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【导读】 联合疗法为实体瘤的免疫抑制和异质性微环境，提供了一种令人信服的治疗方案。然而，在方案设计中纳入单独的治疗方式，可能会受到复杂的物流、制造和药代动力学考虑的阻碍。在这项研究中，团队展示了一种使用lpp基因敲除的渗漏益生菌且同步分泌免疫治疗和溶瘤效应分子的单载体联合抗癌疗法。 2024年10月22日， 台湾中央研究院Kurt Yun Mou团队在期刊《Cell Reports Medicine》上发表了题为“Combinatorial leaky probiotic for anticancer immunopotentiation and tumor eradication”的研究论文。 多功能渗漏益生菌可实现同步免疫激活和肿瘤靶向溶细胞活性， 从而有效抑制肿瘤、提高肿瘤免疫细胞浸润和建立抗癌免疫记忆。LPP基因敲除可以提高益生菌耐受性和静脉适用性，为联合方案开发，提供了一种治疗可行的方法。 https://www.cell.com/cell-reports-medicine/fulltext/S2666-3791(24)00540-8#sec-3 关于溶瘤益生菌 01 最近，细菌和益生菌作为治疗媒介的出现，为治疗开发提供了新的机会。重组克隆技术中的多样化工具集，为生成表达多种生物制剂的载体，提供了合成灵活性。此外，细菌的肿瘤嗜性及其在缺氧肿瘤微环境中增殖的能力，促进了肿瘤靶向生物制剂的递送。 为了实现工程化单载体组合益生菌，团队在这项研究中采用了一种功能丧失策略，通过缺失lpp基因（Δlpp）来松动细菌的外膜，该基因编码共价吸附细菌外膜的脂蛋白。 团队表明Δlpp细菌具有渗漏表型， 能够直接释放表达的生物制剂，为联合治疗设计提供了一个灵活的平台。此外，由于Lpp脂蛋白与免疫刺激和反应原反应相关，因此，功能丧失Δlpp设计具有增强载体耐受性的额外好处。通过插入带有单个启动子的质粒，团队展示了多功能渗漏细菌的制备，这些细菌将免疫刺激、免疫检查点抑制剂和肿瘤靶向溶瘤成分结合在单个载体中，用于抗癌治疗。 为了证明用于抗癌治疗的组合渗漏益生菌的制备，团队整合了免疫刺激和溶瘤嵌合蛋白，以诱导杀瘤活性、调节肿瘤微环境和促进抗癌适应性免疫反应。团队表明，渗漏的细菌能够筛选成分设计，并且在载体工程过程中，验证了每个治疗成分的功能。优化的渗漏益生菌，表示为组合免疫治疗-溶瘤益生菌（CIOP），展示了不同效应器功能的直接和同步释放，从而实现协同抗肿瘤活性。功能丧失Δlpp策略可以提高益生菌耐受性，而不影响其肿瘤嗜性， 这使得CIOP适合静脉内给药。 CIOP在治疗侵袭性肿瘤类型方面优于单模式益生菌，它为肿瘤遏制提供了有利的抗癌免疫反应。多功能载体为单载体组合治疗开发，提供了一种通用方法。 用于单载体联合抗癌治疗的组合免疫治疗-溶瘤益生菌示意图 CIOP的组合免疫治疗和溶瘤功能，发挥协同抗癌活性 02 大的MC38肿瘤在OP和CIOP之间显示出明显的差异，因为OP显示出可以忽略不计的抑制作用，而CIOP有效地控制了原发性肿瘤。CIOP治疗在抑制远端肿瘤生长方面比OP更有效，表明CIOP载体在诱导抗癌免疫反应方面具有优势。CIOP的组合功能赋予的治疗益处在快速生长、表达间皮素的CT26肿瘤模型中也很明显，这表明双重抗癌功能增强了益生菌治疗的肿瘤抑制作用。在携带高度侵袭性B16F10黑色素瘤的小鼠中，团队进一步证明， CIOP可以实现显著的肿瘤抑制， 使肿瘤无法检测，并在单剂量治疗后诱导持久的抗癌适应性免疫。这些结果突出了CIOP在诱导杀瘤和免疫刺激活性，以实现稳健和持久的肿瘤遏制方面的协同作用。 使用表达免疫治疗、溶瘤或组合抗癌功能的益生菌进行抗癌治疗 静脉注射CIOP治疗，可实现肿瘤抑制并增加肿瘤微环境中的免疫细胞浸润 03 对免疫细胞组成的深入分析显示，在CIOP治疗的肿瘤中，CD8和CD4 T淋巴细胞的存在更高。除了T淋巴细胞外，CIOP还增加了MHCII阳性免疫细胞的数量，表明存在抗原呈递细胞，如CD19 B细胞、CD11c+树突状细胞和F4/80+ M1巨噬细胞。 团队还观察到，CIOP治疗的肿瘤具有升高的CD45肿瘤浸润白细胞水平。这些发现证实了， CIOP中免疫调节剂成分介导的免疫刺激功能， 它可以改变免疫抑制性肿瘤微环境，以改善疾病预后。渗漏益生菌提供的高剂量静脉注射治疗，进一步增强了抗癌细菌治疗的转化前景。 CIOP静脉治疗，抑制肿瘤生长并增加免疫细胞浸润 总结 04 1. lpp基因敲除方法： 通过敲除lpp基因，可以产生渗漏膜，这种方法适用于不同的细菌载体，为细菌疗法开发提供了一个多功能的平台。 2. 增强载体耐受性和安全性： 敲除lpp基因不仅产生渗漏膜，还能增强载体的耐受性和安全性，这与荚膜多糖含量的减少有关，后者是病原菌的主要毒力因子。 3. 在肿瘤微环境中的增殖： 尽管在血液中的活力降低，但这些渗漏的益生菌在肿瘤中仍然可以被检测到，表明它们能在缺氧和免疫抑制的肿瘤微环境中增殖，用于嗜瘤治疗递送。 4. 细菌疗法的广泛应用： 细菌疗法在肿瘤学领域的应用日益普及，并且也适用于其他疾病，如代谢疾病、传染病和炎症性疾病。 5. 组合抗癌成分： 文章还展示了通过整合细菌载体工程和嵌合融合蛋白设计，将多种抗癌成分组合成单个载体的可行性。这种设计可以导致协同抗肿瘤作用，增强免疫细胞扩增，同时抑制癌细胞生长。 6. 组合益生菌的优势： 与传统的联合抗癌疗法相比，组合益生菌具有简化生产和简化给药方案的优势，解决了联合疗法背后的生产、物流和药理复杂性。 参考资料： 1.Jin, H. ∙ Wang, L. ∙ Bernards, R. Rational combinations of targeted cancer therapies: background, advances and challenges Nat. Rev. Drug Discov. 2023; 22:213-234 2.Lu, X. ∙ Horner, J.W. ∙ Paul, E. ... Effective combinatorial immunotherapy for castration-resistant prostate cancer Nature. 2017; 543:728-732 【关于投稿】 转化医学网（360zhyx.com）是转化医学核心门户，旨在推动基础研究、临床诊疗和产业的发展，核心内容涵盖组学、检验、免疫、肿瘤、心血管、糖尿病等。如您有最新的研究内容发表，欢迎联系我们进行免费报道（公众号菜单栏-在线客服联系），我们的理念：内容创造价值，转化铸就未来！ 转化医学网（360zhyx.com）发布的文章旨在介绍前沿医学研究进展，不能作为治疗方案使用；如需获得健康指导，请至正规医院就诊。 热门推荐活动 点击免费报名 🕓 上海｜11月15日-16日 ▶ 2024第一届中国类器官转化医学大会 🕓 上海｜11月21日-24日 ▶ 第七届上海国际肿瘤内科学论坛 🕓 全国｜2024年12月-2025年03月 ▶ 中国转化医学产业大会 🕓 上海｜2025年02月28日-03月01日 ▶ 第四届长三角单细胞组学技术应用论坛暨空间组学前沿论坛 点击对应文字 查看详情

摘要：改进的疫苗接种需要更好地传递抗原并激活自然免疫反应。在这里，我们报告了一种脂质纳米颗粒系统，该系统具有携带包括mRNA和蛋白质在内的抗原的能力，通过表面装饰有刺突蛋白形成病毒样结构，展示了对SARS-CoV-2变体的应用。该策略使用Omicron BA.1上的S1蛋白在表面传递XBB.1的S1蛋白mRNA。病毒样颗粒通过表面S1蛋白与ACE2或DC-SIGN受体的相互作用，能够在人类呼吸道上皮细胞和巨噬细胞中特异性增强mRNA的表达。通过相同的受体结合，展示了巨噬细胞和树突状细胞的激活。与单独的mRNA和蛋白质疫苗相比，蛋白质和mRNA的结合在BALB/c小鼠中增加了抗体反应。我们对这种强大免疫机制的探索表明，它可能涉及交叉呈递给从激活的先天免疫信号到适应性免疫信号的不同亚群的树突状细胞。 1.引言 自2019年底由严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）引起的2019冠状病毒病（COVID-19）大流行开始以来，已经开发并上市了多种针对该疾病的疫苗。然而，这些疫苗的应用并未完全限制大流行的传播，流行病学调查中发现的抗体水平显示出有限的持续时间和对病毒变种的低效性。这些发现表明，SARS-CoV-2与宿主免疫系统之间的相互作用在很大程度上尚不清楚，需要开发新型疫苗。幸运的是，基于脂质纳米递送系统的成功开发，mRNA疫苗取得了突破性进展，提供了新的技术可能性。通过人工脂质膜与细胞质膜的融合，将编码抗原的mRNA通过脂质纳米颗粒（LNP）传递到细胞内，可在细胞内有效表达病毒刺突蛋白（S蛋白）抗原，并诱导随后的S抗原呈递，通过树突状细胞（DCs）和巨噬细胞激活先天/适应性免疫。 根据病毒免疫学研究，在细胞内病毒复制过程中产生的结构和/或非结构抗原可以被先天免疫系统的细胞模式识别受体在宿主免疫反应的抗原信号刺激的首次事件中识别。这意味着mRNA具有通过这种自然免疫途径引发免疫反应的优势；其策略在某种程度上类似于膜状病毒SARS-CoV-2的感染机制，尽管活病毒通常利用病毒膜中的S蛋白与细胞膜中的ACE2受体特异性结合以实现病毒基因组的内化。 因此，当脂质递送颗粒在其表面装载S蛋白时，这些脂质颗粒可能具有类似病毒的结构（VLS），通过受体靶向细胞。特别是，SARS-CoV-2的S蛋白被发现与DC和巨噬细胞表面表达的ACE2或DC-SIGN受体相互作用。这些发现导致合乎逻辑的推断，如果能够构建所提出的VLS系统，它将不仅与注射局部组织的肌肉细胞或上皮细胞相互作用，还与携带ACE2受体或DC-SIGN的先天免疫细胞（例如DCs和巨噬细胞）。先前报道了一种可吸入的纳米疫苗，其具有仿生冠状病毒结构，模拟病毒遗传物质由脂质体包裹，表面装载有S蛋白的受体结合域（RBDs）作为“刺突”以模拟病毒结构，表明VLS的可能性。因此，本研究的目的是设计一种VLS颗粒来包裹mRNA分子并装载蛋白质，并研究其免疫学特性，特别是其通过表面S1蛋白特异性结合到DCs和巨噬细胞上的DC-SIGN来在小鼠模型中引发免疫反应的能力。所获得的数据表明，通过VLS结构将mRNA特异性地传递到DCs的这种策略与常规mRNA疫苗相比具有非常重要的意义。 2.结果 2.1.VLS的特性描述 SARS-CoV-2 mRNA疫苗的早期开发中一个重要的技术基础是通过静电吸引和氢键将mRNA分子与阳离子脂质结合，这导致了mRNA分子被LNPs包裹。在我们的VLS设计中，需要一个脂质载体来包裹mRNA，并装载表面蛋白，这可能需要更大的阳离子脂质电荷容量以在离子环境中进行电荷复合。为了使脂质颗粒同时携带mRNA和蛋白的能力更强，我们的设计包括了两种阳离子脂质分子，((2-(2-羟乙氧基)乙基)氮杂二基)双(己烷-6,1-二基)双(2-己基癸酸酯)和1,2-二油酰-3-三甲基铵丙烷；一种中心磷脂，1,2-二油酰-磷脂酰胆碱；以及一种聚聚乙二醇(PEG)分子，甲氧基聚(乙二醇)-N-十四烷基十四酰胺-1-2k。通过微流控工艺生产了这种脂质组成和编码SARS-CoV-2 XBB.1株S1蛋白的mRNA的LNP（补充图1a）。这些特征粒子的结构参数（扩展数据表1）和与脂质定量相关的识别mRNA分子（补充图1a）表明了mRNA疫苗的典型特征。此外，这种LNP能够以剂量依赖性的方式将其包裹的mRNA传递到293细胞中（图1a,b）。此外，表达并纯化的S1重组蛋白（补充图1a）被装载在包裹mRNA的脂质颗粒上，以构建具有与mRNA疫苗相似结构特征的VLSs（扩展数据表1）。我们的电子显微镜观察表明装载过程是不可逆的（补充图1b），并且这种VLS的形态特征显示，与单独包裹mRNA的LNP相比，粒子表面有一些凸起，存在差异（图1c）。添加S抗体可以通过抗体桥使颗粒聚集（图1c）。通过免疫沉淀法对VLSs进行结构分析，使用特定的S抗体表明，沉淀的VLS颗粒含有mRNA分子和S1蛋白（图1d）。这些数据支持在我们的设计模型中使用VLS颗粒。 图1 | VLS和LNP的特征。a，荧光显微镜显示LNP、包裹GFP mRNA的LNP和VLS中GFP表达显著。比例尺，250微米。b，通过西方印迹分析检测293T细胞转染LNPs或VLSs 48小时后的S1蛋白。左图：与LNPs相比，293T细胞转染EGFP或S1 mRNA后的S1蛋白表达；右图：转染不同剂量S1 mRNA的VLSs后，293T细胞中S1蛋白的表达。GAPDH作为蛋白装载对照。西方印迹上信号的强度（条带上方）通过ImageJ（版本1.8.0.112）进行密度分析定量。c，LNPs、包裹S1 mRNA的LNPs、VLS和用特定抗S1抗体处理的VLSs的电子显微镜图像。比例尺，200纳米。a-c中的实验均重复了两次。d，总样品、渗透和洗脱中的蛋白（S1或N）和mRNA含量。“IP-S1”表示样品在与特定抗S1抗体孵育过夜后进行了测试，“IP-N”表示样品与抗N抗体孵育。实验装载量相等，并通过西方印迹和SDS-PAGE银染（Input）鉴定。数据以三个独立实验的平均值±标准差表示。 2.2.VLSs使细胞转染并靶向ACE2/DC-SIGN分子 与mRNA疫苗的LNPs相比，当蛋白装载在表面时，VLSs提高了mRNA的传递能力。S1蛋白与ACE2或DC-SIGN分子的结合可能导致VLSs靶向局部组织中具有这两种受体的细胞。我们的研究表明，VLSs不仅能高效转染293细胞（图2a），而且还能增强16HBE细胞培养中的mRNA表达，这不仅显示了目标mRNA的拷贝数（图2b），而且还表达了蛋白质（图2a），并且在添加针对S或ACE2的抗体后呈现恢复（图2c,d）。THP-1细胞也是如此（图2a,b）。基于我们对大约16HBE细胞表达ACE2和THP-1细胞表达ACE2/DC-SIGN的识别数据（补充图2），两种细胞系中mRNA表达的增强可能是由于ACE2或DC-SIGN与S1蛋白的相互作用介导的。此外，用针对DC-SIGN的特定抗体处理THP-1细胞也干扰了VLS mRNA的表达（图2c,d）。这表明VLSs能够通过S1与ACE2和DC-SIGN受体的相互作用，将mRNA传递到人类巨噬细胞中，这与报告的数据一致。此外，表达DC-SIGN的小鼠DCs（JASWIIs）被发现与S1蛋白相互作用（补充图3a）。