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2 月 29 日，国家自然科学基金委员会发布了 2023 年度「中国科学十大进展」，主要分布在生命科学和医学、人工智能、量子、天文、化学能源等科学领域。来自中国科学院、军事科学院以及中国科学技术大学、香港大学、南方科技大学等多个研究团队的成果入选。其中六项生命科学和医学领域的成果尤为引人关注。它们分别为：揭示人类基因组古病毒驱动衰老机制的干预策略首次发现大脑「有形」生物钟存在及其节律调控机制农作物耐盐碱机制解析及应用新方法实现单碱基到超大片段 DNA 精准操纵揭示人类细胞 DNA 复制起始新机制揭示光感受调节血糖代谢机制2023 年度中国生命科学和医学六大进展简介:揭示人类基因组古病毒驱动衰老机制的干预策略内源性古病毒复活驱动衰老机制，开启衰老的潘多拉魔盒内源性逆转录病毒（ERV）是数百万年前入侵整合到人类基因组的遗迹 ——「古病毒化石」。大量 ERV 遗传信息经过漫长岁月的突变、缺失等变异成为人类基因组中的「暗物质」潜伏下来。细胞衰老是机体衰老以及相关疾病发生发展的重要诱因，人类基因组潜藏着诸多「老化」信号通常受到表观遗传的严密调控而处于沉默状态，但在增龄过程中，由于表观遗传的失序，这些「老化」信号逃离管控，进而激活启动细胞内的一系列衰老程序。占据人类基因组序列较大比例、如「死火山」般沉寂的 ERV 古病毒元件是否参与衰老的程序化调控？2023 年 1 月 6 日，中国科学院动物研究所刘光慧研究组、曲静研究组，与中科院北京基因组研究所张维绮课题组合作，在国际顶级学术期刊 Cell 上，在线发表了题为 Resurrection of endogenous retroviruses during aging reinforces senescence 的研究论文。该研究利用多学科交叉手段，通过对人类基因组中蛋白编码区域的「逆老」基因进行系统排查，发现可重启人类干细胞、运动神经元和心肌细胞活力，逆转关节软骨、脊髓及心脏衰老的新型分子靶标，并构建一系列针对器官退行的创新干预体系。首次发现了年轻的 ERV 亚家族在细胞衰老过程中被再度唤醒，提出了古病毒复活介导衰老程序化及传染性的理论，并创新性地发展出阻断 ERV 古病毒复活及扩散以实现延缓衰老的多维干预策略。为衰老生物学和老年医学研究建立了新的理论框架，提示病毒密码在远古时代便已融入人类的衰老及寿命调控程序，解码基因组中的古病毒元素将有助于剖析人类衰老的机制、健康长寿的规律以及多种老年疾病的诱因。图文参考来源：中国科学院官网https://www.cas.cn/syky/202301/t20230107_4860266.shtml首次发现大脑「有形」生物钟存在及其节律调控机制初级纤毛依赖性 Shh 信号调节生物钟基因和神经肽节律昼夜节律（生物钟），是生物在进化过程中为了适应地球环境昼夜更替而形成的一种节律性的生命活动规律，其准确性和稳定性与健康息息相关，一旦被打乱，可引起睡眠障碍、免疫力下降、代谢紊乱、精神抑郁，严重时会导致糖尿病、肿瘤等重大疾病的发生。由于缺乏对生物节律调节机制的认识，当前国际上尚未研发出针对节律紊乱性疾病的有效治疗药物。2023 年 6 月 2 日，军事科学院军事医学研究院李慧艳研究员团队和张学敏院士团队合作，在国际顶级学术期刊 Science 上在线发表了题为 Rhythmic cilia changes support SCN neuron coherence in circadian clock 的研究论文。该研究发现大脑视交叉上核（SCN）特定区域神经元的初级纤毛是调控机体节律的细胞器，通过组织透明化双光子成像、活细胞动态成像、小鼠昼夜节律行为监测、组织脑片生物节律光度测定等技术，首次揭示了生物钟「有形」指针的存在，阐述了纤毛及 Hedgehog 通路调控昼夜节律的功能机制。为节律调控新药研发开辟了全新路径，使机体对各种复杂环境的快速应对、快速适应成为可能。而靶向 SCN 初级纤毛特定信号通路可能是治疗与昼夜节律紊乱相关的人类疾病的潜在治疗策略，为节律紊乱相关疾病的治疗开辟了全新途径，也是我国脑科学研究的一次重大突破。图文参考来源：军事科学院军事医学研究院农作物主效耐碱基因可大幅提高盐碱地作物产量Gγ 亚基编码基因 AT1 介导植物对碱胁迫的响应机制随着全球人口急剧增加，人均可用耕地和淡水资源日益减少，预计到 2050 年全球农作物产量需要翻倍才能满足人类粮食的需求。