ZFP91

1. 研究背景分子胶降解剂（Molecular glue degraders, MGs）通过重构E3泛素连接酶与靶蛋白的相互作用界面，诱导形成三元复合物以启动蛋白酶体降解通路，为靶向传统不可成药靶点提供了创新范式。然而，现有研究手段存在显著局限性：化学蛋白质组学与亲和富集质谱技术主要聚焦于终末降解事件，难以动态捕获E3连接酶与底物间的瞬时弱相互作用，导致非降解性新底物（neo-substrates）的系统性漏检，这不仅制约了靶点空间的拓展，更影响对分子胶作用机制的深度解析。尤为突出的是，处于临床研究阶段的分子胶（如DKY709）其底物谱系尚未完全解析，且缺乏高通量解析其诱导的E3连接酶互作组的有效工具，这些瓶颈严重阻碍了新一代降解剂的理性设计。2. 研究目的针对上述科学难题，陈小华/谭敏佳团队在《Angew. Chem. Int. Ed.》发表题为《Crosslinking Profiling of Molecular Glue Degrader-Induced E3 Ligase Interactome to Expand Target Space》的研究，开发了基于基因编码光交联非天然氨基酸（UAA）与质谱蛋白质组学联用的全局交联分析策略。本研究构建了三个递进式研究体系：(1) 通过CRBN底物结合域特定位点的UAA整合，实现在活细胞水平精准捕获分子胶（CC-885、DKY709）诱导的CRBN-底物瞬时互作；(2) 系统性鉴定CRBN降解依赖性与非依赖性新底物（FIZ1、ZFP91等），揭示其底物识别基序并并扩展其靶点空间；(3) 基于结构机制设计新型分子胶降解剂CM-2/CM-3，通过TR-FRET和细胞毒性实验验证其通过重塑CRBN互作网络增强抗肿瘤效能的可行性。该技术为分子胶的机制研究及临床转化提供了高效工具，并为克服“不可成药”靶点难题开辟新路径。 3. 研究结果成果一：CRBN互作网络解析通过UAA介导的光交联捕获技术，揭示了CC-885诱导的CRBN动态互作网络。Western blot与质谱联用技术验证了CRBN-GSPT1复合物的特异性形成，阐明CC-885通过精确调控CRBN构象改变实现GSPT1选择性降解的分子基础，为分子胶的靶向性机制提供了直接实验证据。成果二：DKY709底物谱系拓展结合分子对接与定量质谱分析，不仅验证了DKY709的已知降解靶标，更发现FIZ1作为新型CRBN依赖性降解底物。进一步的蛋白丰度测定和Western blot结果证实，FIZ1降解受DKY709诱导，并依赖CRBN介导的泛素-蛋白酶体途径。该研究拓展了CRBN介导的底物谱，同时也为优化临床候选药物的脱靶效应评估提供了关键数据。成果三：理性药物设计突破基于lenalidomide的构效关系优化，成功设计出CM-2、CM-3系列衍生物。分子对接模拟表明，CM-2和CM-3在CRBN结合口袋中具有更优的配体构象，并通过 TR-FRET实验验证了其较高的CRBN亲和力。此外，在MM.1S细胞中，这些新型降解剂表现出更强的细胞毒性和降解活性，表明其在血液瘤治疗中的潜在应用值。    成果四：降解动力学机制阐明分析了分子胶降解剂CM-2和CM-3诱导的靶蛋白降解机制。Western blot结果表明，ZFP91和FIZ1在CM-2处理后显著降解，而蛋白酶体和NEDD8途径抑制实验进一步确认，该降解依赖于CRBN介导的泛素化过程。此外，时间梯度实验揭示了CM-3诱导GSPT1和CK1α降解的动力学模式，为MG降解剂的作用机理提供了更深入的证据。4. 研究结论本研究创新性地构建了光交联蛋白质组学技术平台，实现了分子胶诱导的E3连接酶互作网络解析，并拓展了其潜在靶点范围，为新型降解剂的设计提供了关键结构信息。基于结构机制设计的CM-2、CM-3系列衍生物，在临床前模型中展现出显著优化的药效学特征。该技术平台不仅为分子胶作用机制研究提供了有力工具，更为突破"不可成药"靶点治疗瓶颈开辟了新途径。研究建立的"靶点发现-机制解析-药物设计"三位一体研究范式，为靶向蛋白降解领域的发展提供了方法论创新。声明：发表/转载本文仅仅是出于传播信息的需要，并不意味着代表本公众号观点或证实其内容的真实性。据此内容作出的任何判断，后果自负。若有侵权，告知必删！长按关注本公众号   粉丝群/投稿/授权/广告等请联系公众号助手 觉得本文好看，请点这里↓