这些细胞与VLS包裹的EGF或S1 mRNA的转染导致了明显比单独转染LNP包裹的mRNA更大的mRNA表达，因为针对S或DC-SIGN的特定抗体的阻断消除了这种效应（图2c,d和补充图3c）。使用表达DC-SIGN的小鼠RAW264.7巨噬细胞的相同实验也提供了类似的结果（图2c和补充图3b）。基于先前确认的数据，显示人类DCs和巨噬细胞由于表达ACE2/DC-SIGN而被SARS-CoV-2感染，我们的结果表明，VLS与ACE2或DC-SIGN受体的相互作用可能参与了先天免疫的激活。 图2 | VLS通过S1蛋白靶向ACE2/DC-SIGN分子增强细胞转染，实现mRNA传递。a，不同细胞中S1蛋白的表达通过西方印迹进行检测。c，使用不同细胞的受体或S1（N）蛋白的抗体阻断后，通过西方印迹检测VLSs中S1蛋白的表达。LNPs和包裹S1 mRNA的VLSs与293T细胞、16HBE细胞、THP-1细胞、DCs和RAW264.7细胞共孵育。a和c中的实验均重复了两次。b，通过qRT-PCR评估转染到不同细胞的mRNA拷贝数。d，使用细胞受体的抗体阻断或S1（N）蛋白的抗体阻断后，通过qRT-PCR评估转染到细胞的mRNA拷贝数。b、d中，n=3个独立样本，均值±标准差。黄色框架中的蓝色文本显示了不同抗体处理的样本或细胞。显著性差异是通过单因素方差分析（ANOVA）和Tukey的事后检验确定的。 2.3.VLSs与DCs和巨噬细胞的相互作用 先前的数据表明，LNPs对mRNA疫苗在细胞中诱导的强烈转录反应是由于LNPs引起的外源性损伤，被认为是mRNA疫苗的不良反应。我们研究了是否可以通过S1蛋白与受体的结合来降低我们VLS的活性。在我们的研究中，用VLSs处理的16HBE细胞中具有免疫激活作用的一些分子的表达倾向于增加（图3a），在THP-1细胞中检测到免疫调节因子的表达增加和炎症介质如肿瘤坏死因子（TNF）的表达减少（图3b）。此外，在小鼠DCs的JAWSII菌株中，包括TNF和GATA-3在内的分子表达倾向于减少，而干扰素（IFN）家族成员的表达倾向于增加（图3c）。在RAW264.7小鼠巨噬细胞中观察到免疫调节因子和炎症因子的转录概况轻微且平衡的上调（图3d）。有趣的是，上皮细胞中干扰素家族成员的上调表达与DCs和巨噬细胞中的相似（图3a,c）。这些结果表明VLSs在先天免疫中具有某种免疫激活作用，这与mRNA/LNPs不同，并支持我们的假设，即S1蛋白对VLS表面的影响不仅可以导致mRNA传递，还可以激活DC中的DC-SIGN信号通路。 图3 | LNPs和VLSs转染细胞的免疫基因转录。a-d，16HBE（a）、THP-1（b）、JASWII DC（c）和RAW264.7（d）细胞在转染只包裹S1 mRNA的LNPs或同时包裹S1 mRNA和S1蛋白的VLSs后24小时的免疫反应相关主要基因的表达谱。蓝色代表只包裹S1 mRNA的LNPs，黑色代表VLSs。数据以三个独立实验（n=3）的平均值±标准差表示。显著性差异通过单因素方差分析（ANOVA）和Tukey的事后检验确定。 2.4.用VLSs对小鼠进行免疫接种引发免疫信号传导的差异 我们对VLSs与免疫系统之间的相互作用的研究表明，无论VLS中包裹的mRNA编码GFP还是S1蛋白，它都在局部组织中动态表达（补充图4），类似于mRNA疫苗的报告。有趣的是，VLS组小鼠局部组织中S1抗原与DCs或巨噬细胞的共定位率大于mRNA或单独蛋白组小鼠（图4a和补充图5a,b）。在初次免疫后3-7天，VLS组小鼠脾脏中CD86+ DCs与CD83+ DCs的比率，这表明由Toll样受体（TLR）信号刺激的DCs的成熟度，大于mRNA或蛋白组小鼠（图4b）。 脾脏中特定CD4+与CD8+记忆T细胞的比率在增强型VLS组以及接受用VLS预处理的DCs组中也大于其他两组（图4c,d），这表明VLSs通过S1蛋白特异性结合到DC-SIGN受体与小鼠DCs的相互作用，随后mRNA的有效表达增强了DCs的活化效率，随后激活T细胞是显著的。进一步的抗体测量显示，在注射后第21天，接受用VLS预处理的DCs的小鼠的抗体滴度大于接受用mRNA或蛋白疫苗预处理的DCs的小鼠（图4e）。在免疫后24至48小时，对接种实验VLS疫苗的小鼠局部组织中各种重要免疫分子的转录水平进行后续分析，发现与单独用mRNA或蛋白免疫的小鼠相比，与DCs和巨噬细胞活化直接相关的一些功能分子的表达增加，如CXCL10和MHCI（图4f）。CXCL10的千倍增加表明，由VLSs激活的DCs可以被分类为cDCs21。进一步对接种免疫的小鼠脾脏中收集的淋巴细胞在免疫后不同时间点进行的京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）同源转录组分析显示，与mRNA和蛋白组相比，VLS组显示出特征性的动态轮廓（图4g）。所有转录轮廓的变化表明，接种VLSs和mRNA或蛋白的个体宿主免疫反应存在差异。 图4 | VLSs在小鼠中诱导了先天免疫反应。a，代表性共定位率显示，与肌肉注射VLSs、包裹S1肽的LNPs或包裹S1 mRNA的LNPs的小鼠相比，在24小时和48小时后S1表达与DCs/巨噬细胞在肌肉中的情况。b，小鼠在免疫后3天和7天，脾脏中CD86+与CD83+ DCs的比率，这些小鼠接受了VLSs、包裹S1肽的LNPs或包裹S1 mRNA的LNPs的免疫。c，d，在接受加强和DC处理的输血VLSs、包裹S1肽的LNPs或包裹S1 mRNA的LNPs后，特异性记忆T细胞（c）和活化T细胞（d）中带有CD8标记分子的比率。e，在不同处理组DCs输血后第21天的小鼠抗体滴度。f，小鼠肌肉注射VLSs、包裹S1肽的LNPs或包裹S1 mRNA的LNPs后24小时和48小时，与炎症和先天免疫反应相关的主要基因表达谱。g，在初次免疫后7天、14天和28天以及加强免疫后21天，与免疫调节的激活或分化、细胞过程、信号转导和炎症相关的主要基因表达谱的淋巴结。颜色条代表与LNP组数值相比的log2（倍数变化）。颜色越红，基因转录水平上调越明显。组织中炎症细胞因子的相对表达水平通过比较Ct（ΔΔCt）法归一化至空白对照组（LNP）的水平。数据以三个独立实验（n=3）的平均值±标准差表示。显著性差异通过单因素方差分析（ANOVA）和Tukey的事后检验确定。 2.5.VLSs在小鼠中引发更强的免疫反应 基于对我们的VLS疫苗和当前在人群中使用的mRNA疫苗（III期临床试验）（18岁以上）（补充图6）的分析差异，我们的免疫学数据表明，与mRNA或蛋白疫苗中mRNA和蛋白含量相等的VLSs在接种的BALB/c小鼠中引发强大的免疫反应，接种后对Omicron株S抗原的结合抗体水平远高于单独接种mRNA或蛋白的小鼠；高水平维持了八个月以上（图5a），并且小鼠对武汉、Beta和Delta株的S抗原表现出明显的反应性，水平略低（图5b）。使用假病毒和真病毒同步检测变异株的中和抗体也显示了类似的结果（图5c），其中对变异株的中和抗体达到了高于1:103的水平，这在先前对动物和人类的免疫保护研究中被确认为有效。对武汉、Omicron和XBB.1株的RBD的抗体水平在VLS组中大于其他两组（图5d）。与其他两组相比，接种VLS后，尤其是加强免疫后，VLS组小鼠在上呼吸道和血清中分泌的IgA水平增加（图5e）。此外，比较VLS组和mRNA组小鼠淋巴结中活化B细胞的比率表明，VLS组中活化B细胞的比率大于mRNA组（图5f）。重要的是，针对IFNγ和白介素-4（IL-4）的ELISpot检测显示，在免疫后第90天，VLS组的T细胞反应比mRNA和蛋白组更强烈（图5g）。由于观察到IL-4反应的明显加强，同时对这些小鼠的血清中的多种细胞因子进行了检测，结果表明VLS组的大多数细胞因子水平低于mRNA或蛋白组（图5h）。所有数据表明，VLSs引发的免疫反应应与基于VLSs对先天免疫的已知激活效应的mRNAs或蛋白质引发的免疫反应不同。 图5 | VLSs在小鼠中诱导了适应性免疫反应。a,b, 由VLSs、包裹S1肽的LNPs或包裹S1 mRNA的LNPs在小鼠中诱导产生的针对Omicron（a）和野生型（WT）、Beta和Delta（b）株的SARS-CoV-2特异性抗体滴度。样本在初次注射后的第35、49、120、180和240天获取。c, 由VLSs、包裹S1肽的LNPs或包裹S1 mRNA的LNPs在小鼠中诱导产生的针对Omicron真实病毒株BA.5和假病毒的中和抗体（NAb）滴度。d, 由VLSs、包裹S1肽的LNPs或包裹S1 mRNA的LNPs在小鼠中诱导产生的针对Omicron株、XBB.1株和WT株RBD的IgG抗体滴度。e, 由VLSs、包裹S1肽的LNPs或包裹S1 mRNA的LNPs在小鼠中诱导产生的针对Omicron株刺突蛋白的IgA抗体滴度，在免疫后的第21和49天在小鼠BALF（支气管肺泡灌洗液）和血清中。f, 观察到的经VLS和mRNA疫苗处理的小鼠淋巴结中的活化B细胞。g, 在初次免疫后第49天，经肌肉注射VLSs、包裹S1肽的LNPs或包裹S1 mRNA的LNPs的小鼠的IFNγ和IL-4的ELISpot反应。橙色框架代表包裹5、10、20和40μg S1 mRNA的LNPs，从浅到深；蓝色边框代表5、10、20和30μg S1肽；蓝色边框中的橙色框架从浅到深代表不同剂量的RNA和肽的不同组合的LNPs。SFC，形成斑点的细胞。h, 加强免疫后第28天，用VLSs、包裹S1肽的LNPs或包裹S1 mRNA的LNPs免疫的小鼠血清中的细胞因子。所有测定值都通过减去空白小鼠血清中检测到的值来计算。数据以三个独立实验（n=3）的平均值±标准差表示。显著性差异通过单因素方差分析（ANOVA）和Tukey的事后检验确定。 2.6.VLSs在ACE+/+小鼠中引发的有效免疫保护 在我们的病毒挑战测试中，涉及ACE+/+小鼠和仓鼠（补充图7），结果表明VLSs完全保护了挑战的小鼠免受Omicron BA.5株、XBB.1和武汉株的侵害，因为没有观察到症状（扩展数据表2）。在感染期间，在小鼠的各个器官中检测到很少或没有病毒复制（图6a,b和补充图8-10），并且没有检测到组织病理学变化（扩展数据表3）。值得注意的是，在与VLS阴性小鼠相比，用XBB.1挑战的VLS免疫小鼠的主要器官中没有检测到活病毒（图6c）。此外，对BA.5挑战的小鼠的淋巴细胞在第3天进行了转录组分析。结果表明，与功能反应相关的差异表达基因与免疫系统在VLS组明显不同于其他两组（图6d）。B细胞、CD4+细胞和CD8+细胞的分类表明，更多的DEGs百分比集中在CD4+细胞和B细胞群体中（图6d）。这些基因主要是与淋巴细胞增殖相关的转录调节分子。结合ACE+/+小鼠VLS组中出色的免疫保护效果，这种独特的转录组轮廓表明，通过VLSs与DCs的稳健结合，通过系统激活DCs在VLS刺激下基于不同信号的整合效应引发的免疫学结果。 图6 | VLSs对C57-hACE+/+小鼠中Omicron BA.5和XBB.1株挑战的影响。a, 在Omicron BA.5株感染后，通过RT-qPCR测定了肌肉注射VLS、包裹S1肽的LNPs或包裹S1 mRNA的LNPs的hACE+/+小鼠在肺、大脑和脊髓中的病毒载量。b,c, 在Omicron XBB.1株感染后，通过RT-qPCR测定了肌肉注射VLS和LNPs的hACE+/+小鼠在大脑、肺、淋巴、气管和脊髓中的病毒载量（b），并通过病毒斑点形成测定了病毒滴度（c）。基线是根据未感染的阴性小鼠中检测到的值定义的。FFU，聚焦形成单位；dpi，感染后天数。d, 在Omicron BA.5株感染后3天，从小鼠肌肉注射VLSs、包裹S1肽的LNPs或包裹S1 mRNA的LNPs的淋巴结组织中分离的CD8+ T、CD4+ T和B细胞的激活或分化相关的显著差异表达基因。颜色条代表与LNP组相比的log2（倍数变化）。颜色越红，表示基因转录水平上调越明显。数据以三个独立实验（n=3）的平均值±标准差表示。显著性差异通过单因素方差分析（ANOVA）和Tukey的事后检验确定。 3.讨论 在过去几年的COVID-19大流行期间，mRNA疫苗为我们提供了新的疫苗研究技术和疫苗设计和开发的新思路。这种技术方法诱导了对传染因子的生物学模仿，并为下一代COVID-19疫苗的开发提供了新的可能性。基于这一进展，我们的工作建立了一个改进的脂质系统，扩大了抗原携带能力，包括mRNA和蛋白。这个系统依赖于由两种阳离子脂质、一种中心磷脂和一种聚-PEG分子组装成的专门脂质颗粒的结构，该结构由mRNA和病毒蛋白组成。这种脂质系统能够有效地包裹编码S1抗原的mRNA，并在其表面携带S1蛋白。此外，我们的结果揭示了表面S1蛋白能够与ACE2/DC-SIGN受体结合，促进mRNA进入细胞并增加抗原表达，除了通过LNP融合到细胞膜的表达之外。因此，我们进一步表明，VLS表面S1蛋白在引导mRNA/LNPs靶向DCs和巨噬细胞方面发挥重要作用，这导致免疫系统对抗原的摄取显著增加。对这些细胞的转录概况的进一步分析表明，VLS能够以平衡的方式激发多种免疫调节因子和炎症介质的表达的一般趋势与mRNA/LNPs不同，这表明了VLS作为疫苗免疫原的重要性。这种设计通过体内免疫学分析进一步得到验证；我们观察到在接种VLS的个体的局部组织中，S1抗原与DCs或巨噬细胞的共定位程度更高，以及在接种VLS的个体的淋巴器官中活化DCs群体的百分比更高，与接种mRNA/LNPs的个体相比。进一步使用体外用VLS预处理的DCs的BALB/c小鼠进行的调查揭示了VLS组中活化T细胞的比例比mRNA疫苗组更高。重要的是，接种VLS的小鼠表现出比接种mRNA/LNPs的小鼠更强烈的抗体反应和更强的细胞毒性T淋巴细胞反应。有趣的是，检测到了从上呼吸道和血清中分泌的特异性IgA。基于进一步的保护性动物测试，我们发现这种增强的免疫力为对抗Omicron BA.5、XBB.1或武汉株提供了更有效的保护。进一步的调查揭示了在VLS组的ACE+/+小鼠在挑战时CD4+细胞群体中大多数基因的系统上调和B细胞和CD8+细胞群体中50%以上基因的上调的差异。这些发现表明，接种VLS的小鼠具有特征性的系统性免疫反应，可能因为来自先天免疫系统的多种信号的综合效应。这些数据支持我们的推测，即VLSs能够与各种细胞相互作用，这不仅导致mRNA的内源性抗原蛋白表达和细胞内TLRs26识别的mRNA分子，而且还有DCs的不同亚群的质膜中的其他TLRs27识别外源性S1蛋白，类似于与DC-SIGN或ACE2的结合。