而目前全球有超过 10 亿公顷的盐渍化土壤因盐碱程度过高而不能被有效利用，且不合理的施肥灌溉将会进一步加剧盐碱地面积的扩张，土壤盐渍化问题已经成为世界性难题。目前我们对植物耐碱胁迫环境的认识严重不足。因此，通过培育耐盐碱农作物，提高盐渍化土地产能，是解决未来人类粮食安全和农业发展的重要途径。2023 年 3 月 24 日，10 家科研单位协同攻克了这一难题，分别有: 中科院遗传发育所博士后张会丽、中国农业大学于菲菲、遗传发育所谢鹏、扬州大学孙生远、中科院生物物理研究所乔新华、中科院遗传发育所谢旗、中国农业大学于菲菲、华中农业大学欧阳亦聃以及宁夏大学许兴、中科院东北地理所梁正伟、中科院遗传发育所李家洋和汪迎春、华中农业大学张启发和中科院生物物理所陈畅，研究员们强强联手，以「A Gγ protein regulates alkaline sensitivity in crops」为题于发表在 Science 杂志上。利用高粱资源群体，通过全基因组关联分析、基因编辑、表型分析、免疫共沉淀联合 LC-MS 蛋白质谱鉴定、荧光探针等技术, 揭示了耐盐碱调控基因 AT1 调控植物碱胁迫响应的分子机制，并且在吉林大安和宁夏平罗盐碱地进行了大田实验，进一步检验 AT1 基因的改造对作物在耐盐碱地上产量的影响，发现基于耐盐碱等位基因 AT1/GS3 改良的水稻、玉米、高粱和谷子均有效提高了约 20-30% 的产量和生物量。因此，未来将该基因用于分子设计耐盐碱作物的育种遗传改良中，将为解决全球粮食安全危机和高效利用盐碱土地做出贡献，也为保障粮食安全提供了新思路。图文参考来源：中国农业大学新闻网https://news.cau.edu.cn/kxyj/f69183d54f0943bbbd3b59fb9a73cd67.htm新方法实现单碱基到超大片段 DNA 精准操纵单碱基编辑到大尺度 DNA 精准操纵基因组编辑技术为生物学基础研究和应用研究奠定了坚实的技术基础。但随着生物领域研究飞速发展，小片段 DNA 编辑已经不能满足研究和应用的需要。引领基因组编辑技术突破 DNA 操纵长度的限制，实现 kb 级大片段 DNA 甚至是染色体水平的精准编辑是目前面临的新挑战。然而，目前能够实现大片段 DNA 精准操纵的基因组编辑工具还十分有限，尤其在植物研究领域，相关工具还未见报道。2023 年 4 月 24 日，中国科学院遗传与发育生物学研究所高彩霞研究组开发了 PrimeRoot 技术，通过系统整合优化的引导编辑工具和位点特异性重组酶系统，实现长达 11.1 kb 的大片段 DNA 的高效精准定点插入。相关研究成果以 Precise integration of large DNA sequences in plant genomes using PrimeRoot editors 为题在线发表于 Nature Biotechnology 杂志。研究团队首次运用人工智能辅助的结构预测建立了蛋白聚类新方法，率先将基于结构分类的理念引入工具酶挖掘领域，并基于此开发了系列具有重要应用价值的新型碱基编辑器和我国完全拥有自主产权的、首个在细胞核和细胞器中均可实现精准碱基编辑的新型工具 CyDENT。这项工作通过开展基因组编辑元件挖掘方法和技术体系创新，实现了对基因组的精准操纵，为作物改良和基因治疗提供了重要支撑。展现了大片段 DNA 精准插入技术在未来生物育种中的巨大应用潜力，为基于基因堆叠的作物育种和植物合成生物学研究提供了有力的技术支撑。该文章发表后引起广泛关注，被誉为 「是一项将大片段 DNA 精准高效插入植物基因组的开拓性技术」。图文参考来源：遗传发育所 植物微生物最前线公众号揭示人类细胞 DNA 复制起始新机制人体 MCM2-7 双六聚体（MCM-DH）冷冻电镜结构及 DNA 复制起始调控步骤DNA 复制起始的精准调控是维持人类基因组稳定、抑制遗传疾病和癌症发生的关键生命过程之一。当时 Arthur KORNBERG 教授成功于从大肠杆菌提取液中分离出 DNA 聚合酶，并赢得诺贝尔奖。然而，由于缺乏高分辨率结构技术所带来的挑战，研究人员未能进一步发展此一领域，使之达到其他大分子机器，如核糖体或 RNA 聚合酶所取得的水平。