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摘要：疫苗是控制传染病最有效的工具，这些疾病会导致显著的发病率和死亡率。大多数疫苗通过非肠道途径给药，能够引发强烈的系统性体液免疫反应，但它们诱导的T细胞介导的免疫较弱，且在诱导粘膜保护方面效果不佳。考虑到大多数病原体通过粘膜表面进入体内，一种能在宿主与病原体首次接触点引发保护的疫苗是很有前景的。然而，尽管粘膜疫苗作为在粘膜表面提供保护的良好选择具有优势，目前只有少数粘膜疫苗获得批准。在本篇综述中，我们讨论了疫苗在不同粘膜表面的给药影响；适当的佐剂如何增强保护性粘膜免疫的诱导以及其他可能影响疫苗粘膜免疫反应的因素。 1.引言 疫苗是控制传染病、导致发病率和死亡率的重要原因的最有效工具。根据世界卫生组织的数据，疫苗每年在全球范围内预防超过250万人死亡。因此，疫苗成功地根除了天花，并减少了其他几种疾病如脊髓灰质炎和麻疹的发病率。 疫苗通过在体内模拟病原体感染来发挥作用，这导致免疫系统激活以对抗病原体。疫苗给药后，疫苗中的病原体相关分子模式（PAMPs）与注射部位的先天免疫细胞中的模式识别受体（PRRs）相互作用，并触发免疫级联反应，涉及趋化因子和细胞因子的产生增加，导致注射部位的抗原呈递细胞（APCs）数量增加。APCs主要负责抗原的摄取和随后呈递给激活B细胞的T细胞，导致抗体产生。因此，为了对病原体产生强大和有效的免疫反应，强烈激活B细胞和T细胞是必要的。 消除病原体后，适应性免疫系统会对其发展免疫记忆。这种免疫记忆是长期个体保护的基础，其特点是抗体的持续存在和记忆细胞的产生，这些细胞在再次暴露于同一病原体时会迅速重新激活。因此，疫苗接种的目标是诱导记忆细胞。 大多数疫苗通过非肠道途径给药，通常包括：皮下（SC）、皮内（ID）和肌肉内（IM）。ID免疫接种比IM注射诱导更强的免疫反应，而SC和IM在临床研究中诱导相似的反应。一个可能的解释是，真皮含有更多的树突状细胞（DCs），这有助于抗原的捕获，局部炎症诱导DCs的成熟和它们迁移到引流淋巴结，导致疫苗剂量节省。尽管ID疫苗注射比其他非肠道途径更有效地诱导免疫反应，但它在给药部位引起更严重的不良反应，其次是SC和IM途径。有研究表明，在15个月至5岁儿童中，接种B型流感嗜血杆菌多糖疫苗时，SC/ID注射可能比IM注射更疼痛。尽管有其优势，但使用非肠道途径需要针头，这使得这种途径更具侵入性且成本更高，除了由于使用不当而存在感染风险外，还需要训练有素的人员进行给药。此外，非肠道疫苗可以引发强烈的系统性体液反应，但提供较弱的T细胞介导的免疫和粘膜保护。 与非肠道疫苗相关的另一个问题是，这种途径只保护疾病而不是感染。一些研究发现，接种了针对B型脑膜炎奈瑟菌的疫苗的个体对侵袭性疾病有保护作用，但在随后的12个月内，并没有迹象表明N. meningitidis的携带密度有所减少。 考虑到大多数病原体通过粘膜表面进入体内，因为这些表面直接与空气、水、食物和环境接触，针对宿主与病原体首次接触点的疫苗具有吸引力，因为它们有潜力从首次接触点保护宿主免受病原体侵害。 通过粘膜表面和ID途径给药的疫苗显示出抗原的快速和广泛生物分布，以及诱导保护性粘膜和系统性细胞和体液反应的能力。特别是，粘膜疫苗更安全，因为它们不需要针头。这一方面也导致依从性增加。因此，它们便于在流行病/大流行环境中进行大规模疫苗接种，因为它们易于给药。尽管有所有这些优势，但由于粘膜疫苗需要安全有效的粘膜佐剂来实现预期的免疫反应，此外，抗原必须根据粘膜给药途径免受降解，目前只有少数粘膜疫苗可供商业使用，如表1所示。 鉴于上述情况，在本篇综述中，我们讨论了疫苗在粘膜表面的给药影响，适当的佐剂或载体配方如何促进保护性粘膜免疫的诱导，以及其他可能影响疫苗粘膜免疫反应的因素。 2.粘膜表面的免疫防御 粘膜表面覆盖了身体的400平方米，包括胃肠道、泌尿生殖道和呼吸道。为了防御感染，粘膜表面配备了由粘膜上皮细胞提供的物理、化学和免疫机制（图1）。物理屏障由细胞间的紧密连接和浓密的粘液层组成，防止外来物质的进入和/或粘附。生化屏障由pH差异和微生物群产生的抗菌肽提供。最后，免疫防御包括先天和适应性免疫反应。 图1 粘膜表面和防御机制。上皮细胞之间的紧密连接是抵御病原体的物理屏障。微生物群和抗菌肽分别是病原体的生物和生化屏障。为了引发特异性免疫反应，微褶(M)细胞负责在腔内摄取抗原并将其呈递给树突状细胞，树突状细胞通过MHC-II将其呈递给T淋巴细胞。T细胞分泌细胞因子，调节细胞反应的模式（Th1、Th2、Th17、Treg），并促进B细胞分化为浆细胞，这些浆细胞产生分泌型IgA（SIgA），能够在粘膜中和病原体。 粘膜组织拥有一个被称为粘膜相关淋巴组织（MALT）的有组织的淋巴组织团块。MALT包括被滤泡相关上皮覆盖的淋巴滤泡，其中含有微褶（M）细胞，它们负责在腔内摄取抗原并呈递给树突状细胞（DCs）和巨噬细胞，在那里它们被处理并呈递给淋巴细胞。DCs将抗原呈递给初始T细胞，以克隆扩增并分化为T辅助（Th）细胞亚群（Th1、Th2、Th17或调节性T细胞）。每个亚群将决定细胞因子分泌的轮廓，之后，T细胞与B细胞相互作用，促进它们在多个粘膜部位的分化和抗体产生。这些B细胞将产生抗原特异性的分泌型免疫球蛋白A（SIgA），它防止病原体在粘膜表面的侵袭，以及IgG抗体。Th细胞在粘膜免疫中扮演重要角色。一些报告表明，主要由Th17细胞分泌的白介素（IL）-17是疫苗诱导的对肺炎链球菌、结核分枝杆菌和流感的保护所必需的。此外，IL-17可以通过上调粘膜上皮中的多聚Ig受体水平来增加SIgA水平，并促进B细胞不依赖T细胞分化成SIgA。 在肠道中，免疫系统级联反应发生在有组织的肠道相关淋巴组织（GALT）中，主要在Peyer氏斑中，这是IgA类别转换的主要部位。在上呼吸道中，它发生在小鼠的鼻相关淋巴组织中，由位于鼻咽管入口的硬腭上的一对有组织的淋巴聚集体组成。这种鼻组织在功能上似乎与人类的Waldeyer环扁桃体和腺样体相当。在下呼吸道中，发现了支气管相关淋巴组织。它是肺淋巴系统的一部分，通常在健康成人中不存在，但在抗原刺激下出现，包括炎症、吸烟习惯、胶原血管疾病、感染和艾滋病。 2.1.分泌型IgA：粘膜武器 如前所述，SIgA通过控制与宿主的首次接触以来的病原体定植，从而预防传染病，这是粘膜免疫的一个主要特征。IgA抗体，以其α重链为特征，存在于血清和粘膜中，有两种亚型：通常在血清中发现的IgA1，以及在粘膜中经常出现的IgA2。虽然IgA1主要由蛋白质抗原诱导，但IgA2在抗脂多糖（LPS）反应中占主导地位。 SIgA和血清IgA在位置、结构和功能上有所不同。SIgA通常呈现二聚体结构，并具有分泌成分，这为分子提供了稳定性，保护免疫球蛋白不被降解（鉴于粘膜环境的侵略性），从而帮助抗体与病原体蛋白结合。此外，SIgA是局部产生的，分泌量高，能够中和病原体。有证据表明粘膜中B细胞的快速周转以及长寿浆细胞的存在。最有可能的情况是，浆细胞会根据微生物群组成的变化而持续存在，微生物群的组成受到饮食、感染和抗生素治疗的影响，因此建立了一个动态平衡。 相反，血清IgA通常呈现单体结构，并且分泌滴度较低。有证据表明它有助于控制炎症，但关于其激活补体系统和促进病原体吞噬的能力存在矛盾的研究。SARS-CoV-2感染的粘膜性质导致了几项针对血清IgA的研究。早在2020年，就已验证人类单克隆IgA抗体能够有效地与SARS-CoV-2结合，并阻断血管紧张素转换酶2（ACE2）和受体结合域（RBD）的相互作用，表现出中和活性。因此，当转化为SIgA和IgG结构时，只有前者能够中和SARS-CoV-2。血清IgA也能够中和SARS-CoV-2，如Sterlin等人的研究，而Mazzini等人发现ELISA-IgA与微量中和试验有很好的相关性，因此，从血清样本中去除IgA显著降低了中和活性。比较表明，二聚体IgA比单体IgA表现出更强的中和能力，以及单体IgA和IgG。最近，Fox等人验证了COVID-19患者的牛奶样本在假病毒试验中具有中和作用。此外，粘膜免疫可以改善血清IgA的诱导，可能是因为B细胞在粘膜激活后归巢到脾脏边缘区。 目前的SARS-CoV-2疫苗也可以诱导IgA的产生，这一点已经对Moderna（mRNA1273）和辉瑞/BioNTech（BNT162b2）的mRNA疫苗以及牛津/阿斯利康（ChAdOx1）的病毒载体疫苗进行了验证。未来的粘膜疫苗可能会从异源初免-加强方法中受益。虽然粘膜免疫会诱导SIgA抗体，但非肠道剂量会改善系统性反应。啮齿动物的数据显示鼻内免疫增强了血清中的IgA以及血清和呼吸道粘膜中的IgA。然而，来自人类研究的证据很少。以前感染过COVID-19的疫苗接种志愿者，可能已经诱导了IgA反应，表现出比没有COVID-19病史的受试者更高的IgA滴度和更持久的IgA反应。我们可以推测，如果自然感染被视为鼻内初免，随后的非肠道疫苗将提供更好的免疫反应。另一项研究验证了mRNA疫苗在人乳中增加了IgA和IgG，尽管IgA比IgG更早减少。 有建议认为非肠道部位的淋巴引流可以作为系统性和粘膜免疫之间的交叉路径。这种观察可能让我们对通常分开的粘膜和系统免疫的观点产生疑问，并假设疫苗策略将从初免-加强方法中受益。尽管证据有限，但SIgA的贡献和血清IgA的前景作用应在疫苗研究中进行评估。 3.给药途径 粘膜疫苗能够在系统和粘膜部位诱导抗原特异性的体液和细胞介导的免疫反应。因此，粘膜免疫反应的诱导取决于疫苗的给药部位。口服免疫通常刺激胃肠道、唾液腺和乳腺的免疫反应和抗原特异性SIgA，而鼻内免疫诱导上呼吸道、下呼吸道、唾液腺和生殖器粘膜的抗体产生，舌下疫苗接种诱导胃肠道以及上下呼吸道的抗原特异性免疫反应，如图2所示。上述所有途径以及其他途径，例如阴道内和直肠途径，已在实验动物模型中应用，但只有口服和鼻内途径已在许可的人类疫苗中使用。 图2 粘膜部位的免疫接种不仅引发局部和系统性免疫反应，还在不同部位诱导粘膜反应。(a) 口服免疫刺激胃肠道、唾液腺和乳腺，考虑到母体-胎儿抗体转移，这一点尤其重要。(b) 鼻内途径在上呼吸道、下呼吸道、唾液腺和生殖器粘膜中诱导免疫。(c) 舌下疫苗接种在胃肠道以及上下呼吸道中引发反应。 尽管粘膜疫苗具有已知的潜力，但每种途径都有其含义。口服疫苗的开发代表了最大的挑战，这不仅是由肠道环境的侵略性所构成的——它降解了在其中传递的大多数抗原表位，影响疫苗的生物利用度——而且还由粘膜耐受性所构成，粘膜耐受性保护了对消化抗原的不希望的免疫反应。鼻内途径是一个有吸引力的部位，因为它所需的抗原和佐剂剂量比口服途径少，但它也面临着疫苗开发的挑战。鼻内疫苗配方需要到达呼吸道腔并穿过粘液层，其吸收就在那里发生；为此，疫苗配方需要考虑鼻腔的解剖和生理特征，如前庭区域的通透性差，以及毛发和粘液的快速周转，这些都干扰了成分的吸收。此外，鼻腔酶和局部pH可能影响疫苗的稳定性。 理想的粘膜疫苗在物理和化学屏障（pH和酶）方面是稳定的，将抗原传递到特定的免疫诱导部位，适应粘液周转，能够穿过上皮屏障，并且最终被APCs捕获，并且不诱导粘膜耐受性。