BRD4 x PI3K family

今天和大家分享一篇关于分子胶（MGs）的最新综述文章，该文由Markella Konstantinidou等人撰写，2024年4月发表在《Cell Chemical Biology》。该文讨论了近十年（2014-2023）间，小分子调节蛋白质与蛋白质之间的相互作用（PPI）在药物发现中的进展。重点是分子胶（MGs）--通过稳定原生相互作用或诱导新变态相互作用，而诱导接近的单价小分子。作者的研究既包括偶然发现，也包括理性发现，并介绍了识别这些发现所采用的不同方法。描述了各种具有结构数据的示例，强调了分子识别和结合的要素，这些要素是 MG 作用机制的基础。分子胶分类将这些分子胶化合物分为三大类降解性MGs非降解性MGs 或 PPI 稳定剂诱导自结合的 MGs1. 引言分子胶（MGs）是指一种能在蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）界面上协同结合的一价小分子。通常情况下，MGs对蛋白质配体的亲和力较低，结合后能增强或加强界面上的相互作用。MGs既可以结合原生PPIs，也可以结合非原生或新型PPIs。分子胶降解剂（MGDs）是MGs的一种，结合E3泛素连接酶（E3连接酶）。E3连接酶将泛素转移至底物蛋白质上，通常将该蛋白质标记为通过蛋白酶体降解。MGDs导致所感兴趣的原生或非原生蛋白质被E3泛素化，进而导致蛋白质通过蛋白酶体降解。活动时间：2024年5月20日——2024年5月26日2. 降解性MGs天然MGBs目前已发现几类天然产品可作为分子胶降解剂（MGDs）。这些早期实例表明，小分子具有诱导接近 E3 泛素连接酶并降解结合的能力。2001 年，Gray 等人发现植物激素 auxin 能促进转录抑制因子 AUX/IAA 的降解。2007 年，Tan 等人为植物生长素的作用机制提供了结构基础。晶体结构显示，AUX/IAA 和 TIR1（E3 连接酶复合物 SCFTIR1 的一部分）之间形成的微弱相互作用，通过与 AUX/IAA 结合位点下方的 TIR1 的β螺旋桨结构域结合而得到增强。2010 年，Sheard 等人发现植物激素茉莉酸甲酯也通过类似机制发挥作用，通过招募 E3 连接酶 SCFCOI1 来降解转录抑制因子 JAZ。2020 年，链霉菌衍生的甘露霉素多酮可作为共价 MGD 起作用，靶向推定 E3 连接酶 UBR7 的 Cys374，促进与新底物肿瘤抑制因子 TP53 的相互作用。合成MGBsCRL4-CRBN 2010年的研究首次描述了合成分子胶降解剂（MGDs）的作用机制，发现了CUL4-RBX1-DDB1-CRBN（CRL4CRBN）E3泛素连接酶的靶点。尽管沙利度胺及其衍生物（泊马度胺、来那度胺，IMiD、CELMoD）具有致畸作用，但它们被用于治疗多发性骨髓瘤等疾病。这些化合物可抑制内源性CRL4CRBN底物的泛素化，同时对连接酶进行重编程以靶向新蛋白质进行降解。IMiDs具有不同的降解特性，并能招募不同的新底物导致降解，如酪蛋白激酶1A1和翻译终止因子GSPT1。新型CRBN调节剂的合理优化导致了新一代IMiDs/CELMoDs的诞生，IMiD/CELMoD化合物通过调节CRBN的构象来影响其功能，具有更高的降解效力和选择性，这为进一步合理设计具有改进新底物选择性和有效性的MGD提供了新的思路。RBM39（招募 CRL4-DCAF15）在IMiDs/CELMoDs之后，第二种被发现的可将新底物招募到E3连接酶的MG类别是剪接抑制剂磺胺类化合物（SPLAMS: indisulam、tasisulam、E7820 [NSC 719239] 和氯喹喹啉磺胺 [CQS 或 NSC 339004]）（图1B）。2017年报道了SPLAMS促进RNA结合结构蛋白39（RBM39）被E3泛素连接酶CUL4-RBX1-DDB1-DCAF15（CRL4DCAF15）招募，从而导致RBM39的多泛素化和蛋白酶体降解。对于DCAF15-DDB1-DDA1复合物，在RBM39存在的情况下，结合亲和力增强了100多倍。芳基磺胺类化合物具有协同结合的作用，促进了DCAF15与RBM39的RNA识别结构域的结合，并通过在DCAF15表面的一个浅的、非保守性的空腔上的功能化形成了稳定的三元复合物（图1B）。2020年报道了一个新型磺胺化合物，dCeMM1，可重新调节CRL4DCAF15连接酶，选择性地降解了RBM39，保留了RBM23。cyclin KCR8 通过诱导 CDK12/cyclin K 和 DDB1 之间形成复合物来充当 MGD。CR8 将DDB1+CDK12相互作用增强了 500 至 1,000 倍 。CR8 结构上占据了 CDK12 的 ATP 结合位点，桥接了 CDK12-DDB1 界面并与 DDB1 的一个 β 螺旋桨结构域形成离散接触（图 2A）。CR8的关键结构特征是疏水性苯基吡啶环体系，溶剂暴露在激酶表面，通过与Arg928（DDB1）相互作用诱导与连接酶衔接子DDB1形成络合物。细胞周期蛋白 K 结合在 CDK12 的另一面，不直接与 DDB1 相互作用。因此CR8是一种选择性的cyclin K降解剂。dCeMM1和HQ461这两种化合物，也能够诱导CDK12/cyclin K与DDB1形成复合物，从而降解cyclin K。这些研究揭示了降解剂的结构多样性，但它们的作用机制相似，都是通过促使特定蛋白质与泛素连接酶形成复合物，从而导致蛋白质的降解。β-catenin降解剂2019 年，Simonetta 等人描述了可恢复致癌转录因子 β-catenin 与其同源 E3 连接酶 SCFβ-TrCP 之间原生 PPI 的 MGs 的鉴定和合理设计 。通过荧光偏振结合测定，筛选出了一系列化合物，其中包括NRX-1532，能够选择性地恢复突变型β-catenin的降解，而不影响正常组织中的野生型β-catenin的功能。3. 非降解型 MGs/PPI 稳定剂天然产品天然产物，如雷帕霉素、FK506和环孢霉素A，能够稳定蛋白质相互作用，但不引起任一蛋白质的降解。这些天然产物与蛋白质伙伴形成三元复合物，抑制了特定的生物过程，如免疫反应。它们的作用机制是通过与两个蛋白质形成广泛的相互作用，并在相互作用表面积中贡献了25%–50%。合成 PPI 稳定剂14-3-3富诺卡定-A（FC-A）和cotylenin-A稳定蛋白14-3-3与其客体之间的天然PPI。14-3-3蛋白拥有一个非常广泛的相互作用网络，包括肿瘤促进因子、肿瘤抑制因子和转录因子。MGs通过调节14-3-3与其客体的结合来影响多种生物学效应，如转录因子的细胞核与细胞质之间的穿梭、MAP激酶信号通路的调节等。通过稳定14-3-3与其客体之间的天然相互作用，这些MGs为开发治疗乳腺癌等疾病的新策略提供了潜在途径。尽管天然产物稳定剂的复杂性限制了它们的临床应用，但通过不同的方法，如虚拟筛选、高通量筛选和基于片段的方法，已经开始寻找更具选择性和更有效的14-3-3稳定剂。曲美替尼：MEK/KSR PPI稳定剂Trametinib是一种FDA批准的MEK抑制剂，它被发现可以作为MG稳定MEK与其调节蛋白KSR之间的PPI。据报道，MEK 抑制剂曲美替尼与原生 PPI 发生了意想不到的 MG 型相互作用。2020 年，Khan 等人解析了 MEK 在 MEK 抑制剂作用下与伪激酶 KSR（RAS 激酶抑制剂）结合的晶体结构。LSN3160440：GLP-1R/GLP-1 PPI 的稳定剂2020 年，Bueno 等人报道了 LSN3160440 的发现，这是一种 MG，通过与受体（GLP-1R）和正表配体 [GLP-1-(9-36)] 84 结合，稳定 G 蛋白偶联受体的活性状态构象。GLP-1-(9-36) 是原生配体 GLP-1(7-36)的代谢产物，虽然功能上无活性，但与 GLP-1R 的亲和力较弱。使用冷冻电镜测定了与 LSN3160440 结合的 GLP-1R 与全长 GLP-1、异三聚体 Gs 和抗体 Nb35 的复合物（图 3D）。LSN3160440 是 PPI 稳定剂影响细胞表面信号转导的首个实例。4.诱导自结合的 MGs与天然 PPI 稳定剂相比，有许多诱导自缔合的化合物的例子，包括靶蛋白的同源或异源二聚化、寡聚化或聚合。转甲状腺素蛋白淀粉样蛋白形成的限速步骤是四聚体解离为单体；通过使用afamidis动态稳定四聚体，成功减缓了解离速率，可有效抑制了淀粉样蛋白的聚集，治疗转甲状腺素家族性淀粉样多发性神经病患者BCL6 降解剂化合物（BI-3802）可迅速诱导了BCL6的泛素化和降解，导致对BCL6抑制的基因表达的增强，以及显著的抗增殖效果（图4A）。BI-3802的冷冻电镜结构揭示了该化合物在BCL6-BTB结构域中引发了BCL6的高级别装配成丝状结构。这种装配导致了BCL6的增强泛素化，并在结构上显示了与BTB结构域同源二聚体的直接相互作用。此外，报道了一系列苯并咪唑酮类BCL6与其共抑制剂之间的PPI抑制剂，其中CCT369260作为一种降解剂在淋巴瘤模型中显示出生物活性。PD-L1BMS-8和BMS-202等化合物最初被设计为PD-1/PD-L1蛋白质相互作用抑制剂。它们实际上通过诱导PD-L1形成三聚体复合物来发挥作用。这些化合物通过与PD-L1的相互作用，阻断了PD-L1的糖基化，并导致PD-L1在内质网中的快速降解，从而减少了其在细胞表面的表达。相比之下，另一种化合物17则通过诱导PD-L1的内吞和溶酶体依赖性降解来减少PD-L1在细胞表面的表达。JH-RE-06 二聚化 REV1    JH-RE-06化合物通过诱导REV1的二聚体化，从而破坏REV1-REV7蛋白质间的相互作用，专注于通过靶向REV1 C端域（CTD）和POL ζ的REV7亚基上的一个浅口袋来抑制REV1-POL ζ相互作用。JH-RE-06成功抑制了REV1-REV7相互作用，通过诱导REV1 CTD的二聚体化，阻止了其与REV7和POL ζ的结合。该化合物使肿瘤对顺铂更敏感，并在体外减少了突变。这一研究揭示了小分子可以靶向动态蛋白质界面，并成功干预其功能。NVS-STG2寡聚化STING2023年，Li等人报道了一种名为NVS-STG2的MG样化合物，通过诱导STING（干扰素基因激活剂）的高阶寡聚化来激活人类STING。