2023 年 1 月 5 日，香港大学翟元梁教授联同香港科技大学党尚宇教授、香港科技大学/康奈尔大学戴碧瓘教授和法国居里研究所陈春龙教授，在  Cell 杂志上发表标题为 The Human Pre-replication Complex is an Open Complex 的研究论文。研究人员通过先进的冷冻电镜技术，成功从 HeLa 细胞中纯化得到人内源 MCM2-7 DH-DNA 复合物，并解析出人类复制前期复合体 2.59 埃的高分辨率结构。揭示了人类 MCM-DH 组装及初始 DNA 解旋以促进复制起始的新机制，也为开发以 DNA 复制为标靶的抗癌药物提供重要基础，有望被应用于研发新型、高效及更具针对性的抗癌药物，有望能选择性地杀死癌细胞。图文参考来源：香港科技大学快讯公众号揭示光感知调控血糖代谢的神经机制「眼-脑-棕色脂肪轴」介导光调节血糖代谢神经机制光是一切生命产生的源动力，也是生命体最重要的感知觉输入之一。同时生命体根据外界环境条件控制体内营养物质的代谢平衡是生存的必须，而代谢紊乱会产生严重疾病，哺乳动物已经进化出了精确和复杂的调控网络用于持续动态调控血糖代谢。大量公共卫生调查显示夜间过多光源暴露显著增加肥胖和糖尿病等代谢疾病风险。那么光作为最重要的外部环境因素，其是否直接调控血糖代谢？其中涉及哪类感光的细胞、何种神经环路以及外周靶器官，这些方面的问题一直没有得到解答。2023 年 1 月 20 日，中国科学技术大学生命科学与医学部薛天教授研究团队在 Cell 在线发表题为 Light modulates glucose metabolism by a retina-hypothalamus-brown adipose tissue axis 的研究成果。该工作发现了光直接通过激活视网膜上特殊的感光细胞，经视神经至下丘脑和延髓的系列神经核团传递信号，最终通过交感神经作用于外周的棕色脂肪组织，直接压抑了机体的血糖代谢能力。本研究不但在小鼠动物模型上系统回答了光调节血糖代谢的生物学机理，在人体试验上也发现了同样的现象，显示光调节血糖代谢可能广泛存在于哺乳动物界。该研究发现全新的「眼-脑-外周脂肪轴」介导光对血糖代谢产热的调节机制，为防治光污染导致的糖代谢紊乱相关疾病提供了理论依据与潜在的干预靶点。提示现代人健康生活应关注光线环境的健康，针对夜间光污染造成的罹患代谢疾病风险提高，应考虑生活环境中夜间人造光线的波长、强度和暴露时长。2023 年度第 19 届「中国科学十大进展」遴选活动由国家自然科学基金委员会主办，国家自然科学基金委员会高技术研究发展中心（基础研究管理中心）和科学传播与成果转化中心承办，《中国基础科学》《科技导报》《中国科学院院刊》《中国科学基金》《科学通报》协办，分为推荐、初选、终选、审议 4 个环节。《中国基础科学》等推荐了 2022 年 12 月 1 日至 2023 年 11 月 30 日期间正式发表的 600 多项科学研究成果，由近 100 位相关学科领域专家从中遴选出 30 项成果，在此基础上邀请了包括中国科学院院士、中国工程院院士在内的 2100 多位基础研究领域高水平专家对 30 项成果进行投票，评选出 10 项重大科学研究成果，经国家自然科学基金委员会咨询委员会审议，最终确定了入选 2023 年度「中国科学十大进展」的成果名单。来源 | 生物学霸、中国科学技术大学公众号

前言信使RNA（Messenger RNA，mRNA）是一种由DNA转录的单链核糖核酸，其携带编码蛋白质合成的编码信息可以翻译成各类功能性蛋白/肽段。最早将体外转录的mRNA在鼠肌肉细胞中成功表达相关蛋白的实验，成功奠定了mRNA治疗的基础[1]。mRNA治疗药物理论上可以通过核糖体表达系统翻译成任何蛋白/肽段。相对于基于DNA的基因治疗药物，因为mRNA治疗药物无需进入细胞核发挥疗效，其转染效率相对更高并且毒性更低，更重要的是其没有潜在插入诱变或感染的风险，无需担心对非靶DNA序列的修改而造成的脱靶毒性。并且相对于传统蛋白疗法，mRNA治疗药物可以持续翻译成编码的蛋白质，具备更好的疗效和潜力。mRNA药物的发展历程及作用机理mRNA药物的发展可以分成三个阶段，第一个阶段为1961-1990年，关键发现包括mRNA的发现、mRNA加帽加尾机制、mRNA体外合成、mRNA翻译机制以及早期核酸递送系统的构建等。这个阶段为mRNA的结构与机理的研究奠定了坚实的基础，并且开发出早期基于鱼精蛋白或脂质体的递送系统。