Phosphatidylserine

内容来源：小药说药 前言 在肿瘤免疫治疗中，免疫系统主要诱导细胞毒性淋巴细胞的细胞溶解作用来抑制疾病的进展。然而，肿瘤微环境中的CD8+T细胞往往因为持续的抗原刺激，发生耗竭。耗竭的CD8+T细胞持续存在，但逐渐失去其效应器功能、细胞毒性和增殖能力，导致免疫监视功能低下。 耗尽的CD8 T细胞通常表达一整套抑制性免疫检查点受体（ICR），由同源配体触发，通过下游信号通路调节T细胞反应。在耗竭的CD8+T细胞中，阻断ICR和免疫检查点配体（ICL）之间的相互作用是恢复CD8+T细胞的可行策略。考虑到肿瘤微环境中T细胞与其他免疫细胞之间的广泛相互作用，免疫细胞上的免疫检查点配体表达在促进抗肿瘤免疫应答方面与肿瘤细胞上的ICL表达同样重要。因此，有必要深入了解这些ICL，以及哪些因素导致ICL表达的患者间差异。 PD-1的配体 PD-1介导的T细胞抑制可归因于PD-1的两种众所周知的配体，即PD-L1和PD-L2（B7-DC、CD273）。 PD-L1 相比PD-L2，PD-L1是PD-1更主要的配体。肿瘤细胞的PD-L1表达通常发生在恶性转化过程中，然而，除了导致PD-L1在肿瘤细胞中组成性表达的内在因素外，肿瘤微环境中的外在因素也可促进PD-L1的表达，如营养缺乏、代谢物积累和缺氧。 炎症性肿瘤微环境提供了调节PD-L1表达的各种因子。IFN-γ主要由效应T细胞和NK细胞分泌，是各种肿瘤细胞PD-L1最有效的诱导剂。在机制上，IFN-γ诱导的PD-L1上调是通过JAK1/2–STAT1激活介导的，最终由干扰素调节因子1（IRF1）与PD-L1启动子直接结合。除干扰素外，其他炎症介质也调节PD-L1的表达，如TNF-α、IL-6、IL-27、TGFβ等。 肿瘤浸润性免疫细胞表达的PD-L1通过多种机制促进免疫逃逸。在抗原呈递细胞（APC）上表达的PD-L1，包括树突状细胞和巨噬细胞，与表达PD-1的T细胞或共刺激分子CD80顺式相互作用传递抑制信号。此外，来自活化T细胞的PD-L1与其他T细胞或巨噬细胞上表达的PD-1结合，后者促进M2极化。T细胞上表达的PD-L1本身作为受体，可导致活化T细胞的无能状态或凋亡。 PD-L2 作为PD-1的第二配体，PD-L2也赋予PD-1抑制功能，尽管其机制尚不完全清楚。PD-L2以比PD-L1更高的亲和力与PD-1结合，PD-L2的表达最初被认为仅限于树突状细胞或巨噬细胞，但最近的研究表明PD-L2的表达没有以前认为的那么受限制，已有报道表明其表达在许多人类恶性肿瘤中。 与PD-L1一样，PD-L2在肿瘤细胞中通过IFN-γ诱导上调，IFN-β通过促进STAT3与PD-L2启动子的相互作用也具有类似的作用。此外据报道，Th2型细胞因子IL-4和IL-13也可诱导食管腺癌中PD-L2的表达。 在免疫细胞中，IFN-γ和Th2细胞因子参与PD-L2的表达。粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）是巨噬细胞和树突状细胞中PD-L2的诱导剂。此外，常见的γ链细胞因子，如IL-2、IL-15和IL-21，可在单核细胞或巨噬细胞中诱导PD-L2表达。 TIGIT的配体 TIGIT是一种抑制性受体，主要由NK细胞、调节性T细胞、记忆性T细胞和耗竭的CD8 +T细胞表达。人TIGIT可与三种配体结合，即脊髓灰质炎病毒受体（PVR，NECL5，CD155）、PVR相关2（PVRL2，NECIN2，CD112）和PVR相关3（PVRL3，NECIN3，CD113），其中PVR对TIGIT的亲和力最高。PVR/TIGIT结合通过磷酸化TIGIT胞内段的免疫受体酪氨酸基抑制基序（ITIM）或干扰PVR/DNAX相关分子1（DNAM-1，CD226）结合抑制T细胞反应。 PVR是一种粘附分子，在许多类型的实体和血液系统恶性肿瘤中过度表达，其过度表达与不良预后相关。PVR是连接蛋白和连接蛋白样（Necl）分子家族的成员，并参与各种生理过程，包括细胞间粘附、运动、增殖和分化，其过度表达可能以肿瘤细胞固有的方式产生促肿瘤作用。同时，致癌的RAS/RAF/MEK/ERK信号通路通过激活蛋白-1（AP-1）与小鼠成纤维细胞中PVR启动子的直接结合来上调PVR的表达，但尚不清楚RAS/RAF/MEK/ERK信号是否也增加了人类肿瘤细胞中PVR的表达。 然而，就抗肿瘤免疫反应而言，PVR过度表达是否具有促肿瘤或抗肿瘤作用仍不确定。在调节抗肿瘤免疫反应时，PVR可与三种不同的受体结合——DNAM-1、TIGIT和CD96，根据其结合的受体，可能会产生矛盾的效应。许多研究表明PVR是NK细胞功能的刺激因子，然而，鉴于TIGIT与PVR的结合亲和力高于DNAM-1，且TIGIT在肿瘤浸润淋巴细胞上高度表达，因此，肿瘤细胞上的PVR表达如何影响体内效应细胞需要进一步研究。 TIM-3的配体 TIM-3是T细胞耗竭的标志，是免疫治疗中最常见的靶点之一。Tim-3有四种配体：半乳糖凝集素-9（Gal-9）、磷脂酰丝氨酸（PtdSer）、高迁移率族蛋白盒1（HMGB1）和癌胚抗原相关细胞粘附分子1（CEACAM1）。 其中，Gal-9和CEACAM1通过从TIM-3分离HLAB相关转录物3（BAT3）来减弱TCR信号，并最终导致细胞凋亡。此外，TIM-3和CEACAM1之间的细胞内相互作用支持TIM-3的成熟和表面转运。因此，T细胞内缺乏CEACAM1会导致TIM-3在细胞内积聚，并且无法与配体相互作用，从而使T细胞从TIM-3介导的抑制中释放出来。 另一方面，暴露在凋亡细胞外小叶上的PtdSer可触发CD8+树突状细胞或巨噬细胞亚群上表达的TIM-3并诱导吞噬作用。而HMGB1，一种报警蛋白，可以释放到肿瘤微环境中，与游离DNA形成复合物，复合物的形成有助于DNA内化到树突状细胞中以激活内体TLR。而TIM-3结合HMGB1可抑制复合物的形成和随后的树突状细胞激活。迄今为止，已知TIM-3与PtdSer或HMGB1之间的相互作用间接影响T细胞功能，但PtdSer或HMGB1是否直接影响表达TIM-3的T细胞还有待研究。 LAG-3的配体 迄今已发现了五种LAG-3配体：MHC II、半乳糖凝集素-3（Gal-3）、肝窦内皮细胞凝集素（LSECtin）、α-突触核蛋白原纤维（α-syn）和纤维蛋白原样蛋白1（FGL1）。与其他配体不同，LAG-3结合α-syn与神经系统中病理性α-syn纤维的细胞间传递有关，与免疫反应无关。 尽管有报道称，LAG-3可以高亲和力结合MHCII，并通过阻止MHCII和CD4之间的相互作用来调节CD4+T细胞，但最近的研究表明，LAG-3与MHCII/肽复合物（pMHCII）的结合通过转导抑制信号抑制CD4+T细胞。 此外，研究还发现，大量表达pMHCII的APC通过LAG-3依赖机制抑制CD8+T细胞的激活。另外，其他配体包括Gal-3、LSECtin和FGL1与LAG-3结合，都可以对肿瘤微环境中的CD8+T细胞进行负性调节。 肿瘤内CD8+T细胞和基质细胞是Gal-3的主要来源，但Gal-3也可由多种类型的肿瘤细胞分泌。LSECtin或FGL1在正常生理条件下在肝脏中表达，在一些肿瘤细胞中高度上调。在肿瘤细胞中通过IL-6或IL-10可诱导LSECtin表达，或通过IL-4也可以在人类单核细胞来源的树突状细胞中诱导LSECtin表达。此外，L-6还增加人肝癌细胞中的FGL1的表达。未来的研究需要验证这些配体的精确分子机制以及它们在LAG-3介导的T细胞抑制中的作用。 VISTA的配体 对于VISTA配体的研究长期处于空白状态。然而，目前多个已发表的研究都强调了潜在的VISTA配体。最近，一项研究确定VSIG3（或 IgSF11）为VISTA配体，这种相互作用有助于抑制T细胞反应。由于VSIG3在造血细胞中的表达是无法检测到的，这种相互作用在体内的生理相关性仍有待验证。 此外，有研究发现，VISTA和P-选择素糖蛋白配体-1（PSGL-1）之间存在pH依赖性相互作用。研究人员强调了VISTA细胞外结构域的一个独特特性，它富含组氨酸残基。组氨酸的侧链在酸性pH条件下发生脱质子化，例如在TME中发现的侧链，这种翻译后修饰允许与 PSGL-1 结合。鉴于VISTA多聚体（包括 VISTA-Fc）只在酸性条件下与白细胞结合，这种翻译后修饰在决定VISTA配体相互作用中的重要性是不可低估的。 对这一发现的热情有多种原因。首先，PSGL-1和VISTA在调节T细胞活性和肿瘤免疫方面的作用越来越受到重视。其次，pH 和离子环境是调节免疫受体相互作用的一个新的和有价值的概念。