使用佐剂是一种改善疫苗稳定性和吸收的策略，由于粘膜的生理和化学屏障，提供了更好的抗原传递。 4.粘膜佐剂 “佐剂”一词源于拉丁语adjuvare，意为帮助或援助。佐剂被定义为添加到疫苗配方中的功能性辅料，以增加其抗原的免疫原性。它们允许使用较低剂量的抗原和较少剂量的疫苗免疫方案。因此，佐剂通过增强其在粘膜部位的生物利用度来帮助增加配方的稳定性，其中自然防御机制，如pH、粘液层和运动可能会限制与APCs的相互作用，甚至降解抗原。这一方面影响了免疫反应的强度和持续时间。佐剂构成了一个异质化合物群，可以分为传递系统或免疫刺激分子。 4.1.免疫刺激佐剂 免疫刺激佐剂通过三种机制启动免疫激活：(1) 与非Toll样受体（非TLR）结合后的毒素介导的免疫刺激，例如宿主细胞表面存在的糖鞘脂。这一类别的最好代表是霍乱毒素（CT）和大肠杆菌产生的热敏毒素（LT）；(2) 是PRR配体的物质，例如TLR激动剂；(3) 天然免疫调节剂，如细胞因子、补体片段和信使分子。 研究最深入和最有效的粘膜佐剂是CT、LT和白喉毒素。这些毒素具有佐剂效应，被认为是粘膜佐剂的黄金标准；然而，由于它们的有害毒性效应，它们并未用于临床应用。为了避免这些毒性效应，已经创造了较少毒性的突变体，并连接到其他部分或肽以破坏毒素的活性位点，例如，重组霍乱毒素亚单位B已在Dukoral®疫苗中使用。 另一种使用的佐剂是PRRs配体。这些佐剂基于PAMPs激活，并通过TLR刺激作用。一个有前景的粘膜佐剂是单磷酸脂质A（MPL），源自大肠杆菌的LPS，其中MPL通过与TLR4相互作用刺激免疫反应。单独使用MPL不会引起系统性抗体或T细胞反应。因此，MPL已在包括脂质体和乳液的复合配方中使用，以及与Quillaja saponaria树皮的活性部分（QS-21）结合，形成AS01，它被包括在最近的疟疾疫苗RTS,S（Mosquirix）和目前正在开发的其他疫苗中，以诱导抗原特异性CD4+ T细胞反应，或与氢氧化铝结合形成AS04，由Glaxo-SmithKline在Cervarix™（人类乳头瘤病毒疫苗）和Fendrix™（乙型肝炎疫苗）中使用。 含有未甲基化CpG的合成寡脱氧核苷酸（ODNs）是另一种TLR激动剂。其基序触发表达TLR9的细胞，引发以Th1和促炎细胞因子产生为特征的先天免疫反应。CpG ODN诱导强烈的Th1反应，支持其诱导细胞毒性T淋巴细胞（CTL）和干扰素（INF）-γ分泌的能力。它促进抗原的免疫调节效应，激活APCs，并加快免疫反应。CpG促进浆细胞样DCs上MHC、CD40和CD80的表达，并增强抗原处理和呈递。此外，存在于人类肠道粘膜的B淋巴细胞表达TLR9并响应CpG刺激，导致IgA水平增加。2017年FDA批准的乙型肝炎疫苗HEPLISAV-B是第一个使用CpG ODN作为佐剂的疫苗。 人类TLR5的天然激动剂鞭毛蛋白是细菌鞭毛的关键组成部分，也是另一种粘膜佐剂。鞭毛蛋白与TLR5结合，动员核因子（NF）-κB并通过MyD88依赖途径刺激肿瘤坏死因子（TNF）-α的产生。鞭毛蛋白也可以被NOD样受体（NLR）家族的另外两个受体NLRC4和NAIP5识别；然后，它激活炎症体途径。鞭毛蛋白是先天和适应性免疫系统的有效激活剂。已经证明，促进最大抗原特异性抗体反应所需的鞭毛蛋白剂量低于刺激最大先天免疫反应所需的剂量，因为鞭毛蛋白能够诱导包括DCs、自然杀伤细胞、上皮细胞和淋巴结基质细胞在内的许多先天和非免疫细胞产生促炎细胞因子和趋化因子。 细胞因子和趋化因子已被证明在粘膜部位作为佐剂发挥作用。包括干扰素（INF）-γ、INF-α、IL-12、IL-2、IL-15、IL-18、IL-21、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和Flt-3配体在内的重组细胞因子类似物已被报道具有佐剂活性。IL-1家族细胞因子能够诱导IgA和IgG抗体，而IL-6、IL-12和IL-15诱导CTL反应和疫苗特异性IgA抗体。然而，剂量相关的毒性和稳定性问题等限制阻碍了它们在疫苗中的应用，尽管通过将其包裹在脂质体或微/纳米颗粒中已用来克服这些问题。 4.2.传递系统 传递佐剂包括微球、纳米或微粒、聚合物、乳液、脂质体和免疫刺激复合物（ISCOM），它们被用来包裹抗原并将其传递给特定细胞。传递系统旨在改善抗原在粘膜表面的运输，同时保护它不受降解和/或在局部粘膜环境中的清除，以改善疫苗分布。 脂质体是具有两亲性质的球形脂质双层结构。由于一些优势，它们已被用作疫苗抗原的传递载体，例如防止抗原降解、组织储存效应或抗原的缓慢释放以及促进APCs对抗原的摄取，除了它们的生物相容性、生物可降解性、低毒性和两亲性质。此外，可以在脂质体表面添加：配体，用于特定细胞靶向，粘膜粘附剂和甘露糖衍生物，除了纳入TLR配体或其他PRR配体和免疫球蛋白以有效传递包裹或结合的抗原。阳离子脂质体比阴离子和中性脂质体更具免疫原性；此外，带正电荷的脂质体更好地与带负电荷的抗原结合，并影响它们在给药部位的保留，从而产生储存效应。二甲基二十八烷基铵（DDA）是一种广泛使用的阳离子脂质体，它主要由于抗原负载脂质体和单独给药的抗原之间的大小特征，在注射部位促进储存形成。阳离子佐剂配方01（CAF01）由DDA和海藻糖二油酸酯组成，这是一种合成变体，位于结核分枝杆菌细胞壁的绳索因子。这种配方已在动物模型中与不同病原体一起使用，如结核分枝杆菌、沙眼衣原体、链球菌等，以及基于重组蛋白亚单位（CTH522）的沙眼疫苗的1期临床试验，该疫苗用CAF01佐剂。CAF01被观察到是一种良好的粘膜佐剂；小鼠研究表明，它诱导Th1/Th17谱并增加IgA抗体反应。 粘膜粘附和粘液穿透成分的结合补偿了疫苗配方在粘膜液体中的稀释以及它们在粘膜更替中的损失，通过它们与粘膜上皮表面粘液层和粘液分子的相互作用，增加了剂量配方在吸收部位的抵抗时间。聚乙二醇是一种亲水成分，可以与粘液形成氢键，导致粘膜粘附，并帮助颗粒穿透粘膜，防止聚集，从而促进其穿过粘膜屏障。 另一种广泛研究的粘膜粘附剂是壳聚糖，它是一种低毒性的亲水、生物相容性和生物可降解的聚合物。壳聚糖具有一些对粘膜疫苗接种相关的属性，例如其带正电荷的分子与带负电荷的粘液相互作用以改善粘附；它增强了由于其能够短暂打开上皮紧密连接而增强的穿透性，从而改善了抗原取样及其促进INF-γ、IgG和SIgA分泌的佐剂属性。一项研究评估了一种基于壳聚糖功能化的铁氧化物纳米酶的鼻内流感疫苗，该研究发现壳聚糖增加了抗原对鼻粘膜的粘附，促进了DC的招募和跨上皮树突的形成以进行病毒摄取，并增加了小鼠的IgA-粘膜适应性免疫，提供了针对病毒的保护。 ISCOM是一种直径为30-40纳米的带负电荷颗粒，用作抗原的传递系统。ISCOM是在将抗原与胆固醇、磷脂（通常是磷脂酰乙醇胺和磷脂酰胆碱）以及从Quillaja saponaria Molina树树皮提取的皂苷Quil A混合后形成的。ISCOM的物理特性有助于抗原稳定性，减少与皂苷相关的溶血作用，并改善与DCs的相互作用，从而增强了所结合抗原的交叉呈递，产生抗体和CD4+和CD8+ T细胞反应。ISCOM上调Th1和Th2反应，并刺激强烈的体液反应（IgG1、IgG2a和IgG2b）以及细胞毒性T细胞诱导。已证明ISCOM佐剂是一种良好的粘膜佐剂，因为它诱导强烈的粘膜免疫反应，包括在鼻内接种ISCOM复合多种抗原后在鼻洗液和肺部产生大量IgA。使用与CT和金黄色葡萄球菌蛋白A（CTA1-DD）融合的ISCOM通过口服或鼻内给药诱导强烈的细胞介导和体液免疫反应，包括粘膜IgA。 5.母体-胎儿抗体转移 母体IgG抗体在怀孕期间通过胎盘被动转移到胎儿体内，这对出生后第一年系统免疫至关重要，因为此时免疫系统正在适应和成熟。推荐孕妇接种一些疫苗加强剂，例如针对流感、破伤风、百日咳和白喉的疫苗，以确保母亲和婴儿都受到保护。 然而，SIgA也通过母乳喂养传递给新生儿，并保护胃肠道——考虑到儿童经常遭受腹泻性感染，这是一个重要的问题。如本综述（给药途径部分/图2）所述，粘膜免疫可以增强乳腺中的SIgA，这将有利于通过母乳喂养传递SIgA。研究发现，从初乳样本中分离的SIgA在体外抑制了肠致病性大肠杆菌对Hep-2细胞的聚集，而从IgA中耗尽的初乳则无法做到这一点。因此，母亲的初乳和她婴儿的粪便在免疫印迹分析中识别了相同的大肠杆菌抗原，表明这些抗体在整个胃肠道中的持久性。母乳喂养的新生儿自出生后第一周起粪便中就含有SIgA，而配方奶喂养的新生儿直到第三周才含有。鉴于胃肠道感染对儿童的负担，应考虑在怀孕期间进行粘膜免疫。下一节将讨论微生物群对免疫反应调节的重要性。值得注意的是，母乳喂养可能通过传递微生物和作为益生元来塑造微生物群，这表明这些主题是多么复杂。 6.影响粘膜免疫反应的其他因素 6.1.维生素 维生素A（VA）是一种脂溶性维生素，包括视黄醇、视醛和视黄酯。VA通过食物途径从植物和水果中的前维生素A类胡萝卜素（如β-胡萝卜素）中获取。VA通过一系列酶，包括醇脱氢酶和视醛脱氢酶，代谢成其生物活性形式视黄酸（RA）。RA对激活的淋巴细胞上肠归巢分子α4β7和CCR9的诱导至关重要，并且对依赖于RA和TGF-β结合的FoxP3 Treg细胞的诱导至关重要。因此，RA被报道指导B细胞中免疫球蛋白类别转换，增加IgA的产生，这有助于宿主抵御肠道中的微生物。 维生素A缺乏症（VAD）与疾病易感性增加、疫苗反应差和死亡率增加有关。VAD导致大鼠和小鼠的肠粘膜以及雏鸡的气管上皮中IgA的产生减少。此外，VAD损害疫苗接种后的免疫反应：研究表明，在VAD小鼠中FluMist疫苗接种损害了免疫反应，而接种疫苗时口服RA或视黄棕榈酸酯增加了VAD小鼠中IgA的产生。在接种肺炎球菌疫苗（Prevnar-13）时，通过腹膜内途径给VAD小鼠口服VA补充剂（VAS），结果显示肺炎球菌（T4）特异性抗体（IgM和IgG1）得到改善。另一项研究表明，VAS和重组沙眼衣原体抗原的非肠道疫苗在小鼠中增加肠道IgA。因此，所有这些研究表明VAD损害了对疫苗的粘膜免疫反应，但VAS可以逆转这种效应，即使在非肠道免疫中也能增加IgA的产生。 补充全反式视黄酸（ATRA），VA的活性代谢物，导致恒河猴、黑猩猩和人类血液样本中DCs的α4β7整合素表达增加，这对肠道归巢运输很重要。这种治疗还改善了人类B细胞在体外培养中向浆细胞的分化和成熟。 研究表明，维生素A和D补充剂改善了儿童对流感疫苗的体液反应，这些儿童在基线时这些营养素的水平不足。在儿童和成人的混合队列中，评估了VA、抗流感抗体和炎症相关细胞因子。VA水平较高与IgA抗体和更高滴度的中和抗体相关。有趣的是，VA水平低的个体的鼻腔冲洗样本表达了更多的细胞因子和生长因子，使作者建议VA可能在控制粘膜组织中的炎症中发挥作用。 在婴儿中，一些研究表明VAS可以改善对某些疫苗（如破伤风、白喉类毒素、麻疹和乙型肝炎）的抗体反应。 尽管实验模型的证据非常充分，但关于VAS和疫苗反应的人类研究仍然很少，这使其成为一个有前景的研究领域。 6.2.微生物群 微生物群在许多身体功能中发挥关键作用，如食物消化、合成必需维生素和抵御病原体入侵。微生物群落稳态的改变导致肠道微生物失衡和肠道屏障异常。 