第二个阶段为1990-2019年，伴随着对mRNA机制了解的越发深入，专注于mRNA疗法的公司相继成立，基于mRNA的实验性癌症免疫疗法、激活抗肿瘤T细胞、针对流感/RSV的实验性疫苗、个性化癌症疫苗等纷纷涌现。第三个阶段，即从2019至今，伴随mRNA-1273（Moderna）和BNT162b（Pfizer）COVID-19疫苗获批上市，mRNA药物进入了百花齐放的新阶段，各类治疗形式纷纷涌现，载体以及mRNA修饰、编码技术快速迭代。mRNA药物的发展历程和关键发现见图1。图1. mRNA药物发展历程和关键发现[2]广义上而言，mRNA疗法可以分成mRNA疫苗和mRNA治疗性药物。mRNA疫苗主要通过表达致病原相关蛋白（通常是致病原外部易被免疫细胞识别的蛋白，例如病毒衣壳蛋白等），诱导机体免疫细胞生成相应抗体。具体而言，分成三个阶段，首先是载体运送的mRNA进入抗原呈递细胞（antigen-presenting cells），从胞内体（endosome）中逃逸进入细胞质中，通过核糖体翻译成抗原蛋白，抗原蛋白通过蛋白酶体降解为多肽抗原片段并由MHC I呈递给CD8阳性的胞毒T细胞（Cytotoxic T cell），另外表达的抗原蛋白也会被分泌到细胞外，再通过内化，水解后形成多肽抗原片段由MHCII呈递给CD4阳性的辅助T细胞（Helper T cell），最终激活B细胞分化成浆细胞产生相应抗体。如图2，mRNA疫苗同时激活了细胞免疫和体液免疫，相对传统的灭活疫苗/抗原蛋白疫苗只激活体液免疫，mRNA疫苗具备更强的免疫激活潜力。图2. mRNA疫苗起效机理示意图，包括脂质体包裹的mRNA进入细胞，表达后通过作为内源性抗原和外源性抗原分别激活体液免疫和细胞免疫[3]COVID-19 mRNA疫苗的巨大成功让大家认识到了mRNA疫苗的潜力，各类新型mRNA疫苗不断涌现，据NextPharma数据库，目前全球共有超过500款mRNA疫苗在研，包括针对感染类的疾病如流感（Influenza）、呼吸道合胞病毒（RSV）、人乳头状瘤病毒（HPV）、EB病毒（EBV）以及人类免疫缺陷病毒（HIV）等的mRNA疫苗。另外值得注意的是，得益于mRNA疫苗在激活体液免疫（MHC II）的同时也可以激活细胞免疫（MHC I），目前在癌症疫苗方面有很多的尝试。并且mRNA疫苗具备多重编码的优势，可以同时编码数十个肿瘤抗原以及细胞因子等调节蛋白，可以很好的应对肿瘤个体异质性以及肿瘤微环境抑制等挑战。并且得益于研发周期短、可编程以及运载系统成熟等优点，相对于传统蛋白/肽段类抗原的癌症疫苗，mRNA疫苗在个性化定制（Personalized vaccines）上具备突出的优势。mRNA治疗性药物简单而言就是表达有功能的效应蛋白，达到治疗性的目的，通常又被称为蛋白替代疗法（Protein replacement therapy）。在各个疾病研究领域均有探索，包括癌症、心血管疾病、肺病、血液病、代谢疾病、神经疾病以及肌肉萎缩症等。大部分的mRNA治疗性药物都在临床前阶段，目前仅有少数几款mRNA治疗性药物进入临床阶段[4]，包括表达血管内皮生长因子A（VEGF-A）治疗心衰的mRNA药物，表达人囊性纤维化跨膜调节蛋白（CFTR）治疗肺部囊性纤维化疾病的mRNA药物，以及表达甲基丙二酰辅酶A变位酶（MUT）治疗甲基丙二酸酸血症的mRNA药物等。mRNA药物的DMPK研究可以简单分成两类，mRNA疫苗的DMPK研究以及mRNA治疗性药物的DMPK研究。可以参考之前发表的公众号文章: mRNA药物临床前药代动力学评估策略。简单而言，对于mRNA疫苗，主要是对mRNA本身以及新型载体辅料等的组织分布研究。对于mRNA治疗性药物，除组织分布研究外，系统循环中的mRNA，表达蛋白以及新型载体辅料也需要进行研究，并且相应的免疫原性和PK/PD研究也需要纳入考察范围中。这些多样的DMPK研究策略和考察内容需要相应的生物分析支持，我们建立了一套针对mRNA药物的整合性生物分析平台。这里以代表性的脂质纳米颗粒（Lipid nanoparticles，LNPs）包裹的mRNA药物为例，包括有对于mRNA本身分析，对表达蛋白、新型载体辅料（阳离子脂质或PEG脂质）、免疫原性以及生物标志物的分析等。下面我们将详细介绍每类成分具体的生物分析内容，以及相应的内部验证实验。