这在离子环境在明显影响T细胞免疫命运的肿瘤中尤为重要。更重要的是，这项研究提出了一种创新的策略来构建pH选择性抗体，即配体只针对pH失调的部位（如肿瘤）。 小结 在肿瘤微环境中，肿瘤细胞通过诱导表达和调控不同的ICR和ICL，建立了一个适宜生长的环境。随着肿瘤的发展，ICRs同时受到共同因素的诱导，而相应ICLs的表达具有重叠但独立的调控。此外，肿瘤微环境中存在多种调节因子，每种调节因子都可能对ICL表达产生不同的影响。 由于ICL表达模式可能指示免疫检查点途径的活动，个体间ICL的差异表达谱可用于预测免疫检查点阻断的治疗反应。例如，许多研究表明PD-L1表达与PD-1阻断剂的治疗反应相关。因此，通过识别基于ICL的稳健生物标记物，有可能实现更高的应答率和精确的免疫治疗。 参考文献： 1.Perspectives on immunecheckpoint ligands: expression, regulation, and clinical implications. BMB Rep. 2021Aug 31; 54(8): 403–412. 药渡媒体商务合作 媒体公关 | 新闻&会议发稿 张经理：18600036371（微信同号） 点击下方“药渡“，关注更多精彩内容 免责声明 “药渡”公众号所转载该篇文章来源于其他公众号平台，主要目的在于分享行业相关知识，传递当前最新资讯。图片、文章版权均属于原作者所有，如有侵权，请及时告知，我们会在24小时内删除相关信息。 微信公众号的推送规则又双叒叕改啦，如果您不点个“在看”或者没设为"星标"，我们可能就消散在茫茫文海之中~点这里，千万不要错过药渡的最新消息哦！👇👇👇

引言 磷脂酰丝氨酸（PS）是细胞膜中最丰富的带负电荷的磷脂，在细胞膜结构、细胞凋亡、血液凝固和病毒感染等生理过程中发挥关键作用。在哺乳动物细胞中，PS的生合成发生在内质网中，磷脂酰丝氨酸合成酶（包括PSS1和PSS2）通过钙离子依赖的方式利用丝氨酸将磷脂酰胆碱（PC）或磷脂酰乙醇胺（PE）的极性头基替换，生成PS【1】。PSS1的功能获得性突变会显著增加PS的产量，并引起名为Lenz-Majewski综合症（LMS）的罕见遗传病，其特征包括智力障碍和骨骼发育不良【2】。最新研究表明，PSS1特异性抑制剂在PTDSS2缺乏的癌症和B细胞淋巴瘤的治疗中显示出潜在的应用价值【3,4】。 低密度脂肪蛋白（LDL）通常被称做“坏”胆固醇，LDL在血液中的积累会引发心脑血管疾病和中风。目前，关于治疗高血脂的药物主要作用在增加细胞表面的LDL受体，提高LDL的吸收来减少其在血液中的积累。2020年，1985年诺贝尔奖生理学或医学奖得主Mike Brown 和Joe Goldstein的研究组发现PSS1调控LDL中的胆固醇从细胞膜转运至内质网的过程，其缺失会导致胆固醇在细胞膜上的积累【5,6】。关于PSS1催化PS合成的分子机制、特异性抑制剂的作用机制以及其在LDL代谢调控中的作用仍然不明确。 2024年8月28日，美国德州大学西南医学中心李晓淳研究组在Cell杂志上发表了题为Molecular insights into Human phosphatidylserine synthases 1 reveal its inhibition promotes LDL uptake的研究论文。该研究首次报告了人源PSS1的2.7 Å分辨率的冷冻电镜结构。 PSS1包含10个跨膜螺旋呈现出此前未报道过的拓扑结构。其第1至3和9个跨膜螺旋参与形成二聚化界面，第4至8个跨膜螺旋在内质网腔内侧参与形成催化活性中心，并在其中观察到了内源的底物PE和钙离子。此外，在活性中心的另一侧观察到了两个PS的结合位点，这些位点与LMS致病性功能获得性突变（L265P和P269S）相关。功能研究和分子动力学模拟表明，PS通过变构调节的方式抑制PSS1的催化活性。通过对突变体P269S的结构分析表明，在无PS结合的情况下，PSS1会发生构象变化使得底物磷脂和丝氨酸更容易进入催化活性中心。进一步功能研究表明PSS1利用催化残基组氨酸来激活被钙离子稳定的丝氨酸来完成磷脂头的交换反应。这个反应机理与其研究组发现的MBOAT家族的催化机制类似【7,8】。 通过对PSS1与其特异性抑制剂DS55980254复合物结构的解析，作者观察到抑制剂结合在催化中心旁边的口袋。序列比对分析和分子模拟等实验阐明了抑制剂的特异性和与PS类似的变构调节机理。他们的研究进一步揭示，PSS1缺失会导致内质网胆固醇浓度下降，导致SREBP-2途径的激活。细胞实验表明PSS1抑制剂能够显著提高细胞表面LDLR的数量，从而促进LDL的摄取。与目前广泛应用于临床的他汀类药物不同，DS55980254不会抑制胆固醇合成酶羟甲基戊二酸单酰辅酶A（HMGCR）的活性，也不会导致HMGCR在内质网的积累，有可能避免他汀药物所产生的副作用。由于细胞中还广泛存在PSS2，特异性抑制PSS1的活性也不会导致细胞因PS缺失而死亡。这些发现阐述了通过调控磷脂代谢来控制胆固醇吸收的概念，为开发新型降胆固醇药物提供了理论依据。 模式图（Credit: Cell） 参考文献 1. J. E. Vance, Historical perspective: phosphatidylserine and phosphatidylethanolamine from the 1800s to the present. Journal of lipid research 59, 923-944 (2018). 2. S. B. Sousa et al., Gain-of-function mutations in the phosphatidylserine synthase 1 (PTDSS1) gene cause Lenz-Majewski syndrome. Nature genetics 46, 70-76 (2014). 3. J. Omi et al., Phosphatidylserine synthesis controls oncogenic B cell receptor signaling in B cell lymphoma. The Journal of cell biology 223,  (2024). 4. Y. Yoshihama et al., Potent and Selective PTDSS1 Inhibitors Induce Collateral Lethality in Cancers with PTDSS2 Deletion. Cancer research 82, 4031-4043 (2022). 5. M. N. Trinh et al., Interplay between Asters/GRAMD1s and phosphatidylserine in intermembrane transport of LDL cholesterol. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 119,  (2022). 6. M. N. Trinh et al., Last step in the path of LDL cholesterol from lysosome to plasma membrane to ER is governed by phosphatidylserine. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 117, 18521-18529 (2020). 7. T. Long, Y. Sun, A. Hassan, X. Qi, X. Li, Structure of nevanimibe-bound tetrameric human ACAT1. Nature 581, 339-343 (2020). 8. Y. Liu et al., Mechanisms and inhibition of Porcupine-mediated Wnt acylation. Nature 607, 816-822 (2022). https://doi.org/10.1016/j.cell.2024.08.004 责编|探索君 排版|探索君 文章来源|“BioArt” End 往期精选 围观 一文读透细胞死亡(Cell Death) | 24年Cell重磅综述（长文收藏版） 热文 Cell | 是什么决定了细胞的大小？ 热文 Nature | 2024年值得关注的七项技术 热文 Nature | 自身免疫性疾病能被治愈吗？科学家们终于看到了希望 热文 CRISPR技术进化史 | 24年Cell综述

