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本文为转化医学网原创，转载请注明出处 作者：Sophia 导读： 免疫检查点抑制剂（ICIs）耐药性限制了肝细胞癌 （HCC） 的免疫治疗成功率。然而，免疫治疗耐药性的潜在机制仍然难以捉摸。 2024年2月22日，复旦大学李辉、郭磊、叶青海、樊嘉及中国台湾中国医科大学洪明奇（Mien-Chie Hung）等合作在《Journal of Hepatology》在线发表题为“CRKL dictates anti-PD-1 resistance by mediating tumor-associated neutrophil infiltration in hepatoce”的研究论文， 研究发现CRKL通过介导肝癌中肿瘤相关的中性粒细胞浸润来调控抗PD-1的耐药性。 https://doi.org/10.1016/j.jhep.2024.02.009 研究背景 01 肝细胞癌 （HCC） 是全球癌症相关死亡的第三大原因。尽管肝细胞癌的治疗有了很大的改善，但大多数肝细胞癌患者并不符合手术切除标准。免疫检查点抑制剂（ICIs）在癌症免疫治疗领域留下了不可磨灭的印记;根据III期临床试验IMBrave150的积极结果，阿替利珠单抗联合贝伐珠单抗已成为晚期HCC患者的一线联合治疗。然而，其他针对 HCC 患者的抗 PD-1 治疗（KEYNOTE-240 和 CheckMate-459）的随机临床试验并未显示出显著改善，从而表明 存在塑造 HCC 复杂免疫抑制微环境以驱动抗 PD-1 治疗耐药性的机制，突出了迫切需要确定更好的生物标志物以优化患者选择和克服免疫治疗耐药性。 中性粒细胞是人类中含量最丰富的循环白细胞，可积聚在多种癌症类型中。肿瘤中的中性粒细胞表现出显著的可塑性，并已被证明在T细胞发炎的微环境中获得T细胞抑制能力。中性粒细胞可以通过释放抗肿瘤因子（如 TSP-1 和 H2O2）来抑制肿瘤进展并获得抗肿瘤表型以响应免疫治疗来表现出抗肿瘤作用。然而，更多的研究表明， 肿瘤相关中性粒细胞（TANs） 具有涉及免疫耐受的促肿瘤效应;TANs在一些实体瘤中的高水平浸润有助于肿瘤进展、淋巴结转移、血管生成和不良预后，强调了TANs在协调免疫抑制性肿瘤微环境（TME）和免疫治疗耐药性方面的关键作用。 激酶样基因 CT10 调节因子 （CRKL） 位于人类染色体 22q11.21 上。CRKL 是一种衔接蛋白，由一个 Src 同源 2 （SH2） 结构域和两个 SH3 结构域组成。已经鉴定出几种与 SH2 和 N 末端 SH3 结构域结合的蛋白质。CRKL 普遍表达并参与介导细胞增殖、迁移、粘附、细胞骨架变化、分化、吞噬作用和病原体摄取的各种生物学过程。CRKL 表达升高见于多发性癌，CRKL 扩增驱动癌转化和表皮生长因子受体 （EGFR） 抑制剂耐药。这些发现表明， 异常的CRKL表达在肿瘤进展中起着至关重要的作用。 研究结果 02 CRKL 使用合并基因筛选被确定为候选抗 PD-1 抗性基因。CRKL 过表达通过动员肿瘤相关中性粒细胞 （TAN） 阻断 CD8+ T 细胞的浸润和功能来抵消抗 PD-1 治疗效果。PD-L1+ TAN 被发现是受 CRKL 表达调控并显示免疫抑制表型的 TAN 的重要亚群。从机制上讲， CRKL 通过竞争性降低 Axin1 结合来抑制腺瘤性大肠息肉病 （APC） 介导的 β-连环蛋白的蛋白酶体降解，从而促进 VEGFα 和 CXCL1 的表达。使用人HCC样本，我们验证了CRKL/β-catenin/VEGFα和CXCL1的正相关。使用 CRISPR-Cas9 基因编辑（CRKL 敲除）或其下游调节因子靶向 CRKL 有效地恢复了原位小鼠模型和患者来源的器官型肿瘤球状体 （PDOTS） 模型中抗 PD-1 治疗的疗效。 总之，CRKL/β-catenin/VEGFα 和 CXCL1 轴的激活是抗 PD-1 治疗成功的关键障碍。因此，CRKL抑制剂联合抗PD-1可以用于治疗HCC。 概述图 研究结论 03 本研究，我们发现 CRKL 在抗 PD-1 耐药 HCC 中过表达，而 CRKL 上调促进 HCC 中的抗 PD-1 耐药。我们发现 CRKL/β-catenin/VEGFα 和 CXCL1 轴上调通过促进肿瘤相关中性粒细胞 （TAN） 浸润有助于抗 PD-1 耐药性。 这些发现支持了基于贝伐珠单抗的ICIs联合治疗的策略，CRKL抑制剂联合抗PD-1治疗可能被开发用于治疗HCC。 参考资料： https://doi.org/10.1016/j.jhep.2024.02.009 注：本文旨在介绍医学研究进展，不能作为治疗方案参考。如需获得健康指导，请至正规医院就诊。 热门·直播/活动 🕓 上海｜3月01日-02日 ▶第三届长三角单细胞组学技术应用论坛暨空间组学前沿论坛将在上海召开，诚邀您的参与！ 点击对应文字 查看详情