图3. mRNA药物（以LNP-mRNA药物为例）整合性生物分析内容及相应生物分析平台mRNA整合性生物分析内容及平台1mRNA生物分析平台mRNA的生物分析主要通过两类平台进行，第一类是基于逆转录和扩增的RT-qPCR平台，另一类是基于信号放大的配体结合分析（Ligand Binding Assay, LBA）原理，B-DNA（branched-DNA）或者RNA-scope平台。具体原理见图4，简单而言RT-qPCR首先将mRNA逆转录成cDNA，cDNA进行qPCR扩增，通过SYBR green或Taqman荧光探针指示扩增量，由达到特定阈值的qPCR循环数指征mRNA的绝对量。而B-DNA则是基于核酸探针杂交（hybridization）和信号放大的原理，通过互补序列的核酸探针捕获mRNA于固相载体上，通过多重检测核酸探针放大信号，由信号值指征mRNA的绝对量。具体两个分析平台RT-qPCR和B-DNA的对比与优劣势将在后续的文章中详细介绍，欢迎持续关注。图4. RT-qPCR和B-DNA分析mRNA原理流程示意图[5]值得注意的是，除了基于绝对定量的RT-qPCR和B-DNA分析平台，mRNA药物早期组织分布研究也可以使用RNA Scope显微成像分析，虽然RNA-Scope是半定量的分析，但是其可视化以及可提供更精细的空间/细胞分布的优势使其广泛应用于mRNA 疫苗/药物的早期的组织分布研究中，例如Moderna在研究mRNA LNP疫苗的组织分布上，使用的是RNA-Scope的平台（如图5）。RNA Scope技术的原理也和B-DNA类似，也是基于核酸探针杂交（hybridization）和信号放大的原理。图5. Moderna使用RNA-Scope技术分析肌肉注射的模拟mRNA LNP疫苗组织分布（表达GFP蛋白的mRNA）[6]目前mRNA药物的生物分析，特别是用于IND申报的定量分析仍主要使用RT-qPCR平台，目前监管机构没有针对mRNA RT-qPCR生物分析的指导原则，我们根据行业白皮书以及GCC（Global CRO Council）共识[7]制定了我们自己的RT-qPCR方法开发/验证的接受标准。方法验证包括但不限于：标准曲线、灵敏度、批内/批间精密度和准确度评估、选择性、稳定性以及提取回收率等内容。我们使用模拟的mRNA药物（EGFP mRNA）验证RT-qPCR分析平台，考虑到肝脏通常是LNP mRNA药物组织分布的重要器官并且是主要的靶向和代谢组织，我们选取了SD大鼠肝组织和全血进行qPCR方法的完整验证。我们在NCBI Blast网站上设计EGFP mRNA的扩增引物和相应Taqman探针，RT-qPCR线性范围1pg/mL-1000ng/mL。全血和肝组织的qPCR定量标准曲线如下图所示。图6. 全血和肝脏中EGFP mRNA绝对定量标曲示意图，纵坐标是循环数阈值（Ct），横坐标是log10后的mRNA浓度（pg/mL）在方法验证阶段，我们分别进行了RT-qPCR方法的批内/批间精密度和准确度考察，选择性考察以及稳定性考察。批内/批间精密度和准确度考察显示两位分析人员跨越三天时间三个分析批的批内%CV和%Bias以及批间%CV和%Bias，数据显示不同分析批的标曲和质控样品都具备良好的批内/批间%CV和%Bias，三个分析批重复性良好，方法稳健（表1和表2）。选择性考察选取了三个不同浓度的加标质控样品（ULOQ, HQC, LLOQ），结果超过80%的加标质控样品（17/18）满足%CV和%Bias接受标准，方法具备良好的选择性。同时高浓度和低浓度加标质控样品的短期稳定性考察均通过。表1. 标准曲线样品批内/批间精密度准确度评估表2. 质控样品批内/批间精密度准确度评估总体而言，使用RT-qPCR平台定量分析mRNA药物具备良好的灵敏度、特异性以及稳健性，是目前常用的分析mRNA的平台。除了肝脏组织外，我们为其他基质类型例如全血、血清/血浆、难匀浆组织（肌肉、大脑等）都建立及优化了样品前处理方法，可以满足mRNA药物PK和组织分布的研究需求。2新型脂质生物分析脂质纳米颗粒（Lipid nanoparticles，LNPs）通常由4类成分组成：胆固醇、中性辅助磷脂、可离子化阳离子脂质、PEG脂质。胆固醇和中性辅助磷脂比较常见，通常已在其他相似载体中并获得FDA的批准，往往不需要进行额外的药代动力学考察以及相应的生物分析。而不同的LNP的可离子化阳离子脂质可能差异较大，不同的可离子化阳离子脂质决定了LNP本身的靶向性以及药代动力学特征，是LNP载体常用的结构优化单元。