近日，JACS期刊上发表了一篇名为“Dual-Action-Only PROTACs”的文章。文章标题该研究致力于解决PROTAC类药物在高效降解靶蛋白过程中，因缺乏细胞特异性而引发的脱靶毒性问题。目前，多数可激活PROTAC策略主要依赖单一病理刺激，然而这仍存在在非靶组织中被激活的风险。为了提高药物的选择性，该研究创新性地提出了一种“双激活门控”策略，即只有同时存在两个肿瘤相关刺激——低氧环境和组织蛋白酶L（Cath-L）活性时，才能激活PROTAC的功能。这一巧妙设计充分利用了肿瘤微环境中低氧与Cath-L共存的独特特性，从而实现更加精准的蛋白降解，显著提升了靶向治疗的安全性和有效性。双激活门控DAO-PROTAC的作用机制示意简图该研究的核心设计是开发一种具有“AND逻辑门”特性的双激活专属PROTAC（DAO-PROTAC）分子，通过双重封闭策略显著提升靶向蛋白降解剂的选择性和安全性。作者巧妙地设计了一种结构上同时封闭E3连接酶配体和靶蛋白配体的PROTAC分子。具体而言，该分子分别采用对低氧敏感的4-硝基苄基和对组织蛋白酶L（Cath-L）响应的ε-乙酰化N-Boc-赖氨酸基团进行修饰。只有当低氧环境和Cath-L活性这两种病理相关刺激同时存在于细胞内时，才会分别触发两个自我脱保护反应，使分子恢复为活性结构，从而启动靶蛋白的泛素化与降解过程。为了验证这一设计的通用性，作者成功设计了两个代表性分子：DAO-dBET1和DAO-THAL-SNS-032，并通过实验验证了其有效性。验证DAO策略的有效性作者以BRD4降解剂dBET1为模型，构建了其双封闭版本DAO-dBET1。在MDA-MB-231乳腺癌细胞的实验中，研究发现，当同时施加CoCl₂（用于模拟低氧环境）和高表达Cath-L的条件时，DAO-dBET1能够高效降解BRD4，其半数降解浓度（DC₅₀）为277 nM，与原始dBET1的降解效率（DC₅₀=158 nM）相当。在对照实验中，若缺少任一激活条件，DAO-dBET1均无法引起有效的降解，且未诱导明显的细胞凋亡或毒性反应。流式细胞术检测结果显示，在双刺激条件下，细胞凋亡比例接近dBET1（52%vs.59%），而在无刺激条件下，凋亡比例仅为约9%。这一结果充分验证了DAO策略能够精准响应特定病理环境，显著提升药物的特异性，减少对非靶细胞的影响，为PROTAC药物的设计提供了一条更为安全的路径。验证单一刺激仍具有部分细胞毒性（DAO设计的必要性）为了深入探究DAO设计的必要性，作者分别合成了两种单刺激响应的中间体——Hyp-dBET1（仅对低氧响应）和Cath-L-dBET1（仅对Cath-L响应），以模拟DAO-dBET1在单一条件下的部分脱保护状态。研究结果显示，这些中间体即使在未完全激活的状态下，仍表现出一定程度的生物活性。例如，Hyp-dBET1在低氧条件下能够显著诱导BRD4的降解，并降低c-Myc的表达水平；而Cath-L-dBET1在高Cath-L活性的环境中则会影响ZFP-91的水平。这两种中间体均能诱导细胞凋亡，表现为caspase 3/7活性的显著上升。此外，Hyp-dBET1和Cath-L-dBET1的半数抑制浓度（IC₅₀）分别为3.4 μM和2.8 μM，与JQ1和thalidomide这两种原药的活性水平相当。这一结果表明，仅单侧封闭的PROTAC在特定条件下仍可能释放一个活性端，从而产生“部分激活”效应，进而引发非特异性细胞毒性。因此，完全的双重封闭设计是降低脱靶毒性、确保药物安全性的关键所在。