摘要：液体活检是一种通过血液、唾液和尿液等生物液体进行微创检测的革命性策略，用于癌症的诊断和预后预测。外泌体是细胞外囊泡（EVs）的一个子集，它们在供体细胞和受体细胞之间穿梭分子货物，并在调节细胞间通讯中发挥着关键作用。越来越多的研究表明，外泌体有很大的潜力作为液体活检中的新型生物标志物，因为大量的外泌体富集在体液中，并参与了许多生理和病理过程。然而，外泌体在临床应用中的进一步发展受到高质量分离和组分分析方法缺乏的极大限制。本综述旨在提供关于外泌体分离、表征和内容检测的传统和新型技术的全面概述。此外，总结了外泌体作为液体活检中潜在生物标志物在癌症诊断、治疗监测和预后预测中的作用。最后，评估了将基于外泌体的液体活检应用于精准医学的前景和挑战。 1.引言 癌症是全球主要的死亡原因之一。越来越多的证据表明，癌症的发展是一个动态过程，涉及多种组分，包括肿瘤细胞、基质细胞和免疫细胞。到目前为止，组织活检被认为是癌症诊断的最常用方法。然而，提取的少量组织无法代表肿瘤的异质性或监测动态的肿瘤进展，并且这种侵入性方法可能会增加转移的潜力，最终导致生存和预后不良。由于微创性，液体活检通过收集血液和尿液等生物液体的样本，已经引起了广泛关注，并为癌症诊断和实时监测创造了更多机会。外泌体，直径为40-160纳米，是由大多数细胞积极释放并在体液中稳定循环的脂质双层膜囊泡。最初被低估为细胞废弃物的运输工具，外泌体现在被认识到是细胞间通讯的重要参与者。积累的证据表明，包括核酸、蛋白质和脂质在内的各种生物活性分子富集在外泌体中，并且可以从供体细胞转移到受体细胞，导致信息的细胞内转移。外泌体中的生物活性货物可能被受体细胞摄取，促进肿瘤发生和进展。此外，外泌体参与了前转移生态位的形成、肿瘤血管生成和肿瘤免疫抑制。而且，外泌体可以反映其亲本细胞的生理和病理状态的改变。这些发现导致了分析循环外泌体及其衍生货物可能为癌症液体活检提供新机会的想法（见图1），突显了外泌体作为癌症诊断、进展监测和预后预测的生物标志物的潜力。 图1 外泌体作为液体活检的新靶标。外泌体在体液中富集，并在肿瘤发生、进展和转移中发挥关键作用。与传统的循环肿瘤细胞(CTC)和循环肿瘤DNA(ctDNA)相比，外泌体显示出卓越的特性，如活细胞分泌的囊泡、大量存在和稳定循环。传统和先进的技术已被用于从各种体液中分离外泌体并检测外泌体的载物。特定外泌体分子的检测可能为癌症诊断、进展监测和预后预测提供新策略。 目前，循环肿瘤细胞（CTCs）、循环肿瘤DNA（ctDNA）和外泌体已成为液体活检的三个主要分支。与CTCs和ctDNA相比，外泌体在液体活检中显示出更大的优势。首先，在生物液体中存在大量的外泌体（约10^9个/mL）有助于相对容易地获得囊泡，而每毫升血液样本中只有几个CTCs。其次，外泌体由活细胞分泌，具有来自其亲本细胞的丰富生物学信息。因此，外泌体比ctDNA更具代表性，后者有限地反映了凋亡或死亡肿瘤细胞的信息。第三，由于其脂质双层，外泌体本质上是稳定的，即使在恶劣的肿瘤微环境中也能稳定循环。高生物学稳定性允许长期储存样本以进行外泌体分离和检测。值得注意的是，将外泌体应用于液体活检的一个重大挑战是高效和高纯度的分离，这源于它们的纳米尺度大小和固有的异质性。此外，由于癌症外泌体只占体液中外泌体总数的一小部分，超敏感和特异性检测是发展基于外泌体的癌症诊断的先决条件。迄今为止，已经开发了各种方法用于外泌体分离以及外泌体蛋白和核酸的检测。尽管取得了显著进展，但灵敏度和特异性有限、纯度和通量低仍然是学术研究和实际应用的重大挑战。因此，需要积极研究开发易于操作、高灵敏度和高纯度的外泌体分离和检测平台。在这篇综述中，我们讨论了外泌体分离和检测的最新进展以及它们在临床上的应用，强调了新开发的外泌体分离和检测技术。此外，总结了外泌体作为癌症液体活检中潜在生物标志物的应用。 2.外泌体生物发生和内容物 外泌体是由大多数细胞积极释放的异质群体的膜结构囊泡，可以在许多人体液体中找到，如血液、唾液、眼泪和尿液。外泌体生物发生的过程涉及质膜的内陷、多囊泡体（MVBs）的形成和外泌体分泌。MVBs是由内吞体膜向内膨胀形成的内吞结构。在MVBs内部积累的囊泡，称为腔内囊泡（ILVs），通过MVBs与质膜的融合作为外泌体释放（见图2）。广泛的研究表明，供体细胞衍生的生物活性分子富集在外泌体中，这表明外泌体在遗传信息交换中的关键作用。值得注意的是，与亲本细胞相比，外泌体中特定的RNA组分显示出很大的差异，这可能归因于外泌体形成过程中独特的货物分选过程。货物分选的机制尚不清楚，已报道内吞体分选复合物（ESCRT）依赖方式和ESCRT独立机制参与了这一过程。有趣的是，四跨膜蛋白（CD9、CD63和CD81）、热休克蛋白（HSP60、HSP70）和ESCRT相关组分（Alix和TSG101）已被确认存在于外泌体中，这为它们的识别和检测提供了一定的标记。 图2 外泌体的生物发生、内容物和内化作用。外泌体是由多囊泡体与质膜融合而衍生的囊泡。来自供体细胞的细胞质内容物，如核酸和蛋白质，被分选进入外泌体，并通过内吞作用、吞噬作用、直接融合或直接结合（受体-配体相互作用）的方式传递给受体细胞。 越来越多的研究表明，各种与疾病相关的蛋白质和核酸被装载到外泌体中，并且在不同起源的肿瘤中差异性表达。Hoshino等人指出，通过蛋白质组学分析，血浆衍生的外泌体可以识别特定的癌症类型并区分肿瘤来源。他们发现，51种和19种血浆衍生外泌体蛋白分别在胰腺癌和肺癌中被特异性识别。此外，据报道，卵巢癌中外泌体的CD63高表达，而在肺癌中低表达。CD317和表皮生长因子受体（EGFR）在非小细胞肺癌（NSCLC）衍生的外泌体上高度表达。与健康受试者相比，糖蛋白-1（GPC-1）在胰腺癌患者的血清外泌体中显著增加，并且可以用于早期检测胰腺癌，具有100%的诊断特异性和敏感性。除了蛋白质，如miRNA、mRNA和lncRNA等核酸在外泌体中差异分布，并且可以用作特定的癌症生物标志物。例如，在胶质母细胞瘤患者的血清外泌体中检测到突变型EGFRvIII mRNA。Zhou等人报道，外泌体miR-15a-5p的表达水平在子宫内膜癌中比其他癌症类型高7-19倍。此外，外泌体miR-1247-3p的高表达与肝癌的肺转移正相关，这表明预后不良。鉴于外泌体由活细胞分泌，外泌体中的具体内容物可以反映其亲本细胞的病理生理状态，这使它们成为疾病进展动态监测的有用生物标志物。总的来说，被分选到外泌体中的货物不仅可以为它们的识别提供额外的特征，而且为癌症患者的诊断、治疗监测和预后预测提供了有希望的生物标志物，为液体活检提供了一种新工具。 3.外泌体分离和富集方法 由于独特的形成方式和特定的货物分选过程，外泌体在大小和分子内容上是异质的。从复杂的生物组分中外泌体的分离和富集对于基础研究和临床转化至关重要。到目前为止，已经开发了许多方法，这些方法在分离外泌体的数量和纯度上有显著差异。 4.传统分离方法 4.1.基于超速离心的分离 作为外泌体分离的金标准，超速离心是最常用的方法，包括差速超速离心和梯度密度超速离心。传统的差速超速离心最初由Johnstone等人提出，用于从网织红细胞的培养基中分离外泌体。通常，首先使用低速离心（300 g）去除细胞碎片，然后使用20,000g速度的离心去除其他大囊泡。最后使用高力（100,000g）沉降外泌体。然而，这种方法需要昂贵的仪器，并且存在聚集蛋白的污染。更多的离心周期可以获得更纯净的结果，但会导致更低的回收率。梯度密度超速离心是获得更高纯度外泌体的更好选择。在离心过程中，不同大小的颗粒从两个或多个溶液中分离成不同的层，其密度从上到下增加。基于此，该方法已被应用于分离外泌体，发现它们在密度为1.15到1.19g/mL处浮动。尽管比超速离心具有更高的纯度，但耗时的过程和对大量生物液体的需求大大限制了其在临床应用中的使用。 4.2.基于大小的分离 固定范围直径的特征允许通过基于大小的方法分离外泌体。过滤是使用具有特定孔径的膜过滤器进行外泌体分离的一种基于大小的方法，具有操作简单和有效纯化的优点，但产量低。超滤通常应用于从大量原始材料（如细胞培养基）中浓缩外泌体。目前，超滤与超速离心的结合已被广泛采用，在这种方法中，过滤用于去除细胞和大囊泡，而外泌体的纯化通过超速离心实现。此外，尺寸排除色谱（SEC）可以根据样品的大小和凝胶孔径分离生物分子组分。在分离过程中，大分子早期被洗脱，而小分子或颗粒直接扩散进入孔中。Anita N Böing等人开发了一种基于交联琼脂糖CL-2B柱的SEC协议，该协议可以有效地从无血小板上清液中分离直径大于70nm的外泌体。