量低、安全风险高的瓶颈。3）优化设计的TAD自组装基因药物装载技术平台，优化基因药物装载系统，用于各种基因药物、mRNA疫苗开发，具有免疫原性低、装载基因片段大、靶向效应突出、可口服给药等优势。4）脂质嵌合装载平台，实现核酸、多肽等生物大分子和小分子的口服递送。 严肃医疗方面，天津外泌体科技开发了“牛奶外泌体原料”，产品经多级超深层过滤层析技术制备，纯度达到99%以上；其平台技术可提供纳米递送系统药物装载CRO与CDMO服务，联合开发基于外泌体的创新药或二类新药，可装载抗体、多肽、小分子、核酸等活性物质。 消费医疗方面，牛奶外泌体原料正式准予纳入国际化妆品原料(INCI)目录，商品名称“ Milk Exosomes ”，INCI编号“35079”，并接续开发了“然”系列外泌体-多肽复合原料。公司同时自主开发用于医美护肤的医疗器械级液体敷料和妆字号功能性护肤品，旗下Y³-EXOSOMES LIQUID BANDAGE获欧盟CE认证，可在欧盟27个成员国及其他认可欧盟CE认证的国家进行销售。 图49. Y3系列美容产品(CE认证) 7.4  思珞赛 思珞赛成立于2019年，专注于新型纳米药物，尤其是外泌体相关创新药物的研发和应用，并致力于外泌体本身及其作为药物递送载体的创新技术开发和临床应用转化。此外，基于专业和完善的TAXY™外泌体研究平台，公司同时对外提供相关领域的科研CRO服务和CDMO服务。 2022年7月，思珞赛完成逾千万美元的Pre-A轮融资，由诺辉创投领投。 思珞赛对外泌体载药技术进行了全方位的创新性研发，独立开发了程序化药物递送系统TAXYTM。建立了拥有自主知识产权的外泌体生产细胞系ExoBoost，该细胞系与现有细胞系（如293T，Expi293F）相比，能将外泌体产量提升20倍。此外，公司开发了外泌体药物装载系统ExoPack，能将蛋白或核酸药物高效地、选择性地装载到外泌体的内部或者表面。根据外泌体进入细胞的不同机制，根据受体配体作用的不同，开发出了不同组织靶向性的外泌体ExoTarget，可以靶向脑部、肺部、肌肉等。 思珞赛拥有近1千平米GMP生产和质控区，在质粒构建、菌种库建立和检定、细胞库建立和检定、工艺开发和优化、QC检测及放行、细胞培养及外泌体纯化领域积累了丰富的开发和生产经验。依托自有的外泌体药物研发平台、生产技术优势、完备的多功能GMP车间和GMP生产体系，公司现已具备制备从实验室级别（<2L）放大到工业级别（200L）样本量的能力。 7.5  Exosome Diagnostics Exosome Diagnostics于2018年6月25日被Bio-Techne以2.5亿美元现金和3.25亿美元的里程碑款项收购。 Exosome Diagnostics专注于研发基于生物流体的诊断技术，可利用血液、尿液、脑脊液等外泌体回收RNA、DNA，对疾病的特定基因特征进行分析。公司已开发出ExoDx Lung(ALK)肺癌诊断试剂盒和ExoDx Prostate(IntelliScore)(前列腺癌)血液/尿液检测试剂盒，患者只要提供一份血液或尿液样本，就能从获取的外泌体中分析内含RNA、蛋白质等成分，从而对癌症进行精准诊断。公司能够开发各种病理学中的新型高灵敏度诊断方法，包括前列腺癌、膀胱癌、肾癌、乳腺癌、胶质母细胞瘤等多种疾病，以及目前尚无诊断解决方案的癌症。 7.6  汇芯生物 汇芯生物成立于2017年，主要致力于探索外泌体在疾病早期诊断和治疗方面的应用，特别是将外泌体与液体活检技术相结合来实现癌症的早期筛查。2021年至今相继完成天使轮、Pre-A轮、Pre-A+轮超亿元融资，投资方包括中南创投、苇渡资本、凯风创投、绿河投资。 汇芯生物推出了全球首台用于外泌体分离纯化的非标记自动提纯系统—EXODUS®。纯化原理为负压振荡系统(NPO)结合双耦合谐波振荡系统(HO)作用于纳米超滤芯片; 样本中的游离核酸与蛋白等杂质通过纳米孔快速去除并截留外泌体，从而纯化富集外泌体。技术特点如下：该系统的应用特点为：适用于多种生物样本，外泌体回收率≥90%；适用的样本体积范围宽，杂蛋白去除率≥99%；完整度高，保留生物活性，能够用于细胞外囊泡亚型的分离。主要用于基因组学和蛋白质组学分析、生物分子的载药研究、体外和体内的功能性分析。基于先进的外泌体纯化技术平台，汇芯生物在泌尿系统肿瘤诊断试剂盒开发、规模化干细胞外泌体制备等领域也取得了积极进展。除此之外，汇芯生物还对外提供外泌体分离与提纯、表征与鉴定及外泌体分析服务。 7.7  Codiak Codiak成立于2015年，是由风险投资机构ARCH Venture Partner与Flagship Pioneering共同推动成立的生物科技公司，2020 年 10 月 14 日在 NASAQ 股票市场上市，股票代码为“CDAK”。Codiak Biosciences 在其 A、B 和 C 轮融资以及 IPO 后的三轮融资中筹集了 2.574 亿美元，受“资本寒冬”和“暂停两个临床II期试验管线”影响，当前市值仅剩余1805万美元（原因见5.2.7）。 Codiak致力于工程化外泌体，用外泌体来介导药物递送以及精准治疗，拥有核心专利平台engEx™，可以生产出工业级别和规模的外泌体。Codiak 发现了天然存在的外泌体蛋白——PTGFRN 和 BASP1，作为支架将靶向配体和活性分子引导至外泌体的表面或内腔。在研管线7条，exoIL-12、exoSTING、exoASO-STAT6处于临床I/II期，但exoIL-12、exoSTING项目已暂停，其余产品处于临床前研究阶段。 图50. Codiak研发管线 7.8  Evox Evox Therapeutics创立于2016年4月，分别于2016年、2018年和2021年进行三轮融资，总融资 1.692 亿美元，聚焦基于外泌体递送载药的罕见病治疗。 Evox开发的DeliverEX™外泌体递送技术平台可设计修饰外泌体，并将蛋白质、RNA药物以及小分子药物加载到被修饰的外泌体中，使其靶向目标组织，尤其是向大脑和中枢神经系统的递送。Evox同时具有其独有的专利支架蛋白TSPAN2，相比Codiak的PTGFRN支架蛋白，在载药量和外泌体特异性方面具备优势。 利用DeliverEXTM平台，Evox正在开发内部和合作伙伴的外泌体治疗品管线，用于治疗危及生命的罕见疾病（溶酶体贮积症、苯丙酮尿症、瓜氨酸血症I型等）。Evox与武田制药合作开发外泌体载体的蛋白替代疗法，用于治疗LSD及另一项罕见疾病；与礼来制药合作开发RNAi和ASO药物，用于治疗神经系统疾病。 图51. Evox研发管线 7.9  EVerZom EVerZom 成立于2019年9月，是一家总部位于法国的初创公司，开发符合GMP标准的细胞外囊泡生产平台。作为外泌体领域的CDMO公司，EVerZom旨在通过突破性的专利生产技术，克服外泌体规模化生产的难题。EVerZom的专利创新在于对细胞应用激流刺激来触发大量的外泌体释放，通过改造一个生物反应器来诱导“ turbulence stimulation”，使外泌体的生产速度比传统方法快10倍。 EVerZom为客户提供外泌体制造、表征、分离、工程化服务。同时提供脂肪来源的间充质干细胞外泌体和来自鼠干细胞的外泌体标准品。 图52. EVerZom已服务客户 7.10  Exopharm Exopharm 是一家澳大利亚CRO公司，致力于开发外泌体治疗产品并将其商业化，先后推出产品Plexaris™和Exomeres™。Exopharm可提供从成体干细胞及其他细胞分离纯化外泌体的技术，并克服了现有外泌体纯化工艺的不足。Exopharm与全球20大制药公司Astellas子公司AIRM达成合作服务协议。 Exopharm拥有两项独家专有技术，可实现外泌体的高级定制——LOAD 技术可改善核酸药物加载到外泌体中，而 EVPS 技术可使外泌体定向于选定的细胞类型。LEAP则为外泌体纯化技术平台，解决大规模、低成本临床级外泌体的挑战。这些工程化 EV (EEV) 被设计为适用于遗传疾病、神经变性、病毒感染和癌症等适应症领域的精准药物。 7.11  唯思尔康 唯思尔康成立于2021年7月，作为国内外泌体领域的后起新秀，唯思尔康刚成立即获得亿元天使轮融资资金，由元生创投、联想之星、北极光创投、博远资本、苏州科创基金、苏州中新园创等多家知名投资机构联合参与。目前，唯思尔康已建设完成基础研发中心2000平米，完成外泌体平台的搭建，为外泌体新药研发奠定基础。 modEXO工程外泌体载药平台，是在对外泌体技术深入挖掘理解的基础上，依靠外泌体低免疫原性、多功能、高负载的特点，突出动态模块化设计，以促进组织细胞特异性药物递送、优化医疗窗口、缓释组织药理学、精确的剂量控制、个体定制诊疗方案，实现精确靶向的临床需求。基于该平台已开发多个管线，管线第一梯队是肿瘤免疫方向，第二梯队是免疫方向。 图53. 唯思尔康研发管线 7.12  恩泽康泰 北京恩泽康泰生物科技有限公司成立于2017年6月，该公司是国内首家致力于外泌体技术开发与临床转化的创新型高科技企业，旗下业务板块主要分为：其一，是基于外泌体的创新药研发，主要涵盖肿瘤免疫、罕见病及神经系统疾病等领域；其二，以外泌体为基础的转化医学研究服务，主要与临床专家合作展开科学研究，目前业务已经覆盖全国主要重点城市，已经与国内50多家知名三甲医院和科研单位以及多家精准医学企业建立合作。 恩泽康泰建立了高效的外泌体工程化改造平台，布局了核心平台性IP，并具备成熟的规模化外泌体量产及高纯度分离能力。通过工程化改造的方式对外泌体进行改性，大幅提高了外泌体携带特定有效成分的载量，并实现特定器官的选择性递送。目前，基于自主研发的外泌体技术，恩泽康泰围绕罕见病治疗、肿瘤免疫两个领域展开了管线布局。在罕见病方面，利用基于外泌体的蛋白替代疗法，为缺失特定胞内蛋白的患者（如溶酶体贮积病）补充所需的蛋白，从而起到治疗的效果；在肿瘤免疫方面，利用外泌体激活免疫细胞自身的免疫信号，并配合PD-1/L1单抗药物的使用，恢复机体正常的抗肿瘤免疫反应。 2019年3月，恩泽康泰宣布完成数千万元Pre-A轮融资，由金芒投资领投，澜峰资本、恩然创投跟投。2021年7月，该公司宣布完成近亿元的A轮融资，由隆门资本领投，泰煜投资、火山石投资跟投。2022年，公司宣布完成数千万元A+轮战略融资，由百度风投领投，老股东泰煜投资、火山石资本继续追加投资。2023年3月完成数千万元A++轮融资，本轮融资由中博聚力、延瑞投资共同参与，老股东百度风投继续加持。 END 免责声明：本文仅作知识交流与分享及科普目的，不涉及商业宣传，不作为相关医疗指导或用药建议。文章如有侵权请联系删除。 TIS2024第四届免疫细胞疗法与干细胞疗法论坛重磅来袭，合作详询：王晨 180 1628 8769