已经表明微生物群影响疫苗的免疫反应，微生物的改变影响对注射和口服疫苗的免疫反应。无菌（GF）小鼠缺乏微生物群，显示Peyer氏斑的数量和大小减少，更少的固有层CD4+ T细胞，除了降低类别转换抗体IgA和IgG的水平；它们还缺乏发达的GALT。此外，小鼠早期生活中的抗生素驱动的失衡导致对全球通常给婴儿接种的五种不同疫苗的抗体反应受损——B群脑膜炎球菌疫苗（Bexsero）、C群脑膜炎球菌疫苗（NeisVac-C）、13价肺炎球菌结合疫苗（Prevenar）、六联疫苗（对抗乙型肝炎、白喉、破伤风、百日咳、B型流感嗜血杆菌和脊髓灰质炎病毒，INFANRIX Hexa），以及结核BCG疫苗。另一项研究还表明，抗生素治疗导致微生物组失衡，并影响健康成人对H1N1疫苗的免疫反应。 在中国婴儿中，梭菌科的富集与口服脊髓灰质炎疫苗最后一剂后抗脊髓灰质炎粘膜IgA的阴性检测有关，而放线菌的丰富与抗脊髓灰质炎粘膜IgA呈正相关，多样的肠道微生物群与口服脊髓灰质炎疫苗的粘膜免疫反应呈负相关。 加纳的一项研究报告称，口服轮状病毒疫苗（ORVV）的应答者在接种疫苗前6周大的婴儿中，Bacilli类成员（特别是Streptococcus bovis）的丰度较高，而非ORVV应答者在Bacteroidetes门中，特别是Bacteroides和Provotella种的丰度较高。 另一项研究分析了微生物群对成人接种口服伤寒沙门氏菌疫苗前1周的免疫反应的影响。研究发现，具有更多样化、复杂细菌群落的参与者具有多相细胞介导的免疫反应，这与对疫苗的更好反应相关；然而，该研究没有显示体液应答者和非应答者之间的群落多样性差异。 益生菌对先天和适应性免疫反应有影响。它们通过与肠道免疫细胞和上皮细胞的相互作用或间接通过肠道微生物组调节来介导免疫效应。一项研究表明，每天服用动物双歧杆菌（BB-12®）和副干酪乳杆菌（L. casei 431®）的志愿者，连续6周，并在接种三价灭活流感疫苗后，流感特异性IgG、IgG1、IgG3水平增加，特异性IgA水平更高。 另一项研究中，志愿者连续5周服用L. acidophilus和L. rhamnosus，结果显示接种疫苗后，脊髓灰质炎病毒中和抗体水平和脊髓灰质炎病毒特异性IgA和IgM水平增加。此外，一项比较7种不同益生菌菌株（B. lactis、L. acidophilus、L. plantarum和L. paracasei）连续3周的研究表明，在口服霍乱疫苗接种后，霍乱特异性IgG水平提高，接种B. lactis和L. acidophilus的个体诱导了高滴度的霍乱特异性IgA和IgM。 6.3.在发展中国家口服疫苗的问题 当分析现实世界证据时，口服疫苗在高收入国家的效能高于中低收入国家。值得注意的是，这些国家胃肠道感染的负担更为突出。 虽然在美国和芬兰等国家，活体口服轮状病毒疫苗的效能超过70%，但在非洲国家的效能为61%——值得一提的是，个体评估在南非为76.9%，而在马拉维为49.4%。在美国与印度相比，口服脊髓灰质炎疫苗后的血清转换率更高。在接种口服霍乱疫苗后，来自瑞典斯德哥尔摩的儿童比来自尼加拉瓜莱昂的儿童表现出更高的IgA和弧菌杀菌滴度。这样的方面引发了一个问题：是什么损害了这些疫苗的免疫原性？ 正如本综述前面所讨论的，VAD和微生物群的损害影响免疫反应。食物不安全导致微量营养素营养不良；缺乏清洁水源、适当的卫生设施和卫生教育可能会破坏微生物群的构成，增加肠道病原体的定植。这些问题在发展中国家更为常见，妨碍了口服疫苗的效能。另一个相关问题是新生儿肠道中存在高滴度的抗体，可能通过母乳喂养从不断接触肠道病原体的母亲那里转移。因此，应该研究疫苗接种时间表。有报告称，最近的脊髓灰质炎疫苗接种限制了轮状病毒疫苗的效果，可能是因为口服脊髓灰质炎疫苗可能与口服轮状病毒疫苗竞争，妨碍了强大的体液反应。 总之，一系列因素妨碍了贫困国家口服疫苗的效能。建议使用加强剂量作为克服这些障碍的方法。然而，造成这个问题的社会经济差异应该是讨论的话题，需要政府、科学家和私营部门的参与来解决——就像公共卫生的任何话题一样。 6.4.我们应该针对SARS-CoV-2开发粘膜疫苗吗？ SARS-CoV-2是一种呼吸道病原体——累积证据表明也涉及胃肠道。有效的粘膜免疫被认为是轻度和重度患者之间的差异性方面，提供对上呼吸道病原体的控制。到目前为止，证据已经指出，尽管肌肉内疫苗激发了有效的系统性免疫，但它们未能激活粘膜免疫，这将解释为什么SARS-CoV-2的传播仍然是一个问题。鼻微生物组也被认为是COVID-19临床表现的决定性方面。如前所述，粘膜疫苗易于给药并诱导局部免疫，这两个方面在考虑SARS-CoV-2的粘膜性质和在大流行情况下迫切需要大规模免疫的情况下都是有趣的。 确实，目前有多种粘膜COVID-19疫苗正在进行临床试验，主要是鼻内给药。然而，非肠道疫苗与粘膜疫苗的数量差异——分别是118种和16种，更不用说目前有20多种非肠道疫苗在使用中——留下了一个未解的问题：粘膜免疫是一种被低估的技术，还是前面讨论的障碍阻碍了这种有前途的工具的开发，以控制COVID-19？ 7.结论 粘膜疫苗可以在粘膜表面保护宿主免受病原体的初次接触，并且由于其给药方便和患者接受度高，其应用成为流行期间的一个良好选择。然而，尽管有所有这些优势，但并没有很多粘膜疫苗被批准用于人类使用，因为许多疫苗配方需要根据粘膜给药途径保护抗原免受降解。因此，在疫苗配方中应用佐剂是克服问题的一个好策略。然而，选择一个好的佐剂并不足以改善粘膜疫苗，因为微生物群和维生素可以影响粘膜免疫反应。 一些疾病对微生物群落和维生素吸收有显著影响，如肥胖、糖尿病、炎症性肠病等，这可能妨碍粘膜疫苗的效能。此外，在疫苗接种时间表中应用VA补充剂和益生菌似乎是一个调节粘膜免疫和增加某些个体对疫苗免疫反应的好策略。 因此，开发理想的粘膜疫苗不能仅仅归结为选择完美的佐剂；有必要考虑患者特定的因素，并且，这样分析可能影响疫苗粘膜免疫反应的所有方面。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

近年来，药物生产朝着缩短开发时间、降低成本的方向前进，因而行业都在探索更加高效的生产方法，产业升级向着精细化化工发展。同时，药企与CXO也在向更绿色环保的生产模式转型，这其中生物催化技术在制药工程中的优异表现正受到越来越多的关注。 当前，合成生物学与传统化工的融合，使得合成工艺出现革命性变化。生物催化技术是化合物合成的一个重要创新。通过生物催化技术，可以利用自然界演化出来的酶以及人工开发出来的创新酶作为催化剂，实现更高效、环保的化学反应。其应用范围已经从传统的食品、农业和纺织领域扩展到更广泛的化学品和药物生产领域。 如果说没有酶参与的化学反应像是驾驶汽车翻越高山，需要加大油门（高能耗）才能通过，而有酶参与的生物催化则像是走了一条穿山隧道，平稳而快速。这类反应由于在常温、常压下进行，能耗低且产生污染少，因而能够显著削减生产过程的碳排放，被视为解决资源、能源及环境危机的有效手段。 在医药领域，酶催化技术已经被应用在药物合成中，特别是在合成复杂的天然产物和药物分子时，酶的高选择性和特异性展现出独特的优势。可如今在国内市场，相比酶在食品及农业领域的大规模应用，在医药领域尚处于初始阶段。 据中研普华产业院的数据，2023年全球酶制剂市场规模为128亿美元，而2022年国内仅化学制药市场规模就达8839亿。这条小赛道正在成为助推产业升级的支点。   助力绿色制药， 酶价值初步展现 早在15年前，包括阿斯利康、礼来、GSK、强生、默克、辉瑞等MNC已经着手在制药工业实施绿色化学研究。 以默克为例，它与Codexis公司共同合作开发转氨酶，将其应用于生产西他列汀的关键中间体。相比于化学制备，生物催化合成路线产品总收率提高13%，废物减少19%，且避免了重金属催化剂的使用。 之后在2019年，默克再次与Codexis合作开发依斯拉韦(islatravir)的生物催化合成路径。该项目通过5个定向进化的人工酶催化非天然底物的不对称反应，再通过4个天然酶的辅助，实现了总产率达51%的水相三步一锅法不对称合成，而之前的合成路线都在12~18步之间。 有酶参与的生物催化依靠其高效的优点，并且在越来越多手信药物合成中发挥作用。 例如醇脱氢酶 (ADHs)和酮还原酶 (KREDs)可以将潜手性酮不对称还原为手性醇。这些酶需要搭配NAD+或NAD(P)+作为辅酶，并利用异丙醇或葡萄糖作为还原剂。 罗氏和Genentech利用酮还原酶(KRED)开发了Akt抑制剂帕他色替ipatasertib的不对称合成工艺，还合作开发了那伏莫德Navoximod的酮还原酶催化工艺，从500多种酶中筛到了可以选择性得到trans-环己醇的酮还原酶。 诺华利用酮还原酶开发了FXI抑制剂中间体的不对称合成工艺，默克的ROMK抑制剂MK-7145与诺华的FXI抑制剂中间体的结构类似，通过酶催化反应底物卤代苯乙酮在碳酸钾的作用下关环成手性环氧，在与哌嗪开环后得到MK-7145。 辉瑞利用醇脱氢酶(ADH)开发了手性α-羟基丁酸酯的酶法工艺，该化合物可以用于γ分泌酶抑制剂新药的合成。 目前应用较为广泛的还有用来将前手性酮转化为手性胺的转氨酶。 比如前面提到的辉瑞γ-分泌酶抑制剂新药，就是将底物四氢萘酮通过转氨酶转化成为手性四氢萘胺。而默克的的CGRP受体拮抗剂，由于产物中含有两个手性中心，所以催化过程使用到了动态动力学拆分+转氨化的串联反应，默克用于治疗偏头痛的ubrogepant，同样是通过类似的反应而制备的。 此外，酶催化在他汀类药物中间体、非甾体抗炎类药物中间体、洛尔类药物中间体以及西汀类药物中间体的绿色合成中，都能发挥重要作用。 酶的潜力还远未被发掘 相对传统化工生产，生物催化可以降低能耗15%~80%，生产成本可以降低9%~90%，生物催化已然成为传统化工产业跨越式发展的重要路径。 酶作为生物催化中重要的催化剂，在主流的氧化、水解、还原等10多个类型反应中都能发挥作用，因而被大量应用于医药中间体、化妆品等领域。国内企业也在各自领域开始发力。 如乐普药业通过与浙江工业大学、清华大学和华东理工大学等高校的合作，成功开发了多种酶工程技术，在生物不对称催化技术、微通道连续流反应技术和结晶控制技术实现了突破，尤其是“阿托伐他汀钙化学-酶法组合催化合成项目”方面取得了显著成果，该项目获得了浙江省科技进步奖一等奖。 宏元药业的“他汀类药物系列绿色合成关键技术及产业化”项目也荣获了2021年度浙江省科学技术进步奖三等奖，该项目在他汀类原料药全新工艺路线设计、新型二羰基还原酶高立体选择性酶催化等方面取得了实质性创新和重大突破。这些技术实现了他汀关键手性侧链、他汀母核及系列原料药的产业化。 京新药业通过十余年的持续研究和开发，突破了他汀类药物的关键性技术难题，将酶催化构筑手性中心引入到瑞舒伐他汀钙高光学纯度手性侧链合成中，优化酶法工艺条件,缩短手性侧链合成步骤，提高反应收率，减少三废排放，实现绿色制药。该“瑞舒伐他汀中间体的酶法制备方法”专利也获得了国家知识产权局“中国专利金奖”。 不难发现，目前国内企业还是以单点突围的方式将酶应用于某个细分的医药赛道。 