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2022年期间，关于Fragment to lead 的研究得到了广泛的关注，并产生了许多重要的出版物。其中18 篇文章介绍了已成功片段的先导研究，包括三个临床化合物（MTRX1719、MK-8189 和 BI-823911）的开发。Andrew J. Woodhead等人以表格形式总结了2022年发表的基于片段的药物发现的相关文章，并讨论了其在2015-2022年的综合案例的特征，如靶点类别、筛选方法和配体效率，跟踪该领域进展。引言基于片段的药物发现（FBDD）是目前研究药物靶点和鉴定多类靶点先导化合物的一种行之有效的方法。FBDD 大致包括两个步骤：(1) 使用检测弱亲和力的优化技术筛选低分子量、低复杂度分子（"片段"）库（产生 "命中"）；(2) 通常在结构和计算方法的指导下进行合理设计，以优化这些命中，从而提高药效和分子特性（产生 "先导"）。迄今为止，FBDD 已开发出 7 种已获批准的药物，50 多种片段衍生化合物已进入临床开发阶段，其中 40% 已获批准或正在进行试验（表 1）。表 1. 片段衍生的已获批准药物和 2、3 期临床开发化合物作者根据以下标准对所收到的文章进行了评估，符合标准的例子见表 2：命中片段的分子量 (MW) < 300。所发现的片段来自筛选（如生物测定、生物物理方法、X 射线、虚拟筛选或它们的任何组合）或已知配体的解构。先导物的效力/亲和力等于或优于 2 μM。从片段到先导物的效力/亲和力至少提高 100 倍。文章的发表日期（根据主要引文定义）在 2022 日历年内。表 2. 2022 年片段转化为先导药物的论文概览目标靶点类别下图1显示了 "F2L视角 "每年的目标类别分布情况（以及所有八年的总分布情况）。迄今为止，共有198个目标类别，其中最普遍的目标类别分别是其他酶（70个）、激酶（49个）和其他蛋白质-蛋白质相互作用（PPIs）（30个）。2022 年，PPIs 和非激酶或蛋白酶类是最大的类别（合计占 80%），与往年相比，溴链（6%）、激酶（5%）和其他（5%）只占很小的比例。图 1. 成功的 F2L 案例研究针对的蛋白质类别Kinases激酶Kinases历来占总分布的四分之一。今年的减少可能是由于数据集较小，存在自然变异。以前在文献中报道过的与蛋白激酶 A（PKA）已知实验结合模式的片段被用作模板，利用 Enamine REAL 数据库构建和对接枚举库。在一个优化周期内，后续合成得到的先导化合物的效力提高了 13,500 倍。这种趋势是否会持续下去，我们拭目以待。GPCR表 2 中没有 G 蛋白偶联受体（GPCR）的例子，不过，也有一些不完全符合标准的例子值得一提。其中一个例子是，Shepherd 等人利用表面等离子体共振（SPR）筛选技术确定了一系列腺苷受体家族成员的片段结合亲和力，并开展了后续工作以评估其功能后果。在第二项研究中，对 5HT2A 受体进行了筛选，确定了低 μM 大小的片段，并将其进一步优化到 100 nM 以下，从而以微弱差距未达到表 2 的纳入标准。Proteases蛋白酶抑制剂Proteases占11%，而2021年为0%（但与8%的总平均值一致）。有趣的是，这两个条目（2 和 3）都采用了虚拟筛选的方法来寻找新药，与蛋白激酶 A 的例子类似，这或许说明了人们对这类酶的结合了解的越来越多。具体来说，HIV-1蛋白酶几十年来一直是药物治疗的靶点，而SARS CoV-2 Mpro也受到了广泛关注，这导致了针对这种病毒蛋白酶的药物Paxlovid的快速发展。Other Enzymes其他酶的抑制剂占比44%，略高于全球平均水平（35%）。表 2 的这一部分包括两个临床候选药物：MRTX1719（条目 6），针对 PRMT5 的一种非活性形式，其先导化合物的效力比起始片段高出 8 个数量级；MK-8189（条目 10），是一种磷酸二酯酶 10 A 抑制剂。条目 4 描述了将一个命中片段的特征与一个相关分子合并，从而产生了一种针对 NDM-1 和其他金属-β-内酰胺酶的先导化合物。苯基吡唑[等温滴定量热法（ITC）测定的 Kd = 2.88 mM]，通过结构引导优化，该片段被优化为 3.6 μM 的先导物，配体效率大大提高。PPIs2022年，在PPI领域有几个值得一提的例子。