此外，通过脂质融合转染VLSs的上皮细胞的抗原趋化效应使DCs激活以摄取抗原并产生一定的抗原信号。在VLS免疫期间引发的这些事件可能导致不同亚群的DCs和巨噬细胞对T细胞和B细胞的抗原交叉呈递，并可能导致对VLS免疫的强烈免疫反应（扩展数据图1）。因此，我们假设基于在DCs和巨噬细胞中特异性诱导mRNA表达的策略可能有助于开发病毒样疫苗候选物，使其能够引发综合免疫反应，以提供比当前COVID-19 mRNA疫苗更有效的针对病毒变种的保护。 然而，这项研究缺乏足够的数据来解释VLSs的物理化学结构以及它们与细胞（特别是DCs或巨噬细胞）的相互作用机制、在这些细胞中引发的信号以及VLS免疫个体的系统免疫学过程，这值得进一步深入研究。 4.方法 4.1.伦理声明 四周至五周龄的K18-hACE2 C57BL/6小鼠（人类ACE2基因敲入C57BL/6小鼠）由Cyagen Biosciences提供（动物许可证号码SCXK (Su) 2022-0016）。BALB/c小鼠和七至八周龄的金黄仓鼠从Vital River购买（动物许可证号码SCXK (Jing) 2021-0006和SCXK (Jing) 2021-0011）。所有动物都在特定病原体自由的隔离设施中饲养（实验室许可证号码SYXK (Lu) 2020-0019）。实验动物的照顾和使用遵循“3R”原则和动物福利指南。动物实验过程及与动物相关的护理和福利已经山东威高利彤生物制品有限公司的动物实验伦理委员会审查和批准（批准号码LACUC-RD3-2022-006）。 4.2.细胞系 HEK-293T和16HBE细胞在含有10%胎牛血清（FBS；HyClone，GE Healthcare）、100 U/ml青霉素和100 mg/ml链霉素的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM，Thermo Fisher Scientific）中培养。JASWII树突状细胞在含有20% FBS和5 ng/ml小鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（HY-P7361，MCE）的MEM Alpha（Thermo Fisher Scientific）中培养。RAW264.7细胞在含有10% FBS的最小Eagle培养基（MEM；Thermo Fisher Scientific）中培养。THP-1细胞在含有10% FBS和0.05 mM β-巯基乙醇（M917637，Macklin）的RPMI 1640（Thermo Fisher Scientific）中培养。所有细胞均从ATCC购买，并在37℃、5% CO2条件下维持。 4.3.病毒 新型冠状病Omicron BA.5株（H株）于2022年12月从COVID-19患者中分离出来。完整的基因组序列已上传至NCBI GenBank（OQ179919.1）。新型冠状病KMS-2株（武汉）于2020年2月从云南省传染病医院的COVID-19患者中分离出来。 4.4.动物实验设计 C57BL/6-ACE2（BALB/c或金黄仓鼠）小鼠被随机分为五组（补充图7）。 扩展数据图7| 推测的VLS疫苗与宿主免疫系统相互作用并引发小鼠免疫反应的机制。➀ 注射的VLS疫苗被上皮细胞内吞。从内体逃逸并进入细胞质后，mRNA在核糖体中被翻译成蛋白质。翻译后的抗原蛋白可分泌到细胞外空间。DCs和巨噬细胞可被VLS引起的局部炎症所吸引。分泌的抗原和VLS疫苗表面的抗原均可被招募的DCs和巨噬细胞摄取，随后激活并呈递给Tfh/Th1和B细胞。➁ 注射的VLS疫苗通过S1蛋白特异性结合DC-SIGN或ACE2受体介导，被DCs和巨噬细胞内吞。传递的mRNA被翻译成内源性抗原，可激活DCs和巨噬细胞。这些激活的免疫细胞能够将抗原呈递给Tfh/Th1和B细胞，以激活特异性免疫反应和B细胞的特异性增殖，产生抗体反应，同时引发特异性CTL反应。➂ VLS疫苗表面的S1蛋白抗原作为外源性抗原，被DCs和巨噬细胞识别和内吞，随后激活并呈递给Tfh/Th1和B细胞。这些途径的所有抗原信号都能激活并增强特异性免疫反应。 在A组（免疫实验组，n=35），C57BL/6-hACE2小鼠被分为四组：对照组、VLS组、mRNA组和肽组。VLS包含20μg mRNA和10μg蛋白；mRNA组小鼠接种20μg mRNA，肽组小鼠接种10μg蛋白。所有小鼠在初次免疫后的第21天进行加强免疫。在初次免疫后的24、48和72小时，从免疫部位获取组织，进行qRT-PCR测量细胞因子表达的免疫荧光检测。此外，在初次免疫后的3、7和14天以及加强免疫后的28天，从淋巴结中分离出B细胞、CD4+ T细胞和CD8+ T细胞，进行转录组测序。 在B组（免疫实验组，n=36），C57BL/6-hACE2小鼠被分为三组：对照组、VLS组和mRNA组。用于探索mRNA分子与传递系统的组织部位的mRNA。在肌肉注射后的第1、3、5和7天收集心脏、肝脏、脾脏、肾脏、肺、大脑和淋巴结，进行组织免疫荧光检测。 在C组（免疫实验组，n=72），BALB/c小鼠被分为12组：N1-N12。N1-N4为mRNA疫苗组，N5-N8为VLS疫苗组，N9-N12为肽疫苗组。N1-N4分别包含5、10、20和40μg mRNA。N5-N8包含5μg mRNA和5μg肽、10μg mRNA和5μg肽、10μg mRNA和10μg肽、20μg mRNA和10μg肽。N9-N12分别包含5μg、10μg、20μg和30μg肽。所有小鼠在初次免疫后的第21天进行加强免疫。在免疫后的第35、49、120、180和240天，从尾静脉采集血液样本进行抗体检测。加强免疫后的第28天，收集血液进行中和抗体和结合抗体测试，脾脏进行淋巴细胞分离和ELISpot检测。同时，比较SARS-CoV-2疫苗的免疫滴度。 在D组（免疫保护实验组；C57BL/6-hACE2，n=75；金黄仓鼠，n=40），加强免疫后的第28天，对照组、VLS组、mRNA组和肽组小鼠分别通过鼻内途径用SARS-CoV-2 Omicron BA.5（10^4.5 50%细胞培养感染剂量（CCID50））、SARS-CoV-2野生型（10^4 CCID50）或SARS-CoV-2 Omicron XBB.1（10^4.5 CCID50）进行挑战。在病毒感染后的第3、5和7天收集心脏、肝脏、脾脏、肾脏、肺、气管、大脑、脊髓、淋巴结和性器官，进行病毒载量定量。同时，在挑战后第3天，从C57BL/6-hACE2小鼠的淋巴结中分离出B细胞、CD4+ T细胞和CD8+ T细胞，进行转录组测序。 在E组（输血实验，n=27），DCs用LNPs-肽、LNPs-mRNA和VLSs处理12小时。体外处理的DCs（每只小鼠3×10^5个细胞）通过尾静脉输注到小鼠体内。在移植后的第3和5天获取脾脏和腹股沟淋巴结，进行流式细胞术和qRT-PCR。输血后21天测量抗体滴度。上述动物挑战实验由武汉生物制品研究所委托进行。 4.5.LNP传递系统的合成和配方 根据((2-(2-羟乙氧基)乙基)氮杂二基)双(己烷-6,1-二基)双(2-己基癸酸酯)、1,2-二油酰-3-三甲基铵丙烷、1,2-二油酰-磷脂酰胆碱和甲氧基聚(乙二醇)-N-十四烷基十四酰胺-1-2k的分子量，分别在绝对乙醇（优级试剂）中溶解至20%、10%、20%和10%的分子浓度。所有四个组分以30.68:6.84:15.2:1的摩尔比在乙醇中混合，以准备LNP传递系统。mRNA根据请求比例在20 mM醋酸钠、2.5 mM KCl和0.1%海藻糖的缓冲液中稀释。通过NanoAssemblr Ignite+ LNPs（Precision Nanosystems）将空白LNPs与mRNA以1:3的重量比混合制备LNP-mRNA。脂质颗粒进一步通过Zetasizer Ultra光谱仪进行表征。 4.6.SARS-CoV-2 S1 mRNA的合成 通过PCR技术将SARS-CoV-2的S1序列扩增并插入到PVAX载体中。将黄热病病毒的5′-非翻译区（UTR）扩增并插入到Kozak序列之前，将人类线粒体核糖体的3′-UTR扩增并插入到S1序列之后，作为S1序列的5′-UTR和3′-UTR。构建的质粒用BamHI（目录号R0136V，NEB）在37℃下线性化3小时进行体外转录反应。通过体外转录反应（HiScribe T7 ARCA mRNA Kit，目录号E2060S，NEB）合成N1mψ修饰的S1 mRNA。反应混合物用DNase I处理，并使用氯化锂沉淀进行纯化。 4.7.VLS疫苗的制备 通过将LNP-mRNA和肽添加到缓冲液（0.1%海藻糖和3.5%葡萄糖）中，在室温下以30 r.p.m.混合30分钟，然后在4℃旋转混合10 r.p.m.过夜。VLS疫苗进一步通过Zetasizer Ultra光谱仪进行表征。 4.8.LNP转染的mRNA和VLS细胞 然后，将0.5、1、2、5和10μg的mRNA通过LNP传递系统转染到293T细胞中，并在转染后24小时进行西方印迹检测。同时，将mRNA和VLSs转染到16HBE、JASWII DCs、THP-1细胞和RAW264.7细胞中，在24小时后进行西方印迹分析和qRT-PCR测量。 4.9.共免疫沉淀 向LNP包裹的mRNA和VLS疫苗（VLS疫苗装载了BA.1 S1蛋白或N蛋白）中加入抗S1和抗N抗体。然后，加入50μl的磁性珠（BeaverBeads Protein A Matrix Antibody Purification Kit，目录号20102，苏州）并孵育30分钟，在室温下30 r.p.m.。接下来，在磁场中吸附含磁性珠的样品2-3分钟，室温下，上清液用于mRNA和蛋白含量测量。然后，用洗涤缓冲液洗涤珠，加入洗脱缓冲液进行洗脱，并通过qRT-PCR和ELISA测量mRNA和蛋白含量。 4.10.qRT-PCR 通过qRT-PCR测量VLS和mRNA疫苗中的mRNA含量。根据指南，引物的结合位点设计在SARS-CoV-2 S1基因区域，S1基因的一部分构建在pUC57质粒中。体外转录的mRNA用作标准样品。引物为F：TGGATCTGGAGGGAAAGCAGGCAACT和R：CCGATTGGCAGATCCACCAGAGGTTC，TaqMan探针（Sangon Biotech）的序列为5′-6FAM-ATGGCTACTTCAAGATCTATAGCAAGC-TAMRA-3′。通过绝对定量的qPCR确定组织中的病毒载量。根据世界卫生组织的指南，引物的结合位点设计在SARS-CoV-2 N基因区域，N基因构建在pUC57质粒上。引物为F：GAATGGCTGGCAATGGCGGTGATGCT和R：TTGTTGGCCTTTACCAGACATTTTGCT，TaqMan探针（Sangon Biotech）的序列为5′-6FAM-TTGCTGCTGCTTGACAGATT-TAMRA-3′。使用RNAiso Plus（T9108，Takara）从组织中提取病毒基因组RNA，使用一步PrimeScript RT-PCR试剂盒（Perfect Real Time）（TaKaRa，代码RR064A）进行反应。 组织和细胞中细胞因子的相对表达，使用RNAiso Plus（T9108，Takara）提取总RNA。基因表达以与LNP注射的小鼠或未感染病毒的细胞中的水平的倍数变化（2−∆∆Ct）表示，这些水平用于校准。使用一步SYBR PrimeScript PLUS RT-PCR试剂盒（TakaRa，代码RR096A）进行反应。使用的具体引物列在扩展数据表4和5中。 4.11.免疫荧光和共聚焦显微镜 收集肌肉组织并立即在液氮中冷冻。组织切片嵌入OCT（Tissue-Tek OCT Compound 4583，Sakura）中，并在冰晶切片机上切成5μm厚（CM1850，Leica）。组织切片固定和用5% BSA封闭。检测病毒抗原时，切片依次用小鼠抗SARS-CoV-2 S抗体（Sino Biological，目录号40150-V08B1）和Alexa Fluor 647偶联的山羊抗小鼠IgG二抗（Invitrogen）孵育。使用抗CD11c抗体（Abcam，目录号ab33483-N418）检测DCs，使用抗F4/80抗体（Zhengneng，目录号263101-31B1），Alexa Fluor 488偶联的山羊抗兔IgG二抗和647偶联的山羊抗小鼠IgG二抗（Invitrogen）检测巨噬细胞。所有细胞核均使用4,6-二氨二苯吲哚检测，并使用共聚焦显微镜（TCS SP2，Leica）分析。 4.12.病毒滴定 病毒滴度通过斑点测定法确定，按照标准协议进行，如前所述。简而言之，病毒经过梯度稀释并加入六孔板。羧甲基纤维素用作液体覆盖的基质，结晶紫用作染色以增强斑点可视化，细胞在37℃、5% CO2条件下培养7天。 4.13.中和试验 简而言之，血清在56℃下灭活30分钟，连续稀释1:4，并与病毒以100倍CCID50/100μl的滴度混合，在37℃下孵育2小时。混合物加入六孔板，并使用羧甲基纤维素作为基质，结晶紫用作染色以在37℃、5% CO2条件下培养后增强斑点可视化。同时，测量假病毒的血清中和滴度，50%抑制稀释（EC50）定义为血清稀释度，与病毒对照孔（病毒+细胞）相比，相对光单位减少了50%，减去只有细胞的对照组的背景相对光单位。简而言之，假病毒（Acro，目录号PSSO-HLC016）与测试样品的连续稀释1:64在37℃下孵育1小时，与病毒对照和细胞对照孔一起。然后，将293T-ACE2细胞加入每个孔中。在37℃、5% CO2环境中孵育48小时后，测量发光。 4.14.IFNγ特异性和IL-4特异性ELISpot检测 对于ELISpot检测，根据制造商的协议使用小鼠IFNγ和IL-4 ELISpot试剂盒（Mabtech）。简而言之，用脾淋巴细胞接种板，然后加入3μg的刺激物（XBB Spike RBD蛋白，目录号40592-V08H144，Sino Biological；B.1.1.529 Spike RBD蛋白，目录号SPD-C522e，Acro；BA.4/BA.5 Spike RBD蛋白，目录号SPD-C522R，Acro；BA.2.12.1 Spike RBD蛋白，目录号SPD-C522q，Acro；BQ.1.1 Spike RBD蛋白，目录号SPD-C5240，Acro；BA.2.75.2 Spike RBD蛋白，目录号SPD-C522z，Acro），然后将细胞加入并37℃孵育30小时。