目前，酶的小剂量发酵生产虽已成为生物科技企业的基本配置，但在酶种类开发、酶来源以及规模化量产方面仍有大量进步空间。此外，在酶的规模化生产过程中，酶的高活力以及酶活力稳定性表达方面生产经验与相关理论也尚欠火候。 因此，国内高品质酶制剂被诺维信、Codexis、AB Enzyme、天野、NEB等国际大公司所把持。 酶的大规模生产尚需经验积累 酶的应用场景非常广泛，涉及到生物相关的应用产品与技术基本都能找到对应的酶技术，但酶的生产具有易入门难精通的特点。 对于酶制剂而言，其结构设计仅是开始，也就是说即使通过逆向工程测序将国外优秀的酶产品定位序列也不意味着一定能生产出高品质的酶。 酶的品质受很多因素影响，如质粒、底盘细胞、发酵工艺细节等，而酶的高活力表达以及高稳定发酵生产需要通过长期、大量的实践积累，才能量变产生质变。这方面国外企业无疑具有先发优势。 从流程而言，酶的开发、生产是与具体项目同步进行的。首先通过筛选改造获得想要的酶, 然后小量测试、表达该酶，并做小量的产品转化。随着产品转化量的增大，酶发酵的规模也会越来越大，发酵细节参数也会越来越多，然后重复步骤直到实现酶的规模化生产。 当然，还有另外一种模式即细胞工厂，它将酶工业化的两个环节进行合并，使得菌株的规模化发酵应用成为其攻克的目标。酶工业化发酵生产物是酶，而细胞工厂的产品是代谢物(如麻黄碱)。由于细胞内代谢物生物合成往往涉及到一系列酶基因的表达、调控以及催化，因此细胞工厂的规模化发酵工艺会更复杂。 细胞工厂在制药领域的应用主要在原料药 (如抗生素、阿片类药物吗啡、大麻素等)、医药中间体（如抗疟疾药物青蒿素前体青蒿酸、紫杉醇合成前体紫衫二烯等）、重组蛋白和多肽类药物以及重组疫苗的生产等。 目前，国内的企业如凯赛生物生产二元酸，华恒生物开发β-丙氨酸以及蓝晶微生物的PHA都是走的这条路径。由于细胞工厂的研发周期长，且优势更多体现在规模化效应上，一般主要应用于大宗商品的生产。 尽管细胞工厂一步到位的概念很超前，但酶催化的两步模式也有自身的优势。例如在酶的规模化发酵可控性上分步模式相对更好，此外在酶的工业催化应用形式上更加灵活多样。 酶催化应用的另外一个优势是与传统化工业的兼容性更好。像药明康德旗下的合全药业，凯莱英医药、博腾制药以及诚达药业等都相继成立了相关部门，在酶催化技术上加大了投入，这也从侧面说明了酶催化与传统化学工业的兼容与互补。 如今，国内酶规模化发酵系统知识还在建立阶段，酶发酵的底盘细胞还很有限，生物界大量种类的酶还未能实现有效发酵生产。同时，酶的工业催化应用方式也处于早期阶段，与材料结合应用的固定化酶则处于更初级阶段，模仿细胞工厂的体外多酶联级催化应用同样处于起步阶段。 当然，酶的规模化生产离不开对于酶的认知理解以及酶库的建立，而这一切都离不开酶工程的进步。 人工智能助力酶开发 天然酶在活性、选择性以及热稳定性方面已经不能满足使用需求，探索更高效的酶分子改造技术改善酶的某些特性是酶工程的主要任务。 大多数酶的化学本质是蛋白质，故也称酶蛋白。根据技术路径的不同，现有酶分子改造技术可简单分为基于蛋白质工程技术的传统酶分子改造与人工智能辅助的数据驱动酶分子改造两种。 其中，传统酶分子改造方法包括定向进化和理性设计，这是一种由实验驱动的酶分子改造策略，已经大量应用于酶工程，可由于蛋白质序列空间的尺寸巨大以及实验数据少，酶分子的改造需要进行大量的计算或开展实验筛选工作。想要实现高效的酶分子改造，提高酶分子进化高度，还需引入更为先进的技术来指导改造过程。 随着测序、高通量筛选方法、蛋白质数据库和人工智能的发展，数据驱动的酶工程有望应对这些挑战。 人工智能辅助酶工程有两大目标即酶功能预测和酶分子改造。目前，基于机器学习并采用公开数据集，已成功解决蛋白质的溶解度预测、功能预测、稳定性预测和结构预测等预测类问题。 基于机器学习的酶分子改造过程，图源10.13345/j.cjb.230748 如今，公开的蛋白质数据库中已经收集了数百万条蛋白质序列、数十万个蛋白质结构、数千万个生物物理值以及数百个带注释的催化机制，并且数据还在持续丰富，为人工智能指导的酶工程中机器学习算法奠定了坚实的数据基础。 国内部分参与企业和机构，数据源自公开信息整理 目前，已有不少国内企业躬身入局酶工程。 由君联资本、博远资本联合领投的惠利生物致力于合成生物反应核心酶元件的计算设计，是少数具有核心技术、规模量产、商业化闭环综合能力的生物制造企业，已在医药中间体、动保、食品等多领域落地解决方案。 惠利生物的核心技术平台——酶计算设计平台，是一个标准化、自动化、通用性的人工智能工业酶计算设计平台，用计算技术及数据推动生物制造的高效能、高强度、柔性化发展，通过计算设计技术，大幅优化筛选效率，高效实现酶功能改造，变革性地推动绿色生物制造的发展。惠利生物重点围绕工业酶制剂的创制，为健康医疗，未来食品，新型材料，能源开发，环境保护等提供有效的生物学解决方案。 还有致力于酶的挖掘、工程化改造，以及以生物催化技术的酶赛生物，提供了从概念构思到产品落地的“端到端”的整体生物催化解决方案。其两大底层技术平台BioEngine酶定向进化平台和BioNavigator酶虚拟技术平台，实现了酶工程的虚拟计算与进化，并结合湿实验和干实验的方法，不断帮助酶赛丰富不同的酶库以及积累高质量数据，加速商业化进程。 南京趣酶生物是一家合成生物学创新型企业，基于自主研发的AI平台和多年产业化积累，趣酶生物正在打造自身高效的研发能力和快速的产品持续迭代能力。趣酶生物建立了从基因设计、克隆到蛋白表达的高效研发、生产体系，可以为医药、临床诊断、精细化工以及其他行业提供种类齐全的具有自主知识产权的酶库，围绕工业客户的切实需求，高效低成本实现原料的交付。 可以看到，尽管有不少企业和科研院校入局，但和全球头部企业尚有不小的差距，在人工智能的帮助下，虽能快速拉近距离，但酶的工程化改造和相关制造工艺的优化并非独立进行，而是一套系统工程，它们之间相互影响、相互促进，不能一蹴而就。 像本文首节的那些MNC制药工程中，有一多半项目的背后都站着一家名为Codexis的公司。这些反应中用到的酶有的是从Codexis直接购买，有的是通过Codexis公司定制。如诺华的心衰药物LCZ696用到的转氨酶，就是找Codexis定制，从野生型的酶出发经历了10轮的定向进化，将酶活性提高了500,000倍。我国合成生物学要发展，要建立可靠的产业链，类似的企业必不可少。 虽然酶制剂行业自身仅有百亿美元的市场规模，但其投射到产业下游会呈指数级放大，如不能掌控，在未来产业迭代中难免会被“卡脖子”。目前，国内酶制剂的市场份额主要还是被国外品牌所把持，要想完成国产替代，还需要更多企业投身其中。 参考资料： 1.The Evolving Nature of Biocatalysis in Pharmaceutical Research and Development Scott P. France,Russell D. Lewis,Carlos A. Martinez  doi/10.1021/jacsau.2c00712 2.Microbial Enzyme Engineering: cornerstone of biological manufacturing JIN Cheng doi/10.13344/j.microbiol.china.207007 3.Progress in the application of artificial intelligence-assisted molecular modification of enzymes XU Pei,WANG Weihua,NING Hongwei,CAO Ruifen,LIU Sheng,FAN Peifeng,SONG Xiaoping  doi/10.13345/j.cjb.230748 4.《合成生物学》 刘建忠 *封面图片来源：123rf 如果您认同文章中的观点、信息，或想进一步讨论，请与我们联系；也可加入动脉网行业社群，结交更多志同道合的好友。 近 期 推 荐 声明：动脉网所刊载内容之知识产权为动脉网及相关权利人专属所有或持有。未经许可，禁止进行转载、摘编、复制及建立镜像等任何使用。 动脉网，未来医疗服务平台

引言p53是最重要的抑癌基因，功能广泛而强大。自从1979年p53蛋白被发现以来，p53一直是分子生物学和肿瘤学的“明星分子”。在PubMed数据库中用p53为关键词搜索，可以找到超过十万篇文献。在 Nature 杂志2017年的一项统计中，p53以绝对优势位列过去几十年最热门研究基因榜第一名。2024年是p53蛋白被发现45周年。为庆祝这一事件，2024年5月9日，美国哥伦比亚大学欧文医学中心顾伟教授课题组（刘彦卿博士为第一作者）应邀在 Cancer Cell 杂志撰写了题为：Understanding the complexity of p53 in a new era of tumor suppression 的长文综述。该综述全方位地总结了p53的发现、结构、功能、调节、在生理病理过程中的作用、作为疾病治疗靶点的潜力，以及p53研究领域的一些未解之谜。一、p53的发现、进化与结构p53的研究在过去几十年经历了几次关键的转折，是现代分子肿瘤学发展的一个缩影。1979年，多个实验室在SV40以及其它方式转化的细胞进行研究时独立发现了p53蛋白。最初，p53被认为是一个促进细胞转化的癌基因。然而，1989年一系列论文揭示野生型p53（WT p53）实际上是一个肿瘤抑制因子（图1）。图1 p53研究领域里程碑发现人类p53基因家族包含三个成员p53\p63和p73。该家族起源于至少8亿年前，随后发生基因复制和结构多样化从而产生这三个家族成员。一个有趣的发现是p53家族基因存在于一些单细胞真核生物中，例如领鞭毛类Monosiga brevicollis，这表明p53家族在多细胞生物的进化可能存在重要作用。单细胞真核生物中的p53家族基因被认为可以维持基因组稳定性以应对各种刺激。而p53基因出现在最早的脊椎动物中，并在进化上一直保守。鉴于低等生物患癌症的风险极小，p53家族在低等生物中的存在是引人注目的。这就提出了一个关于p53家族在进化中的最原始功能的问题。该家族最初可能参与维持生殖细胞的完整性，其众所周知的肿瘤抑制能力是在很久以后才获得的。p53蛋白的主要是作为一个转录因（TF）调控基因表达，但它也存在TF非依赖的功能（图2）。人类的全长p53蛋白（FLp53）包含393个氨基酸，这些氨基酸被组织成五个不同的结构域：N端转录激活结构域（TAD）、富含脯氨酸的结构域（PRD）、中间的DNA结合结构域（DBD）、四聚化结构域（TD）和C端调节结构域（CTD）。p53的 TAD分为两个子结构域TAD1和TAD2。在未受刺激的细胞中，p53蛋白同时以单体、二聚体和四聚体的混合状态存在，其中二聚体占主导地位。在不同类型的刺激信号（包括DNA损伤、癌基因激活、核糖体应激、端粒损伤、营养缺乏和缺氧等），p53蛋白通过其TD快速组装成功能性四聚体（一个“二聚体的二聚体“结构”）。通过使用 DBD，该四聚体可识别位于靶基因启动子或增强子处的p53结合位点以调节转录。p53的DBD折叠很好，其结构已被解析。