Shishodia 及其合作者描述了针对 PBRM1-BD2 的 2000 个片段的蛋白质检测 NMR 筛选，并将结合最紧密的片段系列优化为具有选择性、细胞活性的化学探针。第二个值得注意是开发了调控枢纽蛋白14-3-3 的 PPI 稳定剂。利用时间分辨 FRET 分析法，研究人员确定了一种能增强 14-3-3 二聚化并导致蛋白结合增加的药物。迄今为止，大多数实例都是 PPI 抑制剂，而 Venetoclax 的开发是一个重要的片段衍生成功案例（表 1）。稳定与生理相关的 PPI 或诱导新的 PPI 与泛素连接酶系统的成分构成了靶向蛋白质降解的基础。Covalent Inhibitors2022年发表的不符合表2标准的其他基于片段的论文采用了共价方法。St. Denis 等人描述了一个亲电片段库的设计，该库利用 X 射线晶体学筛选法针对 ERK2 进行筛选。发现了多个以 ATP 结合位点附近的 Cys166 为靶点的片段，并对其中一个片段进行了优化，以产生低 μM 的先导物。Yoshimori 等人开发了一种生成式人工智能模型（DeepSARM），用于开发共价激酶抑制剂，并以酪氨酸激酶（BTK）为例，对新设计的配体进行评估。13 和 16 强调了 FBDD 在共价药物发现中的持续应用（13，图 2），针对 KRASG12C，从一个非共价片段开始，在引入亲电子体之前最大化非共价相互作用。图 2. 针对 KRASG12C（表 2 中的13）的片段-引线优化。通过蛋白质观察核磁共振筛选确定了一个非共价片段。在加入共价弹头之前进行了结构指导优化。片段筛查方法图 4 显示了表 2 中列出的 F2L 活动中使用的筛查方法，并将其与往年和所有分析年份的总数进行了比较。此外，研究人员还能针对 PRMT5-SAM 进行 SPR 反筛选，以确认这些片段能如愿与 PRMT5-MTA 发生优先结合。图 4：（A）过去 8 年成功的 F2L 案例研究中使用的碎片筛选技术。(B) 饼图按 2022 栏所占百分比分列。2022 年的几项研究报告了很有前景的新片段筛选技术，这些技术可以发现新靶点，但没有进行大量的靶点优化工作，因此不符合表 2 的收录标准。有趣的例子有：利用DNA编码片段的光激活共价捕获（PAC-FragmentDEL）发现针对PAK4和2-表聚酶的靶点；纳米液体毛细管色谱法鉴定乙酰胆碱酯酶抑制剂；利用多肽荧光探针进行溶解变色蛋白结合测定；利用本机质谱鉴定破坏HSP90-HOP蛋白-蛋白相互作用的片段。寻找命中策略在研究14中，生化检测、热熔融和 SPR 被结合使用，虽然这些技术之间的重叠程度很低，但研究人员认为，应用正交检测可以最大限度地降低漏检的风险，这些漏检的结果随后会被纳入 X 射线晶体学进行结构指导优化。马丁等人在一篇论文中也提到了正交技术的使用，他们认为通过 "三角测量 "的方法可以最好地实现新药的验证和优先排序，相比之下，项目 1 采用的是 "晶体结构优先 "策略，而不是对片段进行任何预筛选。他们最初发现的是与 PKA 结合的弱片段的 X 射线晶体结构，然后利用这些晶体结构进行虚拟筛选，以确定类似先导化合物。片段库FBDD 的一个重要因素是设计合适的片段库。片段库的规模从 100 个到 13 000 个片段不等，规模较大的片段库通常通过核磁共振进行筛选。Enamine Real 和药明康德 GalaXi 等超大型枚举化学库的出现，已成为药物发现界进行初筛、跟踪和虚拟筛选的宝贵资源；预计其使用量在未来几年将显著增加。还有一类是使用虚拟化合物作为主要筛选来源的作品。今年，使用这种方法的作品数量有所增加（2022 年为 13%，而历史平均水平为 8%），分别筛选了 350 万、2.35 亿和 1.28 万个片段。片段优化片段的确定只是优化过程的开始。要将片段进化成更强效的先导分子往往非常具有挑战性。大约 50% 的实例报告了虚拟筛选或对接协议的使用，使用物理学的计算方法进行片段优化也未来可期。如相对自由能扰动和绝对自由能扰动（FEP），尤其是在与实验得出的结构信息相结合时。这些技术已成功应用于后期的 "从先导到先导"（hit-to-lead）和 "先导优化"（lead optimization）计划中；然而，片段的挑战依然存在。在分子动力学模拟过程中，片段大小的化合物的结合模式并不能保证保持不变。总结2022年，FBDD领域取得了一些显著成就，包括针对突变型KRAS的非共价命中物优化、针对RNA靶点的片段筛选和优化以及利用片段筛选整个SARS-Cov-2蛋白质组。