验证对正常细胞的安全性为了验证DAO-PROTAC在正常细胞中的安全性，作者选择了Cath-L表达水平较低的人类肾细胞HEK-293作为模型。实验中，通过CoCl₂处理模拟肿瘤缺氧环境，并同步检测DAO-dBET1在该环境中的降解能力与毒性表现。尽管低氧条件成功诱导了HIF-1α的表达（表明低氧响应元件已被激活），但由于Cath-L表达不足，DAO-dBET1无法完成双重脱保护。因此，BRD4几乎不被降解，且ZFP-91和c-Myc等下游蛋白的表达也未出现显著变化。细胞存活率保持在较高水平，凋亡率与对照组相近，这表明DAO-dBET1在健康组织中基本保持惰性。这一结果凸显了“AND门控”设计的高选择性，有效避免了在单一刺激触发下可能引发的“假激活”或非靶向伤害。这种设计保障了DAO-PROTAC在正常细胞环境中的低毒性和安全性，是其向临床转化的重要优势。验证DAO策略通用性为了验证DAO策略的通用性，作者将其应用扩展至另一个PROTAC分子THAL-SNS-032，该分子靶向癌症中关键的转录调控因子CDK9。在构建的DAO-THAL-SNS-032中，虽然保留了双封闭策略，但对低氧与Cath-L响应基团在分子两端的分布进行了调整：低氧响应基团封闭了E3连接酶结合端（thalidomide），而Cath-L响应基团则修饰了CDK9配体（SNS-032）。在MDA-MB-231细胞中，DAO-THAL-SNS-032在双重刺激条件下实现了高效的CDK9降解（DC₅₀=265 nM），与未封闭版本（172 nM）相当，同时表现出强烈的细胞毒性与凋亡效应。相比之下，在单刺激或无刺激条件下，几乎观察不到降解和毒性作用。免疫印迹实验进一步显示，DAO-THAL-SNS-032成功下调了CDK9下游蛋白MCL-1，从而验证了其靶向功能。这一结果表明，DAO策略可适用于不同的蛋白靶标，具有高度的模块化和广泛的适用性，是一种具有药物开发潜力的通用设计框架。该文提出并验证了一种新型“双激活专属PROTAC（DAO-PROTAC）”策略，通过引入可响应低氧和组织蛋白酶L（Cath-L）的双重触发结构，实现了对靶向蛋白降解剂的高选择性调控。作者以BRD4靶向PROTAC dBET1为模型，构建了其双封闭版本DAO-dBET1，并系统验证了其在两种刺激共存时的高效活化能力，以及在单刺激或无刺激条件下的显著惰性。此外，研究还指出，单侧脱保护中间体仍可能引发一定程度的细胞毒性，从而强调了双重门控设计的必要性。DAO-PROTAC在健康细胞中保持低活性，其安全性优于传统或单封闭PROTAC。进一步地，作者成功将该策略扩展至另一个靶点CDK9，验证了该方法的通用性和模块化特征。总体而言，该研究为提升PROTAC类药物的肿瘤选择性和治疗安全性提供了一种有效的新思路和模块化设计平台。点击下方阅读原文获取文章来源欢迎感兴趣的朋友进群讨论，群二维码如下：推文用于传递知识，如因版权等有疑问，请于本文刊发30日内联系医药速览。原创内容未经授权，禁止转载至其他平台。有问题可发邮件至yong_wang@pku.edu.cn获取更多信息。©2021 医药速览 保留所有权利往期链接“小小疫苗”养成记 | 医药公司管线盘点 人人学懂免疫学| 人人学懂免疫学（语音版）综述文章解读 | 文献略读 | 医学科普|医药前沿笔记PROTAC技术| 抗体药物| 抗体药物偶联-ADC核酸疫苗 | CAR技术| 化学生物学温馨提示医药速览公众号目前已经有近12个交流群（好学，有趣且奔波于医药圈人才聚集于此）。进群请扫描上方二维码，备注“姓名/昵称-企业/高校-具体研究领域/专业”，此群仅为科研交流群，非诚勿扰。简单操作即可星标⭐️医药速览，第一时间收到我们的推送①点击标题下方“医药速览”  ②至右上角“...”  ③点击“设为星标