接下来，去除细胞和培养基，显色发展。使用ELISpot阅读器（Mabtech）计数有色斑点。 4.15.从小鼠淋巴结中分离B细胞、CD4+ T细胞和CD8a+ T细胞 在无菌条件下分离淋巴结并轻轻研磨，将淋巴细胞分离成悬浮液。使用MajoSort小鼠CD19纳米珠（目录号SPD-C522R，Acro 480002，BioLegend）富集B细胞，使用EasySep小鼠CD4+ T细胞分离试剂盒（目录号SPD-C522R，Acro 19852A，Stemcell）富集CD4+ T细胞，使用EasySep小鼠CD8a+选择试剂盒（目录号SPD-C522R，Acro 18953，Stemcell）富集CD8+ T细胞。 4.16.B细胞、CD4+ T细胞和CD8a+ T细胞的转录组分析 通过淋巴结分离B细胞、CD4+ T细胞和CD8a+ T细胞。使用TRIzol（目录号DP421，天根）提取总RNA。使用NanoDrop系统和Bioanalyzer评估RNA数量和完整性，并根据Illumina的说明准备样品并测序（Gene Denovo Biotechnology）。在京都基因与基因组百科全书分析中，选择表达变化2倍或更大的基因在P < 0.05，并按功能类别进行分组。所有转录组测序结果已上传至GSA；提交的指定访问号码为CRA010542。 4.17.酶联免疫吸附试验（ELISA） 使用SARS-CoV-2 Spike Protein ELISA Kit（Acro，目录号RAS-A039）定量S1抗原，并使用SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Nucleoprotein ELISA Kit（Jiya Biotechnology）定量核蛋白。使用SARS-CoV-2 RBD (Wild-Type) Antibody (IgG) Detection Kits（Vazyme，目录号DD3201-01）、SARS-CoV-2 RBD (Omicron BA.4/5) Antibody (IgG) Detection Kits（Vazyme，目录号DD3214-01，中国）和Mouse Anti-2019-nCoV (S) IgA Elisa Kits（FineTest，目录号1906）进行S1-RBD IgG检测。使用Mouse Anti-SARS-CoV-2 (B.1.1.529) Antibody IgG Titer Serologic Assay Kit (Spike S1)（Acro，目录号RAS-T061）、Mouse Anti-SARS-CoV-2 Antibody IgG Titer Serologic Assay Kit (Spike S1)（Acro，目录号RAS-T045）、Mouse Anti-SARS-CoV-2 (B.1.351) Antibody IgG Titer Serologic Assay Kit (Spike S1)（Acro，目录号RAS-T084）、Mouse Anti-SARS-CoV-2 (B.1.617.2) Antibody IgG Titer Serologic Assay Kit (Spike S1)（Acro，目录号RAS-T086）进行S1抗体检测。光密度值至少比阴性对照高2.1倍的血清样本被视为阳性。终点滴度定义为产生阳性光密度值的最高血清稀释度。几何平均滴度计算为每组阳性血清样本的终点滴度的几何平均值。 4.18.西方印迹法 蛋白质通过12% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）分离，并转移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。膜用5%牛血清白蛋白-三羟甲基氨基甲烷缓冲液与Tween-20（Sigma-Aldrich）封闭，并与抗SARS-CoV-2 S1抗体（MHC0102，云南乐鹏科技）、抗ACE2抗体（Abcam，目录号ab15348）和抗DC-SIGN抗体（Santa Cruz Biotechnology，目录号sc-74589）孵育2小时；洗涤三次，然后用辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗小鼠IgG（H+L）（Sigma）孵育1小时。最后，PVDF膜洗涤三次，用ECL超敏化学发光试剂（NCM Biotech，目录号P10100）覆盖，并在Bio-Rad凝胶成像仪上曝光和显色。 4.19.SDS-PAGE的银染 用试剂盒（Fast Silver Stain Kit，目录号P0017S，Beyotime）对制备的SDS-PAGE凝胶进行银染。SDS-PAGE凝胶的银染分为十个步骤：固定、用30%乙醇洗涤、水洗、增感、水洗、银染、水洗、显色、终止和水洗。 4.20.流式细胞术分析 在疫苗初次和加强免疫后的第3天和第7天收集淋巴结和脾脏，并分离淋巴细胞。用于检测DC激活表面标记的流标抗体为PE/Cy5-CD45（目录号MA5-38732，Thermo Fisher）、PE/Cy7-CD11c（目录号A15849，Thermo Fisher）、FITC-CD80（目录号A14722，Thermo Fisher）、APC-CD83（目录号ab234119，Abcam）和PE-CD86（目录号12-0862-82，Thermo Fisher）。用于检测特定T细胞表面标记的流标抗体为BV421-CD44（目录号103019，BioLegend）、APC-CD25（目录号102011，BioLegend）、PE/Cy5-CD3（目录号100205，BioLegend）、FITC-CD4（目录号100405，BioLegend）、APC/Cy7-CD8（目录号100713，BioLegend）和PE-Tetramer（Helixgen COVID-19 MHC-I Tetramer）。用于检测活化B细胞表面标记的流标抗体为FITC-CD19（目录号115505，BioLegend）、PerCp/Cy5.5-GL7（目录号144609，BioLegend）和PE-S1（Expedeon，目录号336-005）。细胞在4℃下染色30分钟，流式细胞分析（LSR Fortessa，BD）前洗涤两次。 4.21.Luminex分析 根据制造商的说明进行Bio-Plex Mouse 23-Plex Panel试剂盒（目录号M60009RDPD）检测。简而言之，通过将重组标准品连续稀释，生成了从1.6到10,000 pg/ml的标准曲线。通过向每个孔中移液200μl的检测缓冲液来阻断滤板。10分钟后，通过真空吸引弃去检测缓冲液，向指定的样品孔中加入25μl的检测稀释液，向标准品孔中加入RPMI 1640 with GlutaMAX（Gibco）。然后，向相应的孔中加入标准品或样品，以及25μl的抗体包被的荧光珠子。生物素标记的二抗和链亲和素-荧光素标记的抗体随后通过交替孵育和洗涤步骤加入到孔中。然后，向孔中加入100μl的鞘液，立即使用Bio-Plex阵列阅读器在高和低RP1目标上使用五参数逻辑回归曲线进行读取。 4.22.统计分析和可重复性 对于西方印迹和电子显微镜、免疫荧光检测至少重复两次；对于ELISA，定量分析至少重复三次。所有数据表示为均值±标准误差。组间显著性差异通过GraphPad Prism进行分析。统计显著性设为P < 0.05。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 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摘要：双特异性抗体（bsAb）和多特异性抗体（msAb）包含多种格式，能够同时结合多个表位，解锁了治疗以前难以治疗或不治之症的机制。早期评估候选抗体的开发潜力可以降低潜力低的抗体的等级，并提升最有前途的候选抗体进行进一步开发。基于蛋白质的治疗需要一套严格的开发潜力要求才能具有竞争力（例如高浓度配方和长半衰期），而这些要求的评估需要一套强大的方法工具箱，其中很少有经过验证用于询问bsAbs/msAbs。在评估bsAbs/msAbs的开发潜力时，需要考虑的重要因素包括它们的分子格式、免疫原性的可能性、特异性、稳定性和高产量生产的潜力。在这里，我们总结了开发潜力评估的关键方面，并提供了如何为给定的bsAb/msAb制定全面计划的指导。 1.介绍 抗体工程的进步已经发展出了多样化的生产和纯化流程，以推进各种大小和复杂性不同的分子格式。双特异性抗体（bsAb；具有两种不同结合特异性的抗体）和多特异性抗体（msAb；具有三种或更多不同结合特异性的抗体）允许在多种疾病领域进行新颖的治疗应用。然而，与传统单克隆抗体（mAb）开发相比，实现双特异性或多特异性所需的典型抗体流程和格式的偏差带来了额外的挑战，并且与开发潜力评估的最佳实践相关的信息很少。本综述总结了bsAbs/msAbs开发潜力的关键考虑因素，这些因素在药物开发过程中集体评估时有助于最大化技术成功的可能性。 通过不变簇分化3（CD3）与靶向肿瘤相关抗原（TAA）的相互作用，招募T细胞来识别T细胞受体/主要组织相容性复合体（MHC），已有几种利用这种免疫细胞重定向策略的分子获得了美国食品药品监督管理局（FDA）的批准，包括blinatumomab（Blincyto®，抗CD19）、teclistamab（Tecvayli®，抗BCMA）、mosunetuzumab（Lunsumio®，抗CD20）、glofitamab（Columvi®，抗CD20）、talquetamab（Talvey®，抗GPRC5D）、elranatamab（Elrexfio®，抗BCMA）和epcoritamab（Epkinly®，抗CD20）。除了免疫细胞重定向，双特异性和多特异性还被用于增加对细胞亚型（例如，用于治疗转移性非小细胞肺癌的volrustomig）的特异性和克服常见的抗性途径（例如，用于治疗EGFR外显子20插入突变的非小细胞肺癌的amivantamab）。 单克隆抗体（mAbs）作为治疗多种疾病和条件的治疗选择的引入，为患者提供了许多以前未满足的医疗需求的解决方案，或者提供了比早期护理标准更有效和/或更安全的治疗。尽管mAbs的治疗成功是不可否认的，但仍有许多未满足的医疗需求。 bsAbs/msAbs是一类能够同时结合多个靶标的大分子，从而解锁了传统mAbs无法提供的新颖作用机制（MOA）和生理特性。bsAbs已被用于肿瘤学中，通过同时结合所需的免疫细胞和肿瘤细胞本身，有效地治疗多种癌症。bsAb T细胞接合器（TCEs）绕过了通过招募T细胞来识别肿瘤相关抗原的T细胞受体/主要组织相容性复合体（MHC）的需要。几种利用这种免疫细胞重定向策略的分子已经获得了FDA的批准，包括blinatumomab（Blincyto®，抗CD19）、teclistamab（Tecvayli®，抗BCMA）、mosunetuzumab（Lunsumio®，抗CD20）、glofitamab（Columvi®，抗CD20）、talquetamab（Talvey®，抗GPRC5D）、elranatamab（Elrexfio®，抗BCMA）和epcoritamab（Epkinly®，抗CD20）。除了在肿瘤学中的应用，bsAbs在2017年通过emicizumab（Hemlibra®）的批准中展示了成功，这是一种bsAb，能够识别酶因子IXa和底物因子X[凝血因子IXa（FIXa）×FX]，用于治疗血友病。 尽管FDA尚未批准任何msAbs，但在临床前和早期临床开发中已经披露了几个有前景的分子。随着我们对疾病病因学的理解的进步，bsAbs/msAbs有望通过多因素靶向潜在生物学或通过增强药代动力学（PK）和药效学（PD）属性来进一步改善结果。 虽然同时结合多个靶标的能力是bsAbs/msAbs的优势，但将多个异质结合基团整合到单个分子中也存在风险，需要在开发潜力计划中通过仔细的临床前评估、选择和修改来考虑和最小化。例如，虽然CD3 TCE bsAbs/msAbs可以有效地将T细胞与TAA结合起来，但微量杂质的存在或稳定性差可能导致异常的T细胞激活，这可能导致患者的不良反应。此外，开发潜力可能取决于上下文，如在静脉注射抗体不导致免疫原性的情况下，皮下注射相同疗法却导致免疫原性的情况，正如Janssen在voxalatamab（JNJ-63898081）中的经验，这是他们的前列腺特异性膜抗原（PSMA）×CD3 bsAb。 早期、有目的、主动的抗体开发潜力评估和修改对于最小化后期开发中昂贵且耗时的挫折以及高效地识别具有成为安全、有效和可制造治疗潜力最大的分子至关重要。 任何格式的基于抗体的治疗药物的开发路径都是漫长而复杂的，需要大量的财务和人力资源。因此，开发潜力应在药物开发过程的早期进行评估，并减轻风险，以最大化整体成功的可能性。可接受的开发潜力，此处定义为分子对药物开发和给药过程中的测试、制造、储存和给药要求的适应性，因此是任何药物开发计划成功的关键标准。与mAbs相比，bsAbs/msAbs的开发带来了额外的独特挑战，因为它们固有的结构复杂性。虽然每种bsAb/msAb格式都会呈现不同的挑战，但有广泛适用于它们开发的总体方法，可以作为起点，并在需要时在方法上进行偏差。 潜在抗体治疗的开发潜力评估是多因素的，有越来越多的工具和流程可用于协助预测低风险分子。需要考虑的重要开发潜力因素包括了解给定bsAb/msAb的分子格式，以及评估它们的免疫原性、特异性、稳定性和可制造性的策略和方法。 2.抗体格式 在人类中，天然抗体由四个多肽链组成，组织成两个相同的轻链和两个相同的重链。抗原识别是通过两个相同的可变抗原结合（Fab）区域进行的。蛋白质和抗体工程的进步带来了各种不同的bsAb/msAb格式，这些格式从免疫球蛋白（Ig）样格式变化到高度工程化的分子，这些分子与传统IgG的相似性最小，这些主题有无数的变化（图1）。这些不同的bsAb/msAb格式与传统mAbs相比具有独特的属性，并有可能实现精确的功能性属性以治疗一系列疾病。Wilkinson和Hale最近发表的一篇出版物中对抗体设计的多样性进行了深入调查。 图1. 