FBDD 已开始用于 PPI 稳定化和靶向蛋白降解（PAK1 降解剂）；预计这一趋势将继续下去。未来 FBDD 的发展领域可能是利用 DNA 编码的定点文库进行快速片段命中跟踪，以及将低温电子显微镜用于 FBDD 以实现新的靶标类别。我们期待着这一领域的发展以及 FBDD 在为患者提供小分子疗法方面的持续影响。参考文献：https://doi.org/10.1021/acs.jmedchem.3c02070声明：发表/转载本文仅仅是出于传播信息的需要，并不意味着代表本公众号观点或证实其内容的真实性。据此内容作出的任何判断，后果自负。若有侵权，告知必删！长按关注本公众号   粉丝群/投稿/授权/广告等请联系公众号助手 觉得本文好看，请点这里↓

前言抗体偶联药物（ADC）是一种强大的抗癌治疗方法，通过靶向特异性抗原的单克隆抗体与小分子细胞毒性药物通过连接子链接而成。ADC利用抗体对其靶抗原的特异性，结合细胞毒性药物的效力，选择性地杀死表达靶抗原的肿瘤细胞。兼具传统小分子化疗的强大杀伤效应及抗体药物的肿瘤靶向性。在ADC的开发中，选择在恶性细胞上高表达但在正常组织和免疫细胞上低表达的靶抗原被认为是实现选择性和效力的关键，同时最大限度地减少靶向肿瘤外毒性。除此之外，选择用于ADC的抗原需要考虑与靶抗原的表达模式和生物学特征相关的几个因素。靶抗原选择的因素在ADC中使用高效细胞毒性有效载荷需要合理的靶抗原选择，目的是最大限度地提高肿瘤选择性和抗肿瘤效力，同时最大限度地降低靶向肿瘤外剂量限制毒性。因此，在试图平衡安全性和有效性等因素的同时，尽可能地向癌细胞递送有效载荷对ADC设计至关重要。根据目前公认的原则，有效ADC的理想靶抗原应在肿瘤细胞表面以足够的密度和均匀性表达，在正常细胞上以最小的表达量表达，以限制靶向肿瘤外毒性并优化治疗指数。除了特异性和过表达外，最佳的靶抗原还需要是细胞外的，以便抗体结合抗原表位。此外，ADC疗效通常取决于有效的靶向介导内化，肿瘤抗原与ADC结合后的内化率和内化溶酶体运输动力学可能直接影响有效载荷释放和癌细胞杀伤。了解抗原靶点主要指向循环或溶酶体靶向途径也是至关重要的。抗原-ADC复合物再循环到质膜被认为会影响ADC向溶酶体的有效递送，并可能阻碍有效载荷向胞质的释放，从而损害ADC的效力。最后，影响ADC有效性的另一个因素是从细胞表面去除抗原的速率，通常由肿瘤细胞产生的蛋白酶介导，这一过程被称为抗原脱落。靶标表达水平达到ADC活性的抗原表达阈值水平根据几个参数而显著变化，其中许多参数尚未完全阐明。已知表达水平取决于特定靶点、识别的抗原表位和癌症适应症，这对于靶向实体瘤的ADC尤其明显。例如，评估Kadcyla对HER2阳性转移性乳腺癌疗效的临床经验表明，与HER2低表达亚组相比，高表达亚组的生存率更好。然而，Enhertu对HER2低表达乳腺癌患者的突出疗效表明，没有广泛适用的靶抗原表达阈值来确保ADC的疗效。在体外和体内实验中，一些HER2阴性细胞系可能仍然保持活跃的HER2信号传导，并且对抗HER2疗法敏感。这表明，由于表面表达的HER2水平较低，导致的较低水平的促肿瘤信号传导仍可能支持肿瘤生长。其它的靶点也不尽相同，例如选择仅高表达FRα靶抗原的患者组似乎与治疗益处相关。而在肾细胞癌临床研究中的ADC靶点CD70，仅观察到抗原表达水平与CD70靶向ADC敏感性之间的有限相关性。总的来说，针对ADC治疗几种癌症类型的临床前研究和临床评估表明，不存在将抗原表达水平与ADC活性相关联的总体范式。因此，需要根据经验确定每种肿瘤类型和ADC的抗原表达的理想Cut-off值。脱靶毒性ADC治疗在临床上观察到的毒性最常见是由于脱靶效应，而ADC的靶向-靶外肿瘤毒性可能受到靶抗原选择的影响。为了减轻毒性，还必须考虑靶抗原的生理作用及其发挥这一作用的机制。因此，新ADC靶标的临床前毒性研究不仅需要研究靶标在肿瘤和正常组织之间的差异表达，还需要研究靶标的生理功能，以确定潜在的毒性。例如，CD44抗体bivatuzumab与DM-1的ADC用于治疗鳞状细胞癌的I期试验报告了致命的皮肤毒性，这可能归因于健康角质形成细胞表达CD44。然而，尽管正常细胞表达靶抗原是一个值得考虑的重要因素，但它并不一定会阻碍ADC的开发和最终成功。例如，尽管TROP-2在一些正常组织中高水平表达，但Trodelvy已成功开发并获得FDA的批准，用于治疗转移性三阴性乳腺癌。