郭等人表明，CL-6B柱在颗粒产量和外泌体纯度方面比CL-2B柱表现更好。与离心和过滤方法相比，SEC具有温和处理和非破坏性结果的优点。此外，SEC与超速离心的结合可能具有提高的回收率和纯度。 4.3.沉淀技术 对于沉淀技术，使用高度亲水的聚合物与外泌体膜周围的水分子竞争性结合，从而降低溶解度，最终实现外泌体分离的低输入体积。迄今为止，聚乙二醇（PEG）是用于外泌体分离的最常用聚合物。Rider等人提出了一种名为ExtraPEG的外泌体纯化方法，该方法能够快速富集外泌体，并从囊泡中获取足够的内容物以供下游分析。最近，许多依赖沉淀技术的商业试剂盒已经被开发用于外泌体的分离和富集，如ExoQuick™和Total Exosome Isolation。Ding等人的研究表明，与其他试剂盒相比，ExoQuick™能够产生相对较高的外泌体产量。然而，这种方法经常因其高成本和共沉淀蛋白聚集体的污染而受到批评。 5.新的富集方法 外泌体特异性标记物和组分的发现为分离外泌体及外泌体亚群（图3）提供了新的途径。通过针对肿瘤相关蛋白如GPC-1和EpCAM（上皮细胞粘附分子）的特异性抗体和核酸适配体，可以很好地区分癌细胞来源的外泌体和正常细胞来源的外泌体。此外，微珠、微流控芯片和热泳等应用使得外泌体的快速便捷富集成为可能。在这里，我们总结了新方法在外泌体富集中的优势和局限性（表1）。 5.1.免疫亲和富集 由于简单性和特异性的优势，免疫亲和分离策略已被用于许多研究中的外泌体富集（图3A）。例如，张等人制造了一种针对活化微流控芯片的抗CD81功能化外泌体分离方法。杨等人报告了一种通过形成AuNC-外泌体-AuR复合物的三明治结构进行外泌体分离的集成微流控装置（图3Aa）。该装置在30分钟内从5mL尿液样本中获得了5×109个颗粒的产量。然而，捕获的外泌体的解离仍然是一个巨大的挑战，这源于抗原和抗体之间的强亲和力。为了解决这一挑战，康等人开发了一种外泌体特异性双模式免疫过滤（ExoDIF）装置。生物素化的抗CD63抗体固定在内通道表面，该表面依次用3,3'-二硫双磺苏糖咪啶（DTSSP）、生物素化牛血清白蛋白和亲和素处理。结果，从高稀释的细胞培养基中捕获了近87.1%的外泌体。值得注意的是，被捕获的外泌体可以通过DTT（二硫苏糖醇）解离，通过破坏DTSSP中嵌入的二硫键（图3Ab）。 最近，康等人提出了一种EVs on demand芯片（EVOD），通过四氮唑-抗EpCAM/抗EGFR抗体（TzAb）与TCO（反式环辛烯）功能化的微流控表面之间的反应，实现了癌症相关外泌体亚群的捕获。该芯片能够从癌症患者中选择性地比从健康捐赠者中多分离出76%的EGFR+外泌体，显示出对NSCLC早期检测的巨大潜力。孙等人设计了一个有趣的共价化学介导的EV点击芯片，通过多标记鸡尾酒（抗EpCAM、抗ASGPR1（唾液酸糖蛋白受体1）、抗CD147）从血浆样本中识别、富集和回收肝细胞癌（HCC）特异性外泌体（图3Ac）。所提出的外泌体纯化系统实现了超过81%的回收率和超过85%的纯度，为检测肝细胞癌提供了一种新的液体活检工具。尽管意义重大，但这些方法成本高且依赖于标记物。此外，应更多关注捕获外泌体的非破坏性释放。 5.2.磁性分离和富集 基于磁性珠的免疫亲和富集近年来因其便利性和高效率而受到广泛关注（图3A）。通常，外泌体通过抗体修饰的磁性珠被捕获，然后通过磁场力分离。例如，方等人进行了CD63抗体共轭磁性纳米粒子以分离外泌体。此外，新型免疫亲和超顺磁性纳米粒子（IS-NPs）被证明具有高效率，通过β-环糊精（β-CD）和4-氨基偶氮苯（AAB）之间的相互作用将抗CD63抗体与超顺磁性纳米粒子结合（图3Ad）。α-CD，一种从β-CD-AAB包合物中提取AAB的竞争性试剂，被适应用于外泌体的洗脱。结果，在人工模型样本中外泌体的捕获和释放效率分别高达80%和86.5%。与传统分离方法相比，IS-NPs方法显示出更高的产量、更高的纯度以及更好地保留了外泌体的结构和功能完整性。特别是癌症衍生的外泌体亚群的分离可以通过将磁性珠与针对肿瘤特异性生物标志物的抗体结合来实现。罗等人通过免疫亲和磁性珠和基于DNA折纸的核酸适配体进行了外泌体的快速分离和捕获。通过与DNA荧光探针的结合，可以实现外泌体的定量检测。李等人开发了一种均质磁荧光外泌体（hMFEX）纳米传感器，用于从乳腺癌患者的80μL血浆中分离GPC-1阳性外泌体。何等人开发了一个微流控平台，通过将样本与抗EpCAM或抗CA125抗体标记的磁性珠混合来捕获肿瘤衍生的外泌体。总的来说，免疫磁性分离方法有潜力促进快速分离和临床应用的循环外泌体在所需领域的实现。 图3 外泌体分离新技术。A 免疫亲和/免疫磁性富集。版权所有 2020 年 Yang ，2017 年 Kang ，2018 年 Cai ，2020 年 Sun 。B 基于物理特性的分离。版权所有 2017 年 Liu ，2019 年 Sunkara V ，2019 年 Hattori 。C 脂质介导分离。版权所有 2018 年 Xu ，2021 年 Jiang 。D 基于声学的分离/热泳富集。版权所有 2021 年 Tayebi ，2019 年 Liu ，2021 年 Tian 。 5.3.基于物理特性的分离方法 基于尺寸的微流控芯片被用来从大细胞碎片或其他膜状囊泡中分离外泌体（见图3B）。刘等人设计了一个基于尺寸的外泌体全隔离芯片（ExoTIC），其中30-200纳米的外泌体通过多个纳米孔膜被富集和纯化（见图3Ba）。与传统的超速离心和商业PEG沉淀试剂盒相比，ExoTIC从小体积的人类血浆中获得了更多的外泌体产量。然而，膜孔堵塞大大限制了外泌体的连续分离。为了克服这个问题，陈等人引入了一个超快隔离系统，EXODUS，它将双耦合谐波振荡集成到双膜过滤器配置中。通过周期性负压和气压切换，在线性纳米孔阳极氧化铝膜上产生了周期性负压振荡，允许小颗粒（即蛋白质和核酸）和流体通过，而较大的外泌体则留在中心腔室。此外，两对振荡器通过横向波和声流学流动使颗粒重新悬浮到液体中，有效限制了污染和颗粒聚集。此外，切向流过滤（TFF）是一种有效减少孔堵塞潜在技术，由于流向和过滤方向垂直状态。Sunkara等人开发了一个微流控切向流过滤装置，Exodisc，用于从人类血浆和尿液中分离外泌体，与传统方法相比，显示出更好的外泌体产量（见图3Bb）。决定性横向位移（DLD）已被用于外泌体分离，因为不同大小的颗粒在具有特定角度显示的微柱平台上表现出不同的轨迹。Wunsch等人提出了一个纳米尺度的横向位移（nano-DLD）阵列，其中较大的囊泡在阵列中横向位移并被收集在侧通道，而较小的囊泡以之字形从阵列中排出，最终实现尿液来源的外泌体的收集。然而，DLD受到通量低和需要高电压的限制，囊泡的密度和刚度可能会干扰基于DLD的外泌体分离。 5.4.基于脂质的分离 囊泡表面的脂质分子使外泌体捕获得以通过亲和介导（见图3C）。万等人报道了一种脂质纳米探针，用于从血浆中快速分离外泌体。外泌体的脂质双层被生物素标记的1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-聚（乙二醇）（DSPE-PEG）探针标记，其中DSPE通过疏水效应插入外泌体膜，PEG在水相中提供溶解性。NeutrAvidin包被的磁性亚微米颗粒被用于通过亲和素-生物素亲和收集外泌体。结果，仅需要15分钟就能分离外泌体，大大缩短了分离程序。值得注意的是，胆固醇-PEG1000约6.4纳米被认为可以最小化脂质纳米探针表面固定时的空间位阻，从而实现了更高的捕获效率。此外，吸附在囊泡膜上的脂质分子也被应用于捕获外泌体。T细胞膜蛋白4（Tim-4），对磷脂酰丝氨酸（PS）有很高的亲和力，已被证实有助于从血清样本中简单分离外泌体，使快速下游分析更加容易（见图3Ca）。此外，TiO2壳层与外泌体磷酸基团的亲和作用是富集磷酸化肽段的一种新策略。庞等人使用Fe3O4@TiO2纳米颗粒在5分钟内富集和分离外泌体，捕获效率为96.5%。Fe3O4@TiO2纳米颗粒与表面增强拉曼散射（SERS）标签的结合可以同时富集外泌体并实现目标miRNAs的原位鉴定（见图3Cb）。 5.5.基于声学的分离方法 基于声学的微流控是一种简单高效的外泌体分离方法。通常，超声波应用于样本，颗粒根据其物理特性（如大小和密度）经受不同的作用力并被分离（见图3D）。Anson等人利用微米级种子颗粒和纳米颗粒在谐振腔中的超声波散射来富集外泌体。集成的声学装置实现了快速操作、非接触和连续分离尿液和血浆样本中的外泌体。吴等人开发了一个声流学平台，用于直接、无标记、非接触富集全血中的外泌体。