摘要：大型分子抗体生物制剂因其卓越的目标特异性、药代动力学和药效学特性、安全性和毒性概况以及多样化工程的适应性，已经彻底改变了医学领域。在这篇综述中，我们重点关注临床前抗体的可开发性，包括其定义、范围以及从候选物到领先优化和选择的关键活动。这包括生成、计算和模拟方法、分子工程、生产、分析和生物物理特性、稳定性和强制降解研究以及流程和配方评估。最近，显然这些活动不仅影响领先选择和可制造性，而且最终与临床进展和成功相关。作为可开发性成功的蓝图，我们探索了新兴的可开发性工作流程和策略，包括对影响所有可开发性结果的四大分子属性的概述：1）构象，2）化学，3）胶体，和4）其他相互作用。我们还检查了风险评估和缓解策略，这些策略增加了将正确候选物带入临床的可能性。 1.引言 生物制剂的发现和开发，特别是抗体和工程化抗体模式，在过去几十年中得到了扩展，目前全球市场上有100多种抗体生物制剂，大约有1000种研究性分子正在进行临床试验。蛋白质和抗体治疗成功针对的治疗适应症包括免疫肿瘤学、心血管、感染性和自身免疫疾病，以及神经退行性适应症。此外，抗体适合工程化以增强多功能性并产生极其多样化的特性，包括多特异性靶向、增强或降低效应功能、增加半衰期。单克隆抗体可以通过选择技术、筛选和工程化设计来增加目标结合并增强可开发性特性。成功的可开发性对领先优化和选择至关重要，并确保强大的处理、稳定性、传递、给药、药代动力学（PK）/生物利用度、安全性，并且与临床成功率相关。 抗体产生和筛选后，关键的临床前可开发性活动包括分子工程、计算和模拟评估、生产、分析和生物物理特性、稳定性和强制降解研究以及流程和配方评估。我们还讨论了适当的分析方法及其使用时机。在可开发性评估中遇到的常见问题和风险，如聚集、自相互作用、疏水性、去酰胺化和氧化，进行了探讨。几个非可开发性活动对大分子发现和开发至关重要，如功能性生物测定法的开发、生物标记物开发、PK/药效学研究和体内疗效，这些可能影响领先选择。然而，这些活动不是这篇综述的重点。在这里，我们将可开发性属性定义为与分子固有属性相关或受其影响的任何事物，与影响领先选择、开发甚至安全性和有效性的靶标生物学和作用机制的效果区分开来。影响所有可开发性属性和结果的分子属性在此被组织为四大类别：1）构象，2）化学，3）胶体，和4）其他相互作用。这些分子类别或属性的定义以及用于审查它们的分析方法和关键标准的例子。最近显然，这些属性不仅影响化学、制造和控制（CMC）属性和结果，还影响给药后现象。我们还检查了可开发性风险评估和缓解策略，这些策略对每种分子都是独特的，并受到负债的性质和数量以及潜在缓解措施的影响。总体而言，这篇综述侧重于大分子或蛋白质可开发性，特别适用于液体配方的单克隆抗体（mAbs）及其工程版本，这是治疗适应症的首选大分子。 尽管其他模式，如抗体-药物偶联物（ADCs）和/或蛋白质-寡核苷酸偶联物，可能提供额外的治疗益处以及可开发性和开发挑战，但它们不在这篇综述的范围之内。 2.抗体产生 2.1.领先到领先 治疗性抗体的临床前可开发性包括使用结合和/或活性评估对产生的领先分子进行初步筛选。然后，在瞬态真核表达和纯化后，进一步筛选这些分子以进一步评估相关的物理化学特性。图1显示了与分子可开发性相关的主要临床前活动流程图，包括领先或抗体产生。虽然抗体产生本身通常不被视为核心可开发性活动，但它肯定可以影响分子属性的范围，因此影响可开发性结果。在进行可开发性评估时，考虑使用的方法是很重要的，无论是小鼠免疫（随后进行杂交瘤筛选）、噬菌体或酵母展示技术，还是合成库。不同的选择技术可能在抗体属性方面产生不同的结果。例如，噬菌体展示产生可能会增加可开发性问题的可能性，如降低溶解度、增加疏水性和增加非特异性导致半衰期差。这些结果可能源于噬菌体选择的多轮，这是为了产生高亲和力分子，但也可能在互补决定区（CDRs）中积累过多的电荷或疏水性，导致更差的可开发性结果。此外，在噬菌体展示中，非特异性结合并不像在动物免疫方法中那样是一个重要的选择压力，后者中产生的抗体被排除用于自身免疫。为了弥补这种自然选择的缺乏，可以在噬菌体展示筛选过程中手动排除疏水CDRs，或者可以采取额外的选择措施来筛选出未折叠或不稳定的可变域。 图1. 示意图突出了大分子治疗性抗体可开发性的各个发现和早期开发阶段。也列出了后期CMC开发的关键交付物。 同样，酵母展示亲和成熟通常增加了疏水性、聚集率和自相互作用倾向，因为结合像在噬菌体展示中一样被迭代最大化。然而，使用酵母展示的一个主要优点是存在真核蛋白质生产机制，需要维持翻译后修饰。此外，存在选择酵母展示变体增加热稳定性的策略。为了增加候选多样性，可能会进行多次领先产生活动，因为一种方法可能在结合、序列和可开发性配置文件方面产生高冗余。理想情况下，应该产生具有多样化结合亲和力和抗原表位的抗体，以最大限度地增加获得具有理想功效、安全性和作用机制的区分抗体的可能性。此外，从这样一个多样化的抗体池中，可以选择和/或进一步优化具有有利可开发性配置文件的抗体。抗体候选物种交叉反应性也是一个重要考虑因素，可能需要单独产生活动以生产动物研究的物种特异性替代品，特别是啮齿动物。 通过小鼠或大鼠免疫产生的抗体通常需要前期的工程化和人源化处理，这将大大增加初始候选物的筛选和特性分析的数量。总体而言，抗体的人源化提出了挑战，例如需要额外的耗时的体外筛选变体和增加的免疫原性风险。建议在解决主要负债的计算和纠正的同时，针对共识人类种系进行人源化，以避免后期需要纠正的严重负债，从而延误选择工作。主要负债被视为潜在严重的化学或物理化学负债。主要负债因素包括位置，特别是负债是否位于可变框架或更令人担忧的可变CDR区域，以及潜在的严重程度，其中流程和配方措施不太可能可接受地减轻风险，给药后的降解将显著，和/或对活性和/或功能有显著影响。应该最初排除或在计算中纠正有问题的主要序列基序，特别是那些含有游离半胱氨酸、共识天冬酰胺糖基化位点（Asn或N后跟XS/T）除保守的N297糖基化外，以及NG去酰胺化基序。 如果潜在修饰的位置在可变CDR区域并且可能影响目标结合或活性，这一点尤其正确。尽管评估人源化变体和化学负债纠正变体进一步扩大了初始筛选工作，但稍后可能会揭示具有减少免疫原性和较少负债的更可开发的候选物。如果需要多特异性格式化，则早期候选物的数量进一步增加，通常首先筛选单价、双价抗体，然后进行多特异性格式化和定制的几轮。所需的或可用的格式，例如抗原结合片段（Fab）、单链可变片段（scFv）或来自羊驼免疫的可变重链抗体片段（VHH），也是一个重要的考虑因素。除此之外，还有许多其他多特异性格式。这样大量的抗体模式工具箱，除了它们如何不对称地排列成多特异性，确实可以创建大量的构造来评估。在实践中，可开发性筛选漏斗可以从领先优化和选择中扩大和收缩，如图2所示。为了减少需要筛选的抗体变体的总数，免疫转基因、人源化动物，如Trianni小鼠，可以产生完全人类抗体并绕过体外人源化的需要。然而，需要在这一代技术中进行大量投资，并且完全人类mAbs也可以通过其他技术产生，如噬菌体展示和单一人类B细胞克隆。根据所需的效应功能和作用机制，还可以评估各种同种型，通常是IgG1或IgG4，或调节其效应功能的变体。 图2. 展示了一个假想的抗体发现和可开发性活动的各个发现阶段的示意图。最终，可能数百或数千个候选物被筛选成相对较少的、有利的候选物。然而，在这个过程中，随着从之前选择的候选物中以迭代方式创建额外的变体、结构、负债纠正或多特异性框架，选择漏斗可以扩大和缩小。在左侧（黑色字体）是可开发性活动，如筛选、工程和选择，这些活动可能会增加来自优选子集的候选物数量，如在创建人源化或校正变体时的情况。在右侧（绿色字体）是采用的可开发性分析和评估，这些评估被分为不同的层级。在这个例子中，最初的命中通过有限的分析筛选出更有利的子集，包括高通量结合/活性、纯度、Tm/Tagg和计算评估（Tier 1测定）。为了筛选出较少的候选物，应该采用扩展特性测定，包括cIEF、HIC、DSC和自相互作用（根据通量需求和材料可用性，通过kDiff和/或AC-SINS），一个短期的、单时间点的加速稳定性保持以评估完整性，如果可用的话进行颗粒分析，以及非特异性测定（Tier 2测定）。随后，最终采用完整的可开发性评估，包括强制降解、完整的纯化过程和配方稳定性评估（Tier 3）。应当注意，当从之前的候选物创建变体（如人源化、格式化或校正）时，或者甚至测试新的批次时，应该重复前一阶段的分析或层级，以便为任何潜在的领先候选物获得完整的特性集（层级1-3）。对于每个阶段，建议的蛋白质材料量可能因样品准备和分析样品需求而异。 3.