KEAP1

本文为转化医学网原创，转载请注明出处 作者：Jerry导读：AURKA是肿瘤治疗的既定靶点; 然而，其抑制剂在临床试验中的疗效受到不同肿瘤亚型缓解率差异的阻碍。3月23日，中山大学研究团队在期刊《Cell Death&Disease》上发表了研究论文，题为“AURKA emerges as a vulnerable target for KEAP1-deficient non-small cell lung cancer by activation of asparagine synthesis”。本研究中，研究人员证明了AURKA调节氨基酸合成，使其成为KEAP1缺陷非小细胞肺癌(NSCLC)的脆弱靶点。从机制上讲，AURKA与eIF2α激酶GCN2相互作用，并保持其磷酸化，以调节eIF2α-ATF4介导的氨基酸生物合成。AURKA抑制抑制了天冬酰胺合成酶(ASNS)的表达，使得KEAP1-缺陷的NSCLC细胞易受AURKA抑制剂的影响，其中ASNS高表达。本研究揭示了AURKA在氨基酸代谢中的关键作用，并确定了AURKA抑制剂的特定代谢适应症。这些发现还为KEAP1-突变/缺陷NSCLC提供了新的临床治疗靶点，该疾病的特点是对放疗、化疗和靶向治疗具有耐药性。https://www.nature.com/articles/s41419-024-06577-x#Sec9研究背景 01 Aurora kinase A (AURKA)是一种重要的有丝分裂激酶，它的激活在多种癌症中发挥重要作用。前期研究发现，AURKA在乳腺癌中的高表达促进了细胞增殖、侵袭、干性及化疗耐药。此外，AURKA在非小细胞肺癌(NSCLC)中也显著上调，并与不良预后相关。抑制AURKA会导致纺锤体形成异常和有丝分裂缺陷，最终导致肿瘤细胞死亡。目前已有几种AURKA抑制剂，包括阿立塞替(MLN8237)、达努塞替和ENMD-2076，在多种肿瘤类型中均有一定的抗肿瘤效果。然而，MLN8237在复发性外周T细胞淋巴瘤中的III期临床试验被宣告失败，与对照化疗药物相比未显示出生存优势。因此，AURKA抑制剂的临床应用面临停滞。研究进展 02 为了确定AURKA抑制剂的代谢适应性，研究人员使用代谢文库在肺癌和乳腺癌细胞中进行了CRISPR/Cas9筛选。为了验证KEAP1突变或缺陷对AURKA抑制剂的增敏作用，研究人员首先在癌症药物敏感性基因组学数据库GDSC中分析了具有野生型或突变型KEAP1的NSCLC细胞系对AURKA抑制剂的敏感性。随后，研究人员选择了KEAP1野生型NSCLC细胞株H1975、H3122、H1650和KEAP1突变型NSCLC细胞株H2122(F211C)、HCC44(A170-R204del)进行进一步验证，使用CCK8实验检测这些细胞株在不同浓度MLN8237下的细胞活力，也证实了KEAP1突变使NSCLC细胞对MLN8237敏感。此外，研究人员在KEAP1野生型NSCLC细胞株H1975和H3122中敲低KEAP1后进行了克隆形成实验，观察到这两个细胞株对AURKA抑制剂的敏感性显著增强。在MDA-MB-231细胞中也获得了类似的结果。最后，使用H1975野生型和KEAP1-敲低细胞在裸鼠皮下成瘤实验中进一步证实了KEAP1敲低后NSCLC细胞对AURKA抑制剂MLN8237的敏感性显著增强。为了研究NRF2的激活是否介导了KEAP1的敲低对AURKA抑制剂的增敏作用，我们在KEAP1缺陷细胞中敲低了NRF2。克隆形成结果证实了NRF2的敲低对KEAP1的敲低对AURKA抑制剂的增敏作用的缓解作用。此外，在KEAP1突变细胞系HCC44(KEAP1-F211C)中敲低NRF2显著降低了细胞对AURKA抑制剂的敏感性。总之，KEAP1缺陷增强了NSCLC细胞对AURKA抑制的敏感性，并且这种作用依赖于NRF2通路的激活。KEAP1缺陷通过NRF2激活使NSCLC细胞对AURKA抑制敏感研究结论 03在本研究中，研究人员采用CRISPR代谢筛选技术，发现了携带代谢相关基因突变的特定肿瘤亚型对AURKA抑制剂MLN8237表现出敏感性。