2025年3月25日，中国科学院上海药物研究所陈小华课题组与谭敏佳、李佳课题组合作在Angew. Chem. Int. Ed.期刊发表题为“Cross-Linking Profiling of Molecular Glue Degrader-Induced E3 Ligase Interactome to Expand Target Space”的研究论文。团队基于基因密码子扩展技术、光交联非天然氨基酸和蛋白质组学分析，发展了一种在活细胞内直接捕捉“分子胶诱导的E3连接酶-底物”相互作用的新方法。该方法为分子胶降解剂及其可调控的靶标发现提供了新的化学生物学工具，为探索“难成药”靶标的降解和扩展靶标空间提供新视角。该论文被Angew. Chem. Int. Ed.期刊选为“Very Important Paper”。分子胶（Molecular Glue, MG）是一类通过诱导形成新的蛋白质-蛋白质相互作用（neoPPIs）来调控靶标蛋白功能的小分子化合物（图1a），已成为新药发现和疾病治疗新范式。发现分子胶诱导的底物，不仅对新分子胶降解剂的设计和发现具有重要科学意义，而且为扩展靶标空间提供新思路，从而发展疾病治疗新策略。分子胶诱导的泛素蛋白酶体系统的靶向蛋白降解涉及多个生物学过程，然而，现有研究方法主要依赖于底物降解终点或底物泛素化标记的检测，难以有效捕获分子胶诱导形成的E3连接酶与底物的动态相互作用，制约了其可调控底物包括可降解和非降解底物的系统性发现及其作用机制的深入研究。针对以上挑战，该研究提出了“光交联非天然氨基酸捕捉分子胶诱导的底物”的策略，开发了一种活细胞中分子胶诱导的底物发现新方法，实现了对分子胶诱导的E3连接酶底物及分子胶降解剂的发现（图1b）。本工作发展的活细胞内“光交联非天然氨基酸捕捉分子胶动态诱导的底物”新方法本研究基于基因密码子扩展技术，将具有光交联活性的非天然氨基酸（UAA）定点引入到E3连接酶CRBN的底物结合界面，光激活条件下实现活细胞内对分子胶诱导的CRBN-底物共价捕获。这一方法突破了现有技术在灵敏度和准确性上的限制，成功鉴定出分子胶CC-885诱导的内源性降解底物（如GSPT1、GSPT2、ETF1），并揭示了临床分子DKY709降解的新靶标FIZ1，拓展其潜在靶标空间。此外，基于分子胶与CRBN的结合特点，设计了两种新型分子胶降解剂CM-2和CM-3，这些分子胶在多发性骨髓瘤MM.1S细胞系中表现出显著的抗增殖活性；并利用该方法揭示了其诱导的新底物（如ZFP91，PI4KB等），为开发新一类分子胶及其可调控的靶标发现提供了新策略。同时，该研究发现了底物与CRBN结合的新模式，为“E3连接酶-分子胶-诱导底物”的识别机制提供了新见解。该项研究对分子胶发现的重要意义在于，更多不同结构类型分子胶底物互作组的系统性分析结果，能够为针对其中感兴趣的被招募底物的新分子胶设计提供源头信息，进而设计特异性分子胶降解该底物、扩展分子胶可调控的靶标空间。该方法不仅能够全面分析分子胶诱导的蛋白-蛋白相互作用，可扩展到更多分子胶诱导底物的发现，为新分子胶及其可调控靶标的发现提供了新策略；该方法还可拓展至更广泛的靶向蛋白降解(TPD)和化学分子诱导的蛋白质互作领域的研究，有助于推进针对"难成药"靶标的分子胶降解剂或蛋白质稳定剂的发现。上海药物所副研究员许亚莉、同济大学博士后赵雯思、上海药物所博士后聂辉军、助理工程师王家敏为本论文的共同第一作者。上海药物所陈小华研究员、谭敏佳研究员、李佳研究员为本论文的通讯作者。该工作得到国家自然科学基金委、上海市市科委扬帆项目和上海药物所自主部署项目等支持。全文链接https://onlinelibrary.wiley.com/doi/epdf/10.1002/anie.202505053声明：发表/转载本文仅仅是出于传播信息的需要，并不意味着代表本公众号观点或证实其内容的真实性。据此内容作出的任何判断，后果自负。若有侵权，告知必删！长按关注本公众号   粉丝群/投稿/授权/广告等请联系公众号助手 觉得本文好看，请点这里↓