引言免疫检查点抑制剂(ICIs)耐药性限制了肝细胞癌(HCC)免疫治疗的成功。然而，免疫治疗耐药的机制仍然难以捉摸。2024年2月22日，复旦大学李辉、郭磊、叶青海、樊嘉及中国台湾中国医科大学洪明奇（Mien-Chie Hung）等合作在Journal of Hepatology 在线发表题为“CRKL dictates anti-PD-1 resistance by mediating tumor-associated neutrophil infiltration in hepatoce”的研究论文，该研究发现CRKL通过介导肝癌中肿瘤相关的中性粒细胞浸润来调控抗PD-1的耐药性。CRKL是一种候选抗PD-1耐药基因。CRKL过表达通过动员肿瘤相关中性粒细胞(TANs)阻断CD8+ T细胞的浸润和功能而使抗PD-1治疗效果无效。PD-L1+ TANs被发现是TANs的一个重要子集，受CRKL表达调节，并表现出免疫抑制表型。在机制上，CRKL通过竞争性地降低Axin1结合抑制APC介导的β连环蛋白蛋白酶体降解，从而促进VEGFα和CXCL1的表达。使用人类HCC样本，验证了CRKL/β-catenin/VEGFα与CXCL1的正相关。利用CRISPR-Cas9基因编辑(CRKL敲除)靶向CRKL或其下游调节因子，在原位小鼠模型和患者源性器官型肿瘤球体(PDOTS)模型中有效恢复抗PD-1治疗的疗效。CRKL/β-catenin/VEGFα和CXCL1轴的激活是成功抗PD-1治疗的关键障碍。因此，CRKL抑制剂联合抗PD-1可能用于治疗HCC。肝细胞癌(HCC)是全球癌症相关死亡的第三大原因。虽然HCC治疗有了很大的进步，但大多数HCC患者不符合手术切除标准。免疫检查点抑制剂(ICIs)在癌症免疫治疗领域取得了不可磨灭的成就;根据III期临床试验IMBrave150的阳性结果，atezolizumab+贝伐单抗已成为晚期HCC患者的一线联合治疗方案。然而，其他针对HCC患者的抗PD-1治疗的随机临床试验并没有显示出显著的改善，从而表明存在形成HCC复杂免疫抑制微环境的机制，以驱动抗PD-1治疗的耐药，突出了迫切需要确定更好的生物标志物，以优化患者选择和克服免疫治疗耐药。中性粒细胞是人体中最丰富的循环白细胞，在多种癌症类型中积累。肿瘤中的中性粒细胞表现出显著的可塑性，并在T细胞炎症微环境中获得T细胞抑制能力。中性粒细胞可通过释放抗肿瘤因子如TSP-1和H2O2来抑制肿瘤进展，并在免疫治疗中获得抗肿瘤表型，从而发挥抗肿瘤作用。然而，更多的研究表明，肿瘤相关中性粒细胞(TANs)具有促肿瘤作用，包括免疫耐受。在一些实体人肿瘤中，TANs的高水平浸润有助于肿瘤进展、淋巴结转移、血管生成和预后不良，强调了TANs在协调免疫抑制肿瘤微环境(TME)和免疫治疗耐药在预后不良中的关键作用。模式图（Credit: Journal of Hepatology）人类激酶样基因(CRKL)的CT10调控因子位于染色体22q11.21上。CRKL是一种连接蛋白，由一个Src同源2 (SH2)结构域和两个SH3结构域组成。已经鉴定出几种与SH2和N端SH3结构域结合的蛋白。CRKL普遍表达，并参与多种生物过程，介导细胞增殖、迁移、粘附、细胞骨架变化、分化、吞噬和病原体摄取。CRKL在多种癌症中表达升高，CRKL的扩增驱动癌转化和表皮生长因子受体(EGFR)抑制剂耐药性。这些发现表明，异常的CRKL表达在肿瘤进展中起着重要作用。该研究发现CRKL在抗PD-1耐药的HCC组织中表达上调，CRKL过表达通过募集TANs和重塑肿瘤免疫微环境(TIME)促进抗PD-1耐药，提示CRKL是克服抗PD-1耐药的潜在靶点。这些发现支持以贝伐单抗为基础的ICIs联合治疗策略，CRKL抑制剂联合抗PD-1治疗可能被开发用于HCC的治疗。原文链接https://doi.org/10.1016/j.jhep.2024.02.009责编|探索君排版|探索君文章来源|“iNature”End往期精选围观一文读透细胞死亡(Cell Death) | 24年Cell重磅综述（长文收藏版）热文Nature | 破除传统：为何我们需要重新思考肿瘤的命名方式热文Nature | 2024年值得关注的七项技术热文Nature | 自身免疫性疾病能被治愈吗？科学家们终于看到了希望热文Nature | 癌症与神经系统的致命舞蹈