这表明，对于抗TROP-2 ADC，与恶性组织相比，正常组织中抗原的表达差异可能足以避免严重的毒性。此外，也有人认为，TROP-2在正常细胞上的细胞内而非细胞表面表达，或在抗体或ADC无法接近的导管或腺上皮管腔侧等部位的表达，可能起到重要作用。抗原脱落当选择ADC靶点时，抗原的脱落率可能是一个重要的考虑因素。在基于抗体的治疗方法中，抗原脱落是指去除细胞表面表达的靶抗原，这一过程通常由蛋白酶介导，作为功能调节的一种手段。早期对免疫毒素的研究表明，抗原脱落的增加可能会减少可用于靶向和肿瘤结合的ADC的量，从而损害ADC的有效性。然而，其他使用数学和实验模型的研究表明，高抗原脱落率可能增加还是降低ADC的有效性取决于几个因素，包括ADC内吞率、ADC再循环率和通过肿瘤微环境的外渗率。例如，对于抗间皮素和抗CD25免疫毒素的相同模型表明，脱落率的增加会增加前者的效力，但会降低后者的效力。血液肿瘤的ADC靶点对于血液肿瘤，免疫谱系特异性生物标志物如CD19、CD20、CD22、CD33、BCMA和CD79在恶性血液细胞上以高水平广泛而均匀地表达，因此已被广泛探索为ADC发展的候选靶点。此外，批准的ADC的靶抗原在结合后都很容易发生内化，这也是有助于ADC疗效的一个重要特征。CD33CD33是一种67kda跨膜糖蛋白受体，是唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素（SIGLEC）家族成员，通常在正常髓系细胞上表达，由于其在AML细胞上优先过表达，是Gemtuzumab ozogamicin的靶点。CD33的胞内免疫受体酪氨酸基抑制基序（ITIM）调节CD33的内吞作用，可通过网格蛋白介导的内吞作用（CME）激活内吞作用。关于内吞效率，AML细胞中CD33的表达水平与其内吞率之间没有相关性。CD33是一种缓慢内化的抗原，此外，CD33交联并不能改善内吞作用。对GO无响应的AML患者可能与CD33受体内吞的功能低下有关。CD22CD22是一种140 kDa的跨膜糖蛋白，与CD33一样，它也是Siglec家族的成员，并与该家族共享多种结构特征。关键的区别在于CD22比CD33大得多，因为它有多个Ig结构域和ITIM/ITIM样基序。CD22的表达仅限于B细胞，CD22在各种B细胞恶性肿瘤（包括ALL）的大多数母细胞中表达水平升高。CD22通过CME进行内吞作用。类天然配体通过CD22的结构性快速内吞在细胞内积聚。这些配体在溶酶体中被分类降解，而CD22则循环回到细胞表面。此外，CD22配体诱导的内吞激活细胞内池，补充或增加细胞表面CD22的表达水平。因此，CD22对ADC具有良好的内吞特性。CD19CD19被认为是一种泛B细胞标志物，也是成熟B细胞表面多分子复合物的主要信号传导成分。CD19的表达在大多数B细胞恶性肿瘤中高度保守，此外CD19具有快速内化动力学，不会脱落到循环中，使其成为理想的ADC靶抗原。CD79bCD79b仅在未成熟和成熟的B细胞中表达，在恶性肿瘤≥80%的B细胞中过表达。CD79a和CD79b是两种非共价结合的跨膜蛋白，介导信号传导和内吞作用。对于后者，CD79a-CD79b异二聚体是控制BCR内吞的支架。BCR内吞作用主要由CME完成，并由AP-2介导。有趣的是，CD79a直接与AP-2的μ亚单位相互作用，进而激活CD79b并导致整个BCR复合物的内吞。此外，对于ADC来说，CD79a可以作为单体内化，但CD79b却不能。如果CD79b的近端膜酪氨酸（Y195）发生突变，AP-2与CD79a的结合就会被阻断，内吞也被阻断。在18%的活化B细胞样DLBCL标本中，Y195发生突变。总之，有证据表明CD79b其内吞活性依赖于整个BCR复合体的内化，而不是作为单体的内化。BCMABCMA或CD269，也称为TNFR超家族成员17，转导诱导B细胞存活和增殖的信号。BCMA的分子量仅为20.2 kDa，其配体结合的胞外区域具有“臂椅”构象，由六个CRD组成。除了多发性骨髓瘤外，BCMA还表达于许多血液系统恶性肿瘤，如霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤。然而，关于BCMA所利用的精确内吞途径的知之甚少。与内吞作用有关，唾液酸化是一种调节功能，它可能诱导BCMA利用CME发生内吞作用。