领先优化和选择 3.1.候选筛选 无论产生方法和领先数量如何，分子首先需要在亲和捕获后可接受地表达并具有可接受的纯度特性。筛选分子的基本工作流程通常从杂交瘤表达开始，然后是蛋白A（ProA）捕获，主要评估结合特性以及对不到一毫克（mg）材料的有限纯度和分析测试。更可行的候选物，可能在数十到数百的规模上，然后可以转移到瞬态中国仓鼠卵巢（CHO）表达以生产mg数量，然后通过ProA捕获并筛选高通量“Tier 1”测定（图2）。这些包括尺寸排除高效或超高效液相色谱（SE-HPLC/UPLC）、毛细管十二烷基硫酸钠电泳（cSDS）、表面等离子共振（SPR）的结合/活性，以及温度依赖的熔化和聚集（Tm/Tagg）评估。虽然表达和纯化通常可以在CMC开发后期进行优化，但瞬态表达和纯化材料的初始纯度和异质性问题可以表明不稳定或折叠不良的分子。对瞬态领先进行初始纯度和异质性评估至关重要，以早期发现潜在问题，例如在表达和/或亲和纯化期间发生的聚集和剪切倾向。SE-HPLC或UPLC建议用于初始评估聚集，这是CMC释放和稳定性质量属性，可能会导致给药后的免疫原性或降低效力。与分析SEC（或SEC-MALS）偶联的在线静态（多角度）光散射可以进一步表征或确认蛋白质聚集体的性质。虽然这是在未受压力的分子上进行的，但它们可能在亲和捕获前的培养上清或低pH ProA洗脱步骤中容易聚集。可以通过变性还原cSDS直接评估抗体主链剪切，并通过非还原cSDS直接解离域，这些是CMC关键纯度和质量属性。剪切可能是酸性或碱性催化或酶性质的，而抗体域解离通常源于未形成或断裂的域间二硫键。此外，剪切产物的存在可能会导致下游聚集和颗粒形成，这不仅影响药物产品属性，而且可能影响安全性和效力。cSDS阐明的其他常见表达杂质是表达期间形成的重链二聚体或由于轻链（LC）的降解性丢失。cSDS也可以阐明并量化多特异性表达中的同源二聚体和不匹配杂质。为了进一步完善候选物，建议还筛选温度依赖的解链（Tm），这通常伴随着补充的温度依赖的聚集（Tagg）。虽然在较低的过程和储存相关温度下的聚集倾向可能或可能不会反映在更高温度下，动力学驱动的解链中，但可能存在相关性，并且有选择候选物的提议指南。这是因为溶液中的聚集是一个复杂的现象，不仅仅通过动力学Tm测量来预测。应对这些最初表达的领先或首选子集进行体外结合SPR或基于细胞的测定，以验证结合或活性特性，并应假设各种杂质属性，如聚集和剪切，可能会影响结合或活性。一旦选择了理想的候选物，应在启动一系列工程和格式化、下游表达、纯化、扩展特性以及配方和稳定性研究之前，通过完整质量谱（MS）确认其身份。3.2.额外或扩展特性 在选择最终候选物之前，需要进行额外的特性分析，以最大化选择具有理想质量和可开发性特性的良好候选物的可能性。在整个过程中，将非可开发性工作，如体外功能测定和/或动物模型研究，纳入考虑也是至关重要的。重要的是要在功能属性和可开发性属性之间取得平衡，因为改变一个属性，如亲和力，可能会影响另一个属性，如稳定性，反之亦然。通常，各种领先分子及其变体在目标结合亲和力和表位方面可能相似，以及它们在功能测定中的输出。这对于具有相似序列的人源化变体和多特异性构造尤其如此，其中共享类似的结合臂，但构造可能在链长度、方向或格式（如Fab与scFv）上有所不同。在这些情况下，额外的可开发性特性提供了一个极好的机会，根据它们的物理化学属性进一步区分这些分子。这可以在几个到几十个领先上完成，这取决于生成活动以及是否需要人源化、负债纠正和/或多特异性格式化。表1提供了扩展特性可开发性测定、它们测量的属性及其理由的全面总结。此外，这些测定也显示在图2所示的假设可开发性工作流程图中，作为“Tier 2”测定，包括温度依赖的解链（Tm），最好通过热量测定，等电点（pI）和电荷异质性，疏水性，自相互作用，亚可见颗粒评估，以及多特异性或非特异性相互作用。还包括了一个短期稳定性保持以评估完整性作为Tier 2活动。 3.3.温度依赖性解链 为了进一步评估构象稳定性，差示扫描量热法（DSC）可以作为黄金标准来准确测量熔化温度（Tm）的起始点和转变。一个足够高的Tm可能表明在较低温度下具有良好的或可接受的构象稳定性。理想情况下，抗体治疗的Tm起始点应大于50°C，远高于标准的加速储存温度40°C以及生理温度。因此，可以预期感兴趣的分子在生理条件下在构象上是完整的，并且在没有过度的温度依赖性解链的干扰下经受加速压力。如前所述，Tm也可能与在过程条件下的聚集倾向、甚至颗粒形成倾向相关，在配方稳定性上，或者在经受各种强制降解条件时。然而，情况并非必然如此，因此当试图区分候选物时，应将其他属性与Tm一起权衡。 3.4.等电点 通过毛细管等电聚焦（cIEF）对电荷异质性的表征至关重要，以验证pI是否可接受，并将适应平台纯化和配方工作。抗体通常具有基本的pI，这导致在酸性配方中由于分子间固有的电荷排斥而具有有利的胶体稳定性。然而，pI过低的抗体可能难以从电荷相似的宿主细胞蛋白（HCPs）中纯化出来，并且在低pH值的代表性配方中配方，这种pH值平衡了构象、胶体和化学稳定性，通常商业mAbs的pH值约为6。此外，电荷异质性的差异与新生儿受体（FcRn）依赖的PK半衰期和效力的差异有关。过高的pI与不良的非FcRn依赖的PK和生物利用度结果有关，并且通过选择性工程化可变框架或CDR区域进一步降低pI在某些情况下改善了半衰期。同样，过度的可变域电荷与小鼠、猕猴和人类中的快速清除有关。由于配方中高pI抗体通常表现出优异的胶体属性，同时通过电荷介导的非特异性结合和清除呈现PK风险，因此在提名领先候选物时应平衡胶体属性与组织分布和PK风险，并避免可能挑战纯化和配方活动的低pI。因此，抗体基治疗的pI范围在7-9之间是适当的。 3.5.疏水性和自相互作用 疏水相互作用色谱（HIC）是评估领先分子疏水性和异质性的常用方法。高度疏水的分子可能有增加的聚集倾向，与其它表面或分子非特异性相互作用，或自相互作用。特别是，抗体可变域CDRs中的疏水斑块可能表现为负面的可开发性结果。作为额外特性的一部分，应评估分子的自相互作用，或胶体稳定性。自相互作用可能导致高粘度，特别是对于双价抗体，这会损害诸如泵送、灌装和过滤等过程步骤以及注射性，特别是皮下注射剂的注射性。评估小规模或中等规模（1-2毫克）的自相互作用的典型方法涉及使用动态光散射（DLS）测量流体动力学半径（Rh）和扩散相互作用参数（kDiff）。与DLS一样，静态光散射（SLS）方法可用于获得第二维系数（B22），这是自相互作用倾向的另一个指标。测量zeta电位或总表面电荷也是表征潜在自相互作用的一个选项。在非常小的微克（µg）规模上，使用亲和捕获自相互作用纳米粒子光谱（AC-SINS），一种基于抗体偶联的金纳米粒子的测定，通过UV吸收移位揭示自相互作用，已经成功进行了高通量的自相互作用评估。也有报道其他基于纳米粒子的测定可以预测粘度。随着材料可用性的增加，可以在更高浓度（100毫克/毫升或更高）下直接评估（动态）粘度，以确定自相互作用是否显著。 3.6.完整性和针对性强制降解 分子如何在过程和储存期间保持完整性可以在早期筛选期间通过进行短期加速稳定性保持的小规模努力来评估，这通常涉及有限数量的材料，通过在代表性配方中将样品在40-50°C下保持一周。应使用分析SEC和cSDS来评估基本完整性特性，如聚集和剪切。此外，如果在计算中预测显示可能潜在热点的主要化学负债，它们可以通过有针对性的强制降解来评估，然后再进行正式的稳定性和强制降解评估。例如，如果CDRs的主要序列评估揭示了N-去酰胺化基序，如NS，分子可以在更全面评估之前经受高pH压力，这将需要更多的时间、材料和单独的规模扩大表达。表2中列出了许多其他可以通过计算序列或同源模型评估的化学负债。 3.7.颗粒 可见和亚可见（蛋白质）颗粒分析也是CMC开发中的关键工作，并且与聚集一样，是生物制剂的关键质量属性（CQA），可能导致不必要的免疫原性。因此，在领先选择之前对未受压力和受压力样品上的颗粒形成进行评估是有价值的。典型的表征和量化亚可见蛋白质颗粒的方法使用光遮挡、流成像和更近期的基于膜的技术。然而，颗粒形成高度依赖于过程和配方，因此在未定义、扩大规模的下游过程、灌装完成和配方活动之前进行评估有局限性。具体而言，在制造过程中遇到的剪切、泵送、混合和摇动压力很难在下游过程开发之前模仿。此外，聚山梨酯（PS）-20或PS-80的添加主要在早期CMC活动中进行评估，并用于防止由于过程和运输相关的机械和搅拌压力而引起的聚集和颗粒形成。从本质上讲，颗粒分析在领先选择和CMC进入之前区分领先候选物可能很有用，但在最终过程和配方变量不明确时，不用于评估绝对颗粒计数。如果无法进行颗粒分析，基于吸光度的简单浑浊度测定可以作为不太敏感的替代品来监测颗粒形成。此外，通过SE-UPLC在热应力样品上早期评估可溶性聚集速率或通过DSC在各种配方中评估解链倾向，可能与某些治疗性抗体的颗粒形成倾向相关。 3.8.多特异性或非特异性 最后，评估分子与过程组分、配方辅料或体内其他生物分子的粘性或相互作用倾向，这可能影响PK和生物利用度，是非常有价值的。分子可能如何非特异性地结合到其他分子可以通过多特异性试剂（PSR）和杆状病毒粒子（BvP）测定和交叉相互作用色谱（CIC）来评估。值得注意的是，临床阶段抗体的有利PSR和BvP属性与临床阶段进展相关。同样，适当地，在毒理学和1期研究之前，在人体血清中对领先分子进行短期完整性或生物基质体外稳定性研究也是适当的。 3.9.额外特性 对未受压力的领先分子进行额外的特性分析也可能是必要的，并且有价值，例如测量可集中性（至150 mg/ml及以上）、在不同配方pH值和浓度下的粘度、在不同配方pH条件下的聚乙二醇（PEG）溶解度，以及在不同配方条件下的DLS相互作用参数。