该装置集成了两个分离模块，其中一个能够去除直径大于1微米的颗粒，另一个可以从未外泌体和其他颗粒中分离外泌体。最近，顾等人报道了一个声学驱动的旋转液滴装置，其中倾斜的交错换能器（IDTs）被用来根据不同频率的声波使纳米颗粒移动。通过将两个不同大小的液滴放置在一起，可以特别集中固定大小的颗粒。结果，该方法可以从5微升样本中在不到1分钟的时间内分离外泌体。此外，Tayebi等人将声辐射力（ARF）与介电泳（DEP）结合起来，在流动路径中放置高频（>10 MHz）的交错换能器，同时产生ARF和介电泳力场。介质中的颗粒通过流体阻力、ARF和DEP力场之间的竞争呈现横向平移，从而实现了细胞外囊泡的主动分离（见图3Da）。 5.6.热泳富集 热泳是指颗粒通过局部激光加热诱导的温度梯度，从高温区域迁移到低温区域的现象。为了解决耗时的分离和纯化程序的挑战，刘等人开发了一种敏感的热泳方法来富集肿瘤衍生的外泌体。通过使用针对肿瘤特异性标记物的核酸适配体，热泳能够实现快速分离和富集外泌体，而无需预先分离外泌体（见图3D）。外泌体的积累产生了核酸适配体的放大荧光信号，这使得外泌体表面生物标志物的分析以及miRNAs的检测成为可能（见图3Db）。田等人进行了类似的检测，分析了1微升血浆中的外泌体，为转移性乳腺癌的液体活检提供了一种低成本、敏感的方法（见图3Dc）。 6.外泌体表征 如2018年细胞外囊泡研究的最小信息标准（MISEV2018）所建议，外泌体的鉴定应包括西方墨点验证外泌体特异性标记物，并且至少使用两种方法对外泌体单个颗粒进行表征。 6.1.可见表征 透射电子显微镜（TEM）被认为是识别和表征单个外泌体的常用方法，其典型结构为杯状（见图4A）。对于扫描电子显微镜（SEM），通过收集从样本中弹出的电子来呈现图像（见图4C）。值得注意的是，外泌体的形态可能会受到样本处理过程中脱水的影响。相反，冷冻电子显微镜（冷冻-EM）是更好的选择，因为它避免了样本固定和脱水。外泌体在非常低的温度下被分析，并且呈现出与TEM图像不同的圆形结构（见图4B）。此外，原子力显微镜（AFM）可以通过振幅调制和相位调制提供表面形态和材料属性（刚度、粘附性）的信息（见图4D）。而且，特定外泌体膜标记功能化的AFM探针允许单个外泌体中蛋白质的识别和检测。 图4 外泌体表征技术。A 透射电子显微镜。版权所有 2020 年 Li。B 冷冻电镜。版权所有 2018 年 Tian。C 扫描电子显微镜。版权所有 2010 年 Sharma 。D 原子力显微镜。版权所有 2010 年 Sharma。E 动态光散射。F 纳米颗粒追踪分析。G 可调电阻脉冲传感。 6.2.定量表征 动态光散射（DLS）是一种测量外泌体尺寸分布和zeta电位的技术。散射光的干涉和强度变化可以通过传感器识别，从而估计颗粒的尺寸分布（见图4E）。然而，蛋白质聚集体和大囊泡的污染使得DLS很难将它们与外泌体区分开来。纳米颗粒跟踪分析（NTA）是一种广泛用于确定颗粒浓度和尺寸分布的方法（见图4F）。颗粒被一束光照射，散射光信号被光学显微镜收集。可调电阻脉冲传感（TRPS）检测外泌体通过充满导电介质的孔时离子电导率变化产生的电信号（见图4G）。 7.检测外泌体内容物的技术 7.1.传统的蛋白质分析 外泌体中的膜蛋白和细胞质蛋白都可以被检测到。一些外泌体上的膜蛋白参与了癌症的发展和进展，因此被用作外泌体分离和纯化的靶点。西方墨点和酶联免疫吸附测定（ELISA）是检测外泌体蛋白质的两种常规方法。然而，这些方法面临着复杂程序和低灵敏度问题。 8.新的蛋白质检测方法 8.1.比色检测 到目前为止，已经开发出多种新技术来检测外泌体蛋白质（见表2）。比色检测是一种通过比较或测量有色物质的颜色强度来确定组分含量的方法（见图5A）。与其他纳米材料如Fe3O4 NPs和AuNPs类似，DNA具有显著增加单壁碳纳米管（s-SWCNTs）过氧化物酶活性的能力。夏等人开发了一种直观简单的外泌体检测方法。简要地说，CD63核酸适配体提高了s-SWCNTs的微小过氧化物酶活性，并有效地催化了3,3',5,5'-四甲基联苯胺（TMB）的氧化，使无色溶液变蓝。相反，外泌体的加入诱导核酸适配体从纳米管表面释放，溶液的颜色由深变浅，这可以通过肉眼或紫外-可见光谱仪观察到，检测限（LOD）为5.2×105个粒子/μL。如前所述，ZnO-芯片被设计用于有效分离外泌体。在外泌体与一抗混合物（抗CD9/CD63抗体）孵育后，通过HRP（辣根过氧化物酶）标记的二抗识别（见图5Aa）。最后，通过紫外-可见光谱仪或微孔板分析仪获得了最小可检测浓度为2.2×104个粒子/μL。梁等人设计了一个与双膜过滤器和ELISA集成的微流控系统，用于检测膀胱癌患者尿样中外泌体的含量。除了常见的外泌体蛋白，比色法也可以用来检测癌症特异性蛋白。例如，PSA（前列腺特异性抗原）核酸适配体基础传感器被用于在500μL人类血浆中直观检测前列腺癌特异性外泌体。此外，Di等人报告了一种纳米酶辅助免疫吸附测定（NAISA），它能够灵敏和快速地多重分析外泌体蛋白（见图5Ab）。外泌体表面蛋白可以被固定在微孔板表面的抗体特异性捕获并催化比色反应。来自微孔板阅读器的信号强度与目标蛋白的数量成正比。结果，NAISA允许从临床样本中快速分析多种外泌体蛋白，如CD63、CEA（癌胚抗原）、GPC-3（Glypican-3）、PD-L1（程序性死亡配体1）和HER2（人类表皮生长因子受体2）。 8.2.荧光检测 荧光光谱光度法是一种根据荧光光谱线的阳性和强度进行物质鉴定和含量测定的方法（见图5B）。何等人进行了一种微流控芯片，用于检测30μL血浆样本中的表面和腔内生物标志物。该芯片获得了IGF-1R（胰岛素样生长因子1型受体）的显著提高的检测灵敏度，0.281pg/mL的IGF-1R和0.383pg/mL的p-IGF-1R，这比ELISA实现的灵敏度高100倍（见图5Ba）。刘等人开发了一种免疫吸附测定，其中免疫磁性珠被用来捕获外泌体，然后与酶报告分子结合，可以产生用于量化液滴微流控系统中GPC-1+外泌体的荧光信号。魏等人提出了类似的单分子阵列（SiMoa）平台，通过该平台可以超灵敏地检测通用外泌体和肿瘤衍生外泌体，检测限分别为34个粒子/μL和25个粒子/μL。余等人进行了一种基于CD63核酸适配体的检测方法。外泌体上的CD63可以与修饰在磁性珠表面的核酸适配体结合，导致Cy3标记的短序列进入上清液。上清液中的荧光强度用于量化复杂临床样本中的外泌体。氧化石墨烯具有通过荧光共振能量转移（FRET）与荧光染料结合时淬灭荧光的能力。例如，当FAM标记的核酸适配体被吸收到氧化石墨烯膜上时，荧光被淬灭，而目标外泌体与核酸适配体竞争性结合并重新表现出荧光信号，检测限为1.6×105个粒子/mL（见图5Bb）。李等人开发了一种基于聚集诱导发光体（AIEgens）的简便荧光核酸适配体传感器。氧化石墨烯吸收（含有四苯基的叔胺）TPE-TAS/核酸适配体复合物在没有外泌体的情况下允许荧光淬灭。当目标外泌体被引入时，核酸适配体优先与其目标结合，导致TPE-TAS/核酸适配体复合物从氧化石墨烯表面分离，随后出现“开启”的荧光信号。在优化条件下，肿瘤衍生外泌体的线性范围大约为4.0×105个粒子/μL至1.8×107个粒子/μL。 8.3.电化学检测 电化学检测是通过测量样品的电化学势或电流来检测分析物的方法，具有高灵敏度和宽测量范围的优点（见图5C）。近年来，研究人员开发了电化学生物传感器，因为当识别元素如抗体和核酸适配体特异性结合到外泌体时，改变的电化学信号可以量化外泌体。曹等人提出了一种电化学生物传感器，用于准确检测PD-L1+外泌体（见图5Ca）。外泌体首先被抗CD63功能化的磁性珠捕获，然后与抗PD-L1连接的DNA链结合，引入超支化滚环放大（HRCA）。HRCA可以降低环境pH值，导致PVP@HRP@ZIF-8分解并释放HRP，从而产生放大的电化学响应，因此实现了癌症衍生PD-L1+外泌体的识别和检测。这种生物传感器对PD-L1+外泌体显示出宽动态范围（1×103至1×1010个粒子/mL），检测限为334个粒子/mL。Jeongmin等人报告了一种HiMEX方法，该方法集成了磁性外泌体分离和外泌体结合蛋白的电化学检测，经过酶放大。从20μL血浆样本中外泌体中肿瘤生物标志物（EGFR、EpCAM、CD24和GPA33）的联合检测有助于结直肠癌的诊断和监测。电化学方法，特别是基于核酸适配体的生物传感器在检测和分析外泌体蛋白方面显示出巨大潜力。Kashef-Kheyrabadi等人介绍了一种可分离的微流控装置，该装置实现了基于核酸适配体的电化学生物传感方法（DeMEA）。在这个系统中，针对EpCAM的核酸适配体被固定在预先电镀金纳米结构的电极表面，微流控涡旋可以增加外泌体和传感表面之间的碰撞（见图5Cb）。