该研究通过对THP1-dual细胞进行表型筛选，发现NVS-STG2能够诱导STING的高阶寡聚化。NVS-STG2与cGAMP和C53（一种能够结合到STING TMD口袋的化合物）一起使用时，能够增强STING的激活，并形成更大的寡聚体。这项研究揭示了NVS-STG2作为MG的作用机制，为开发STING激活剂提供了重要基础。MERS-CoV 异常二聚化MERS-CoV核衣壳蛋白（N-NTD）的N端结构域的结晶具有一个异常的二聚体界面，在蛋白质表达过程中存在的两个非内源性 N 端载体融合残基（His37 和 Met38）促进了二聚化。残基Trp43对于疏水口袋的形成至关重要，介导了二聚化。针对残基Trp43进行了基于结构的虚拟筛选。发现5-苯氧基胍胺（P3）通过荧光热稳定性实验能够稳定野生型MERS-CoV N-NTD。ISRIB 作为 "molecular staple "稳定了 eIF2B 全酶的活性十聚体形式在真核细胞中，整合性应激反应（ISR）是一种感知和应对各种压力的机制，通过重新编程翻译和控制蛋白质稳态来提供细胞的保护和适应。ISR的调节依赖于eIF2的磷酸化，其通过抑制eIF2B的活性来抑制翻译起始。而ISRIB则被发现可以通过激活eIF2B来抵消eIF2的抑制作用，从而促进全局蛋白质合成。ISRIB的作用靶点是eIF2B，它通过在eIF2B十聚体的中心对称界面处结合，稳定了eIF2B的活性形式。这一发现为ISRIB的作用机制提供了分子层面的解释，显示了其作为一种“分子钉”的作用方式。5. MGsBRD4 抑制剂和 MGsMGDs 是目前在临床试验中进行评估的主要类型。这主要包括靶向 CRBN 的 MGD 和靶向 DCAF15 的 E7820。MGD 可以稳定 "原生 PPI "和 "新变态 PPI "之间的连续体。与典型的 PROTAC 作用机制不同，IBG1 通过分子内结合 BRD4 上的两个相邻结构域（BD1 和 BD2）并诱导构象变化来降解 BRD4，该构象变化被 E3 连接酶 DCAF16 而非 DCAF15 识别。现有多家生物技术公司都在积极探索靶向降解的新机制和新策略，而且已经有这方面的实例发表。例如，最近有报道称 PI3K 抑制剂 inavolisib/GDC-0077 可作为突变 PI3Kα 的降解剂。从著名的 BET 抑制剂 JQ1（图 6A）的结构出发，最近有人描述了开发 BRD4 降解剂的方法。据报道，化合物 MMH2 与 DCAF16 和 BRD4BD2 的三元复合物的冷冻电镜结果支持了 DCAF16 和 BRD4 之间预先存在结构互补性的概念（图 6B）。IBG1 结合在 DCAF16/BD1/BD2 的界面上，其 JQ1 部分位于 BD2 袋中，E7820 部分位于 BD1 袋中（图 6C）。总结虽然作者在这篇综述中主要关注的是单价 MGs，但其最新研究描述了一种介于单价胶和二价降解剂之间灰色地带的 "新模式"。对于所有类型的 MGs，作者预计化学生物学方法将进一步阐明 E3 连接酶的分子识别、形状互补性、合作性、潜在动力学和脱粒等方面的问题。最终，预计人们将能够根据蛋白质+分子胶的复合表面来预测所形成的三元复合物。期望在未来10年内看到分子胶（MGs）领域取得显著进展。声明：发表/转载本文仅仅是出于传播信息的需要，并不意味着代表本公众号观点或证实其内容的真实性。据此内容作出的任何判断，后果自负。若有侵权，告知必删！长按关注本公众号   粉丝群/投稿/授权/广告等请联系公众号助手 觉得本文好看，请点这里↓

近年来，蛋白水解靶向嵌合体（PROTAC）技术已成为一种新型治疗范例。PROTAC 是异双功能分子，通过劫持泛素-蛋白酶体系统来降解靶蛋白。目前，大约 20-25% 的蛋白质靶点正在研究中，大多数工作都集中在它们的酶功能上。与小分子不同，PROTAC 通过与靶蛋白结合并诱导随后的蛋白酶体降解来抑制靶蛋白的整个生物学功能。PROTAC 弥补了传统小分子抑制剂难以处理转录因子、核蛋白和其他支架蛋白的局限性。目前，PROTACs已成功降解多种蛋白，如BTK、BRD4、AR、ER、STAT3、IRAK4、tau等。然而，哪些靶点适合PROTAC技术以实现比小分子抑制剂更好的效益尚不完全清楚。如何合理设计高效的PROTACs并优化其口服有效，给研究人员带来了巨大的挑战。在这篇综述中，我们总结了PROTAC技术的特点，详细分析了设计高效PROTAC的一般原理，并讨论了针对不同蛋白质类别的PROTAC的典型应用。此外，评估了PROTAC可能面临的挑战和局限性。1. 背景介绍Sakamoto 等人2001年首先报道了蛋白水解靶向嵌合体 (PROTAC)。PROTAC 是异双功能分子，包含三个组件：目的蛋白 (POI) 结合部分、接头和 E3 泛素连接酶结合部分（图 1a) 。PROTAC分子可以与E3连接酶和靶蛋白结合形成POI-PROTAC-E3连接酶三元复合物。劫持泛素蛋白酶系统（UPS）随后导致目标蛋白被多泛素化，然后蛋白质被蛋白酶体降解。PROTAC 同时招募 E3 连接酶和 POI，使 POI 和 E3 连接酶在空间上接近。PROTAC 模拟 E3 连接酶对底物的特异性识别并劫持细胞内蛋白质破坏机制以从细胞中去除 POIs。图 1. a.基于UPS的PROTAC机制。UPS 由用泛素修饰蛋白质的特定酶（E1、E2 和 E3）和降解泛素标签蛋白的蛋白酶体组成。PROTAC 包含 POI 配体、E3 配体和接头。E3-PROTAC-POI 三元复合物诱导 POI 的多泛素化和蛋白酶体介导的降解。b. PROTAC 技术发展的里程碑现代药物发现的重点是寻找与目标蛋白具有高结合亲和力的小分子，这些小分子通过占据酶活性位点来调节蛋白功能。然而，一些蛋白质缺乏可结合位点或酶活性位点，如转录因子、RAS家族蛋白、支架蛋白和调节蛋白，使得它们对传统小分子药物不敏感。随着 PROTAC 的出现，无需考虑活性位点的存在即可降解“不可成药的蛋白质”。PROTAC 具有独特的优势，拓宽了未来药物发现的视野。一系列用于降解雄激素受体（AR）和雌激素受体（ER）的PROTACs药物已进入临床试验。到目前为止，PROTAC 已被证明可以有效降解多种蛋白质，例如代表性的 AR、ER 核受体、各种激酶、转录因子和异常蛋白质聚集体。2001年，报道了第一个PROTAC，它由招募蛋氨酸氨基肽酶2（MetAP-2）的血管生成抑制剂卵酸素和招募E3泛素连接酶β-TRCP的IкBα磷酸肽组成。F-box 蛋白 β-转导蛋白重复序列蛋白 (β-TRCP) 已被证明可与 IкBα（NF-кB 的负调节因子）结合(即连接的双功能肽段)。研究表明，该PROTAC可以在体外有效降低MetAP-2水平。在细胞外研究显示出希望后，这项开创性的工作得以持续下去。2003年，PROTAC被应用于靶向降解ER和AR受体。IкBα 磷酸肽分别与雌二醇和二氢睾酮 (DHT) 连接，使得 PROTAC 能够有效降解 Erα 和 AR。2004年，含有E3连接酶结合肽ALAPYIP来招募von Hippel-Lindau (VHL)，它可以诱导AR和FK506结合蛋白12 (FKBP12)的降解。虽然基于肽的PROTAC具有生物相容性高、体内毒性低的优点，但不能忽视大分子量带来的有限的细胞通透性和合成问题。随着E3连接酶小分子配体的发展，如MDM2、cIAP、VHL、Cereblon（CRBN）、DCAF11、DCAF15 、DCAF16、KEAP1和 RNF114，PROTAC 快速进入小分子化。CRBN E3复合物的研究在2010年取得了重大突破。CRBN是CUL4-RBX1-DDB1-CRBN（CRL4 CRBN）E3泛素连接酶的底物受体亚基，已被确定为沙利度胺免疫调节药物的直接靶点（ IMiD）。这些IMiD结合CRBN连接酶，为具有锌指结构域的多个转录因子（例如IKZF1和IKZF3）提供结合位点，形成其抗癌作用的基础。在过去的几年中，沙利度胺及其衍生物因其有效的POI降解和良好的成药性而成功应用于PROTAC中，用于多种蛋白质类别的靶向降解。ARV-825（图 2a) 是第一个结合泊马度胺和含溴结构域蛋白 4 (BRD4) 抑制剂 OTX015 的 PROTAC（图 2b）。该PROTAC可以有效降解伯基特淋巴瘤(BL)细胞中的BRD4蛋白。图2. 针对不同蛋白质的代表性 PROTAC2012年，Crews和Ciulli团队鉴定了第一个具有微摩尔解离常数的VHL小分子配体。为了提高第一代VHL配体的亲和力和亲脂性，Galdeano等人发现了VHL 的第二代配体，VH032 被确定为具有纳摩尔亲和力。新型 VHL E3 配体的鉴定标志着 PORTAC 技术的一个里程碑（图 1b)。这些新发现的VHL 配体为设计 VHL 招募 PROTAC 开辟了新的机会。VH032与VHL的晶体结构，为构建第一个VHL招募PROTAC MZ1提供了结构细节（图 2b)。化合物 MZ1 能够有效且选择性地去除 BRD4。后来揭示了BRD4-MZ1-VHL复合物的晶体结构，揭示了MZ1被“夹在”BRD4和E3连接酶之间，并且BRD4-VHL的新接触是由MZ1诱导的协同识别产生的，发现PROTAC诱导的静电表面靶蛋白和 E3 连接酶之间的相互作用对于稳定三元复合物非常重要。上述突破性研究为后来基于VHL的PROTAC研究奠定了基础。迄今为止，基于VHL的PROTAC已成功应用于各种疾病相关蛋白的降解，例如BCR-ABL、ALK和FAK。越来越多的靶点被确认为“PROTACable”基因组，部分PROTAC分子已取得临床效益。例如，已进入临床试验的PROTAC靶点包括AR、ER、IRAK4、STAT3、BTK、BRD9、BCR-Xl等。至少有20个PROTAC进入临床试验。其中，来自Arvinas的ARV-110和ARV-471是临床研究最先进的PROTAC药物。Arvinas、C4 Therapeutics、Kymera Therapeutics 和 Captor Therapeutics 是 PROTAC 领域的先锋制药公司，推动了 PROTAC 的临床转化。