常见的单克隆抗体（mAb）、双特异性抗体（bsAb）和多特异性抗体（msAb）配置。a. 标准免疫球蛋白G抗体；b. 对称IgG样双特异性抗体；c. 含有scFv和sdAb的双特异性抗体；d. 多价双特异性抗体；e. 多特异性抗体。 基于IgG的bsAb/msAb格式通常保留天然蛋白质的可结晶片段（Fc）区域，通常可以细分为对称或不对称格式。这些bsAbs/msAbs通常依赖于有目的的突变来增强链配对效率，以及修改Fc介导的功能或半衰期延长。 基于片段的分子，如单链可变片段（scFv）或驼类重链可变域（VHH），通常不包含Fc区域，保留抗原结合的最小要求，允许连接不同的结合片段。通常引入不同长度的连接子来连接具有独特功能属性的不同部分。虽然这些偏离传统IgG格式的变化是必要的，以便启用或改善功能性活动，但它们也影响了其开发潜力。 确保bsAbs/msAbs的适当开发潜力和可制造性需要特别考虑抗体格式。一般起点是确定正在评估的新型格式与“IgG样”的相似程度，与天然蛋白质的偏差越大，需要越来越严格的审查。例如，为了推动bsAb的轻链和重链的正确组装而应用的有目的的突变，可能会降低稳定性，增加免疫原性，和/或改变Fc功能。 同样，虽然缺乏Fc的格式，如scFvs，可能提供更好的生物分布和更高的效力，它们通常容易高度聚集，并可能导致分子没有所需的溶解度和稳定性水平的最终治疗。此外，通常需要双特异性格式或多特异性格式的连接子，这些格式附加了额外的scFv或Fab到IgG框架，这些连接子本身可能会引入免疫原性或显著改变药代动力学（PK）属性。 一旦传统的IgG骨架被修改以允许双特异性或多特异性，就需要定制的制造过程，以获得足够数量的高纯度bsAb/msAb。一个主要考虑因素是，每种独特的格式通常需要不同的纯化策略。例如，由于许多基于片段的抗体缺乏Fc，它们需要偏离用于典型IgG的基于蛋白A亲和色谱的纯化策略。由此产生的bsAbs/msAbs通常具有缩短的半衰期，需要在配方中进行额外考虑，如持续静脉内输注或修改，如与聚乙二醇或人血清白蛋白融合，以延长半衰期，实现更有利的PK特性。 此外，许多双特异性和多特异性格式可以引入多种格式特定的杂质，这些杂质对许多分析和纯化方法提出了独特的挑战。这些格式特定的杂质在生物物理属性（如分子量和等电点（pI））上可能与所需的双特异性产品几乎相同，需要开发定制的分析测定和/或纯化方法。 对双特异性和多特异性格式的修改也可能影响蛋白质表达水平，因此可能不适合高通量生产和开发潜力调查。因此，必须仔细考虑不同格式及其产生足够产量和产品质量以进行高通量开发潜力测定的能力。综合考虑，正在开发中的格式与所需的治疗候选属性应指导开发潜力评估策略。 2.1.格式考虑 虽然这里没有回顾bsAb/msAb工程策略的细节，但了解为什么做出某些工程选择以及分子格式的修改如何影响功能是重要的，这使得一个知情的过程能够从功能和开发潜力的角度权衡候选分子的相对风险。就与目标结合相关的功能而言，bsAb/msAb格式可以在两个一般类别中相互偏离：结合价（即，任何目标的结合基团数量）和结合几何学（即，组装分子中靶向基团的相对方向）。 这些两个维度的变化如何产生改善活性的例子包括zanidatamab，这是一种HER2靶向双特异性抗体，它采用了scFv和Fab，从而改善了受体聚集和补体依赖性细胞毒性，以及BiTE（双特异性T细胞接合器）格式，这是两个scFv分子的融合，是第一个商业批准的TCE。这种格式虽然容易聚集，但在目标肿瘤细胞和T细胞之间实现了短的细胞间距离，这可以导致与更IgG样的bsAbs相比显著增强的细胞毒性效力。 BiTE格式的演变是双亲和性重定向抗体格式，它包括一个经过工程改造的二硫键，连接了两个可变域（Fv）的重链可变域（VH）和轻链可变域（VL）的交叉融合。分子格式对活性和开发潜力的耦合影响是过去二十年的积极研究领域。 Loh等人比较了八种不同的HER2 × CD3“结-孔”Fc基础bsAb格式在稳定转染池中的表达、纯化容易性、热稳定性、抗原结合和功能表征。在这项研究中，几何学和价的变化没有影响表达水平或热稳定性，但增加scFv的数量导致了更高的异质性和聚集倾向。Madsen 等人进行的一项类似研究通过使用带有10个氨基酸连接子的单域抗体（sdAb）与IgG融合，生成了针对PD-L1 × HER2的不同几何结构的双特异性抗体（bsAbs），并评估了它们的生产、稳定性、抗原结合以及CD16a结合特性。将sdAbs融合到重链的N-或C-末端通常可以提高产量，但某些融合分子导致分子组装不良，高价分子显示出胶体稳定性低的迹象。 此外，与bsAbs/多特异性抗体（msAbs）格式相关，翻译后修饰、片段和格式相关杂质（如错配物种和半抗体）对功能性活动的影响应在定义关键质量属性（CQAs）时考虑。Lippold 等人报道了一种开发2 × 1TCE的优雅方法，该方法使用功能性CD3亲和色谱结合质谱（MS）来定义CQAs，这可能是一种广泛可定制的方法，用于分析化学稳定性风险及其对功能性活动的影响。总之，格式优化是调节bsAbs/msAbs活性的强大方式，但必须与适当选择的开发性检测一起进行。 2.2.生成bsAb/msAb分子的共同组成部分 尽管许多bsAb/msAb格式尝试主要使用来自典型人类IgG的分子组分，但这些分子的复杂性需要偏离。如下所述，多肽连接元件和VHH部分特别是非IgG元素，在bsAb/msAb分子的工程中常用。 多肽连接子可以分为刚性、柔性和体内可裂解连接子。它们不仅用于将不同的蛋白质结构域连接在一起，还可以有其他效果，例如增加活性、调节药代动力学(PK)特性、在体内释放蛋白质结构域，或将治疗剂定向到特定的组织或器官。多肽融合到Fc结构域、转铁蛋白或人血清白蛋白通常用于延长抗体的半衰期，通常需要使用连接子。此外，多肽连接子通常用于构建单链靶向结构域，如单链可变片段(scFvs)，以及将这些结构域与其他蛋白质组分融合，以修改结合价数，并实现不同的双特异性和多特异性几何结构，而不引入额外的链配对复杂性。通常，在这些应用中使用多甘氨酸-丝氨酸(G4S)n连接子的变体，其中整体长度被优化以最小化聚集倾向，同时保持位点可及性。连接子长度和组成的优化是格式设计的关键组成部分，正如在CD19 × CD3双特异性串联二价体的优化中所展示的，连接子的变化被证明影响折叠效率、稳定性和活性。已经展示了几种稳定多肽连接子的策略，例如通过点突变减少蛋白酶敏感性，从而改变裂解基序，应用稳定框架突变，修改融合几何结构和连接子锚点，引入二硫键，变化连接子长度，以及添加谷氨酸和赖氨酸残基以提高溶解性。VHHs，也称为Nanobodies®，是由骆驼科动物自然产生的只有重链的单变量域抗体。它们缺乏传统抗体中与VL结构域配对所需的疏水界面，因此具有高溶解性和小尺寸(15 kDa)等特征。它们的热稳定性可能有所不同，但许多VHHs具有独特的能力，在热暴露后重新折叠并恢复抗原结合， 因此，与传统的靶向单元如Fab或scFv相比，它们表现出额外的稳定性特征，后者在热暴露后通常显示出不可逆的聚集。VHHs通常具有更长的、高度可变的互补决定区(CDR)3环，这些环补偿了缺失的VL结构域。这些扩展的CDR3环实现了高亲和力和特异性结合，并有助于通过形成折叠覆盖结构来屏蔽否则暴露的疏水残基。与传统的scFv相比，scFv由最小的IgG结合域VH和VL通过多肽连接子连接而成，并且由于它们的“呼吸”界面容易聚集，VHHs是有趣的替代品，作为靶向单元，以实现额外的抗原结合能力和价数在双特异性抗体/多特异性抗体上，具有优越的开发性属性，并避免许多IgG样双特异性格式中常见的链配对复杂性。首个VHH衍生抗体caplacizumab(Cablivi®)在2019年的批准为VHH在双特异性抗体/多特异性抗体中的增加使用奠定了基础。在双特异性抗体/多特异性抗体中使用VHHs已被证明用于靶向FcγRIII，在TNF × F4/80双特异性抗体中，Vδ2-TCE，在双特异性和三特异性VH在CD1d × Vγ9H SEED结构体中，等等。以及在一种增强对HIV株特异性中和能力的双特异性抗体中。 3.免疫原性 生物治疗剂可能具有免疫原性，即在患者体内引起对治疗剂本身的不需要的免疫反应，通常通过产生结合治疗剂的抗体，可能影响安全性和/或有效性。免疫原性可能导致治疗抗体在临床开发过程中的药物失败，导致资本、时间和资源的大量损失。抗药物抗体(ADA)是免疫原反应的标志。ADAs可以降低治疗效果，引起不良反应，甚至导致严重的副作用。T细胞通过反应治疗抗体中的特定序列在决定免疫反应中发挥关键作用，这些序列由抗原呈递细胞(APCs)在人类白细胞抗原(HLAs)中呈递。由于缺乏完整的临床研究来审查双特异性抗体/多特异性抗体，这些替代格式的免疫原性风险的数据很少。最近批准的双特异性抗体/多特异性抗体的报告，或目前在临床开发中的那些，表明不同抗体模式的ADA发病率和这些ADAs的临床结果各不相同，包括TCEs、双免疫检查点抑制剂和各种肿瘤相关抗原(TAAs)的双结合物。这些不同的结果突出了需要从早期临床前阶段到临床阶段开发全面的免疫原性风险评估策略，以促进选择、设计和开发具有降低患者免疫原潜力的最优双特异性抗体/多特异性抗体。下面提供了一个概述，说明可以有助于塑造对双特异性抗体/多特异性抗体治疗剂的免疫反应的多种因素，包括与产品相关的因素、与患者相关的因素和与疾病相关的因素。此外，我们简要讨论了目前可用于预测、监测和减轻双特异性抗体/多特异性抗体在临床前开发阶段的免疫原性的工具和进展。 3.1.基于序列的风险 与所有蛋白质治疗剂一样，对双特异性抗体/多特异性抗体产生免疫反应的主要风险决定因素之一是原始氨基酸序列。双特异性抗体/多特异性抗体通常包含大量工程化序列元素，这些元素使得不同的功能域能够非自然地连接到一个分子中。此外，这种双特异性抗体/多特异性抗体特有的工程通常与额外的抗体工程方法结合，如人源化突变(将小鼠CDRs移植到人抗体框架中)和Fc效应子修饰(要么调节Fc受体介导的效应子功能，要么通过修改与新生儿Fc受体(FcRn)的结合来延长半衰期)。这些新颖的工程序列可能通过引入新抗原或暴露可以被APCs处理和呈递的隐蔽表位来增加免疫原性，从而激活T细胞反应。因此，免疫原性风险评估和减轻策略最好从双特异性抗体/多特异性抗体的工程阶段开始，并在整个表征和筛选过程中使用越来越彻底的方法。通过设计低风险抗体结构使用脱免疫和耐受化(introduction of T regulatory cell epitopes)方法，由计算预测工具和可用的体外/离体确认试验的组合指导，可以实现降低免疫原性。 3.2.计算机模拟免疫原性风险评估 在抗体发现阶段早期，通常会首先应用计算机模拟(in silico)的T细胞表位筛选和预测工具。有多种商业、公共和学术平台可用于筛选抗体序列中的T细胞表位（通常是9到15个氨基酸的序列），以预测可能与HLA分子结合的序列。这些预测工具仅基于抗体的主要序列来识别潜在的T细胞表位。更复杂的计算方法能够使用同源建模和分子动力学模拟等技术生成抗体结构的三维模型。这些方法允许评估可能影响免疫原性的结构特征，如溶剂暴露的环、翻译后修饰和构象灵活性。 计算机模拟预测工具有助于在bsAb/msAb的早期开发过程中识别潜在的免疫原性区域，并允许选择潜在的免疫原性较低的分子或应用进一步的蛋白质工程技术来降低候选分子的风险。这些计算机模拟方法具有高通量和相对较低成本的优势。然而，这些计算工具通常存在一些局限性，例如倾向于过度预测，同时未能充分反映人类群体中发现的重要HLA II类多态性。 因此，建议使用各种体外和离体方法，包括免疫测定和基于细胞的测定，对这些假定的T细胞表位进行进一步的检测。 3.3.体外HLA I类和II类结合测定 HLA结合测定评估肽段在体外与不同HLA等位基因结合的能力，并补充计算机模拟预测工具。纯化的HLA-II肽段（通常是重叠的15个氨基酸的肽段）在一系列浓度下与单体HLA-II分子共同孵化。使用多种方法，包括荧光光谱、生化测定（例如，酶联免疫吸附测定）或表面等离子共振（SPR）来量化结合亲和力和动力学。通常，这些测定以高通量规模进行，能够快速筛选大量的肽库。这些结合测定的一个固有困难是全球人群中各种HLA-II等位基因的正常分布的代表性有限。为了克服这一局限性，HLA-II结合测定通常使用共享表位结合基序的HLA-DR等位基因组，也称为超类型等位基因，能够代表全球超过95%的人类HLA分布。 由于HLA-I分子的高度多态性和结构/构象对结合亲和力的影响，HLA-I结合测定的使用较少，尽管已经描述了几种测定和方法，包括基于荧光激活细胞排序（FACS）的MHC稳定化测定、竞争测定、分型B细胞系或使用HLA的基于细胞的测定。 虽然HLA结合测定可以提供有关特定HLA等位基因结合的有意义的信息，但由于它们依赖于感兴趣的肽段的最佳设计和纯度，因此存在一些局限性。这种依赖性可以直接影响肽-HLA相互作用的结合和稳定，并导致假阴性结果。此外，虽然从HLA结合测定获得的数据可能表明特定肽基序可能与HLA等位基因结合，但这些数据并没有考虑到这种肽基序是否能够在APC表面的HLA分子上被处理和呈递。 3.4.MHC相关肽蛋白质组学 MHC相关肽蛋白质组学（MAPPs）方法在识别存在于APC表面相关HLA分子上的已处理肽段方面被证明是有价值的，特别是鉴于液相色谱/质谱（LC/MS）灵敏度和蛋白质组分析工具的最新进展。在这种方法中，完整的bsAb/msAb分子被装载到体外生成和成熟的单核细胞衍生的树突状细胞（DCs）上，以使DCs摄取和处理抗体，然后细胞裂解和分离肽-MHC复合物，这些复合物稍后被解离并通过MS测序进行测序。 MAPP测定的通量相对较低，主要是由于DC生成的限制。因此，MAPPs通常在临床前开发过程的后期阶段使用，并用于有限数量的开发候选物。从MAPPs获得的数据可以帮助识别可能被工程化以降低免疫原性的主导抗原肽序列。当这些个体的DCs被包括在分析中时，这种方法还可以揭示健康和疾病个体之间在抗原处理和呈递方面的差异。 尽管从MAPP测定中收集到的有价值的信息，但仔细解释至关重要。当评估bsAbs/msAbs与APCs（如DCs）的潜在直接或间接相互作用时，bsAbs/msAbs增加了一层复杂性。在使用MAPPs测定针对DCs表达的靶标或对DC功能重要的途径（如CD40×CD11c或LAG-3×PD-L1 bsAbs）的bsAbs/msAbs时，应考虑这种相互作用。 这些靶标的结合可能会干扰这些细胞中的抗原呈递机制，这反过来可能会影响该测定识别真实主导抗原序列的能力。