CD30CD30是一种120kda跨膜糖蛋白，属于肿瘤坏死因子受体（TNFR）超家族。其细胞外部分由六个扩展构象的富含半胱氨酸的结构域（CRD）组成。CD30在活化的T细胞和B细胞以及各种淋巴肿瘤（包括霍奇金淋巴瘤和ALCL）上表达。CD30不具有内吞作用，相反，它因蛋白水解裂解而脱落，CD30的脱落由基质金属蛋白酶（MMPs）介导。脱落是CD30生物学的一个特征，高浓度的循环可溶性CD30可以作为监测肿瘤进展的血清标志物。对于ADC的疗效，升高的CD30循环水平似乎会隔离注射的ADC，从而减少能够定位于CD30阳性肿瘤部位的ADC的数量。因此，缺乏内吞作用的结果表明CD30不是理想的ADC靶点。实体瘤的ADC靶点设计用于治疗实体瘤的ADC针对一系列抗原，这些抗原通常包括可能与促肿瘤途径有关的肿瘤相关膜蛋白或受体。迄今为止，FDA批准用于治疗实体瘤的ADC靶向包括HER2、TROP2、Nectin-4、FRα和TF。HER2HER2是一种185kda跨膜糖蛋白，属于EGFR家族。HER2/neu基因的扩增是已知的人类恶性肿瘤和转移的驱动因素。由于HER2在癌症中的作用，几十年来一直被作为治疗靶点。HER2也一直是ADCs的靶点，T-DM1和T-DXT都被批准用于HER2阳性转移性乳腺癌患者。HER2的内吞存在多种机制，首先是CME，共免疫沉淀清楚的显示HER2直接与AP-2结合，此外，dynasore能完全阻断SKBR3细胞的HER2内吞作用。另外，有研究证明HER2可以利用小窝介导的内吞途径和CLIC/GEEC的内吞途径。TROP-2Trop2是一种46kDa的单体糖蛋白，具有选择性过表达、结构性内吞作用和导向溶酶体等特性，使其成为ADC的一个非常有吸引力的靶点。Trop2的内化机制与CME有关。此外，Trop2与多种配体结合，如claudin-1、claudin-7、cyclin D1和IGF1，然而，这些配体都没有证明在与Trop2结合或相互作用时被内化。因此，与正常细胞相比，Trop2在肿瘤细胞中发生的内吞作用更为强烈，这些都表明Trop2是ADC的一个很好的靶点。Nectin-4Nectin-4是一种66 kDa 的I型跨膜蛋白，其主要作用是促进细胞间的接触。Nectin-4作为ADC靶点很有吸引力，因为研究表明，它在几种肿瘤类型中过表达，但在正常成人组织中几乎不存在。目前，没有发现天然配体或mAb/ADC与nectin-4的复合物内吞的信息，但是可以借鉴nectin-4结合病原体内吞的研究。Nectin-4也是麻疹病毒的受体，研究表明，麻疹病毒通过巨胞饮作用进入MCF7、HTB-20乳腺癌和DLD-1结直肠癌细胞。病毒进入需要PAK1，相反，dynamin抑制剂Dynasore对病毒进入没有影响。此外，表达显性负性小窝蛋白的细胞并不能消除病毒的内吞作用。基于这些间接研究，nectin-4表现出病毒受体所需的强大的内吞活。TFTF（组织因子），也称为凝血活酶因子III或CD142，是一种具有促凝血活性的跨膜糖蛋白，具有与蛋白水解酶因子VIIa（FVIIa）复合诱导细胞内信号传导的能力。TF被认为通过调节细胞生存、增殖、转移和血管生成的FVIIa依赖性细胞内信号通路促进癌症进展。由于缺氧诱导的信号传导，它在各种实体瘤和肿瘤血管系统中上调。这种抗原的内化特性是开发TF靶向ADC的理想选择。此外，已报道的TF-FVIIa介导的表面TF表达诱导的机制，其中TF-FVIIa复合物的形成导致TF从高尔基体释放，然后运输到膜，导致细胞表面TF表达增强。如果这种作用可以由抗TF ADC诱导，那么这可以允许重复靶向表达TF的恶性细胞。FRαFRα（叶酸受体α）是一种膜结合代谢叶酸受体，参与叶酸的细胞内运输。一旦与叶酸结合，受体-配体复合物通过非经典的脂筏内吞机制内化。FRα在卵巢癌、乳腺癌、子宫内膜癌、间皮瘤和肺癌中高表达，而在正常细胞中几乎不表达，使得该受体非常适合ADC靶向。此外，FRα被认为通过与叶酸结合来辅助促肿瘤信号传导，诱导下游效应，如STAT3的激活、FRα的细胞内转运以作为促生长途径的转录因子，以及叶酸的细胞内运输用于DNA生物合成。小结对于ADC选择针对实体瘤和血液瘤的靶抗原，可能需要考虑几个因素：包括（1）抗原在肿瘤和健康组织中的表达程度；（2）抗原在正常细胞和肿瘤细胞中的生理功能；（3）抗原的内吞特性和内吞机制；（4）抗原是否、在何处以及如何脱落，脱落对ADC有效性的潜在影响；（5）抗原循环及其对ADC作用机制的影响。