Arvinas 致力于将其代表性的 ARV-110 和 ARV-471 推向市场。ARV-110和ARV-471的早期临床数据显示出理想的安全性、有效暴露和对患者有意义的临床疗效，证明了该方法的治疗可行性。研究数据表明，ARV-110 作为口服生物可利用的降解剂是安全的。I 期试验表明，在具有特定基因突变的人群中，ARV-110 将 40% 的 mCRPC 患者的前列腺特异性抗原 (PSA) 水平降低了 50% 以上。此外，在最初的临床研究中，一名患者的活检数据显示AR下降了70%~90%。一项针对平均接受5次连续治疗的ER+和HER2-乳腺癌患者的I期临床研究表明，ARV-471可以显着降低患者肿瘤组织中ER的表达水平，平均降低ER水平62% ，最多可达90%。此外，ARV-471的I期临床数据还显示，在30-700 mg的所有剂量水平下均观察到高水平的ER降解（89%），且耐受性良好。最先进的PROTAC药物ARV-110和ARV-471的临床试验结果被认为是PROTAC领域发展的风向标。作为一种新的药物范式，PROTAC药物的临床转化仍存在相当大的疑问。PROTAC如何在不满足Lipinski五法则的情况下保证治疗效果，以及如何研究、阐明和减少PROTAC药物异双功能分子形式可能引起的复杂脱靶效应和副作用，是临床试验中不可避免的挑战。作为首批进入III期临床试验的PROTAC药物，ARV-471在早期试验中就表现出了强劲的临床表现。如果后续临床试验结果能够达到预期目标，PROTAC可能会在不久的将来进入临床使用，这将为靶向蛋白降解药物的研发带来历史性突破。在这篇综述中，列出了过去 5 年来 PROTAC 首次应用的靶标。同时简要回顾一下 PROTAC 技术与其他技术相比的优势。然后，作者概述了 PROTAC 在靶向多种相关蛋白（尤其是临床试验中的分子）方面的最新进展。还讨论并推荐了设计新 PROTAC 分子的基本考虑因素。试图为相关领域的人们设计有效的PROTAC提供有价值的参考。2.PROTAC 的优点多样化的新型治疗策略（例如小分子抑制剂、单克隆抗体和RNA干扰（RNAi））已成为药物发现的既定范例。小分子抑制剂的活性通常取决于占据靶标的活性口袋，与内源配体竞争以抑制靶蛋白或酶的功能。小分子抑制剂的长期临床应用面临耐药性和脱靶效应的挑战。单克隆抗体药物通过阻断细胞外蛋白质-蛋白质或蛋白质-配体相互作用来调节细胞反应。单克隆抗体药物的主要优点在于其与靶蛋白的高亲和力，但其不足之处在于细胞渗透性差、口服不可用以及成本高。RNA 干扰用于通过敲低 mRNA 来诱导基因沉默，因为 RNAi 的催化性质能够降解多个 mRNA 转录本。然而，脱靶效应、口服生物利用度差和组织渗透性不理想使得药物递送研究具有挑战性。作为一种有前途的治疗范例，PROTACs 比小分子抑制剂、单克隆抗体和其他治疗策略具有独特的优势（表 3）。当目标蛋白被蛋白酶体降解时，PROTACs可以从复合物中解离出来，并继续发挥降解作用（称为“事件驱动”机制），从而使低暴露量发挥功效。此外，PROTAC 完全废除了靶标的功能，甚至 POI/E3 亲和力较低的配体也可用于靶标降解。在本节中，我们将简要比较 PROTAC 与其他治疗策略。表3 PROTAC 与其他治疗策略的比较2.1 降解“不可成药”的蛋白质尽管FDA已经批准了近400种针对人类蛋白质的药物，但与疾病相关的蛋白质约有3000种，远远超出了我们的处理能力。然而，它们中的大多数没有合适的治疗药物，因为缺乏所谓的可成药深沟和活性口袋来占据小分子，例如支架蛋白、转录因子和RAt肉瘤（RAS）蛋白，长期以来被认为是“不可成药”的蛋白质。因此，小分子很难调控这些不可成药的蛋白质，只能依靠持续占据靶蛋白的结合口袋来发挥其药理活性（称为“占据驱动”机制）。幸运的是，PROTAC 诱导的蛋白质降解有可能解决这些问题。与传统的小分子抑制剂不同，PROTAC不需要对配体的高亲和力和持久的占据，即使是低亲和力的配体也可以诱导靶蛋白的有效降解。对于这些具有挑战性的不可成药靶点，PROTAC 可以在不存在活性口袋的情况下与靶蛋白结合，从而导致蛋白酶体介导的降解并完全抑制靶蛋白的生物学功能。例如，RAS 蛋白是肺癌、结直肠癌和胰腺癌中最常见突变的癌蛋白。RAS 蛋白包含三种亚型：KRAS、NRAS 和 HRAS。其中，KRAS突变是癌症的致命驱动因素。由于之前缺乏明确的结合袋，KRAS 多年来一直被视为不可成药的蛋白质。然而，FDA 快速跟踪了两种共价抑制剂的指定，即 AMGEN 的 sotorasib (AMG 510) 和 Mirati Therapeutics 的 adagrasib (MRTX849)（图 2c)，两者均在临床试验中证明了对 KRASG12C 的有效抑制作用。不幸的是，长期和长时间的使用不可避免地导致亲和力严重下降和获得性耐药性。2020 年，通过将 MRTX849 与 VHL 配体连接，设计并合成了一系列 KRAS G12C PROTAC。经过降解活性筛选后，他们确定了一种最有效的 PROTAC，它可以快速诱导 KRAS G12C蛋白的降解（DC 50  = 0.59 μM，NCI-H2030 细胞），并且在其他细胞中也表现出降解活性。2.2 提高选择性和特异性药物化学研究人员的主要目标是发现具有高选择性的分子，以最大限度地减少脱靶效应带来的副作用和毒性。然而，由于同一家族的蛋白质之间的差异有限，因此很难实现。相同家族蛋白质之间氨基酸残基的细微差异不足以为小分子抑制剂提供足够的分辨率。PROTAC独特的机制赋予其双选择性底物识别的特性。也就是说，除了目标蛋白配体的底物选择性外，降解前形成稳定的POI-PROTAC-E3三元复合物还需要E3连接酶和目标蛋白之间适当的蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）。因此，E3连接酶从整个蛋白质水平选择性识别靶蛋白提高了PROTAC的选择性和特异性。激酶亚型选择性的一个典型例子是针对血清和糖皮质激素诱导的蛋白激酶 (SGK)，SGK 家族包含三种亚型：SGK-1、SGK-2 和 SGK-3。据报道，突变的PI3K可以通过SGK3依赖性机制诱导肿瘤发生。一些证据表明，各种 ATP 竞争性抑制剂对所有 SGK 异构体缺乏选择性，因为它们对不同异构体具有相似的亲和力 。然而，同一家族成员的相似催化结构域阻止了研究人员开发异构体特异性抑制剂。为了解决这个问题，高度特异性的SGK3-PROTAC1（图 2d) 已开发出来。这种PROTAC是基于非SGK3选择性抑制剂308-R设计的，用于特异性降解SGK3。在低微摩尔浓度的 SGK3-PROTAC1 下，可以显着降低细胞内 SGK3 水平，而不影响 SGK1 和 SGK2。可以推测，SGK3-PROTAC1的选择性和特异性源自SGK3-PROTAC1诱导三元复合物形成过程中VHL对SGK3的选择性识别。2.3 作用机制 (MOA)传统的小分子抑制剂以剂量依赖性方式发挥作用，通过最大化药物受体占据来达到临床效果。药物浓度过高会导致不良副作用和脱靶效应。PROTACs可以启动催化靶蛋白的降解并从蛋白酶体中逃逸。理论上，PROTAC 可以以更低的剂量、更长的给药间隔进行递送，并且比小分子抑制剂具有更低的毒性，因为它们的低浓度足以降解蛋白质并且不受平衡占用的限制。由于其催化性质，低剂量的 PROTAC 可能会降低发生脱靶效应的可能性。2.4 消除药物靶点的积累小分子抑制剂与靶蛋白的结合即使在相对较短的时间内也可以增加蛋白质的积累。可以归因于两个原因：1）药物与靶蛋白结合可以稳定蛋白质结构，从而延长其半衰期；2)长期抑制会导致其代偿性表达上调。一般来说，靶蛋白的积累可能不利于药物的功效。因此，对于这些对抑制剂不敏感的蛋白质，采取PROTAC介导的蛋白质降解是极其合适的。例如，BRD4，作为重要的溴结构域和末端结构域（BET）家族成员之一。研究人员证明，靶向 BRD4 是抑制 MYC 驱动的癌症的有效手段。然而，小分子 BRD4 抑制剂 JQ1（图  2e) 和 OTX015 导致大量蛋白质积累，需要高浓度的抑制剂来抑制下游 c-MYC。2015 年，Lu 等人通过劫持 CRBN E3 连接酶设计了一种有效的 BRD4 PROTAC (ARV-825)，它诱导所有 BL 细胞系中 BRD4 蛋白快速持续的降解。这凸显了 PROTAC 相对于小分子抑制剂的优势。2.5 其他的优势除了上述几点之外，PROTAC 还具有其他优点。获得性耐药的发生往往与点突变密切相关，点突变会降低抑制剂与靶蛋白的亲和力。PROTAC 能够通过完全消除靶标机制来克服耐药性问题。此外，PROTAC的事件驱动模型不需要高药物暴露来降低脱靶效应的风险。与其他 DNA 水平蛋白质敲除技术不同，PROTAC 能够在翻译后水平在体内快速降解目标蛋白质。在靶向蛋白降解（TPD）领域，除了基于UPS的PROTAC之外，靶向溶酶体的嵌合体（LYTAC）、靶向自噬的嵌合体（AUTAC）和基于抗体的PROTAC（AbTAC）通过溶酶体降解靶蛋白。PROTAC 不能降解细胞外蛋白和膜蛋白。因此，溶酶体诱导的蛋白质降解可以弥补 PROTAC 的缺乏。LYTACs首先由Banik等人提出，并由结合溶酶体靶向受体（LTR）的配体和结合细胞外或膜蛋白的配体组成。目前，只有聚丝氨酸-O-甘露糖-6-膦酸酯（M6Pn）和N-乙酰半乳糖胺（Tri-GalNAC）是可用的LTR配体。LYTAC 已被用于成功降解载脂蛋白 E4、表皮生长因子受体 (EGFR)、程序性死亡蛋白配体 1 (PD-L1) 和 CD71 。但由于其分子量大、细胞通透性差、体内可能出现免疫反应，还需要进一步研究。2019 年，高桥等人开发了基于自噬过程的 AUTAC，用于内源性蛋白质的降解。AUTAC 是一种双功能分子，具有连接 POI 配体和自噬招募标签。然而，由于缺乏有效的自噬途径招募配体，目前发表的 AUTAC 效率低下。自噬过程极其复杂，可能对自然自噬产生影响，AUTACs的作用机制尚不清楚，因此需要深入研究。AbTAC 利用双特异性抗体，其中一只臂针对 POI，另一只臂针对 RNF43 E3 连接酶。AbTACs 可以诱导 POIs 内化和随后的溶酶体降解，但确切的降解机制仍有待证实。