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研发进展推介、博士后招聘联系公众号（备注：单位+姓名） 2024年3月18日，李志裕教授等人在Journal of Medicinal Chemistry 上发表了题为Structure-Guided Discovery of Potent and Selective CLK2 Inhibitors for the Treatment of Knee Osteoarthritis的文章，在这篇文章中，作者等人设计并合成了一系列高效的基于吲唑类化合物的CLK2抑制剂，其中化合物LQ23对CLK2的抑制活性高于先导化合物(IC50=1.4 nM)，具有较高的CLK2/CLK3选择性(>70倍)。此外，LQ23在体内外均有显著的抗骨关节炎作用，其作用机制可能是通过抑制CLK2/Wnt信号通路，降低炎症细胞因子，下调软骨降解酶，增加关节软骨。总体而言，这些数据支持LQ23作为膝关节内OA治疗的潜在候选者，利用其独特的作用机制进行靶向治疗。骨关节炎是一种典型的退行性疾病，传统上具有不同的病因，但具有相似的生物学、形态学和临床特征。在各种类型的骨性关节炎中，膝关节骨性关节炎的发病率尤其高。骨性关节炎的疼痛和残疾严重影响患者的生活质量，已成为当今社会严重的社会和经济负担之一。目前，骨性关节炎的治疗相对有限，主要集中在抗炎药物上。然而，消炎药并不能修复软骨。因此，对治疗疾病的骨性关节炎药物(DMOADs)的需求尚未得到满足。DMOADs不仅具有抗炎作用，还可通过促进软骨细胞再生和抑制软骨分解代谢来减轻软骨损伤。研究表明Wnt信号在骨性关节炎发病机制中的核心作用，许多与Wnt途径相关的新的生物学过程和靶点已被发现。在这些靶点中，酪氨酸和丝氨酸/苏氨酸激酶CLKs被报道通过调节细胞内信号来调节Wnt途径。基于CLK2在退行性疾病和肿瘤中的重要作用，研究机构相继设计了许多不同类型的CLK2抑制剂。目前，有五种药物正在进行临床试验，用于治疗退行性疾病和肿瘤。2018年，J.Kallen的团队报告了一系列有效的吲唑类CLK抑制剂的发现。确定了吲唑1是一种高效的吲唑CLK抑制剂，作为先导化合物。随后，作者等人引入了芳香族乙炔基团，合成了一系列新型的CLK2抑制剂。在这些抑制剂中，LQ23(CLK2，IC50=1.4 nM)表现出显著的CLK2抑制活性。并且LQ23对CLK1/2/4(CLK1，IC50=2.1 nM；CLK2，IC50=1.4 nM；CLK4，IC50=3.2 nM)显示出更高的抑制效力。此外，LQ23对CLK2的选择性高于CLK3(IC50>100 nm)。随后作者等人进一步证实LQ23对蛋白激酶的选择性，结果表明化合物LQ23是一种很好的选择性CLK2抑制剂。（图1）图1 (A)化合物LQ23对CLK2、CLK3和DYRK1A的抑制活性。(B) pSRSF4、pSRSF5和pSRSF6在二甲亚砜(DMSO)或Lorecivivint (30 nM)或LQ23(10、30和100 nM)处理1小时后的蛋白表达情况。(C) pSRSF4、pSRSF5和pSRSF6在转染靶向CLK2的siRNA的软骨细胞中的蛋白表达情况接下来，作者等人评估了LQ23在体外诱导软骨细胞早期分化的能力。据报道，转化生长因子β3可刺激骨髓间充质干细胞分化为高度特异的软骨细胞。结果表明LQ23可诱导骨髓间充质干细胞分化为软骨细胞样细胞(图2A)。此外，在单层条件下用LQ23处理14天的BMSCs表明软骨细胞正在分化，这是由成熟软骨细胞特异性蛋白(II型胶原，Col IIA)的存在支持的(图2B)。提示LQ23可促进BMSCs向软骨细胞分化。图2 LQ23诱导骨髓间充质干细胞的软骨细胞分化。(A)骨髓间质干细胞(用30 nM LQ23或DMSO或20 ng/mL TGF β3处理14天)用甲苯胺蓝和阿利新蓝染色。(B)骨髓间充质干细胞(用30 nM LQ23或DMSO或20 ng/mL TGF β3处理14天)用Col IIA染色，显示成熟软骨细胞除促进软骨再生外，骨性关节炎的长期疾病治疗还需要抑制软骨的降解。因此，作者等人还评估了LQ23对软骨细胞和骨髓间充质干细胞在病理生理条件下的分解代谢的影响。当肿瘤坏死因子TNF-α(20 ng/m L)和肿瘤抑素M(OM，10 ng/m L)处理时，软骨细胞和骨髓间充质干细胞MMP3、MMP13和ADAMTS5的基因表达上调(图3A，B)。