研究结果表明，MLN8237对KEAP1突变或缺陷的肿瘤细胞的生长抑制效果尤为显著。此外，研究人员阐明了AURKA的抑制下调了天冬酰胺的合成，从而增强了KEAP1缺陷的NSCLC对MLN8237的敏感性。因此，本研究揭示了KEAP1突变或缺陷肿瘤的一个有前途的药物靶点，并探索了AURKA抑制剂的新型临床应用。参考资料：https://www.nature.com/articles/s41419-024-06577-x#Sec9声明：发表/转载本文仅仅是出于传播信息的需要，并不意味着代表本公众号观点或证实其内容的真实性。据此内容作出的任何判断，后果自负。若有侵权，告知必删！长按关注本公众号   粉丝群/投稿/授权/广告等请联系公众号助手 觉得本文好看，请点这里↓

引言通过小分子激活Nrf2是治疗绝经后骨质疏松症的一种很有前途的策略。然而，目前还没有批准用于治疗慢性疾病的Nrf2激活剂，Nrf2调控破骨细胞分化的下游机制尚不清楚。2024年4月2日，华中科技大学李锋及宋科翰共同通讯在Cell Metabolism 在线发表题为“A clinical-stage Nrf2 activator suppresses osteoclast differentiation via the iron-ornithine axis”的研究论文，该研究表明bitopertin，一种临床阶段的甘氨酸摄取抑制剂，通过激活Nrf2抑制破骨细胞分化并改善卵巢切除术诱导的骨质流失。从机制上讲，bitopertin与Keap1 Kelch结构域相互作用，减少Keap1-Nrf2结合，导致Nrf2泛素化和降解减少。在小鼠和人类受试者中，与临床批准的Nrf2激活剂相比，Bitopertin与更少的不良事件相关。此外，Nrf2转录激活铁转运蛋白编码基因Slc40a1，以降低破骨细胞内的铁水平。Nrf2缺失或补铁上调鸟氨酸代谢酶Odc1，从而降低鸟氨酸水平，从而促进破骨细胞分化。总之，该研究确定了一种新的临床阶段Nrf2激活剂，并提出了破骨细胞中一种新的Nrf2-铁-鸟氨酸代谢轴。绝经后骨质疏松症是在缺乏雌激素的情况下由破骨细胞过度活化引起的代谢紊乱。骨密度(BMD)的降低使患者髋部或椎体脆性骨折的风险增加，在全球范围内造成严重的残疾和社会经济负担破骨细胞在巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)和核因子kB配体受体激活剂(RANKL)的刺激下向骨髓源性巨噬细胞(bmdm)分化。用双膦酸盐化合物靶向破骨细胞是治疗骨质疏松症的主流策略。然而，严重的不良反应和较差的依从性是许多患者标准化双膦酸盐治疗的障碍，导致骨质疏松症治疗不足需要发现新的治疗靶点，以确保对这些患者提供更好的护理。核因子E2相关因子2 (Nrf2)是一种氧化还原相关的转录因子，其激活可通过抑制破骨细胞分化来改善绝经后骨质疏松症。在非胁迫条件下，Nrf2被Keap1隔离在细胞质中，并被Cul3泛素连接酶泛素化，用于蛋白酶体降解在氧化应激过程中，Nrf2与Keap1分离并易位到细胞核，激活多种参与细胞抗氧化反应的细胞保护基因。这些基因的Nrf2结合位点被称为抗氧化反应元件(AREs)由于具有细胞保护作用，已经发现了许多Nrf2激活因子。然而，它们中的大多数是亲电性和间接Nrf2激活剂，共价靶向KEAP1中的半胱氨酸151，其中只有两种被批准用于临床使用，即延胡索酸二甲酯(DMF)用于治疗复发型多发性硬化症和omaveloxolone (OMA)用于治疗弗里德赖希共济失调。除Keap1外，这些亲电Nrf2激活因子还与其他关键酶或蛋白质的半胱氨酸残基相互作用并影响其功能，导致“脱靶”和毒性作用。在人类中，在临床试验中，间接Nrf2激活剂与高不良事件发生率相关另一种策略是找到Keap1-Nrf2相互作用的直接抑制剂来选择性激活Nrf2。然而，直接Nrf2激活剂通常分子大小较大，这降低了其进入中枢神经系统治疗相关疾病的能力，目前尚无临床批准的直接Nrf2激活剂。因此，开发更安全、更有效的Nrf2激活剂用于临床仍然是一个挑战。