如果临床或商业目标产品档案（TPP）需要高浓度配方以支持高剂量或通过预充注射器进行皮下注射，这一点尤其关键，因为这些额外的活动旨在表征高度浓度依赖的抗体或蛋白质行为。此外，特定多特异性分子（如Duobodies）的游离巯基含量可以通过反相色谱、基于荧光的定量或MS来测量，以确定二硫键在组装期间是否正确形成，或调查由于二硫键断裂可能导致的稳定性问题。 3.10.最终领先选择和CMC进入 为确认用于研究性新药（IND）支持研究的最终领先候选物，该分子应对平台纯化和配方方法有适应性，并且具有可接受的稳定性和强制降解属性。这在图2中强调为“Tier 3”活动。适当评估和缓解重大可开发性问题和负债有助于确保对过程、产品质量、临床供应和多年来临床开发的批次可比性的控制。还应考虑TPP需求和要求，以适应特殊情况，如高浓度配方或替代药物产品展示。 3.11.纯化过程 领先分子应可接受地良好表达，理想情况下应适应基于平台的纯化策略。虽然最终领先可能基于瞬时表达材料被选中，但来自稳定细胞系的材料可能在纯度和产量上表达更高，并且具有更具代表性的核心糖基化谱。经过所有平台纯化步骤（如ProA亲和、低pH灭活、阴离子交换（AEX）流穿和阳离子交换（CEX）结合及洗脱过程）后，最终领先应具有可接受的产量和纯度。在抛光过程中也常使用混合模式离子交换树脂。如果出现需要过程改进的问题，如产量和/或纯度低，这可能影响领先选择或需要重新设计分子。如果采取过程缓解策略，理想情况下，缓解措施简单且易于制造。一个例子是在过程步骤中简单添加稳定剂，如pH调整，以防止聚集或颗粒形成。 3.12.稳定性和强制降解 应在40°C下进行短期加速稳定性研究，通常在溶液中进行长达一个月的更高蛋白质浓度，以及强制降解评估，以确定分子是否具有可接受的可开发性和CMC风险。（加速）稳定性评估是为了确定分子是否具有主要完整性或异质性问题，评估蛋白质浓度依赖的行为，特别是聚集，预测液体配方的长期稳定性，并确定是否需要显著的配方优化或缓解。因为降解机制可能遵循阿累尼乌斯动力学，这项加速研究也可能预测长期的常温储存稳定性和保质期。然而，温度依赖现象，如聚集，可能是复杂的，并不遵循阿累尼乌斯动力学，然而在更高温度下加速这一过程对于在发现阶段节省时间是必要的。理想情况下，对稳定性进行评估的平台配方可以适应毒理学研究和1期剂量要求，可以轻松地向下转换，并使用常见的“通常认为安全”（GRAS）辅料，如组氨酸和蔗糖。蔗糖或类似的糖也应使用，以进一步协助稳定，特别是用于冻干保护和达到等渗性。使用蔗糖的另一个优点是，如果可开发性工作未能在液态中充分稳定分子，它适用于冻干。用于评估这些受压样品的完整性和异质性的分析方法应代表标准的CMC释放和稳定性测定，如SE-HPLC、cSDS和cIEF。此外，应进行肽图MS和结合评估，以确定是否发生特定部位的化学修饰，它们发生在哪里，以及它们对结合和活性的潜在影响。因此，在进行更彻底的配方评估之前，包括在代表性容器封闭中优化pH和辅料（通常是玻璃瓶或预充注射器（直接皮下注射的情况）），通常对潜在问题以及过程和配方工作如何缓解它们有很好的了解。例如，在更高的抗体浓度下，自结合可能导致高粘度，导致过程、稳定性和/或注射性结果差。如果存在自相互作用问题，它们可以通过降低pH的配方工作来缓解，或使用粘度修饰剂，如精氨酸，NaCl，甘氨酸，和最近，咖啡因。 用于评估化学稳定性的常见强制降解条件是低pH、高pH、生理pH和化学和/或光压力。在领先选择之前评估一些配方条件允许可开发性科学家更好地了解配方和pH依赖的行为，如果各种pH在加速、固定温度下进行评估，这也可以从强制降解条件中利用。例如，低pH、代表性配方pH、生理pH和高pH都可以在40°C下评估一周。因此，如果观察到化学负债，如剪切、去酰胺化或异构化，可以从研究结果中了解其pH依赖的行为，进一步表明负债如何影响过程、配方工作和给药后行为。此外，大多数化学负债在pH或反应物浓度方面是伪一级的，因此它们在较低的蛋白质浓度下可以评估它们的倾向。因此，这些强制降解评估揭示了如何通过配方pH或是否需要工程和/或替代分子选择来缓解问题的线索。这种方法的一个例子是评估去酰胺化机制和速率，无论是实验上还是计算上，与配方pH相比。 3.13.修正工程 尽管不理想，但在最终领先候选物上进行全面的可开发性评估，当已经投入了大量的发现时间和资源时，如果出现重大负债，如过高或过低的pI、聚集、去酰胺化或自相互作用等令人担忧的风险，可能需要进行修正工程。在确定化学或物理负债的严重性时，必须考虑其性质、位置和降解速率。此外，其对pH值、温度和抗体浓度的依赖性很重要，其对目标结合以及免疫原性或不良药代动力学等其他属性的影响至关重要。虽然负债的性质和数量在整体可开发性风险中占有重要地位，但潜在缓解措施的数量和性质也很重要。一个常见的例子是聚集，它可以通过工程纠正，但通常通过纯化去除、调节配方pH值或使用精氨酸或蔗糖等稳定剂来改善。表2中总结了主要负债、它们的常见发生方式和潜在缓解策略。 一个可能需要分子工程的常见负债是天冬酰胺去酰胺化，因为它通常是伪一级碱催化的，并且在更高的pH值下加速，包括生理pH值。常见的热点基序通过主要N、N+1序列签名（如NG、NS、NT和NN）来阐明。这些主要序列基序的存在使去酰胺化成为可能，而去酰胺化的潜力进一步因位于表面暴露区域（如CDRs）和主链灵活性和构象而增强。由于去酰胺化在更高的pH值和温度下加速，它通常不是低pH值、低温液体配方中的储存问题。然而，如果发生去酰胺化，它在生理细胞培养条件和生理pH值及温度下的给药后是不可避免的，它将在高温下持续数周。此外，去酰胺化在蛋白质中非常普遍，并且是更强大的化学降解机制之一。因此，如果可变区域（如重链（HC）-CDR3）存在热点去酰胺化位点，应进行修正，这反过来可能影响异质性、活性和功能。有实例表明，当在生理pH值和温度下观察到5-10%的去酰胺化率时，治疗分子已被选择进行修正。较低水平可以在进入开发时进行监测，但可能可以继续进行，无需修正，因为总体水平不太可能达到显著百分比。如果去酰胺化影响结合或活性，关键关键属性，修正的需求就会增加，因为这也会增加关键性。天冬酰胺去酰胺化位点也可以突变为天冬氨酸，去酰胺化产物之一，并评估目标结合以确定其影响。此外，可以将通过肽MS确定的mAb可变位点去酰胺化率与保守的Fc去酰胺化位点（即NGQPENNYK）进行比较，以确定热点去酰胺化的准确性和相对严重程度。 像去酰胺化一样，另一个常见负债是甲硫氨酸/色氨酸（Met/Trp）氧化，这可以通过强制氧化研究有效评估。轻度氧化可以氧化敏感的Met和Trp残基，而常用的化学氧化剂叔丁基过氧化氢和偶氮双（2-脒基丙烷）二盐酸盐分别倾向于特异性地氧化Met和Trp残基。如果氧化被证明相当广泛，可以尝试进行修正工程，但通常暴露的CDR Trp残基更难以纠正并保持生物活性。与去酰胺化不同，氧化风险可以通过使用抗氧化剂如乙二胺四乙酸的配方工作更容易地缓解，这些抗氧化剂与从过程或药物容器组分中浸出的金属氧化剂螯合，并且甲硫氨酸作为竞争性过氧化氢清除剂。此外，可以使用琥珀色或防紫外线玻璃瓶进一步保护液体药品免受光氧化。虽然Met/Trp氧化是CQA，需要适当的缓解，必要时应尝试进行修正，但市场上有成功的商业产品在批准的配方中没有抗氧化剂的情况下，具有反应性CDR Met氧化。 4.早期CMC开发 4.1.配方开发 在对提名的领先候选物在分子属性和潜在重大负债方面有了很好的了解之后，应进行更全面的配方开发评估。这通常发生在IND申请提交之前以及制造和灌装完成工作的发现和早期CMC界面。配方开发活动包括优化配方pH值、聚山道/表面活性剂类型和浓度，并在相关产品展示中评估诸如搅拌和冷冻/解冻等不同压力。此外，可以确认以前的可开发性工作，特别是稳定性和强制降解评估。 在考虑配方优化方法时，阐明pH依赖行为的以前的强制降解评估也可以帮助确定是否通过改变配方来减少一个负债可能会加剧另一个不需要的负债，如聚集或剪切。例如，降低配方pH值以增加胶体稳定性和减少自结合也可能促进聚集、剪切或天冬氨酸（D）异构化。同样，提高pH值可能会促进额外的负债，如N-去酰胺化。在图3中，这个概念针对各种潜在负债与pH值进行了图解。重要的抗体属性，如构象和胶体稳定性，以及聚集、剪切和去酰胺化等负债，显示为对溶液pH值的增加倾向或风险。然而，应当注意，这些现象仍然是抗体依赖的，某些负债可能根本不显著或根本不存在，特别是在可变域中。因此，最终配方应旨在平衡所讨论分子的各种分子属性和负债的稳定化。 图3. 示意图显示了潜在负债及其发生的倾向与溶液pH值的关系。箭头指示每个属性倾向增加的方向。 如果可开发性风险太大或即使在优化的液体配方中也可能无法管理，可以使用冻干法来稳定药物产品形式中的分子，但随后需要额外的加工和给药/重建期间的步骤。如果长期储存稳定性是一个问题，可以考虑在早期开发中使用冷冻液体小瓶，待3期过程和配方锁定后进行额外的配方改进或优化。然而，额外的冻融周期可能会导致不需要的并发症，如分子变性和容器封闭完整性问题。 4.2.分析开发 总的来说，冷藏液体配方是临床开发中最直接和多功能的呈现形式。支持这一点的因素有：1）只需要评估一种呈现形式，2）不需要额外的冻干或冷冻过程，3）在给药期间不需要重新组合或解冻，4）液体形式很容易适应瓶装和预充注射器容器封闭系统。然而，治疗性抗体可能容易在液体状态下在过程、储存和体内降解。因此，在领先选择之前，至关重要的是要理解治疗性抗体在溶液中的物理化学行为，以及在模拟过程、配方和类似生理条件下的不同条件下的行为。 分析方法开发和CMC释放和稳定性分析的确认，以评估关键质量属性（CQAs），是在最终领先选择后的另一个关键交付领域。