在使用MAPPs测定之前，可以使用DC结合测定和评估DC成熟、激活和细胞因子测量的测定来了解bsAb/msAb对DCs的影响。 此外，评估bsAbs/msAbs对内源性蛋白的已知表位呈递的影响也可以提供对抗体与MAPP测定潜在干扰的洞察。 通过MAPPs识别的主导抗原序列表明这些序列可能通过抗原呈递机制被处理和呈递；但这并不一定意味着这些序列会转化为T细胞反应。因此，建议进行进一步的确证性体外T细胞激活和增殖实验，特别是当对感兴趣的序列进行进一步重设计可能会对抗体的效力或特异性产生重大影响时。 3.5.T细胞激活和增殖实验 各种体外T细胞激活和增殖实验已经开发出来，并越来越多地被用来评估治疗性抗体候选物的免疫原性。这些实验大多数使用新鲜分离或冷冻保存的健康或疾病个体的外周血单个核细胞（PBMCs）、去除CD8 T细胞的PBMCs，或与单核细胞衍生的树突状细胞（DCs）共培养的分离CD4 T细胞。PBMCs可以被整个抗体刺激，允许抗原呈递细胞（APCs）摄取、处理和呈递肽序列给原始T细胞，导致T细胞激活、增殖和细胞因子分泌。流式细胞术通常用于评估通过标记PBMCs与细胞示踪染料来评估抗原特异性T细胞增殖。此外，使用特定的T细胞激活标志物如CD25、CD69、HLA-DR、CD134和/或CD137通常与增殖评估结合使用，以了解T细胞的激活状态和对刺激的反应程度。 激活的T细胞产生的细胞因子也可以通过流式细胞术进行细胞内细胞因子染色或通过酶联免疫吸附点（ELISpot）或多重荧光斑点（FluoroSpot）实验进行评估。 尽管基于PBMC的实验被认为是最简单且接近体外模拟复杂抗原呈递和T细胞激活过程的设置，但它们受到能够响应特定抗原刺激的前体原始T细胞数量相对较低的限制，导致实验灵敏度降低。DC-T细胞实验提供了一个替代方案，克服了这一限制，作为一个较不复杂的体外系统，允许免疫反应的基本组成部分之间的抗原特异性相互作用，即DCs和T辅助细胞。 虽然这些实验越来越被接受，但它们与bsAbs/msAbs的兼容性需要确认。bsAbs/msAbs通常针对T细胞或其他免疫细胞表达的受体或配体。在这些例子中，使用完整的抗体进行刺激可能不合适，因为免疫反应可能主要由抗体的MOA和与免疫细胞的直接结合驱动，而不是由抗原刺激驱动。这可以通过使用来自抗体序列的重叠肽段库而不是完整的抗体来克服。然而，使用肽段库有自己的局限性，包括更高的成本和可能识别出不一定在体内由APCs处理或呈递的肽段的风险。因此，使用MAPPs实验数据来指导设计和生产感兴趣的序列以在这些体外实验中进行测试可能是有益的。此外，bsAbs/msAbs由于抗体在所需格式中的错配组装，携带更高的杂质风险，导致产生其他不想要的错配格式，这可能会影响体外实验的性能，并导致对免疫原性风险的潜在误解。 因此，使用高纯度的测试文章准备这些实验至关重要。 3.6.B细胞表位和体外B细胞实验 虽然CD4 T细胞在导致ADA产生的免疫反应中起着关键作用，但B细胞也直接识别、结合、内化、处理和呈递治疗性抗体的表位给T辅助细胞，导致原始B细胞分化为记忆和产生高亲和力（IgG）ADAs的浆细胞。然而，体外B细胞实验受到在体外诱导B细胞反应的生物学复杂性的限制。已经描述并商业化了几种评估B细胞在体外刺激后分泌IgG/IgM的比色和荧光B细胞ELISpot实验，这些ELISpot实验主要关注评估记忆B细胞反应。目前尚无强大的实验可用于测量原始B细胞对体外刺激的IgG产生，主要是由于从IgM到IgG产生过程中涉及的免疫过程的复杂性。 在缺乏强大的体外B细胞实验的情况下，已经开发了几种用于预测B细胞表位的计算工具，如免疫表位数据库和分析资源SEPIA。 许多这些预测方法使用序列衍生特征，包括氨基酸组成、亲水性、表面可及性、β-转角和主链柔韧性来提高B细胞表位预测性能，这通常相对于现有的T细胞表位预测工具是有限的。 3.7.与产品关键质量属性相关的风险因素 CQAs是在适当的限制、范围或分布内存在的物理、化学、生物学或微生物学属性或特征，以确保所需的产品质量。 CQA相关的免疫原性风险因素是在治疗性抗体开发过程中的重要考虑因素。 由于分子设计的相对复杂性，bsAbs/msAbs通常与许多制造挑战相关，如增加的聚集、降低的稳定性和由于存在不想要的错配抗体格式而导致的产品相关杂质，这些都影响bsAb/msAb的免疫风险、与先天免疫细胞上的模式识别受体的相互作用以及意外佐剂效应导致打破耐受。 PBMC和全血实验是经常用来评估CQA相关免疫原性风险的工具。 这些实验能够广泛代表特定人群，通常被认为比其他基于细胞系的实验格式更具临床相关性。这些实验中通过与抗体孵化后分泌的细胞因子和趋化因子水平的量化来测量免疫原性反应。这些类型的实验面临的挑战包括从大量供体（通常>25）中获取足够数量的PBMC和新鲜全血样本，以及高供体间变异性。 重要的是，必须考虑特定bsAb/msAb的作用机制（MOA）来解释这些实验获得的数据。通常首先进行全血或PBMC实验以获得更广泛的风险评估，然后进行其他体外实验以进一步进行机制性特征描述。 3.8.与患者相关的风险因素 预先存在的反应性是随着基于抗体治疗领域，特别是bsAbs/msAbs的快速增长而日益受到关注的问题，尽管其对药物安全性和有效性的影响尚不清楚。最近有关bsAb/msAb免疫原性的报告表明，在临床药物开发阶段考虑实施对药物未接触受试者预先存在反应性的筛选和特征化策略是必要的。 许多正在开发的bsAb/msAb模式针对的目标已经使用其他生物治疗药物进行了探索，包括mAbs和抗体药物偶联物。在某些情况下，bsAbs/msAbs可能使用以前开发或批准的抗体的抗体臂，如上文提到的JNJ-61178104（以前称为COVA322）bsAb，它建立在阿达木单抗的骨架上。 在这些情况下，针对先前生物治疗的ADA反应可能导致由于快速记忆回忆反应而对bsAb/msAb的免疫原性反应增强。因此，应考虑对患者进行预先存在的反应性筛选，特别是在有生物治疗药物治疗史的患者中。此外，这种预先筛选可能有助于在预期出现显著免疫原性反应和相关不良事件时定义潜在的患者排除标准。 虽然目前主要在临床环境中使用筛查或治疗前时间点的患者样本来评估预先存在的ADA，但预先存在的ADA的高流行率表明，在临床前开发阶段早期使用健康或药物未接触的捐赠者的人类血清进行更严格的评估是有必要的。用bsAb给药的受试者中出现的治疗性ADA与在健康捐赠者中检测到的预先存在的ADA相关，并且预先存在的ADA的表位特异性能够预测临床ADA的表位偏好。 在评估LY3415244的安全性和免疫原性的1期试验中也有类似的观察结果，其中所有12名入组的患者都对至少一个bsAb臂产生了治疗性ADA。针对anti-TIM-3臂的ADA被发现更早出现，并对大多数患者的可溶性TIM-3目标参与产生负面影响。在最近的一项调查中，评估了60个正常人类血清样本中针对LY3415244的预先存在的ADA反应性，分析同样发现，正常人类血清样本中针对LY3415244的预先存在的ADA免疫原性主要针对TIM-3 CDRs。 3.9.治疗相关风险因素 包括给药途径、药物剂量和给药方案以及使用免疫调节共治疗药物，都是影响生物制剂免疫原性风险的因素，包括bsAbs/msAbs。大多数治疗性抗体通过静脉注射或皮下注射给药。尽管普遍接受的观点是皮下注射治疗性抗体与更高的免疫原性风险相关，但目前临床批准的抗体的数据并不支持这一假设。然而，与皮下注射相关的独特的免疫原性挑战可能对bsAbs/msAbs特别重要。皮下注射通常需要相对于静脉注射的高浓度给药。因此，与增加的bsAb/msAb聚集体以及其他产品属性相关的挑战可能在通过皮下途径产生更高的免疫反应中发挥重要作用。这一假设得到了pasotuxizumab这一例子的支持，这是一种PSMA × CD3 bsAb TCE，在1期研究中评估了静脉和皮下给药。 虽然静脉组的患者中没有检测到任何ADA，但所有接受皮下治疗的患者都发展出非短暂的ADA。此外，在这些患者中超过93%的人发现中和性ADA，并且没有人对局部糖皮质激素治疗有反应。当JNJ-63898081，另一种PSMA × CD3 bsAb TCE，通过静脉和皮下给药给试验参与者时，也报告了类似的结果。 药物剂量和给药方案也可能强调bsAbs/msAbs的免疫反应风险，因为由于细胞因子释放综合征等毒性，给药通常限于相对于mAbs的较低剂量。与msAb/msAb的较低剂量可能潜在地导致ADA介导的药物清除增加和次优的PK和PD性能。此外，治疗持续时间也是一个需要考虑的重要因素，尽管其与免疫刺激性bsAbs/msAbs在肿瘤学中的相关性可能不清楚，因为这些方案不需要长期治疗。此外，可能需要长期治疗的bsAbs/msAbs，如那些用于自身免疫性疾病的，可能从其自身的免疫抑制MOA中受益，导致免疫原性降低。最后，与抗炎药物或化疗的联合治疗也可能影响bsAbs/msAbs的免疫潜力。 3.10.作用机制风险因素 最近批准的bsAbs/msAbs的数据，以及其他在临床开发中的bsAbs/msAbs，表明这些bsAbs/msAbs的作用机制在它们在患者中的免疫潜力中起着关键作用。根据分子的不同，可以增加或减少免疫原性。例如，批准用于B细胞恶性肿瘤的bsAb TCEs，如CD19 × CD3 blinatumomab和BCMA × CD3 teclistamab，显示出最小的ADA发病率（<2%），可能由于它们的B细胞耗竭MOA。另一方面，针对B细胞上共刺激分子的bsAbs/msAbs，ABBV-428，一种间皮素-CD40 bsAb，在1期临床试验中显示出高ADA发病率（63%），可能由于其对B细胞的CD40激动效应和对药物PK的影响。非B细胞耗竭TCEs也可能由于其MOA涉及广泛的T细胞激活而带来更高的免疫原性风险，如AMG 211，一种CEA × CD3双特异性T细胞-引导剂，它在所有接受>3.2 mg高剂量治疗的患者中诱导了ADA，并在高滴度下暴露量下降，导致停药。 免疫调节性bsAbs/msAbs通过激活共刺激通路或拮抗抑制通路（如CTLA-4 × PD-1和CTLA-4 × OX-40双特异性抗体）可能会对患者造成更高的免疫原性风险，导致ADA发生率增加，因为它们相对于针对相同靶点的单抗单药治疗能够释放更强的免疫细胞激活。这一概念得到了抗PD-1和抗CTLA-4单抗的单药治疗和联合治疗报告的支持。当nivolumab与ipilimumab联合使用时，ADA发生率较单药治疗（11%）显著提高，报告为26-38%。 类似地，当抗PD-L1抗体durvalumab与化疗联合使用时，ADA发生率极低（<1%），而与抗CTLA-4抗体tremelimumab和化疗联合使用时，ADA发生率则较高。 与这些观察结果一致，LY3415244，一种针对TIM-3和PD-L1的bsAb，也被报告在所有给药的患者中诱导ADA。最近，在针对HER2和4-1BB的bsAb PRS-343的1期研究中也报告了类似的观察，PRS-343的给药导致ADA发生率为28%。 尽管存在这些趋势，免疫原性仍然难以预测，因为并非所有这些机制总是导致免疫原性增加。 另一个与作用机制相关的风险因素是抗体与其可溶性或膜寡聚靶标形成免疫复合物的能力。由于bsAbs/msAbs能够结合多个靶点，免疫复合物形成的风险可能更高。大型免疫复合物被广泛认为通过增加APCs的摄取以及通过交联和激活B细胞受体的T细胞非依赖性激活B细胞来增强免疫反应。针对炎症细胞因子TNF和IL-17A的bsAb JNJ-61178104支持这一概念，因为其给药已被证明在所有患者中诱导ADA。 尽管目前对免疫调节性bsAbs/msAbs的临床免疫原性数据有限，但现有证据表明它们与增加的免疫原性风险和更高的ADA发生率相关。因此，作用机制的考虑应成为bsAb/msAb开发过程中全面免疫原性风险评估策略的重要组成部分。重要的是，这些考虑也应适用于上述讨论的各种体外和体外工具的兼容性，考虑到正在开发的抗体的作用机制，以及这对这些实验数据解释的影响。 总之，随着bsAbs/msAbs领域的快速发展，以及关于与这一类抗体相关的免疫原性和安全风险的知识逐渐可用，开发全面的免疫原性风险评估策略对于实现最佳抗体开发至关重要。这些免疫原性风险评估策略可以在临床前阶段涉及各种计算工具以及体外和体外实验，同时关注与bsAb/msAb开发相关的重要药物、患者和治疗相关风险考虑。 4.特异性 在双特异性抗体（bsAbs）和多特异性抗体（msAbs）的开发中，多特异性（在蛋白质组中对靶点外的结合）和多反应性（对带电或疏水蛋白、膜或其他生理表面的非特异性结合）都是不希望出现的属性，它们可以改变疗效、清除率和组织分布。这些不需要的效果可能导致靶点外毒性、免疫原性和生产上的挑战。 多特异性可以由几种机制引起，例如与不相关靶标的分子模拟或CDRs中的可塑性，这些特征可能因在同一抗体上具有多个互补决定区而加剧。多反应性归因于不希望的抗体表面属性，例如电正性、电负性和疏水性表面斑块或Fv和Fc的电荷不平衡。在bsAbs/msAbs中，与从亲本分子行为预期的相比，多特异性和多反应性都可以被调节。这些差异可以归因于结合价的改变和/或复杂的互补决定区间相互作用。然而，尽早识别可能产生靶点外效应的抗体至关重要，建议在将亲本分子重新格式化为bsAbs/msAbs之前对其进行评估。 4.1.计算机预测 众多的计算机模拟工具已被开发出来，用于评估抗体特征以预测多反应性。抗体的特性，如序列组成、互补决定区（CDR）的长度和表面特性（即电荷和疏水性），通常从同源模型中得出，已被用来创建多反应性的预测模型。 具有大量电荷在其CDR上的抗体或高疏水性可能具有加速的清除率，对他们的治疗有效性产生负面影响。这种加速清除被认为是由于抗体表面的正电荷可能与负电荷的细胞膜或细胞外基质相互作用，导致 增加的组织吸收和血液清除。几个小组已经评估了使用许多可用的在硅片上的工具来探索抗体开发能力，但这些工具的广泛适用性对bsAbs/msAbs的探索较少。Jain等人。系统地评估了在硅片上派生的特征和体外指标之间的关系， 评估了许多开发能力方面。 虽然预测体外测定结果的能力大于那些仅从计算派生指标派生出来的，总体正电荷被发现对多特异性有害，更大的负电荷区域似乎有益，其他基于序列的趋势对氨基酸组成和位置在CDRs中证实了其他研究，这些研究正在调查多反应性。此外，许多在硅片上的指标的数量下降超出了确定的可接受分布（通常称为标志或违规行为）随着临床路径的进展（即，批准的抗体具有最少的在硅片上的标志）。