通常这些新型的脂质成分并未应用在已获批的上市药物中，需要进行完整的体内外ADME考察，同时也涉及到相应的生物分析。阳离子脂质决定LNP递送系统的递送效率和转染效率，它有三个重要的结构区域，分别是极性头部（Head Group）、连接链（Linker）、疏水尾部（Hydrophobic tail）。其中极性头部影响脂质带电情况，在溶酶体逃逸过程也起主要作用，连接链决定了阳离子脂质体的化学稳定性和生物可降解性，疏水尾部影响脂质行为，其既为脂双层提供足够的流动相，又能促使阳离子脂质体在体内的脂质融合。脂质体的新型脂质成分的生物分析主要使用LC/MS平台进行，但是由于LNP成分复杂、同分异构体多，在进行体内分析时，易受到体内内源性成分的干扰，对方法提出的挑战较大。在分析过程中需要格外注意其因自身特殊结构可能导致的非特异性吸附、与色谱柱结合强及提取回收率差等问题。药明康德DMPK在新型脂质分析方面具有丰富经验，将在未来的公众号中与大家详细分享。3表达蛋白生物分析根据研究目的和研究阶段的不同，表达蛋白的分析可以使用基于显微成像的IHC，也可以使用传统Western blot或基于LBA平台的绝对定量方法（ELISA或MSD等）。如下表列出相应平台的优缺点。目前基于LBA平台检测可以根据待测蛋白的大小以及关键试剂的可获取性，开发夹心法ELISA或者竞争法ELISA绝对定量各类体液和组织中的表达蛋白。并且药明康德DMPK目前有基于Hamiltion移液平台的自动化ELISA工作站，可以全天候24小时工作，可快速筛选抗体对及优化抗体工作浓度。表3. 不同分析平台对于mRNA表达蛋白分析的优缺点4免疫原性分析由于mRNA药物的成分相对比较复杂，免疫原性的产生可能由于不同的组分引起，因此需要考虑不同组分的不同免疫原性。这里以LNP载体的mRNA药物为例，免疫原性的考察通常包括如下三个部分，对表达蛋白的免疫原性分析，对mRNA本身的免疫原性分析，以及对于载体（特别是PEG）的免疫原性分析。普遍认为mRNA本身的免疫原性很低，较难引起抗药抗体的产生，但是其序列可能引起特定TLR的激活，可能造成特定免疫通路的激活，通常可在临床前阶段留样待测，并无法规强制要求考察。载体的免疫原性根据载体的不同通常差异较大，目前常用的LNP载体通常认为是免疫原性很低的载体，以LNP本身制备ADA阳性对照（Positive control）比较困难，一般情况下不考察LNP总体的免疫原性。但是值得注意的是LNP上通常有PEG脂质，其中的PEG修饰成分是潜在的引起免疫原性的物质，并且机体可能存在预存anti-PEG抗体（pre-existing anti-PEG antibodies）也会造成药物清除速度加快等情况。因此通常对于LNP载体的mRNA药物，会建议考察其PEG成分的免疫原性。还有一个很重要的潜在免疫原性来源是mRNA药物表达的蛋白，mRNA药物表达蛋白由于蛋白序列和折叠方式可能与内源性蛋白存在差异，因此会有潜在的免疫原性风险。并且由于mRNA蛋白的表达量和持续表达时间等因素，可能也会增加潜在的免疫原性风险。对于mRNA以及载体的免疫原性，通常使用ADA直接法（ADA direct assay）检测，表达蛋白的免疫原性检测则通常使用ADA桥接法（ADA bridge assay）检测。检测形式示意图如下所示。图7. mRNA免疫原性分析检测形式示意图，通常针对mRNA本身以及载体的免疫原性分析使用ADA direct assay format，而针对mRNA表达蛋白免疫原性使用ADA bridge assay format5mRNA药物生物标记物分析mRNA药物临床前的生物标志物分析主要包括：免疫反应分析（其中包括免疫细胞分型分析、细胞因子/免疫因子分析以及免疫球蛋白亚型分析）、效应蛋白相关通路生物标志物分析等。对于mRNA疫苗或mRNA治疗性药物，其生物标志物的分析侧重点不同。总体上生物标志物的分析主要集中在对于mRNA药物的药效和安全性的评估、生物标志物的选择以及分析方法的确证内容上，遵循以研究目的为导向（fit for purpose）的设计。DMPK目前针对常见的免疫细胞分型分析、细胞因子/免疫因子分析以及免疫球蛋白亚型分析等都有成熟的确证后的方法可以直接使用。并且针对效应蛋白相关通路生物标志物分析等，可以设计开发并且确证高灵敏度的LBA分析方法，灵敏度低至1pg/mL。