模式图（Credit: Cell Metabolism）Bitopertin是一种口服、临床甘氨酸转运蛋白1 (Glyt1)抑制剂，最初用于治疗精神分裂症。最近，bitopertin被FDA授予孤儿药资格，用于治疗红细胞生成性卟啉原症(EPP)，这是一种罕见的、使人衰弱的、潜在威胁生命的血液疾病。bitopertin治疗EPP的疗效正在两项正在进行的2期临床试验AURORA (NCT05308472)和BEACON (ACTRN12622000799752)中进行评估bitopertin的潜在临床应用是基于其限制甘氨酸摄取的作用。有趣的是，骨质疏松症患者的血清甘氨酸水平明显高于骨密度正常的患者。另一项研究显示，甘氨酸支持谷胱甘肽的形成，并有助于脂多糖刺激后BMDMs中白细胞介素(IL)-1β的产生，表明甘氨酸具有促炎作用。然而，目前尚不清楚甘氨酸水平升高是否与骨质疏松症有因果关系，以及甘氨酸是否影响BMDMs向破骨细胞的分化。该研究发现bitopertin，而不是甘氨酸补充剂，通过Nrf2激活改善卵巢切除术(OVX)诱导的骨质疏松症。在机制上，bitopertin与Kelch结构域相互作用，减少Keap1-Nrf2相互作用，减少Nrf2降解。与现有的临床Nrf2激活剂相比，Bitoeprtin在人类受试者中更安全，与更少的不良事件相关。更重要的是，该研究发现了一个新的Nrf2 -铁-鸟氨酸代谢轴在破骨细胞分化。该研究结果表明，bitopertin在治疗骨质疏松症中具有先前未被认识到的治疗作用，并有助于阐明Nrf2对破骨细胞作用的分子机制。原文链接https://www.cell.com/cell-metabolism/abstract/S1550-4131(24)00084-6责编|探索君排版|探索君文章来源|“iNature”End往期精选围观一文读透细胞死亡(Cell Death) | 24年Cell重磅综述（长文收藏版）热文Nature | 破除传统：为何我们需要重新思考肿瘤的命名方式热文Nature | 2024年值得关注的七项技术热文Nature | 自身免疫性疾病能被治愈吗？科学家们终于看到了希望热文CRISPR技术进化史 | 24年Cell综述

什么是抗氧化肽低浓度的自由基在各种人体生物功能中起着至关重要的作用，包括凋亡和蛋白质磷酸化过程。然而，在人体内过多的自由基往往与阿尔茨海默病、癌症和其他慢性疾病等疾病有关。因此，发现安全、高效且易得的抗氧化剂以预防自由基对细胞的有害影响或减轻其负面影响至关重要。抗氧化肽是一种具有特殊结构的蛋白质片段，它们在体内可以帮助对抗氧化应激。抗氧化肽可以帮助中和这些自由基，减少它们对细胞的损伤，从而保护身体免受疾病和衰老的影响。挑战与方法然而，材料准备、蛋白质提取、水解、纯化和鉴定抗氧化肽可能是一项耗时且很有难度的任务。由Olsen等人收集的数据表明，目前仅存在696种天然来源的抗氧化肽。这说明抗氧化肽化学空间很大，而且还有很大的空间等待我们去探索。为了解决这一问题，机器学习模型提供了一种可以替代传统方法的途径，用于快速发现具有作者所期望的功能的抗氧化肽。在这项研究中，作者首次开发了基于递归神经网络（RNNs）的生成模型，用于新型AOPs的从头设计。考虑到抗氧化剂数据集中仅有696个独特序列，是一个相对较小的数据集，用它做从头开始训练的生成模型是不切实际的。由于抗氧化肽与Specht等人编制的肽序列数据集之间关键氨基酸分布具有相似性。所以，作者使用了该肽序列数据集训练了RNN模型。图1：用于抗氧化肽设计的传统和从头生成方法流程图2：用于抗氧化肽设计的机器学习方法的流程图从头抗氧化肽设计的概述图。(a) 基础（预训练）生成模型。(b) 用于预测 AOP 的微调模型。(c) 用于预测生成序列的抗氧化活性的分类模型。根据五重分类评估开发了五个模型。(d) 从微调模型中生成了最多 8 个氨基酸的 5 万条肽序列。(e) 根据生成的肽的新颖性和独特性对其进行过滤。(f)使用抗氧化剂分类模型过滤剩余生成的肽，并基于所有五个分类模型的输出概率将结果与0.99或更大的阈值相交。(g) 两个肽毒性预测网络服务器在 122 个剩余肽序列上的交集。(h) 使用 Levenshtein 距离对剩余序列进行聚类，并选择每个聚类的质心数据点。