深入了解靶抗原的这些属性，并且仔细考量抗原的选择可能如何影响ADC性能的其他方面，将有助于我们设计用于治疗实体瘤和血液瘤临床安全、有效的最佳ADC。参考文献：1.Target Antigen Attributes and Their Contributions to Clinically Approved Antibody-Drug Conjugates (ADCs) in Haematopoietic and Solid Cancers. Cancers (Basel).2023 Mar; 15(6): 1845.2. Impact of EndocytosisMechanisms for the Receptors Targeted by the Currently Approved Antibody-DrugConjugates (ADCs)—A Necessity for Future ADC Research and Development. Pharmaceuticals(Basel). 2021 Jul; 14(7): 674.封面图来源：123rf【回顾】首届诺和诺德中国研发日：畅想没有严重慢性疾病的未来决赛落幕！2家中国早期初创药企，站上了「星」的起点DRUGTIMES点击在看 共济新药研发浪潮

点击上方的 行舟Drug ▲ 添加关注   前言 ADC对于药物靶点的选择，除了首先要在肿瘤过度表达外，这些抗原的另一个重要因素是内吞的效率，这是药物释放活性所必需的。事实上，ADC的疗效取决于靶向介导的内化在肿瘤细胞内传递有效载荷的效率。ADC内化的途径和效率，也与ADC药物的疗效和设计息息相关。因为它是连接子选择可切割、不可切割或pH/还原敏感型的重要因素，以及有效载荷（或其活性代谢物）是否能够在细胞膜上扩散以提供“旁观者效应”，还有是否提高了肿瘤杀伤率或有助于剂量限制毒性。因此有必要深入了解ADC的内吞作用和机制，因为它是ADC在体内发挥药效中极其重要的第一步。ADC的相关内吞途径一般来说，正常的内吞作用可分为三个阶段：（1）芽的形成，（2）膜的弯曲和囊泡的成熟，（3）膜的断裂并释放到细胞质中。多种内吞途径有重叠的方面，因此内吞的一般过程是高度灵活和复杂的。网格蛋白介导的内吞作用网格蛋白介导的内吞作用（CME）在概念上是一个简单的过程，包括几个连续和部分重叠的步骤。CME可由质膜上的某些受体结构性启动，或者需要配体和/或抗体结合后启动。当细胞质中的内吞衣壳蛋白开始聚集在质膜的内小叶上时，CME就开始了。衣壳蛋白通过从细胞质中招募并与额外的蛋白质适配器相互作用而继续组装和生长。关键的衔接蛋白使膜弯曲，从而将内化受体/配体集中到一个“网格蛋白包被坑”（CCP）中。由于CCP内陷增大，CCP颈缩窄时，通过一个断裂过程与质膜分离。肌动蛋白聚合有助于将CCP向内拉入细胞质，直到断裂完成，CCP释放并成为一个网格蛋白包被的囊泡（CCV）。最后，CCV外壳被分解，CCV与内涵体融合以运输到特定的亚细胞位置，或者可以被回收回细胞表面。                          网格蛋白是CME的关键成分，由重链和轻链组成。三个网格蛋白重链和轻链形成一个三聚体，它与其他三聚体相互作用，并在新兴的CCP周围形成一个多边形晶格。衔接蛋白2（AP-2）是一种异源四聚体复合物，它介导CCP颈部的收缩。Dynamin是一种GTP酶，在成熟囊泡的颈部形成螺旋状聚合物。GTP水解后，dynamin诱导囊泡从质膜分裂。小窝介导的内吞作用不依赖于网格蛋白的内吞作用包括小窝介导的内吞作用、小窝蛋白非依赖性载体蛋白/GPI-富集的早期内区室（CLIC/GEEC）和巨胞饮作用。小窝是质膜的小瓶状内陷，其特征是高水平的胆固醇和鞘糖脂，通过不依赖于网格蛋白的途径介导内吞作用，并且存在于大多数细胞类型中。小窝的主要支架蛋白是小窝蛋白，它是形成寡聚体的20–24 kDa完整膜蛋白。小窝蛋白共享共同的支架结构域，这些支架结构域介导与自身和其他包含小窝蛋白结合结构域蛋白质的相互作用。虽然小窝具有类似CCPs的内陷形态，但它们是不同的。简单地说，CCP的密度是恒定的，而小窝的密度会因细胞类型的不同而变化很大。CCPs随着萌发的内体成熟而增大，相比之下，小窝囊泡保持不变的大小。一旦进入细胞内，小窝就形成了高阶结构，而不是由CCPs形成的简单的球形内体。小窝蛋白介导的内吞作用的另一个独特方面是，只有约1%的小窝是从质膜上萌发的。