3. PROTAC靶向多种蛋白质的典型应用理论上，如果有合适的小分子与那些 POI 特异性结合，PROTAC 可以降解几乎所有的细胞内蛋白质，但并非所有降解剂都优于小分子抑制剂。在这里，我们总结了一些具有明显抑制活性的典型PROTAC分子，其中一些已经进入临床试验阶段。3.1 用于靶向蛋白激酶的 PROTAC人类基因组编码超过 500 种蛋白激酶，使其成为最大的蛋白质家族。目前，传统的小分子抑制剂是蛋白激酶相关疾病的主要治疗选择。大多数激酶抑制剂集中于抑制受体酪氨酸激酶（RTK）。然而，耐药性的出现损害了临床获益，因此迫切需要应用新的治疗策略来克服这一挑战。2013年，Crews团队报道了最早的激酶PROTAC，用于靶向PI3K，阻断人表皮生长因子受体3（ErbB3）–PI3K-Akt（蛋白激酶B）信号通路。该 PROTAC 由两个招募 POI 和 E3 连接酶的异特异性肽序列组成。ErbB3 衍生序列，磷酸化后可与 PI3K 结合。另一个源自HIF1α 的序列可以通过 VHL 进行鉴定。两个部分通过 PEG 连接体结合，并掺入细胞穿透序列以改善细胞通透性。然而，由于渗透性差和连接体不稳定，该 PROTAC 仅显示出中等效力。FAK 是一种酪氨酸激酶，调节肿瘤进展的许多方面（例如侵袭、转移和血管生成）。FAK 激酶抑制剂 defactinib 在治疗恶性胸膜间皮瘤干癌的临床试验中因缺乏疗效而失败。FAK 还具有除激酶以外的支架作用，但激酶抑制剂不能抑制激酶独立的功能。因此，设计了PROTAC-3（图 2f) 可有效诱导 FAK 降解，IC 50为 6.5 nM 。PROTAC-3是一种由defactinib和VHL配体组成的双功能分子。它通过有效诱导降解，有效抑制 FAK 激酶依赖性信号传导和激酶依赖性信号传导。布鲁顿酪氨酸激酶 (BTK) 是 TEC 家族非受体胞质酪氨酸激酶的成员，也是 B 细胞受体 (BCR) 信号通路的关键调节因子，在 B 细胞的生命活动中发挥着关键作用，例如增殖、存活和分化。BTK在B细胞肿瘤中广泛表达，临床干预一般通过抑制BTK的激酶活性来进行。2013年，FDA批准了首创的共价抑制剂伊布替尼用于治疗多种B细胞恶性肿瘤。Ibrutinib 与 BTK 的半胱氨酸 481 (C481) 共价结合，IC 50为 0.5 nM 。然而，已经发现 BTK (C481S) 481 位的半胱氨酸到丝氨酸突变是导致伊布替尼获得性耐药的原因。因此，使用 PROTAC 技术诱导 BTK 蛋白降解已成为一种有前途的替代方法。迄今为止，四种 BTK 降解剂已进入临床试验。它们分别是来自Nurix Therapeutics的NX-2127（NCT04830137）和NX-5948（NCT05131022 ），来自海思科和百济神州的HSK-29116（ NCT04861779）和BGB-16673（NCT05006716）。NX-2127具有BTK降解剂和IMiD新底物降解剂活性。目前正在进行 NX-2127 治疗复发或难治性 B 细胞恶性肿瘤的临床试验。临床前数据表明，NX-2127 可有效诱导多种癌细胞系和人外周血单核细胞 (PBMC) 中ibrutinib敏感的 BTK WT（野生型）和ibrutinib耐药的 BTK C481S降解，DC 50  < 5nM。此外，NX-2127比ibrutinib更有效地抑制 TMD8 细胞中BTK C481S的细胞增殖。NX-2127 由沙利度胺 IMiD 组成，具有免疫调节活性。揭示来那度胺导致 CRBN 新底物 Aiolos (IKZF3) 和 Ikaros (IKZF1) 选择性泛素化和降解。已表明 IKZF3 的过度表达是慢性淋巴细胞白血病 (CLL) 中 BTK 抑制剂耐药性的驱动因素。因此，NX-2127将BTK降解与IKZF降解相结合有望增强其抗肿瘤活性。NX-5948 是 Nurix Therapeutics 设计的另一种 BTK 降解剂。与 NX-2127 不同，NX-5948 缺乏免疫调节活性，并且在动物模型中具有穿过血脑屏障 (BBB) 的能力。NX-5948 显示出与临床前数据相似的性能，临床前数据表明 NX-5948 在淋巴瘤细胞系和 PBMC 中诱导 BTK 降解（< 1 nM 时降解效率为 50%）。3.2 用于靶向核受体的 PROTAC核受体（NR）属于转录因子家族。与其他传统转录因子不同，其主要功能是将外部信号转换为转录输出。典型的 NR 包括三个结构域：两个分别结合 DNA 和配体的结构域，以及一个在序列和大小方面高度可变的非结构化 N 末端调节结构域。配体激动剂结合会产生构象变化，导致核定位信号 (NLS) 暴露，从而使 NR 易位至细胞核并结合响应元件。与配体结合域结合的小分子抑制剂被设计用来激活或阻断核受体的信号转导功能。然而，小分子抑制剂有几个缺点。例如，目前对抑制剂概念的理解尚不清楚，因为当 AR 基因过度表达或突变时，持续的 AR 拮抗剂被证明是激动剂。此外，孤儿NRs的一些配体尚未确定，从而使得靶向NRs治疗疾病变得更加复杂。PROTAC 技术的出现使得针对更广泛的 NR 成为可能。AR、ER等NRs参与体内各种重要的生理进程，与前列腺癌、乳腺癌密切相关。因此，一系列针对ER或AR的PROTAC被开发出来。AR信号传导对于前列腺正常功能的发育和维持至关重要。AR不仅在维持肌肉骨骼和男性性相关功能中发挥着关键作用，而且在前列腺癌的进展中也发挥着关键作用。使用恩杂鲁胺和阿帕鲁胺等 AR 拮抗剂抑制 AR 功能是治疗前列腺癌的常见策略。不幸的是，接受抗雄激素治疗的患者最终会出现去势抵抗。PROTACs 作为一种替代的潜在治疗方法出现，以弥补 AR 抑制剂的缺点。由此，合成了一种有效的 AR PROTAC ARCC-4（图 2g)，其由恩杂鲁胺衍生物和招募VHL的E3配体组成。与其母体抑制剂恩杂鲁胺相比，ARCC-4可以有效降解AR和长期使用临床抑制剂引起的AR突变体，且不会导致耐药性的存在。众所周知，ARV-110（图 2g)是第一个处于临床试验中的AR靶向PROTAC。最新的临床试验数据表明ARV-110具有可接受的安全性。最大耐受剂量 (MTD) 尚未确定，推荐的 2 期剂量 (RP2D) 的确定仍在继续。此外，ARV-110 已在转移性去势抵抗性前列腺癌 (mCRPC) 患者服用恩杂鲁胺和/或阿比特龙后表现出抗肿瘤活性 。最近，王的团队报道了两种高效且可口服生物利用的 AR PROTAC，ARD-2128 和 ARD-2585（图 2g）。ARD-2128 是一种优化的 AR 拮抗剂，通过刚性接头与沙利度胺连接，在小鼠中实现了 67% 的口服生物利用度和比恩杂鲁胺更好的抗肿瘤活性。ARD-2585 包含与 ARD-2128 相同的 CRBN 配体，在 VCaP 细胞系中达到 ≤ 0.1 nM 的 DC50值，在小鼠中达到 51% 的口服生物利用度。乳腺癌是一种乳腺组织发生癌变的恶性肿瘤，患者通常是女性群体。根据肿瘤受体的状态，乳腺癌可分为三种类型：雌激素受体阳性（ER+）、人表皮生长因子受体2阳性（HER2+）和三阴性亚型（ER-、PR-、HER2） -）。其中，ER+乳腺癌最常被诊断出。ER是核受体家族的成员，ERα和ERβ调节雌激素的基因表达。然而，ERα 已被证实主要负责女性生殖系统和乳腺组织中雌激素信号的转换。大多数选择性雌激素受体降解剂（SERD）旨在靶向 ERα 来治疗 ER + 乳腺癌。SERD 是一类与 ERα 结合并随后被蛋白酶体降解的小分子。氟维司群(Fulvestrant)是唯一被批准并通过每月肌肉注射用于治疗绝经后女性乳腺癌的 SERD。针对氟维司群口服生物利用度差的缺点，一系列SERD分子被开发出来。但SERD分子不能完全降解ER，长期使用会导致耐药性。PROTAC技术提供了另一种治疗选择。Arvinas 开发了一种针对 ER 的 PROTAC，ARV-471（图 2h)，经FDA批准进入临床试验，用于治疗局部晚期或转移性ER阳性/HER2阴性乳腺癌患者。中期试验结果显示，ARV-471可显着降低肿瘤组织中ER的表达水平，平均降低62%，最高可达90%。此外，ARV-471 可以在多种 ER 阳性乳腺癌细胞系中降解野生型和临床相关的 ERα 突变体（Y537S 和 D538G），其DC 50值约为 2 nM。3.3 用于靶向转录因子的 PROTAC转录因子（TF）是一类与DNA特定序列结合以调节基因转录过程的蛋白质。转录因子在增殖、分化和死亡等多种细胞功能中发挥着关键作用。除核受体外，直接靶向转录因子对于小分子抑制剂来说尤其具有挑战性，因此几十年来它们一直被认为是“不可成药的蛋白质” 。因此，诱导蛋白质降解成为转录因子的一种潜在方式。根据DNA结合域的具体结构，转录因子可分为数十个家族。值得注意的是，C2H2锌指、同源域和螺旋-环-螺旋家族占转录因子总数的80%以上。信号转导和转录激活因子 3 (STAT3) 是一种关键的核转录因子，在酪氨酸 705 上被磷酸化，并整合细胞因子和生长因子信号传导以调节一系列细胞过程。STAT家族由7种蛋白组成，其中STAT3已被证明在多种癌症中过度表达，尤其是乳腺癌。靶向 STAT3 是治疗各种癌症、炎症和自身免疫性疾病的普遍策略。STAT3在Tyr705位点的磷酸化可以触发其二聚化，并且与靶基因的转录调控密切相关。STAT3二聚化依赖于两个单体的Src同源2(SH2)结构域之间的相互作用。基于这一机制，研究人员热衷于寻找作用于SH2结构域的小分子抑制剂，以阻断STAT3二聚化和转录活性。然而，由于STAT家族成员之间存在结构同源性，一些作用于STAT3 SH2结构域的抑制剂已表现出有限的临床价值，这为特定STAT3抑制剂的开发带来了障碍。另一个突出的问题是，单个 STAT3 蛋白仍然具有转录活性，因此开发 STAT3 SH2 结构域的抑制剂并不是完全抑制 STAT3 活性的可行方法。PROTAC 作为靶向蛋白降解的新型疗法具有广阔的前景。在这里，我们介绍了一种特定且有效的 STAT3 PROTAC。白等人。报道了第一个STAT3 PROTAC SD-36（图 2i)不仅能有效、特异性地降解STAT3，而且具有抗白血病和淋巴瘤细胞系增殖活性。