因此，DeMEA能够量化不同阶段乳腺癌患者血浆样本中的外泌体，为癌症特异性外泌体的高度敏感和早期检测提供了一种方法。 图5 新方法检测外泌体内容物。A 比色检测。版权所有 2018 年 Chen，2020 年 Di 。B 荧光检测。版权所有 2014 年 He，2018 年 Jin 。C 电化学检测。版权所有 2020 年 Cao 。2020 年 Kashef-Kheyrabadi L。D SPR/SERS 检测。版权所有 2014 年 Hyungsoon Im ，2020 年 Dong。E 单外泌体检测。版权所有 2019 年 Wang，2019 年 He 。F ddPCR。版权所有 2020 年 Sun ，2021 年 Liu。G 分子信标。版权所有 2016 年 Ji Hye Lee ，2015 年 Ji Hye Lee 。H LSPR 检测。版权所有 2021 年 Wu 。 8.4.表面等离子共振检测 表面等离子共振（SPR）是一种物理光学现象，由金属膜/液体界面处的全反射光引起，用于分析分子间相互作用（见图5D）。Im等人开发了一种基于透射SPR的纳米等离子体外泌体（nPLEX）检测方法，通过周期性纳米孔阵列（见图5Da）进行。每个阵列中的功能化抗体，nPLEX传感器显示出与目标外泌体蛋白水平成比例的光谱移动或强度变化。在另一项研究中，由于等离子体效应，AuNC-Exosome-AuR上观察到显著改善的散射波长移动和散射强度。通过抗LRG1抗体偶联的AuR探针评估了肺癌患者和健康个体尿液中外泌体中LRG1（富含亮氨酸的α-2-糖蛋白1）的差异表达。范等人开发了一种基于SPR成像（SPRi）的生物传感检测方法。抗体（抗CD63/抗EGFR/抗EpCAM）修饰的金芯片与不同识别位点之间的生物亲和相互作用允许对NSCLC衍生的外泌体进行多重表征。这种生物传感器的检测限估计为104个粒子/μL。尽管具有多种优点，但纳米等离子体生物传感器的广泛应用受到纳米结构制造困难的限制。为了解决这一挑战，刘等人开发了一种无需纳米结构的强度调制SPR生物传感器。在这个传感器中，激光的反射强度和参考强度被两个光电探测器记录，并用于量化外泌体蛋白的表达水平，显示出比ELISA更高的检测灵敏度。 8.5.表面增强拉曼散射 表面增强拉曼散射（SERS）能够通过电磁和化学机制增强附着在粗糙金属表面的小型分子的拉曼信号（见图5D）。一种新的检测方法被报道用于外泌体的实时检测和蛋白质分析。通常，镀金的载玻片与3D打印的抗体阵列结合使用，用于捕获外泌体，QSY21包覆的金纳米棒被用作标记剂，用于定量检测目标蛋白。通过这种针对HER2和EpCAM的检测方法，定量确定了乳腺癌患者血浆衍生的外泌体水平。提出的3D打印阵列模板实现了廉价、便携且易于建立的检测平台，为新型癌症液体活检的发展提供了新策略。董等人表明，蛋白质磷酸化状态的分析可能为癌症诊断提供新的可能性（见图5Db）。开发了一种类似蜂巢的Au包覆的TiO2大孔反蛋白石结构，用于在无需任何标记过程的情况下捕获和分析外泌体。1087 cm-1的SERS峰的强度指的是外泌体磷酸化蛋白中的P-O键，且峰强度至少是来自癌症患者的血浆的两倍。然而，上述两种检测方法都需要预先分离外泌体，这大大阻碍了快速分析。庞等人提出了一种简单的免疫分析方法，直接从血清样本中捕获和分析外泌体PD-L1。Fe3O4@TiO2纳米颗粒被设计用于分离外泌体，抗PD-L1抗体修饰的Au@Ag@MBA SERS标签被应用于外泌体PD-L1的标记和SERS检测。这种检测方法在40分钟内成功定量了4μL血清样本中的外泌体PD-L1。 8.6.CRISPR/Cas系统辅助检测 在CRISPR/Cas9系统中，Cas9核酸酶可以通过识别特定的互补双链DNA（dsDNA）含有PAM（protospacer adjacent motif）序列，并通过导向RNA（gRNA）的帮助，高效地剪切dsDNA序列。通过特异性靶向外泌体蛋白的核酸适配体，蛋白质的检测可以转化为核酸的定量。最近，赵等人报告了一种结合了基于核酸适配体的外泌体膜蛋白识别和CRISPR/Cas12辅助的荧光信号放大的检测方法。在这个系统中，CD63核酸适配体特异性地靶向外泌体膜蛋白，触发核酸适配体的构象变化并释放阻断链（与核酸适配体具有互补序列）。释放的阻断链随后被CRISPR/Cas12a识别，导致对TaqMan探针的转剪切，荧光报告团和猝灭团的分离，最终产生放大的荧光信号。结果，这种方法实现了103至107个粒子/μL的线性检测范围，并成功应用于直接检测血浆外泌体，无需超速离心。邢等人开发了一种apta-HCR-CRISPR检测方法，用于从50μL鼻咽癌患者血清中检测循环的核糖体蛋白+或PD-L1+外泌体。核糖体蛋白或PD-L1靶向核酸适配体首先通过HCR（杂交链反应）放大，产生长重复的CRISPR可靶向DNA单元。通过收集CRISPR-Cas12a的旁路剪切活性诱导的荧光信号，该检测方法实现了102个粒子/μL的检测限。李等人进行了类似的检测，用于超灵敏检测CD109+和EGFR+外泌体。CRISPR/Cas系统预计将成为识别和定量外泌体蛋白的敏感工具，并可能有助于癌症的诊断和治疗监测。 8.7.单个外泌体检测 内在异质性是阻碍体液中外泌体分析的主要因素之一。单个外泌体检测可能提供更准确的肿瘤进展信息（见图5E）。郭等人提出了一个ssDNA辅助的单个外泌体检测平台。滚环放大（RCA）有助于从表面蛋白产生放大的荧光信号，使单个外泌体容易可视化，检测限为82个囊泡/μL。此外，刘等人开发了一种λ-DNA和核酸适配体介导的方法，允许通过大小和肿瘤相关标记表达对外泌体进行二维分析。 由于纳米尺寸的外泌体不能通过常规流式细胞术敏感地识别，因此醛/硫酸盐乳胶珠被用来与囊泡结合，然后被荧光抗体染色并对其蛋白标记进行表征。例如，抗GPC-1抗体和Alexa-488标记的二抗被引入到附着外泌体的珠子上，阳性珠子的百分比在此被称为GPC-1+外泌体的百分比。此外，外泌体中表达的EpCAM、HER2和EGFR的检测表明了它们在癌症诊断中的潜在作用（见图5Ea）。此外，纳米流式细胞术的发展为单颗粒的多参数分析提供了新的选择。通过纳米流式细胞术使用免疫荧光标记测量单个外泌体的CD9、CD63、CD81、CD235a、CD45、CD41a和CD144的表达，以评估通过六种不同方法分离的外泌体制备的质量。刘等人使用纳米流式细胞术分析泪液衍生外泌体中CD9、CD63、CD81、CD47、CD45、CD24和EpCAM的表达，并发现泪液中外泌体浓度大约是血浆外泌体的100倍。 9.传统的核酸分析 除了蛋白质载体外，外泌体中也包裹有核酸。RNA是外泌体中主要的核酸载体，已显示出作为癌症诊断和预后预测的特定生物标志物的潜力。然而，检测外泌体核酸的准确性和可行性常受到其低丰度的阻碍。为了定量外泌体核酸的表达水平，已使用了如qRT-PCR（实时定量逆转录PCR）、微阵列和下一代测序（NGS）等技术。尽管qRT-PCR具有高灵敏度，但它只能用于检测已知序列的核酸。NGS有利于高通量发现和定量未知的外泌体RNA转录本。然而，需要解决的不足之处包括高成本、大量数据和构建文库的复杂性。通过杂交探针和目标基因的互补组合，微阵列可以一次分析外泌体中的数千种核酸，但存在灵敏度低的缺点。为了克服这些限制，正在投入更多努力开发高灵敏度和便捷的外泌体核酸检测方法（见表3）。 10.新的核酸检测技术 10.1.ddPCR 液滴数字PCR（ddPCR）是一种技术，其中PCR反应混合物被分成油包水乳液中的数万个水性液滴（见图5F）。每个单独的液滴包含不超过一个目标基因的副本，并根据荧光幅度被标记为阳性或阴性。然后通过泊松分布和阳性液滴的比例估计目标核酸的浓度。ddPCR与qPCR的比较表明，ddPCR在分析尿液外泌体miRNAs方面具有更高的准确性和灵敏度。Chen等人使用ddPCR从胶质母细胞瘤（GBM）患者的血清或脑脊液（CSF）衍生的外泌体中识别IDH1（异柠檬酸脱氢酶1）转录本。在携带突变型IDH1胶质母细胞瘤患者的CSF衍生外泌体中鉴定出突变型IDH1 mRNA，并且在来自肿瘤患者的外泌体中发现IDH1 mRNA的水平高于健康对照组。Sun等人最近使用ddPCR从肝癌（HCC）患者的血浆样本中定量10种HCC特异性mRNA（见图5Fa）。通过计算数字评分评估了HCC外泌体衍生mRNA签名的诊断价值。此外，通过ddPCR检测外泌体miR-15a-5p以区分子宫内膜癌（EC）患者和健康受试者。