然而，p53的TAD和CTD存在很多无序区，导致其并没有一个确定的结构。但这一特点有利于它们与转录相关的cofactor相互作用。这些无序区也可能通过与别的蛋白发生相分离介导转录活动。这两个结构域也是进行翻译后修饰 (PTM) 的主要区域。此外，PRD也有助于p53的转录调节活性。p53通过由两个十聚体重复组成的特定反应元件（RE）被招募到 DNA：RRRCWWGYYY（R，嘌呤；W、A 或 T；和 Y，嘧啶）。p53直接调控300多个靶基因的转录。而考虑到间接调节的基因，p53可以调节数千个基因的表达。目前大多数被报道的p53靶基因是蛋白质编码基因，但p53还调节各种非编码 RNA，比如miRNA、lncRNA，甚至circRNA。二、p53的调节：蛋白翻译后修饰是关键为了准确地执行其多方面的功能，p53的表达和活性需要在蛋白质、DNA和RNA水平上受到精细和多层次的调控（图2）。图2 p53的调节蛋白层面的调节p53蛋白可经历多种类型的PTM，包括ubiquitination、phosphorylation、acetylation、methylation、SUMOylation、NEDDylation、OGlcNAcylation、ADP-ribosylation、UFMylation、hydroxylation、β-hydroxybutyrylation、sulfation及isoLG adduction。不同的刺激信号决定PTM的位点和类型。p53的许多PTM是可逆的。PTM对p53的影响包括改变其蛋白质水平、细胞定位、cofactor招募、靶基因选择性，甚至蛋白质聚集。其中，泛素化、磷酸化和乙酰化在影响p53功能方面最常见且最有影响力。泛素化通常发生在p53 的C赖氨酸残基处。MDM2是最著名的p53调节因子，它使p53发生泛素化而受到降解，以维持未受刺激的细胞中的低p53水平或将核p53输出到细胞质。许多刺激和调节因子是通过减轻MDM2的抑制来激活p53。例如，p14ARF蛋白可以通过抑制MDM2介导的p53降解来稳定p53。支持MDM2介导的p53抑制的重要性的令人信服的证据来自小鼠模型，其中MDM2缺陷引起的胚胎致死可以通过敲除p53来回复。有趣的是，MDM2本身就是p53的靶基因。MDM2-p53构成的反馈环路是p53相关通路的核心。MDMX（或MDM4）是MDM2的家族成员，虽然其本身缺乏E3泛素连接酶活性，但可以与MDM2形成异二聚体，增强p53的降解。其他可降解p53的E3泛素连接酶包括ARF-BP1/HUWE1、COP1、CHIP和Pirh2。 丝氨酸和苏氨酸磷酸化位点分布在整个p53蛋白。ATM对p53的磷酸化是最早用于解释p53如何响应DNA损伤的机制。S15、T18和S20的磷酸化会破坏MDM2对p53的结合和抑制，同时增强p53与CBP等转录辅助因子的相互作用。其结果是p53介导的转录被激活，诱导细胞周期停滞和细胞凋亡。严重的DNA损伤进一步使p53在S46处磷酸化，从而加强细胞凋亡。p53乙酰化的发现是最早发现非组蛋白也可以发生乙酰化的例子。DBD中几个赖氨酸残基的乙酰化对于p53激活的能力至关重要，可以以启动子特异性的方式影响细胞周期停滞、细胞凋亡、衰老、铁死亡和mTOR通路。p53乙酰化在肿瘤抑制中的作用可以通过一系列乙酰化缺陷型（KR mutation）基因敲入小鼠模型得到最好的说明。例如，尽管p53-3KR突变体保留了其DNA结合活性，但却不能激活p21等主要靶基因。然而 p53-3KR突变小鼠却不易患肿瘤。而p53-4KR和p53-5KR突变体进一步消除了p53调节铁死亡和mTOR通路的能力，使得p53基本丧失肿瘤抑制功能。值得注意的是，CTD乙酰化的作用很复杂：CTD相同的赖氨酸残基也可以发生甲基化、泛素化、SUMOylation和NEDDylation等修饰。因此，CTD乙酰化缺陷突变体（p53-6KR和p53-7KR）小鼠未能表现出对肿瘤抑制的显著影响，因为这些突变体同时消除了不同类型PTM对p53功能的正面和负面影响。事实上，模拟乙酰化 (p53-KQ)的突变小鼠在转录和肿瘤抑制中表现出明显的p53激活（即便p53蛋白水平并未显著增加），这一发现强调了CTD乙酰化在体内状态的作用。总而言之，多种多样的蛋白修饰类型一起调节了p53的活性。值得注意的是，虽然in vitro研究表明很多PTM都对p53的功能有重要影响，但这些结果在in vivo状态未必可以得到重复。要想弄清某种蛋白修饰对p53的功能影响，最合适的是使用knock-in的小鼠模型。在蛋白质水平上，cofactor是另一个影响p53活性的重要因素。p53蛋白可以与多种cofactor结合，包括activator和inhibitor，这对其蛋白折叠、稳定性、细胞定位、DNA 结合、转录激活能力和靶基因选择有重要影响。例如，许多分子伴侣可以调节调节p53的折叠和稳定性。MDM2和MDMX结合p53的TAD以抑制其转录激活活性（不依赖于与MDM2作为E3泛素连接酶的作用）。多种转录调节因子（例如PBRM1、SET和Dicer）能够与p53相互作用。m6A甲基转移酶复合物的组成部分METTL3和 RBM15与p53相互作用，选择性地修饰部分p53靶基因的mRNA。 局部的染色质结构和表观遗传状态在决定p53的DNA结合和有效转录激活方面也起着至关重要的作用。在胶质母细胞瘤中，BRD8通过在p53靶基因位点招募组蛋白变体H2AZ来维持抑制性的染色质状态，从而阻止p53的结合。而TRIM24可以同时结合 p53和未甲基化的H3K4，阻止p53打开染色质。p53还可以与其他临近结合的TF合作建立易接近的染色质状态并增强转录。DNA和RNA层面的调节p53基因拥有两个启动子，从而导致选择性转录起始。p53基因的启动子区域可以发生DNA甲基化和组蛋白甲基化，从而影响p53基因本身的转录。多种转录因子可以控制p53基因的转录。p53的pre-mRNA可以发生选择性剪接。此外，p53 mRNA的稳定性、细胞定位和翻译都受到严格调控。另外，p53的激活是不是一个简单的“全或无”的模式，而是一个高度动态的过程。细胞的异质性、刺激的特性、上述多样化的调控因素以及其下游靶基因的稳定性共同决定了p53活性的动态变化。p53的variant、isoform和家族成员上述调节主要针对野生型p53。除此之外，p53还存在多种变体（包括单核苷酸多态性SNP和突变体）、不同转录本（isoform）和另外两个家族成员p63和p73。p53 SNPs: twins are differentP72R多态性是p53研究最广泛的SNP。与R72变体相比，P72变体诱导细胞凋亡的能力较弱，因此与R72变体相比，其个体寿命更长，但癌症死亡率更高。然而，也有报道称，携带R72变体的小鼠比P72的小鼠表现出更高的代谢功能障碍倾向，但它们也表现出雌性胚胎着床率的提高。p53基因中还有一些种族特异性的SNP，可能影响疾病易感性和治疗。p53 mutants: guardian has a dark side除了SNP之外，p53基因还会经历其他类型的遗传变异，例如基因缺失，以及更常见的基因突变。p53是癌症中最常见的突变基因之一，超过一半的癌症具有突变的 p53。错义突变是p53的主要突变类型。p53错义突变有6个最主要的突变位点：R175、G245、R248、R249、R273和R282，均位于DBD。它们的突变占p53所有错义突变的近 30%。其他错义突变发生率相对较高的位点包括H179和Y220。所有错义突变都能不同程度地影响p53的热稳定性。一般来说，p53的错义突变可分为“接触突变”和“结构/构象突变”。接触突变维持p53的整体构象但破坏了p53与DNA的结合（例如R248W和R273H）；而结构/构象突变则显著改变DBD的构象和稳定性（例如R175H、G245S和R249S），均会破坏p53的转录激活活性。R196、R213、R306和R342是p53无义突变的主要位点。虽然大多数癌症患者的p53突变发生在其体细胞中，但Li-Fraumeni综合征(LFS)患者携带一个生殖细胞来源的p53突变。他们一生中患一种或多种癌症的风险高达90%，其中50%在30岁之前罹患癌症。值得注意的是，正常体细胞也可能含有p53突变和其他致癌突变，这引出了一个问题：这些细胞在某些条件下是否更容易发生癌变。突变体p53的功能可归因于三种不同的效应：1）功能缺失（LOF）：突变体p53失去WT p53的活性。例如，p53突变体诱导细胞周期停滞和细胞凋亡的能力常常受到损害。2）显性负效应（DNE）：突变体p53干扰剩余的WT p53的功能。在人类多能干细胞中，突变型p53促进细胞自我更新。然而，正常组织中的这种DNE可能不像癌细胞中那样常见，因为正常细胞中突变型p53的水平通常保持在较低水平，类似于WT p53。3）功能获得（GOF）：突变体p53获得了缺失WT p53所未观察到的额外活性，通常是通过与特定cofactor的相互作用来实现。突变体p53的GOF很大程度上归因于其在癌细胞中可以积累到很高水平。例如，突变体p53可以与WT p53和其他肿瘤抑制因子（例如p63和p73）发生聚集。p53热点突变体可能获得抑制铁死亡的活性，从而促进肿瘤生长。通过调节促转移基因的表达，p53突变体能够增强不同小鼠模型中癌细胞的转移潜力。尽管大量证据表明p53突变体GOF的重要性，最近的一项研究表明，在不同的实验设置下，LOF比GOF更为关键。然而，将p53突变的功能仅归类为这三种效应之一过于简单化。GOF还是LOF在体内发挥更主导的作用可能取决于具体情况。很明显，p53突变引起的总体效果是上述所有三种效应综合作用的结果。p53 isoforms: one root, many branches除了全长p53（FLp53）之外，p53基因还可以产生其它转录本（isoform），这是由启动子选择、选择性剪接、选择性翻译，甚至FLp53的翻译后切割引起的。由四种不同 N 末端（ATG1、Δ40、Δ133和Δ160）和三个不同的C末端（α、β和γ）的不同组合方式，p53蛋白有至少12 种典型isoform。这些isoform的表达取决于其种类、发育阶段、组织类型，并且还受到各种调节机制的影响。这些isoform可能具有独特的活性。整体而言N端亚型比C端亚型得到更好的研究。特别地，它们在不同的癌症中经常表达异常。例如，Δ40p53抑制肿瘤细胞生长，而Δ160p53可以与突变型p53协作促进肿瘤发生。p63 and p73: siblings stand togetherp53与p63和p73具有高度的结构相似性，尤其是在它们的DBD。然而，它们在结构上也存在差异。这些结构特征导致这三种蛋白质之间既有共同，又有不同的功能。p63和p73都能够调节许多p53的靶基因并表现出肿瘤抑制活性。与p53相比，p63和p73在生殖细胞保护、生育力维持和发育调节方面发挥更多作用。例如，p63敲除（KO）小鼠表现出肢体、颅面和上皮发育缺陷，而p73 KO小鼠则表现出神经系统异常。三、p53的功能：多样性与复杂性p53可以调节多种功能，这些功能共同组成了复杂的p53功能网络（图3）。