同样，Zhang等人。生成了用于识别潜在多特异性的物理化学 规则，通过评估序列和结构特征与测定之间的相关性来探测自关联和结合到各种多特异性试剂在137个临床阶段抗体上。最近对1000个mAbs的生物信息学分析系统地 确定了多反应性和非多反应性抗体之间的关键差异，目标是扩展对属性的理解推动多反应性超出疏水性，电荷和CDR环灵活性。多反应性抗体往往有CDRs，平均产生轻微的亲水性，中性电荷的结合表面，可能潜在地允许与广泛的配体进行弱相互作用。这些数据被用来构建一个计算框架，可以识别多反应性抗体，准确率为75%。最近开发的机器学习方法已被用来预测纳米抗体和scFv中的多反应性。这些可变域格式是bsAbs/msAbs中越来越常见的组成部分，因为它们不需要非轻链的共价配对，因此产生较少的格式特异性错配物种。哈维等人。使用一个合成库，旨在模仿一个天真的骆驼库并将其排序到结合池到多特异性试剂（PSR）使用FACS。结果被用来训练逻辑回归和神经网络模型来分类纳米体多反应性。有几个预测特征为多反应性例如，存在精氨酸和色氨酸；然而，它们被位置强烈混淆。值得注意的是，他们的模型能够建议突变以减少估计的多反应性。Lim等人，通过训练四种监督式机器学习方法，利用这些数据计算了19,426个已知多反应性档案的scFv的基于序列和基于结构模型的特征，并得出结论，表现最好的模型具有与多个不同的CDR和全局抗体特征相关的特征，包括CDRH3中的色氨酸数量、等电点（pI）和径向旋转半径。然后，这些模型与基于自然语言的模型描述符相结合，以从scFv特征中提取额外的信息。表现最佳的集成模型在识别多反应性scFv方面的精确度和准确率超过75%。可用于特异性预测的在硅片上工具的数量和可变性可能会令人生畏，而且很少有模型专门针对bsAbs/msAbs的独特属性进行了设计。因此，建议主要使用这些方法作为在开发过程的早期对几个候选分子进行初步评估，以识别抗体和相关的在硅片上指标，这些指标落在任何一个预测的极端。这些数据可以作为进一步实验探究策略的有用指南。 4.2.体外特异性测定 评估PK属性是与特异性相关的主要开发能力属性。事实上，mAbs的长消除半衰期是这类治疗药物的主要优势。调节清除率的最重要元素是Fc中含有的分子在内质网隔室中依赖pH的特定FcRn结合。BsAbs/msAbs通常通过扰动或移除Fc-常驻FcRn相互作用来大幅度改变这一档案。分析FcRn亲和液相色谱使用从pH 5.5到8.8的线性pH梯度来分离IgG异构体、降解产物和工程抗体，如bsAbs/msAbs，基于它们在不同pH下对FcRn的亲和力。与野生型IgG相比，突变体的洗脱峰档案和保留时间的变化与FcRn转基因小鼠中的PK档案相关。尽管普遍认为Fc在FcRn介导的循环中起主导作用，但还表明，可变域的净电荷也影响与FcRn的结合，正如brakinumab所示，其Fv净电荷较高，但与ustekinumab相比具有类似的pI。FcRn有一个扩展的负电荷表面补丁和增加的brakinumab结合，阻止了在生理pH下与FcRn的有效解离，并减少了其终端半衰期。在中性pH下从FcRn的缓慢释放已被证明对两个具有类似pI和生物物理属性的bsAbs的PK产生不同的影响。 除了FcRn独立特性如单克隆抗体（mAbs）的Fv电荷、目标结合和定位、多特异性和多反应性或糖基化变化可能导致不期望的增加清除率，影响mAbs的药代动力学（PK），这些特性对于双特异性/多特异性抗体（bsAbs/msAbs）的开发同样重要。特别值得注意的是，针对CD3的bsAb TCEs通常具有与不良PK相关的多反应性标志，部分原因是许多针对CD3的抗体结合到CD3 epsilon极端N-末端的电负性线性表位，并且具有较高的等电点（pI）值。基于结构的方法和使用基于酵母的检测平台的抗体工程已被证明可以纠正这种多反应性行为，同时增加对CD3的亲和力。 测试更广泛的多反应性和多特异性，这与药代动力学不佳、制造困难和耐受性问题有关，由于人类蛋白质组和其他生理表面呈现的巨大潜在非目标空间，这是一项挑战。人类细胞微阵列技术可以在体外分析人类蛋白质组，以减少体内非目标毒性和加速清除的风险。 筛选多特异性性还可以包括结合由CHO、HEK或Sf9细胞提取物制成的PSRs，其中包含溶解的膜蛋白。这种方法可以作为基于展示的方法的反筛选，如针对SARS-CoV-2的基于纳米抗体的四价bsAb所示。 如上所述，局部正电荷可以导致通过增强FcRn结合、防止FcRn-抗体解离和有效回收来加速清除率。虽然可以从序列或通过毛细管等电聚焦等直接方法估算抗体的pI，但它是多反应性的一个差指标，因为它不显示电荷斑块或局部不平衡，通常更倾向于使用结构衍生方法，如Fv电荷对称性和空间电荷图（SCM）。 除了静电相互作用外，抗体的疏水性是多特异性以及潜在胶体稳定性问题的可靠指标。可以通过分析疏水相互作用色谱上的保留时间和洗脱曲线来评估抗体的疏水性。某些抗体germlines，如VH1–69，由于它们的重链CDR2更疏水，更可能产生疏水性较高的抗体，但这种倾向可以通过工程方法和生物物理评估来最小化。 在bsAbs/msAbs的临床前阶段进行特异性测试，应考虑作为降低开发和制造风险的两阶段方法。应评估每个亲本抗体，并仅选择低风险的亲本抗体或结合域进行重组成bsAbs/msAbs。重组成后，应在衍生的bsAb/msAb上重复相应的特异性测定，以确认所应用的设计和格式没有显著改变每个亲本抗体或结合域的特性。选择具有良好特异性特性的低风险亲本序列是有效生成可开发bsAbs/msAbs的先决条件。 5.稳定性 抗体的稳定性包括许多分子内在和药物相关的外在组成部分，包括热稳定性、胶体稳定性、耐蛋白水解性和血液中的化学稳定性。这些领域的缺陷可能导致制造过程中的困难、影响货架期以及改变抗体的免疫原性和活性。 5.1.热稳定性 热稳定性是承受热应用时蛋白质展开和降解的能力。成功开发的抗体的一个关键特性是它们良好的热稳定性，这主要由mAbs中的Fab区域决定，但对于bsAbs/msAbs可能不那么明显。就稳定性而言，Fv区域具有最高程度的变异性，因为其主要序列因每种抗体而异。 低热稳定性可能使抗体更容易聚集，限制了它们作为治疗性抗体的潜力。抗体热稳定性的一个有用估计值是其熔化温度（Tm），定义为抗体在其展开状态的浓度等于其在折叠状态的浓度的温度。抗体包含几个区域，包括可变Fv区域和恒定CL、CH1、CH2和CH3区域。这些区域中的每一个都是伪独立的，因此在不同区域之间通常观察到不协同的展开。众所周知，IgG1 CH2区域的Tm约为70°C，CH3区域的Tm约为82°C。 一项研究发现，当通过异二聚体CH3界面构建bsAbs时，所得抗体的CH3热稳定性显著降低，与K409突变相关的Tm降低约为12°C。 Fv、CH1和CL区域倾向于协同展开，其Tm可以根据可变区域序列跨越大范围。差示扫描量热法（DSC）用于建立不同区域的热稳定性和热力学特性。 差示扫描量热法（DSC）特别适合于双特异性/多特异性抗体（bsAbs/msAbs），因为它可以通过额外的信息，如展开焓变，来识别不同区域的展开事件，但由于仪器限制和样品需求，通常相对低通量。相比之下，差示扫描荧光法（DSF），也称为热移测定，基于色氨酸和酪氨酸在展开时的内在荧光或添加荧光染料，通常高通量。这种技术在高通量环境中的一个典型用例是识别低稳定性抗体进行优先级降低，这些抗体的Tm接近或低于CH2热展开温度。 除了热展开外，许多DSF仪器还能够检测由热展开引起的聚集体形成，这导致光散射增加。这种聚集的起始温度通常用于筛选各种配方对聚集倾向的影响。 bsAbs/msAbs的形式对热稳定性有若干重要影响。一般来说，bsAb/mAb设计策略很少相对于亲本mAbs增加热稳定性。因此，建议在开发过程早期评估亲本抗体的热稳定性，并且理想情况下应降低热稳定性低的mAbs的优先级。在bsAb/msAb工程之后，通常一个或多个重组成的可变区域会失去热稳定性。设计可能如何影响亲本抗体不同区域的热稳定性，理想情况下应通过DSC进行评估，DSC非常适合解耦大多数mAb和bsAb格式中存在的众多展开事件。使用不需要突变Fv区域的bsAb/msAb格式，如VHH域，可能完全避免基于重组成的热稳定性下降的不可预测性。 已经开发和优化了几个bsAb平台和结合域的工程解决方案，以避免热稳定性的损失。对于目标域，包括在Fabs的VH-VL和CH1-CL界面、scFvs的可变域之间、scFvs的连接和可变域之间引入二硫键，或在scFvs的连接和可变域之间引入二硫键。后一种方法被证明可以将二硫键固定的scFvs的热稳定性提高约10°C。用于保持热稳定性的其他方法包括合理工程或随机突变方法的组合、人源化到更稳定的框架、或将稳定框架残基转移到不太稳定的框架上。 5.2.化学稳定性 化学稳定性指的是抗体一级序列中共价键的完整性以及重链-重链或重链-轻链之间。基于抗体的治疗药物的化学稳定性可能受到多种不同的降解途径的影响，包括脱酰胺作用、异构化、氧化、二硫键交换、N-末端焦谷氨酸形成、C-末端赖氨酸剪切、片段化和糖基化。 根据这些降解事件的位置与亲和位点和恒定域的关系，抗体的活性或半衰期可能会受到影响。一个众所周知的例子是曲妥珠单抗，其中LC-Asn30的脱酰胺对效力有轻微影响，而HC-Asp102的异构化显著降低了其效力。由于氧化应激，蛋氨酸氧化为蛋氨酸亚砜可能会对抗体产生几种影响，如报告的单克隆小鼠抗体OKT3。在Fc区域的M428/M252处蛋氨酸氧化可能会影响与FcRn的结合，从而影响抗体的回收，这会减少抗体的半衰期。任何影响亲和位点活性或Fc效应功能的化学降解都是有害的。因此，选择化学稳定的靶向单元以限制项目失败的风险非常重要。bsAb/msAb格式及相关的连接子或突变应用于生成bsAbs/msAbs也可能影响化学稳定性。化学稳定的靶向单元在重组成bsAbs/msAbs时可能会遇到不可预见的化学稳定性问题；因此，仔细评估亲本和衍生的bsAbs/msAbs都很重要。如果检测到降解事件，它们有时可以通过适当的配方条件来减轻。但重要的是要注意，强大的化学稳定性对于体内给药后的稳定性很重要，因此工程方法通常比配方筛选更可取。导致抗体降解的常见事件包括脱酰胺作用、异构化和片段化。脱酰胺作用是抗体中普遍存在的修饰，它发生在生产、储存或体内，并且更容易影响天冬酰胺残基，以及在较小程度上影响谷氨酰胺残基。脱酰胺作用是通过主链酰胺氮对侧链酰胺的羰基碳的亲核攻击和随后氨的丢失，导致通过天冬酰-琥珀酰亚胺（Asu）中间体形成天冬氨酸，通常在中性或碱性pH下加速。 相反，天冬氨酸通过Asu中间体的水解异构化通常在酸性pH下加速，并导致异天冬氨酸或天冬氨酸的形成（在中性条件下的比例为3:1）。异构化不依赖于水的存在，因此也可能发生在冻干的抗体配方中。 识别化学降解风险最直接的方法是通过对一级氨基酸的简单基序分析。然而，任何给定基序的降解倾向高度可变，并且取决于额外的结构因素，如溶剂可及性和二级结构构象，以及诸如pH、温度、辅料等外在因素。因此，基序方法仅作为化学责任风险的初步评估，任何情况都应通过额外的分析来确认。最近，基于结构和同源模型的方法已被开发出来，以更好地评估这些降解事件的可能性，某些位置和溶剂暴露的CDR环中的序列基序被识别为脱酰胺、异构化和氧化的热点。 虽然从开发的角度来看，Fv区域的降解通常是最具问题的，但这些修饰也常位于IgG的恒定区域。 化学稳定性问题可以通过强制降解研究来识别，这些研究通过故意将治疗性抗体暴露于应力条件下，在其整个生命周期中进行调查。这些研究可以包括长时间暴露于高温、低/高pH值、冻融循环、搅拌、糖基化、光照和生理或氧化应激。这些研究通常结合实验方法来检测和定量任何化学修饰，如离子交换和疏水相互作用色谱、标记和HPLC-UV-Vis、通过质谱的肽图、十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）或毛细管电泳和等电聚焦。 这些研究劳动密集、耗时且耗费材料，通常在发现过程的后期阶段对较少数量的抗体进行，通常在细胞系开发前。根据检测到的任何化学责任的位置，这些研究的样本通常也通过结合和活性测定来表征，以评估任何化学降解事件是否影响对目标的结合亲和力或抗体的活性和回收。抗体治疗中化学稳定性受损的另一种表现是片段化，可以分为非酶促和酶促片段化。非酶促片段化在抗体中经常观察到，主要在恒定区域，最有可能在上铰链区域，由于其动态环结构，可能性最高。 在上铰链区域的非酶促片段化发生在蛋白质主链中，通过诸如β-消除、直接水解、介导的裂解或自由基催化等化学反应，这取决于溶剂条件，如碱性或酸性pH值、温度以及自由基或金属的存在。非酶促片段化也可能伴随着二级、三级和四级结构以及构象灵活性发生，将序列空间中相距甚远的侧链带到局部环境中。非酶促片段化事件经常发生在天冬氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸或天冬酰胺残基上，其中除了甘氨酸外，其他残基都可以通过它们的侧链介导片段化事件。CH1恒定区域的K(133)STSGGT环可能是一个常见的裂解位点，产生两个约35和15千道尔顿的片段，CH2区域（G236-G237，D270-P271）的其他位点也被发现可以迅速裂解。酶促片段化通常由蛋白酶裂解介导，这发生在mAbs和bsAbs/msAbs的生产和纯化过程中，铰链区域是酶促裂解最常见的位点。在所有情况下，片段化主要通过如天然尺寸排除色谱或SDS-PAGE等分离方法检测。与任何已识别的化学稳定性问题一样，需要根据裂解位点在Fv或恒定区域的位置评估其对抗体活性的影响。检测bsAbs/msAbs中片段化的工作与mAbs相同，但由于存在两个或更多的靶向区域，事件的复杂性和分配裂解基序的难度可能会增加。 此外，双特异性/多特异性抗体（bsAbs/msAbs）可能会经历一个更为严格的纯化过程，包括额外的色谱步骤来去除与格式相关的杂质，因此任何化学稳定性的缺陷在制造过程中可能变得更加明显或累积。 焦谷氨酸的形成通常出现在抗体重链和轻链的N-末端，特别是当N-末端残基是谷氨酰胺时，对于谷氨酸来说则较少见。焦谷氨酸的形成可以通过非酶促的自发环化在体外通过亲核攻击N-末端主链酰胺氮对侧链酰胺形成稳定的五元环与H2O离去基团，或在体内由谷氨酰胺环化酶催化，这是一种在人类、动物和植物中发现的酶。如果控制不当，焦谷氨酸的形成可能导致抗体异质性，并可能影响制造过程中关键质量属性（CQAs）的维持。