Shen等人报告说，在与良性肺肿瘤相比，从恶性肺癌患者的EpCAM特异性外泌体中通过ddPCR定量了更多的lncRNAs RP11-77G23.5和PHEX-AS1的拷贝数。 10.2.分子信标 分子信标（MB）是一种发夹状的寡核苷酸，两端分别标记有荧光染料和猝灭剂（见图5G）。MB设计用于与目标序列自发杂交，从而破坏发夹环结构并诱导荧光出现。Lee等人观察到，分子信标与癌细胞和人血清中外泌体中的miRNA-21的杂交获得了高荧光信号（见图5Gb）。此外，通过基于MB的生物传感器从人尿液中外泌体中检测到miR-375和miR-574-3p。人血清中外泌体中miR-21、miR-375和miR-27a的表达水平被检测出来（见图5Ga）。Oliveira等人利用CPP（细胞穿透肽）将MB传递穿过血浆膜，然后检测红细胞（RBC）衍生外泌体中的miRNA-451a。Chen等人设计了一个2'-O-甲基化和硫代磷酸酯修饰的分子信标，用于定量分析人血浆中外泌体miRNA-1246。使用Triton X-100破坏外泌体膜后，探针可以特异性地靶向内部的miRNA-1246并显示定量荧光信号。Zhang等人开发了一个集成的外泌体分离和检测系统，其中外泌体可以通过微流控技术使用少量样本分离。同时，纳米孔检测技术有效地提高了无需放大和荧光标记的肿瘤相关miRNA的检测效率。基于分子信标的生物传感器具有简单程序、无需外泌体预分离和核酸提取的优势，显示出它们在癌症诊断和预后液体活检中的巨大潜力。 10.3.DNA四面体探针 DNA四面体是一种具有高可控性的DNA纳米结构，可以通过化学修饰和DNA自组装提供多样化的放大信号标签。Gao等人进行了一个基于DNA四面体纳米探针的FRET传感平台，用于灵敏地检测不同细胞系中的miR-146b-5p。Chen等人报告了一个发夹四面体纳米探针，用于人血清中外泌体miR-21的定量测量。在没有miR-21的情况下，荧光供体-猝灭剂对的结构导致了低FRET效应，而目标miRNA的存在诱导了干环结构的破坏和强FRET的发生。因此，该检测方法在1×10-12至10×10-9M（摩尔/升）的范围内获得了良好的线性，并检测限为45.4×10-15M。Zhang等人提出了一个类似的基于两个多功能DNA四面体辅助催化发夹组装的电化学生物传感器。通过利用局部反应和级联放大，该传感器能够在30分钟内灵敏地检测肿瘤相关外泌体miRNA，低至7.2 aM。 10.4.局域表面等离子共振 局域表面等离子共振（LSPR）发生在入射光频率与贵金属纳米颗粒或金属导电电子的整体振动频率相匹配时（见图5H）。Joshi等人开发了一种基于LSPR的生物传感器，用于无标记和非破坏性测量外泌体miR-10b。金纳米棱柱通过化学合成到硅烷化的玻璃基底上，然后功能化HS-C6-ssDNA和PEG6-SH。目标miR-10b和HS-C6-ssDNA的直接杂交诱导双链DNA的形成，这可以增加纳米棱柱的折射率并改变LSPR偶极峰的波长（λLSPR）。miR-10b的浓度可以通过ΔλLSPR来评估。该平台足够灵敏，即使在亚阿摩尔浓度范围内，也能区分miR-10b和miR-10a（仅一个核苷酸差异）。Wu等人开发了一种基于SPRi的生物传感器，用于准确诊断NSCLC的多种外泌体miRNAs，其中Au-Ag异质结构和DNA四面体框架被用来增强SPR信号，每种外泌体miRNA都可以被不同SPR信号超灵敏地识别（见图5Ha）。 10.5.基于TIRF的单囊泡成像 作为单外泌体分析方法，全内反射荧光（TIRF）已经出现，为提供有关外泌体异质性的额外信息（见图5E）。He等人提出了一个基于TIRF的单囊泡成像检测方法，该方法将分子信标探针送入外泌体，从而诱导目标miRNA的放大荧光（见图5Eb）。他们对单个囊泡进行了直接可视化和人血清样本中miR-21的原位定量分析，发现这种检测方法在区分癌症患者和健康受试者方面比传统PCR检测方法表现更好。 10.6.热泳辅助检测 Zhao等人开发了一种热泳传感器，用于无需RNA提取或目标放大即可原位检测外泌体miRNA（见图5F）。修饰在纳米孔中的核酸适配体能结合目标外泌体miRNA，诱导荧光的出现。经过热电泳积累后，荧光信号被放大，允许在少量血清样本中灵敏地检测0.36 fM外泌体miRNA。此外，Han等人提出了一种基于DNA四面体的热泳检测（DTTA），实现了血清外泌体中14 aM mRNA的检测限。DNA四面体的两个荧光标记的识别序列被外泌体内化后，可以结合目标mRNA，导致FRET信号增加。热泳效应被应用于进一步放大FRET信号，实现了对外泌体中PSA mRNA的高灵敏度检测。DTTA检测显示，外泌体PSA mRNA在区分前列腺癌和良性前列腺增生方面比血清PSA蛋白表现更好（AUC：0.93对比0.74），为精确检测前列腺癌提供了一种新方法。 10.7.CRISPR/Cas系统辅助检测 最近，CRISPR/Cas系统为开发用于检测和定量外泌体中核酸的分析方法提供了新机会。已经提出了将核酸放大与CRISPR/Cas整合的策略，以提高分析特异性和灵敏度。例如，Wang等人进行了一种名为滚动循环放大辅助CRISPR/Cas9切割（RACE）的平台，用于检测多种外泌体miRNA。在RCA过程中，Padlock探针在HiFi Taq DNA连接酶的存在下识别单碱基差异。由大量重复目标序列和PAM结构组成的长ssDNA的放大产物被Cas9核酸酶特异性识别。因此，与ssDNA杂交的TaqMan探针被Cas9蛋白完全切割，允许“开启”荧光变化，可以方便地通过光谱测量。结果，这种RACE平台可以用于高度特异性地检测人血浆中的单一或多种外泌体miRNA。然而，基因组中大量的天然PAM结构可能增加非目标效应的风险，极大地损害分析的特异性。 11.机器学习 机器学习指的是一种技术，它通过构建已知数据的模型来预测和分析未知数据。作为人工智能的关键分支，机器学习已被广泛用于外泌体生物标志物的多重分析。已经开发了诸如线性判别分析（LDA）、主成分分析（PCA）、神经网络（NN）、支持向量机（SVM）和随机森林（RF）等算法，将多变量数据分类为典型的分类模型，然后应用于未知生物数据的预测和分组。Kawakami等人证明，机器学习算法在预测和诊断上皮性卵巢癌方面比传统的逻辑回归分析表现更好。Wu等人使用尿液衍生外泌体的荧光信号作为输入数据，应用KNN（K-最近邻）和SVM作为机器学习模型，进行外泌体生物标志物分析。通过引入机器学习算法，诊断模型能够对多种疾病进行准确诊断和分类。刘等人使用LDA确定了七个外泌体生物标志物的总签名，这在区分前列腺癌和良性疾病方面取得了高准确性。田等人通过LDA分析了1μL血浆中外泌体的八个与癌症相关的蛋白质的加权和。PCA是一种算法，它通过正交变换将一组可能相关的变量转换为一系列线性无关变量。Shin等人使用PCA探索了细胞外泌体和人血浆外泌体的特征。结果表明，机器学习模型能够以95%的准确率对正常和肺癌细胞系衍生的外泌体进行分类，并在预测整个队列的肺癌方面获得了0.912的AUC。刘等人采用RF、NN和SVM分析了乳腺癌患者的多种外泌体衍生mRNAs，与单一标志物相比，表现出改善的诊断性能。这些研究表明，将外泌体分析与机器学习相结合在癌症液体活检中具有巨大潜力。值得注意的是，典型的机器学习方法需要大型数据集，而临床样本数量有限和数据不足可能导致准确性和可靠性差。更强大机器学习算法的出现将有利于液体活检中外泌体的分析。 12.外泌体在癌症液体活检中的意义 近期研究表明，外泌体在早期诊断、疾病监测和预后预测方面优于CTCs和ctDNA。在此，我们总结了外泌体在多种癌症液体活检中的应用（见图6，表4）。 图6 外泌体在癌症液体活检中的应用。癌症衍生的外泌体富集了差异表达的蛋白质和核酸，并且已被测试作为不同癌症早期诊断、分期分类和预后预测的新生物标志物，突显了它们在癌症液体活检和精准医疗中的重要价值。 12.1.HCC 肝细胞癌是癌症相关死亡的第四大原因。装载在HCC衍生外泌体中的分子签名可用于诊断。发现外泌体miR-21能够抑制HCC细胞的凋亡，并在HCC患者中上调。诸如CEA和GPC-3等外泌体蛋白能够区分HCC患者和健康受试者，可能作为无创癌症诊断的有希望的生物标志物。在包含158个样本的研究中，收集血浆用于检测10个HCC特异性基因，包括甲胎蛋白（AFP）、GPC3、白蛋白、载脂蛋白H等。观察到与非癌症队列相比，通过ddPCR在HCC队列中获得了更高的荧光信号。这10个基因签名通过机器学习进一步计算，显示出在区分早期HCC和有风险的肝硬化方面具有巨大潜力，AUC为0.93。Nakano等人比较了接受肝移植的HCC患者中外泌体miR-92b和循环AFP的表达水平。