图3 p53的功能以及其在生理病理过程中的作用细胞周期停滞、凋亡、衰老与基因组稳定性诱导细胞周期停滞、凋亡和衰老是p53最早被发现的几项功能。各种刺激信号可以诱导p53发挥这些功能，其中DNA损伤是最有效的刺激类型。DNA损伤后，p53蛋白被稳定并激活以阻止细胞周期进行，为细胞提供时间窗口和足够的物质和能量，以修复受损的DNA。如果损伤太严重而无法修复，p53就会引发细胞凋亡和衰老，以消除受损的细胞。值得注意的是，p53激活的结果还取决于细胞和DNA损伤的类型。这三种功能被广泛认为是p53预防肿瘤发生的主要屏障。另外，p53也能被CRISPR-Cas9编辑基因组时产生的DNA损伤激活，从而降低基因编辑的效率。另一方面，未能消除受损细胞会导致基因组不稳定。p53的缺失，包括失杂合性（LOH）和双等位基因失活或缺失，会促进基因组不稳定并驱动肿瘤细胞基因组的进化。p53被誉为“基因组的守护者”。p53可以直接促进DNA伤修复。事实上，许多p53靶基因有助于DNA修复过程。然而，目前仍不清楚p53介导的这些DNA修复相关靶基因的激活是否足以独立于其他p53功能从而抑制肿瘤发生。代谢和铁死亡p53是调节葡萄糖、脂质、氨基酸、核苷酸、铁和氧化还原代谢的重要调节因子（参见一阴一阳之谓道：顾伟实验室总结p53基因在肿瘤代谢中的复杂作用）。此外，它还调节自噬，并与AMPK、AKT和mTOR等关键代谢调节因子存在广泛的交互作用。p53的这一功能将其与多种代谢性疾病（包括癌症）联系起来。一般来说，p53抑制合成代谢过程（例如脂肪从头生成和核苷酸合成），同时促进分解代谢（包括氧化磷酸化、脂肪分解和脂肪酸氧化）。增强的糖酵解会产生多种用于癌细胞生物合成的分子原料（Warburg效应），因此也会受到p53的抑制。p53的这些代谢功能抑制了癌细胞快速增殖的需求，从而导致肿瘤抑制。然而，p53在许多代谢过程中表现出双向作用。这种矛盾的活动本质在于p53功能的复杂性。p53在ROS控制中的作用提供了一个很好的例子。当ROS强度较低时（代表轻度、短暂、可耐受和可缓解的刺激），p53发挥抗氧化作用，减少ROS，保护细胞免受损伤（促生存）。相反，当ROS水平过高并可能造成无法控制的损伤（代表严重、长期、有害且无法缓解的刺激）时，p53会进一步提高ROS水平，导致细胞死亡，从而保护附近未受损的细胞（促死亡）。铁死亡是一种铁依赖的受调节细胞死亡方式，发生在脂质过氧化水平过高时，与代谢途径密切相关。p53是铁死亡的主要调节因子之一（参见重新界定铁死亡基本类型：顾伟实验室总结p53在铁死亡调节中的复杂作用）。p53的几个代谢靶基因（包括SLC7A11、VKORC1L1、GLS2和PLTP）直接参与调节铁死亡。与DNA损伤反应期间的细胞凋亡类似，铁死亡能够消除代谢应激过程中严重受损的细胞。p53介导的铁死亡被认为是肿瘤抑制中的重要武器。有趣的是，一个非洲人群特异性p53 SNP可能减弱p53诱导铁死亡的能力从而损害了其肿瘤抑制功能。与细胞凋亡不同，经典铁死亡的发生通常需要用铁死亡诱导剂（例如GPX4抑制剂）对细胞进行处理。值得注意的是，最近的一项研究表明，在缺乏常见铁死亡诱导剂的情况下，PHLDA2介导的磷脂酸过氧化会触发非经典铁死亡反应。由于p53能够同时促进经典和非经典铁死亡过程，因此一个有意思的问题是哪种铁死亡途径在p53介导的肿瘤抑制中发挥了更重要的作用。干细胞与细胞竞争干细胞与癌细胞有许多相似之处，包括持续增殖能力、代谢重编程和核心的转录因子网络。因此，p53在各种类型的干细胞中限制细胞干性并调节细胞命运。在胚胎干细胞（ESC）中，p53抑制维持干性的基因，同时激活促进分化相关的基因。在成体干细胞（ASC）中，p53抑制细胞自我更新、促进干细胞耗竭、维持干细胞静止或刺激分化。p53限制细胞干性的能力对其肿瘤抑制功能至关重要，因为这可以阻碍癌症干细胞的形成。p53调节的特异性分化途径有助于肺癌的肿瘤抑制。p53的丢失或突变可能会导致癌症中的去分化、细胞重编程和细胞可塑性增加。产生诱导型多能干细胞（iPSC）的过程类似于去分化和细胞癌化。p53是这一过程中的主要抑制因子之一，沉默p53可以大幅提高产生iPSC的效率。细胞竞争在正常发育、组织损伤修复、肿瘤进化和转移中至关重要。 一般来说，由于p53抑制合成代谢和增殖，同时促进细胞死亡，不利于细胞在竞争中胜过邻近细胞，因此高水平的p53活性往往标志着细胞竞争中的“失败者”状态。然而，有研究表明果蝇里的超级竞争者细胞需要p53活性才能消除附近的正常细胞。p53对细胞竞争的调节具有重要的生理意义。携带突变p53的细胞可能会发生克隆扩增，可能驱动肿瘤的发生和进化。这些p53突变细胞并不总是被保留，因为它们可能通过与附近的正常细胞竞争而经历坏死性凋亡，或者被具有更高适应度的其它基因突变的细胞所淘汰。肿瘤转移p53以细胞自主和非自主的方式在多个阶段抑制转移。在肿瘤细胞中，p53限制其移动性和上皮-间充质转化（EMT）过程。循环系统中的转移性癌细胞可能会发生失巢凋亡和铁死亡，这两个过程均可以被p53促进，以防止癌细胞迁移到新位点。在转移扩散的每一步，癌细胞都会采用专门的代谢程序来满足其能量和生物分子的需求，p53则可能抑制这些细胞代谢过程。另一方面，p53塑造了不利于转移的肿瘤微环境（TME）。例如，p53抑制血管生成和淋巴管生成，阻断通过血液和淋巴系统这两条的要转移途径。它还可以维持细胞外基质的完整性，增强肿瘤细胞在其上面的粘附，限制肿瘤细胞的运动。此外，p53还可以激活抑制肿瘤转移的炎症反应。免疫p53的另一个重要功能是调节免疫反应。p53通过多种机制在先天免疫和适应性免疫中发挥作用。肿瘤细胞和非肿瘤细胞中的p53协同构建肿瘤抑制免疫网络。在肿瘤细胞中，p53通过上调miR-34间接抑制PD-L1表达，使肿瘤细胞对抗肿瘤免疫反应和免疫治疗敏感。p53激活cGAS-STING通路以诱导抗肿瘤活性。在小鼠肝癌模型中，恢复p53表达会诱导肿瘤细胞衰老，引发炎症细胞因子的释放，并引发先天免疫反应以消灭肿瘤细胞。在肝星状细胞中，p53诱导的细胞衰老也表现出肝癌抑制作用—通过建立衰老相关分泌表型（SASP），可增强M1巨噬细胞极化以维持肿瘤抑制性TME。在小鼠骨髓前体细胞的亚型中，p53驱动其分化为Ly6c+CD103+单核抗原呈递细胞，从而增强抗肿瘤免疫。肿瘤细胞或TME细胞中p53的缺失可以将肿瘤抑制性免疫微环境逆转为免疫抑制状态，促进肿瘤细胞的免疫耐受或逃逸，或建立有利于肿瘤转移的炎症环境。突变的p53可能会刺激肿瘤细胞免疫逃避。有趣的是，p53突变体本身可以产生作为肿瘤免疫治疗靶点的肿瘤抗原。p53也参与自身免疫反应和针对各种病原体的免疫防御。值得注意的是，并非p53的所有免疫相关活性都会促进免疫细胞功能或有益于健康。p53可能抑制某些T细胞亚型的增殖和功能。例如，p53抑制抗原非特异性CD4+T细胞增殖，这一过程可以通过T细胞受体（TCR）信号通路消除。一些病毒依赖于p53引起细胞周期停滞来进行复制。p53功能的再思考p53是一个强大的调节因子，具有一系列多样化且复杂的功能，很难仅用几句话来概括其作用。这些功能由这种单一蛋白质精细协调，以实现统一的生物学目的。一些简化的表述通常被用于描述p53的工作模式，例如“基因组的守护者”、“保护者或杀手”、以及“促生存或促死亡”。p53的工作模式源于低等生物中p53同源基因对生殖细胞的保护。人类p53在体细胞中发挥类似的保护作用。在大多数表达p53或p53样基因的物种中，该基因本质上是一个刺激反应因子，而不仅仅是肿瘤抑制因子。因此，p53也可以被称为“细胞卫士”。p53的肿瘤抑制作用可能是一种巧合，因为它的一些卫士功能本质上与许多癌细胞特性是拮抗的。因此，p53的正常活性附带地抑制了肿瘤的发生和发展。四、p53在生理病理过程中的作用基于其广泛的功能，p53在正常生理活动中有重要作用。另外，p53也在疾病中发挥正面或负面的作用（图3）。生殖、发育、再生、修复和衰老p53主要影响雌性的生殖。p53可以转录激活激活LIF基因，这是胚胎着床的关键细胞因子。p53缺失的雌性小鼠中较低的LIF水平会导致着床失败。在35岁以下不孕女性中，p53的P72变体（对LIF转录激活作用比R72更弱）的比例更高，表明p53活性与着床率之间存在正相关。p53对发育的调节源于其在细胞周期、细胞死亡、干细胞和细胞竞争中的关键作用。p53维持胚胎干细胞的基因组完整性，促进分化，维持正常发育。早期发育中的p53必须受到控制，p53失调（缺失、过度激活或突变）与小鼠和人类的各种发育缺陷有关。p53还在不同类型的成体干细胞中发挥作用，通过保护成体干细胞完整性、使它们处于休眠状态、微调分化途径、阻止无限增殖、无序分化和去分化过程，以及抑制肿瘤发生，来维持体细胞层次结构。p53也在组织再生中发挥作用。最近的一项研究发现，p53通过调节AT1分化来促进肺泡再生。由于伤口愈合过程与肿瘤转移有许多相似之处，p53可能会抑制这个过程。理论上，p53的活性同时具有促衰老和抗衰老作用。一方面，p53介导的应激（尤其是DNA损伤，这是衰老的关键驱动因素）反应利于细胞存活、去除受损细胞、保护组织完整性并维持机体稳态，从而有可能延缓衰老。然而，p53调节的过度且持续的DNA损伤反应会对衰老产生相反的影响。另一方面，p53导致的干细胞耗竭会加速衰老过程，但也有反例。此外，p53调节代谢、免疫活性及其与Sirtuins家族蛋白的相互作用也与衰老有关。p53活性、肿瘤抑制和衰老之间的关系已在不同的小鼠模型中进行了研究，但尚未达成共识，这可能源于p53功能的高度环境依赖性。对p53、癌症和衰老之间关系的深入了解可以通过研究小鼠以外的动物来获得。一个值得注意的例子是大象，它有20个p53基因拷贝，并且表现出低肿瘤发生率和较长的寿命。目前还需要投入更多努力来探索p53在衰老中的作用，希望开发出能够更好地平衡肿瘤抑制与衰老的干预措施，或者可能在降低肿瘤发病率的同时实现长寿。神经退行性疾病p53在衰老调节中的作用与其在各种神经退行性疾病（NDD）中的功能密切相关。p53蛋白水平在这些疾病中通常是升高的。p53主要通过诱导细胞凋亡来促进NDD进展。最近，铁死亡被认为在NDD中发挥着重要作用。作为铁死亡的主要调节者，p53可能通过调节铁死亡参与NDD进展。此外p53蛋白聚集与阿尔茨海默病有关。在开发通过针对p53通路来进行癌症治疗或延缓老年人衰老的的药物时，应考虑p53对NDD的影响。放射病、化疗毒性和缺血性损伤接触辐射和基因毒性试剂（出于意外或者是作为癌症治疗的一部分），都会激活p53依赖性细胞凋亡和铁死亡，导致不同器官出现病变。特别是，这种机制是肿瘤放疗和化疗中主要副作用的基础。在基因毒性刺激下，p53的存在并不总是有害的。p53对辐射的反应是组织特异性的；虽然它会刺激造血系统、毛囊和脊髓中与辐射相关的细胞死亡，但它对胃肠道具有辐射防护作用。同样，p53促进的细胞凋亡和铁死亡会导致大脑（例如中风）、肾脏（例如肾移植）和心脏（例如心肌梗塞）等器官的缺血性损伤。代谢性疾病p53在多种代谢疾病中，包括肥胖、糖尿病、酒精性和非酒精性脂肪肝病（AFLD和NAFLD）以及心血管疾病，发挥着复杂的作用。