SD-36 由选择性 STAT3 抑制剂 SI-109 和来那度胺组成，是 PROTAC 如何应用于靶向转录因子等挑战性蛋白质的典型成功范例。4. PROTAC的设计和开发PROTACs的降解活性不仅取决于两端与其各自靶标的亲和力，还依赖于能够形成稳定PPI的三元复合物的形成。目前，PROTAC的构建很大程度上依赖于经验分析(empirical analyses)和构效关系（SAR）研究。然而，合成难度对快速合成大量 PROTAC 化合物库提出了重大限制。通过分析和总结已发表的PROTAC结构，我们将提供PROTAC设计的常规策略，以加速PROTAC的发现。此外，还列出了一些最近报道的 PROTAC，它们招募具有相应降解活性的传统 E3 连接酶（表 4）。表 4. 2019年以来报道的PROTAC代表性化合物4.1 E3连接酶及其配体在已鉴定的 600 多种连接酶中，只有少数具有小分子配体的连接酶已用于 PROTAC 靶向。我们列出了常用的 E3 连接酶及其配体（图 3）。总结分析了近 20 年来发表的高活性 PROTAC 的结构，发现最常用的是 CRBN、VHL 和 cIAP 配体，其中 CRBN 占 60.1%，VHL 占 30.1%，cIAP 占 5.5%。主要原因是CRBN在高丰度的组织中广泛表达，并且基于CRBN的PROTAC具有更好的降解效率。此外，与VHL配体相比，CRBN配体具有更好的类药特性。招募 MDM2 和 cIAP 的 PROTAC 通常具有较高的分子量和较差的组织渗透性，表明口服生物利用度可能是一个潜在的问题。其他一些E3连接酶如DCAF11、DCAF15、DCAF16、KEAP1和RNF114等较少使用，原因如下：它们的配体来源于天然产物， E3连接酶亲和力差，合成困难，且大多数E3连接酶是由不可逆的PROTACs招募的，其降解活性较差，并具有一定的潜在毒性。值得注意的是，不同的招募 E3 连接酶已被证明可诱导不同程度的蛋白质降解。主要原因是：不同细胞中E3连接酶的表达水平不同，可能导致降解效率不同。并且有些蛋白质对于不同的E3连接酶具有不同程度的选择性。因此，在设计PROTAC的过程中，应优先选择针对CRBN或VHL的配体，因为这两种E3连接酶的应用范围最广。作为说明性实例，ARV-110和ARV-471都选择CRBN连接酶作为E3配体。在这里，我们回顾了 PROTAC 设计中使用的传统 E3 连接酶及其配体。图3 用于 PROTAC 的 E3 连接酶的代表性小分子配体。蓝点表示适当的链接子结合位点4.2 PROTAC的链接子设计策略1. 连接子类型Maple 研究组建立了一个包含 400 多个已发表的 PROTAC 的数据库，以找到已应用于 PROTAC 的一般原理。数据库中链接子结构的摘要（表 5）揭示了迄今为止 PROTAC 设计中常用的连接体是 PEG 和不同长度的（不）饱和烷烃链。由于化学合成简便的特点，烷基接头通常用于合成 PROTAC 分子，以确定最佳接头长度。然而，由于 PROTAC 的高疏水性，烷基连接子的引入可能会降低 PROTAC 的细胞渗透性。含有杂原子（氧原子或氮原子）的烷基链比单独的烷基链具有改善的亲水性。此外，掺入PEG链可以增强PROTAC的溶解度和细胞对PROTAC的吸收。超过一半已发表的 PROTAC 结构包含烷基和 PEG 基序。PROTAC 中加入了烷基、PEG 和乙二醇链以提高灵活性。然而，它们的引入会影响 PROTAC 的药代动力学 (PK) 特性。近年来，线性连接基逐渐被刚性连接基取代，例如炔烃和饱和杂环（哌嗪和哌啶）。芳环或炔链的引入赋予了一定的刚性并促进稳定的三元络合物的形成。它还促进 PROTAC 的溶解度和细胞渗透性。因此，使其具有口服生物利用度和临床效果，例如 ARV-110、ARV-471 和 BTK PROTAC。点击化学通常用于体内构建PROTAC分子，因此选择三唑基团来连接POI和E3连接酶配体。三唑在体内很难代谢，因此，引入三唑可能有助于增强代谢稳定性并延长PROTAC的耐久性。ARV-110的发现过程是PROTACs开发中极具参考价值的例子。在早期的研究中，AR拮抗剂和基于VH032的ARCC-4被发现具有有效的降解活性。鉴于ARCC-4缺乏口服生物利用度，将VHL配体替换为CRBN配体，并对接头进行相应优化以提高生物利用度。然后对弹头进行进一步改造，得到两种体内外活性均优于ARCC-4的PROTAC，但两种化合物均具有较高的清除率。改用刚性接头后，活性和生物利用度得到改善，剂量递增暴露的进一步优化最终导致了 ARV-110 的发现。表5 已发表的 PROTAC 结构的 Maple 数据库中选定的连接基序的出现情况 2. 连接子长度连接体的长度对 PROTAC 的降解活性也有显着影响。最近，Bemis 等提出了线性接头长度 SAR 研究模型，表明具有较长接头的降解剂更有可能在 PROTAC 的初步设计中取得成功。一旦确定了有效的PROTAC，将逐步缩短连接子的长度，以确定最佳连接子长度。当接头太短时，由于空间位阻效应，2个配体很难同时结合到各自的靶标上，从而阻碍了三元复合物的形成。但如果接头过长，则会阻碍PPI，导致靶蛋白泛素化失败。此外，较长的连接体具有较大的分子量，这使得 PROTAC 穿过细胞膜的可能性较小。因此，将刚性连接体（例如炔、哌嗪和哌啶）掺入连接体中可以有效改善PROTAC的药代动力学特征和功效。#3. 选择合适的链接子附着位点PROTAC 具有三个必要的组件：弹头、E3 连接酶配体和连接它们的连接体。一旦弹头和E3连接酶配体固定，连接子组成、长度和附着位点的选择和优化是构建PROTAC的重要因素。具有合适连接基的 PROTAC 分子对 POI 降解的活性和选择性具有显着影响。一般来说，最好从靶标蛋白暴露于溶剂的位置连接接头，这样不会影响其配体的结合亲和力。在大多数情况下，研究人员已经通过共晶结构和SAR研究确定了合适的连接位置。对于弹头和E3连接酶配体，连接体附着位点的选择需要考虑不影响其受体原有的亲和力。最重要的是，不要从配体的关键活性基团衍生连接子。4. 光控连接器尽管与传统的小分子抑制剂相比，催化 MOA 为 PROTAC 带来的副作用更少。然而，PROTAC 独特的催化特性也不可避免地会因正常细胞和癌细胞中的强烈降解而产生不利影响。为了克服这个问题，光控连接器的引入使得 POI 以时空方式降解。将光可切换的偶氮苯基团纳入连接体中是一种利用光控制降解活性的可逆方法。在不同给定波长的照射下，PROTAC会在“顺式”和“反式”之间可逆地转换，从而产生相应的非活性或活性PROTAC的构象。在一定波长的照射下，非活性PROTAC将转化为活性亚型。只有活性的PROTAC才有能力与靶蛋白形成稳定的三元复合物，引发后续的泛素化和蛋白酶体降解。此外，在某些波长的光下，也可以通过切换回非活性形式来中断降解。研究人员设计了一种双稳态 photoPROTAC，使用四氟偶氮苯基团来光学控制 BET 的降解。photoPROTAC 通过光可切换四氟偶氮苯连接体将 VHL 配体和 JQ1 连接在一起（图 4a)。有研究小组开发了一种不同的方法，通过将光笼基团(photocaging moiety)掺入弹头或 E3 配体来阻碍稳定 POI-PROTAC-E3 连接酶复合物的形成，从而光学控制靶蛋白的降解。在指定波长的光照射下，一旦光笼部分被释放，它就可以恢复到活性构象。2019年，PROTAC首次使用了光笼策略。光笼部分与 dBET1 中的弹头侧缀合，产生 pcPROTAC1（图 4b)。在365 nm波长照射下，4,5-二甲氧基-2-硝基苯甲基（DMNB）被释放，从而形成活性dBET1。此外，光笼的PROTAC-3将光笼基团引入CRBN配体侧以阻碍CRBN募集，在365 nm波长照射下，未笼的pcPROTAC-3诱导BTK降解（图 4C）。这些研究证明了将光笼组引入任一侧的可能性。然而，与 POI 配体缀合会比 E3 配体更好，因为它排除了目标蛋白在没有光照的情况下具有的抑制活性的影响。图4 a,  photoPROTAC -1，包含 BRD 靶向 JQ1 和通过光可切换四氟偶氮苯部分连接的 VHL 配体。光照射将非活性顺式-photoPROTAC-1 转化为其活性反式异构体，反之亦然，b DMNB 保护的 PROTAC 在 365 nm 处照射会释放有效的 BET 降解剂 dBET1，c在 365 nm 处照射 NVOC 保护的 PROTAC 会释放有效的 BTK 降解剂。5. 可点击的链接器点击反应是PROTAC在细胞中自组装的有效生物正交工具，并改善了PROTAC较差的渗透性。Astex Pharmaceuticals 开发了更小的基于前体的细胞内 CLIPTAC（细胞内点击形成的蛋白水解靶向嵌合体，CLIPTAC）系统。该系统中的小分子前体具有较小的分子量，例如四嗪 (Tz) 标记的沙利度胺衍生物 (~ 572 Da) 和反式环辛烯 (TCO) 标记的 JQ-1 衍生物 (~ 609 Da)。Heightman研究组开发了两种 CLIPTAC 模型，它们可以通过反式环辛烯和四嗪前体分子的点击反应在细胞内合成。结果表明，CLIPTACs能够成功诱导HeLa、A375和HCT116等三种细胞系中BRD4和ERK1/2（细胞外调节蛋白激酶）的降解。这一开创性的策略不仅提高了PROTAC的细胞通透性和溶解度，而且无需进行连接子优化，对于不同的目标蛋白降解只需改变蛋白配体部分，更加灵活方便。4.3 计算机仿真加速 PROTAC 设计PROTACs的合理设计包括三个组成部分：弹头、E3配体和连接体。虽然弹头和E3配体的发现过程本质上与小分子相似，但连接体的设计有些挑战性，因为POI和E3连接酶在没有有效PROTAC的情况下无法相互作用。随着人们更好地理解连接子对 PROTAC 的理化性质和降解活性的重要性，当前的研究集中在从头 PROTAC 设计上。连接子的长度、组成、灵活性和连接位点都对降解效率产生巨大影响。此外，另一个设计挑战来自于PROTAC分子往往溶解性差、渗透性差、生物利用度低和不可预测的钩状效应，这阻碍了PROTAC的临床转化。因此，迫切需要寻找新的方法来提高PROTAC的发现效率。为了加速合理 PROTAC 的设计进度。