通常，发现阶段使用的分析方法可以利用到早期CMC评估和确认，因为它们通常是平台驱动的。例子包括尺寸排除高效液相色谱（SE-HPLC）和毛细管十二烷基硫酸钠电泳（cSDS），可能需要一些修改或优化，但可以利用常见的分离柱、流动相、样品准备程序和毛细管。在CMC开发的后期，对杂质识别和方法验证有了更多的了解。然而，由于在CMC开发之前选择了领先，就如何检测和量化杂质和/或异质性的分析方法做出了假设。幸运的是，用于评估CQAs的分析方法可以充分检测和量化聚集、剪切、pI和电荷异质性，通常不需要广泛的优化或定制。此外，全面的发现阶段可开发性评估应评估其他分子属性，如Tm、疏水性和自相互作用，以便更好地了解治疗分子的分子属性，从而使下游开发风险更加明确。 4.3.过程开发 对于大分子生物制剂的另一个关键交付物是稳定的细胞系开发（CLD）。这可以跟在彻底表征和瞬时表达的候选物的最终领先选择之后进行，其中稳定的CLD旨在优化滴度表达，同时保持理想的纯度属性，不引入新的负债。通过这样做，开发和选择单一克隆，通常源自CHO-K1或CHO-S，优化细胞生长和活性，以产生高质量和滴度的抗体产品。CLD活动可以在风险上的多个领先候选物上提前开始，以缩短最终领先选择阶段的时间表，特别是在稳定池的细胞系生成阶段，特定基因转座酶靶向的进步可能进一步加速稳定克隆的选择。在CLD稳定克隆选择过程的后期，应专注于最终领先候选物。评估多个领先候选物用于稳定CLD生产的这种方法对于多特异性抗体特别有利，其中亚单位化学计量和正确组装可以在瞬时表达努力之外进行优化。虽然瞬时表达多特异性变体然后纯度表征可能选择具有改进组装和减少常见杂质形成的变体，如同源二聚体或半分子形成，但稳定的CLD可能在这方面进行改进或完全依赖于以合理的滴度和纯度组装所需产品，以促进下游处理工作。例如，Wang及其同事通过稳定细胞系的生成和选择最佳克隆，展示了改进的双特异性表达和减少的同源二聚体杂质。这样的高质量表达减少了下游纯化和灌装/完成活动的负担和风险，以生产可接受的产量和纯度的产品。此外，核心Fc N-糖基化异质性通常由细胞系表达参数和条件定义。稳定的CLD可以确认这是否受到控制并且是理想的异质性，但也可以确定分子变体是否影响这种异质性，如果CLD在最终领先选择之前应用于它们，特别是对于Fc工程变体。 虽然调查基本分子属性的领先候选物通常只需要亲和纯化，但通过确定的储存稳定性和强制降解研究评估的最终领先应该通过类似于制造的完整纯化过程进行纯化。如前所述，这将包括ProA亲和、低pH保持、AEX流穿和CEX结合和洗脱过程。这些纯化步骤应该将感兴趣的分子纯化到高纯度和可接受的异质性。低pH保持步骤通常在pH 3.5-4.0下进行，主要灭活内源性和偶然病毒，但也可能导致抗体剪切或聚集。或者，如果分子在低pH下不稳定，可以使用洗涤剂进行病毒灭活。AEX流穿步骤主要去除带负电荷的分子，如HCPs、DNA和RNA，这些基本纯度特性分析（如SE-UPLC和cSDS）不敏感。CEX步骤旨在完全抛光感兴趣的分子，并进一步去除聚集体、错误组装或断裂的分子，或不需要的异质性，包括过量的糖基化或电荷异质性。选择CEX树脂用于特定抗体的纯化通常是经验性的，但建议采用默认或平台方法，直到需要进一步优化。为了配方药物物质，超滤/透析（UF/DF）是一个关键活动，其中感兴趣的分子被缓冲液交换和浓缩到所需的配方，通常在添加聚山道之前。在可开发性和早期开发工作中，产品质量属性侧重于由诸如SE-HPLC/UPLC、cSDS、cIEF和颗粒分析等分析定义的散装纯度特性，特别是当决定领先分子或配方时。然而，为了提供用于动物研究、良好实验室规范毒理学研究和随后的临床研究的材料，这些研究需要在良好生产规范条件下生产的药物，其他过程和释放分析评估潜在污染物至关重要，如CHO DNA水平、生物负荷和内毒素。 5.四大可开发性属性 影响所有可开发性结果的四大属性是构象、胶体、化学和其他相互作用。许多属性，如聚集，被清楚地理解为主要由解链驱动，因此被归类在“构象”类别中。其他可开发性结果并不那么明显或容易分类。其他问题，如制造中的问题机械问题或辅料质量的问题，可能影响开发结果，但如果它们与治疗分子无关，则在这里不被视为可开发性问题。治疗分子与辅料或药物产品容器之间的问题相互作用是分子可开发性问题，因为它们与分子的固有属性有关。例如，分子可能在过滤或UF/DF操作过程中由于自结合引起的高粘度而出现过程失败。在表3中，我们总结了许多常见的可开发性和/或CQAs，这些属性影响领先选择和CMC开发，以及潜在的安全性和有效性，并将每个属性归类为四大类别之一或多个。还包括了确保成功可开发性结果的关键标准的例子。应该注意的是，虽然每个类别可以独立描述，但它们并不完全独立，因为一个属性可能影响另一个。例如，化学去酰胺化和/或氧化可能在构象不稳定或聚集中出现，反之亦然。 5.1.构象稳定性 构象稳定性属性可以影响聚集速率、DSC（或Tm）的温度依赖性解链、化学变性倾向以及不溶性颗粒的形成。CMC稳定性和释放分析分析，如尺寸排阻色谱（SEC）和亚可见颗粒分析，明显地分别评估了可溶性和不溶性聚集，这主要是由蛋白质解链驱动的，尽管它们也可能受到其他因素的影响，如天然表面静电和疏水性。聚集通常是由部分解链分子之间的共价和非共价结合混合而成的，并且依赖于pH值、温度和浓度。如果有问题，聚集的性质可以通过圆二色谱或傅里叶变换红外光谱进一步探索，以评估变性或解链时二级和三级结构的变化。此外，可以通过DSC分析解链的可逆性，以衡量配方中聚集可能的可逆性。构象稳定性也会影响除聚集和温度依赖性解链之外的许多其他结果。例如，表达或纯化产量差可能是由于表达时不完全折叠或在纯化过程中遇到的各种pH值或离子强度环境中解链所致。高度构象状态的存在可能导致通过各种方法（如HIC）确定的异质性增加。部分解链抗体形成的可溶性聚集体和不溶性颗粒不仅存在CQA问题，还存在免疫原性风险。给药后，结构不良或构象多样性分子可能导致增加的免疫原性或不良的药代动力学/生物利用度，因为在解链/聚集状态下展示的一系列表面可能触发免疫反应或简单地被快速清除。 5.2.化学稳定性/特性 化学稳定性受翻译后修饰（PTMs）的影响。如上所述，天冬酰胺去酰胺化和甲硫氨酸/色氨酸氧化是影响质量和功能属性的两种最常见的PTM。通常，位置、溶剂可及性和局部主链构象和/或灵活性支配固有的分子反应性。这些修饰和其他修饰通过质谱进行特定位点的评估，但其他方法如反相（RP）-HPLC或HIC可能有助于监测氧化的异常变化，同样，cIEF用于监测去酰胺化。还有许多其他修饰存在，如焦谷氨酸形成、非酶促的赖氨酸糖化、天冬氨酸异构化、主链剪切或断裂以及二硫键还原和错配。其他修饰，如天冬酰胺糖基化，是酶促的，受表达条件和分子固有序列及结构属性的驱动。CQAs包括许多化学修饰，特别是天冬酰胺去酰胺化、甲硫氨酸/色氨酸氧化和天冬氨酸异构化，这些修饰对成功的CMC开发至关重要，因为它们也会影响活性、安全性和有效性。在最近的一项研究中，单克隆抗体的天冬氨酸异构化与增加的免疫原性相关。此外，抗体甲硫氨酸氧化已被证明通过影响与FcRn受体的结合而对体内半衰期产生负面影响。治疗性抗体CDR区的N-去酰胺化已被证明会影响目标结合数级，保守的Fc去酰胺化（在N325）已被证明通过减少FcγRIIIa结合而影响抗体依赖性细胞介导的细胞毒性。这一类还包括由表面特性定义的属性，如pI和疏水性，尽管这两种属性都可能导致其他不良结果，特别是聚集、自相互作用或非特异性相互作用。 5.3.胶体稳定性 胶体稳定性指的是分子非共价自结合形成“胶体”或更大复合物的能力，这些复合物影响整体溶液流变学和粘度。在这里，我们将自相互作用与聚集区分开，因为后者由（部分或完全）解链分子的复杂网络组成。像自相互作用一样，聚集可以是可逆的，但它主要是不可逆的，特别是在高阶聚集体中。因此，聚集体是长寿的，可以通过尺寸排阻色谱、分析性超速离心或甚至场流分离等色谱技术进行评估。在自相互作用或自结合的情况下，折叠的、天然的分子以高度瞬态和浓度依赖的方式可逆地结合，这不能直接通过使用分析样品量在稀薄浓度下进行的色谱技术直接检查。特别是在双价抗体中，自结合可以在更高的配方浓度下导致大的寡聚复合物。因为双价性增强了导致粘度增加的抗体寡聚化，当格式化为多特异性抗体时，自相互作用风险可能会发生变化，其中Fab价可能会改变。此外，已报道抗体自相互作用导致稳定性和溶解度降低，甚至可能发生相分离和凝胶化。在一份报告中，去除一个横跨HC-CDR1和HC-CDR2的疏水表面纠正了体外自相互作用，改善了血清半衰期和非特异性组织结合，暗示自相互作用的高倾向也可能通过相同的界面与其他分子的非特异性相互作用相关。由于自相互作用通常是由至少一个相互作用分子中的CDR残基介导的，这些残基也介导目标结合，因此在保持理想活性的同时，可能很难通过工程或突变来纠正自相互作用。此外，可能很难从结构上预测两个分子将如何自相互作用或自结合。最近，通过晶体学和建模工作，已显示抗体通过CDR装置以对称的“面对面”方式自相互作用。其他报告已经证明了Fab-Fc自相互作用，这可以通过IgG1/IgG4同种型转换来缓解。值得注意的是，配方辅料和调节配方pH已被证明在几个实例中通过减少蛋白质-蛋白质相互作用来降低粘度。由重链在表达期间的独特自相互作用驱动的重链二聚体形成，最近也被报道为可开发性问题。 5.4.其他相互作用 其他相互作用包括那些可能影响过程、药物产品或体内行为的治疗分子之间的相互作用。例如，治疗分子与过程组分、配方辅料、药物产品容器之间的相互作用，以及与表达HCPs和体内生物分子的相互作用。