图8. mRNA药物相关生物标志物分析示意图，包括免疫反应分析和效应蛋白下游通路生物标志物分析等结语mRNA药物理论上可以通过核糖体表达系统翻译成任何蛋白/肽段，具有开发各类mRNA疫苗或治疗性药物的可能，并且具有发展个性化药物（Personalized medicine）的潜力。随着COVID-19 mRNA疫苗的大获成功，对于mRNA疫苗或治疗性药物的研发热情也在不断高涨，相对于传统的大分子药物，mRNA药物结构更加复杂，其ADME、有效性以及安全性的研究内容相对更加复杂，涉及到的生物分析平台和策略也更多，考虑到mRNA药物设计之间的差异，不同的mRNA药物也需要为其量身定制合适的生物分析方法。参考文献：[1] Sahin, Ugur, Katalin Karikó, and Özlem Türeci. "mRNA-based therapeutics—developing a new class of drugs." Nature reviews Drug discovery 13.10 (2014): 759-780.[2] Qin, Shugang, et al. "mRNA-based therapeutics: powerful and versatile tools to combat diseases." Signal transduction and targeted therapy 7.1 (2022): 166.[3] Palmer, Michael, and Sucharit Bhakdi. "The Pfizer mRNA vaccine: pharmacokinetics and toxicity." Letsbfree. Com (2021).[4] Vavilis, Theofanis, et al. "mRNA in the Context of Protein Replacement Therapy." Pharmaceutics 15.1 (2023): 166.[5] Henderson, Neil, and Amanda Wilson. "Measurement of mRNA therapeutics: method development and validation challenges." Bioanalysis 11.21 (2019): 2003-2010.[6] Moderna 2022 Science Day presentation.[7] Wissel, Mark, et al. "Recommendations on qPCR/ddPCR assay validation by GCC." Bioanalysis 14.12 (2022): 853-863. （下滑查看更多）作者：周毛天，颜欢，卢金莲，宋苗苗，刘欢（SD），邢丽丽编辑：钱卉娟设计：倪德伟，张莹莹免责声明“药渡”公众号所转载该篇文章来源于其他公众号平台，主要目的在于分享行业相关知识，传递当前最新资讯。图片、文章版权均属于原作者所有，如有侵权，请及时告知，我们会在24小时内删除相关信息。微信公众号的推送规则又双叒叕改啦，如果您不点个“在看”或者没设为"星标"，我们可能就消散在茫茫文海之中~点这里，千万不要错过药渡的最新消息哦！👇👇

*仅供医学专业人士阅读参考我们知道，肿瘤除了有“良恶”之分，还有“冷热”之分。所谓的“冷”肿瘤，是指在肿瘤微环境中CD8阳性T淋巴细胞等免疫细胞不能有效地浸润肿瘤，以免疫检查点抑制剂（ICI）为代表的免疫治疗通常对其无效；而“热”肿瘤，与之相反，肿瘤微环境中CD8阳性T淋巴细胞等免疫细胞可以有效地浸润肿瘤，对ICI治疗非常敏感。近日，山东大学齐鲁医院李涛团队、北京协和医院赵海涛团队、山东第一医科大学附属肿瘤医院刘杰团队联合发表了一篇文章，他们在分析了四个ICI队列和TCGA泛癌队列后发现，存在组蛋白赖氨酸N-甲基转移酶2（KMT2）突变的患者更容易从ICI治疗中获益（具体表现为总生存期[OS]、无进展生存期[PFS]更长，客观缓解率[ORR]更高）。他们还发现，之所以KMT2突变的患者能从ICI治疗中获益，正是因为KMT2突变的肿瘤微环境整体偏“热”，表现出了更强的免疫原性，肿瘤浸润的免疫细胞更多，免疫细胞毒性更强，更有利于免疫治疗。此外，单因素和多因素分析均显示，KMT2突变情况还可以作为ICI治疗效果的有效预测因子。研究发表在Molecular Cancer上[1]。