Zheng 等人创建了一种新颖的深度生成模型（PROTAC-RL）。将一对E3配体和弹头输入到模型中，在强化学习（RL，Reinforcement Learning）的指导下，输出设计的接头以及具有特定性质的化学上可行的PROTAC。具体来说，他们首先预训练了一个基于transformer神经网络的链接子生成模型（Proformer）。为了克服PROTAC训练数据量低的挑战，首先通过许多与PROTAC大小相似的准PROTAC小分子对模型进行预训练，然后用真实的PROTAC集和增强数据对模型进行微调。Proformer 随后被输入基于记忆的强化学习框架 PROTAC-RL，并获得经验奖励以获得具有理想 PK 属性的 PROTAC。为了证明有效性，研究团队将BRD4识别为POI并生成了5000个PROTAC。依靠超级计算能力，他们进一步对这些虚拟分子进行聚类和筛选。研究人员最终选择、合成并实验测试了六种PROTAC，其中三种表现出抑制活性，一种先导化合物表现出针对肿瘤细胞系的高抗增殖活性和良好的药代动力学。Western blot 检测结果显示化合物 1-3（图 2j) 低微摩尔浓度降解细胞内 BRD4。所有这些化合物在微摩尔浓度下均表现出针对 Molt4 细胞系的抗增殖活性。整个研究工作仅耗时49天，表明计算机模型的应用可以促进高效合理的PROTAC设计和优化。5. PROTACs在疾病中的应用在过去的二十年中，PROTAC 在解决疾病相关蛋白方面表现出了独特的优势。目前，一些具有代表性的PROTAC已进入治疗癌症的临床试验。除了癌症之外，PROTACs在治疗其他疾病方面也具有巨大优势，例如神经退行性疾病、免疫系统疾病或病毒感染。在这里，我们总结了这些疾病的一些 PROTAC 靶标（表 6）。表6 针对不同疾病的多种 PROTAC疾病领域目标癌症激酶：BTK、FAK、MEK、IRAK4、BCR-ABL、EGFR、CDK、Aurora A转录因子：AR、ER、STAT3表观遗传蛋白：EZH2、BRD、HDAC、KDM5C、Sirt2、EDR5、PRMT5、NSD3、NAMPT、ENL、p300/CBP神经退行性疾病GSK-3β、LRRK2、α-Synuclein、Tau、TRKA、TRKC、mHtt免疫失调HDAC3、H-PGDS、IRAK1、IRAK3、IRAK4病毒性疾病PEGS-2、NS3/4A、Mpro其他的HMGCR、VEGFR25.1 PROTAC 靶向癌症相关靶点致癌蛋白在癌症进展中不可或缺，这使得 PROTAC 特别适合治疗癌症。目前大多数 PROTAC 的研究都集中在与癌症相关的靶点上。在已报道的研究中，研究人员首选激酶作为降解靶标。据统计，激酶占PROTAC降解靶标总数的45%，其中一半以上的PROTAC靶向RTK和CMGC激酶组(CMGCs)。BTK PROTAC 已进入临床试验，多种化合物已显示出良好的临床效益。文献中也对针对 ALK、MEK 和 CDK 等激酶的 PROTAC 进行了广泛的研究和调查。除了基于激酶的PROTAC之外，还有大量的PROTAC专注于靶向核受体和表观遗传蛋白。到目前为止，PROTAC 应用最成功的目标是 AR 和 ER。与激酶小分子抑制剂相比，AR和ER的耐药性非常复杂和棘手。由于AR突变的多样性，AR的原始抑制剂恩杂鲁胺可能会失去抑制功效，甚至成为部分激动剂。因此，PROTAC特别适合治疗AR相关癌症，尤其是转移性去势抵抗性前列腺癌。5.2 PROTAC 用于治疗神经退行性疾病最常见的神经退行性疾病包括阿尔茨海默病、亨廷顿病和帕金森病。它们经常发生在老年人群中，是一类导致认知障碍的疾病。错误折叠蛋白的聚集是神经退行性疾病的主要原因之一，常见的错误折叠蛋白是β-淀粉样蛋白、tau、α-突触核蛋白和polyglutamates。Tau 是阿尔茨海默病的重要微管相关病理蛋白，由于缺乏活性口袋，它像许多非酶蛋白一样难以调节。AD 和其他神经退行性疾病最显着的特征之一是 Tau 蛋白的积累。AD 患者大脑中的 tau 蛋白水平高于健康人。高Tau水平可以促进其聚集，并影响β淀粉样蛋白（Aβ）的毒性。因此，最大限度地减少 Tau 聚集被认为是治疗 AD 的潜在方法。由此，设计合成了一种带有Keap1 E3连接酶配体的肽基PROTAC，用于降解细胞内Tau，在体外表现出与tau和keap1的高亲和力，并诱导Tau的适度降解。亨廷顿病（HD）是由亨廷顿基因变异引起的，变异产生的异常突变型亨廷顿蛋白（mHtt）在大脑中积累，会影响神经和神经细胞功能。因此，抑制或清除有毒 mHtt 聚集被认为是一种潜在的治疗方式。此前的研究主要集中在开发对 mHtt 聚集体具有抑制作用的化学小分子。不幸的是，由于化学聚集调节剂的机制尚不清楚，因此没有适用的临床结果。有设计了 PROTAC，将 mHtt 聚集体探针与泛素连接酶 cIAP1 的配体结合在一起。实验数据表明，这两种化合物能够诱导活细胞中mHtt的降解。这种效果在 HD 患者和具有更长多聚谷氨酰胺重复序列 (145Q) 的 mHtt 患者中尤其明显。5.3 PROTAC 用于治疗免疫相关疾病IRAK4白细胞介素 1 受体相关激酶 4 (IRAK4) 在 Toll 样受体 (TLR) 和白细胞介素 1 受体 (1L-1R) 信号通路中发挥重要作用。IRAK4 属于四个激酶家族（IRAK4、IRAK1、IRAK2 和 IRAK-M）。IRAK4接收来自上游TLR和1L-1R的信号并激活其下游NF-κB和JNK信号通路，这些信号通路与人类炎症反应和癌症密切相关。TLR或1L-1R受体被激活后，IRAK4通过共享死亡结构域(DD)与MyD88和IRAK2结合，形成myddosome复合物。myddosome 复合物发挥其磷酸化功能并激活下游 IRAK1 和相关因子 6 (TRAF6)，从而激活下游 NF-κB 和 JNK 信号通路，转录与炎症和细胞增殖相关的基因。IRAK4的过度激活或功能障碍会相应地导致不同的问题。除了激酶活性外，IRAK4 还具有支架信号传导。因此，传统的小分子抑制剂无法阻断IRAK4的全部功能。作为一项有前途的技术，PROTACs可以消除蛋白质的所有功能。2020 年，报道了几种可以选择性降解 IRAK4 的 PROTAC。组蛋白去乙酰化酶3组蛋白脱乙酰酶 (HDAC) 家族是一类染色质修饰酶，可通过组蛋白修饰来沉默转录。HDACs家族由18种同工酶组成，可分为四种类型。其中，HDAC1-3和8属于I类HDAC，在细胞运动、免疫调节和增殖中发挥关键作用。然而，HDAC3 的结构包含一个高度保守的催化结构域，这使得 HDAC3 的选择性靶向具有挑战性。2020 年，报道了一种新型的 HDAC3 PROTAC HD-TAC7（图2k)，由 CRBN 配体泊马度胺和选择性 I 类 HDAC 抑制剂邻氨基苯胺组成。HD-TAC7具有中等降解效力，但对HDAC1和HDAC 2没有影响。Liao等人开发了基于 VHL 的 PROTAC XZ9002（图 2k) 可以特异性降解 HDAC3 并抑制肿瘤细胞活性 。5.4 针对病毒相关目标的 PROTAC人们认为PROTAC也可以应用于抗病毒领域，以降低对耐药突变的敏感性。随着常规抗病毒药物的耐药性，临床治疗效果开始逐渐恶化。最近的研究利用 PROTAC 开发了一种化学降解抗病毒药物，以诱导病毒蛋白降解。设计了一种 PROTAC，它由与丙型肝炎病毒 (HCV) 蛋白酶活性位点结合的可逆共价抑制剂特拉匹韦和 CRBN 连接酶的配体组成。化合物DGY-08-097（图 2l)，不仅抑制而且降解 HCV NS3/4A 蛋白酶，在细胞感染模型中表现出效率。严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）自2019年爆发以来对全世界人民的生命和健康构成严重威胁。尽管世界范围内已经设计了多种针对 COVID-19 的疫苗，但该病毒的高致突变性限制了疫苗的有效性。2021 年，Desantis 等人设计了一系列基于吲哚美辛的PROTACs泛冠状病毒抗病毒药物。吲哚美辛（INM）具有抗病毒活性，但其背后的机制尚不清楚。INM 针对 SARS-CoV-2 的抗病毒活性可能来自其对人前列腺素 E 合酶 2 型 (PGES-2) 的抑制活性。先前的研究报道INM在纳摩尔浓度下具有抑制PGES-2的活性。PGES-2 已被证明与 SARS-CoV-2 的 NSP7 蛋白存在相互作用 。NSP7 与 PGES-2 的相互作用也存在于其他冠状病毒中，这表明靶向 PGES-2 可能是基于 INM 的抗病毒 PROTAC 设计的潜在方法。德桑蒂斯等人。设计了四种基于 INM 的 PROTAC，但生物学评价结果显示，只有两种化合物的效力比 INM 强约 4.5 倍，并且对 β-冠状病毒 HCoV-OC43 和 α-冠状病毒 HCoV-229E 具有广谱抗病毒活性。5.5 其他 PROTAC2020 年，Rao 等人报道了 HMG-CoA 还原酶 (HMGCR) 的第一个 PROTAC，HMGCR 是胆固醇生物合成途径中的限速酶。他们通过结合阿托伐他汀(Atorvastatin)和 CRBN 配体合成了一系列 PROTAC。经过优化和筛选，他们最终找到了最有效的降解剂P22A（图 2m) DC 50为 0.1 μM。该PROTAC强调了治疗高胆固醇血症和心血管疾病的潜在应用。此外，PROTAC 是其他非癌蛋白的一种有前途的治疗方法。有报道了第一个诱导α1A-肾上腺素受体（α1A - AR）降解的PROTAC ，也是第一个针对G蛋白偶联受体（GPCR）的PROTAC。他们通过不同的连接体将α1A -AR抑制剂哌唑嗪与泊马度胺连接起来，最终发现了有效的化合物9c（图 2m）。9c可以抑制PC-3细胞的增殖并导致肿瘤生长减慢，这为前列腺癌的治疗提供了新的策略。Hu等人提出了吲哚胺 2,3-双加氧酶 1 (IDO1) 的第一个 PROTAC。IDO1 已被广泛报道为关键的免疫检查点，在多种癌症中过度表达。Hu等人发现了一个 PROTAC 2c（图 2m) 诱导 IDO1 显着且持续的降解。研究表明，造血祖细胞激酶1（HPK1）的PROTAC有助于改善基于CAR-T细胞的免疫疗法。