在一小部分内化的小窝中，它似乎遵循一条与Rab5（早期内胚体的标志物）共定位的循环途径。这可能对以利用小窝蛋白介导内吞作用的受体为靶点的ADC带来挑战。CLIC/GEEC内吞作用CLIC/GEEC是一种内吞室，主要发生在配体激活的细胞中，这可能由生长因子、抗体的受体交联或细菌毒素和病毒引起。此外，细胞膜必须处于高流动性状态，因为CLIC/GEEC在低于生理温度或膜处于更高张力的情况下不起作用。CLIC在迁移细胞的前缘增加。识别CLIC/GEEC途径的其他相关参数包括动力非依赖性质膜断裂、对胆固醇消耗的敏感性、Rab5/与早期内体融合的获得、胎盘碱性磷酸酶（PLAP）和与FAK相关的GTPase调节因子（GRAF1）。巨胞饮作用巨胞饮作用是一种更大规模的内吞作用形式，通常涉及质膜高度皱折的区域/突起，这些区域/突起随后相互融合或与质膜融合。膜皱褶是巨胞饮作用的形态学特征。巨胞饮作用依赖于肌动蛋白聚合、Rac1蛋白和p21活化激酶1（PAK1）。PAK1是一个关键的调节因子，因为它与Rac1相互作用，Rac1激活磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）、Ras、Src和Hsp90，以促进巨胞饮作用。巨胞饮作用也是胆固醇依赖性的，这是招募Rac1所必需的。这些成分最终导致比CME和小窝蛋白更大吸收面积的内吞作用。ADC靶向抗原的内吞特性CD33CD33是一种67kda跨膜糖蛋白受体，通常在正常髓系细胞上表达，由于其在AML细胞上优先过表达，是GO的靶点。CD33的胞内免疫受体酪氨酸基抑制基序（ITIM）调节CD33的内吞作用，可通过CME激活内吞作用。关于内吞效率，AML细胞中CD33的表达水平与其内吞率之间没有相关性。CD33是一种缓慢内化的抗原，此外，CD33交联并不能改善内吞作用。对GO无响应的AML患者可能与CD33受体内吞的功能低下有关。CD30CD30是一种120kda跨膜糖蛋白，属于肿瘤坏死因子受体（TNFR）超家族。其细胞外部分由六个扩展构象的富含半胱氨酸的结构域（CRD）组成。CD30在活化的T细胞和B细胞以及各种淋巴肿瘤（包括霍奇金淋巴瘤和ALCL）上表达。CD30不具有内吞作用，相反，它因蛋白水解裂解而脱落，CD30的脱落由基质金属蛋白酶（MMPs）介导。脱落是CD30生物学的一个特征，高浓度的循环可溶性CD30可以作为监测肿瘤进展的血清标志物。对于ADC的疗效，升高的CD30循环水平似乎会隔离注射的ADC，从而减少能够定位于CD30阳性肿瘤部位的ADC的数量。因此，缺乏内吞作用的结果表明CD30不是理想的ADC靶点。CD22CD22是一种140 kDa的跨膜糖蛋白，与CD33一样，它也是Siglec家族的成员，并与该家族共享多种结构特征。关键的区别在于CD22比CD33大得多，因为它有多个Ig结构域和ITIM/ITIM样基序。CD22的表达仅限于B细胞，CD22在各种B细胞恶性肿瘤（包括ALL）的大多数母细胞中表达水平升高。CD22通过CME进行内吞作用。类天然配体通过CD22的结构性快速内吞在细胞内积聚。这些配体在溶酶体中被分类降解，而CD22则循环回到细胞表面。此外，CD22配体诱导的内吞激活细胞内池，补充或增加细胞表面CD22的表达水平。因此，CD22对ADC具有良好的内吞特性。CD79bCD79b仅在未成熟和成熟的B细胞中表达，在恶性肿瘤≥80%的B细胞中过表达。CD79a和CD79b是两种非共价结合的跨膜蛋白，介导信号传导和内吞作用。对于后者，CD79a-CD79b异二聚体是控制BCR内吞的支架。BCR内吞作用主要由CME完成，并由AP-2介导。有趣的是，CD79a直接与AP-2的μ亚单位相互作用，进而激活CD79b并导致整个BCR复合物的内吞。此外，对于ADC来说，CD79a可以作为单体内化，但CD79b却不能。如果CD79b的近端膜酪氨酸（Y195）发生突变，AP-2与CD79a的结合就会被阻断，内吞也被阻断。在18%的活化B细胞样DLBCL标本中，Y195发生突变。总之，有证据表明CD79b其内吞活性依赖于整个BCR复合体的内化，而不是作为单体的内化。TROP-2Trop2是一种46kDa的单体糖蛋白，具有选择性过度表达、结构性内吞作用和导向溶酶体等特性，使其成为ADC的一个非常有吸引力的靶点。Trop2的内化机制与CME有关。