论文首页截图组蛋白甲基化是一种常见的DNA修饰，在调控染色质结构、基因转录过程中发挥着重要的作用。常见的甲基化主要发生在组蛋白H3、H4的精氨酸和赖氨酸残基上，其添加和去除受KMT2家族成员催化。KMT2家族成员共有6个，其中主要的几个亚型分别为KMT2A、KMT2B、KMT2C和KMT2D。近年来，有研究发现，KMT2突变经常出现在多个癌种中，这些突变破坏了组蛋白甲基化，导致DNA损伤修复和基因表达失调，进一步促进了肿瘤的发生和发展。但也有研究指出，正是这种基因组的不稳定性反而增强了肿瘤的免疫原性，提高了肿瘤对ICI治疗的敏感度。不过这些研究通常局限于单个癌种，KMT2突变对免疫治疗的影响是否存在于多个癌种中还不清楚。在本研究中，研究人员先是在TCGA泛癌队列中对KMT2家族的突变频率进行了分析。结果发现，在各种癌症中，KMT2家族的突变率均很高，其中黑色素瘤最高，突变率超50%。在KMT2家族成员中，突变率最高的是KMT2C和KMT2D（约为10%），其次是KMT2A和KMT2B（约为6%）。这一发现也证实，KMT2突变的确普遍存在于多个癌种中。KMT2突变频率接下来，为了评估KMT2突变是否与患者接受ICI治疗后的疗效有关，研究人员汇总了四个有关ICI治疗的临床队列，共纳入2069例患者，涉及10种癌症类型。根据KMT2突变状态，研究人员将患者分为KMT2-MUT组和KMT2-WT组，另外，研究按照KMT2亚型的不同，进一步将KMT2-MUT组细分为KMT2（A、B、C、D）-MUT组。结果发现，与KMT2-WT组相比，KMT2-MUT组患者有着更高的肿瘤突变负荷（TMB），这也意味着KMT2-MUT组新抗原产生的更多，肿瘤免疫原性更高。临床结果分析显示，KMT2-MUT组在OS（中位：34个月 vs. 16.4个月，P<0.001）、PFS（中位：9.1个月 vs. 3.5个月，P=0.002）、持久临床益处（DCB，54.1% vs. 32.6%，P<0.001）和ORR（40.6% vs. 22.0% P<0.001）上的表现均显著优于KMT2-WT组。在KMT2（A、B、C、D）-MUT组中，研究人员在KMT2（A、B、C、D）-MUT组中也观察到了类似的结果。两组患者的主要临床结果此外，单因素和多因素分析均显示，KMT2突变是接受ICI治疗患者预后的有效预测因子。以上结果也提示，KMT2突变的患者能从ICI治疗中获益。为了进一步观察为什么KMT2突变的患者能从ICI治疗中获益，研究人员对KMT2-MUT组和KMT2-WT组患者肿瘤微环境中免疫细胞浸润水平和免疫细胞数量进行了探讨。结果显示，在免疫浸润方面，通过像DNA甲基化阵列测量的白细胞分数这样的4种评估免疫细胞浸润水平的方法，研究人员发现，与KMT2-WT组相比，KMT2-MUT组肿瘤明显有着更高水平的免疫细胞浸润。4种评估免疫细胞浸润水平的方法在免疫细胞数量上，研究人员同样观察到，KMT2-MUT组患者肿瘤微环境中有着更多的CD8阳性T细胞，一些趋化因子，如CXCL9和CXCL10的表达水平也更高。免疫亚型鉴定出KMT2-MUT肿瘤微环境偏“热”。KMT2-MUT组患者肿瘤微环境变化此外，细胞毒性评估显示，KMT2-MUT肿瘤具有更强的免疫细胞毒性。大多数白细胞、淋巴细胞和免疫活性相关的因子在KMT2-MUT肿瘤中的表达水平也较高。同样，类似的结果在KMT2（A、B、C、D）-MUT组中可以观察到。这也解释了为什么KMT2-MUT患者对ICI治疗更敏感的原因。总之，该研究发现，KMT2突变不仅会让肿瘤微环境偏“热”，有助于ICI治疗，还能在多种癌症中预测ICI治疗的疗效。本文作者认为，这一研究结果的意义在于，肿瘤微环境的变化可以改变免疫治疗的疗效，并最终为个体化治疗策略的开发提供指导建议。参考文献：[1]Wang, DX., Long, JY., Li, RZ. et al. Mutation status of the KMT2 family associated with immune checkpoint inhibitors (ICIs) therapy and implicating diverse tumor microenvironments. Mol Cancer 23, 15 (2024). https://doi.org/10.1186/s12943-023-01930-8.本文作者丨张金旭