对于bsAbs来说也是如此，由于所有链的N-末端在某些双特异性格式中可能不同，检测和控制焦谷氨酸形成的复杂性增加了。 主要发生在赖氨酸侧链胺基和较小程度上的N-末端胺基和精氨酸的糖基化是一种非酶促的糖基化修饰，可以改变对抗原的亲和力，影响抗体的效力，并增加聚集。这种现象在治疗性抗体中很常见，并已在bsAbs中得到证实。这种糖基化事件通常由细胞培养中的发酵过程或储存期间引起，当含有蔗糖的配方水解导致非还原糖时，这会通过低pH和高温度加速。因此，制造过程需要严格控制，以通过适当的生产和配方条件满足CQAs。糖基化可以通过硼酸盐或离子交换色谱、毛细管等电聚焦、LC/MS方法和比色法检测。 5.3.胶体稳定性和粘度 胶体稳定性指的是折叠蛋白通过自相关沉淀在溶液中的倾向，由电荷不平衡、疏水斑块、融合蛋白界面解离和结合以及与离子的相互作用介导。 粘度是描述给定抗体配方流动阻力的相关属性，由不希望的分子间蛋白-蛋白相互作用引起，这些相互作用由胶体和构象浓度依赖行为介导。这些相互作用可能源于与部分原子电荷分布、等电点和偶极矩相关的变量域的静电属性，或导致自相关的疏水属性和形状互补性。对于高浓度的治疗性bsAbs/msAbs配方，胶体稳定性和粘度是重要的属性。通常通过盐或PEG诱导沉淀、静态光散射、多角度光散射和动态光散射（DLS）来评估蛋白质治疗剂的胶体稳定性。DLS可以在高通量设置中确定扩散相互作用参数（kD），特别适合评估配方条件及其在搅拌等应激条件下对胶体稳定性的影响。胶体稳定性通常在含有scFv域的bsAbs/msAbs中受损，由于VH-VL界面的柔韧性增加，这种柔韧性通过可逆解离和结合形成寡聚体，这一过程取决于蛋白质浓度，并可能受到pH值、离子强度和其他辅料的影响。Majumder等人证明，一个易于聚集的scFv-bsAb在组氨酸和谷氨酸的等摩尔缓冲液组合中具有改善的胶体稳定性，展示了配方对改善胶体稳定性的潜力。 自相互作用测定评估抗体在高浓度（>100 mg/mL）下配制用于治疗管理时的胶体稳定性风险。由于bsAbs中靶向臂的价数通常减少，mAbs中自相互作用测定观察到的趋势在bsAbs/msAbs中可能减弱，但不太可能完全消失。此外，任何bsAbs/msAbs平台的设计突变以强制正确的重-重和重-轻界面组装，如引入电荷对和疏水界面工程，如果突变部分或完全暴露或引起构象变化影响抗体表面属性，可能带来自相关风险。因此，重要的是只考虑低风险的靶向单元进行重组成bsAbs/msAbs，并通过自相互作用测定再次评估重组成分子对不希望的自相互作用的倾向。评估自相互作用的方法包括动态光散射（DLS）、亲和捕获自相互作用光谱（AC-SINS）、电荷稳定自相互作用光谱（CS-SINS）和生物层干涉测量（CSI-BLI）。DLS是一种广泛使用的评估抗体自相关性的技术，可以在微孔板格式中进行，使用少量抗体评估数百个样本。DLS测量增加的水动力半径作为蛋白质浓度的函数。从在相对较低的抗体浓度（1-20 mg/mL）下进行此分析得出的kD与高达175 mg/mL浓度的29种不同mAbs的粘度测量结果相关性良好。在AC-SINS中，抗体被吸附到金纳米颗粒上，产生高局部蛋白质浓度，模拟浓缩的抗体溶液。吸引的自相互作用减少固定抗体之间的粒子间距离，导致最大吸收波长（等离子体波长，λp）的红移。AC-SINS在高通量板格式中识别具有高自相关风险的抗体，同时在稀薄浓度（<50 μg/mL）下使用极少量的样本。这种方法通常用于筛选临床前阶段的抗体胶体稳定性风险。这种方法进一步发展为通过聚赖氨酸涂层通过电荷稳定（CS-SINS）筛选某些配方条件和弱酸性缓冲条件。虽然bsAb重组成可能导致衍生的bsAb与亲本mAb相比AC-SINS得分降低，但由于bsAbs AC-SINS得分与粘度风险之间关系不太明确，因此必须选择低风险的mAb进行重组成。 在生物层干涉测量（CSI-BLI）中，抗体通过其Fc区域装载到生物层干涉测量生物传感器上，以测量自结合反应。Fab可用于通过氢键配对、离子相互作用或疏水相互作用进行结合，该测定可以在低样品量（15μg）的高通量格式下进行。 抗体候选物和配方的粘度风险通常通过使用粘度计直接测量。由于高浓度配方需要大量样品，通常在开发过程的相对后期进行此实验。将单克隆抗体重组成bsAbs/msAbs可能会导致粘度增加，因为在存在两个靶向单元时会出现新的相互作用，特别是如果这些单元具有相反的静电属性。混合两种低粘度mAbs（pI分别为6.3和9.3）的粘度数据与相关bsAb的高粘度相关。新型几何结构导致的更大的bsAbs/msAbs也可能导致粘度问题，如一项研究中所示，一种双变量域免疫球蛋白bsAb比亲本mAb更粘稠，粘度的增加归因于bsAb的整体大小。有几种策略可以预防适用于mAbs和bsAbs/msAbs的粘度问题。首先选择对其预期给药途径具有有利的低粘度行为的bsAbs/msAbs非常重要。选择低粘度亲本抗体进行双特异性IgG重组可能无法预测具有有利粘度的bsAb/msAb，正如Tilegenova等人所证明的，用一个抗IL-13/IL-17双特异性IgG4抗体进行的研究发现，怀疑引起阳离子-π和/或π-π相互作用的芳香族点突变降低了双特异性的粘度，并且对一个在150 mg/mL时粘度高的单特异性抗GCGR IgG1抗体也成功。从蛋白质序列或结构计算的Fv净电荷可以表明潜在的粘度风险。Fv电荷<2的抗体被认为是高风险，因为它们可能有负电荷斑块，可能驱动与恒定域中的正电荷斑块自相关。此外，Fv电荷对称参数，即VH和VL的净电荷乘积，也可以表明由于自相关引起的粘度风险。 总之，稳定性评估是非常多维的，并且是全面开发性评估的关键要素。在目标给药途径和粗略配方的背景下最好评估稳定性。有大量的测定可用于这些测量，这些测定在实施的难易程度、通量和预测能力上有所不同，一个结构良好的评估策略应该在开发过程中利用多种测定。5.4.体内稳定性 治疗性抗体在给药后数天和数周内的体内物理化学稳定性可能对药物效力、清除和免疫原性有影响。与mAbs一样，IgG样的bsAbs/msAbs最好具有提供长半衰期的药代动力学（PK）特性。由于它们的半衰期较长，因此可以减少给药频率并改善患者依从性。与mAbs一样，bsAbs/msAbs的体内稳定性可以通过检测其在体内的浓度随时间的变化来评估，这通常通过ELISA或基于质谱的检测来完成。体内稳定性的测定对于预测药物效力和评估长期给药方案的可行性至关重要。 由于它们在循环中的半衰期大约为3周，内源性和重组抗体可以经历与治疗性抗体在制造和储存过程中类似的体内生物转化事件，包括异构化、氧化、糖基化、二硫键修饰、N-末端焦谷氨酸形成、C-末端赖氨酸剪切和蛋白水解裂解。在体内对抗体药物的生物转化事件的检测和定量是治疗性抗体开发中一个相对较新且日益增长的领域，这一领域面临着一些技术挑战。 血清是血液的一个亚室，含有富含白蛋白、半胱氨酸、胱氨酸、谷胱甘肽、同型半胱氨酸和其他小硫醇的异质环境，这可能导致抗体二硫键的重新排列，特别是对于IgG和IgG4。根据局部环境和溶剂暴露，这种混乱可能与使用工程二硫键以增强热和胶体稳定性的bsAb/msAb格式相关。 在啮齿动物和非人灵长类动物中进行的血清稳定性研究和药代动力学（PK）评估有助于评估bsAbs/msAbs的稳定性，并在开发性评估的早期识别潜在的责任。PK与抗原结合能力之间的关系可以用来识别体内不稳定的开发候选物。例如，体内脱酰胺作用可能导致抗原结合的丧失，影响效力，并可能引起潜在的关注。 IgG1、IgG2和IgG4亚类的的治疗性抗体可能容易受到木瓜蛋白酶、胃蛋白酶和链球菌免疫球蛋白降解酶的重组蛋白酶裂解，不同的酶特异性和裂解效率主要基于它们各自的铰链序列。此外，IgG1可以被肿瘤微环境中的蛋白酶如基质金属蛋白酶裂解，或者在循环中，而IgG2则较不易受到裂解。IgG1两个重链的下铰链的裂解可能对Fc效应功能产生负面影响，如抗体依赖性细胞介导的细胞毒性和补体依赖性细胞毒性，因为裂解位点靠近Fcy受体和C1q的结合位点，可能与自身炎症性疾病中mAbs的治疗抵抗性有关。蛋白酶裂解事件可能以类似的方式影响IgG型bsAbs/msAbs格式的铰链区域，具有潜在的意想不到的裂解敏感性、特异性和效率。因此，应在临床前开发阶段监测这些裂解事件。许多bsAb格式使用甘氨酸-丝氨酸的扩展连接序列来系上额外的模态并增加价数，这些可能容易受到体内蛋白水解裂解的影响。 相反，最近已经利用在实体瘤的肿瘤微环境中优先表达的某些蛋白酶的存在来激活被蛋白酶可裂解的域或肽段掩盖的bsAb TCEs，以限制它们在循环中的靶向毒性。在另一个例子中，蛋白酶敏感的连接子被用来将两个域抗体系成一个bsAb分子，用于治疗性口服治疗炎症性肠病。 6.可制造性 可制造性是分子开发性评估的一个组成部分。通过可制造性评估，可以更深入地了解分子行为，从而设计出既注重质量又注重数量的制造过程和控制策略。这种评估最好在代表性材料上进行，评估与产品质量、可扩展性和工艺产量相关的大规模生产过程的技术可行性。通常，可制造性评估分子适应平台流程和方法，以支持简化的开发工作。及早识别CQAs（关键质量属性）和工艺及分析开发的风险，可以减轻开发挑战，并允许优先分配工艺开发资源。开发候选物的可制造性是实现供应高质量、纯化和配方化的抗体以推进毒理学研究、临床研究和商业化的关键考虑因素。执行严格和全面的临床计划以及满足商业化视角下的供应链目标所需的抗体数量，突出了建立强大和可扩展制造工艺的基本需求。 6.1.双特异性抗体/多特异性抗体的制造考虑 从可制造性的角度来看，单克隆抗体（mAbs）已经通过发表的报告和行业指导文件得到了很好的表征。自1986年首个单克隆抗体商业化以来，已经开发了许多可制造性工具，并对潜在的责任进行了表征，降低了将单克隆抗体治疗推进到制造过程中的相关风险和挑战。 尽管双特异性抗体/多特异性抗体（bsAbs/msAbs）作为一类治疗药物取得了进展和势头，但与单克隆抗体相比，支持其开发到制造的资源相对较少，这主要是因为它们在临床和商业制造方面的历史相对有限。此外，bsAbs/msAbs的结构异质性除了必须克服的单克隆抗体工艺障碍外，还提出了几个可制造性挑战。 6.2.工艺考虑 上游工艺考虑 在开发稳定表达bsAb/msAb的细胞系时，上游处理考虑不仅必须评估典型的开发标准，如蛋白质滴度、细胞系稳定性、群体倍增时间、翻译后修饰以及在预测设备、材料、培养基和饲料背景下的可制造性，而且还必须额外评估完整bsAb/msAb分子正确组装的可能性。 开发bsAb/msAb上游工艺可能非常具有挑战性，因为几个变量可能影响正确与错误组装分子的比例，以及错误组装物种的身份和相对丰度。载体和序列设计、选择克隆性和正确组装分子产量的过程，以及细胞培养和蛋白质表达的多因素性质（如上所述），都是需要考虑的关键因素。使用导向突变，如knob-into-hole突变，结合细胞系开发选择和上游工艺开发考虑，通常用于努力优化粗提物中正确配对目标分子的浓度。 尽管在细胞系开发和上游处理方面取得了进展，但在细胞培养上清液中存在错配的bsAb/msAb并不罕见，制造过程中还需要在下游成功纯化此类产品相关杂质的方法。 下游工艺考虑 在下游处理中，上游bsAb/msAb制造过程中产生的错配变体是不受欢迎的，它们作为工艺杂质，给纯化过程带来额外负担。在典型的单克隆抗体制造过程中，半抗体和抗体片段是常见的杂质，但具有显著结构和生化特性差异的变体更容易使用依赖分子电荷差异的色谱方法分离。这对bsAbs/msAbs的可制造性提出了特别的挑战，因为潜在的错误组装分子，如几个四链bsAb分子中的那些，可能表现出难以用制造中常用的分离方法区分的生物物理特性。不同质量的产品相关杂质也可能影响纯化和表征方法，包括由于bsAb/msAb变体的聚集倾向增加而产生的重大制造挑战。因此，在开发bsAb/msAb候选物时及早评估可制造性是非常有利的，以确定由于链错配而产生的结构变体之间的分子属性差异是否提供了足够的分辨率，以实现大规模成功纯化。变体之间的pI差异是主要关注点，因为在大规模制造中广泛使用了pH和/或电导依赖的色谱过程。 也可以利用其他纯化方法从其他属性中分离产品相关变体，包括利用疏水相互作用色谱针对变体之间的疏水性差异，或依靠独特的属性组合通过多模式色谱方法实现分离。虽然结合多种纯化方法可以增加成功分离配对的bsAbs/msAbs与错配变体的可能性，但涉及的额外时间和成本通常是不受欢迎的。在制造过程中，定制与建立可靠的平台流程相反，突出了开发需要有限工艺定制的bsAbs/msAbs的价值。 使用适当的分析方法对于生产中双特异性抗体/多特异性抗体（bsAb/msAb）的特性描述至关重要。除了典型的与产品相关的、宿主细胞相关的以及其他与工艺相关的杂质外，建立一个足够灵敏的分析方法以区分正确和错误组装的抗体产品非常重要。在开发过程中，区分这些变体的可制造性和工艺开发至关重要。此外，这种材料可能用于临床前研究，强调了其质量的重要性。当考虑制造规范时，批量放行标准推动目标分子的最终浓度以及任何指定杂质在可接受的范围内。液相色谱/质谱（LC/MS）方法，包括去糖基化完整质谱，通常能够区分错配变体，识别包含错配的重链（HC）和/或轻链（LC）组合的分子，以及正确配对的bsAbs/msAbs。随着bsAb/msAb药物开发向商业化发展，另一个关键的分析挑战是生物测定法的开发。bsAb/msAb的生物测定法必须准确且可重复地反映分子的双重作用机制和潜在的机制协同作用。将这些组合到单一测定中可能证明是一个重大挑战，评估是否需要开发两个单独的生物测定法是建立适当分析策略时的一个重要因素。7.结论 首个基于bsAb和msAb的药物开发涉及大量投资，用于制造和评估这些新兴分子，以满足现代治疗药物所期望的严格的安全性和有效性标准。治疗性双特异性抗体的开发有着悠久且研究深入的历史，始于20世纪60年代双特异性F(ab)2分子的形成，并于2018年首个双特异性药物blindumomab获得FDA批准。随后，用于生成这些复杂分子的蛋白工程方法以及高效评估其功能和开发性属性所需的技术和知识都有了显著改进。这些努力的结果是，过去几年有数百个bsAb/msAb分子进入临床研究，为临床上评估这些令人兴奋的分子提供了独特的治疗潜力。同时在体内对多个靶标采取行动的能力为药物开发提供了组合机会，并有望改变许多疾病的治疗格局。因此，用于工程化和评估这些独特分子的方法必须继续发展，以满足这一机会并为患者提供价值。 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