治疗分子可能与过程组分（如过程泵和过滤器）不利地相互作用或吸附，或帮助促进从不锈钢中渗出铁、铬、铜和镍等金属，这可能导致产品氧化和不稳定。其他常见的相互作用可能是与分析柱树脂的相互作用，如尺寸排阻HPLC，这可能使直接分析CQAs复杂化。治疗分子也可能与配方辅料不利地相互作用，尤其是聚山道，这可能导致不稳定性，如聚集体的形成或氧化降解。有趣的是，假定通过与治疗抗体的相互作用在纯化去除中存活下来的酶促HCP，已被报道可以降解聚山道，这反过来又导致了抗体稳定性和颗粒问题。如果在纯化过程中没有去除，酶促或蛋白水解HCP也可以直接降解感兴趣的抗体，除了呈现一般的免疫原性风险。其他污染风险，如脂多糖内毒素，可能通过与感兴趣的抗体的相互作用存活下来。抗体与药物产品容器的相互作用，特别是与瓶塞橡胶或注射器塞子硅涂层的相互作用，可能导致颗粒形成，通常与外来颗粒或硅油滴结合，尽管配方是这些现象的主要驱动因素。抗体相互作用或吸附可能在产品给药期间与各种附件发生，如静脉袋或泵送设备。 给药后，目标分子可能与各种生物分子特异性或非特异性地相互作用，可能导致药代动力学不良、生物利用度和效力不佳。一个例子包括去除IgG1和IgG4抗体上的电荷“斑块”，不影响pI，结果在小鼠中改善了半衰期和分布，这与体外减少非特异性结合相关（对CHO细胞和肝素）。还有其他例子，高度特异性与其他生物分子的相互作用导致了负面的临床结果，例如，抗程序性细胞死亡蛋白1（PD-1）抗体camrelizumab与血管内皮生长因子受体2（VEGFR2）和其他两种分子之间的强结合相互作用，导致了强大的VEGFR2激动作用和血管瘤。值得注意的是，其他抗PD-1疗法，如nivolumab和pembrolizumab，不会导致VEGFR2激动作用，因此这种副作用是camrelizumab非特异性（激动剂）效应所独有的。虽然这些不需要的相互作用在发现阶段几乎不可能完全预测，但最近开发了各种分析方法，可能有助于预测它们发生的可能性。杆状病毒粒子测定（BvP）通过ELISA或流式细胞术评估对各种蛋白质池的非特异性结合，并已与人类的清除率相关。PSR测定是使用CHO膜提取物评估对感兴趣分子的非特异性结合的类似方法，已与其他用于预测非特异性的测定相关。肝素色谱用于将体外保留时间与小鼠和生理模型中的抗体清除率相关。在Jain及其同事的一项研究中，与这些预测非特异性测定相关的可开发性标志物对于处于开发后期的治疗性抗体有所减少。与高级临床阶段的相关性表明，这些非特异性测定可能预测影响临床终点（如安全性和有效性）的体内相互作用。这似乎引入了在IND前阶段评估复杂非特异性相互作用的新兴趋势，以增加临床成功的可能性。可开发性早已被证明对于预测CMC开发结果和制造成功特别有用。然而，由于没有文献引用将CMC失败作为临床失败的直接原因，人们普遍认为临床结果不能通过可开发性评估来预测。然而，将非特异性纳入可开发性评估及其最近与临床成功的相关性表明情况可能并非如此。事后看来，作为可开发性属性的改进多特异性与临床进展的相关性意味着临床失败可能以前是由次标准的可开发性属性引起的。其他更常用的表征工具，如HIC，可以评估疏水性，这通常与非特异性结合和整体“粘性”相关。其他报道用于评估潜在非特异性相互作用的方法是CIC和站立单层吸附色谱。如果最近显示可预测非特异性相互作用的测定尚未纳入可开发性工作流程，标准的过程和分析方法可能会提供线索。例如，治疗分子可能非特异性地结合到纯化和分析树脂上，或者通过HIC计算或实验性地显示出高表面疏水性。34 这些信息可以在决定领先时考虑。 6.计算机计算工具的进步 6.1.预测计算 近年来，使用计算工具来预测抗体的可开发性和质量属性变得越来越普遍。通常，这些工具基于序列和/或结构导出的参数，筛选和/或将初始命中或候选物筛选成更有希望的领先分子。使用抗体同源模型和计算表面属性，已经可以预测聚集、粘度、化学不稳定性、和药代动力学清除等可开发性属性。本质上，这些方法可以在表达、纯化和表征之前，将数百个候选物计算筛选成相对较小的子集。为了计算预测浓度依赖的粘度，通常评估净可变域或总抗体电荷以及表面疏水性指数。 有趣的是，Tomar及其同事根据全长同源模型获得的疏水性和静电参数，预测了16个单克隆抗体的总抗体粘度曲线。他们发现与总可变重（VH）和可变轻（VL）电荷、疏水表面积、zeta电位和令人惊讶的WALTZ聚集倾向有最大的统计显著性。在对60个IgG1单克隆抗体的研究中，抗体同源模型的分子动力学模拟将粘度与疏水性、净电荷和电荷分布相关联。此外，快速体内清除与高度带电和/或疏水性CDRs相关。在这项研究中，分子动力学模拟输出，如潜在反应性残基的溶剂可及性，也与实验色氨酸氧化和天冬氨酸异构化率相关。值得注意的是，对100多个临床阶段抗体治疗的研究表明，平均重链-CDR3长度比评估的成千上万的临床前抗体序列短，表明较短的长度被选择，因为它们导致更好的可开发性结果。在同一研究中，对于CDR区域，类似的发现被报道在疏水性斑块度量方面。许多基于网络的工具使用基于结构的表面行为计算来预测蛋白质的稳定性或可开发性概况，如治疗性抗体分析器（TAP）、SAP（空间聚集倾向）、Abpred（抗体预测数据库）用于疏水性预测，以及SAbPred（结构抗体预测数据库），包括建模、注释、人源化和可开发性预测工具。迄今为止，有许多例子表明，计算模型已经成功预测了大量抗体的聚集、粘度、化学稳定性和体内行为的实验结果。 6.2.机器学习和人工智能 在此基础之上，使用机器学习（ML）和人工智能（AI）来预测可开发性属性，如粘度和聚集倾向。序列、结构和分子动力学已被用于训练机器学习算法，然后尝试预测分子属性。最近的例子包括使用ML预测亲和力和特异性、去酰胺化、甲硫氨酸氧化、疏水性、和粘度。最近，AI被探索用于通过预测蛋白质-溶剂相互作用来揭示最佳抗体和蛋白质配方。在蛋白质结构预测方面，AlphaFold和AlphaFold2最近已商业化推出，用于预测蛋白质结构甚至其复合物。ABlooper（抗体“Looper”）被开发为一种深度学习工具，可以从抗体序列中轻松预测CDR结构。虽然它们在制药行业的使用可能并不普遍，但AI/ML的出现可能成为常规，作为最初的计算努力的一部分，在任何实验努力之前筛选和评估分子属性和相互作用。 7.结论 抗体和蛋白质治疗的可开发性是推动和推进领先候选物优化和选择进入IND支持和临床研究的关键活动。适当和彻底的可开发性研究不仅检查将代表过程和药物产品适应性潜在CQAs，而且阐明可能影响给药后安全性和有效性以及最终临床成功的分子属性。最近在计算方法和非特异性评估方面的进展也有助于简化和实现更有针对性的可开发性评估。我们提出这四大属性的大型分子抗体和蛋白质治疗作为影响所有可开发性结果的属性：1）构象，2）胶体，3）化学，和4）其他相互作用。在发现阶段可开发性和早期开发活动中对这些属性及其风险进行全面检查，提供了最好的可能性，即强大和高质量的领先候选物被提升，潜在的CMC和临床开发风险是可控的。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

摘要：外泌体逐渐被认为是细胞间通讯的重要媒介。它们将活性生物分子传递给目标细胞，并在多种生理和病理过程中发挥重要作用，展现出作为疾病新治疗策略的巨大潜力。方法：在这篇综述研究中，我们研究了过去二十年间发表的关于外泌体在不同疾病中应用的文章，以及这一领域的视角和挑战。结果：外泌体的主要临床应用包括将其用作生物标志物、无细胞治疗剂、药物传递载体、外泌体动力学的基础分析以及癌症疫苗。来自人类或植物的不同来源的外泌体被用于各种临床试验中。大多数研究人员使用循环系统中的外泌体进行生物标志物实验。间充质干细胞（MSCs）和树突细胞（DCs）是两种广泛认可的外泌体来源。MSCs衍生的外泌体通常用于炎症治疗和药物传递，而DCs外泌体用于在癌症患者中诱导炎症反应。然而，外泌体的临床应用面临各种问题和挑战。此外，基于外泌体的临床试验的转化需要符合特定的良好生产规范（GMP）。在这篇综述中，我们根据应用类型和疾病对临床试验中的外泌体进行了总结。我们还讨论了关于外泌体动力学和临床应用的主要问题和挑战。结论：外泌体是临床试验中治疗许多疾病的有希望的平台。这个令人兴奋的领域正在迅速发展，对外泌体发挥各种作用的潜在机制的理解还远远不完整，需要在这些小囊泡的研究中进一步进行多学科研究。 背景 细胞外囊泡（EVs）是由大多数细胞通过多种机制产生的异质性细胞衍生囊泡，通过转移生物信号如许多非编码RNA、编码RNA、DNA链、片段和脂质到对应细胞，促进细胞间通讯。EVs还可以通过许多体液传递其货物/信息，包括循环系统、唾液、脑脊液（CSF）、尿液、牛奶和支气管肺泡灌洗液（BALF）。一旦传递到目标细胞，EVs可以通过驱动不同的信号通路来调节受体细胞的命运和形态，这可能导致正常生理或病理学，具体取决于EVs的来源和细胞状态。越来越多的证据表明，EVs在一系列细胞过程中发挥关键作用，包括增殖、生长、发育、血管生成、免疫调节、感染、转移、重编程和重塑。已经记录了三种主要的EVs亚类，包括微囊泡（MVs）或外泌体、凋亡体和小外泌体（图1）（表1）。MVs指的是由质膜产生的EVs，大小范围为100-1000纳米，通过一个复杂的机制，称为脱落或质膜的芽生，类似于病毒向外芽生细胞膜。另一种越来越吸引科学家注意的EVs是小外泌体，大小范围为30-150纳米。这些囊泡据报道在大小和货物上也是异质的，因此在目标细胞信号上发挥着不同的功能。小外泌体的起源是参与内吞作用途径的囊泡，是一种称为多囊泡体（MVBs）的晚期内吞体开始产生小外泌体。EVs的最新进展表明，小外泌体的生物生成可能与另一个内膜系统相互作用，以维持细胞稳态。