(i)对12个肽进行DFT计算，并根据其性质选择6个肽。(j) 实施 DPPH 清除测定。(l)实施羟基清除测定。(k)实施溶血测定。随后，作者采用迁移学习来对作者的模型进行微调，特别是用于生成AOPs。从微调模型获得的所有数据都经过分类，以确定其清除活性。这种分类依赖于一个训练有关抗氧化剂数据集的模型，以及从两个不同服务器评估其毒性。经过这一严格的过滤过程，编制了最终的肽列表。这些肽进一步通过对其序列进行聚类分析，并选择质心肽进行后续研究。密度泛函理论（DFT）计算被用来评估分子属性，包括最高占据分子轨道（HOMO）、最低未占据分子轨道（LUMO）和HOMO–LUMO能隙。这些参数作为本研究中肽抗氧化剂排序的标准。根据这些计算参数，作者选择了六种肽作为进一步调查的候选物。随后，作者通过合成和测试所选择的肽，证明了通过2,2-联苯基-1-苯基肼（DPPH）、羟基和溶血试验，作者将能够识别非溶血性AOPs。所有实施的过程如图2所示。在追求强大的抗氧化肽的过程中，作者采用了多方面的策略，以发现生成的肽是否能够同时展现出抗氧化清除活性并通过利用分子动力学（MD）模拟抑制Keap1蛋白。Keap1-Nrf2蛋白相互作用（PPI）在调节Nrf2方面起着关键作用，Nrf2是一种转录因子，通过控制含有200多个抗氧化反应元件（ARE）的基因的转录来保护细胞免受氧化应激的影响。Keap1与Cullin3-RBX1复合物结合在一起，通过细胞负向结合，促进其泛素化和蛋白质体降解，从而对Nrf2起到负调控作用。氧化应激是各种病理状况的主要促发因素，突显了打破Nrf2/Keap1 PPI的重要性。结论该研究应用机器学习模型进行抗氧化肽（AOPs）的全新设计，并通过优化的生成模型生成了十二个新颖的AOP序列。通过DFT计算，基于它们的EHOMO和Eg对生成的肽进行排名，以识别最有希望用于合成的肽。其中，具有EHOMO为-4.92 eV的GP12肽被认为是一种强大的电子供体，表明其具有卓越的抗氧化性质。为了评估这些肽的抗氧化能力和抗溶血活性，作者合成了EHOMO最高的三种肽（GP9、GP10和GP12）以及另外三种随机选择的肽。结果显示，在六种合成肽中有三种（GP9、GP10和GP12）的抗氧化活性达到了抗坏血酸的水平，并且具有非溶血性质。在计算机生成的肽GP1-GP12存在的情况下，蛋白质的RMSF和FES分析显示不同的序列会引起蛋白质的显著结构变化，影响其稳定性和灵活性。基于MD模拟和抗氧化试验的结果和观察，GP12表现出最佳结果，值得进一步分析其在体外和体内抗氧化活性及对Keap1的活性。可以肯定地说，机器学习方法结合DFT计算和MD分析适用于在未来的前景中自动化肽的设计，无需提取、纯化、合成和测试大量的肽。然而，正如结果所显示的那样，该模型无法为羟基清除试验生成活性的AOPs。由于目前缺乏用可以于评估每种抗氧化剂活性特定测试方法的信息，对创建具有特定活性的抗氧化肽造成了限制。为了解决这些问题，有必要对当前数据集中的所有肽进行高通量筛选，利用特定和固定的抗氧化活性测定方法，如DPPH、羟基和ROS活性来进行筛选。这样不仅可以丰富数据集，还可以全面了解序列中氨基酸之间的相互关系。参考资料：Hesamzadeh, P., Seif, A., Mahmoudzadeh, K. et al. De novo antioxidant peptide design via machine learning and DFT studies. Sci Rep 14, 6473 (2024). https://doi.org/10.1038/s41598-024-57247-z版权信息本文系AIDD Pro接受的外部投稿，文中所述观点仅代表作者本人观点，不代表AIDD Pro平台，如您发现发布内容有任何版权侵扰或者其他信息错误解读，请及时联系AIDD Pro (请添加微信号sixiali_fox59)进行删改处理。本文为原创内容，未经授权禁止转载，授权后转载亦需注明出处。有问题可发邮件至sixiali@stonewise.cn关注我，更多资讯早知道↓↓↓