它的多方面活性，特别是在代谢调节方面的功能，影响不同细胞、组织和器官（例如胰腺β细胞、肝脏、肌肉和脂肪组织）中发生的代谢性疾病。关于p53在这些疾病中的功能，经常有看似相互矛盾的结果。例如，骨骼肌祖细胞和agouti-related peptide neuron中的p53可以预防肥胖。而肝脏中的R72 p53变体却可促进脂肪积累和NAFLD。此外，在内皮细胞中，p53会加剧饮食性肥胖。因此，在讨论p53在全身代谢和相关代谢疾病中的功能时，必须将其置于特定的背景下。以p53为靶点治疗某些代谢疾病时必须小心，以避免扰乱其他代谢过程，并最大限度地降低受体细胞癌变的风险。癌症如前所述，p53拥有一系列功能来对抗癌症的所有Hallmarks，这些功能可能由于其在癌细胞中的突变、缺失或抑制而丢失或逆转（图4）。图4 p53与cancer hallmarks虽然只需要一个p53等位基因的突变就可能导致细胞癌化，p53基因的失杂合性（LOH）经常发生。p53突变背后的机制尚不完全清楚。有些可能是由环境和化学致癌物引起的，例如紫外线辐射、黄曲霉素和烟草，它们会在p53基因上留下特征突变指纹。p53突变的频率和模式由性别、组织类型和细胞等因素决定。此外，不同肿瘤之间p53突变发生的时间也不同。即使在同一肿瘤类型中，不同的p53突变体也可能不会导致相同的表型。之前介绍过，突变型p53通过LOF、DNE和GOF促进肿瘤发展，这在小鼠模型中得到了很好的证明。虽然人们广泛关注p53热点突变，但其它突变也不应忽视。例如，破坏p53寡聚化的错义突变可导致肿瘤发生。p53 PRD中的错义突变可能会影响其肿瘤抑制功能。肿瘤中针对突变p53的血清抗体、突变p53的免疫组化结果，以及突变p53的DNA片段可用作肿瘤患者的诊断和预后生物标志物。p53突变还可作为某些肿瘤治疗效果的预测因子，并可用于患者分类。p53基因位于17号染色体的短臂（17p13.1）上，这是肿瘤中经常缺失的区域。p53 缺失以多种不同方式促进肿瘤生长和转移。p53缺失通常与附近基因（例如POLR2A和EIF5A）的缺失有关，这些基因的缺失也有助于肿瘤发生。同时靶向这些一起缺失的基因有可能更好地治疗肿瘤。由于p53突变和缺失对癌症发生有显著影响，p53突变或缺失已被有效地应用于建立各种小鼠肿瘤模型。一个紧密相关的问题是，p53的LOF、DNE和GOF中，哪一个对于p53相关的肿瘤进展更重要？虽然p53突变体的GOF对肿瘤的促进作用已获得大量证据支持，但也有研究表明，LOF和DNE比GOF对细胞癌化的贡献更大。LFS患者中等的p53 LOH发生率（40-60%）对这个问题有提示作用。目前还需要进行更多研究来澄清这个问题。此问题的答案很可能是随不同的肿瘤类型发生变化。 相当大比例的肿瘤保留了两个完整的野生型p53等位基因。这些肿瘤可能使用不同的方法来减弱p53及其相关通路的活性。一种常见的方法是通过上调p53的负调节因子来增强对p53蛋白水平、入核、启动子结合和转录激活活性的抑制。肉瘤和胶质母细胞瘤中MDM2基因的扩增就是一个显著的例子。除了扩增之外，MDM2的T309G SNP 和p14ARF的缺失都会增强肿瘤中MDM2对WT p53的抑制。许多致癌病毒（例如SV40、EBV和KSHV）通过抑制p53来转化细胞。WT p53会通过多种机制错误折叠成pseudo-mutant。除了直接抑制p53外，p53下游效应分子的抑制也会损害WT p53的肿瘤抑制作用。尽管p53是众所周知的肿瘤抑制因子，但零星报道表明在某些情况下,WT p53活性可能促进肿瘤发生和肿瘤存活。这可能发生在癌前阶段和肿瘤生长期间。WT p53的激活还可能破坏肿瘤治疗的疗效，促进肿瘤耐药，导致肿瘤复发。这些情况都源于癌前细胞或肿瘤细胞为了生存和发展而利用了p53的一种或多种功能。相应地，一些p53靶基因，例如MDM2和TIGAR，可以发挥癌基因作用。因此，p53不应被简单而刻板地视为一个肿瘤抑制因子。p53还影响其他一些疾病。总而言之，除了其最著名的在癌症中的功能之外，p53在正常生理和病理过程中都有广泛作用（图 3）。机体健康是通过维持身体各方面的稳态来实现的，这是一个动态和平衡的过程。作为主要的应激反应因子，p53可以保护细胞稳态免受各种刺激的影响。然而，它的活性可能对健康产生积极和消极的影响，因此应被保持在一个平衡状态。p53活性不足和过度都会破坏健康状态。因此，在设计靶向p53的健康促进和疾病治疗策略时，应认真仔细地考虑p53的双刃剑角色。五、靶向p53以治疗疾病靶向p53治疗癌症其“肿瘤抑制转录因子”的特性使得p53看起来很难成为靶向治疗的靶点。尽管如此，研究者已经开发了多种方法来增强或恢复野生型p53的功能，这具体取决于p53在癌细胞中的状态（抑制、突变或者丢失）（图 5）。图5 靶向p53治疗癌症在保留WT p53的癌细胞中，一个直观的想法是消除对p53的抑制。这可以通过降低p53抑制蛋白的蛋白质水平（使用siRNA、PROTAC或分子胶水等）或活性来实现。然而，这些方法通常缺乏靶点特异性，因为许多p53抑制因子具有p53之外的其它靶标。因此，人们付出了大量努力来寻找特异性破坏p53与其抑制因子之间的蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）的小分子。MDM2是提高WT p53蛋白水平和活性的主要靶点。Nutlin是第一个干扰MDM2结合并降解p53的小分子。基于它，包括RG7112和更有效的RG7388 （idasanutlin）在内的几种衍生物已被开发出来并在临床试验中进行测试。MDM2拮抗剂idasanutlin在一项名为“复发性或难治性急性髓系白血病的总体生存（MIRROS）”临床试验中，尽管与阿糖胞苷加安慰剂组相比，阿糖胞苷加idasanutlin组的总体缓解率令人鼓舞，但尚未达到主要终点（总体生存率）。更重要的是，idasanutlin治疗可能会引起血细胞和胃肠道毒性，凸显了p53激活药物的潜在副作用。MDM2-p53相互作用的其他小分子抑制剂包括APG-115和AMG 232（KRT-232），两者均正在临床试验中。ALRN-6924是一种装订肽，可同时减轻MDM2和MDMX对p53的抑制。p53的其他负调节因子，如USP7、HPV E6、SIRT1/2、VPRBP和SETD8都是很有前景的激活p53的靶标。鉴于PTM对调节p53活性至关重要，靶向这些cofactor具有不错的潜力。同样，如何特异性影响p53的蛋白翻译后修饰状态（而不影响别的蛋白）是一个很大的挑战。另外，调节WT p53蛋白质折叠、细胞定位、DNA结合和活性动态的cofactor也应考虑用于靶向治疗。与p53表达和活性相关的其他方面，包括选择性剪接和翻译、mRNA稳定性和SNP，也可以作为治疗靶点。在携带p53错义突变的癌细胞中，目前主要努力方向集中在恢复WT p53的活性。多项证据提示WT和突变体p53的构象可能是可互换的。这种可能性为使用专门设计的小分子（corrector）来恢复突变型p53的肿瘤抑制构象提供了机会。1999年，CP-31398成为第一个被发现能够恢复突变p53转录激活能力并抑制肿瘤生长的化合物。此后，发现了更多突变p53的corrector，例如PRIMA-1。PRIMA-1的降解代谢物亚甲基奎宁环酮（MQ），与突变体p53中半胱氨酸的硫醇基团共价结合，以恢复其WT构象。然而，它还通过与其他蛋白质反应，以p53非依赖的方式改变细胞的氧化还原状态。其衍生物PRIMA-1MET（APR-246或eprenetapopt）和APR-548正在进行多项临床试验。一种缩氨基硫脲药物COTI-2也处于临床试验中。上海交通大学卢敏教授课题组发现，三氧化二砷（ATO），一种治疗急性早幼粒细胞白血病的药物，可以恢复许多p53突变体，其效率取决于突变体的可溶性和温度敏感性。该组还发现抗寄生虫药物酒石酸锑钾(PAT)也可以恢复温度敏感型p53突变体，如p53-V272M。上述这些corrector可以恢复多个p53突变体，但它们的广谱性质可能会限制它们对特定突变的效率。针对特定突变的靶向corrector将更适合个性化治疗。例如PhiKan083、PK7088、PC14586和KG13可以用于纠正p53-Y220C突变体。此外，西奈山医学院金坚教授课题组发现了一种p53乙酰化靶向嵌合体（AceTAC）-MS78可促进p53-Y220C的K382乙酰化，从而专门恢复其肿瘤抑制活性。对于更常见的p53-R175H突变体，缩氨基硫脲药物ZMC1（NSC319726）可促进突变p53与锌结合使突变体形成WT构象。ReACp53和ADH-6可以缓解突变体p53的聚集。解离的突变体p53部分恢复了肿瘤抑制活性。突变体 p53的某些GOF方面也是可靶向的。例如，NSC59984促进突变型p53降解，从而释放被束缚的p73以抑制肿瘤生长。其他药物，如ganetespib、MCB-613和biomimetic nanoreceptor也促进突变型p53降解。为了治疗p53的无义突变，可以使用诱导翻译通读（readthrough）或抑制“无义介导的mRNA降解（NMD）” 的小分子，例如G418、2,6-DAP、CC-90009和NMDI14。对于p53突变的癌细胞，另一种方法是溶瘤病毒疗法。ONYX-015是一种改良的腺病毒，仅在p53失活的细胞中复制，因此选择性地杀死具有p53突变的癌细胞，同时不伤害正常细胞。要治疗p53缺失的肿瘤，一种方法是直接引入p53蛋白或使用基因疗法来传递p53的mRNA或DNA进入肿瘤细胞，从而恢复WT p53蛋白的表达。腺相关病毒（AAV）和纳米颗粒技术的进步可能会增强p53基因治疗的开发和应用。CRISPR-Cas9碱基编辑技术在纠正肿瘤中p53突变方面的潜力也值得重视。靶向p53可以涉及肿瘤微环境中的多种细胞类型，以实现肿瘤抑制的效果。例如，p53激活会诱导内源性逆转录病毒的表达，从而增强免疫治疗。如前所述，突变型p53可以产生免疫治疗可靶向的肿瘤新抗原。例如，工程化抗体P1C1TM可以区分WT和p53突变细胞上的识别p53肽段的MHC，介导细胞毒性或作为抗体药物偶联物（ADC）以特异性消除p53突变的肿瘤细胞。双特异性抗体H2-scDb，可将呈递p53-R175H新抗原的癌细胞与T细胞连接起来，有效促进T细胞对癌细胞的破坏。识别突变型p53衍生的新抗原还可以增强过继性细胞疗法（例如CAR-T和TCR-T）和p53疫苗的开发。近年来mRNA疫苗技术的成功鼓励了在p53疫苗方向的进一步探索。靶向免疫细胞和肿瘤基质细胞（例如癌症相关成纤维细胞）中的p53也可以增强抗肿瘤效果。p53的状态可以显著影响对某些癌症治疗的敏感性。通常，p53靶向疗法会与其他疗法联合使用，这主要有两个目的：增强激活或恢复p53的功效，以及利用由同时激活 p53并干预其他途径产生的合成致死效应。例如，在急性髓性白血病中，p53的激活与 Bcl-2抑制相结合有助于克服对其中任何单个治疗方法的耐药性并增强癌细胞凋亡。除了直接靶向p53蛋白之外，p53通路关键的下游成分，尤其是对p53介导的肿瘤抑制至关重要的效应分子，也可以进行靶向从而部分激活p53信号通路。