例如，正常生理和几种疾病中报道了小外泌体信号通路和自噬之间的串扰。在过去的十年中，寻求改善治疗结果并专注于精准医疗的外泌体的转化医学有了显著增加。外泌体具有独特的性质，吸引了研究人员使用它们来治疗许多疾病，包括退行性疾病和癌症。到目前为止，已经使用不同来源的外泌体进行了许多临床试验来治疗各种疾病。尽管这种方法很有趣，临床试验也显示出满意的结果，但这个领域存在一些挑战和限制，需要进一步的调查来验证这些结果，并为基于外泌体的研究引入一个黄金标准。系统地检查外泌体的效率和安全性需要确定它们的个性和纯度。国际细胞外囊泡协会（ISEV）通过在2014年和2018年发布MISEV指南，启动了EVs分离和表征程序的标准化，这些指南讨论了在基于EVs的研究中必须考虑的最重要的特征。此外，EV-TRACK数据库成立于2017年，为研究人员在发表前提供他们的纯化和表征方法，并就实验计划的可能限制提出建议（https://evtrack.org/about.php）。本文概述了外泌体的潜在临床应用以及在这条路线上的挑战和问题。 图1 细胞外囊泡(EVs)的生物生成。EVs的两个主要亚类是外泌体和微囊泡(MVs)。外泌体的生物生成过程复杂，发生在细胞质中位于多囊泡体(MVBs)内。ESCRT复合体和不同的分子以依赖ATP和不依赖ATP的方式，促进外泌体的装载、排序和形成。外泌体的货物来自高尔基体、内体途径和细胞质。Rab蛋白介导内体室和外泌体的细胞内运输。MVBs已报道能与质膜、溶酶体或两栖体融合。当MVBs与质膜融合时，外泌体被释放到细胞外环境中。有证据表明外泌体生物生成途径可能与自噬通路存在交叉。MVBs可能与自噬体融合形成称为“两栖体”的混合囊泡，这些囊泡最终与质膜或溶酶体融合。MVs比外泌体大，通过向外芽生和脱落过程从质膜形成。EVs可以通过三种可能的方式影响目标细胞的命运和信号通路，包括内吞作用、受体-配体相互作用，以及与质膜的直接融合。 外泌体 外泌体是指许多细胞释放到细胞外基质中的膜结合囊泡。主要思想是这些纳米颗粒在细胞内生成，在多囊泡体（MVBs）内，通过MVBs膜的内陷，导致在MVBs内生成腔内囊泡（ILVs）（图1）。 这些囊泡可能被称为前外泌体，当MVBs与细胞膜融合后，它们可以被分泌出细胞；现在被称为外泌体。MVBs总是不将ILVs排出细胞外，而是它们可能与溶酶体融合，随后ILVs及其货物被降解以供回收和重复使用，以维持细胞稳态。此外，有证据表明MVBs可能与自噬途径的自噬体融合，并生成称为“两栖体”的混合囊泡，随后，两栖体现在可能与血浆膜融合并分泌带有其他货物的外泌体。了解MVBs如何以及为什么与不同的膜融合一直是一个长期目标，因为这对区分外泌体的异质性以及相关的生理后果、调节它们在临床使用中的产生以及监测病理条件至关重要。MVBs膜上存在各种分子和复合物，它们介导货物装载和向内芽生膜的排序，并使新形成的ILVs掐入MVBs。例如，一个由四个复合物组成的与ESCRT相关的机制，以调节的方式使用ATP分子介导生物生成和装载ILVs，或者涉及一个不依赖ESCRT的机制。许多与MVBs相关的Rab蛋白以不同的方式促进MVBs的运动。其中，Rab7、Rab8、Rab11、Rab27和Rab35在调节外泌体途径中的作用已被认可。SNARE蛋白是短分子，它们促进MVBs和细胞质膜的融合。分泌到细胞空间后，外泌体与目标细胞相互作用，这些细胞要么靠近，要么远离。有人提出，外泌体或其他EVs利用三种机制来影响受体细胞的功能，包括内吞作用（例如吞噬作用和胞饮作用）、受体-配体相互作用和直接融合，这些机制导致细胞和生物过程的变化，参与正常生理或恶化病理条件。这是外泌体的旅程；然而，需要进一步的调查来确定外泌体是如何为一个明确的目的而产生的。外泌体的货物包括来自细胞膜、内体室、细胞质和来自内膜系统的分子，如高尔基体[7,18]。外泌体在干燥过程中呈现特定的双凹形或杯状，而在透射电子显微镜下它们呈现球形[26]。这些囊泡的密度为1.08-1.19 g/ml，具有常见的外泌体标记物，如CD9、CD63、CD82、CD81、Alix和Tsg101。成千上万种类型的生物分子存在于外泌体中，包括蛋白质、众多RNA和脂质，这些数据被各种数据库收集和呈现，如Vesiclepedia（http://www.microvesicles.org）、Exocarta（http://www.exocarta.org）和中国的一个生物信息学实验室（http://bioinfo.life.hust.edu.cn）。了解驱动外泌体生物生成和装载的机制，以及外泌体的货物和外泌体被其他细胞摄取的方式，将支持科学家实现精细和高效的转化医学。值得一提的是，完全理解外泌体的性质、纯度和来源对于下游实验至关重要。例如，来自干细胞的外泌体可能参与再生和正常生理，而来自感染或癌细胞的外泌体则介导病理学（图2）。 图2 外泌体的临床应用。在临床试验中，外泌体被用作生物标志物、无细胞治疗（外泌体治疗）、药物输送系统和癌症疫苗。来自植物细胞、间充质细胞、T细胞和树突细胞的外泌体被用于治疗不同的疾病。此外，这些来源的外泌体是药物输送系统的有希望的载体。在直接方法中，外泌体被装载治疗剂，而在间接方法中，适当的细胞通过基因工程改造或与治疗剂共培养以产生人工外泌体。 临床试验 已经很好地建立起来，外泌体是治疗许多疾病的理想候选者。在临床试验之前，许多临床前实验已经证实了外泌体治疗许多疾病的优势，从再生医学领域到癌症。近年来，外泌体在临床试验中进行了研究，总共有两种类型的外泌体在临床试验中使用，具体来说，人类细胞/样本和植物标本的外泌体。对ClinicalTrials.gov（https://clinicaltrials.gov/）的调查显示，外泌体的主要应用是生物标志物、外泌体治疗、药物输送系统和癌症疫苗（图3）。此外，一些试验旨在分析不同条件下人类样本中的外泌体。分析显示，共记录了116项试验，其中58项（50%）属于生物标志物应用（图3）。在外泌体治疗方面，已注册了33项（28.44%）研究（图4）。在药物输送系统试验中，有6项（5.17%）研究，而在外泌体基础分析方面，已注册了17项（14.66%）研究（图4）。最后，有2项临床试验（1.72%）与外泌体疫苗研究相关。临床试验中的外泌体需要符合良好生产规范（GMP）。GMP等级外泌体生产方法包括细胞类型、培养环境、培养系统和培养基。生产后还需要进一步纯化，通常分为三个步骤。GMP外泌体的第三个主题是建立表征和鉴定方法，包括物理配置和生物活性功能特征。此外，欧洲药品管理局（https://www.ema.europa.eu/en）发布了关于先进治疗药物产品分类的科学建议。该机构描述了细胞和分子生物技术的新科学进展导致了先进治疗的发展，如基因治疗、体细胞治疗和组织工程。这个生物医学的新兴领域为治疗人类疾病和功能障碍提供了新的机会。此外，它为研究人员提供了先进治疗药物产品的指导方针、建议和标准，并修订了指令和法规。 图3 基于外泌体的临床试验分析 图4 外泌体治疗产品当前良好生产规范（GMP）生产流程图 生物标志物应用 如上所述，外泌体存在于许多生物液体中，可能为监测正常生理状态下的细胞状态或病理条件发生时提供了一个新的窗口。通过简单的液体活检，如血浆、血清、尿液、唾液等，外泌体和其他细胞外囊泡可用于分析它们的货物，用于诊断、预后、进展和化疗抗性生物标志物应用。尽管大多数细胞类型都会释放外泌体，但有证据支持在几种病理条件下，如癌症，外泌体分泌上调。外泌体在大多数体液中是稳定的，并能保护生物分子免受降解。在病理条件下，细胞变化可以反映在细胞释放的外泌体的生物成分中。外泌体的货物改变可以通过转录组学、蛋白质组学和脂质组学研究进行鉴定和分析；因此，特定分子水平的差异对于生物标志物应用将是有用的。不同的实验室已经显示了癌细胞及其体外外泌体的miRNAs差异表达，此外，一些在体外和动物癌症模型上进行的研究表明miRNAs表达水平的改变。不同的miRNAs正在开发中，包括miRNA-200-5p、miRNA-378a、miRNA-139-5p和miRNA-379用于肺癌，miRNA-21用于食管鳞状细胞癌，被建议作为非侵入性诊断生物标志物。此外，外泌体蛋白对许多癌症具有生物标志物潜力。在癌症的情况下，早期发现肿瘤对于有效治疗至关重要。如图4A和B所示，其中43项（74.13%）临床试验与癌症生物标志物研究相关，其余属于其他疾病（约25.87%）。深入了解外泌体货物排序机制及其分泌、通过特定体液的转移以及在生理设置和不同疾病背景下的稳定状态水平，将产生更强的生物标志物，用于监测疾病的发生和发展。此外，进一步的研究对于验证外泌体生物标志物与传统癌症生物标志物相比的特异性和灵敏度至关重要。 药物输送应用 外泌体作为用于输送治疗剂的生物纳米平台已在临床前和临床实验中进行了研究。在纳米技术领域，设计智能载体进行靶向药物输送是黄金标准。外泌体可能是将几种药物输送平台制剂转化为临床应用的良好申请者。从药物输送的角度来看，外泌体在磷脂结构方面类似于脂质体。然而，外泌体可以从各种体液和细胞中收集，具有不同脂质和表面蛋白和受体的复杂结构；这些生物分子可能有助于组织和细胞靶向，而一些则保证最小的非靶向相互作用。这些独特的蛋白质装饰的磷脂膜可能具有与邻近和远距离目标相互作用的理想条形码。尽管进行了广泛的研究，基于外泌体的药物输送系统相对于其他合成纳米载体（如脂质体）的优越性，以及相关的利益风险比仍然是辩论的问题。治疗剂，包括核酸、蛋白质和药物，至少可以通过两种通用方法插入外泌体，然后被运送到特定目标。这些方法是直接方法或外源性方法，其中药物通过几种方法加载到分离的外泌体中；以及间接方法或内源性方法，其中亲本细胞被加载药物或基因改造以表达所需的蛋白质、受体和RNA。