PROTAC 技术在疾病治疗领域如此广泛，使其成为药物发现的强大工具。6. PROTAC的缺点和未来的挑战PROTAC作为一项新兴技术，引起了学术界和制药行业的高度关注。任何新技术的发展都会伴随着各种机遇和挑战，PROTAC也不例外。PROTAC潜在机遇和挑战的前景将有助于靶向蛋白质降解药物的研发。尽管PROTAC相对于其他药物发现范式具有独特的优势，但它也有一些缺点，带来了不可忽视的问题和挑战：药物特性：PROTAC分子比传统小分子药物更加复杂，具有更多的潜在代谢位点，这影响了PROTAC分子的代谢稳定性。同时，传统的小分子抑制剂普遍遵循“五法则”，但大多数报道的PROTAC的分子量往往大于700，导致渗透性差、溶解度低、口服生物利用度不理想。因此，如果不满足“五法则”，如何改善PROTAC分子的理化性质将是其成功成药的关键。耐药性：首先，PROTACs可以通过E3连接酶复合物核心成分基因组的改变而引起耐药性。CRBN 基因或 CUL2 基因表达的显着降低也会导致对 PROTAC 的耐药性 [ 10.1158/1535-7163.MCT-18-1129 ,  10.1021/acschembio.9b00525 ]。研究表明CRBN基因组的缺失是骨髓瘤细胞对IMiD产生耐药性的主要原因。其次，PROTAC的作用取决于特定的E3连接酶亚型，特定E3连接酶的表达限制了PROTAC在不同细胞类型中的应用。尽管人类基因组编码数百种 E3 泛素连接酶，但只有少数 E3 连接酶和小分子配体已用于PROTAC。因此，寻找更多种类的E3连接酶用于PROTAC药物的研发可能是解决耐药性的出路。“钩状效应(Hook)”和“脱靶效应”：如何避免Hook效应和脱靶效应也是PROTAC药物研发的一大挑战。PROTACs并不一定药物浓度越高，降解效果就越好，这就是人们常说的“Hook效应”。在PROTACs的研究中，发现显着高于DC50 的浓度会产生自抑制效应以补偿降解效率，称为“Hook效应”。此外，PROTACs分子的脱靶效应机制尚未完全了解。PROTACs可以完全降解靶蛋白，从而抑制靶蛋白的所有功能。然而，在这个过程中，正常蛋白质可能会被意外伤害，脱靶效应和毒性也是最大的挑战之一。例如，研究表明沙利度胺衍生物可引起IKZF1、IKZF3和GSTP1等转录因子的降解。进一步研究发现，沙利度胺衍生物对GSPT1等转录因子的降解是由于其“分子胶”效应。靶点选择：迄今为止，PROTAC技术适合哪些靶点才能获得比小分子抑制剂更好的益处尚不完全清楚，而且PROTAC的大多数靶蛋白都是“可成药”蛋白的一部分。事实上，PROTAC 技术的最大优势之一是其处理“不可成药”目标的潜力。由于PROTAC技术只需要暂时介导三元复合物的形成，因此可以将低亲和力POI配体掺入PROTAC分子中。不幸的是，迄今为止，针对“不可成药”蛋白质的 PROTAC 分子很少。因此，PROTAC的另一个挑战是需要开发更多针对“不可成药”蛋白质的分子，从而体现PROTAC技术的优势。7. 讨论与结论作为一种新兴的药物发现范式，PROTAC 引起了学术界和工业界的高度关注。尽管PROTAC技术在药物研发方面具有诸多优势，但在发现和临床应用过程中仍存在诸多障碍和挑战，如脱靶、细胞通透性、稳定性、大分子量等。口服生物利用度和药物完整性也是 PROTAC 药物开发持续面临的挑战。值得注意的是，与其他传统小分子抑制剂相比，PROTAC在临床应用中仍具有诸多优势。首先，PROTAC通过诱导致病蛋白降解发挥作用，因此可以促进多轮靶蛋白的降解，协助消除脱靶效应和药物靶点的积累。PROTAC 还可以降解一些被认为“不可成药”的蛋白质，例如转录因子。其次，PROTAC具有提高选择性和特异性、克服耐药性的优点。总之，目前PROTAC药物研发的现状是优点与缺点并存，但如何解决这些问题将是PROTAC药物研发成功的关键。高效PROTAC分子的发现是一个耗时且具有挑战性的过程，例如接头长度和结构的优化。迫切需要总结一种设计高效PROTAC分子的通用方法。目前PROTAC的设计和优化主要集中在POI配体和连接体的构效关系研究上。其中，连接子不仅对PROTACs的降解活性至关重要，而且极大地影响膜的通透性、代谢稳定性和药物利用度。因此，如何有效设计并连接POI和E3配体是PROTACs分子设计的关键。到目前为止，指导连接子设计的原则，包括长度和组成，尚未被完全理解。另一方面，基于“光控连接体”设计的photo-PROTAC也比传统药物具有一些优势，这也是本文所介绍的。预计新兴的photo-PRTOAC能够成为PROTAC药物中的领军者。本文总结了PROTAC设计的一般原则，为PROTAC的研究和设计提供了系统的认识。此外，E3连接酶对于三元复合物的组成也至关重要。然而，在人类基因组编码的数百种E3连接酶中，只有少数E3连接酶被用于PROTAC中，并且发现新的E3连接酶及其配体的进展远远落后于PROTAC的研究。迄今为止，大多数PROTACs通过招募E3连接酶CRBN、VHL、MDM2和IAP来诱导靶蛋白降解，仅通过这些E3连接酶对PROTACs的研究还远远不够。因此，有必要探索更多新型E3连接酶来加速PROTAC的发展。但可以预见，未来E3配体的数量可能会大幅增加，这将为PROTAC的设计提供更多选择。PROTAC技术已经发展了近20年，部分分子已进入临床试验，这揭示了PROTAC在肿瘤、免疫疾病、神经退行性疾病、心血管疾病和病毒感染方面的巨大治疗潜力。世界各地也有研究使用该技术来治疗 COVID-19。目前，已有PROTAC药物已进入III期临床试验。尽管已有十余种药物正在进行临床试验，但临床研究数据仍不足，还需要更多的临床研究来证明PROTAC技术的前景。随着研究的深入，这些障碍将在不久的将来基本得到解决。一旦更多的药物进入临床应用，将开启药物研发的新时代。尽管仍有许多障碍和挑战需要克服，但PROTACs以其独特的优势具有巨大的治疗潜力。相信未来，随着技术的发展和研究的深入，PROTACs的设计和合成将逐步优化，最终将为多种疾病的治疗开辟一条康庄大道，有望为多种疾病的治疗提供广阔的前景。在不久的将来会产生临床治疗效果。总之，PROTAC技术不仅为药物化学领域的研究提供了有力的工具，也为未来临床药物的发展带来了巨大的希望。参考文献:https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC9763089/声明：发表/转载本文仅仅是出于传播信息的需要，并不意味着代表本公众号观点或证实其内容的真实性。据此内容作出的任何判断，后果自负。若有侵权，告知必删！长按关注本公众号   粉丝群/投稿/授权/广告等请联系公众号助手 觉得本文好看，请点这里↓

——诺华“合成致死”新靶点创新产品进展——2024年1月26日，CDE官网公示，诺华在研创新产品HRO761获得临床试验默示许可，拟开发治疗晚期不可切除或转移性MSI-H/dMMR型实体瘤。截图来源：CDE官网HRO761为WRN抑制剂。Werner综合征RecQ解旋酶（WRN）是近年来发现的“合成致死”新靶点，对MSI-H肿瘤具有“合成致死”作用，是该赛道的潜力创新产品。但纵观诺华近年来在创新药品领域，进展多遭受坎坷。布局风险性极大的“合成致死”赛道，又是新靶点，着实风险和机遇并存。我们来回顾下该赛道目前的研究进展情况。——合成致死里程碑产品PARPi适应证撤销——PARP抑制剂（PARPi）是首款根据合成致死原理研发的抗癌药，自2014年奥拉帕利问世以来，全球已上市六款PARP抑制剂，分别是奥拉帕利、鲁卡帕尼、尼拉帕利、他拉唑帕利、氟唑帕利和帕米帕利。深刻改变了卵巢癌治疗格局，同时，也先后获得乳腺癌、胰腺癌和前列腺癌的适应症。逐步引起国际制药巨头纷纷押注合成致死赛道。但随着FDA近期对PARPi适应症的撤销，又为合成致死赛道蒙上了阴影。PARP抑制剂（PARPi）的问世，深刻改变了既往治疗手段有限的卵巢癌的治疗格局，但是，随着相应临床试验随访时间的延长，临床数据显示卵巢癌患者使用鲁卡帕尼、奥拉帕利和尼拉帕利的死亡风险有所增加，所以在2022年FDA接连撤回奥拉帕利和鲁卡帕尼末线治疗卵巢癌的适应症以及尼拉帕利末线治疗卵巢癌、输卵管癌或原发性腹膜癌的适应症。让外界对于以PARPi为代表的合成致死赛道前景充满担忧。既往时刻，诸多国际制药巨头已经纷纷押注合成致死赛道，未来是否真的如预期中的一路坦途呢？——合成致死赛道频繁BD——2022年3月22日，Volastra Therapeutics宣布，与百时美施贵宝达成研发合作，利用Volastra基于探索染色体不稳定性（chromosomal instability, CIN）的药物发现平台，发现与染色体不稳定性相关的合成致死药物靶点。合成致死是一种已经得到验证的靶点发现策略， 它通过探索肿瘤细胞的弱点，在杀死肿瘤细胞的同时避免伤害健康细胞。根据合作协议，Volastra将负责针对未公开的靶点进行一系列研发活动，直至选定开发候选疗法。百时美施贵宝将负责后续开发、监管和商业化活动。Volastra将获得3000万美元的前期付款，并有资格获得高达11亿美元的里程碑付款。2022年6月1日，RepareTherapeutics宣布，与罗氏制药集团就拆monsertib（RP-3500）的开发和商业化达成全球许可和合作协议。Repare将收到1.25亿美元的预付款，并有资格获得高达12亿美元的潜在开发、监管、商业和销售里程碑，以及全球净产品销售的特许权使用费。Camonsertib是一种选择性ATR（共济失调毛细血管扩张突变基因Rad3相关激酶）口服小分子抑制剂，用于治疗具有特定合成致死基因组改变的肿瘤，包括 ATM（共济失调-毛细血管扩张突变）基因。让大众的视线再次聚焦到合成致死赛道上。在具体回顾基本概念前，我们先讲解下ATR抑制剂的作用机制。——ATR抑制剂作用机制——内源性（DNA双链断裂）和外源性（紫外线辐射和化学毒性等）的因素，引起细胞DNA的损伤，为了维持基因组的完整性，细胞进化出DNA损伤应答机制DDR（DNAdamageresponse）可以检测DNA损伤并修复，与细胞周期的检查点相互作用以控制细胞增殖。