揭示了外泌体miR-92b能够预测HCC的早期复发，AUC为0.925，而AFP的AUC为0.651。Zhu等人整合了血浆外泌体RNA序列、无细胞RNA序列和TCGA组织RNA序列数据集，以识别5个非编码RNA（circ-0073052、circ-0080695、SNORD3B-1、LINC01226和HULC）作为肝癌的潜在生物标志物。此外，SNORD3B-1、circ-0080695和miR-122的组合面板在将肝癌患者与健康捐赠者分类方面显示出最高的AUC（89.4%），与其他标志物面板相比。通过所选的面板，在测试和验证集中，79.2%的AFP阴性样本和77.1%的早期肝癌样本被成功检测，这表明外泌体RNAs小组在早期诊断肝癌方面的潜力。 12.2.PDAC 作为与胰腺癌进展相关最公认的指标之一，miRNA-10b目前正在被广泛研究用于胰腺导管腺癌（PDAC）的早期诊断。Joshi等人指出，胰腺癌患者、患有慢性胰腺炎（CP）的高危患者和健康个体之间外泌体miR-10b的水平显著不同，这表明miR-10b在诊断胰腺癌和预测可能发展为PDAC的CP患者方面的潜力。Pang小组使用双SERS生物传感器进行一步检测外泌体中的mRNAs，也得出了相同的结论。Melo等人发现，GPC-1+循环外泌体（GPC-1+crExos）在识别PDAC患者与健康个体和慢性胰腺炎方面表现出高特异性和敏感性（AUC=1.0），优于CA199（AUC=0.739）。此外，GPC-1+crExos的水平与手术前后患者的肿瘤负担和生存相关，表明GPC-1作为治疗反应和预后监测的可靠生物标志物的潜力。此外，GPC-1和CD63的组合被证明在将PDAC患者与健康受试者区分开来方面显示出99%的敏感性和82%的特异性。此外，迁移抑制因子（MIF）被报道在区分胰腺癌的不同阶段方面比GPC-1和EGFR表现更好。 12.3.CRC 结直肠癌（CRC）是最常见的恶性肿瘤之一，发病率和死亡率都很高。外泌体中的环状RNA与癌症的发生和发展有关。由于其环状结构，它提供了一个稳定的癌症诊断生物标志物。发现环状RNA-0004771在CRC患者血清外泌体中上调。外泌体circ-0004771的AUC用于从健康对照中识别CRC为0.88，用于区分I和II期患者与其他良性肠道疾病为0.816，这表明circ0004771可以作为结直肠癌的潜在诊断标志物。Wei等人探索了新的外泌体生物标志物，用于结直肠癌的早期诊断和预后。对血浆样本的检测显示，与健康和良性对照相比，CRC患者中CD9、CD63和EpCAM的表达显著更高（分别为0.90和0.96的AUC）。此外，miR-15b、miR-21和miR-31被报道在CRC患者血清外泌体中高度表达。ROC曲线显示miR-15b的AUC为0.86，组合的miR-15b、miR-21和miR-31小组展现出81.21%的敏感性和81.03%的特异性。 12.4.NSCLC 非小细胞肺癌占肺癌引起的死亡的80%以上。与正常人相比，NSCLC患者血清外泌体中PD-L1的水平较高。Pang等人在一个更大的患者队列中进一步证实了外泌体PD-L1的诊断价值，AUC为0.97。Ma等人发现，与健康个体相比，复发性NSCLC患者中外泌体miR-21的表达更高。然而，在外泌体中也发现了高水平的miR-21在其他癌症中，如结直肠癌、乳腺癌和肝癌。因此，检测多种miRNAs可能对NSCLC诊断更有价值。Wu等人证明miR-21、miR-378、miR-139和miR-200在NSCLC患者和健康捐赠者之间差异表达，为NSCLC早期诊断提供了更多可选的生物标志物。值得注意的是，实验结果表明，与血浆和支气管肺泡灌洗液相比，NSCLC患者尿液衍生外泌体中外泌体RNAs的数量更多，这可能为选择样本分析外泌体提供了新的方向。 12.5.乳腺癌 乳腺癌（BC）是女性癌症相关死亡的最常见原因。早期诊断可以有效降低死亡率并取得更好的治疗效果。尽管作为广泛使用的生物标志物，CA15-3（碳水化合物抗原15-3）对于诊断原发性和转移性乳腺癌（MBC）的敏感性还不够。Lee等人证明，癌细胞衍生的外泌体miR-21、miR-222和miR-200c可在体液中量化，并用于乳腺癌诊断。Lu等人报道，RDW（红细胞分布宽度）、MPV（平均血小板体积）和CA15-3的组合显示出比单一生物标志物更好的特异性和敏感性，用于识别乳腺癌。此外，通过机器学习计算八个生物标志物（CA15-3、CA125、CEA、HER2、EGFR、PSMA、EpCAM和VEGF）的加权和，鉴定出一种外泌体签名。结果，该签名显示出高度的区分准确性，用于区分MBC与非转移性肿瘤和年龄匹配的健康捐赠者（91.1%）。此外，据报道，外泌体签名能够准确监测MBC治疗反应，并作为MBC患者无进展生存的独立预后因素。 12.6.前列腺癌 PSA是检测前列腺癌的广泛使用的生物标志物。然而，增加的PSA也出现在如良性前列腺增生（BPH）等炎症性疾病中。因此，迫切需要开发敏感和特异性生物标志物，以早期诊断患者并监测癌症进展。Li等人报道，外泌体ephrinA2具有比血液中循环PSA更好的能力，以区分前列腺癌患者和BPH患者，AUC为0.906。此外，发现血清外泌体中EpCAM和PSMA增加。此外，据报道，外泌体TUBB3 mRNA的表达与转移性去势抵抗性前列腺癌患者阿比特龙治疗的无进展生存期差有关。 12.7.外泌体在临床试验和癌症液体活检中的应用 由于与CTC和ctDNA相比，外泌体具有活细胞分泌、大量存在和稳定循环的优势，基于外泌体的液体活检已在临床试验中进行了测试，其中一些已经获得批准并进入市场。2016年，Exosome Diagnostics提出了世界上第一个基于外泌体的液体活检，ExoDx™ Lung (ALK)，用于从血样中分离和分析外泌体RNA。在CLIA认证实验室中，ExoDx™ Lung (ALK)被证明是一种准确、实时的工具，用于检测NSCLC患者中的EML4-ALK突变，敏感性为88%，特异性为100%，这比cfDNA提供了一种更直接和敏感的检测基因融合的方法。此外，ExoDx Prostate IntelliScore (EPI)已获得FDA认证。基于对外泌体中ERG、PCA3和SPDEF RNA的检测，EPI提供了一个风险评分，以预测PSA在2到10ng/mL之间的患者是否有可能发展为高级别前列腺癌。根据ExoDx，前瞻性研究中达到了93%的敏感性，并且当EPI阈值设定为15.6时，避免了26%的不必要的针刺活检。三个独立的、前瞻性的、多中心的临床试验宣布EPI的表现优于标准护理，并且可以用来协助早期诊断前列腺癌和消除不必要的前列腺活检。此外，MedOncAlyzer 170是一种新开发的液体活检系统，能够一次性检测外泌体RNA和ctDNA。它可以从小量（0.5ml）的患者血液或血浆中识别多种癌症类型中的显著和功能性突变。由于外泌体和ctDNA的独特形成方式，MedOncAlyzer 170在检测癌症进展和治疗的所有阶段的突变方面准确且高度敏感。尽管临床应用价值已经得到验证，但仍然需要更大的临床样本、人群和试验来确认基于外泌体的液体活检在癌症诊断和治疗中的作用。 13.结论和展望 目前，在精准医疗领域，组织活检的局限性已逐渐被认识到。相反，液体活检具有微创性、易于获取样本和动态分析的优势。外泌体已被证实在体液中稳定循环，并包含反映肿瘤进展状态的多样化信息。外泌体作为诊断和预后生物标志物的潜力已在多种癌症中进行了研究。然而，外泌体的高异质性和纳米尺寸为获取其分子信息和相互作用带来了巨大的技术挑战。在这篇综述中，我们总结了传统和新型技术隔离、表征和检测外泌体的优点和缺点。基于物理或生物学特性的技术正在被广泛开发用于外泌体分离，微流控设备的应用在超快速分离高产量的纯外泌体方面具有巨大潜力。尽管取得了革命性的进展，但目前尚无标准化方法用于从细胞培养基和人体体液中高通量、高纯度、最小损伤分离外泌体。循环外泌体中包含的多种分子突显了外泌体在液体活检中的潜力。需要更快、更便捷的方法来验证外泌体货物作为癌症诊断中的生物标志物。大多数新的检测平台虽然优于传统方法，但仍面临低灵敏度和不同外泌体亚群的高异质性挑战。单外泌体检测和分析技术可能揭示特定外泌体的独特分子轮廓，并提供一种可行的策略来获取准确的癌症相关信息。对外泌体异质性的进一步探索将解决当前外泌体研究中的许多挑战。改进开发新策略，从体液中分离外泌体并以快速和敏感的方式分析外泌体内容物，将促进基于外泌体的液体活检在癌症精准医疗中的实践应用。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。