*仅供医学专业人士阅读参考在固若金汤的实体瘤面前，免疫细胞始终是弱小的一方。去年8月份，美国范德堡大学的研究人员发现，杀伤性T细胞竟然在接触肿瘤后的6-12小时内就能发生耗竭[1]。去年年底，以色列魏茨曼科学研究所的一项研究表明，NK细胞入瘤24小时之内，就失去了抗肿瘤活性；而巨噬细胞入瘤后48小时之内就会被肿瘤策反，发挥促进肿瘤生长的作用[2]。近日，由新加坡科技研究局（A*STAR）的Melissa S.F. Ng和A*STAR及上海交通大学医学院附属仁济医院-上海市免疫治疗创新研究院的Lai Guan Ng（黄来源）领衔的研究团队，在顶级期刊《科学》上发表一项重磅研究成果[3]，深入阐述了瘤内中性粒细胞的命运。他们首次发现，中性粒细胞在进入肿瘤之后，在一天之内就会被肿瘤重编程成为超级长寿的促癌亚型。具体来说，在肿瘤的调教下，此类中性粒细胞的寿命达到循环中性粒细胞的4倍以上，而且它们还不惧低氧和缺乏营养的环境，聚集在肿瘤核心区域附近，表达高水平的血管内皮生长因子α（VEGFα），促进肿瘤核心区域血管的形成，为肿瘤提供养分，促进肿瘤的生长。A*STAR的Melissa S.F. Ng、Immanuel Kwok和Leonard Tan，及上海交通大学医学院附属仁济医院-上海免疫治疗创新研究院的史长明为研究论文的共同第一作者。论文首页截图作为最积极、最强力的免疫细胞之一，中性粒细胞总会在第一时间赶到“案发现场”。然而，在癌症这种疾病类型中，科学家很早就发现，肿瘤中浸润的中性粒细胞与患者的预后较差有关[4]。它甚至被认为是一种促进癌症进展的免疫细胞类型[5]。不过，中性粒细胞促进肿瘤进展的原因，科学家仍知之甚少。为了搞清楚中性粒细胞为何会促进肿瘤进展，又是如何促进肿瘤进展的，黄来源团队以胰腺癌为研究模型，采用单细胞转录组和具有空间分辨率的多组学方法，深入研究了胰腺癌里中性粒细胞的变化、分布及功能。从单细胞RNA测序（scRNAseq）结果来看，在中性粒细胞发育和循环的组织中，它有一条单一的变化轨迹。肿瘤组织中的中性粒细胞却不太一样，它们获得了独特的转录谱，并形成了三个不同的亚群（T1、T2和T3）。从转录组特征来看，T1中性粒细胞的成熟度与未成熟中性粒细胞相当，而T2中性粒细胞的成熟度与成熟中性粒细胞相当。而且T1和T2中性粒细胞沿着肿瘤特异性分支发展，并往成熟度介于T1和T2之间的T3亚群汇聚。这意味着，T3亚群可能是T1和T2分化的终期阶段。瘤内中性粒细胞的发展轨迹值得注意的是，转录组学数据还显示，T3中性粒细胞中，与缺氧、糖酵解和血管生成有关的基因（如Vegfa和Hk2等）表达上调，染色质可及性增加。而其他组织中的中性粒细胞没有这些转录组特征。基于以上研究结果，研究人员认为，浸润肿瘤的中性粒细胞无论处于哪个成熟阶段，都能被肿瘤微环境重新编程，转录和染色质的发展轨迹趋向于独特的T3状态。接下来黄来源团队评估了是否能通过蛋白质表达来区分这三个亚群。结果发现，仅需要CD101和dcTRAIL-R1这两个蛋白即可。CD101阳性属于成熟的中性粒细胞，CD101阴性属于未成熟的中性粒细胞；而免疫调节或抑制标志物dcTRAIL-R1则是T3中性粒细胞的象征。如此一来，T1中性粒细胞就是CD101和dcTRAIL-R1双阴性，T2是CD101阳性和dcTRAIL-R1阴性。基于蛋白标志物的分类方法搞清楚瘤内中性粒细胞的特征之后，就需要弄清楚它们的分布和功能了。从前面的转录组数据来看，T3中性粒细胞表现出明显的细胞应激和生存途径特征，包括对缺氧、氧化应激和糖酵解的反应。此外，T3中性粒细胞还富集了血管生成基因，包括Vegfa、Thbs1和Lgals3。黄来源团队认为，这些数据表明T3不仅适应了肿瘤环境，还具有很强的促瘤作用。从空间转录组数据来看，与T1和T2相比，T3中性粒细胞在肿瘤中糖酵解、缺氧和血管生成的高分区域（肿瘤核心的坏死区域，也是肿瘤最需要营养的区域）出现的频率更高。