DDR的核心激酶是3种结构独特的丝氨酸/苏氨酸激酶成分的中枢调控因子：共济失调性毛细血管扩张突变蛋白（ATM）、Rad3相关蛋白ATR、DNA依赖性蛋白激酶(DNA-PK)。ATM和DNA-PK主要在双链断裂修复中被激活；而ATR主要在单链断裂修复中被激活。DNA损伤累积并阻碍DNA复制的过程就会发生RS，在RS下，DNA链的损伤可导致复制减慢或停止，如果损坏未修复可能会崩溃，导致细胞死亡，ATR在协调RS中起着至关重要的作用。复制蛋白A（RPA）在损伤位点与单链DNA结合，所得复合物结合可引发ATR募集到DNA损伤位点。当ATR被复制蛋白A（RPA）激活后，会磷酸化CHK1，后者又磷酸化CDC25A，最终通过抑制周期蛋白依赖性激酶（CDK）的活性介导G2～M期和S期检测点的活化，来减少RS并触发适当的DNA修复途径。而ATR抑制剂可以干扰DNA修复，这样癌细胞的DNA就有可能产生一堆错误而且得不到修复，然后凋亡。正常细胞有很多蛋白质负责DNA修复（比如MMR相关的就有4个，MSH2、MSH6、MLH1、PMS2；此外，BRCA以及POLE等蛋白），单独阻断ATR，并不会对DNA修复有影响。综上可知，ATR抑制剂也属于合成致死理论的明日之星。——合成致死理论——合成致死（Synthetic lethality）理论由来已久，通俗来讲，指两个非致死基因同时失活将导致细胞死亡的现象。概念最早可以追溯到1992年，美国科学家卡尔文在果蝇的研究中发现，具有pd和 Pdr双基因突变的果蝇不能存活，而这其中任何一个基因单独突变都不会导致果蝇死亡。1946年，西奥多·多布赞斯基正式提出“合成致死“概念，用来描述这种不同基因之间的互补性致死作用。科学家们很容易将果蝇中发现的这种现像与肿瘤治疗理论相结合，如果发现肿瘤细胞中存在特定基因A失活，那么用药物抑制它的合成致死搭档基因B，使两者都失活，而健康的体细胞因为有正常的基因A，能够保证正常的生理功能的表达，不会受到药物的伤害，从而只特异性的杀死该类肿瘤细胞。基于合成致死原理的肿瘤治疗原理很简单，但难点相信大家也能想得到。没有技术的突破，你很难找到合适的成对存在的合成致死基因。犹如好的逗哏必须得有好的捧哏才能合演一场成功的相声。突破在于PARP与BRCA这对黄金搭档的世纪相遇，促进了PARP抑制剂的成功商业化上市，并在卵巢癌领域获得巨大成功，由此开启了基于“合成致死”理论进行药物开发的热潮。最成功的产品当然是PARP抑制剂。——PARP抑制剂——PARP（聚腺苷二磷酸核糖聚合酶）在DNA单链碱基切除、修复过程中发挥着关键作用。BRCA是重要的抑癌基因与肿瘤易感基因，包括BRCA1及BRCA2。BRCA基因突变会导致基因组不稳定性显著增加，从而显著提高女性罹患乳腺癌、卵巢癌以及其他癌症（胰腺癌、子宫内膜癌、腹膜癌及宫颈癌等）的风险。在人体内，BRCA可与PARP共同作用于同源重组（HR）修复通路，这种双保险组合，可以有效保证体内DNA复制的正确性。但部分癌细胞，BRCA基因会突变，此时，人类如若开发出能够抑制PARP的药物，通过抑制肿瘤细胞DNA损伤修复、促进肿瘤细胞发生凋亡，从而可增强放疗以及烷化剂和铂类药物化疗的疗效。特别是对于携带BRCA突变的肿瘤细胞，理论上对PARP抑制剂的敏感度会更高。 BRCA和PARP的合成致死示意图 目前，已经有四种PARP抑制剂在中国获批上市，分别是奥拉帕利、尼拉帕利、氟唑帕利以及帕米帕利，将这几款PARPi在卵巢癌领域获得FDA和NMPA批准的适应症总结如下：来源：NMPA、FDA、各公司官网（未更新最新追踪结果）——开发PARP抑制剂新策略——随着临床上PARPi不断涌现，耐药现象同样限制了PARPi的进一步运用。PARPi的耐药性的主要原因是BRCA1/2突变癌细胞HR修复活性的恢复。详细地说，BRCA1/2中的继发突变与原始突变导致的链终止子/移码的废除有关，导致全长 BRCA1/2 开放阅读框的恢复。因此，活性BRCA1/BRCA2蛋白表达被恢复，从而重新启动功能齐全的HR途径。除了BRCA1/2中其他突变介导的耐药性外，还提出了BRCA1启动子甲基化的减少/丧失，从而恢复了BRCA1的表达而导致对PARPi的耐药性。为了克服耐药性，一方面进一步对PARP抑制剂进行修饰开发以发现下一代PARP抑制剂，另一方面采取联合用药，如2023年3月，强生旗下杨森（Janssen）公司则宣布向FDA递交了将PARP抑制剂尼拉帕利和醋酸阿比特龙（abiraterone acetate）以双效片剂（DAT）形式的新药申请（NDA），联合强的松（prednisone）共同用于治疗BRCA阳性的转移性去势抵抗性前列腺癌（mCRPC）患者，或者双靶点抑制剂，如进入临床II期的Stenoparib，同时抑制PARP1/2和TNKS1/2，还有很多临床前在研的靶向PARP和其它靶点如HDAC、TOPO、BRD4、PI3K、HSP90、AChE和PD-L1等的抑制剂。与此同时也在开展其它靶向PARP新策略，如PARP的PROTAC和PARP抑制剂的前药。除了在PARPi升级改造下苦功夫以外，也期望能够在其他的靶点上，如WEE1和TP53，重塑PARPi的辉煌。——WEE1与TP53——PRMT5/MAT2A抑制剂、WEE1抑制剂，都是潜在的合成致死赛道的黑马，本文主要介绍尚在临床早期的WEE1抑制剂的相关知识。与 WEE1 形成合成致死基因搭档的，则是大名鼎鼎的抑癌基因 TP53。 TP53 与 WEE1合成致死效应 TP53 是人类非常重要的抑癌基因，在正常细胞中低表达，在恶性肿瘤中高表达。TP53 基因翻译的 P53 蛋白是细胞生长、增殖和损伤修复的重要调节因子。细胞的 DNA 受损时，P53 蛋白阻止细胞增殖而停止于 G1/S 期，把损伤修复好后才能进入 G2 期，如不能修复则促进细胞凋亡。在所有恶性肿瘤中，50% 以上会出现该基因的突变，从而导致大多数恶性肿瘤细胞于 G1/S 期检查点存在修复缺陷，复制出错的细胞就会轻松通过 G1 关卡，进入到 G2 期。 WEE1在 G2/M 检查点中作用的示意图  目前，直接针对抑癌基因 TP53 的药物研发，比直接针对原癌基因，如 EGFR、ALK 的靶向药物研发要艰难的多。现在针对抑癌基因的药物研发，更多的是在信号通路的上下游想办法，找相应的药物靶点，进行抑制。而 WEE1 就是合理的与 TP53 相搭配的合成致死靶点。WEE1 是 DNA 损伤修复（DDR）通路相关的一个重要激酶。WEE1 激酶能磷酸化细胞分裂周期基因 (cell division cycle，CDC2)，下调其活性，进而可以调控细胞 G 2 到 M 期的转变并调节细胞有丝分裂。它在染色体浓缩延迟和组蛋白合成中也起到关键作用，与 TP53基因突变存在一定的合成致死效应。 ——WEE1抑制剂在研项目汇总—— PARPi和WEE1抑制剂与化疗的增敏探索目前，临床有多款 WEE1 抑制剂在研，且各种 WEE1 抑制剂与 DNA 损伤 (化疗或放射治疗) 相结合的联合治疗方式已取得了很多进展，如进展最快的 Adavosertib（AZD1775），已在全球布局50余项临床试验，多为联合用药方案。基于此，WEE1 逐渐成为肿瘤治疗中的一个重要靶点。来源：医药魔方巧合的是，与 PARPi 在卵巢癌领域所获得的巨大成就相比，作为临床进展最快的 WEE1抑制剂—Adavosertib，在妇瘤领域中的浆液性子宫癌（USC）中也有着不俗的表现。                           USC非化疗药物数据对比  普通化疗对USC疗效较差，近年来，Her-2靶向治疗，抗血管生成药，酪氨酸激酶抑制剂与免疫检查点抑制剂的结合，以及我们今天所介绍的WEE1细胞周期调节剂，在USC领域取得了不错的ORR和PFS数据 。然而 Adavosertib 单药或联合用药均出现频率较高的不良事件，主要为腹泻、呕吐等胃肠道相关及贫血等血液方面不良事件, 对于Adavosertib 进一步的拓展蒙上了阴影。                           国内一众企业，在“合成致死“肿瘤治疗领域，多聚焦于已经商业化运作成功的PARPi的研发，鲜有突破创新者。不过值得一提的是，专注于”合成致死“作用机制药物研发的英派药业，是国内该领域鲜有的突破创新者，利用自主研发的 DNA损伤修复通路平台，开始探索PARP、WEE1等合成致死靶点的药物研发。在研产品包括PARP抑制剂（IMP4297）、WEE1抑制剂（IMP7068）、Hedgehog通路抑制剂（IMP5471）等。此次施贵宝重金布局合成致死领域，会更加吸引大众视野。——PRMT5与MTAP的初识探索——有企业全力押注PARPi的研发，自然也有企业想弯道超车，基于PARPi的成功，能否寻找到堪比PARP/BRCA的下一对“合成致死“黄金搭档呢？答案是有的， PRMT5/MTAP正是这种潜在的组合。PRMT5在基因表达、剪接和DDR中的作用模型PRMT（蛋白质精氨酸甲基转移酶）能够使多种蛋白甲基化，并在基因表达、剪接和DNA损伤修复等生物学过程中发挥重要作用。目前，已发现了11种PRMT家族的成员，主要的研究热点集中在PEMT5上。 MTAP（methylthioadenosine phosphorylase，甲硫腺苷磷酸化酶）常与体内常见的抑癌基因CDKN2A发生共缺失现象，这种共缺失现象在肿瘤中的比例可达9%~15%。 PRMT5和MTAP是合成致死组合2016年的两篇背靠背《Science》文章首次报道了抑制PRMT5在MTAP缺失肿瘤中的合成致死效应。另外，有研究证明，MTAP缺失的癌细胞对蛋氨酸腺苷转移酶2A（MAT2A）也敏感。因此，PRMT5抑制剂和MAT2A抑制剂有望成为治疗MTAP缺失肿瘤的新一代靶向药物。  在研PRMT5/MAT2A抑制剂项目汇总目前，有多款PRMT5/MAT2A抑制剂正在临床试验中，其中不乏GSK、辉瑞等大药企的身影，也有Agios这类新兴生物制药公司。让我们期待在肿瘤靶向药物治疗领域，“合成致死“理论能够再下一城。声明：发表/转载本文仅仅是出于传播信息的需要，并不意味着代表本公众号观点或证实其内容的真实性。据此内容作出的任何判断，后果自负。若有侵权，告知必删！长按关注本公众号   粉丝群/投稿/授权/广告等请联系公众号助手 觉得本文好看，请点这里↓