观察到的Trop2强大的内吞作用，一种潜在的解释可能是由于显著的Trop2聚集。研究Trop2的构象动力学，发现Trop2通过位于跨膜结构域的氨基酸“VVVVV”组成的相互作用片段形成天然的同型二聚体。Trop2的二聚作用可以通过其他细胞表面蛋白质进一步将Trop2单体招募到更接近的位置。因此，Trop2簇很可能由多个二聚体通过脂筏和其他膜结合蛋白连接而成。Trop2与多种配体结合，如claudin-1、claudin-7、cyclin D1和IGF1，然而，这些配体都没有证明在与Trop2结合或相互作用时被内化。因此，与正常细胞相比，Trop2在肿瘤细胞中发生的内吞作用更为强烈，这些都表明Trop2是ADC的一个很好的靶点。BCMABCMA或CD269，也称为TNFR超家族成员17，转导诱导B细胞存活和增殖的信号。BCMA的分子量仅为20.2 kDa，其配体结合的胞外区域具有“臂椅”构象，由六个CRD组成。除了多发性骨髓瘤外，BCMA还表达于许多血液系统恶性肿瘤，如霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤。然而，关于BCMA所利用的精确内吞途径的知之甚少。与内吞作用有关，唾液酸化是一种调节功能，它可能诱导BCMA利用CME发生内吞作用。HER2HER2是一种185kda跨膜糖蛋白，属于EGFR家族。HER2/neu基因的扩增是已知的人类恶性肿瘤和转移的驱动因素。由于HER2在癌症中的作用，几十年来一直被作为治疗靶点。HER2也一直是ADCs的靶点，T-DM1和T-DXT都被批准用于HER2阳性转移性乳腺癌患者。HER2的内吞存在多种机制，首先是CME，共免疫沉淀清楚的显示HER2直接与AP-2结合，此外，dynasore能完全阻断SKBR3细胞的HER2内吞作用；其次小窝蛋白结合基序φxφxxxxφ（φ代表芳香族氨基酸Trp、Phe或Tyr）通常存在于小窝蛋白相关蛋白上，有趣的是，序列WSYGVTIW已在HER2的细胞内激酶结构域中被鉴定出；另外，有研究证明HER2可以利用CLIC/GEEC的内吞途径。这些不同的发现揭示了HER2内吞的重要特征。首先，HER2的内吞作用是混杂的，其次，小窝介导的内吞途径似乎更常被利用。Nectin-4Nectin-4是一种66 kDa 的I型跨膜蛋白，其主要作用是促进细胞间的接触。Nectin-4作为ADC靶点很有吸引力，因为研究表明，它在几种肿瘤类型中过表达，但在正常成人组织中几乎不存在。目前，没有发现天然配体或mAb/ADC与nectin-4的复合物内吞的信息，但是可以借鉴nectin-4结合病原体内吞的研究。Nectin-4也是麻疹病毒的受体，研究表明，麻疹病毒通过巨胞饮作用进入MCF7、HTB-20乳腺癌和DLD-1结直肠癌细胞。病毒进入需要PAK1，相反，dynamin抑制剂Dynasore对病毒进入没有影响。此外，表达显性负性小窝蛋白的细胞并不能消除病毒的内吞作用。基于这些间接研究，nectin-4表现出病毒受体所需的强大的内吞活性。小结药物剂量-暴露-效应关系的确定是ADC成功的关键部分，内吞作用是这种关系的关键部分，因此，对于优化给药方案以最大限度地提高治疗指数非常重要。然而尽管目前ADC领域如火如荼，但是我们对靶受体的内吞作用仍知之甚少。另外，许多内吞作用的核心成分和关键的效应器非常重要，然而这些蛋白可能在癌症中普遍发生突变，这也会影响ADC内吞作用和疗效。相信随着该领域的发展，经过无数次积累的经验，ADC终会迎来真正的春天。参考文献：1.Impact of EndocytosisMechanisms for the Receptors Targeted by the Currently Approved Antibody-DrugConjugates (ADCs)—A Necessity for Future ADC Research and Development. Pharmaceuticals(Basel). 2021 Jul; 14(7): 674.文章信息源于公众号小药说药，登载该文章目的为更广泛的传递行业信息，不代表赞同其观点或对其真实性负责。文章版权归原作者及原出处所有，文章内容仅供参考。本网拥有对此声明的最终解释权，若无意侵犯版权，请联系小编删除。学如逆水行舟，不进则退；心似平原走马，易放难收。行舟Drug每日更新 欢迎订阅+医药大数据|行业动态|政策解读