T3明显靠近肿瘤核心，T1和T2更多地分布在肿瘤外缘结合一开始得到转录组数据，肿瘤把T3中性粒细胞弄到核心部位的目的昭然若揭。肿瘤让被“黑化”的中性粒细胞促进核心部位长出血管，为肿瘤深处输送氧气和养料，进而促进肿瘤的生长。共注射实验证实了转录组数据得出的结论。与T1和T2相比，将T3与癌细胞共同注射到小鼠体内，更能促进肿瘤长血管。换句话说，T3中性粒细胞促进血管生成的能力最强。血管生成能力比较在了解肿瘤“黑化”中性粒细胞的时间轨迹的时候，黄来源团队发现，T3重编程在进入肿瘤时就已经开始了。而且他们还发现，入瘤后的中性粒细胞寿命可以长达135个小时（近6天），是中性粒细胞在血液中半衰期（31小时）的超4倍。值得注意的是，一旦中性粒细胞被重编程为T3中性粒细胞，即使它们摆脱了肿瘤也不会恢复原来的表型。简单来说，中性粒细胞进入肿瘤之后，肿瘤就开始重编程中性粒细胞，dcTRAIL-R1表达逐渐上调，逐渐往T3型发育。在拥有超级长寿的T3中性粒细胞之后，肿瘤会将它们安排到高度缺氧的核心区域，让T3诱导核心区域长出血管，进而达到促进肿瘤生长的目的。机制示意图在研究的最后，黄来源团队T3中性粒细胞存在的广泛性，以及临床应用价值。他们发现，肿瘤中性粒细胞的重编程在不同肿瘤类型中是一致的，T3中性粒细胞代表了终末分化的肿瘤中性粒细胞。基于来自癌症基因组图谱（TCGA）和国际癌症基因组联盟胰腺癌-澳大利亚（PACA-AU）的两个独立胰腺癌队列数据，他们还发现T3中性粒细胞特征高表达的患者总生存期（OS）较差，且不受患者性别、年龄和肿瘤分期等潜在混杂因素的影响。此外，在其他多种癌症类型中，T3中性粒细胞特征高表达也与患者的死亡风险升高有关。T3特征与不同癌症类型预后的关系总的来说，黄来源和Melissa S.F. Ng领衔的这项研究，系统地探索了肿瘤内中性粒细胞的“黑化”过程。他们发现无论是成熟还是未成熟的中性粒细胞，只要进入肿瘤就会被重编程成为T3终末态中性粒细胞，随后聚集在缺氧和高糖酵解特征的肿瘤核心区域，促进血管生成，支持肿瘤生长。这一发现让我们对中性粒细胞的促瘤作用有了更深入的认知，为靶向中性粒细胞的免疫疗法的开发提供了新思路。参考文献：[1].Rudloff MW, Zumbo P, Favret NR, et al. Hallmarks of CD8+ T cell dysfunction are established within hours of tumor antigen encounter before cell division. Nat Immunol. 2023;24(9):1527-1539. doi:10.1038/s41590-023-01578-y[2].Kirschenbaum D, Xie K, Ingelfinger F, et al. Time-resolved single-cell transcriptomics defines immune trajectories in glioblastoma. Cell. doi:10.1016/j.cell.2023.11.032[3].Ng MSF, Kwok I, Tan L, et al. Deterministic reprogramming of neutrophils within tumors. Science. 2024;383(6679):eadf6493. doi:10.1126/science.adf6493[4].Gentles AJ, Newman AM, Liu CL, et al. The prognostic landscape of genes and infiltrating immune cells across human cancers. Nat Med. 2015;21(8):938-945. doi:10.1038/nm.3909[5].Bronte V, Brandau S, Chen SH, et al. Recommendations for myeloid-derived suppressor cell nomenclature and characterization standards. Nat Commun. 2016;7:12150. doi:10.1038/ncomms12150本文作者丨BioTalker