LQ23(30 NM)可显著抑制细胞因子诱导的基质降解酶的表达，包括MMP3、MMP13和ADAMTS5(图3A，B)，其效力与Lorecivivint(30 nM)相似或提高。LQ23治疗组与模型组比较，NO释放量明显减少。提示LQ23在体外对软骨降解有抑制作用。图3 LQ23保护软骨细胞和骨髓间充质干细胞免受体外分解代谢破坏。细胞因子TNF-α (20 ng/mL)和Oncostatin M (10 ng/mL)刺激软骨细胞和骨髓间充质干细胞，DMSO或Lorecivivint (30 nM)或LQ23 (30 nM)处理72 h如图4所示，LQ23和Lorecivivint均能有效抑制肿瘤坏死因子TNF-α、IL-6和IL-β在TNF-α和OM刺激的软骨细胞中的表达。同时，LQ23的抑制作用与siCLK2一致。体外实验表明，LQ23具有与Lorecivivint相当的抗炎活性。随后，在TNF-α和OM刺激的软骨细胞中，观察了LQ23对STAT3的影响。当用TNF-α和OM处理软骨细胞时，Western Blot检测到STAT3的磷酸化水平显著升高(图5)，而LQ23则呈剂量依赖性地抑制STAT3的磷酸化。提示LQ23具有较强的体外抗炎作用。图4 LQ23抑制软骨细胞的炎症反应。用细胞因子TNF-α (20 ng/mL)和Oncostatin M (10 ng/mL)刺激软骨细胞，用DMSO或Lorecivivint (30 nM)或LQ23 (30 nM)处理48 h。用qRT-PCR检测细胞因子(TNF-α、IL-6和IL-1β)的基因表达图5 LQ23剂量依赖性地抑制TNF-α和OM刺激的软骨细胞中STAT3磷酸化。(A) Western blot检测TNF-α和OM刺激软骨细胞中磷酸化和总STAT3蛋白表达水平。(B)通过三次独立实验定量测定pSTAT3和STAT3的比例半月板损伤常见于膝关节骨性关节炎的MRI图像，可导致膝关节骨性关节炎。然而，修复半月板损伤的努力在很大程度上并不成功，也未能阻止导致膝关节骨性关节炎的退行性改变的进展。在大鼠炎性半月板损伤模型和大鼠前交叉韧带切断内侧半月板部分切除(ACLT+pMMx)模型上，采用生化和组织病理学方法观察LQ23对软骨再生和保护的影响。MIA可引起局部炎症、软骨退变和关节疼痛增加，或LQ23(1.5μg/kg，单次IA注射)可降低血浆中炎症细胞因子(TNF-α、IL-6和IL-1β)水平和软骨中分解代谢酶(MMP3、MMP13和ADAMTS5)水平。此外，与OA疾病严重程度相关的循环COMP水平在LQ23治疗的大鼠中自治疗后第11天起显著降低。LQ23在治疗后28天仍有效(图6A，B)。第28天苏木精-伊红(H&E)染色显示，LQ23治疗组关节形态明显改善。经LQ23治疗后，关节软骨表面光滑，细胞排列更规则，滑膜厚度减少，股骨与胫骨间隙增大(图6C)。而Lorecivivint或LQ23治疗显著降低了光镜下软骨检测评价标准OARSI评分51(图6D)，提示LQ23抑制炎症，保护软骨。图6 LQ23在碘乙酸钠(MIA)诱导的大鼠膝关节OA模型中抑制炎症，保护软骨，改善功能。注射mia的大鼠经IA注射给药后，分别给药整车或Lorecivivint (1.5μg/kg)或LQ23 (1.5μg/kg)。软骨和血浆分别于第11天和第28天采集综上所述， CLK2是开发DMOAD药物的一个与Wnt途径相关的有前景的靶点。作者团队发现了一系列新的化合物，确定了具有代表性的化合物LQ23，该化合物对CLK2具有较强的抑制活性，IC50为1.4 nM，且比CLK3具有更高的选择性。LQ23还可诱导BMSCs向软骨细胞分化。在体外，LQ23还能降低细胞因子诱导的NO生成和体内循环COMP水平，这表明LQ23可以预防OA病理条件下的基质分解。体内药代动力学数据和受试化合物在体外人体细胞中的有效性证明了LQ23的药物设计理论是合理的。这些发现强调了LQ23作为一种小分子潜在的DMOAD的前景，用于膝骨性关节炎的有效治疗。原文链接：https://doi.org/10.1021/acs.jmedchem.3c02092声明：发表/转载本文仅仅是出于传播信息的需要，并不意味着代表本公众号观点或证实其内容的真实性。据此内容作出的任何判断，后果自负。若有侵权，告知必删！长按关注本公众号   粉丝群/投稿/授权/广告等请联系公众号助手 觉得本文好看，请点这里↓