这种方法虽然可能不如直接激活WT p53有效，但可能比激活p53更容易实现，并且可以作为p53靶向治疗策略的补充。除了治疗和预防应用之外，p53在诊断和预后方面的价值也不应被忽视。虽然从来不缺乏靶向p53的思路，但能进入临床试验的药物和疗法只是少数，更不用说成功获批进入临床应用了。在p53靶向药物真正造福癌症患者之前，还需要克服以下几个障碍：1、需要优化药物的吸收、分布、代谢和排出（ADME）。2、p53靶向治疗的效率受到多种因素的影响。尽管p53具有强大的肿瘤抑制能力，但其激活并不总是能保证有效地根除肿瘤细胞。患者分类和联合治疗等策略可能会提高疗效。3、一些药物的特异性较低，可能会导致脱靶效应。4、药物on-target或off-target所引起的副作用是主要的安全问题。这在正常细胞通过阻断MDM2-p53相互作用来激活WT p53时尤其明显。鉴于诱导细胞周期停滞、细胞凋亡和衰老对于p53的肿瘤抑制并非必不可少（而这几个效应却是p53激活的副作用产生的主要机制），开发在不损害正常细胞的情况下依然保留p53抗肿瘤作用的疗法是一个切实可行的目标。另一个令人担忧的问题是，在携带p53突变的正常细胞中，MDM2抑制剂可能通过稳定这些p53突变体来激活它们的致癌功能。这一问题值得临床实践中认真关注。特异性地向肿瘤细胞递送药物可以降低毒性。值得注意的是，如前所述，p53介导的细胞死亡对肿瘤放疗和化疗过程中出现的副作用有明显贡献。因此，抑制p53活性可能有利于减少这些与治疗相关的副作用。有趣的是，如果控制得当，p53的轻度激活可用于cyclotherapy，从而起到保护正常细胞的作用。5、p53靶向治疗存在驱动肿瘤进化的风险，以及筛选出p53突变，导致治疗抵抗和肿瘤复发。适当的联合治疗可能有助于减轻这种风险。6、如前所述，p53在极少情况下会促进肿瘤存活、进展、耐药性和复发。在这些情况下，需要仔细考虑以确定是否应该激活p53来治疗肿瘤。随着人工智能、结构生物学和多组学等领域的进步，这些问题最终将得到解决。靶向p53治疗其它疾病在正常生理过程和非癌症疾病中靶向p53的探索并不像在癌症中那样广泛和深入。然而，鉴于p53的广泛作用，调节其活性可能改善正常生理功能和以及减轻p53相关疾病，从而增强健康。例如，激活子宫中的p53可能会提高胚胎着床的成功率，而抑制p53则可能会预防神经退行性疾病并减少缺血性器官损伤。在代谢性疾病和衰老中，p53的作用仍然存在争议，值得进一步研究。为了抑制p53活性，可以采用多种方法，例如使用p53特异性抑制剂，破坏p53与其激活因子之间的蛋白结合，或增强p53抑制因子的功能。这些方法正好与用于激活p53的方法相反。需要注意的是，抑制p53可能会无意中增加肿瘤发生的风险。进行短期干预和针对某些细胞进行特异性递送p53抑制药物等策略可以降低这种风险。展望未来，p53的临床应用将不仅仅局限于癌症治疗；靶向p53以改善健康的前景充满希望。六、p53领域亟待解决的重要问题p53领域在过去45年的发展里取得了巨大的进展。p53基本的作用机制，调节方式，以及疾病治疗潜力得到了阐明。但这个领域依然存在一些基本的问题需要解决。第一、基础水平的p53有什么作用。在静息状态的细胞中，p53蛋白的表达和活性都保持在较低水平，直到各种刺激稳定并激活它。然而，p53执行某些功能（例如调节细胞干性、细胞竞争、ROS水平和免疫活动）时并不总是需要明显的刺激。那么基础水平的p53在未应激的细胞中如何发挥作用？p53的基础活性是否有助于肿瘤抑制？基础表达的p53可以与其部分靶基因的启动子或增强子结合，建立一个对刺激进行快速反应的准备状态。重要的是，它还维持一个特定的靶基因表达谱。特别地，基础水平的p53可以维持一些肿瘤抑制基因，如PTEN的表达。基础水平p53和p53激活所调节的靶基因谱可能存在差异。另外，p53的蛋白积累、完全的转录激活能力、以及四聚体的构象对于其肿瘤抑制作用并不是绝对必要的。因此，利用p53的基础活性可能有助于最大限度地减少对正常细胞的副作用，并降低因其激活而选择p53突变的风险。研究基础水平p53的功能需要合适的实验模型。虽然敲除肿瘤细胞系中的p53可能会提供一些见解，但将细胞从体内转移到培养皿的这个过程本身就可能激活p53。因此，培养皿细胞中的p53水平可能无法反映真正无应激的基础p53状态，这在解释体外实验结果时需要注意。更重要的是，培养的细胞缺乏体内存在的多样化环境刺激，因此无法完全模拟实际的成瘤过程。此外，在p53 KO小鼠中观察到的表型不应仅仅归因于基础p53活性的丧失，因为激活的p53的功能也被消除了。第二、p53的抑制性靶基因对其功能有何贡献？p53的作用不仅限于激活转录。人们还发现它可以抑制许多基因的表达，包括SLC7A11、NANOG和VKORC1L11。在大多数情况下，p53在转录或转录后水平间接抑制基因表达。它与其它转录因子竞争DNA结合，激活基因表达的负调节因子，或抑制转录激活因子的表达。但也有报道表明，通过识别特殊的结合位点，p53可以直接抑制转录，干扰增强子功能，以及重塑染色质结构。尽管p53是否可以直接抑制转录尚存争议，需要进一步研究。但一个无可争议的事实是，数百个基因在p53激活时下调，或在p53缺失时上调。未来的研究将更明确地阐明p53是否以及如何直接抑制转录，以及这些抑制性靶基因在p53网络中发挥什么样的作用。第三，基因工程小鼠模型（GEMM）对于p53研究是否足够有效？虽然GEMM极大地增进了我们对p53的理解，但它们也存在固有的局限性。最值得注意的是人类和小鼠之间的物种差距，许多人类p53与小鼠 p53的靶基因并不重叠，更不用说免疫系统或其他生物系统之间的差异了。在体外研究中获得的有关p53的结果经常在小鼠模型中进行测试。尽管如此，在小鼠中大多数可重复的结果不能直接转化应用到人类身上。目前，人源化小鼠模型和人类类器官可作为GEMM的补充。然而，这些替代方案也有其局限性。因此，迫切需要为p53研究开发更实用且与人类生理病理相关的实验系统。第四，p53环境依赖性活性的基础机制和生物学相关性是什么？上述各部分内容里，一个反复重申的事实是p53功能高度依赖具体的环境。p53的靶基因谱表现出显著的器官特异性和随时空不同而变化。p53表达的异质性在单个肿瘤的不同细胞里也很明显。即使在同一细胞内，p53激活的靶点选择性和结果也由多种变量决定。此外，性别也可以决定某些受p53调节的人类行为。在解释与p53相关的实验结果时，将它们置于特定的背景中至关重要。目前仍需进一步努力，更深入地了解p53活性调控机制，以根据不同情境开发针对p53的特定治疗方案。第五，靶向p53真的是治疗癌症的可靠方法吗？癌症中p53的多种失调形式和p53错义突变的多样性使针对每种类型的p53变化而设计的特定药物变得困难。p53活性的背景依赖性使这个问题变得更加复杂。然而，以p53为靶点来治疗癌症仍然是一种吸引人的方法。考虑到频繁的副作用，p53通路中是否还有其他元件可以作为比MDM2更安全的靶点，而不影响抗肿瘤功效？是否有可能通过激活或抑制p53来治疗所有p53相关疾病，并改善整体健康，特别是延长寿命，从而实现“双药包治百病”的目标？这个目标看似遥不可及，但确实值得探索。同样，其他几个重要问题仍然没有答案。p53的新靶基因不断被发现。一个值得注意的例子是ZMAT3基因，它在p53的肿瘤抑制中发挥着关键作用。p53的未被发现靶点和功能有哪些？p53介导肿瘤抑制不可或缺的靶点或功能有哪些？p53的两个TAD的功能多样性和进化意义是什么？它们如何合作执行p53的肿瘤抑制功能？该领域已取得一些进展，但尚未得到充分解决。p53的non-cell-autonomous活性是癌症治疗的可行靶标吗？在什么情况下p53会支持肿瘤的发展？我们能否利用p63和p73与p53靶向药物协同治疗癌症或其他疾病？这个问题清单可以更长。未来还会涌现出新的问题。正是在寻找这些问题的答案的过程中，我们对p53的认识得到更新和加深。七、结论在过去45年里，对p53研究是一段非凡历程。如上所述，无数发现使人们更好地了解在不同生理环境下p53功能的复杂性。p53能调节多种肿瘤抑制活动，这提出了一个问题：哪种机制对于抑制不同类型的肿瘤更为关键。此外，虽然p53被广泛认为是一种肿瘤抑制因子，但并非所有p53诱导的活性都是肿瘤抑制所必需的。例如，p53介导的促细胞生存活性似乎与其在肿瘤中的生长抑制功能不一致。然而，这种活性对于正常细胞稳态可能很重要，允许正常细胞在应激反应期间存活。如何激活p53功能来治疗癌症依然没有很完善的答案。将MDM2靶向方法转化为临床应用的困难引发了一个重要的问题，即如何在不伤害正常组织的情况下杀死癌细胞。目前尚不清楚MDM2抑制剂（特别是在骨髓中）引起的毒性是MDM2途径或是p53激活所特有的。如果是前者，则应认真考虑靶向p53激活的不同途径。值得注意的是，与细胞凋亡等经典活动相比，许多涉及代谢、铁死亡和免疫的p53靶点不会直接对细胞造成严重伤害。研究这些靶基因的特异性激活是否能有效抑制肿瘤生长而不引起严重毒性将是很值得探索的方向。该综述通讯作者为哥伦比亚大学医学院顾伟教授，第一作者为顾伟教授实验室刘彦卿博士。本文写作过程中得到了p53主要发现者之一的Arnold Levine院士的帮助。苏振毅博士（近期已回到南京医科大学建立实验室）和Omid Tavana博士对本文亦有贡献。通讯作者介绍：顾伟教授，1986年毕业于北京大学，1995年获美国哥伦比亚大学博士学位，1995-1998在洛克菲勒大学从事博士后研究（导师为真核生物RNA聚合酶发现者、拉斯克奖得主Robert Roeder教授）。1999年入职哥伦比亚大学。2007年至今在哥伦比亚大学医学中心担任正教授、哥伦比亚大学Institute for Cancer Genetics的Abraham and Mildred Goldstein教授。顾伟教授顾伟教授主要从事p53在肿瘤抑制中的功能研究。他在p53相关调控通路（乙酰化和泛素化）以及铁死亡领域取得了杰出成就，在 Cell、Nature、Science、Cancer Cell、Nature Cell Biology、Nature Cancer、Cell Metabolism 和 Molecular Cell等国际权威杂志上发表论文60余篇，包括以通讯作者在Cell（7篇）、Nature（6篇）和Science（1篇）发表论文14篇，论文总被引近60000次，H指数95，并担任 Cell、Nature 和 Science 等国际权威期刊的审稿人。原文链接https://www.cell.com/cancer-cell/abstract/S1535-6108(24)00133-8文章来源|“生物世界”End往期精选围观一文读透细胞死亡(Cell Death) | 24年Cell重磅综述（长文收藏版）热文Nature | 破除传统：为何我们需要重新思考肿瘤的命名方式热文Nature | 2024年值得关注的七项技术热文Nature | 自身免疫性疾病能被治愈吗？科学家们终于看到了希望热文CRISPR技术进化史 | 24年Cell综述