如果亲本细胞正确产生所选分子的外泌体，则内源性方法具有较低的复杂性水平。或者，有一种称为外泌体启发的脂质体的方法，其中一个所需的脂质体与外泌体融合以构建混合载体。正在进行的临床试验表明，外泌体被用于输送治疗剂，例如，在ClinicalTrials.gov资源中有六项临床试验注册（https://clinicaltrials.gov/ct2/home）。在两项临床试验中，作者旨在通过直接方法将姜黄素封装到植物衍生的外泌体中，用于治疗结直肠癌和肠易激综合症（NCT01294072和NCT04879810）。此外，三项临床试验旨在修改间充质干细胞（MSCs），以产生过度表达的外泌体（表2）。这些试验都没有完成，到目前为止结果尚不可用。值得一提的是，一些临床试验使用来自肿瘤细胞的微粒来输送药物（例如NCT02657460和NCT01854866）。这些研究使用了微粒而不是外泌体的术语，并且在ISEV基于EVs研究的指南之前就已经记录了。 尽管研究人员已经努力利用外泌体的独特属性来推进智能药物输送系统，这些系统在药代动力学、靶向和安全性方面显示出可观的利润，与合成纳米载体相比，临床转化这些结果面临挑战。由于外泌体本身的特征复杂性、尺寸异质性和自然（批次到批次）的差异贯穿其组装过程，其固有的生物发生过程风险高于原始合成制造方法。此外，需要技术上可行且可重复的方法来用治疗药物加载它们。尽管脂质体的加载方法已经优化并在工业环境中使用，但外泌体仍然需要这样的方法。当前的细胞培养和外泌体纯化方法限制了标准化和大规模生产外泌体的实施。因此，要使外泌体被视为可靠的治疗载体，需要可扩展的制造工艺，以快速、成本效益和可重复的方式生产外泌体。 外泌体治疗 如今，人们对使用细胞衍生物（如外泌体）而非干细胞进行治疗的兴趣日益增加。来自干细胞的外泌体代表了与干细胞相同的治疗和临床益处。目前，已知许多来自原生干细胞的外泌体已被证明能够恢复不利条件和受损组织。一些实验室采用了提高外泌体产量和改善外泌体治疗潜力的策略，包括干细胞的预处理、干细胞的遗传修饰以及外泌体与生物材料的结合。例如，使用去甲肾上腺素和N-甲基多巴胺来促进间充质干细胞（MSCs）分泌外泌体，而不影响其调节能力。其他物理策略包括将干细胞与低氧、酸性介质和脂多糖共同孵育。除了动物细胞，微生物和植物衍生的外泌体也被认为具有。然而，这些外泌体/EVs的安全性需要评估。在临床背景下，外泌体已注册用于治疗多种疾病。近年来，由于COVID-19肺炎的爆发；由于其免疫调节和再生潜力，MSCs衍生的外泌体正日益受到检验。根据ClinicalTrials.gov资源（https://clinicaltrials.gov/ct2/home），共有33项外泌体治疗临床试验注册，其中20项临床试验使用了MSCs衍生的外泌体（60.60%）。研究人员还使用植物、T细胞和DCs衍生的外泌体治疗不同疾病。大多数研究（9项临床试验）属于SARS-CoV-2肺炎治疗（图4）。这些结果表明，来自MSCs的外泌体经常用于再生医学。然而，一些研究表明，MSCs外泌体治疗有时被视为“双刃剑”。与令人满意的结果相反，外泌体治疗的安全性、副作用和不良结果尚不完全清楚。一项临床研究旨在调查植物（葡萄）外泌体预防头颈部癌症放化疗相关口腔粘膜炎的能力（NCT01668849）。最近，FDA指出，内布拉斯加州接受未经批准产品治疗的患者报告了严重的不良反应，这些产品被宣传为基于外泌体的产品。该机构强调，目前没有监管批准的外泌体产品，患者被一些诊所欺骗，以预防和治疗多种疾病。除了外泌体的产量，许多其他属性也受到选择的分离方法的影响。外泌体的纯度和物理化学属性是受不同分离方法影响的主要因素。可以使用不同的方法，如超滤、尺寸排除色谱、水相两相系统和基于聚合物的沉淀，用于外泌体的大规模生产。达到临床使用的大规模所需外泌体是一个主要挑战。外泌体的产量通常少于1 µg外泌体蛋白/mL培养基，而大多数研究中外泌体的有益剂量约为10-100 µg外泌体蛋白/小鼠。在临床试验中使用外泌体需要符合GMP。在GMP中，外泌体的显著问题普遍存在。首先，大规模生产。实现基于外泌体的治疗的一个主要问题是外泌体的低生产力。其次，收集高质量和统一的外泌体。外泌体的物理化学和纯度属性是受不同分离方法影响的主要问题。第三，标准化储存条件。第四，开发外泌体的治疗潜力。对于外泌体的压倒性低效率，阐明它们的治疗潜力可能是一种可能的解释。过度表达或富集治疗性生物分子是提高治疗潜力的简单方法（图5）。此外，将外泌体输送到目标组织/细胞是一个关键问题。由于外泌体的生物学效应是通过它们被目标细胞摄取来实现的，因此澄清和控制外泌体的生物分布对于临床治疗应用是必要的。骨髓来源的MSCs、人类心脏祖细胞、单核细胞来源的DCs、脂肪组织来源的干细胞和HEK293细胞等五类细胞已在GMP中用于生产外泌体。尽管已有几项实验研究报告，但关于植物衍生外泌体的GMP生产证据较少。总的来说，一个正常的临床试验项目和监督监测值得注意，以确认患者在接受干细胞和外泌体治疗时的安全性。 图5 分析基于外泌体的生物标志物临床试验(A, B)以及针对不同疾病的基于外泌体治疗的临床试验(C) 外泌体疫苗 肿瘤细胞衍生的外泌体已被用于治疗以引发强烈的抗肿瘤免疫反应。此外，基于外泌体的疫苗对几种传染病显示出了希望的结果。来自先天免疫细胞和肿瘤细胞的外泌体有潜力被用作癌症疫苗（图2）。外泌体上的几种活性分子，如MHC和共刺激分子，促进免疫细胞的抗肿瘤反应。最近在分析外泌体货物方面的进展也导致了活性剂的增加，这些活性剂可能被用于癌症免疫疗法。基于对外泌体在癌症免疫疗法中功能的广泛研究，已经使用外泌体进行了许多临床前研究。在接受抗Survivin免疫疗法的胶质母细胞瘤患者中，CD9+/SVN+和CD9+/GFAP+/SVN+外泌体的低水平与患者持续生存相关。此外，肿瘤细胞衍生的外泌体含有DNA链，这些DNA链可以通过STING/cGAS途径诱导免疫细胞反应，因此，这些外泌体可能在免疫检查点治疗中调节肿瘤免疫。来自癌症患者的DCs衍生外泌体在一些小规模临床试验中被证明是安全和可行的用于免疫疗法。DCs外泌体免疫疗法在精确和精确的免疫反应方面优于其他疗法。此外，DCs外泌体免疫疗法具有更高的生物稳定性和生物利用度，成本更低。在第一阶段I临床试验(NCT01159288)中，作者使用自体DCs衍生外泌体进行疫苗接种，以对抗转移性黑色素瘤，并展示了它们的安全性。然而，他们没有观察到深刻的CD4+或CD8+T细胞反应；仍然需要检查疫苗抗原分布背后的机制。此外，在另一项研究中，DCs衍生外泌体已被证明可以增加NSCLC患者的NK溶解活性并诱导MAGE特异性T细胞反应。在一项免疫疗法II期临床试验中，作者旨在通过使用IFNγ DCs外泌体来增强进展期NSCLC患者的T细胞和NK免疫反应。作者报告说这些外泌体可以增强患者的NK细胞的抗肿瘤免疫。然而，关键的临床结果，无进展生存期(PFS)的50%，没有实现，研究中没有描述出色的免疫反应。最后一个可信的选择是将DCs外泌体疫苗与基于NK的疗法相结合，以产生针对NK依赖性肿瘤的协同免疫原性结果。此外，似乎构建一种经过修饰的永生化DC系库，该库被修饰以表达单一MHC II分子和/或没有MHC蛋白，可以使DCs外泌体的恒定生产变得有希望，减少治疗成本和细胞培养时间间隔。在对免疫细胞招募有抵抗力的脑癌中，DCs外泌体在小鼠模型中已被证明对胶质瘤有希望，表明这些外泌体免疫疗法可以成为胶质母细胞瘤的新疗法。根据目前的研究结果和临床试验，外泌体被认为将成为各种癌症的免疫治疗疫苗。临床试验管理了符合当前GMP标准的自体DCs外泌体。迄今为止的临床试验对于证明自体外泌体管理的可行性和短期安全性非常重要，但基于外源性外泌体产品的疗法的安全性问题将更加严格。尽管一些研究已经描述了大量外泌体生产的协议和生物相容性的发展，但需要额外的临床前和临床审查以确认。最后，相对较小的尺寸和统一的形状使外泌体能够成功逃避单核吞噬系统的清除，不仅延长了它们的循环时间，也暗示了它们在细胞-细胞通信中的优越性。 结论 在过去二十年中，EVs/外泌体领域取得了惊人的进步。许多研究人员正在进行外泌体的发现和应用，为人类健康提供帮助。然而，指导方针、标准化、命名和动力学仍需取得更一致的方法。外泌体在体内转移的事实以及货物通过体液传递和送达目标的机制存在不足，是我们建议需要进一步考虑的领域。我们主要鼓励来自不同学科的研究人员，如临床医生、细胞生物学家、技术权威和计算机专家的合作，可以在外泌体假定的任何领域带来重大飞跃。在这项研究中，我们根据潜在应用和疾病类型，认真审查了外泌体的治疗应用和最近临床试验的现状。尽管临床前研究描述了有希望的结果，但获得更大成果需要对外泌体基础治疗进行许多改进。人类和衍生的植物外泌体已在临床试验中记录。来自人类细胞的外泌体占大多数，并与植物相比有完整的报告。外泌体的临床应用包括用作预后和诊断疾病的生物标志物、药物输送载体、无细胞治疗和癌症疫苗。所有这些应用都伴随着挑战和限制，需要更多的探索和标准化。进一步的研究表明，符合GMP的人类外泌体可以满足临床试验的使用需求。我们认为，外泌体在疾病管理中的有效性主要取决于技术进步，这些技术进步允许它们的发现、对不同疾病发展的敏感性和特异性。 为了推动人用及兽用疫苗行业交流，共同探讨该领域的最新研发进展、产业化现状及未来发展趋势，生物制品圈联合四叶草会展将于2024年8月16日-17日在苏州共同举办“第三届新型疫苗研发峰会”。诚邀全国相关领域专家、学者和企业家共享学术盛会。现将有关事宜通知如下。 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